MX2014015523A - Ligando de grasas obtenido a partir de la biomasa del procedimiento de elaboracion de la cerveza. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona una composición rica en polisacáridos que comprende beta-glucano, quitina y quitosano, extraídos de la pared celular de Saccharomyces cerevisiae a partir de biomasa subproducto resultante de un procedimiento de elaboración de la cerveza, el procedimiento para su obtención y sus usos. La composición presenta, entre otras biofuncionalidades, un efecto ligando de grasa selectivo por lo que es útil en la prevención y/o tratamiento de enfermedades como el sobrepeso, la obesidad, la hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, hipertensión arterial y trastornos cardiovasculares. Se puede formular como producto comestible, farmacéutico o veterinario.

Description

LIGANDO DE GRASAS OBTENIDO A PARTIR DE LA BIOMASA DEL PROCEDIMIENTO DE ELABORACIÓN DE LA CERVEZA La presente invención se refiere a los campos de la medicina y la nutrición y, en particular, a los complementos alimenticios para uso en el control del peso y en la reducción de grasas con efectos cardiovasculares negativos.

ESTADO DE LA TÉCNICA Los malos hábitos alimentarios y el estilo de vida de nuestra sociedad han dado lugar a un creciente problema de salud pública. Dentro de la desintegración actual en referencia a la pirámide recomendada de ingesta diaria de alimentos, los puntos más críticos se encuentran en el consumo excesivo de ácidos grasos saturados y colesterol. Mientras que se recomienda que el consumo de ácidos grasos saturados sea del 7% en relación a la ingesta total de energía y que el de colesterol sea <250 mg/día, la realidad es que alcanzan valores del 15% y 350 mg/día, respectivamente. El exceso en el consumo energético se debe principalmente al consumo excesivo de grasas saturadas, mientras que la ingesta excesiva de colesterol es causada por el consumo excesivo de productos de origen animal.

Todos los estudios epidemiológicos coinciden en que el consumo excesivo de alimentos ricos en grasas junto con una disminución en el gasto energético por actividad física conlleva una serie de trastornos de salud prevalentes. Entre los más graves se encuentran el sobrepeso/obesidad y la hipercolesterolemia. Además del deterioro en la calidad de vida, el sobrepeso y la obesidad se han vinculado como factores causales de condiciones de salud adversas serias que incluyen enfermedades cardiovasculares, diabetes tipo 2, problemas músculo-esqueléticos, y cáncer. Por otro lado, se cree que la hipercolesterolemia, que puede conllevar problemas de aterosclerosis, es un importante factor de riesgo de enfermedades cardiovasculares, principal causa de mortalidad en países desarrollados.

En vista de lo anterior, cada vez son más buscados agentes reductores de lípidos que no requieren prescripción que permitan ayudar a reducir el peso corporal y disminuir el colesterol. Como resultado, independientemente de su diversa y no siempre plenamente justificada eficacia, se comercializan una multitud de suplementos alimenticios reductores de lípidos de venta libre. Entre ellos, el quitosano, disponible en forma de cápsulas y comprimidos, se considera capaz tanto de reducir los niveles de colesterol como de producir una perdida de peso rápida.

El quitosano es un poliaminosacárido derivado de la quitina. La quitina, uno de los recursos orgánicos renovables más abundantes de la naturaleza, presente principalmente en el exoesqueleto de los crustáceos, es químicamente un polímero lineal compuesto de unidades de N-acetil-D-glucosamina y unidades de D-glucosamina unidas por enlaces b-(1-4) -glucosídicos, donde las unidades N-acetil-D-glucosamina son predominantes en la cadena del polímero. La forma desacetílada de la quitina se refiere al quitosano. La quitina se refiere generalmente a un copolímero con un grado de acetilación (GA) de más del 40% (es decir, una cantidad de N-acetil-D-glucosamina superior al 40% y una cantidad de D-glucosamina inferior al 60%) e insoluble en ácidos diluidos. El nombre quitosano se utiliza para un copolímero con GA inferior al 40% [es decir, más del 60% de GD (grado de desacetilacíón), cantidad de N-acetil-D-glucosamina inferior al 40% y cantidad de D-glucosamina inferior al 60 %] que, en la mayoría de casos, será soluble en ácido diluido. La quitina y el quitosano pueden ser considerados químicamente análogos a la celulosa, cuyos grupos hidroxilo en el carbono-2 han sido sustituidos por grupos acetamido y amino, respectivamente. El quitosano posee distintas propiedades químicas y biológicas atribuibles a la presencia de múltiples grupos amino en sus moléculas. Esto puede ser explotado en una gran variedad de procesos, incluidos los tratamientos medicos, y esto es posible debido a la excelente biocompatibilidad del quitosano y a que se trata de un compuesto fisiológicamente inerte.

La quitina y el quitosano se encuentran como material estructural en muchos organismos acuáticos (caparazones de gambas y cangrejos y las placas óseas de calamares y sepias), en muchos insectos, crustáceos terrestres ( Armadillidium vulgare, Porcellio scaber), nematodos, hongos y en algunos microorganismos (levaduras, hongos y algas). Los caparazones acuáticos contienen aproximadamente un 30-40% de proteína, 30-50% de carbonato de calcio, y 20-30% de quitina en relación a la materia seca. Estas proporciones varían dependiendo de las especies de crustáceos y las estaciones. Tradicionalmente la quitina se obtiene mediante la descalcificación y desproteinización de los caparazones de cangrejo o gambas, que implica la disolución de carbonato de calcio con una solución de ácido y la eliminación de las proteínas en medio alcalino o con enzimas, respectivamente. El quitosano puede ser obtenido por desacetilación de la quitina con una solución alcalina caliente, y un proceso de decoloración. Este procedimiento de producción de quitosano tiene algunas características desfavorables. Por ejemplo, el procedimiento requiere energía calorífica cara y un alcalino cáustico, que es un peligro potencial para la salud. El procedimiento también produce grandes cantidades de residuos, lo que requiere importantes costes de eliminación. Además, el suministro de caparazones de gamba o cangrejo es altamente dependiente de factores estacionales y ambientales, dando lugar a limitaciones impredecibles en la capacidad de producción y a características físico-químicas inconsistentes en los productos finales para su uso en aplicaciones médicas y la agricultura. Además, el quitosano obtenido a partir de caparazones de gambas puede presentar antígenos en el producto final que podrían causar alergias al consumidor. Por lo tanto, aunque el quitosano ha sido clínicamente bien tolerado, no puede ser recomendado para personas alergicas a los crustáceos. Estos problemas pueden ser evitados mediante la extracción de quitosano a partir de fuentes diferentes.

En la actualidad la investigación se centra en la extracción de quitosano puro a partir de componentes de la pared celular de hongos. Con este objetivo, N. Nwe et al. estudió la unión entre el quitosano y glucanos en la pared celular de hongos para desarrollar un método enzimático para la producción de quitosano muy puro a partir del hongo Gongroella butlerí con un alto rendimiento (N. Nwe et al. 2010, “Production of fungal chitosan by enzymatic method and applications in plant tissue culture and tissue engineering: eleven years of our progress, present situation and future prospects” Biopolymers, edited by Magdy Elnashar, published: September 28, 2010, chapter 7 pp. 135-162).

EP 1483299 describe un método que permite separar la quitina de b-glucanos de una manera controlada, sin degradación o transformación de las cadenas de quitina. El método se basa en poner el contacto las células fúngicas de Aspergillus niger con una solución básica, poniendo en contacto la fracción insoluble en alcalino con una solución ácida, permitiendo la obtención de una suspensión de fracciones alcalino-insoluble acidificadas que comprenden dichos derivados de la pared celular, y finalmente poniéndolo en contacto con enzimas b-glucanasas, para obtener un producto de quitina, o con quitina desacetilasa, para obtener un producto de quitosano.

Una de las aplicaciones del quitosano consiste en su uso como suplemento alimenticio antilipidémico donde, debido a la hidrólisis limitada por las enzimas digestivas humanas, el quitosano pasa a lo largo del sistema digestivo hasta el intestino grueso prácticamente intacto, actuando de manera efectiva como una fibra alimentaria. Se cree que el quitosano reduce la absorción de grasas en el tracto gastrointestinal mediante la unión con los grupos carboxilo aniónicos de los ácidos grasos y los ácidos biliares, e interfiere con la emulsión de lípidos neutros (es decir, el colesterol y otros esteróles) mediante la unión por enlaces hidrofóbicos. El potencial anti-hiperlipidémico del quitosano se ha estudiado tanto in vivo como in vitro. Los estudios in vivo incluyen ensayos llevados a cabo tanto en animales como en humanos y consistieron en varias determinaciones, sobretodo en relación al peso corporal, los niveles de lípidos séricos y las concentraciones de lípidos en las heces. Cabe destacar que los datos reportados son contradictorios. Aunque la mayoría de ensayos con animales mostraron efectos del quitosano en la reducción del peso corporal y los niveles de colesterol (H. Yao et al., “Effect of chitosan on plasma lipids, hepatic lipids, and fecal bile acid in hamsters human triáis failed to show these effects” J. Food Drug Anal. 2006, vol. 14, pp. 183-189), los ensayos en humanos no han podido mostrar estos efectos (M.D. Gades et al., “Chitosan supplementation and fat absorption in men and women” J. Am. Diet. Assoc. 2005, vol. 105, pp. 72-77, C.N. Mhurchu et al., “Effect of chitosan on weight loss in overweight and obese individuáis: a systematic review of randomized controlled triáis” Obes. Rev. 2005, vol. 6, pp. 35-42).

Las formulaciones de suplementos de quitosano son similares pero no idénticas. El quitosano por sí mismo es el producto por desacetilación química de la quitina como materia prima, y el grado de desacetilación en el producto varía en función de las condiciones de reacción. Durante el procesamiento, algunos factores tales como el grado de desacetilación y peso molecular de las moléculas, la relación qultina/quitosano, solubilidad, fuerza iónica, pH, tamaño de partícula, y la temperatura afectan a la producción del quitosano y sus propiedades. Podría esperarse que la eficiencia del quitosano pudiese depender de sus propiedades fisicoquímicas. Sin embargo, no se ha establecido una correlación entre la capacidad ligando y la determinación de las propiedades físico-químicas del quitosano. Esto se indica en un estudio, entre otros, en el que describieron la capacidad de unión de ácidos biliares y de grasa, la capacidad de hinchamiento, el grado de desacetilación, y la viscosidad en disolución de 11 preparados de quitosano (K. Zhou et al., n vitro binding of bile acids and triglycerides by selected chitosan preparations and their physico-chemical properties” Food Science and Technology 2006, vol. 39, pp. 1087-1092).

Los suplementos a base de quitosano se venden como “capturadores de grasas” o "ligandos de grasa". Los reclamos publicitarios para algunos de estos suplementos pueden dar a los consumidores expectativas poco realistas. Si bien se anuncia tener tanto la capacidad de reducir el colesterol como de producir una rápida perdida de peso, pueden al mismo tiempo tener efecto anti-nutricional debido a su capacidad para atrapar también a moléculas de origen lipídico que son beneficiosas para la salud humana, tales como vitaminas liposolubles A, D, E, K, colesterol HDL, esteróles vegetales, y ácidos grasos poliinsaturados como los ácidos grasos omega 3 y 6.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una composición rica en polisacáridos que comprende beta-glucano, quitina y quitosano, extraído de la pared celular de Saccharomyces cerevisiae a partir de la biomasa subproducto resultante del procedimiento de elaboración de la cerveza, el procedimiento para su obtención y los usos del mismo. Como la composición de la invención es rica en polisacáridos (quitina, quitosano y beta-glucano) en esta descripción se denomina como "composición rica en polisacáridos". "La composición", "el producto" y "la composición de la invención" también se utilizan indistintamente para referirse a la composición de la invención.

En consecuencia, un primer aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para obtener una composición rica en polisacáridos que comprende beta-glucano, quitina y quitosano, extraídos de la pared celular de Saccharomyces cerevisiae a partir de biomasa del subproducto resultante de un procedimiento de elaboración de la cerveza, que comprende los siguientes pasos: i) preparar un reactor con una solución de NaOH a una concentración entre 0,25 y 3 M con agitación y una temperatura entre 50 y 95 °C; ii) añadir la biomasa subproducto resultante del procedimiento de elaboración de la cerveza a la solución; iii) mantener las condiciones durante al menos 1 hora; iv) enfriar la solución hasta temperatura ambiente; v) neutralizar la solución con al menos una adición de solución ácida o de agua, hasta alcanzar pH 7, donde cuando se hace más de una adición, se realiza un paso de separación del producto sólido de la solución entre adiciones; vi) separar el producto sólido obtenido del paso (v) de la solución; vii) cuando la neutralización del paso (v) se ha hecho mediante la adición de una solución ácida, se somete el producto sólido a por lo menos un lavado con agua y se separa el producto sólido obtenido; y viii) secar el producto sólido hasta un peso constante y micronizar.

Otro aspecto de la invención es la provisión de una composición obtenible por el procedimiento que se define anteriormente.

Al ejercer varios efectos beneficiosos en humanos, la composición de la invención es útil como agente terapeutico o profiláctico. Así, otro aspecto de la invención se refiere a la composición de la invención para su uso como agente de prevención y/o terapéutico. Particularmente, la composición es útil en la prevención y/o el tratamiento en un animal, incluyendo el ser humano, de un trastorno seleccionado del grupo consistente en sobrepeso, obesidad, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, hipertensión arterial y trastornos cardiovasculares. La invención proporciona el uso de la composición para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de los trastornos mencionados anteriormente. Esto puede ser alternativamente formulado como un metodo para la prevención y/o el tratamiento en un animal, incluyendo el humano, de un trastorno seleccionado del grupo consistente en sobrepeso, obesidad, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, hipertensión arterial y trastornos cardiovasculares, que comprende la administración a dicho animal que lo necesite una cantidad efectiva de la composición de la invención.

Otro aspecto de la invención se refiere a la composición de la invención para su uso como un agente ligando de grasa intestinal.

En otro aspecto, la composición de la invención es útil como agente detoxificante.

En otro aspecto, la composición de la invención es útil como agente inmunoestimulante. Otro aspecto de la invención se refiere a un producto farmacéutico y/o de veterinaria que comprende una cantidad efectiva de la composición como se define anteriormente, junto con cantidades apropiadas de excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables. El término "cantidad efectiva" que se usa aquí, significa una cantidad de un agente activo suficiente para proporcionar el beneficio deseado, pero suficientemente baja para evitar efectos secundarios graves dentro del criterio médico.

Otro aspecto adicional de la invención se refiere a un producto comestible que comprende una cantidad efectiva de la composición de la invención, junto con cantidades apropiadas de otros ingredientes comestibles.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La pared celular de Saccharomyces cerevisiae puede representar entre el 20 y el 30% de la masa celular seca. Se compone principalmente de manoproteínas y beta-glucanos y pequeñas cantidades de quitina y lípidos. La proporción de estos componentes puede variar de acuerdo con las cepas y las condiciones de cultivo. Como se ha descrito anteriormente, hay metodos en la téenica para extraer quitosano de componentes de la pared celular de hongos. Por otro lado, la técnica también describe métodos para obtener beta-glucanos de levaduras, y en particular a partir de Saccharomyces cerevisiae. WO91/03495 describe métodos para producir glucanos solubles para estimular la producción de plaquetas. Uno de los métodos parte de partículas enteras de glucanos previamente preparadas a partir de levadura de panadero seca de acuerdo con el procedimiento del Jamas et al., US4810646, y comprende pasos adicionales para solubilizar las partículas de glucano insolubles. Otro método descrito en el Ejemplo 2 de la solicitud de patente se refiere a una secuencia de tratamientos para producir glucanos solubles a partir de una cepa seleccionada de S. cerevisiae.

Así, aunque la técnica describe métodos para obtener, por un lado quitina/quitosano y por otro lado beta-glucanos de la levadura, la calidad y cantidad del producto final extraído a partir de los micelios de hongos depende del origen fúngico, sus condiciones de crecimiento (composición del medio de fermentación: fuente de carbono y su concentración, fuente de nitrógeno y su concentración, iones metálicos y su concentración; y las condiciones de fermentación: tamaño de inoculo, tiempo de cultivo, temperatura de fermentación), y de los pasos del procedimiento de extracción.

La invención proporciona un procedimiento industrial para obtener una composición rica en polisacáridos. El procedimiento comprende los pasos explicados en la sección anterior. Se prepara un reactor con una solución de NaOH en una concentración entre 0,25 y 3 M con agitación y a una temperatura entre 50 y 95°C. En realizaciones particulares de la invención, la concentración de NaOH se selecciona de entre 0,25; 0,50; 0,75; 1,0; 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,8; 1,9; 2,0; 2,1; 2,2; 2,3; 2,4; 2,5; 2,6; 2,7; 2,8; 2,9 y 3 M. Particularmente, el NaOH está en una concentración entre 0,25 y 1,5 M. Más particularmente, la concentración de NaOH es 0,25 M. En otra realización particular, la concentración de NaOH es de 1 M.

En otra realización de la invención, el tratamiento con solución de NaOH en el reactor se lleva a cabo a una temperatura seleccionada de entre 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 , 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 , 90, 91 , 92, 93, 94, y 95 °C. Particularmente, la temperatura es entre 65 y 85 °C, y más particularmente a 80 °C.

En una realización de la invención, despues de enfriar la solución (paso (iv), se neutraliza por la adición de una solución ácida para alcanzar pH 7 y los sólidos se separan de la solución. En particular, la solución ácida es una solución de ácido fosfórico, una solución de HCI, una solución de ácido acético. Luego, el producto sólido se somete a al menos un lavado con agua. Entre lavados, el producto sólido se separa de la solución.

En otra realización de la invención, el paso de neutralización se realiza con al menos una adición de agua, en particular, agua destilada. Cuando se hace más de una adición, se realiza un paso de separación del producto sólido de la solución entre adiciones. Cuando se hace la neutralización con adiciones de agua, no sería necesario lavar el sólido después de la neutralización pero puede hacerse si se desea una producto sólido más limpio.

En una realización particular de la invención, el procedimiento comprende un paso antes de la neutralización, que consiste en separar el producto sólido de la solución una vez enfriada. La separación se hace por ejemplo por centrifugación. En el escalado industrial, el Lote 2 por ejemplo se ha hecho añadiendo este paso.

En una realización particular de la invención, la biomasa resultante del procedimiento de elaboración de la cerveza se añade al reactor en una cantidad entre 1:2 y 1:5. Concretamente las cantidades son 1:3. Esto se expresa como biomasa húmeda: solución de NaOH. Como se muestra en los ejemplos, los lotes 2-4 se fabricaron de esta manera añadiendo cantidades de biomasa de 1 :3 (lote 2 y 3) y 1 :2 (lote 4). Expresada en producto seco, la cantidad usada en dichos ejemplos sería de 1:39 y 1:23 respectivamente.

Así, la biomasa subproducto resultante de un procedimiento de elaboración de la cerveza puede añadirse al reactor con la solución de NaOH directamente proveniente del procedimiento de elaboración de la cerveza. Esta biomasa es entonces húmeda (llamada aquí "biomasa húmeda") porque comprende impurezas del procedimiento de elaboración de la cerveza.

La biomasa subproducto resultante del procedimiento de elaboración de la cerveza también puede añadirse al reactor seca. Así, en otra realización, el procedimiento comprende adicionalmente un pre-tratamiento de la biomasa resultante del procedimiento de elaboración de la cerveza antes de su adición a la solución de NaOH. El pretratamiento comprende los siguientes pasos: (a) tamizar la biomasa para separar la biomasa de Saccharomyces cerevisiae de las impurezas del procedimiento de elaboración de la cerveza; (b) secar la biomasa de S. cerevisiae obtenida en el paso (a), y (c) moler el producto de S. cerevisiae obtenido en el paso (b). En este caso, la adición del producto de S. cerevisiae seco al reactor es en una cantidad entre 1:20 y 1:40 peso/volumen. En particular la cantidad es de 1:30 w/v. Como se muestra en los ejemplos, el lote 1 se fabricó de esta manera añadiendo una cantidad de biomasa de 1:30.

Las condiciones en el reactor se mantienen durante al menos 1 hora. Particularmente, las condiciones se mantienen entre 5 y 20 h y preferiblemente durante 16 h. En otra realización, la reacción dura 10 h (ver por ejemplo Lote 4).

El producto final se seca y es finalmente micronizado. Preferiblemente, el producto se dispone en bandejas de vidrio y se seca en estufa de vacío a 60 °C hasta peso constante, y despues se microniza. El secado puede realizarse bajo vacío para reducir el tiempo de proceso. En una realización particular, el secado se realiza mediante spray-drying del producto hasta una cantidad de disolvente inferior al 5% en peso.

La presente invención abarca todas las combinaciones posibles de las condiciones particulares descritas aquí. Los ejemplos a continuación (Lotes 1-4) muestran que ciertas condiciones de reacción y pasos del procedimiento pueden variarse sin que cambien significativamente las características del producto (como puede verse en el punto 9.4 de los ejemplos).

Como resultado de este procedimiento, se obtiene una composición que comprende beta-glucano, quitina y quitosano, de la pared celular de S. cerevisiae. En una realización de la invención, la relación de quitosano, quitina y beta-glucano en la composición está entre 1:10:80 y 1:20:150. En otra realización de la invención, la solubilidad de la composición a pH 3,5 en agua destilada es de entre 650 y 800 mg/l. En otra realización de la invención, el porcentaje de masa atómica de carbono, hidrógeno y nitrógeno de la composición es, respectivamente, entre el 36 y 44% para el carbono, entre el 5,5 y 7% para el hidrógeno, y entre el 0,2 y 0,8% para el nitrógeno.

En una realización particular de la invención, el procedimiento de obtención de la composición se realiza a una concentración de 0,25 M de NaOH, a 80 °C con una cantidad de producto de S. cerevisiae seco en el reactor de 1 :30, durante un tiempo de reacción de 16 h. Las propiedades químicas de la composición obtenida con estas condiciones se describen en la sección 2 de los posteriores EJEMPLOS. Más concretamente, la relación quitosano, quitina y beta-glucano en la composición es 1:14:116; la solubilidad de la composición a pH 3,5 en agua destilada es 710 mg/l; y el porcentaje de la masa atómica de carbono, hidrógeno y nitrógeno de la composición es 40,32; 6,35 y 0,24% respectivamente.

En una realización particular de la invención, el procedimiento de obtención de la composición se realiza a una concentración de NaOH de 0,25 M a 80 °C con una cantidad de biomasa de S. cerevisiae húmeda en el reactor de 1 :3, durante un tiempo de reacción de 16 h. Antes del paso de neutralización, el producto se separa de la solución una vez enfriada. En una realización particular, el producto obtenido tiene las propiedades descritas en la sección 9.4 Lote 2.

En una realización particular de la invención, el procedimiento para obtener la composición se realiza a una concentración de NaOH de 0,25 M, a 80 °C con una cantidad de biomasa de S. cerevisiae húmeda en el reactor de 1 :3, durante un tiempo de reacción de 16 h. Después de la hidrólisis, la mezcla es directamente neutralizada añadiendo una solución ácida (sin la previa centrifugación de la mezcla de reacción). Después de la neutralización, la mezcla es centrifugada y luego lavada. En una realización particular, el producto obtenido tiene las propiedades descritas en la sección 9.4 Lote 3.

En una realización particular de la invención, el procedimiento para obtener la composición se realiza a una concentración de NaOH de 0,32 M, a 80 °C con una cantidad de producto de S. cerevisiae húmedo en el reactor 1:2, durante 10 h de tiempo de realización. Después de la hidrólisis, la mezcla se neutraliza directamente añadiendo una solución ácida (sin la previa centrifugación de la mezcla). Después de la neutralización, la mezcla es centrifugada y luego lavada. En una realización particular, el producto obtenido tiene las propiedades descritas en la sección 9.4 Lote 4.

Los beta-glucanos son conocidos como modificadores de la respuesta biológica debido a su capacidad para activar el sistema inmune. Además, la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) ha concluido en una reciente opinión científica que puede establecerse una relación de causa y efecto entre el consumo de beta-glucanos y la reducción de las concentraciones de colesterol en sangre. Los componentes alimenticios que fueron objeto de estudio fueron beta-glucanos, que son fibras solubles procedentes de cereales. En cuanto al control de peso, ninguna de las referencias presentadas a la EFSA, se refirió a los efectos del consumo de beta-glucano en el peso corporal por lo que el panel concluyó que no se establecía una relación de causa-efecto entre el consumo de beta-glucanos y el mantenimiento o la consecución de un peso corporal normal (vease Scientific Opinión on the substantiation of health claims related to beta glucans and maintenance of normal blood cholesterol concentrations (ID 754, 755, 757, 801, 1465, 2934) and maintenance or achievement of a normal body weight (ID 820, 823) pursuant to Article 13(1) of Regulation (EC) No 1924/2006 EFSA Journal 2009; vol. 7(9) pp. 1254 [18 PP·])· Sorprendentemente, la composición de la invención basada en una mezcla de beta-glucanos y quitina/quitosano de biomasa de Saccharomyces cerevisiae obtenida a partir í del procedimiento de elaboración de la cerveza ha mostrado un efecto de disminución de lípidos específica, así como un efecto de reducción de peso y una reducción de la circunferencia de la cintura en ensayos clínicos en humanos.

Los ejemplos siguientes demuestran que la composición de la invención implicó una mejora sustancial en la capacidad de mejorar el perfil lipídico de las ingestas. En una realización particular de la invención, la composición tiene una capacidad de ligar grasa de al menos 10 veces su peso, determinado por un ensayo que consiste en: i) poner en contacto aceite de algodón con la composición en una solución ácida durante dos horas a 37 °C y agitación constante, ii) centrifugar la solución para separar el aceite de algodón unido a la composición del aceite de algodón no unido presente en el sobrenadante, iii) mezclar el sobrenadante con hexano y centrifugar la mezcla, y ¡v) recuperar la fase superior de la mezcla centrifugada, permitiendo que el hexano se evapore, y pesar el aceite de algodón no unido. Este ensayo también se explica en detalle en la sección 3 de los EJEMPLOS.

Los ejemplos siguientes también demuestran que los animales alimentados con el producto de la invención presentaron un incremento de peso inferior en comparación con productos comerciales ligando de grasa similares utilizados como grupo control. La eficiencia energética (g de peso corporal obtenido por kcal de alimento ganado) es el valor que muestra claramente la eficacia del producto en la reducción de la absorción. En este caso, el producto de la invención redujo la absorción de grasa total medida como eficiencia de la alimentaria total, en comparación con los controles. El consumo del producto de la invención no implicó un aumento significativo en la excreción fecal de los animales. No puede decirse lo mismo en el grupo de un producto comercial (Quitosano S). El quitosano S alcanzó valores extraordinariamente altos de excreción y materia seca. Este hecho, a diferencia de lo que pasa con el producto de la invención, implica que hay un efecto no selectivo en el caso de producto quitosano S, el cual no ligaría específicamente la grasa sino también muchos otros nutrientes. Así, el producto de la invención tiene la ventaja de carecer de los efectos anti-nutricionales presentados por otros productos ligando de grasa comerciales, como se muestra en los ejemplos. La unión selectiva de grasa es de interés puesto que la excreción de ácidos grasos saturados incrementó después del consumo del producto DAMM. El producto resultante del proceso descrito en el Ejemplo 1, de aquí en adelante y, a lo largo del presente documento, también se denomina "producto DAMM" o "Lote 1". La de ácidos grasos monoinsaturados incrementó, aunque con resultados estadísticamente no significativos, mientras que la de los ácidos grasos poliinsaturados no incrementaron.

El efecto ligando de grasa del producto de la invención tambien ha sido demostrado in vivo en seres humanos. Los resultados de un ensayo clínico funcional en seres humanos mostraron una reducción de peso de 0,7 kg y una disminución de la circunferencia de la cintura de 2 cm teniendo en cuenta que el grupo placebo en global mostró un incremento de 1 ,4 Kg después del tratamiento durante 3 meses. Se observó una reducción del 0,82% de grasa corporal total después de consumir el producto. Se observó una redistribución de la grasa en el cuerpo reduciendo su acumulación en la zona abdominal. Esto está relacionado con un beneficio potencial en la reducción de factores de riesgo cardiovascular, hipertensión y diabetes. Con estos resultados se puede inferir que el producto promueve la pérdida de peso, con una reducción global de 2,1 kg de peso y una reducción de la circunferencia de cintura de 2 cm a los 3 meses de tratamiento. Estos resultados son clínicamente relevantes ya que los resultados de disminución de peso y de circunferencia de cintura se obtuvieron en ausencia de dieta restrictiva específica y en un corto periodo de tratamiento (3 meses).

Además del efecto de reducir selectivamente la absorción de grasas de la dieta, la composición de la invención también mostró una biofuncionalidad en el metabolismo de la glucosa. En las pruebas orales de tolerancia de glucosa en un modelo animal, el pico de glucosa en sangre, particularmente en el tiempo inmediatamente postprandial, mostró una reducción en comparación con el control negativo y del mismo orden que el control comercial positivo.

También se ha demostrado que el producto de la invención puede ser utilizado como agente detoxificante ya que captura diferentes tóxicos relevantes: la micotoxina aflatoxina B1, mercurio, bifenilos policlorados (PCB 209) y furano.

Diferentes repeticiones del procedimiento de obtención de la composición resultaron en un producto homogéneo que mantenía las mismas funcionalidades biológicas mencionadas. Así, una ventaja del procedimiento y el producto de la invención es que las propiedades y la utilidad del producto final no dependen de la materia prima, como ocurre con la quitina/quitosano extraídos de crustáceos. Una ventaja adicional y relevante es que mediante el procedimiento de la invención puede obtenerse un material idéntico a lo largo del año, y que la composición extraída está libre de metales pesados tales como níquel, cobre, que están presentes en las composiciones extraídas de crustáceos.

En otra realización, el procedimiento para obtener una composición rica en polisacáridos comprende un segundo tratamiento termoalcalino con el fin de modificar el grado de desacetilación de la quitina. Así, después de neutralizar y separar el producto sólido obtenido de la primera reacción, el producto se somete a un segundo tratamiento con NaOH a una concentración entre 25 y 50% a una temperatura entre 40 y 80 °C y con un tiempo de reacción entre 30 y 240 minutos. Particularmente, el NaOH está a una concentración seleccionada de 25%, 37,5% y 50%. La temperatura de reacción se selecciona entre 40, 60 y 80 °C, y el tiempo se selecciona entre 30, 120, 135 y 240 minutos. Como se muestra en los ejemplos a continuación (sección 7), los productos resultantes de este tratamiento son útiles como agentes de detoxificación, ya que son capaces de capturar diferentes sustancias tóxicas relevantes: la micotoxina aflatoxina B1 , el mercurio, bifenilos policlorados (PCB 209) y el furano.

En otra realización, las fracciones obtenidas de este segundo tratamiento termoalcalino son útiles como agentes inmunoestimulantes, como se muestra en el ejemplo más adelante (sección 7). Concretamente, en un estudio in vivo, los animales suplementados mostraron una mayor capacidad de protección contra infecciones bacterianas, debido a un aumento en el porcentaje de células activadas con actividad oxidativa. Una composición especialmente útil como agente inmunoestimulante es la obtenida por hidrólisis durante 30 minutos con 25% de NaOH a 40 °C del producto de partida tal como se obtuvo por el procedimiento explicado en la sección 1 de los EJEMPLOS.

La invención tambien proporciona productos farmacéuticos y/o veterinarios que comprenden una cantidad efectiva de la composición de la invención, junto con cantidades adecuadas de excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables. A este respecto, el producto farmacéutico se puede preparar para ser administrado por vía oral en forma de comprimidos, píldoras, cápsulas, microcápsulas, gránulos, suspensiones, jarabes, polvos secos, preparaciones líquidas, etc. La selección de los excipientes y los métodos más apropiados para la formulación en vista de la finalidad particular de la composición está dentro del alcance de personas expertas en teenología farmacéutica. Se prefiere la administración oral.

El término "farmacéuticamente aceptable" como se usa en esta descripción, se refiere a compuestos, materiales, composiciones, y/o formas de dosificación que son, dentro del buen criterio médico, adecuadas para uso en contacto con los tejidos de un sujeto (por ejemplo, humano) sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica, u otro problema o complicación, conmensurable con una relación beneficio / riesgo razonable. Cada vehículo, excipiente, etc. también debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación. Vehículos, excipientes, etc. adecuados pueden encontrarse en textos farmacéuticos estándar. Asimismo, el término "veterinario aceptable" significa adecuado para su uso en contacto con los tejidos de un animal no humano.

La composición de la invención puede también incluirse en una variedad de productos comestibles, por ejemplo productos derivados de la leche, yogur, cuajada, queso (por ejemplo, queso fresco, crema, procesados, blandos y duros), leche fermentada, leche en polvo, un producto fermentado a base de leche, un helado, un producto basado en cereal fermentado, polvo a base de leche, bebidas, un apósito, y un alimento para mascotas. El término "producto comestible" se utiliza aquí en su sentido más amplio, incluyendo cualquier tipo de producto, en cualquier forma de presentación, que puede ser ingerido por un animal, pero exceptuando productos farmacéuticos y de veterinaria. Ejemplos de otros productos comestibles son los productos cárnicos (por ejemplo, patés, salchichas de frankfurt y de salami o carne para untar), chocolate para untar, rellenos (por ejemplo, trufa, crema) y glaseados, chocolate, confitería (por ejemplo, caramelo, fondant o toffee), productos de panadería (pasteles, pastas), salsas y sopas, zumos de frutas y blanqueadores de café. Productos comestibles particularmente interesantes incluyen suplementos alimenticios y fórmulas infantiles. En la presente invención, los suplementos alimenticios también incluyen nutracéuticos, que son conocidos como fracciones de alimentos que tienen un efecto medicinal sobre la salud humana. También se incluyen forrajes para alimentación animal en el alcance de la invención. Las composiciones de la invención también podrían ser utilizadas como ingredientes en otros productos de alimentación. Por consiguiente, en otro aspecto de la invención, se proporciona un producto comestible que contiene la composición de la invención junto con cantidades apropiadas de ingredientes comestibles. Preferiblemente, la composición de la invención es un suplemento alimenticio. Si la composición de acuerdo con la invención se utiliza como un suplemento alimenticio, puede administrarse como tal, o puede mezclarse con un líquido potable adecuado, tales como agua, yogur, leche o zumo de frutas, o puede mezclarse con sólidos o alimentos líquidos. En este contexto, el suplemento alimenticio puede estar en forma de comprimidos, píldoras, cápsulas, gránulos, polvos, suspensiones, bolsitas, pastillas, dulces, barras, jarabes y formas correspondientes de la administración, por lo general en forma de dosis unitaria. Preferiblemente, la composición de la invención se administra en forma de polvo en una cápsula o formando una pastilla, fabricada en procedimientos convencionales de preparación de productos farmacéuticos. En otra realización preferida, la composición se presenta en forma de polvo dentro de una tapa de botella para disolverse fácilmente en un líquido potable. Los regímenes de administración adecuados de la composición de la invención pueden ser establecidos por la persona experta en la materia. La composición de la invención puede ser administrada una vez al día, una vez por semana, varios días a la semana o varias veces al día.

La composición de acuerdo con la invención puede formularse como producto comestible, farmacéutico o veterinario, en el que la composición es el único agente activo o ser mezclado con uno o más agentes activos y/o ser mezclado con excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables (en el caso de un producto farmacéutico o veterinario) o aditivos adecuados (en el caso de un producto comestible).

Así, se entiende que un sujeto puede beneficiarse de las funcionalidades del producto de la invención sea cual sea la forma de administración, es decir, como producto comestible, farmacéutico o de veterinaria. Las funciones biológicas son las que se explican en esta descripción, e incluyen los efectos ligando de grasa y su consecuente uso en la prevención y/o tratamiento de una enfermedad como el sobrepeso, la obesidad, la hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, hipertensión arterial y trastornos cardiovasculares. Las biofuncionalidades también incluyen el efecto ligando de glucosa, el efecto detoxificante e inmunoestimulante.

Las siguientes secciones describen el procedimiento de obtención de la composición de la invención en detalle, así como las propiedades de la composición, incluyendo sus efectos ligando de grasa a través de ensayos in vitro, e ¡n vivo en animales y humanos. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitantes de la presente invención. Los resultados obtenidos demuestran que la composición de la invención tiene características mejoradas en comparación con otros productos ligandos de grasa comerciales.

A menos que se defina de otro modo, todos los terminos téenicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto ordinario en la técnica a la que pertenece esta invención. Métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí pueden utilizarse en la práctica de la presente invención. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Los objetos adicionales, ventajas y características de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica después del examen de la descripción o pueden aprenderse por la práctica de la invención. Además, la presente invención cubre todas las combinaciones posibles de realizaciones particulares y preferidas descritas aquí.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La FIG. 1 muestra el análisis 1H-RMN del producto DAMM (figura inferior) en comparación con el producto obtenido anteriormente a escala de laboratorio (C60, figura superior).

La FIG. 2A-2B muestra los difractogramas (rayos X) del producto DAMM (FIG. 2A) y de quitina pura (quitina procedente de caparazón de cangrejo Sigma, C3641) (FIG. 2B).

La FIG. 3 muestra el producto final en forma de polvo fino de color marrón brillante.

La FIG. 4 muestra el análisis 1H-RMN de los productos: Lote 4 (figura superior), Lote 3 (figura central) y Lote 2 (figura inferior).

EJEMPLOS EJEMPLO 1. Procedimiento para obtener la composición rica en polisacáridos ("producto DAMM"! La fuente de Saccharomyces cerevisiae para ser utilizado como material de partida derivaba de ocho usos repetidos en el procedimiento de elaboración de la cerveza. El subproducto del procedimiento de elaboración de la cerveza se tamizó con un tamiz de 1 mm a fin de separar la biomasa de S. cerevisiae a partir de las impurezas del procedimiento de elaboración de la cerveza. La biomasa de S. cerevisiae obtenida se secó en una estufa y fue molida para obtener un polvo.

La humedad de la biomasa de levadura se determinó con un analizador de humedad IR Sartorius MA30. El medio de reacción se preparó cargando el reactor con agua destilada, ajustando la agitación a 150 rpm, añadiendo la cantidad de NaOH necesaria para obtener una solución de NaOH 1 M y luego calentado el medio de reacción a 80 °C. La biomasa de levadura se pesó en una proporción peso seco de biomasa de levadura/medio de reacción de 1/30. La biomasa de levadura se añadió caliente al medio de reacción, y la reacción se mantuvo durante 16 h. Una vez transcurrido el tiempo de reacción, el producto se enfrió hasta temperatura ambiente. Posteriormente, el volumen de reacción se descargó en un recipiente inerte. Las condiciones de operación de centrifugación continua se ajustaron a 120 segundos de tiempo de giro, y 2 segundos de tiempo de descarga. La centrifugación se realizó alimentando la centrífuga (Centrífuga PGE Westfalia CTC 1 (WhisperFugeTM)) con el producto de reacción desde el recipiente, a temperatura ambiente usando una bomba peristáltica (3 L/min de caudal). Después de esta primera centrifugación, el sólido obtenido se recogió en un recipiente y se neutralizó con agua destilada. Para este fin, se añadieron volúmenes de agua destilada consecutivamente, con agitación constante y se controló el pH de la mezcla. El volumen final de la mezcla fue de aproximadamente el 50% del volumen de reacción y el valor de pH entre 9 y 10. El volumen obtenido de la mezcla neutralizada se centrifugó de nuevo, y el procedimiento de neutralización-centrifugación se repitió como se ha descrito anteriormente hasta alcanzar un pH de 7. Cinco ciclos de centrifugación / neutralización fueron suficientes para alcanzar un pH de 7. El producto final a pH 7 se lavó con agua destilada con agitación hasta la desintegración completa del sólido. El volumen final de esta solución fue de aproximadamente el 25% del volumen de reacción. El volumen de la mezcla obtenida se centrifugó de nuevo a temperatura ambiente y con una velocidad de flujo de 3 L/min como se ha descrito anteriormente. El producto obtenido en el anterior paso se concentró por centrifugación discontinua, usando una centrífuga Eppendorf 5804R. Por último, el producto obtenido se secó por atomización (“ spray-dryincf ) con las siguientes condiciones de funcionamiento: Tamaño de la cámara de atomización = ø 1200 x 745 mm; materiales en contacto con el producto = acero inoxidable AIS 316; material exterior: AISI 304; cielón = ø 300; rpm rotativas = 24400 rpm, potencia de rotación = 3,5 kW de rotación, tasa máxima del aire (toma de aire) * 990 m3/h, temperatura máxima de entrada de aire = 250 °C, máxima potencia de tea baterías de entrada de aire = 27 kw; bomba peristáltica para el líquido de entrada: automática / velocidad manual.

El producto resultante del procedimiento descrito en esta sección también se denomina "producto DAMM" o "Lote 1" en los siguientes «iperimentos.

El procedimiento se escaló a escala piloto, variando la concentración de NaOH de 1 M a 0,25 M. Se realizaron ensayos in vitro de capacidad igando de grasa para evaluar el mantenimiento de las biofuncionalidades del producto con la escala, con resultados positivos.

EJEMPLO 2. Caracterización del producto En la FIG. 1 un análisis 1H-RMN mostró que el producto obtenido DAMM a escala piloto (figura inferior) presenta los mismos grupos funcionales en comparación con el producto obtenido anteriormente a escala de laboratorio (figura superior) (este producto se llama "C60" en la figura). La FIG. 2A-2B muestra los difractogramas (rayos X) de producto DAMM (FIG. 2A) y de quitina pura (FIG. 2B). La FIG. 3 muestra la apariencia del producto DAMM.

El análisis químico mostró que el producto DAMM tenía una proporción de quitosano, quitina y beta-glucano de 1:14:116 y un porcentaje de masa atómica de carbono, hidrógeno y nitrógeno de 40,32%, 6,35% y 0,24% respectivamente. La solubilidad del producto a pH 3,5 en agua destilada fue de 710 mg/l.

EJEMPLO 3. Efectos como ligando de grasa: ensayos in vitro de selectividad Los ensayos de unión de grasa y de selectividad en la captura de grasas se realizaron por CGL-MS con los siguientes lípidos: • Aceite de oliva + colesterol (25 mg de colesterol/ml de aceite de oliva) • Aceite de semilla de algodón • Aceite de pescado + ácido elaídico (2,5 mg de ácido elaídico/ml de aceite de pescado) Los argumentos para el uso de estas grasas y no otras fueron los siguientes: - Son mezclas complejas de lípidos, por lo que puede obtenerse información sobre la mayor o menor afinidad para los diferentes tipos de ácidos grasos. Además, la situación está cerca de una ingesta real.

- El uso de aceite de pescado es muy interesante para probar el grado de afinidad para el ácido docosahexaenoico (DHA) y ácido eicosapentanoico (EPA), ya que es interesante evitar su inmovilización debido a sus significativos beneficios para la salud.

- La introducción de colesterol en los ensayos con aceite de oliva proporciona información sobre la capacidad de unir una de las grasas más dañinas de origen animal.

- Con estos productos, se evalúa el grado de afinidad para la captura de un total de 16 ácidos grasos, más o menos beneficiosos o dañinos para la salud cardiovascular.

Los productos ligando de grasa (“ fat-binders analizados fueron el producto DAMM, un quitosano comercial, con grado de desacetilación del 82% de Primex ("Chitoclear", Islandia) ("Q Primex") y un glucano de Laminaría ( Laminaría digitata Sigma, L9634).

El protocolo utilizado fue el siguiente: Se prepararon 12 mL de solución (p/v) a pH 2 con HCI 0,5 M de cada producto ligando de grasa a ensayar. Se añadieron 3 g de lípidos a esta solución y se agitó a 300 rpm durante 3 horas a 37 °C. El pH de la solución se aumentó a continuación con NaOH 0,1 M a un primer pH de 6,2 y luego a un pH máximo de 6,5 y se mantuvo en agitación a 37 °C durante 2,5 h. La solución se centrifugó a 2000 g a 37 °C para separar la grasa no ligada al producto. La grasa no unida se eliminó con una pipeta teniendo cuidado de no aspirar la fase acuosa. La solución se acidificó con HCI 0,5 M para solubilizar el fat-binder y liberar tanta grasa como fuera posible. La fase acuosa se extrajo tres veces con 5 mL de hexano y los tres extractos orgánicos se unieron al final para evaporados a 40 °C en un recipiente pesado. Finalmente, la grasa seca se pesó para cuantificar la cantidad de grasa que los fat-binders eran capaces de unir. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 1.

TABLA 1 El producto DAMM muestra una capacidad ligando de grasa notablemente inferior en comparación con Qs Primex en el caso de aceite de pescado + ácido elaídico. Este resultado es muy relevante ya que es interesante para evitar la inmovilización de los componentes de aceite de pescado (EPA y DHA), ya que son beneficiosos para la salud. En los experimentos de unión selectiva de grasa, se obtuvo un valor final de % mejora. Este valor se obtiene a partir de restar el % de cada ácido graso con el % presente en el control sin tratar. Los resultados se muestran en las TABLAS 2, 3 y 4. El signo es positivo o negativo dependiendo de la salud o toxicidad de cada grasa. En las siguientes tablas, "tr" significa trazas; insat = insaturado; sat = saturado, monoinsat = monoinsaturado; poliinsat = poliinsaturados.

TABLA 2 TABLA 3 TABLA 4 El producto que implica unas mejoras más sustanciales con respecto al perfil lipídico de las ingestas (y por lo tanto de la dieta) es el producto DAMM.

EJEMPLO 4. Efectos como lii in vivo en animales 4.1 Ensayo in vivo en animales Se realizó un estudio en animales para evaluar la capacidad ligando de grasa selectiva. El modelo animal elegido fueron cobayas Dunkin Hartlcy hembra ya que este modelo tiene un perfil de metabolismo lipídico, especialmente en el caso del colesterol HDL, LDL y VLDL, muy similar al perfil humano. Las cobayas eran de 5-6 semanas de edad y 300-400 g de peso. Los animales se dividieron en grupos diferentes, cada uno de n= 8: - Grupo control negativo con celulosa (producto sin capacidad ligando de grasa); - Grupo positivo con salvado de avena Santiveri ® ("Crusca di Avena", fibra soluble, con supuesta capacidad para reducir la absorción de grasas) - Grupo con producto Quitosano S (de bajo peso molecular, kDa 50-1.000, viscosidad baja, GD mínimo 70%, Primex, Islandia) - Grupo con producto Quitosano L (peso molecular elevado, 500-5.000 kDa, GD mínimo 70%, Primex, Islandia) El ensayo duró 35 días que incluyeron 7 días de aclimatación y 28 días de experimentación. Los animales estuvieron en jaulas individuales, con ciclos de 12 h de luz/oscuridad, agua y comida ad libitum. Para maximizar la observación de diferencias, se usó una dieta hipercalórica rica en grasas y azúcares simples: 4.7 kcal vs 3,8 kcal. Para la adición del 12% de cada uno de los productos a ensayar (celulosa / Santiveri ® / DAMM producto / Quitosano S / Quitosano L), se usó una alimentación basal para maximizar los posibles efectos de cada uno de los productos experimentales. Los resultados se muestran en la TABLA 5.

TABLA 5 La eficiencia alimentaria (g/100g) es el aumento de peso del animal en gramos por cada 100 g de alimento ingerido. La eficiencia alimentaria en kcal g/100 es el aumento de peso corporal del animal en gramos por 100 kilocalorías ingeridas. La comparación de los resultados se llevó a cabo a traves de grupos de análisis cruzados. La prueba estadística utilizada fue la comparación múltiple de Duncan (p<0,05). Las muestras con letras diferentes presentan diferencias estadísticamente significativas.

Como puede verse en la TABLA 5, los efectos del producto Quitosano L sobre la ganancia de peso y la eficacia (resultados subrayados) son anormalmente altos, rondando la toxicidad. El Quitosano L causó importantes problemas intestinales en los animales y diarrea. Así, se puede decir que el Quitosano L produce efectos anti-nutricionales no deseables. Este hecho implica que la inclusión de este grupo en el análisis puede enmascarar los resultados. En consecuencia, se decidió excluir el grupo Quitosano L del análisis estadístico.

Los resultados resumidos en la TABLA 5 muestran que los animales alimentados con el producto DAMM presentaron un aumento de peso menor en comparación con los grupos control Santiveri ® y celulosa. La eficiencia energética (g ganados por kcal de alimento ingerido) es el valor que muestra claramente la eficacia del producto en la reducción de la absorción. El valor en kcal elimina las posibles diferencias entre las dietas debido a su composición. Por lo tanto, el producto DAMM disminuyó la absorción de grasa total medida como la eficiencia alimentaria total (g de peso corporal obtenido por cada kcal ingerida), en comparación con la celulosa y el control positivo. El Quitosano S muestra una mayor reducción que el producto DAMM, pero el producto DAMM presenta la desviación más pequeña en los valores. Se puede observar que Santiveri ® y el control negativo tienen un rendimiento similar. 4.2. Análisis de las heces El estudio se continuó analizando las heces, como ratificación de la capacidad de los productos para reducir la absorción de grasas y para dilucidar la capacidad de unirse preferencialmente a una u otra grasa. Los valores que se analizaron fueron: - Producción de heces: interesante para inferir el mecanismo de acción y la molestia potencial para los consumidores - La absorción aparente: calculada como gramos de materia seca absorbidos por 100 g de alimento seco consumido - Excreción total: calculada como gramos de materia seca excretados por 100 gramos de materia seca consumida - Análisis de ácidos grasos en las heces: calculados como concentración de ácidos grasos y cantidad excretada durante las diferentes semanas del experimento.

La comparación de los resultados se llevó a cabo a través de grupos de análisis cruzados. La prueba estadística utilizada fue la comparación múltiple de Duncan (p£0,05). Los resultados se expresan como gramos de heces frescas excretados por cobaya y por día (n = 8) en el caso de excreción, y como gramos de heces en peso seco por cobaya y día (n = 8) en el caso de la material seca. Los resultados se muestran en la TABLA 6.

TABLA 6. Las muestran con diferentes letras presentan diferencias estadísticamente significativas.

El consumo de producto DAMM no implicó un aumento significativo de la excreción fecal de los animales. Extrapolando esto al potencial consumo humano, significa que no habría inconveniente en este sentido. También es importante observar que la materia fecal tenía una buena apariencia. No puede decirse lo mismo en el grupo de Quitosano S (TABLA 6). A la semana, no hubo diferencias estadísticamente significativas en ningún caso. En la semana 1, en "Excreción", el producto DAMM no difirió de cualquier otro grupo. El producto DAMM presentó diferencias en el valor de la materia seca vs el grupo Quitosano S. En la semana 4, el Grupo DAMM, el grupo celulosa y el grupo de Santiveri ® difirió significativamente del grupo Quitosano S. Así, el consumo de pienso con producto DAMM, aunque aumentó ligeramente la excreción, no fue estadísticamente significativo, a diferencia del producto Quitosano S. Éste es un punto interesante, porque el aumento de la excreción de heces no es negativo, pero siempre si se lleva a cabo dentro de los parámetros normales, que no es el caso del producto Quitosano S.

El producto Quitosano S alcanza valores extraordinariamente altos de excreción de materia seca. Este hecho, a diferencia de lo que sucede con el producto DAMM implica que hay un efecto no selectivo, pero por una acción por métodos físicos: el producto Quitosano S no se une a grasa específicamente, sino también a muchos otros nutrientes más. En consecuencia, la excreción se incrementa y la ganancia de peso es inferior. En vista de los altos valores de materia seca obtenida por el grupo Quitosano S, parece claro que su biofuncionalidad es debida al incremento en la viscosidad del bolo alimenticio. Este es un método físico que implica una mayor eliminación de grasa y una posibilidad reducida de absorción. En consecuencia, Quitosano S es un producto sin capacidad ligando de grasa específica que podría dar lugar a efectos antinutricionales.

Dado que los valores en materia seca del control negativo (celulosa), el grupo comercial (Santiveri ®) y el grupo DAMM son muy similares (no significativamente diferentes) y por otro lado, los valores de ganancia de peso, como se muestra, son diferentes, puede inferirse que la excreción de grasa es muy superior en el grupo DAMM. Los valores del grupo Quitosano S reafirman la no especificidad en la excreción como consecuencia de métodos físicos. 4.3. Composición lipídica de las heces Por último, la composición lipídica de las heces de los animales fue analizada para evaluar si había diferencias en relación al grado de excreción de determinados lípidos. El análisis estadístico se realizó de acuerdo a la prueba de comparaciones múltiples de Duncan (p<0,05).

En la semana 0 no hubo diferencias entre grupos, por lo que la línea base fue la misma para todos los estados y cada uno de los grupos. El análisis de ácidos grasos en la semana 4 se muestra en la TABLA 7, donde los resultados se expresan como mg de ácido graso por g de heces y en la TABLA 8, donde los resultados se expresan como mg de ácidos grasos excretados por animal y por día.

TABLA 7: Resultados expresados como mg de ácido graso por g de heces C18:1 trans (suma de ¡someros trans) TAGS: total ácidos grasos saturados AGMI: total ácidos grasos monoinsaturados (no trans) AGPI: total ácidos grasos poliinsaturados (no trans) TAGI: total ácidos grasos insaturados En comparación con el control negativo (celulosa), el producto DAMM mostró valores más altos de ácidos grasos que tienen un efecto negativo potencial para la salud (saturados). Por el contrario, la mayor parte de los ácidos grasos monoinsaturados y poliinsaturados mostraron diferencias significativas.

TABLA 8: resultados expresados en mg de ácido graso excretado por animal y día. , 0,37 0,19 A 0,31 0,11 A 9,07 2,56 B 0,92 0,14 A 22,82 10,90 A 20.40 6,76 A 435,13 113,54 B 33,12 7,58 A 2,43 1,19 A 2,02 0,76 A 28.52 6,75 B 3.76 0,91 A 0,84 0,31 A 0,82 0,25 A 5,54 1,21 B 1,28 0,37 A 26,08 12,35 A 23,24 7,75 A 469,94 121,64 B 38,16 8,79 A 23,74 12.24 A 18,19 6,31 A 589.90 168,87 B 27,90 10,62 A 0,56 0,21 A 0,43 0,13 A 7.52 2,05 B 0,70 0,18 A 24,31 12,44 A 18,62 6,44 A 597,41 170,91 B 28,60 10,76 A 50,39 24,74 A 41,86 14,18 A 1067,36 291,36 B 66.76 19,17 A 440,82 161,82 A 403,33 128,21 A 2090,28 496,10 B 747,45 209,40 A La excreción de ácidos grasos saturados incrementó significativamente después del consumo del producto DAMM. La de ácidos grasos monoinsaturados incrementó, aunque los resultados no fueron estadísticamente significativos, mientras que los ácidos grasos poliinsaturados no incrementaron.

A la vista de los resultados, el producto DAMM implica una mayor excreción de ácidos grasos saturados: C14:0 / C16:0 / 018:0 / C20:0 / C22:0 (ácidos mirístico, palmítico, esteárico, ácidos araquídico y behénico). Esto es positivo porque una reducción en la absorción de ácidos grasos saturados implica una mejora en el perfil nutricional de la dieta. Como consecuencia de esta reducción, se encuentra una reducción estadísticamente significativa de la absorción total de ácidos grasos saturados (TAGS). Respecto al ácido linoleico (C18:2n6) y ácido a-linolénico (C18:3n3), no se observó un incremento estadísticamente significativo en el producto DAMM. Esto representa otra biofuncionalidad interesante para un producto “ fat-bindei selectivo de grasa, ya que los ácidos linoleico y linolénico son ácidos grasos esenciales e importantes para la salud. Para reforzar los valores observados, los resultados confirman que no hay un aumento en la excreción de ácidos grasos poliinsaturados y en el total de insaturados. En cambio, hay una reducción neta en la absorción total de ácidos grasos, de manera que el producto DAMM es un producto que reduce la absorción de grasa, pero no aumenta la excreción de los ácidos grasos que son beneficiosos para la salud.

El producto Santiveri ® tiene un buen rendimiento (similar a la del producto DAMM) por lo que se refiere a la selectividad, como se ve en los resultados estadísticos de los valores expresados como mg de ácidos grasos por gramo de heces. Sin embargo, en los niveles de excreción diaria, su comportamiento no es el deseable: la excreción de sus valores son bajos, lo que explica la falta de efecto que se observa en la eficiencia alimentaria y los valores de aumento de peso. El producto Quitosano S muestra lo contrario de lo reportado para el producto Santiveri ® por lo que se refiere al análisis de ácidos grasos: la capacidad ligando de grasa no es selectiva y un aumento de la excreción de por su alta producción de heces.

EJEMPLO 5. Efectos como ligando de grasa: ensayo clínico funcional en seres humanos El estudio fue un ensayo clínico, aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo, con grupos paralelos, para estudiar la eficacia y seguridad del producto DAMM, como suplemento dietético en el control del peso. El tamaño de la muestra fue de 60 pacientes divididos en dos grupos de estudio paralelos de 30 participantes, uno recibió sustancia activa (producto DAMM) disuelta en agua, mientras que el otro recibió placebo disuelto en agua. Los pacientes reclutados eran adultos con un índice de masa corporal entre el sobrepeso y la obesidad (25-34,99 g/m2), sin trastornos de la alimentación y sin seguir o haber seguido una dieta baja en calorías en los tres meses anteriores. El reclutamiento no fue fácil debido a los requisitos mencionados, los pacientes tenían que ser personas que vinieran como primera consulta y si no, que se supiese con seguridad que no se les había prescrito una dieta o algún tipo de intervención dietética. Las dificultades en el reclutamiento conllevaron un ensayo multicéntrico. El protocolo clínico fue aprobado por el Comité Ético del Hospital Clínic de Barcelona, Centro Clínico Diagnóstico de Madrid y el Instituto Médico Europeo de la Obesidad de Madrid.

El objetivo era demostrar que el consumo del producto DAMM mejoraba el peso (en última instancia, IMC). Con la finalidad de realizar un seguimiento adecuado de la evolución de los pacientes, el estudio fue de 12 semanas (84 días) con una evaluación intermedia a los 42 días. El estudio contó con 60 participantes (11 hombres y 49 mujeres con una edad media de 48 años (22 a 65 años)). 44 de ellos completaron el estudio. De los pacientes que abandonaron el estudio, la mayoría fue por motivos personales. Se dieron recomendaciones dietéticas generales de una dieta sana de tipo mediterránea (eucalórica) a los participantes, los cuales la siguieron durante 1 mes antes del inicio de la fase experimental, teniendo en cuenta las desviaciones de la dieta en las que incurrían. Un análisis ANOVA no resultó en diferencias estadísticamente significativas en las características demográficas o en las características clínicas básales de los participantes. Así, los resultados obtenidos al final del ensayo son el resultado del efecto de producto sin influencias de la distribución de los pacientes.

El producto DAMM se presentó en tapones de rosca adaptable a botellas de líquidos. Los productos objeto de estudio fueron (composición por tapón de rosca): - Producto experimental: 1 g de producto DAMM + 35 mg colorante "caramelina" (E-102/124/132 16%) - Control: placebo: 1 g de celulosa microcristalina + 17,5 mg de colorante (E-102/124/132 16%) Cada sujeto disolvió 2 tapones en una botella de 500 mi de agua y se lo tomó con la comida y disolvió 1 tapón en una botella de 500 mi y se lo tomó con la cena. El procedimiento se repitió diariamente durante 12 semanas. Cada participante realizó 3 visitas al centro de estudio durante la fase experimental, uno a tiempo 0 (visita 0 o línea de base), una visita intermedia y una al final del estudio. En cada visita, se analizaron diferentes parámetros como el peso y la talla, medidas antropométricas (circunferencia cintura y la cadera), porcentaje de grasa corporal (medida por absorciometría de energía dual de rayos X) y análisis de sangre.

TABLA 9. Resultados en peso (kg). DE = Desviación estándar; ESM = Error estándar de la media Comparación intra-grupo: Despues de tomar los productos DAMM durante 3 meses, se observó una reducción del peso de 0,7 kg. La diferencia entre los valores iniciales y finales fue estadísticamente significativa con p = 0,027. En el grupo placebo existieron diferencias estadísticamente significativas, pero para la ganancia de peso, con p = 0,000. Comparación inter-grupos: Comparando las diferencias en el peso de los participantes recibiendo el producto DAMM vs recibiendo placebo, se encontró que estas diferencias fueron estadísticamente significativas con p = 0,000.

TABLA 10. Resultados de perímetro de cintura (cm). DE = Desviación estándar; ESM Error estándar de la media Comparación intra-grupo: Se produjo una disminución en el perímetro de cintura después de tomar el producto DAMM. La diferencia de la reducción de 2 cm en el perímetro de cintura entre los valores iniciales y finales fue estadísticamente significativa con p=0,013. No se observaron diferencias estadísticamente significativas para el grupo placebo.

Comparación entre grupos: Comparando las diferencias en el perímetro de cintura de los participantes que recibieron el producto DAMM vs placebo, se encontró que estas diferencias fueron estadísticamente significativas con p=0,015.

TABLA 11. Resultados de grasa corporal (%) DE = Desviación estándar; ESM = Error estándar de la media Se observó una reducción del 0,82% del total de grasa corporal después de tomar el producto DAMM. Esta disminución tuvo una tendencia a la significación estadística de p = 0,067. No se observaron diferencias estadísticamente significativas en la grasa corporal en el grupo placebo.

Se observó una reducción del 1% de la grasa androide (parte superior del cuerpo) en el grupo de producto DAMM, pero esta diferencia no fue estadísticamente significativa, p=0,101. El producto también disminuyó el porcentaje de grasa corporal, es decir, un 0,8% de la pérdida de grasa corporal y una reducción de casi el 1% de grasa androide. Estos resultados no fueron estadísticamente significativos debido a que el tamaño de la muestra no era lo suficientemente grande como para detectar diferencias entre grupos, pero es clínicamente importante. La reducción de grasa corporal y el porcentaje de grasa androide corresponden a una redistribución de la grasa corporal, lo que reduce su acumulación en la zona abdominal. Esto se relaciona con un posible beneficio en la reducción de factores de riesgo cardiovascular, hipertensión y diabetes. Es probable que pudieran haberse encontrado diferencias significativas con una N mayor. No hubieron variaciones estadísticamente significativas en el perímetro de cadera y en la grasa ginoide (parte inferior del cuerpo) después de tomar el producto de DAMM y en el grupo placebo. Con estos resultados se puede deducir que el producto DAMM promueve la pérdida de peso, con una reducción de aproximadamente 2,1 kg de peso y una reducción del perímetro de cintura de 2 cm a los 3 meses de tratamiento. Estos resultados son clínicamente relevantes ya que los resultados de disminución de peso y de perímetro de cintura se obtuvieron en ausencia de dieta restrictiva específica y en un corto tiempo de tratamiento (3 meses). La encuesta sobre el producto entregado a los participantes reveló que estaban satisfechos con el sabor y el olor agradable del producto.

EJEMPLO 6. Efecto como ligando de glucosa: Prueba oral de tolerancia a la glucosa en un modelo animal Los experimentos de "prueba de tolerancia oral a la glucosa" (OGT) permiten analizar el efecto de ciertos compuestos en respuesta a la ingesta de glucosa. A pesar del nombre ("oral"), los experimentos también pueden ser realizados por la administración intragástrica, como en este caso. El protocolo fue el siguiente: 24 ratas macho Sprague-Dawlcy con peso entre 250-300 g se dejaron en ayuno durante la noche (14 a 16 h). El alimento fue retirado y los animales fueron trasladados a jaulas limpias para evitar la ingesta de materia fecal. El agua fue administrada ad libitum durante todo el experimento. El día del experimento, después del ayuno, los animales fueron pesados. Los compuestos a ensayar se mezclaron en dosis predeterminadas con la dosis de glucosa elegida para finalmente administras ¡ntragástricamente 1 mi de tratamiento / 200 g animal (es decir, 2 g. glucosa / kg de animal). La goma guar se utilizó como control positivo debido a que es un ligando de glucosa reconocido. Los grupos de ensayo fueron los siguientes: - Control positivo: goma guar (6 mg/ml) + glucosa (400 mg/ml) a 1 mi por 200 g de animal, n=8 - Control negativo: glucosa (400 mg/ml a 1 mi por 200 g de animal), n=8 - Grupo DAMM: producto DAMM (6 mg/ml) + glucosa (400 mg/ml a 1 mi por 200 g de animal), n=8 Una vez preparadas las soluciones, se determinó el valor de la glucemia basal de todos los animales (correspondiente a tiempo 0) utilizando un Glucometer® Elite. Los diferentes tratamientos se administraron por vía intragástrica a cada grupo de animales. El cronómetro se activó después de la administración al primer animal en cada grupo. Los niveles de glucosa se determinaron en tiempo 15, 30, 60 y 120 min. Después de la última medición de la glucemia, se restauró la alimentación de los animales, de acuerdo con las instrucciones del Comité Ético.

TABLA 12. Resultados expresados como media en mg/dL ± DE.; AUC significa área incremental bajo la curva; los resultados en la misma línea con diferentes letras presentan diferencias basadas en el test multivariable Duncan con p<0,05.

Las diferencias entre los valores observados en los primeros puntos de la cinética mostraron significación estadística: éste es el punto más interesante en la detección de diferencias entre los grupos, ya que es el pico donde el aumento en la concentración de glucosa vs. el punto anterior (línea base) es más pronunciada. En este tiempo postprandial es donde los picos de glucosa muestran un mayor incremento y, por lo tanto, representan un riesgo para la salud. Sin lograr una significación estadística, se puede ver claramente que en los tiempos 90 y 120 min hay una inversión en las posiciones relativas de las curvas del control positivo y el producto DAMM.

El producto DAMM no muestra un efecto mayor en la reducción de glucosa con respecto al control positivo de goma guar, pero los resultados son satisfactorios, porque el producto DAMM es capaz de controlar los niveles de glucosa. El producto DAMM tiene una ventaja importante sobre la goma de guar ya que este último incrementa muy significativamente la viscosidad de las soluciones, por lo que el "atrapamiento mecánico" que sufre la glucosa explica esta reducción en el pico de sangre. Por el contrario, el producto DAMM no altera la viscosidad de una solución, lo que representa un hecho muy importante en la teenología alimentaria. El producto es adecuado para los diabéticos ya que el pico de glucosa es inferior y para los deportes ya que el pico es más sostenido en el tiempo. EJEMPLO 7. Efecto detoxificante Se analizó el poder secuestrante del producto DAMM frente a diferentes tóxicos. También se ensayaron diferentes fracciones obtenidas a partir de un segundo tratamiento termoalcalino del producto DAMM para determinar su capacidad detoxificante. El nombre de cada fracción indica las condiciones específicas de tratamiento de dicho tratamiento termoalcalino secundario. Para todos los casos, el % de compuesto secuestrado se determinó utilizando el siguiente cálculo: % de compuesto secuestrado = 100 (1-XFx / Xref) x 100 XFx es la concentración de compuesto experimental para cada fracción x, y Xref es la concentración teórica del compuesto. La cantidad de compuesto secuestrado por mg de la fracción de producto DAMM se determinó mediante la siguiente fórmula: (Xref - XFX) x Vx / Mr X = ng compuesto secuestrado / mg de fracción de producto DAMM Vx es el volumen de la fracción y el Mr el peso molecular del compuesto ensayado. 7.1. Análisis de la aflatoxina B1 La aflatoxina B1 (AFB1) es un subtipo de micotoxina producida por los miembros del genero Aspergillus como Aspergillus flavus y Aspergillus parasiticus. Puede ser un contaminante de varios alimentos. El metabolismo de AFB1 da lugar a uno de los más potentes carcinógenos. Para el análisis, cada una de las fracciones de producto DAMM se dispensó (en experimentos independientes) en un tubo de ensayo a una concentración de 1 mg/ml en agua destilada. 0,9 mi de solución estándar de AFB1 (0,9 mg de AFB1) fueron añadidos a un volumen final de 17,9 mL. La concentración final teórica de AFB1 en la suspensión de la prueba fue de 50,3 mg/mL (50,3 ppm). Se prepararon tres tubos idénticos como controles sin la adición de fracciones de productos DAMM. La mezcla se incubó a 37 °C con agitación a 300 rpm durante 3 horas. A continuación el producto se filtró a través de una jeringa de 0,45 mm de diámetro de poro. El AFB1 finalmente secuestrado se determinó por HPLC-FD. 7.2. Análisis de mercurio (Ha) Cada una de las fracciones fue dispensada (en dos repeticiones) en un tubo de ensayo a una concentración de 1 mg/mL en agua destilada (20 mg de cada fracción con 19 mL de agua destilada). A continuación, 1 mi de solución de cloruro de mercurio (0,560 mg de Hg) se añadió alcanzando un volumen final de solución de ensayo de 20 mi. La concentración teórica final de Hg en la solución de ensayo fue 28,00 pg/ml (28,00ppm). Se prepararon tres tubos idénticos como controles sin la adición de fracciones de producto DAMM. La mezcla se incubó a 37 °C con agitación a 300 rpm durante 3 horas. A continuación el producto se filtró a través de una jeringa de 0,45 pm diámetro de poro. Se determinó el Hg finalmente secuestrado. Los valores de Hg secuestrado fueron sorprendentemente buenos, como se muestra en la TABLA 13. 7.3. Bifenilos policlorados Se decidió utilizar el compuesto PCB 209 (decaclorobifenilo) como modelo de los bifenilos policlorados (PCB) en el medio ambiente por ser uno de los más abundantes y tóxicos. Cada una de las fracciones fue dispensada (dos repeticiones) en un tubo de ensayo a una concentración de 1 mg/ml en diclorometano (10 mg de cada fracción con 10 mL de diclorometano). 0,1 mi de solución stock de PCB 209 (55 mg PCB 209) se añadieron a la solución anterior. La concentración teórica final de PCB 209 en la solución de ensayo fue de 5,5 mg/ml. Se prepararon tres tubos identicos como controles sin la adición de fracciones de producto DAMM. La mezcla se incubó a 30 °C con agitación a 300 rpm durante 3 horas. Entonces el producto se filtró a través de una jeringa de 0,45 mm de diámetro de poro. Finalmente se determinó el PCB 209 secuestrado. 7.4. Furanos Cada una de las fracciones fue dispensada (en experimentos independientes) en un tubo de ensayo a una concentración de 1 mg/mL en diclorometano (10 mg de cada fracción con 10 mL de diclorometano). 0,1 mL de solución madre de furano (55 pg furano) se añadió a la solución anterior. La concentración teórica final de furano en la solución de ensayo fue de 5,5 pg/ml. Tres tubos idénticos se prepararon como controles sin la adición de fracciones de productos DAMM. La mezcla se incubó a 30 °C con agitación a 300 rpm durante 3 horas. Entonces el producto se filtró a través de una jeringa de 0,45 pm de diámetro de poro. Finalmente se determinó el furano secuestrado. Los resultados para todos los tóxicos analizados se muestran en la TABLA 13.

TABLA 13 Como puede verse en la tabla no todas las fracciones se probaron con todas las sustancias tóxicas. A pesar de ello, no pueden ser descartadas porque pueden ser interesantes por ser activas frente a una sustancia tóxica en particular. Por ejemplo, la fracción 4 es muy buena para AFB1 y Hg, las fracciones 8, 10,15, 19 y 20 son activas contra la AFB1 y muy buenas para Hg, y las fracciones 12, 13, 14, 17 y 18 no presentan captura de AFB1 , pero para Hg la captura es muy buena. 7.6. Biodisponibilidad de las fracciones Además de un efecto detoxificante, el siguiente punto fue verificar la idoneidad de estas fracciones para el uso deseado: evitar la absorción de toxinas presentes en los alimentos. Con esta finalidad, se probó que tenían una baja biodisponibilidad a la hora de ser absorbidas por el epitelio intestinal. La evaluación se realizó en placas de Transwell con un metodo basado en la diferenciación de las células M en un modelo de células Caco-2 por inducción de proteínas MIF (factor inhibidor de la migración).

Preparación de las células M Las células Caco-2 se cultivaron en placas Transwell. Las células fueron creciendo durante 14 días a 37 °C, y 5% de CO2 hasta la diferenciación total. La resistencia transepitelial (TEER) se monitorizó durante el crecimiento hasta un valor de 250 Q.cm2 momento en el cual se añadió la proteína MIF a una concentración de 0,3 mg/mL de sobrenadante. Se incubó durante 5 horas a 37 °C y C02 al 5%.

Mareaje con DTAF (diclorotriazilaminofluoresceina) de las fracciones del producto DAMM Las fracciones se molieron primero hasta obtener un polvo fino. 20-25 mg de polvo se diluyeron en 1 mL de tampón borato a pH 9. La mezcla se sometió a ultrasonidos durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añadió 1 mL DTAF (1 mg/mL) y se mantuvieron en agitación constante durante toda la noche. La solución final se centrifugó a 4000 rpm durante 10 minutos y se realizaron lavados consecutivos con 5 mL de PBS.

Las diferentes fracciones marcadas se añadieron a la parte superior de las placas Transwell y se incubaron durante 3 h.

La determinación se realizó con un fluorímetro en modo “well-scanning” (escaneado del pocilio) a 520 (Em) -490 (Ex). Se utilizaron las diluciones 1/50 y 1/100 para cada una de las fracciones. El análisis se realizó por duplicado obteniendo un valor promedio. En cada caso, se evaluó el % de penetración de la fracción en el modelo de epitelio intestinal. Los resultados sobre la biodisponibilidad junto con los resultados de captura anteriores se muestran en la TABLA 14.

TABLA 14 Hay un solapamiento significativo entre las fracciones que muestran una captura mayor y una menor absorción, lo cual es ideal para los fines de detoxificación.

EJEMPLO 8. Efecto inmunoestimulante Se realizaron una serie de experimentos para determinar el efecto del producto sobre el sistema inmune: - "Phage-tesf: determinación cuantitativa de la actividad fagocítica de los monocitos y granulocitos en sangre heparinizada.

- "Burst-test": determinación de la actividad oxidativa de los monocitos y granulocitos en sangre heparinizada.

Se dividieron ratas Wistar en dos grupos, cada uno de n= 8; uno con el producto experimental y el otro con un control. El producto experimental fue la fracción 2 de la anterior sección 7 obtenido por hidrólisis durante 30 minutos con 25% de NaOH a 40 °C. El ensayo duró tres semanas. Las ratas se mantuvieron en ciclos de 12 h de luz/ oscuridad, con comida y bebida ad libitum. La dieta base fue la misma, y fueron modificadas con el producto a ensayar: - Dieta control: dieta estándar para ratas (Teklad Global Diet, 2014); - Dieta experimental: dieta estándar para ratas (Teklad Global Diet, 2014) suplementada con 1,2 g del producto experimental. La dosis fue de 100 mg de producto experimental inmunoestimulante/kg animal (30 mg/día) Durante la experimentación se controló regularmente el peso del animal y alimento consumido, junto con los valores indicativos del estado del sistema inmunitario en cada uno de los grupos. La toma de muestras se llevó a cabo en los días 0 y 12 (duración total de 22 días) anestesiando a los animales con isoflurano y extrayendo una muestra de sangre de la vena safena. Los animales fueron anestesiados y sacrificados el último día, obteniendo el máximo volumen de sangre por punción cardiaca. 8.1. Phaqe-test La prueba de fagocitosis (Phage-test) permite la determinación del porcentaje de linfocitos que muestran capacidad fagocítica y el número de bacterias fagocitadas por cada linfocito que expresa dicha actividad. 100 mL de sangre se enfriaron a 0 °C en un baño de hielo y se añadieron 20 pL de una suspensión enfriada de Escherichia coli marcada fluorescentemente. Las muestras fueron incubadas a 37 °C en un baño de agua durante 10 min. Luego se enfriaron las muestras. Se añadieron 100 pL de solución quelante para eliminar las bacterias no internalizadas pero que quedaban adheridas a la superficie celular. Se añadieron 3 mL de solución tampón de lavado y las muestras se centrifugaron 5 min a 250 g a 4 °C. Se descartó el sobrenadante y se añadió tampón de lisis. Las muestras fueron incubadas para eliminar células no inmunes. 200 pL de solución marcadora de ADN se añadieron a la fracción de células de la serie blanca obtenidas. Después de menos de 1 h de mareaje, las células se analizaron por citometría de flujo. El mareaje de ADN de las células leucocitarias, que emite fluorescencia en el rango rojo, permitió distinguir los eventos (células) que eran leucocitos de otros. Utilizando las propiedades de refracción de luz de cada tipo de célula se dibujó un histograma se puede distinguir los neutrófilos y los monocitos. Los resultados obtenidos en el Phage-test se muestran en la TABLA 15.

TABLA 15. Resultados del Phage-test Los resultados del Día 0 no estaban disponibles debido a la insuficiente cantidad de sangre. Los resultados se expresan como media ± DE para n = 3 (las muestras de sangre se juntaron en un pool debido a la insuficiente cantidad de muestra) en el día 12 y n = 9 a 22 días. Las muestras del mismo día y en la misma columna que muestran letras diferentes presentan diferencias estadísticamente significativas (p<0,05).

Se puede observar que el número de muestras para el día 12 no era lo suficientemente elevado como para establecer diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos en cuanto a número de células. Sin embargo, se observa significación estadística en el grupo experimental en el aumento de la fluorescencia media de los neutrófilos y monocitos en relación con la muestra control. En el día 22, no hubo diferencia en el porcentaje de neutrófilos y monocitos estimulados, es decir, el número de células que son capaces de mostrar actividad fagocítica. Con respecto a los monocitos, el producto experimental incrementó significativamente su actividad en relación con el grupo control (p<0,01). En consecuencia, el porcentaje de monocitos que muestran capacidad fagocítica no es diferente entre tratamientos, pero los monocitos de los animales alimentados con el producto experimental muestran la capacidad de fagocitar o ingerir una mayor cantidad de bacterias E. coli por monocito estimulado. 8.2. Burst-test El “Burst-test” permite determinar la capacidad de las celulas del sistema inmune de expresar actividad oxidativa, es decir, el potencial de eliminar las partículas estimulantes utilizando mecanismos dependientes de oxígeno.

Para cada muestra, se añadieron 100 mI de sangre en 3 tubos diferentes, los cuales se enfriaron en un baño de hielo a 0 °C. Se añadieron 20 mL de solución tampón (control negativo) a uno de los 3 tubos mientras que se añadieron diferentes partículas estimulantes de la actividad oxidativa en los otros tubos: partículas de E. Coli y un ligando de C-forbol 13-miristato 12 acetato proteína quinasa (PMA) como control alto. Las muestras se mezclaron y se incubaron a 37 °C en un bario de agua durante 10 min. Se añadieron 20 pL de sustrato dehidrorodamina 123 (DHR) que puede ser oxidado dando fluorescencia verde. Fueron incubadas 10 minutos más. Se añadieron 2 mL de solución de lisis y las muestras se incubaron a 25 °C para eliminar los eritrocitos. Se lavó con tampón. Se añadieron 200 pL de solución marcadora de ADN a la fracción de células blancas obtenidas. Después de menos de 1 h de mareaje, las células se analizaron por citometría de flujo. El tamaño de la muestra en los días 0 y 12 no era lo suficientemente grande como para determinar diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos. En consecuencia, el análisis de datos se centra principalmente en el último día de tratamiento.

En base a los resultados, cuando se utilizó la estimulación alta (PMA) no se observaron diferencias significativas en la actividad de los neutrófilos. Sin embargo, en el grupo experimental hubo una tendencia a aumentar la intensidad de la fluorescencia detectada en monocitos, lo que indica una tendencia a aumentar su actividad. Cuando las muestras fueron sometidas a un estímulo particulado [E. coli ), los animales alimentados con el producto experimental mostraron una ligera pero no significativa tendencia a aumentar el porcentaje de neutrófilos que muestran capacidad oxidativa. En relación a los monocitos, el grupo experimental mostró un mayor porcentaje de celulas que muestran capacidad oxidativa (p <0,05). En consecuencia, como en el Phage-test, el consumo del producto experimental funciona principalmente aumentando la respuesta de los monocitos. Los resultados obtenidos en el Burst-test se muestran en la TABLA 16.

TABLA 16. Resultados de Burst-test, día 22, para partículas E. coli En conclusión, el producto experimental tuvo un efecto significativo en el aumento de la respuesta inmune. Esta actividad se centró principalmente en la capacidad del producto de aumentar la respuesta de los monocitos en contra de un potencial proceso infeccioso. Su consumo implica una tendencia a aumentar la actividad fagocítica de los neutrófilos y un incremento estadísticamente significativo en la actividad fagocítica de los monocitos. No aumenta la proporción de leucocitos que expresan la actividad, pero los que la expresan tienen la capacidad de ingerir un mayor número de patógenos. El producto aumenta la proporción de monocitos que expresan actividad oxidativa cuando se someten a un estímulo particulado como E. coli. Por lo tanto, el producto aumentó la cantidad de bacterias ingeridas por los monocitos, lo que puede permitir un mayor número de monocitos que expresan actividad oxidativa. La extrapolación a consumo humano para detectar las mismas biofuncionalidades sería de 5-6 gramos al día.

EJEMPLO 9. Escalado industrial Se obtuvieron diferentes lotes de producto mediante procedimiento industrial y se compararon con el obtenido como se describe en el EJEMPLO 1 (“Producto DAMM” y al cual se hace referencia aquí como Lote 1) Para el escalado industrial, se utilizó como materia prima la biomasa húmeda de Saccharomyces cerevisiae subproducto del procedimiento de elaboración de la cerveza. 9.1. Lote 2 La cantidad de materia seca en la biomasa húmeda fue de aproximadamente el 17% despues de secar el producto a 105 °C. De este 17%, un 13% corresponde a sólidos insolubles (células de Saccharomyces cerevisiae ) y un 4% corresponde a sólidos solubles.

El medio de reacción se preparó cargando el reactor con 300 kg de agua destilada y añadiendo 4 Kg de NaOH. Cien kilogramos de biomasa húmeda se añadió al medio de reacción, de manera que la relación biomasa húmeda:medio de reacción fue de 1:3. Teniendo en cuenta que la biomasa húmeda contenía un 13% de levadura, la relación sería 1:39 si se expresase como levadura seca: medio de reacción. La concentración final de NaOH fue de 0,25 M.

La mezcla se calentó hasta 80 °C y se dejó reaccionar con agitación constante a esta temperatura durante 16 h. Una vez transcurrido el tiempo de reacción, el producto se enfrió hasta temperatura ambiente. La mezcla se centrifugó para separar la fracción insoluble del medio básico utilizando una cetrífuga Gea Westfalia (modelo SC 6-01-576, Hidrostop). La centrifugación se realizó a una velocidad de flujo entre 100 y 300 l/h. El residuo resultante fue resuspendido nuevamente con 370 I de agua destilada y neutralizado añadiendo HCI 3 M hasta pH=7.1. Posteriormente, la mezcla se centrifugó como se describe anteriormente. El residuo se lavó finalmente añadiendo 360 I de agua y centrifugando. El residuo obtenido se secó por spray-drying. Con esta finalidad, se mantuvo una suspensión acuosa en el atomizador añadiendo 4,5 I de agua y agitando constantemente durante el procedimiento. Las temperaturas de entrada y de salida fueron de 180 °C y 93-94 °C, respectivamente. El producto resultante de este procedimiento fue un polvo fino, referido aquí como Lote 2. 9.2. Lote 3 El producto se obtuvo siguiendo el procedimiento para el Lote 2 con modificaciones menores. Concretamente, después de la hidrólisis a NaOH 0,25 M a 80 °C durante 16h, la mezcla fue directamente neutralizada añadiendo HCI 3 M (sin la primera centrifugación de la mezcla de reacción). Después de la neutralización, la mezcla fue centrifugada como se describe con anterioridad. Por lo tanto, en comparación al Lote 2 el procedimiento permitió obviar un paso de centrifugación optimizando los costes industríales. Al producto resultante se hace referencia aquí como Lote 3. 9.3. Lote 4 La cantidad de materia seca en la biomasa húmeda fue aproximadamente del 18%. De este 18%, un 11% corresponde a sólidos insolubles (células de Saccharomyces cerevisiae ) y un 7% a sólidos solubles.

El producto se obtuvo como se describe para el Lote 3 con modificaciones menores. El medio de reacción se preparó cargando el reactor con 300 kg de agua destilada, y añadiendo 5,7 kg de NaOH. Se utilizaron 143 kg de biomasa húmeda en lugar de 100 kg. Se añadieron al medio de reacción de manera que la relación biomasa húmeda: medio de reacción fue de 1:2. Teniendo en cuenta que la biomasa húmeda contenía un 11% de levadura, la relación sería 1 :23 si se expresa como levadura seca: medio de reacción. La concentración final de NaOH fue 0,32 M. El tiempo de hidrólisis se redujo de 16 a 10 h. Por lo tanto, en comparación al Lote 3 el procedimiento supuso una reducción del tiempo de hidrólisis. Al producto resultante se refiere aquí como Lote 4. 9.4. Caracterización del producto La fibra alimentaria se determinó siguiendo el método oficial AOAC 991.43 (AOAC Official Method 991.43. Total, Soluble and Insoluble Dietary Fiber in foods. Enzymatio-Gravimetric Method, MES-TRIS Buffer). Los azúcares simples se cuantificaron por HPLC con un detector de índice de refracción. Los resultados se muestran en la TABLA 17.

TABLA 17 (% por peso seco) Los glucanos se determinaron siguiendo el método con referencia K-YBGL 07/11 usando el kit de Megazyme, el cual se describe a continuación. Los reactivos utilizados en este método fueron: Botella 1: suspensión de exo-1,3- -glucanasa (100 U/ml) más b-glucosidasa (20 U/mL), 2,0 mi. 8 mi de tampón acetato de sodio 200 mM (pH 5.0) se añadieron a la botella 1 (esto es, diluyendo los contenidos del vial en 10 mi). Se dividieron en alícuotas de volumen apropiado y se almacenaron en tubos de polipropileno a - 20°C en hielo durante su uso. Botella 2: Solución de amiloglucosidasa (1630 U/ml) más ¡nvertasa (500 U/ml) en 50% v/v de glicerol, 20 mi.

Botella 3: Tampón de reacción GOPOD. Tampón (48 mi, pH 7,4), ácido p-hidroxibenzoico y azida sódica (0,4% p/v). Los contenidos de la botella 3 se diluyeron hasta 1 ,01 con agua destilada o desionizada.

Botella 4: Enzimas reactivos GOPOD. Glucosa oxidasa más peroxidasa y 4-aminoantipirina. Los contenidos de la botella 4 fueron disueltos en los contenidos diluidos de la botella 3 (ver reactivo precedente). Esta mezcla reactiva (reactivo GOPOD) se dividió luego en alícuotas de volumen deseado para su almacenamiento.

Botella 5: Solución estándar de D-glucosa (5 mi, 1 ,00 mg/ml) en ácido benzoico 0,2% p/v. Botella 6: Preparación control de b-glucano de levadura (~2 g de contenido de b-glucano según etiqueta de la botella).

Determinación de glucanos totales (a-glucanos+ b-glucanos) más D-glucosa en oliaosacáridos, sacarosa v D-glucosa libre. (a) Solubilización e hidrólisis parcial de glucanos totales: las muestras se molieron para cribarlas a través de 0.5 mm utilizando un molinillo centrífugo Retsch. Se añadió la muestra molida (100 mg) a un tubo de cultivo Fisher Brand 20 x 125 mm. Se dieron golpecitos al tubo para asegurar que toda la muestra caía en la base del tubo. Se añadieron 1,5 mi de HCI concentrado (37% v/v) a cada tubo, se taparon los tubos y agitaron vigorosamente en un vórtex. Los tubos se colocaron en un baño de agua a 30 °C durante 45 min y se agitaron en un vórtex cada 15 min (para asegurar la completa disolución del b-glucano). Se añadieron 10 mi de agua a cada tubo, se cerraron los tubos y agitaron en un vórtex. Se aflojaron los tubos y se situaron en un baño de agua hirviendo (~ 100°C). Después de 5 minutos se apretaron los tapones y se continuaron incubando durante 2 horas. Los tubos se enfriaron a temperatura ambiente, se aflojaron cuidadosamente los tapones y se añadieron 10 mi de KOH 2 N. Los contenidos de cada tubo se transfirieron cuantitativamente a frascos volumétricos de 100 mi utilizando tampón acetato de sodio 200 mM (pH 5,0) para lavar los tubos, y ajustar el volumen. Se mezcló completamente por inversión. Una alícuota de cada suspensión se centrifugó a 1500 g durante 10 min. (b) Determinación de glucanos totales más D-glucosa en sacarosa y D-glucosa libre. Alícuotas de 0,1 mi (por duplicado) de extractos centrifugados se transfirieron al fondo de tubos de vidrio (16 x 100 mm). 0,1 mi de la mezcla de exo-1,3-p-glucanasa (20 U/ml) más b-glucosidasa (4 U/ml) en tampón acetato de sodio 200 mM (pH 5,0) se añadieron al fondo de cada tubo, los tubos se mezclaron en un vórtex e incubaron a 40 °C durante 60 min. 3,0 mi de mezcla de glucosa oxidasa/peroxidasa se añadieron a cada tubo e incubaron a 40 °C durante 20 min. La absorbencia de todas las diluciones se midió a 510 nm frente a un blanco de reactivo.

Determinación de a-qlucanos más D-glucosa en sacarosa v D-glucosa.

Se añadió muestra molida (100 mg) a tubos de cultivo Fisher Brand 20 x 125 mm. Se dieron golpecitos a los tubos para asegurar que toda la muestra caía en el fondo del tubo. Se añadió una barrita magnética agitadora (5 x 15 mm) seguida de 2 mi de KOH 2 M a cada tubo y los pellets fueron resuspendidos agitando aprox. 20 min en un baño de hielo/agua sobre un agitador magnético. Se añadieron 8 mi de tampón acetato de sodio 1,2 M (pH 3,8) a cada tubo con agitación. Inmediatamente, se añadieron 0,2 mi de amiloglucosidasa (1630 U/ml) más invertasa (500 U/ml), se mezcló bien y se colocaron los tubos en un baño de agua a 40 °C. Los tubos se incubaron a 40 °C durante 30 minutos mezclando intermitentemente con un vórtex. Los contenidos de cada tubo fueron cuantitativamente transferidos a un frasco volumétrico de 100 mi y ajustando el volumen con agua. Se mezcló bien y una alícuota de la solución fue centrifugada a 1500 g durante 10 min.

El blanco de reactivo consistió en 0,2 mi de tampón acetato de sodio (200 mM, pH 5,0) + 3,0 mi de reactivo glucosa oxidasa/peroxidasa. El patrón de D-glucosa consistió en 0,1 mi de patrón D-glucosa (1 mg/ml) + 0,1 mi de tampón acetato de sodio (200 mM, pH 5,0) + 3,0 mi de reactivo glucosa oxidasa/peroxidasa.

Cálculos Glucanos totales (% p/p)= DE x F x 100/0.1 x 1/1000 x 100/W x 162/180 = DE x F/W x 90. a-Glucanos (% p/p) = DE x F x 1000 x 1/1000 x 100/W x 162/180 = DE x F/W x 90 (volumen final 100 mi) = DE x F/W x 9.27 (volumen final 10.3 mi) b-Glucanos = Glucanos totales - a-Glucanos donde: DE = absorbencia de la reacción -absorbancia del blanco.

F = factor para convertir la absorbancia a mg de la D-glucosa= 100 (pg de patrón D-glucosa)/absorbancia GOPOD para 100 pg de patrón D-glucosa. 100/0,1 = factor de corrección de volumen; para glucanos totales (levadura), (se analizaron 0.1 mL de los 100 mi) 1000 = factor de corrección de volumen, para a-glucanos (se analizaron 0.1 mL de los 100 mi). 1/1000 = conversión de pg a miligramos. 100/W = conversión a 100 mg de muestra (es decir, como de % p/p).

W = peso de muestra analizado 162/180 = factor para convertir la D-glucosa libre, como se determina, a anhidroglucosa, como se encuentra en b-glucanos.

Los resultados se muestran en la TABLA 18. Debe tenerse en cuenta que el metodo enzimático puede cuantificar la glucosa procedente de otros oligosacáridos no-glucanos, aunque los resultados se muestran como % total de glucanos.

TABLA 18 (% de peso seco) Los b-glucanos (1-3, 1-6) se incluyen dentro de la categoría de “fibra alimentaria” porque son polisacáridos no-digeribles. Esta categoría también incluiría quitina/quitosano, entre otros. Por el contrario, los a-glucanos son polisacáridos digeribles y por lo tanto no se incluyen en “fibra alimentaria”. La cantidad de azúcares simples es negligible en todos los lotes. En el Lote 3 donde el producto fue neutralizado antes de la primera centrifugación, el contenido en b-glucanos se mantiene en comparación al Lote 2 pero se extraen menos a-glucanos. Esto no es problemático dado que la biofuncionalidad del producto se atribuye a la fibra alimentaria que incluye b-glucanos y quitina/quitosano.

Composición elemental (media de 3 replicados) Lote 2: 0,27% N, 42,99% C, 6,67% H Lote 3: 0,50% N, 43,79% C, 6,77% H Lote 4: 0,75% N, 42,82% C, 6,83% H Los valores son del mismo orden que los obtenidos a través de diferentes procedimientos. 1 mg de muestra se sometió a combustión a 1200 °C y analizó con un microanalizador.

RMNs El espectro de 1H-RMNs se obtuvo disolviendo la muestra en D20 a una concentración de 20 mg/ml y se acidificaron con 30 mI de DCI para disolver completamente las muestras. 5 pl de una solución de TMSP (20 mg/ml en D20) se añadieron como referencia interna (0 ppm). El espectro se realizó a 70 °C para evitar el solapamiento de la señal de agua con la H1 de la señal del quitosano. Se utilizó un Bruker Avance 600 MHz con las siguientes condiciones de análisis: zgpr (pulso de 90 con presaturación de la señal de agua), número de acumulaciones: 128; ancho del espectro: 12 ppm; presaturación 2-4.

La FIG. 4 muestra el espectro de NMR de los Lotes 2, 3 y 4. La región entre 3,5-4 ppm muestra todos los picos asociados con los protones de polisacáridos (glucano, quitina, quitosano), lo cuales son los más intensos en el espectro, dado que son los principales componentes del producto. El H1 del quitosano tambien puede verse en todos los espectros alrededor de 5,3 ppm. La señal de protón beta puede verse justo antes de la señal de agua y la de alfa protón después de la señal de agua. En esta área del espectro, las señales son muy similares en intensidad, de manera que la proporción de los diferentes polisacáridos en los tres lotes debería ser muy similar. Al mismo tiempo, los espectros coinciden con el espectro RMN del Lote 1 (FIG. 1).

REFERENCIAS CITADAS EN LA SOLICITUD N. Nwe et al. 2010, “Production of fungal chitosan by enzymatic method and applications ¡n plant tissue culture and tissue engineering: 11 years of our progress, present situation and future prospects” Biopolymers, edited by Magdy Elnashar, Publicado: Setiembre 28, 2010, capítulo 7 pp. 135-162 H. Yao et al., “Effect of chitosan on plasma lipids, hepatic lipids, and fecal bile acid in hamsters human triáis failed to show these effects” J. Food Drug Anal. 2006, vol. 14, pp. 183-189 M.D. Gades et al., “Chitosan supplementation and fat absorption in men and women” J. Am. Diet. Assoc. 2005, vol. 105, pp. 72-77 C.N. Mhurchu et al., “Effect of chitosan on weight loss in overweight and obese individuáis: a systematic review of randomized controlled triáis” Obes. Rev. 2005, vol. 6, pp. 35-42 K. Zhou et al., “ In vitro binding of bile acids and triglycerides by selected chitosan preparations and their physico-chemical properties” Food Science and Technology 2006, vol. 39, pp. 1087-1092 EP1483299 WO 91/03495 US 4810646

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para obtener una composición que comprende beta-glucano, quitina y quitosano, extraídos de la pared celular de Saccharomyces cerevisiae a partir de biomasa subproducto resultante de un procedimiento de elaboración de la cerveza, que comprende los siguientes pasos: i) preparar un reactor con una solución de NaOH a una concentración entre 0,25 y 3 M con agitación y una temperatura entre 50 y 95 °C; ii) añadir ia biomasa resultante del procedimiento de elaboración de la cerveza a la solución; iii) mantener las condiciones durante al menos 1 hora; iv) enfriar la solución hasta temperatura ambiente; v) neutralizar la solución con al menos una adición de solución ácida o de agua, hasta alcanzar pH 7, donde cuando se hace más de una adición, se realiza un paso de separación del producto sólido de la solución entre adiciones; vi) separar el producto sólido obtenido del paso (v) de la solución; vii) cuando la neutralización del paso (v) se ha hecho mediante la adición de una solución ácida, se somete el producto sólido a por lo menos un lavado con agua y separando el producto sólido obtenido; y viii) secar el producto sólido hasta un peso constante y micronizar.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, donde la temperatura en el paso (i) es entre 65 y 85 °C.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, donde la temperatura en el paso (i) es 80 °C.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la solución de NaOH está a una concentración entre 0,25 y 1 ,5 M.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la biomasa subproducto resultante del procedimiento de elaboración de la cerveza se añade al reactor en una cantidad entre 1:2 y 1:5.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que además comprende separar el producto sólido de la solución del paso (iv) antes del paso (v) de neutralización.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el paso (viii) se realiza por spray-drying del producto hasta un contenido de disolvente inferior al 5% del peso.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que además comprende un pre-tratamiento de la biomasa resultante del procedimiento de elaboración de la cerveza antes de ser añadida a la solución de NaOH, donde el pre-tratamiento comprende los siguientes pasos: (a) tamizar la biomasa para separar la biomasa Saccharomyces cerevisiae de impurezas del procedimiento de elaboración de la cerveza; (b) secar la biomasa de Saccharomyces cerevisiae obtenida en el paso (a); y (c) moler el producto de Saccharomyces cerevisiae obtenido en el paso (b).

9. Composición obtenible por el procedimiento como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

10. Composición como se define en la reivindicación 9, para su uso como agente preventivo y/o terapéutico.

11. Composición como se define en la reivindicación 9, para su uso como agente ligando de grasa en el intestino.

12. Composición como se define en la reivindicación 9, para su uso en la prevención y/o tratamiento de un trastorno seleccionado del grupo que consiste en sobrepeso, obesidad, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, hipertensión arterial y trastornos cardiovasculares.

13. Producto farmaceutico y/o de veterinaria que comprende una cantidad efectiva de la composición como se define en la reivindicación 9, junto con cantidades apropiadas de excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables.

14. Producto comestible que comprende una cantidad efectiva de la composición como se define en la reivindicación 9, junto con cantidades apropiadas de otros ingredientes comestibles.

15. Producto comestible según la reivindicación 14, que es un suplemento dietético.