PT2771027E - Composições hemostáticas - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "Composições hemostáticas"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a composições hemostáticas e processos para fazer tais composições.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Composições hemostáticas numa forma seca estável ao armazenamento, que compreendem material granulado biocompativel, biodegradável, estável e seco são conhecidas por exemplo de W098/008550A ou W02003/007845A ou US2005/284809. Estes produtos têm sido aplicados com sucesso no estado da técnica para hemóstase. O FloSeal® é um exemplo de um agente hemostático altamente eficaz consistindo numa matriz granular de gelatina intumescida numa solução contendo trombina para formar uma pasta fluida.

Uma vez que tais produtos têm de ser aplicados a seres humanos, é necessário garantir niveis de segurança máximos para a qualidade, estabilidade ao armazenamento e esterilidade dos produtos finais e dos seus componentes. Além disso, o fabrico e manuseamento, devem ser feitos tão convenientemente e eficientemente quanto possível.

Um produto de sucesso neste campo (o produto FloSeal® acima mencionado) utiliza uma matriz de gelatina utilizada em conjugação com uma solução de trombina liofilizada reconstituída. A matriz de gelatina é aplicada como uma forma granular fluida de gelatina e trombina com um teor de gelatina de cerca de 11 a 14,5%. Teores mais baixos de gelatina resultam num produto que escorre com o desempenho diminuído devido às dificuldades em manter o produto no local do tratamento, especialmente sob condições de alto fluxo sanguíneo. Uma concentração de partículas de gelatina mais elevada conduz a um produto que é difícil de aplicar por meios usuais de administração, tais como seringas ou cateteres, devido a uma maior resistência em fluir. A inclusão de plastificantes na composição, por exemplo, polietilenoglicóis, sorbitol, glicerol e semelhantes tem sido sugerida (EPO927053B1) e pode diminuir a força de extrusão, mas a inclusão destes materiais não melhora necessariamente o desempenho. É um objeto da presente invenção proporcionar uma composição hemostática baseada numa gelatina reticulada com propriedades de aderência e hemostática melhoradas em comparação com os produtos de gelatina, tais como o FloSeal, de acordo com a técnica anterior, e métodos para fazer tais composições hemostáticas. As composições também devem ser proporcionadas numa forma conveniente e funcional, nomeadamente como uma pasta fluida utilizável em cirurgia endoscópica e microcirurgia. Os produtos devem ter uma força de extrusão de 40 N ou abaixo, preferencialmente abaixo de 35 N, sendo especialmente preferido abaixo de 20 N. Os produtos devem, preferencialmente, ser proporcionados em formatos de produtos que permitam uma disponibilização conveniente de composições hemostáticas "prontas-a-usar", que possam ser aplicadas diretamente numa lesão, sem quaisquer passos de reconstituição morosos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Portanto, a presente invenção proporciona uma composição hemostática compreendendo gelatina reticulada numa forma particulada adequada para utilização em hemóstase, em que a composição está presente na forma de pasta contendo 15,0 a 19,5% (p/p) de gelatina reticulada, preferencialmente 16,0 a 19,5% (p/p), 16,5 a 19,5% (p/p), 17,0 a 18,5% (p/p) ou 17,5 a 18,5% (p/p), sendo mais preferido 16,5 a 19,0% (p/p) ou 16,8 a 17,8% (p/p), sendo especialmente preferido 16,5 a 17,5% (p/p), e em que a composição compreende um melhorador de extrusão, em que o melhorador de extrusão é albumina numa quantidade entre 0,5% e 5,0% (p/p). A invenção também se refere à utilização desta composição hemostática para o tratamento de uma lesão selecionada do grupo consistindo numa ferida, uma hemorragia, um tecido danificado e/ou tecido a sangrar, compreendendo a administração de uma tal composição hemostática, e kits para fazer a tal composição hemostática para o tratamento de uma tal lesão.

DESCRIÇÃO DE CONCRETIZAÇÕES ESPECÍFICAS DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona uma composição hemostática compreendendo gelatina reticulada numa forma particulada adequada para utilização em hemóstase, em que a composição está presente na forma de pasta contendo 15,0 a 19,5% (p/p) de gelatina reticulada (= peso de gelatina reticulada seca por peso da composição final), preferencialmente 16,0 a 19,5% (p/p), 16,5 a 19,5% (p/p), 17,0 a 18,5% (p/p) ou 17,5 a 18,5% (p/p), sendo mais preferido 16,5 a 19,0% (p/p) ou 16,8 a 17,8% (p/p), sendo especialmente preferido 16,5 a 17,5% (p/p), e em que a composição compreende um melhorador de extrusão, em que o melhorador de extrusão é albumina numa quantidade entre 0,5% e 5,0% (p/p) .

Verificou-se surpreendentemente no decorrer da presente invenção que a disponibilização de melhoradores de extrusão, tais como albumina na quantidade apropriada, permite o uso de concentrações de gelatina mais elevadas e que o uso de concentrações de gelatina mais elevadas melhora as propriedades hemostáticas de tais produtos. Isto é um efeito que não é sugerido no estado da técnica anterior. Além disso, foi surpreendente que uma concentração mais elevada de gelatina reticulada resulte em melhores propriedades de aderência (em contraste com os resultados conhecidos no estado da técnica anterior (por exemplo, Fig. 4 de WO2008/076407A2).

Para permitir as propriedades preferidas devido às concentrações mais elevadas de gelatina na pasta, de acordo com a presente invenção, é necessário proporcionar os melhoradores de extrusão em quantidades apropriadas. As quantidades devem ser suficientemente elevadas de modo a se obter o efeito de extrusão, isto é, para permitir uma pasta fluida, mesmo para quantidades de 15 a 19,5% de gelatina reticulada, de forma a que a composição hemostática possa ser aplicada por exemplo em microcirurgia; por outro lado, as quantidades devem ser suficientemente baixas para evitar propriedades funcionais negativas da composição hemostática, por exemplo, aderência a feridas ou desempenho hemostático. O melhorador de extrusão albumina (especialmente albumina de soro humano), deve ser proporcionado numa quantidade entre 0,5 e 5,0% (p/p) (= peso de melhorador de extrusão por peso da composição final), preferencialmente 1,0 a 5,0% (p/p), preferencialmente 2,0 a 4,5% (p/p), sendo mais preferido 1,5 a 5,0% (p/p), sendo especialmente preferido cerca de 1,5% (p/p).

Outra classe de melhoradores de extrusão são os fosfolípidos, tais como fosfatidilcolina e -serina, ou misturas complexas, tais como as lecitinas ou óleos de soja.

Numa outra concretização preferida, a presente invenção proporciona uma composição hemostática compreendendo gelatina reticulada numa forma particulada adequada para utilização em hemóstase, em que a composição está presente na forma de pasta contendo 16,0 a 19,5% (p/p), preferencialmente 16,5 a 19,5% (p/p 17,0 a 18,5% (p/p) ou 17,5 a 18,5% (p/p), sendo mais preferido 16,5 a 19,0% (p/p) ou 16,8 a 17,8% (p/p), sendo especialmente preferido 16,5 a 17,5% (p/p), e em que a composição compreende o melhorador de extrusão albumina. Preferencialmente, o melhorador de extrusão é a albumina do soro humano.

Numa outra concretização preferida, a presente invenção proporciona uma composição hemostática compreendendo gelatina reticulada numa forma particulada adequada para utilização em hemóstase, em que a composição está presente na forma de pasta contendo 15,0 a 19,5% (p/p) de gelatina reticulada, preferencialmente 16,0 a 19,5% (p/p), 16,5 a 19,5% (p/p), 17,0 a 18,5% (p/p) ou 17,5 a 18,5% (p/p), sendo mais preferido 16,5 a 19,0% (p/p) ou 16,8 a 17,8 % (p/p), especialmente 16,5 a 17,5% (p/p), e em que a composição compreende um melhorador de extrusão numa concentração superior a 0,8% (p/p), preferencialmente cerca de 3,3% (p/p). Preferencialmente, o melhorador de extrusão é a albumina de soro humano, por exemplo nas concentrações acima mencionadas.

As composições hemostáticas de acordo com a presente invenção têm vantagens específicas sobre as composições que utilizam quantidades inferiores de gelatina reticulada (13 a 14,5%), especialmente têm uma eficácia melhorada in vivo. Durante o decorrer da presente invenção foi inesperadamente revelado que uma formulação com uma concentração mais elevada de partículas de gelatina resulta num maior desempenho hemostático tanto em métodos de ensaio ex vivo que utilizam sangue humano completo como em experiências pré-clínicas em animais. Os produtos de acordo com a presente invenção permitem uma redução do tempo cirúrgico de aproximação e um tempo mais rápido para hemóstase.

As composições de acordo com a presente invenção têm uma força média de extrusão (empregando o método de ensaio descrito no exemplo 1) de 40 N ou abaixo, preferencialmente abaixo de 35 N, sendo especialmente preferido abaixo de 20 N.

De acordo com concretização preferida da presente invenção, a composição hemostática compreende gelatina reticulada com glutaraldeido ou gelatina reticulada com genipina ((1R,2R,6S)- 2- hidroxi-9-(hidroximetil)-3-oxabiciclo[4.3.0]nona-4,8-dieno-5-carboxilato de metilo), preferencialmente gelatina de tipo B, mais preferencialmente do tipo B originária de pele.

Preferencialmente, a gelatina reticulada está presente como material granular. A composição hemostática de acordo com a presente invenção compreende preferencialmente um polímero de gelatina que é especialmente um polímero de gelatina tipo B. A gelatina tipo B demonstrou ser especificamente vantajosa para uso em agentes hemostáticos já que o tratamento base é altamente eficaz em gerar gelatina de propriedades adequadas e em mitigar os riscos de infeção virai e zoonótica. Uma preparação de gelatina especificamente preferida pode ser preparada por processamento de cório de bovino jovem com NaOH 2N durante cerca de 1 hora à temperatura ambiente, neutralização a pH 7-8, e aquecimento a 70°C. O cório é então completamente solubilizado a gelatina com 3- 10% (p/p), preferencialmente 7-10% (p/p) de gelatina em solução. Esta solução pode ser moldada, seca e moída para proporcionar pó de gelatina tipo B.

Preferencialmente, a gelatina tem uma resistência de Bloom de 200 a 400, especialmente uma gelatina tipo B com uma resistência de Bloom de 200 a 400. Bloom é um ensaio para medir a resistência da gelatina. O ensaio determina a massa (em gramas) necessária para uma sonda (normalmente com um diâmetro de 0,5 polegadas) desviar a superfície do gel 4 mm, sem o quebrar. O resultado é expresso em Bloom (graus) . Para realizar o teste de Bloom em gelatina, uma solução de 6,67% de gelatina é mantida a 10°C durante 17-18 horas antes de ser testada. A composição hemostática de acordo com a presente invenção contém preferencialmente gelatina reticulada numa forma particulada, especialmente como material granular. Este material granular pode intumescer rapidamente quando exposto a um fluido (isto é, o diluente) e nesta forma intumescida é capaz de contribuir para uma pasta fluida que pode ser aplicada num local de hemorragia. De acordo com uma concretização preferida, a gelatina reticulada é fornecida de uma gelatina reticulada seca. Este pó de gelatina reticulada seca pode ser preparado para reidratar rapidamente se em contacto com um diluente farmaceuticamente aceitável. Os grânulos de gelatina, especialmente sob a forma de um pó de gelatina, compreendem preferencialmente partículas relativamente grandes, também referidas como fragmentos ou subunidades, tal como descrito em W098/08550A e W02003/007845A. Um tamanho (mediano) de partícula preferido será a gama de 10 a 1000 m, preferencialmente de 200 a 800 m, mas dimensões de partículas fora desta gama preferida podem encontrar uso em muitas circunstâncias.

Normalmente, as partículas de gelatina têm um diâmetro médio de partícula ("diâmetro médio de partícula" é o tamanho mediano tal como medido por difratometria laser; "tamanho mediano" (ou diâmetro de massa mediano das partículas) é o diâmetro da partícula que divide a distribuição de frequência em metade; cinquenta por cento das partículas de uma determinada preparação têm um diâmetro maior, e cinquenta por cento das partículas têm um diâmetro mais pequeno) de 10 a 1000 m, preferencialmente 50 a 700 m, 200 a 700 m, 300 a 550 m, sen especialmente preferido 350 a 550 m (tamanho mediano). Apesar de os termos em pó e granular (ou granulados) serem por vezes utilizados para distinguir classes separadas de material, pós são aqui definidos como uma subclasse especial de materiais granulares. Em particular, pós referem-se àqueles materiais granulares que têm os tamanhos de grão mais finos, e que, portanto, têm uma maior tendência para formar aglomerados quando fluem. Os grânulos incluem materiais granulados mais grossos que não tendem a formar aglomerados, exceto quando molhados. A presente gelatina reticulada na forma particulada adequada para utilização em hemóstase pode incluir formas dimensionalmente isotrópicas ou não isotrópicas. Por exemplo, a gelatina reticulada no kit de acordo com a presente invenção pode ser grânulos ou fibras; e pode estar presente em estruturas descontínuas, por exemplo, em formas de pó. A composição de gelatina seca é absorvente de líquidos.

Por exemplo, quando em contacto com líquidos, por exemplo, soluções aquosas ou suspensões (especialmente um tampão ou sangue) a gelatina reticulada absorve o líquido e irá exibir um grau de intumescimento, dependendo da extensão da hidratação. 0 material absorve preferencialmente de pelo menos 400%, preferencialmente cerca de 500% a cerca de 2000%, especialmente desde cerca de 500% a cerca de 1300% de água ou tampão aquoso, por peso, correspondendo a um aumento nominal de diâmetro ou largura de uma partícula individual de subunidade na gama de por exemplo aproximadamente 50% a aproximadamente 500%, normalmente de aproximadamente 50% a aproximadamente 250%. Por exemplo, se as partículas granulares (secas) têm uma gama de tamanho preferida de 0,01 mm a 1,5 mm, especialmente de 0,05 mm a 1 mm, a composição completamente hidratada (por exemplo, após a administração numa ferida ou após o contacto com uma solução tampão aquosa) pode ter uma gama de tamanho de 0,05 mm a 3 mm, especialmente de 0,25 mm a 1,5 mm.

As composições secas também exibirão um "intumescimento de equilíbrio" significativo, quando expostas a um meio aquoso de reidratação (= diluente farmaceuticamente aceitável, também referido como meio de reconstituição). Preferencialmente, o inchaço vai estar na gama de 400% a 1300%, preferencialmente 400% a 1000%, mais preferivelmente de 500% a 1100%, sendo especialmente preferido de 500% a 900%, dependendo da sua utilização pretendida. Tal intumescimento de equilíbrio pode ser controlado, por exemplo (para um polímero reticulado) através da variação do grau de reticulação, que por sua vez é alcançado através da variação das condições de reticulação, tais como a duração da exposição a um agente de reticulação, a concentração de um agente de reticulação, temperatura de reticulação, e semelhantes. Materiais com diferentes valores de intumescimento de equilíbrio têm um desempenho diferente em diferentes aplicações. A capacidade de controlar a reticulação e o intumescimento de equilíbrio permite que as composições da presente invenção possam ser otimizadas para uma variedade de usos. Além de intumescimento de equilíbrio, também é importante controlar a hidratação do material imediatamente antes da aplicação a um local alvo. Hidratação e intumescimento de equilíbrio são, é claro, intimamente ligados. Um material com 0% de hidratação vai ser não intumescido. Um material com 100% de hidratação estará no seu conteúdo em água de equilíbrio. Hidratações entre 0% e 100% vão corresponder ao intumescimento entre as quantidades mínima e máxima. " Intumescimento de equilíbrio " pode ser determinado subtraindo o peso seco do hidrogel de gelatina em pó do seu peso quando completamente hidratado e, portanto, totalmente intumescido. A diferença é então dividida pelo peso seco e multiplicada por 100 para dar a medida do intumescimento. O peso seco deve ser medido após a exposição do material a uma temperatura elevada durante um tempo suficiente para remover substancialmente toda a humidade residual, por exemplo, duas horas a 120°C. A hidratação de equilíbrio do material pode ser conseguida por imersão do material seco num diluente farmaceuticamente aceitável, tal como solução salina aquosa, durante um período de tempo suficiente para o teor de água se tornar constante, tipicamente durante 18 a 24 horas à temperatura ambiente. A gelatina reticulada pode ser proporcionada como uma película, que pode então ser moída para formar um material granular. A maioria das partículas contidas no material granular (por exemplo, mais do que 90% p/p) têm preferencialmente dimensões das partículas de 10 a 1000 mpreferencialmente 50 a 700 m, 200 a 700 m, 300 a 550 m, sendo especialmente preferi 350 a 550 m.

Preferencialmente, a forma fluida da composição hemostática contém partículas que são mais que 50% (p/p) com um tamanho de 100 a 1000 m, preferencialmente mais de 80% (p/p) com um tamanho de 100 a 1000 m.

Exemplos de materiais adequados para a gelatina reticulada são descritos nomeadamente nos exemplos 1 e 2 de EP1803417B1 e no exemplo 14 US6,066,325A e US6,063,061A. A gelatina também pode ser usada com adjuvantes de processamento, tais como PVP, PEG e/ou dextrano como adjuvantes de reidratação.

Num aspeto particular da presente invenção, as composições irão compreender pós de gelatina reticulada tendo um teor de humidade de 20% (p/p) ou menos, em que o pó foi reticulado na presença de um adjuvante de reidratação de modo que o pó tem uma taxa de reidratação aquosa que é, pelo menos, 5% mais alta do que a taxa de reidratação de um pó semelhante preparado sem o adjuvante de reidratação. A "taxa de reidratação" é definida de acordo com EP1803417B1 referindo-se à quantidade de uma solução aquosa, tipicamente 0,9% (p/p) de solução salina, que é absorvida por um grama de pó (base peso seco) em trinta segundos, expressa em g/g. A taxa de reidratação é medida misturando a gelatina reticulada com solução salina durante 30 segundos, e depositando a gelatina molhada sobre uma membrana de filtro sob vácuo para remover a solução aquosa livre. Regista-se então o peso da gelatina molhada retida no filtro, seca-se (por exemplo, 2 horas a 120°C), em seguida, regista-se 0 peso seco de gelatina e calcula-se o peso da solução que foi absorvida por grama de gelatina seca.

Composições preferidas da presente invenção vão ter uma taxa de reidratação de pelo menos 3 g/g, preferencialmente pelo menos 3,5 g/g e, frequentemente, 3,75 g/g ou mais alta. Taxas de reidratação de pós similares preparados sem os adjuvantes de reidratação são tipicamente inferiores a três, e um aumento da percentagem na taxa de reidratação será normalmente de pelo menos 5%, sendo preferencialmente pelo menos 10%, e sendo mais preferencialmente pelo menos 25 % ou mais alta. A reticulação pode ser realizada com qualquer agente de reticulação adequado, por exemplo, glutaraldeido, tal como por exemplo descrito no documento W098/08550A e W02003/007845A. A reticulação também pode ser realizada com um agente de reticulação não-tóxico, tal como genipina e semelhantes. O custo de produção é menor para um produto de gelatina reticulada com genipina de acordo com a presente invenção, do que uma reticulada com glutaraldeido, já que os custos com reagentes, energia e tempo são mais baixos. A reação da gelatina reticulada com genipina pode ser realizada em água a pH neutro, à temperatura ambiente por < 16 horas. O produto pode ser limpo por uma lavagem com etanol e/ou água o que não só é mais barato, mas, mais importante, mais seguro para o operador. O método aplica preferencialmente a gelatina como estando presente na forma seca, antes do passo de reticulação. O agente de reticulação tipo genipina preferido de acordo com o presente invento é, claro, genipina ((IR,2R,6S)-2-hidroxi-9-(hidroximetil)-3-oxabiciclo[4.3.0]nona-4,8-dieno-5-carboxilato de metilo); no entanto, também podem ser utilizados outros agentes de reticulação do tipo iridoide ou secoiridoide, tais como oleuropeína. Concentrações preferidas de genipina para reticulação estão na gama de 0,5 a 20 mM, preferencialmente 1 a 15 mM, especialmente de 2 a 10 mM.

De acordo com uma concretização preferida da presente invenção, a gelatina reticulada com genipina é submetida a um passo de extinção/oxidação com agentes oxidantes, tais como lixivia, tBu-hidroperóxido, etc., preferencialmente a um tratamento com percarbonato de sódio, hipoclorito de sódio, água de cloro ou peróxido de hidrogénio (H2O2) , sendo especialmente preferido um tratamento com percarbonato de sódio ou H2O2, sendo mais preferido um tratamento com percarbonato.

Concentrações preferidas de H2O2 são 0,5 a 20% (p/p), especialmente 1 a 15% (p/p), sendo mais preferidas de cerca de 5% (p/p). Numa concretização especialmente preferida, a concentração de genipina é entre 5 e 10 mM, o tempo de reação de gelatina com genipina é entre 3 e 10 horas, especialmente 6 horas, a concentração de H2O2 é entre 3 e 5% (p/p) e o tempo de reação da gelatina reticulada com genipina com H2O2 é de cerca de 20 horas,

Concentrações preferidas de percarbonato são entre 1 e 10% (p/p), especialmente 1 a 5% (p/p), sendo mais preferido 1 a 4% (p/p). Numa concretização especialmente preferida, a concentração de genipina é entre 5 e 10 mM (especialmente cerca de 8 nM), o tempo de reação da gelatina com genipina é entre 3 e 10 horas (especialmente cerca de 5 horas), a concentração de percarbonato é entre 1 e 10% (p/p), sendo especialmente preferido entre 1 e 4% p/p, e o tempo de reação da gelatina reticulada com genipina com o percarbonato é entre 1 e 20 horas, preferencialmente entre 1 e 5 horas (por exemplo,1,2 ou 3 horas). A extinção também ser realizada na presença de antioxidantes, tais como ascorbato de sódio ou por controlo do potencial de oxidação do meio de reação, tal como a realização da extinção e/ou a reação com genipina numa atmosfera inerte, tal como azoto ou árgon.

Condições preferidas de reticulação incluem a realização em solução aquosa, preferencialmente num tampão de solução salina tamponada de fosfato (PBS)/etanol, especialmente a um pH de 4 a 12, preferencialmente de 5,0 a 10,0, especialmente de 6 a 8, ou em água desionizada ou outros tampões aquosos que podem conter entre 0 e 50% de um solvente orgânico miscivel em água. Um tampão de PBS contém quantidades fisiológicas de NaCl e KC1 em tampão fosfato a um pH fisiológico. Um exemplo para um tampão de PBS contém NaCl 137 mM, KC1 2,7 mM, Na2HP04 2H 10 mM, KH2P04 1,76 mM (pH=7,4) . Um outro exemplo de um tampão de PBS consiste em NaCl 137 mM, KC1 2,7 mM, Na2HP04 4,3 mM e KH2P04 1,4 mM (pH=7,5). A reação pode também ser levada a cabo num tampão aquoso contendo até 50% de um solvente orgânico miscível com a água e/ou adjuvantes, tais como PEG, PVP, manitol, percarbonato de sódio, lactato de sódio, citrato de sódio, ascorbato de sódio, etc. .

Preferencialmente, o passo de reticulação é realizado a uma temperatura de 4°C a 45°C, preferencialmente de 15 a 45°C, especialmente de 20 a 40°C. O passo de reticulação pode ser seguido por um passo de extinção, especialmente com um extintor contendo um grupo amino, preferencialmente um aminoácido, especialmente glicina. Com o extintor, os agentes de reticulação tipo genipina que ainda não reagiram são inativados (por exemplo, por reação com o extintor em excesso) para evitar mais reticulação. A extinção pode também ser realizada através do aumento do pH da solução para valores entre 8 e 14, ou utilizando compostos nucleófilos contendo grupos amino, tiol ou hidroxilo e também uma combinação de aumento de pH e utilização de compostos nucleófilos. O passo de extinção depois da reação de reticulação genipina-gelatina de acordo com a presente invenção pode ser ativamente dirigido para conferir um desejado desempenho físico, tais como intumescimento e TEG, que são determinantes importantes da atividade hemostática acima e para além da reticulação generalizada com genipina sozinha. A gelatina reticulada é preferencialmente lavada depois do passo de reticulação, preferencialmente por metanol, etanol ou água, especialmente por água desionizada. Um outro passo de lavagem preferido aplica um tampão aquoso contendo até 50% (v/v) de solvente orgânico miscível com água e/ou um ou mais adjuvantes.

De acordo com uma concretização preferida, a gelatina reticulada é seca. Em tal estado seco, a composição hemostática é estável durante armazenamento durante muito tempo, mesmo a temperaturas elevadas (por exemplo, mais do que 20°C, mais do que 30 °C ou mesmo mais do que 40 °C) . Condições de secagem preferidas incluem polímeros biocompatíveis reticulados que são secos para ter um teor de humidade abaixo de 15% (p/p) , preferencialmente abaixo de 10%, sendo mais preferido inferior a 5%, especialmente inferior a 1%. Numa outra concretização preferida, o produto pode ser fornecido num estado hidratado ou molhado em que a solução de hidratação pode ser um tampão ou solução biocompatível. Um produto Glu-gel tem uma tendência para ser camuflado por tecido circundante, uma vez que a sua cor ligeiramente amarela se mistura com ele. Isso faz com que a avaliação visual da aplicação desejada seja problemática. Os produtos de gelatina reticulada com genipina de acordo com a presente invenção surgem com cor variada de amarelo pálido a azul-escuro ou verde com base no nível das condições de reação de reticulação, e posterior processamento e passos de finalização. Esta sintonização de cor e capacidade para se obter a cor desejada na cor do produto acabado tem a vantagem adicional de proporcionar aos médicos uma indicação visual da aplicação adequada do produto em locais de feridas, uma vez que esta cor diferencia-o do tecido circundante, em vez de ser potencialmente camuflado por ele. Esta é uma outra característica nova da presente invenção. Por outro lado, a cor pode ser removida para se obter um produto incolor, dependendo das necessidades no que diz respeito aos produtos finais.

Numa concretização preferida o polímero biocompatível, por exemplo, gelatina, reticulado com um agente de reticulação de tipo genipina, por exemplo genipina, um polímero homogeneamente (uniformemente) reticulado como pode ser demonstrado, por exemplo, por medições de fluorescência, tal como descrito no Exemplo 3 do presente pedido. Numa concretização especialmente preferida, o polímero biocompatível, tal como gelatina, está presente como um polímero biocompatível reticulado homogeneamente com genipina, tal como gelatina, em forma particulada. É preferida uma composição hemostática, de acordo com a presente invenção, em que os excipientes, tais como lubrificantes, por exemplo ácido hialurónico, estão presentes.

Numa outra concretização da presente invenção, excipientes tais como lubrificantes, por exemplo ácido hialurónico, são excluídos. 0 diluente farmaceuticamente aceitável é preferencialmente uma solução aquosa e pode conter uma substância selecionada a partir do grupo consistindo em NaCl, CaCÍ2 e acetato de sódio. Por exemplo, um diluente farmaceuticamente aceitável compreende água para injeção, e - independentemente uns dos outros - NaCl 50 a 200 mM (preferencialmente 150 mM) , CaCÍ2 10 a 80 mM (preferencialmente 40 mM) e acetato de sódio 1 a 50 mM (preferencialmente 20 mM). Noutra concretização o diluente farmaceuticamente aceitável contém menos de 35 g/1 de manitol, preferencialmente menos de 25 g/1, sendo mais preferido menos de 10 g/1, sendo especialmente preferido o diluente farmaceuticamente aceitável é, na sua essência, livre de manitol.

De acordo com uma concretização preferida, o diluente farmaceuticamente aceitável compreende trombina, preferencialmente 10 a 1000 UI de trombina/ml, especialmente 250 a 700 UI de trombina/ml. Preferencialmente, a composição hemostática nesta forma pronta-a-usar contém 10 a 100 000 unidades internacionais (UI) de trombina, sendo mais preferido 100 a 10 000 UI, especialmente 500 a 5000 UI. A trombina (ou qualquer outro agente indutor da coagulação, tais como veneno de cobra, um ativador de plaquetas, um péptido ativador de recetor de trombina e um agente de precipitação de fibrinogénio) pode ser derivado a partir de qualquer preparação de trombina, que seja adequada para uso em seres humanos (isto é, farmaceuticamente aceitável). Fontes adequadas de trombina incluem sangue humano e de bovino, plasma ou soro (trombina de outras fontes animais pode ser aplicada, se não forem antecipadas reações imunológicas adversas), trombina de origem recombinante (por exemplo, trombina recombinante humana) e pode ser preferida trombina autóloga humana para algumas aplicações. O diluente farmaceuticamente aceitável é utilizado numa quantidade para se alcançar a concentração final desejada na composição pronta-a-usar. A preparação de trombina pode conter outros componentes úteis, tais como iões, tampões, excipientes, estabilizadores, etc.. Preferencialmente, a preparação de trombina contém albumina humana como o melhorador de extrusão. Os sais preferidos são NaCl e/ou CaCl2, ambos usados nas quantidades e concentrações usuais aplicadas para a trombina (por exemplo, NaCl de 0,5 a 1,5% (por exemplo, 0,9%) e/ou CaCl2 20 a 80 mM (por exemplo, 40 mM)).

Numa outra concretização, o diluente pode também incluir um tampão ou sistema tampão, de modo a tamponar o pH da composição seca reconstituída, preferencialmente a um pH de 3,0 a 10,0, sendo mais preferido de 6,4 a 7,5, especialmente a um pH de 6,9 a 7,1. O estabelecimento de quantidades apropriadas de gelatina reticulada, diluente e melhorador de extrusão pode ser feito no kit de acordo com os pré-requisitos acima referidos: Por exemplo a) um frasco com 0,736 a 0,995 g gelatina reticulada seca (correspondente a 15,0 a 19,5% (m/ m) no produto final) pode ser fornecida e b) um segundo frasco com 4 ml de diluente com 60 a 240 mg de albumina e, opcionalmente, trombina a uma concentração de 500 Ul/ml e/ou 40 mM CaCl2. Alternativamente, a albumina pode ser adicionada na forma liofilizada ao componente de gelatina seca a) do kit. Por exemplo, a) um frasco com 0,573 a 0,775 g de gelatina reticulada seca (correspondente a 15,0 a 19,5% (p/p) no produto final) disso 48 a 192 mg de albumina pode ser fornecida e b) um segundo frasco com 3,2 ml de diluente e, opcionalmente, trombina a uma concentração de 500 Ul/ml e/ou 40 mM CaCl2. O componente de gelatina reticulada do kit de acordo com a presente invenção é preferencialmente proporcionado como uma composição seca, em que a gelatina reticulada está presente na forma seca.

De acordo com a presente invenção uma composição de gelatina reticulada substancialmente seca tem um teor residual de humidade que pode corresponder, aproximadamente, ao teor de humidade de produtos disponíveis comparáveis, tais como FloSeal® (o FloSeal, por exemplo, tem aproximadamente 8-12% de humidade na forma e produto seco).

De acordo com a presente invenção, a gelatina reticulada seca na forma particulada adequada para utilização em hemóstase no kit é, preferencialmente gelatina na forma de pó, especialmente onde as partículas do pó têm um tamanho de partícula mediano de 10 a 1000 m, preferencialmente 50 a 700 m, 200 a 700 m, 300 a 550 m, especialmente preferido 350 a 550 m. De acordo com a presente invenção, uma "preparação seca granular de gelatina reticulada" é, em princípio conhecida por exemplo a partir de W098/08550A. Preferencialmente, a gelatina reticulada é um material seco granular estável, biocompatível, biodegradável.

De acordo com um outro aspeto, a presente invenção refere-se a uma composição hemostática de acordo com a presente invenção para utilização no tratamento de uma lesão selecionada a partir do grupo que consiste numa ferida, uma hemorragia, tecido danificado, tecido a sangrar e/ou defeitos ósseos.

De acordo com um outro aspeto da presente descrição também proporciona um método de administração de uma composição hemostática de acordo com a presente invenção a um local alvo no corpo de um paciente, compreendendo o referido método a administração ao local alvo de uma composição hemostática produzida pelo processo de acordo com a presente invenção. Embora também a composição seca possa ser aplicada diretamente ao local do alvo (e, opcionalmente, ser colocada em contacto com um diluente no local alvo, se necessário), é preferido colocar a composição hemostática seca em contacto com um diluente farmaceuticamente aceitável antes da administração ao alvo local, de modo a se obter uma composição hemostática de acordo com a presente invenção na forma de pasta.

Num tal método, pode ser aplicado um kit para fazer uma pasta fluida de gelatina reticulada para o tratamento de uma lesão selecionada do grupo que consiste numa ferida, uma hemorragia, tecido danificado e/ou a sangrar, compreendendo este kit a) uma composição hemostática seca compreendendo gelatina reticulada na forma particulada para ser reconstituída numa pasta fluida contendo 15,0 a 19,5% (p/p) de gelatina reticulada (= peso da gelatina seca para peso da composição final) , preferencialmente 16,0 a 19,5% ( p/p), 16,5 a 19,5% (p/p), 17,0 a 18,5% (p/p) ou 17,5 a 18,5% (p/p), sendo mais preferido 16,5 a 19,0% (p/p) ou 16,8 a 17,8 % (p/p), sendo especialmente preferido 16,5 a 17,5% (p/p), gelatina reticulada e b) um diluente farmaceuticamente aceitável para reconstituição da composição hemostática, em que a composição ou o diluente compreendem o melhorador de extrusão albumina, numa quantidade que conduz a uma concentração de albumina na pasta reconstituída de entre 0,5 e 5,0% (p/p) (= peso do melhorador de extrusão por peso da composição final), preferencialmente 1,0 a 5,0% (p/p), preferencialmente 2,0 a 4,5% (p/p), mais preferencialmente de 1,5 a 5,0% (p/p), sendo especialmente preferido cerca de 1,5% (p/p).

Um outro componente preferido de um tal kit é especificamente se a composição hemostática está na forma seca, - um diluente para reconstituição (= meio de reidratação) da composição hemostática. Outros componentes do kit podem ser meios de administração, tais como seringas, cateteres, escovas, etc. (se as composições não são já fornecidas nos meios de administração) ou outros componentes necessários para uso em prática médica (cirúrgica), tais como agulhas de substituição ou cateteres, tubos extra ou mais meios de cobertura de ferida. De acordo com a presente invenção preferencialmente o kit compreende um invólucro que aloja a seringa, a composição hemostática seca e estável e uma seringa que contém o diluente (ou fornecida para recolher o diluente a partir de outro recipiente contendo diluente).

Numa concretização preferida, o diluente farmaceuticamente aceitável é fornecido num recipiente separado. Este pode ser, preferencialmente, uma seringa. O diluente na seringa pode então ser facilmente aplicado no recipiente final para a reconstituição das composições hemostáticas secas de acordo com a presente invenção. Se o recipiente final, for também uma seringa, ambas as seringas podem ser finalizadas em conjunto numa embalagem. É, portanto, preferido proporcionar as composições hemostáticas secas de acordo com a presente invenção numa seringa que é completa com uma seringa de diluente com um diluente farmaceuticamente aceitável para reconstituir a referida composição hemostática seca e estável.

De acordo com uma concretização preferida, o recipiente final contém ainda uma quantidade de um estabilizador eficaz para inibir modificação do polímero, quando exposto à radiação esterilizante, preferencialmente ácido ascórbico, ascorbato de sódio, outros sais de ácido ascórbico, ou um antioxidante.

Com um tal diluente farmaceuticamente aceitável, uma forma pronta-a-usar da presente composição hemostática pode ser proporcionada, que pode então ser aplicada diretamente ao paciente. Assim, também o método para fornecer uma forma pronta-a-usar de uma composição hemostática de acordo com a presente invenção é proporcionado, em que a composição hemostática é proporcionada numa primeira seringa e um diluente para reconstituição é proporcionado numa segunda seringa, a primeira e a segunda seringa estão ligadas uma à outra, e o fluido é trazido para a primeira seringa, para produzir uma forma fluida da composição hemostática; e, opcionalmente, retornando a forma fluida da composição hemostática para a segunda seringa, pelo menos uma vez. Preferencialmente, as preparações prontas-a-usar estão presentes ou são proporcionadas como hidrogéis. Produtos deste tipo são conhecidos, em principio, na técnica, mas num formato diferente. Por conseguinte, um método para proporcionar uma forma pronta-a-usar de uma composição hemostática de acordo com a presente invenção, em que a composição hemostática é proporcionada numa primeira seringa e um diluente para reconstituição é proporcionado numa segunda seringa, a primeira e a segunda seringa estão ligadas uma à outra, e o diluente é trazido para a primeira seringa para produzir uma forma fluida da composição hemostática; e, opcionalmente, retornando a forma fluida da composição hemostática para a segunda seringa, pelo menos uma vez, é uma concretização preferida da presente invenção. Este processo (também referido como "swooshing") proporciona uma forma pronta-a-usar adequada das composições de acordo com a presente invenção, que pode fácil e eficientemente ser feito também dentro de curtos intervalos de tempo, por exemplo, em situações de emergência durante cirurgia. Esta forma fluida da composição hemostática proporcionada por tal método é especialmente adequada para utilização no tratamento de uma lesão selecionada a partir do grupo que consiste numa ferida, uma hemorragia, tecido danificado, tecido a sangrar e/ou defeitos ósseos.

Por razões de estabilidade, tais produtos (bem como os produtos de acordo com a presente invenção) são geralmente proporcionados numa forma seca, num recipiente final e trazidos para a forma pronta-a-usar (que é geralmente na forma de um (hidro)gel, suspensão ou solução) imediatamente antes da utilização, necessitando da adição de diluentes farmaceuticamente aceitáveis (= meio de reidratação).

De acordo com um outro aspeto, a presente invenção refere-se a um método para proporcionar uma forma pronta-a-usar de uma composição hemostática de acordo com a presente invenção, em que a composição hemostática é proporcionada numa primeira seringa e um diluente para reconstituição é proporcionado numa segunda seringa, a primeira e a segunda seringa estão ligadas uma à outra, e o fluido é trazido para a primeira seringa, para produzir uma forma fluida da composição hemostática; e, opcionalmente, retornando a forma fluida da composição hemostática para a segunda seringa, pelo menos, uma vez.

Preferencialmente, a forma fluida da composição hemostática de acordo com a presente invenção contém mais do que 50% (p/p) de partículas com um tamanho de 100 a 1000 m, preferencialmente mais de 80% (p/p) de partículas com um tamanho de 100 a 1000 m. O polímero hemostático reticulado biocompatível de acordo com a presente invenção - uma vez aplicado a uma ferida - forma uma matriz eficiente que pode formar uma barreira para o fluxo sanguíneo. Especificamente as propriedades de intumescimento do polímero hemostático podem torná-lo uma barreira mecânica eficaz contra sangramento e processos de re-sangramento. A presente composição pode adicionalmente conter um componente polimérico hidrófilo (também referido como "componente reativo hidrófilo" ou "agente de reticulação (polimérico) hidrófilo") que aumenta ainda mais as propriedades adesivas da presente composição. Este componente polimérico hidrófilo da composição hemostática, de acordo com a presente invenção, atua como um agente de reticulação hidrófilo, que é capaz de reagir com os seus grupos reativos, uma vez aplicada a composição hemostática a um paciente (por exemplo, a uma ferida de um paciente ou outro local onde o paciente tiver necessidade de atividade hemostática). Por isso, é importante para a presente invenção que os grupos reativos do componente polimérico hidrófilo sejam reativos quando são aplicados ao paciente. É por isso necessário fabricar a composição hemostática, de acordo com a presente invenção, de modo a que os grupos reativos do componente polimérico que devem reagir quando aplicados numa ferida sejam mantidos durante o processo de fabrico.

Para agentes de reticulação poliméricos hidrófilos cujos grupos reativos são hidrolisáveis, o contacto prematuro com água ou líquidos aquosos tem de ser impedido antes da administração da composição hemostática ao paciente, especialmente durante o fabrico. No entanto, o processamento do componente polimérico hidrófilo durante o fabrico pode ser possível também em meio aquoso em condições em que as reações dos grupos reativos são inibidas (por exemplo, a um pH baixo). Se os componentes poliméricos hidrófilos podem ser fundidos, os componentes poliméricos hidrófilos fundidos podem ser pulverizados ou impressos sobre a matriz de gelatina reticulada. Também é possível misturar uma forma seca (por exemplo, um pó) do componente polimérico hidrófilo com uma forma seca da gelatina reticulada. Se necessário, um aumento de temperatura pode ser depois aplicado para fundir o componente polimérico hidrófilo aspergido para a gelatina reticulada para conseguir um revestimento permanente da composição hemostática. Em alternativa, estes componentes poliméricos hidrófilos podem ser tomados em solventes orgânicos inertes (inerte, vis-à-vis os grupos reativos dos componentes poliméricos hidrófilo) e trazido para a matriz da gelatina reticulada. Exemplos de tais solventes orgânicos são o etanol seco, acetona seca ou diclorometano seco (que são, por exemplo, inertes para os componentes poliméricos hidrófilo, tais como os PEG substituídos com éster-NHS). Alternativamente, também podem ser adicionados grupos nucleófilos (por exemplo, PEG-SH).

Numa concretização preferida o componente polimérico hidrófilo é um componente polimérico hidrófilo único e é um polímero de poli(óxido de alquileno), preferencialmente um polímero contendo PEG. Os grupos reativos deste polímero reativo são preferencialmente grupos eletrófilos. 0 componente hidrófilo reativo pode ser um polímero de poli (óxido de alquileno) multieletrófilo, por exemplo, um PEG multieletrófilo. 0 componente hidrófilo reativo pode incluir dois ou mais grupos eletrófilos, preferivelmente um PEG contendo dois ou mais grupos reativos selecionados de succinimidilésteres (-CON(COCH2) 2) , aldeídos (-CHO) e isocianatos (-N=C=0) , por exemplo, um componente tal como divulgado no documento W02008/016983 A.

Grupos eletrófilos do agente de reticulação polimérico hidrófilo preferidos, de acordo com a presente invenção, são grupos reativos com os grupos amino, carboxi, tiol e hidroxi de proteínas, ou suas misturas.

Grupos reativos preferidos, específicos para grupos amino, são os grupos éster NHS, grupos imidoéster, grupos aldeído, grupos carboxi, na presença de carbodiimidas, isocianatos, ou THPP (ácido beta-[Tris(hidroximetil)fosfino]-propiónico), sendo especialmente preferido tetrassuccinimidil-glutarato de pentaeritritolpoli(etilenoglicol)éter (= Pentaeritritol tetraquis [l-l'-oxo-5'-succinimidilpentanoato-2-poli- oxoetilenoglicol]éter (= um PEG-NHS com PM de 10000) .

Grupos reativos preferidos, específicos para grupos carboxi, são grupos amino na presença de carbodiimidas.

Grupos reativos preferidos, específicos para grupos tiol, são maleimidas ou haloacetilos.

Grupo reativo preferido, específico para grupo hidroxi, é o grupo isocianato.

Os grupos reativos no agente de reticulação hidrófilo podem ser idênticos (homofuncional) ou diferentes (heterofuncional). O componente polimérico hidrófilo pode ter dois grupos reativos (homobifuncional ou heterobifuncional) ou mais (homo/heterotrifuncional ou mais).

Em concretizações especiais, o material é um polímero sintético, preferencialmente compreendendo PEG. O polímero pode ser um derivado de PEG compreendendo grupos laterais ativos adequados para a reticulação e aderência a um tecido.

Através dos grupos reativos o polímero reativo hidrófilo tem a capacidade de reticular proteínas do sangue e também proteínas da superfície dos tecidos. A reticulação à gelatina reticulada também é possível. O poli(óxido de alquileno) multieletrófilo pode incluir dois ou mais grupos succinimidilo. O poli(óxido de alquileno) multieletrófilo pode incluir dois ou mais grupos maleimidilo.

Preferencialmente, o poli(óxido de alquileno) multieletrófilo é um polietilenoglicol ou um seu derivado.

Numa concretização mais preferida o componente polimérico hidrófilo é tetrassuccinimidilglutarato de pentaeritritolpoli(etilenoglicol)éter (=COH102, também pentaeritritol-tetraquis[l-l'-oxo-5'-succinimidilpentanoato-2-polioxoetileneglicol]éter). 0 componente polimérico hidrófilo é um agente de reticulação hidrófilo. De acordo com uma concretização preferida, este agente de reticulação tem mais do que dois grupos reativos para reticulação ("braços")/· por exemplo, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais braços com os grupos reativos para reticulação. Por exemplo, NHS-PEG-NHS é um agente de reticulação hidrófilo eficaz de acordo com a presente invenção. No entanto, para algumas concretizações, um polímero de 4 braços (por exemplo, p-NP-PEG de 4 braços) pode ser mais preferido; com base no mesmo princípio, um polímero de 8 braços (por exemplo, NHS-PEG de 8 braços) pode ser ainda mais preferido para essas concretizações em que a reticulação multirreativa é benéfica. Além disso, o agente de reticulação hidrófilo é um polímero, ou seja, uma molécula grande (macromolécula) composta por unidades estruturais repetidas, que estão tipicamente ligadas por ligações químicas covalentes. 0 componente polimérico hidrófilo deve ter um peso molecular de pelo menos 1000 Da (para servir corretamente como agente de reticulação na composição hemostática de acordo com a presente invenção); preferencialmente, os polímeros de reticulação, de acordo com a presente invenção, têm um peso molecular de pelo menos 5000 Da, especialmente de pelo menos 8000 Da.

Para alguns agentes de reticulação hidrófilos, a presença de condições de reação básicas (por exemplo, no local de administração) é preferível ou necessária para o desempenho funcional (por exemplo, para uma reação de reticulação mais rápida no local da administração). Por exemplo, o carbonato ou iões de bicarbonato (por exemplo, como um tampão com um pH de 7,6 ou superior, preferencialmente de 8,0 ou superior, especialmente de 8,3 e superior) podem ser adicionalmente proporcionados no local de administração (por exemplo, como uma solução tampão, ou como um tecido ou uma almofada embebido com um tal tampão) , de modo a permitir um melhor desempenho da composição hemostática de acordo com a presente invenção, ou para permitir a utilização eficiente como hemostático e/ou material aderente à ferida. A reatividade do componente polimérico hidrófilo (que, como mencionado, atua como agente de reticulação) na composição, de acordo com a presente invenção, é mantida na composição. Isto significa que os grupos reativos do agente de reticulação ainda não reagiram com a composição hemostática e não foram hidrolisados pela água (ou pelo menos não numa quantidade significativa, o que tem consequências negativas sobre a funcionalidade hemostática das presentes composições) . Isto pode ser conseguido através da combinação da gelatina reticulada com o agente de reticulação hidrófilo de uma maneira que não leva a uma reação dos grupos reativos do agente de reticulação com o polímero hemostático ou com água. Geralmente, isto inclui a omissão de condições aquosas (ou hidratação), especialmente hidratação sem a presença de condições ácidas (se os agentes de reticulação não são reativos sob condições ácidas). Isso permite que o fornecimento de materiais hemostáticos reativos.

Razões preferidas de gelatina reticulada para componente polimérico hidrófilo na composição hemostática, de acordo com a presente invenção, são de 0,1 a 50% (p/p), preferencialmente de 5 a 40% (p/p).

Outros componentes podem estar presentes na composição hemostática, de acordo com a presente invenção. De acordo com concretizações preferidas, as composições hemostáticas, de acordo com a presente invenção, podem ainda compreender uma substância selecionada do grupo que consiste em antifibrinolítico, procoagulante, ativador de plaquetas, antibiótico, vasoconstritor, corante, fatores de crescimento, proteínas morfogenéticas do osso e analgésicos. A presente invenção também se refere a um recipiente final terminado contendo a composição hemostática de acordo com a presente invenção. Este recipiente terminado contém a composição hemostática de acordo com a presente invenção, numa forma estável à armazenagem, estéril e comercializável. O recipiente final pode ser qualquer recipiente adequado para a acomodação (e armazenamento) de compostos farmaceuticamente administráveis. Seringas, frascos, tubos, etc., podem ser usados; contudo, o proporcionar das composições hemostáticas de acordo com a presente invenção numa seringa é especialmente preferido. As seringas têm sido uma forma administração preferida para as composições hemostáticas tal como divulgado na técnica anterior, também por causa das vantagens de manuseamento de seringas na prática médica. As composições podem, depois, preferencialmente ser aplicadas (após reconstituição) através de agulhas específicas da seringa ou através de cateteres adequados. As composições hemostáticas reconstituídas (as quais são preferencialmente reconstituídas para formar um hidrogel) podem também ser aplicadas por vários outros meios, por exemplo com uma espátula, um pincel, um spray, manualmente por pressão, ou por qualquer outra técnica convencional. A administração da composição hemostática reconstituída a um paciente por meio de via endoscópica (laparoscopia) é especificamente preferida. Normalmente, as composições hemostáticas reconstituídas de acordo com a presente invenção vão ser aplicadas, utilizando uma seringa ou aplicador semelhante capaz de extrusão da composição reconstituída através de um orifício, abertura, agulha, tubo, ou outra passagem para formar um leito, uma camada, ou uma porção similar de material. A rutura mecânica das composições pode ser realizada por extrusão através de um orifício na seringa ou outro aplicador, tendo tipicamente um tamanho na gama de 0,01 mm a 5,0 mm, preferivelmente 0,5 mm a 2,5 mm. Preferencialmente, no entanto, a composição hemostática vai ser inicialmente preparada a partir de uma forma seca tendo um tamanho de partícula desejado (que por reconstituição, especialmente por hidratação, produz subunidades do tamanho requerido (por exemplo, subunidades de hidrogel)) ou será parcialmente ou inteiramente mecanicamente interrompido o tamanho requisito prévio para uma extrusão final ou outro passo de aplicação. É obviamente evidente que estes componentes mecânicos têm que ser proporcionados sob forma estéril (interior e exterior), a fim de cumprir os requisitos de segurança para utilização humana. A composição hemostática de acordo com a presente invenção é preferivelmente aplicada na sua forma pastosa a um paciente a partir de um recipiente tal como descrito no Exemplo 1 com uma força de extrusão de 40 N ou inferior, tal como inferior 30N ou inferior 20 N, preferencialmente numa gama de 15 a 30 N.

Outro aspeto da invenção refere-se a um método para proporcionar uma composição hemostática pronta-a-usar que compreende contatar uma composição hemostática de acordo com a presente invenção. A invenção é ainda descrita nos exemplos e figuras dos desenhos que se seguem, ainda que sem se limitar aos mesmos. A Figura 1 mostra a força média de extrusão de pastas de gelatina reticulada com glutaraldeído contendo 17,5% (p/p) de gelatina reticulada com várias concentrações de albumina do soro humano na componente de trombina (força de extrusão necessária para empurrar o produto para fora da seringa a uma velocidade de compressão de 250 milímetros/minuto, calculado a 35 mm de distância; todos os produtos incubados durante 30 minutos à temperatura ambiente, rápida "re-swooshing" pouco antes de medição de força de extrusão). O eixo dos X mostra a concentração de albumina do soro humano na componente de trombina em [g/1], o eixo dos Y mostra a força média de extrusão [N] . A Figura 2 mostra a consistência das pastas de gelatina reticulada contendo 17,5% (p/p) de gelatina reticulada, dependendo da concentração de albumina de soro humano. A Figura 3 mostra a força média de extrusão de pastas de gelatina reticuladas com genipina contendo 17,5% (p/p) de gelatina com várias concentrações de albumina do soro humano na componente de trombina. O eixo dos X mostra a concentração de albumina do soro humano na componente de trombina em [g/1], o eixo dos Y mostra a força média de extrusão [N]. A Figura 4 mostra a avaliação da gravidade do sangramento após aplicação do artigo teste e aproximação.

As Figuras 5 a 8 mostram a eficácia hemostática no modelo Punção-biópsia fígado porcino de diferentes preparações. O eixo dos X mostra o tempo após a aplicação em [segundos], o eixo dos Y mostra a percentagem de sucesso hemostático (definido como "nenhum sangramento" na Figura 5 e como "nenhum sangramento" ou "exsudação" na Figura 6).

Nas Figuras 5 e 6, os símbolos significam: _ gelatina reticulada com glutaraldeído com 50 g/1 de albumina de soro humano na solução de trombina (n = 8) ----- gelatina reticulada com glutaraldeído com 75 g/1 de albumina de soro humano na solução de trombina (n = 8)

Nas Figuras 7 e 8 os símbolos significam: _ 17,5% (p/p) de gelatina reticulada com glutaraldeído ----- 14,5% (p/p) de gelatina reticulada com glutaraldeído ............... 17,5% (p/p) de gelatina reticulada com glutaraldeído mais 2,5% de PEG 10 000 em solução de trombina

EXEMPLOS

Exemplo 1: Determinação da força de extrusão (FE):

Um aparelho para testes mecânicos Instron (modelo 5544) equipado com uma célula de carga de 100 N a operar a uma velocidade de feixe transversal de 250 mp/pin foi usado para medir forças de extrusão necessárias para extrudir o produto da seringa. As forças de extrusão necessárias foram medidas durante o deslocamento completo do feixe transversal (34 mm de deflexão) que corresponde a uma distância que o êmbolo de uma seringa se move de modo a extrudir quase todo o produto para fora da seringa. A partir dessas forças as forças médias de extrusão foram calculadas como segue:

As amostras para este teste foram preparadas como se segue: uma seringa padrão de 5 ml (com um corpo cilíndrico com um diâmetro interno de 12,2 mm) com um sistema Luer-lock macho (o bocal interno de diâmetro de lúmen onde o adaptador está ligado mede de 2,54 milímetros) é cheia com 0,704 g de massa seca da amostra sólida (aprox. 0,8 g, tendo uma humidade residual de aprox. 12% em consideração) . Como um diluente, 3,2 ml de uma solução de trombina contendo 500 Ul/ml de trombina em cloreto de cálcio 40 mM e quer 0, 5, 15, 25, 50 ou 75 mg/ml de albumina de soro humano foi usada. O diluente e o componente sólido foram misturados ligando a seringa contendo o diluente (uma seringa de 5 ml padrão com um sistema Luer-lock fêmea) e a seringa que contém o componente seco e empurrando os conteúdos para trás e para a frente, pelo menos, 10 vezes (esta técnica de mistura é chamado "swooshing"). Em seguida, a amostra foi incubada durante 30 min à temperatura ambiente, antes da medição. Após a incubação, cada amostra foi "re-swooshed" duas vezes e a seringa contendo o produto (a seringa que anteriormente detinha o componente seco, como mencionado acima) foi ligada a um aplicador maleável (sistema de ligação Luer-lock fêmea, diâmetro interno de 2,29 milímetros contendo dois fios e tendo um comprimento total de 141,5 mm) . A seringa foi montada no aplicador e colocada no aparelho Instron e o teste foi iniciado.

As seringas e o aplicador estavam comercialmente disponíveis como partes do produto FloSeal Hemostatic Matrix da Baxter .

Os resultados para uma gelatina reticulada com glutaraldeído como no FloSeal estão representados na Fig. 1 e os da gelatina reticulada com genipina, como descrito em baixo, estão representados na Fig. 3 e também mostrados nas na Tabela 1 e Tabela 2 correspondentes. A consistência das pastas de gelatina reticuladas contendo 17,5% (p/p) de gelatina reticulada, dependendo da concentração de albumina é mostrada na Fig. 2 (com 0, 25, 50 e 75 g/1 de albumina de soro humano fornecida no componente de trombina).

Tabela 1: C(albumina)[g/1] no Força de Extrusão Desvio-padrão componente trombina [N] Õ 40 274

5 38 ITS 15 3Õ 276 25 25 277

50 19 ITT 60 19 I7Õ

Tabela 2: C(albumina)[g/1] no Força de Extrusão Desvio-padrão componente trombina [N]

Õ 54 ITT 15 29 377 50 17 272

Preparação de gelatina reticulada com genipina:

Colagénio derivado de bovino foi processado por tratamento alcalino e, subsequentemente, lavado com água desionizada (DIW, do inglês Deionized Water) para remover os sais residuais. A gelatina foi extraída por tratamento com calor e seca em folhas. As folhas foram moídas a um pó que era para ser processado usando genipina como um agente de reticulação. lkg de grânulos de gelatina foram adicionados a 201 de uma solução 10 mM de genipina em DIW. A reação foi realizada a um pH neutro (7,2), num tanque revestido de temperatura controlada a 23°C. O passo de mistura foi realizado durante 6 horas e a solução foi drenada, retendo-se os sólidos numa malha, e lavando-se completamente com DIW para lavar a genipina restante. O material foi ressuspenso numa solução 5% de H2O2 durante 20 horas. O material foi lavado completamente com DIW para remover a H2O2. Os sólidos foram pré-secos em papel de filtro sob vácuo e, em seguida, secos em estufa, durante 2,5 dias. A matriz seca foi moída em pó e colocada em seringas de plástico individuais antes da exposição à radiação gama.

Exemplo 2: Determinação da eficácia hemostática Materiais e métodos:

Modelo Animal

Para este modelo, uma laparotomia de incisão mediana é realizada, seguida de eletrocautério para parar o sangramento da incisão cirúrgica. O fígado é exposto e um lóbulo isolado. Uma punção-biópsia de 10 mm de diâmetro é usada para criar uma série de 2, lesões de espessura não-cheias, de aproximadamente 5 mm de profundidade, com o tecido central removido. Uma avaliação de pré-tratamento é feita da lesão, que inclui a recolha de sangue que flui de cada lesão, por 10 seg., com gaze previamente pesada.

Artigos de teste são randomizados e apresentados ao cirurgião que desconhece o tratamento da amostra.

Aproximadamente 1,0 ml do produto de teste designado é aplicado topicamente a uma lesão. Gaze humedecida com solução salina é usada para ajudar a aproximar os artigos de teste às suas lesões designadas, e o temporizador é iniciado. A gaze de aproximação humedecida com solução salina é removida depois de 30 segundos. O grau de hemorragia é avaliado aos 30, 60, 90, 120, 300 e 600 seg. após os artigos de teste serem aplicados às suas lesões designadas de acordo com as representações na Fig. 3 (pontuação de hemorragia: 0: sem sangramento (produto saturado com sangue), 1: gotejar (sangue para fora do produto, mas sem gota de sangue); 2: muito ligeira (gota de sangue sobre o produto); 3: leve (gota de sangue fluindo para baixo); 4: moderado (pequena quantidade de sangue fluindo para baixo); 5: (grande quantidade de sangue fluindo para baixo)). .

Produto saturado com sangue, mas sem hemorragia ativa é marcado como um "0" (zero). Solução salina é usada para irrigar o excesso de artigos de teste das lesões após a avaliação dos 300 seg. . O procedimento é repetido e realizado em múltiplos lóbulos hepáticos. Um único cirurgião cria, trata, e realiza as avaliações por observação. Síntese dos Artigos de teste

Artigos de teste para a avaliação in vivo no modelo fígado-porcino foram feitos através da preparação de pastas de gelatina reticulada (em concentrações de 14,5% e 17,5% com 25 ou 50 g/1 de albumina de soro humano na solução de trombina (com ou sem 2,5 % de PEG adicional)).

Os resultados estão representados nas Figs. 5 a 8 mostrando um melhor desempenho com 17,5% de gelatina e menos eficácia na presença de plastificantes (PEG).

Exemplo 3:

Amostras de gelatina foram formuladas de acordo com o folheto informativo para FloSeal com algumas exceções chave. Em primeiro lugar, cloreto de sódio foi usado em vez de cloreto de cálcio e a gelatina foi formulada a 125% de sólidos, em vez de 100%. As formulações de gelatina/trombina foram deixadas a repousar durante 25 minutos e, em seguida, 1 ml da preparação foi descartado. O outro 1 ml de material foi aplicado ao sistema de hemostasia tópica (THS) . O aparelho THS foi previamente preparado com plasma pobre em plaquetas. O THS é um dispositivo concebido para simular uma ferida que sangra. A ferida artificial é um furo cilíndrico num substrato de silicone. A superfície do cilindro de silicone foi revestida com uma camada de fibrinogénio. Uma bomba de seringa libertava o fluido de coagulação (sangue inteiro, plasma, etc.), neste caso, plasma pobre em plaquetas, enquanto que a pressão de retorno foi gravada. Nesta experiência, o plasma foi fluído a uma taxa fixa de 0,25 ml/min através de um pequeno orifício na parte inferior central da ferida cilíndrica. O excesso de plasma foi embebido com gaze imediatamente antes da aplicação da matriz hemostática. À medida que o plasma continuou a fluir, 1 ml da matriz hemostática foi aplicado à ferida cilíndrica. Esta foi imediatamente coberta com gaze molhada e uma pressão fixa foi aplicada. Após 30 segundos, o peso foi removido e o plasma continuou a fluir durante 8-10 minutos, altura em que o fluxo foi parado e o coágulo colocado numa câmara de humidade, onde permaneceu durante mais de 2 horas. No final das duas horas, o coágulo foi montado num vibrátomo a 8°C, onde secções de aproximadamente 500 m de espessura foram seccionadas a partir do coágulo. Estas secções foram imersas em tampão PBS. As secções foram armazenadas num frigorífico a 5°C quando não em uso. A secção foi colocada sobre uma lamela e visualizada com um microscópio confocal Nikon AIR usando o programa de computador NIS-Elements Advanced Research v3.22.00 Build 710. Para aquisição das micrografias, uma objetiva plan fluor lOx foi utilizada, com luz laser de excitação a 488nm e uma "janela" de recolha de emissão de 500-550nm. Uma imagem de luz transmitida foi adquirida simultaneamente, utilizando um detetor de luz transmitida. Com estes parâmetros de imagem, foi utilizada computação automatizada realizada pelo programa de computador para gerar mapas macroscópicos das amostras. Áreas menores das amostras foram também caracterizadas pela aquisição de pilha "Z"(z-stacks) 3D de imagens com uma espessura de corte ótico de 5,125 mO mapa confocal composto foi utilizado para identificar os grânulos de gelatina que estão localizados na superfície, e que foram seccionados. Isto foi importante para o posicionamento da medição da elasticidade no microscópio de força atómica (AFM) . A secção de coágulo foi montada num AFM multimodo Veeco. O multimodo foi equipado com um controlador Nanoscope V e um scanner piezoelétrico JV. As medidas de força foram feitas com um cantiléver AFM Novascan que suportou uma esfera de poliestireno 4,5 mA constante de força do cantiléver foi determinada como sendo de 0,779 N/m pelo método de sintonização térmico. O cantiléver foi colocado por cima do centro do grânulo de gelatina, e, em seguida, foram feitas medições de força numa matriz 16 xl6. Cada curva de força envolveu a movimentação do grânulo de gelatina até contactar com a esfera de poliestireno, e a continuação da movimentação do grânulo até que a deflexão cantiléver atingiu um valor de estímulo pré-estabelecido de 2 volts, altura em que a gelatina foi recolhida para uma distância de 1,00 micron da localização do estimulo.

Discussão

Os dados de fluorescência mostram que a gelatina reticulada com glutaraldeido não é uniformemente reticulada. Em vez disso, a densidade de reticulação parece maior em torno das extremidades dos grânulos, com a porção central do grânulo a ser significativamente menos reticulada do que as extremidades. Em contraste, a gelatina reticulada com genipina aparece uniformemente (homogeneamente) reticulada ao longo dos grânulos. Não há efeitos substanciais das extremidades à intensidade de fluorescência. A intensidade da fluorescência dos materiais reticulados com genipina e com glutaraldeido não pode ser diretamente comparada, por causa das diferenças de fluorescência potenciais atribuídas aos próprios agentes de reticulação. No entanto, a medição do módulo de elasticidade medido no AFM mostra que a gelatina reticulada com genipina é mais dura do que a gelatina reticulada com glutaraldeido, que parece ser mais macia (mais flexível).

Lisboa, 2015-11-12

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composição hemostática compreendendo gelatina reticulada na forma particulada adequada para utilização em hemóstase, em que a composição está presente na forma de pasta contendo 15,0 a 19,5% (p/p) de gelatina reticulada, preferencialmente 16,0 a 19,5% (p/p), 16,5 a 19,5% (p/p), 17,0 a 18,5% (p/p) ou 17,5 a 18,5% (p/p), sendo mais preferido 16,5 a 19,0% (p/p) ou 16,8 a 17,8% (p/p), sendo especialmente preferido 16,5 a 17,5% (p/p), e em que a composição compreende um melhorador de extrusão, em que o melhorador de extrusão é albumina numa quantidade entre 0,5 e 5,0% (p/p),
2. 2. Composição hemostática de acordo com a reivindicação 1, em que o melhorador de extrusão é albumina numa quantidade entre 1,0 e 5,0% (p/p), preferivelmente 2,0 a 4,5% (p/p), sendo mais preferido de 1,5 a 5,0% (p/p), sendo especialmente preferido cerca de 1,5% (p/p).
3. 3. Composição hemostática de acordo com as reivindicações 1 a 2, em que a gelatina reticulada é gelatina reticulada com glutaraldeido ou gelatina reticulada com genipina.
4. 4. Composição hemostática de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a gelatina reticulada é gelatina tipo B.
5. 5. Composição hemostática de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a gelatina reticulada está presente como material granular.
6. 6. Composição hemostática de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a gelatina reticulada tem um tamanho de partícula de 100 a 1000 m, preferencialmente 200 a 800 ,msendo mais preferido de 350 a 550 m.
7. 7. Composição hemostática de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a composição contém trombina, preferencialmente 10 a 1000 UI de trombina/ml, especialmente 250 a 700 UI de trombina/ml.
8. 8. Composição hemostática de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, para utilização no tratamento de uma lesão selecionada do grupo que consiste numa ferida, uma hemorragia, tecido danificado, tecido a sangrar e/ou defeitos ósseos.
9. 9. Kit para fazer uma pasta fluida de gelatina reticulada para o tratamento de uma lesão selecionada do grupo que consiste em uma ferida, uma hemorragia, tecido danificado e/ou a sangrar compreendendo a) uma composição hemostática seca compreendendo gelatina reticulada na forma particulada para ser reconstituída numa pasta fluida contendo 15,0 a 19,5% (p/p) de gelatina reticulada, preferencialmente 16,0 a 19,5% (p/p), 16,5 a 19,5% (p/p), 17,0 a 18,5% (p/p) ou 17,5 a 18,5% (p/p), sendo mais preferido 16,5 a 19,0% (p/p) ou 16,8 a 17,8% (p/p), sendo especialmente preferido 16,5 a 17,5 % (p/p), e b) um diluente farmaceuticamente aceitável para a reconstituição da composição hemostática, em que a composição ou o diluente compreendem albumina numa quantidade que conduz a uma concentração de albumina na pasta reconstituída entre 0,5 e 5,0% (p/p), preferencialmente 1,0 a 5,0% (p/p), preferivelmente 2,0 a 4,5% (p/p), sendo mais preferido de 1,5 a 5,0% (p/p), sendo especialmente preferido cerca de 1,5% (p/p).
10. 10. Kit de acordo com a reivindicação 9, em que o diluente farmaceuticamente aceitável compreende um tampão ou sistema tampão, preferencialmente a um pH de 3,0 a 10,0.
11. 11. Kit de acordo com a reivindicação 9 ou 10, em que o diluente farmaceuticamente aceitável compreende trombina, preferencialmente 10 a 1000 UI de trombina/ml, especialmente 250 a 700 UI de trombina/ml.
12. 12. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, em que o diluente farmaceuticamente aceitável contém uma substância selecionada do grupo consistindo em NaCl, CaCÍ2 e acetato de sódio.
13. 13. Método para proporcionar uma forma pronta-a-usar de uma composição hemostática de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a composição hemostática é proporcionada numa primeira seringa e um diluente para reconstituição é proporcionado numa segunda seringa, a primeira e a segunda seringas estão ligadas uma à outra, e o fluido é levado à primeira seringa para produzir uma forma fluida da composição hemostática; e, opcionalmente, retornando a forma fluida da composição hemostática à segunda seringa, pelo menos, uma vez.
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 13 em que a forma fluida da composição hemostática contém partículas as quais mais do que 50% (p/p) têm um tamanho de 100 a 1000 m, preferencialmente mais de 80% (p/p) têm um tamanho de 100 a 1000 m. Lisboa, 2015-11-12