JPH11506727A - コラーゲンを基礎とした送達マトリックス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 コラーゲン粒子を含んでなり、ここで前記粒子の各々は５μｍ〜８５０μｍの直径を有し、そして、ｐＨ約７．０の水溶液中に懸濁させたとき、−２０モル／モルコラーゲン〜−５００モル／モルコラーゲンまたは＋２０モル／モルコラーゲン〜＋２５０モル／モルコラーゲンの正味電荷密度を有する、コラーゲンに基づく送達マトリックス。また、このような送達マトリックスを使用して物品を製造する方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 コラーゲンを基礎とした送達マトリックス 発明の背景 本発明は、一般に、治療剤の送達に関する。 一般に、水溶性生物活性剤は水溶性／膨潤性コラーゲン送達マトリックスの中 に容易に混入することができる。これは水溶性生物活性剤をコラーゲン調製物と 混合し、生物活性剤をコラーゲンと共沈させ、生物活性剤を粘着マトリックスの 中に捕捉させるか、または生物活性剤にコラーゲン繊維をからみ合わせることに よって達成することができる。コラーゲン、特に繊維形成性コラーゲン、例えば 、Ｉ型コラーゲンは送達ビヒクルとしての用途を有するために、生細胞を包含す る多数の生物活性剤はコントロール可能な方法でコラーゲンマトリックスの中に 組込まれる。 送達の用途のためのコラーゲンの有用な性質にかかわらず、不溶性コラーゲン 粒子のマトリックスを使用して生物活性剤をより効果的にかつより効率よく送達 する方法はまだ開発されていない。 発明の要約 本発明の１つの面はコラーゲンに基づく送達マトリックスに関する。マトリッ クスはコラーゲン粒子（例えば、Ｉ型コラーゲンから製造される）を含み、ここ で前記粒子の各々は５μｍ〜８５０μｍ（好ましくは１５μｍ〜６００μｍ）の 直径を有し、そして、ｐＨ約７．０（すなわち、ｐＨ６．５〜７．８）の水溶液 中に懸濁させたとき、−２０モル／モルコラーゲン〜−５００モル／モルコラー ゲン（好ましくは−４０モル／モルコラーゲン〜−４００モル／モルコラーゲン ； そしてより好ましくは−１００モル／モルコラーゲン〜−３００モル／モルコラ ーゲン）の正味の負の電荷密度または＋２０モル／モルコラーゲン〜＋２５０モ ル／モルコラーゲン（好ましくは＋５０モル／モルコラーゲン〜＋２００モル／ モルコラーゲン、そしてより好ましくは＋１００モル／モルコラーゲン〜＋１６ ０モル／モルコラーゲン）の正味の正の電荷密度を有する。この開示において記 載するコラーゲン粒子の直径は、コラーゲン粒子を空気乾燥し、凍結乾燥するか 、または真空乾燥した後（すなわち、下記の実施例１、コラーゲン粒子の製造、 Ｅ．およびＦ．に記載されている条件、同等の条件下に）における粒子の最大直 径を意味する。また、本明細書において記載するコラーゲン粒子の電荷密度値は 、下記の実施例１、−４０〜−７０モル／モルへの正味電荷密度の変更、に記載 する式に基づいて計算された平均数であることに注意すべきである。 本発明の他の面は、コラーゲン送達マトリックスのためのコラーゲン粒子を製 造する方法に関する。この方法は、まずコラーゲン調製物（例えば、純粋なまた は実質的に純粋なコラーゲン、例えば、精製されたコラーゲン物質のヒドロキシ プロリン含量により示されるように、≧９０重量％のコラーゲン／精製された物 質の重量）を断片化（例えば、粉砕または切断により）して粒子を形成し、そし て次に各々の前記粒子が、ｐＨ約７．０（すなわち、ｐＨ６．５〜７．８）の水 溶液中に懸濁させたとき、−２０モル／モルコラーゲン〜−５００モル／モルコ ラーゲンまたは＋２０モル／モルコラーゲン〜＋２５０モル／モルコラーゲンの 正味電荷密度を有するように、前記粒子を化学的に変性する工程を含む。変性工 程の前または後に、５μｍ〜８５０μｍ（好ましくは１５μｍ〜６００μｍ）の 直径を有する粒子のみを、例えば、篩分けにより、選別することが望ましい。 また、コラーゲン粒子の各々は５μｍ〜８５０μｍ（好ましくは１５μｍ〜６ ００μｍ）の直径を有し、そして、ｐＨ約７．０（すなわち、ｐＨ６．５〜７． ８）の水溶液中に懸濁させたとき、−２０モル／モルコラーゲン〜−５００モル ／モルコラーゲンまたは＋２０モル／モルコラーゲン〜＋２５０モル／モルコラ ーゲンの正味電荷密度を有する、コラーゲン粒子を使用する方法は、本発明の範 囲内に入る。この方法は、３成分、すなわち、生物活性剤、水溶液、およびちょ うど記載したコラーゲン粒子を混合してペースト様物質を形成する工程を含む。 溶液は約７．０のｐＨを有することが好ましいが。より高いか、またはより低い ｐＨをある種の環境下に使用することができる。一般に、これらの成分の任意の １つをまず混合した後、第３成分を添加することができる。また、すべての３成 分を同時に一緒に配合することができる。ペースト様物質は、必要に応じて、さ らに加工（例えば、適切なマトリックスの形態に製作）した後、生物活性剤で治 療すべき被検体（哺乳動物、例えば、ヒトの患者）の中にまたは上に送達するこ とができる。送達は注射器、カニューレ、またはカテーテルで実施するか、また は外科的移植により実施することができる。 前述のコラーゲンに基づく送達マトリックスを使用して被検体に投与すること ができる生物活性剤は、下記のものを包含するが、これらに限定されない：成長 因子（例えば、形質転換成長因子−β、表皮成長因子、インスリン様成長因子、 血小板由来成長因子、線維芽細胞成長因子、および骨形態形成タンパク質）、プ ロスタグランジン、トロンビン、高分子（例えば、細胞付着タンパク質、例えば 、ラムニン、フィブロネクチンおよびコンドロネクチン、多糖、例えば、グリコ サミノグリカン、糖タンパク質、およびコラーゲン、例えば、Ｉ型コラーゲン〜 ＸＩＶ型コラーゲン）、生細胞、同種異系骨細片、自原性骨細片、リン酸三カル シウム、ヒドロキシアパタイト、炭酸カルシウム、およびバイオグラス。 本発明のコラーゲン粒子のマトリックスは、下記の実施例１、最後の節、に記 載されている方法により測定して、生物活性剤を含有する水溶液を吸収する高い 能力を有する。 本発明の他の特徴および利点は、いくつかの態様の下記の詳細な説明、および 、 また、添付した請求の範囲から明らかであろう。 発明の詳細な説明 本発明によるコラーゲン粒子の送達マトリックスは、５μｍ〜８５０μｍの直 径を有し、そして、約７．０（すなわち、６．５〜７．８）のｐＨ値の水溶液中 に懸濁させたとき、−２０モル／モルコラーゲン〜−５００モル／モルコラーゲ ンまたは＋２０モル／モルコラーゲン〜＋２５０モル／モルコラーゲンの範囲の 正味電荷密度を有する、高度に親水性の、不溶性コラーゲン粒子から構成されて いる。 例えば、本発明のコラーゲンに基づく送達マトリックスは天然のＩ型コラーゲ ンから製造することができる。Ｉ型コラーゲン分子は約２５０の正に帯電した基 （リジンおよびヒドロキシルリジンのε−アミノ基の各々はｐＨ９より大きいｐ Ｋを有し、そしてアルギニンのグアニジノ基はｐＨ１２より大きいｐＫを有する ）、および約２５０の負に帯電した基（アスパラギン酸のβ−カルボキシル基お よびグルタミン酸のγ−カルボキシル基の各々はｐＨ５より小さいｐＫを有する ）を有する。その結果、約７．０（すなわち、６．５〜７．８）のｐＨ値におい て、コラーゲン分子は電気的に中性であり、そしてその結果、その粒子は有効な 凝着マトリックスを形成しない。 各々が約７．０（すなわち、６．５〜７．８）のｐＨにおいて所望の正味の負 の電荷密度を有するコラーゲン粒子をもつコラーゲンに基づく送達マトリックス を得るためには、コラーゲン粒子のリジンおよびヒドロキシルリジンのε−アミ ノ基を化学的変性反応、例えば、酢酸無水物を使用するアセチル化反応に付して 、正に電荷したε−アミノ基を中性のアセチル基に変換する。約１００ε−アミ ノ基／Ｉ型コラーゲン分子が存在するので、完全にアセチル化されたコラーゲン の正味電荷密度は約７．０（すなわち、６．５〜７．８）のｐＨにおいて−１０ ０ モル／モルコラーゲンとなり、そして負に帯電したカルボキシル基の反発的静電 相互作用の結果、コラーゲンはいっそう親水性となり、水をいっそう吸収する（ 膨潤する）。親水性（膨潤能力）をさらに増加するために、リジンおよびヒドロ キシルリジンのε−アミノ基はコハク酸無水物を使用するスクシニル化によりカ ルボキシル基に変換することができる（電荷の逆転）。したがって、完全にスク シニル化されたコラーゲンの正味電荷密度は約−２００モル／モルコラーゲンで ある。コラーゲンの親水性（または正味電荷密度）のさらにより高い程度は、順 次の化学的変性により、例えば、まずアルカリ性条件において次亜臭素酸塩の存 在において脱グアニジン化することによってコラーゲン中のアルギニンのすべて のグアニジノ基をアミノ基に変換し（アルギニンをオルニチンに変換し）、次い でコハク酸無水物を使用してスクシニル化することによって、得ることができる 。これらの順次の変性から生ずる正味電荷密度は、約７．０（すなわち、６．５ 〜７．８）のｐＨにおいて約−５００モル／モルコラーゲンである。 正味の正の電荷密度を有するコラーゲン粒子は、また、カルボキシル基を変性 して、例えば、メチルアルコールを使用するエステル化反応により、カルボキシ ル基をメチルエステル基に変換することによって、製造することができる。完全 にメチル化されたコラーゲンは、約＋２５０モル／モルコラーゲンの正味電荷密 度を有する。負に帯電したコラーゲンと同様に、正に帯電したコラーゲンは、リ ジン、ヒドロキシリジンおよびアルギニンのアミノ基とグアニジノ基との間の反 発的電荷相互作用のために、約７．０（すなわち、６．５〜７．８）のｐＨにお いて高度の親水性を有し、膨潤する。 必要に応じて、ポリアニオン性ポリマー、例えば、アルギニン酸またはポリグ ルタミン酸をコラーゲン粒子に、架橋剤、例えば、カーボジイミドを使用して、 共有結合させ、ポリアニオン性ポリマーのカルボキシル基とコラーゲンのアミノ 基との間でアミド結合を形成することができる。そのように実施することによっ て、カルボキシル基／コラーゲン分子の平均数が増加する結果、コラーゲン粒子 の正味電荷密度は増加する。コラーゲンマトリックスの中へのポリアニオン性ポ リマーの組込みはポリマーの直径に依存し、したがって、ポリマーとコラーゲン との間の有効なカップリングのためのコラーゲンマトリックスの中へのポリマー の拡散速度に依存する。無効のカップリングは表面カップリングを生し、これは マトリックスの有意な膨潤を発生させないことを指摘しなくてはならない。カッ プリング反応をマトリックスの膨潤条件下に、例えば、４より低いか、または１ １より高いｐＨにおいて、実施して、コラーゲンマトリックスの内部空間の中へ のポリマーの拡散を促進することによって、いっそう有効な組込みを達成するこ とができる。 さらに、ポリカチオンポリマーのアミノ基がコラーゲン中のカルボキシル基に 結合するように、架橋剤としてカーボジイミドを使用して、ポリカチオンポリマ ー、例えば、ポリリジン、シトサンおよびその他をコラーゲンマトリックスに共 有結合的にカップリングさせることができる。そのように実施することによって 、アミノ基／コラーゲン分子の平均数が増加するとともに、コラーゲン粒子の正 味電荷密度は増加する。 正味の正の電荷を有するペプチドまたはタンパク質を送達するために、正味の 負の電荷を有するコラーゲン送達マトリックスはいっそう望ましい。送達マトリ ックスは、機械的相互作用、例えば、からみ合いおよび捕捉に加えて、静電相互 作用により、生物活性ペプチドまたはタンパク質と結合する働きをする。他方に おいて、正味の負の電荷を有するペプチドまたはタンパク質を送達するために、 正味の正の電荷を有する送達マトリックスはいっそう望ましい。さらに、送達す べき生物活性剤の直径に依存して、問題の特定の生物活性剤の効能を最大にする ためにマトリックスの最適な送達条件を得ることができるように、マトリックス 内のコラーゲン分子の反発的相互作用（膨潤）の程度をコントロールすることが できる。ある種の生物活性剤の解放速度をコントロールする追加の手段として、 この分野においてよく知られている方法により、まず生物活性剤をリポソーム、 マイクロカプセルの形態で被包するか、または合成ポリマーの中に含浸させるこ とはしばしば望ましい。この特定の場合において、生物活性剤を含有するリポソ ーム、マイクロカプセルまたは合成ポリマーをまず水溶液中に分散させ、次いで これをコラーゲン送達マトリックスと混合して、送達用のペースト様マトリック スを形成することができる。 送達すべき生物活性剤が不溶性物質、例えば、骨細片または粒子、バイオグラ スまたはヒドロキシアパタイト粒子であるとき、約７．０（すなわち、６．５〜 ７．８）のｐＨにおいて送達マトリックスからのこれらの生物活性物質に対して 発揮される凝着の機械的力により、コラーゲン粒子の送達マトリックスの中にこ れらの生物活性物質を組込むことができる。 本発明の送達マトリックスの粒子直径は重要である。８５０μｍより大きい直 径を有する乾燥コラーゲン粒子は、一般に、凝着性ペースト様マトリックスの形 成において、したがって、それらの送達能力において有効ではない。これは大き い粒子の表面積の減少し、粒子間の相互作用が減少のためである。他方において 、粒子直径が小さ過ぎる場合、例えば、５μｍより小さいとき、粒子はｉｎ ｖ ｉｖｏにおいて炎症性細胞による食作用に暴露されるか、または送達部位から外 に移動し、これによりその場における送達マトリックスの滞留時間が最小となり 、会合した生物活性剤は急速に消失する。例えば、８５０μｍより大きいコラー ゲン粒子は、凝着性ペースト様物質を形成するよりむしろ、水和したとき第２様 特性を生成する傾向がある。 生物活性剤を含有するコラーゲンマトリックスは、直接的移植により、注射器 、カニューレ、または経皮的アプローチを介するカテーテルを使用するか、また はペースト様物質が問題の組織または器官の部位に送達されかつ順応するように 、 関節鏡検査的に補助された外科的アプローチにより、特定の組織または器官の部 位に送達することができる。 例えば、Ｉ型コラーゲンを使用して本発明の送達マトリックスを製造するとき 、それはヒトまたは動物からの任意のＩ型コラーゲンに富んだ組織さから得るこ とができる。これらの組織は、皮膚、骨、腱、および靭帯を包含するが、これら に限定されない。動物組織は、コントロールされた条件下に新鮮な組織を大量で 得ることが容易であるので、好ましい。下記の手順を使用して、腱からＩ型コラ ーゲン粒子の送達マトリックスを製造することができる： 腱を筋膜および余分の組織の除去により清浄にし、細かく切る。細かく切った 腱を１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０中で抽出して、新しく合成されかつ安定なフィ ブリルの中にまだ組込まれていないコラーゲン分子、ならびに非共有結合的相互 作用によりコラーゲンと会合した糖タンパク質およびプロテオグリカンの小部分 を除去する。他の塩、例えば、塩化カリウムおよびその他を塩化ナトリウムの代 替物として使用することができる。 細胞膜またはコラーゲン質組織に関連する脂質を、まず洗浄剤、例えば、トリ トンＸ−１００（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、ミズーリ州セントル イス）で抽出し、エーテル−エタノール混合物で抽出する。トリトンＸ−１００ の濃度は通常約２％〜４％であるが、好ましくは約３％である。エーテル−エタ ノールの好ましい混合物は通常約１：１比（ｖ／ｖ）である。抽出時間は通常約 ８時間〜約９６時間であるが、好ましくは約２４〜４８時間である。 それ以上の精製は、腱を酸性および塩基性の条件下に抽出することによって達 成することができる。酸性および塩基性の双方の抽出は非共有結合の分子間相互 作用を弱化し、これにより非共有結合的に結合した糖タンパク質、グリコサミノ グリカン（「ＧＡＧｓ」），および他の非コラーゲン分子の解放を促進する。 アルカリ性条件下の腱の抽出は、腱をＣａ（ＯＨ）₂、ＮａＯＨ、またはその 他で、ｐＨ１２〜１３において、８〜９６時間、構造安定化塩、例えば、（ＮＨ₄ ）₂ＳＯ₄、Ｎａ₂ＳＯ₄およびその他の存在において処理して、コラーゲンの変 性の潜在的危険を最小にすることによって達成される。アルカリ処理は非架橋糖 タンパク質およびＧＡＧｓをコラーゲン分子から解離させ、また、残留脂質を鹸 化により除去する。 酸抽出は構造安定化塩の存在において３以下のｐＨにおいて実施することがで きる。酸、例えば、酢酸、塩酸、またはその他を使用することができる。アルカ リ性抽出と同様に、酸抽出は非架橋の糖タンパク質およびＧＡＧｓを除去する。 コラーゲン分子の非三重螺旋部分（テロペプチド）が分子間架橋の形成に関係 づけられる。それらの部分は弱い抗原であり、そしてプロテアーゼ、例えば、ペ プシン、トリプシン、およびその他による攻撃に対する感受性である。このよう なプロテアーゼによる延長した消化は、フィブリルを個々の分子に解離させる。 しかしながら、最大のテロペプチドが完全な解離なしに除去されるように、消化 のプロセスを適切にコントロールするとき、機械的強さを有意に危うくしないで 、フィブリルの免疫原性をさらに減少することができる。例えば、コラーゲンモ ノマー（送達マトリックスにおいて使用するために不適当である）を単離するた めに、ペプシンを使用する皮膚または腱の消化は通常約１：１０（ｗ／ｗ）の酵 素：コラーゲンの比で約２４〜９６時間、室温以下の温度において実施される。 他方において、送達マトリックスにおいて使用するために適当である、コラーゲ ンのフィブリルは、約１：２００（酵素：コラーゲン、ｗ／ｗ）の比で約１０〜 ４８時間、４℃において達成される制限されたペプシン消化により、得ることが できる。 １つの態様において、精製されたコラーゲンを、化学的変性前に、さらに処置 して適当な直径の粒子を製造する。例えば、精製されたコラーゲン繊維をまず空 気または真空乾燥し、次いで切断または粉砕し、篩分けして、５μｍ〜８５０μ ｍの直径を有する粒子を製造する。任意の商業的粉砕装置をこの目的に使用する ことができる。繊維に基づくコラーゲン物質、例えば、腱または皮膚から得られ たものの粉砕または切断は、種々の直径の不規則の形状の繊維質粒子を生成し、 次いでこれらを分粒して前もって決定した直径の粒子を得る。種々のメッシュ大 きさの商用篩はこの分粒に適当である。 コラーゲン粒子の正味電荷密度を変更するために使用できる化学的変性の例示 的例を下記表に記載する： † 記載する値はｐＨ７．４において測定し、直径５μｍ〜８５０μｍを有す る乾燥コラーゲン粒子を使用する１または２以上の変性により得ることができる 最大値を表す。 ^a Ｂｏｗｅｓ、ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．４３：３６５−３７２、 １９４８。 ^b Ｇｒｅｅｎ、ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．５４：１８１−１８７、 １９５３。 ^c Ｇｕｓｔａｖｓｃｎ、Ａｒｋｉｖ ｆｏｒ Ｋｅｍｉ １７：５４１−５ ５０、１９６１。 ^d Ｂｏｓｅ ｅｔ ａｌ．、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａ ｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．７４：４６、１９５８。 ^e Ｆｒａｅｎｋｅｌ−Ｃｏｎｒａｔ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ ｍ．１６１：２５９−２６８、１９４５。 当業者は、本明細書における説明に基づいて、本発明をその完全に利用するこ とができると考えられる。したがって、下記の特定の態様は、単に例示であり、 開示の残部をいかなる方法においても限定するものでないと解釈すべきである。 すべての本明細書において引用する刊行物は引用することによって本明細書の一 部とされる。 実施例１コラーゲン粒子の製造 Ａ．機械的崩壊 ウシアキレス腱をＵＳＤＡ承認屠殺場から入手した。特記しない限り、組織を 精製プロセスの間に冷たく保持して、細菌の汚染および組織の分解を最小にした 。 注意して選択した腱の付着組織をまず機械的に引っ掻いて除去した。腱を微細 片に切り、過剰量（１０体積）の冷水中で洗浄して、残留する血液タンパク質お よび水溶性物質を除去した。 Ｂ．塩抽出 洗浄した腱を１０体積の５％ＮａＣｌ、０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中 で２４時間抽出して、塩可溶性物質を除去した。塩抽出した腱を約１０体積の水 で洗浄して塩を除去した。 Ｃ．脂質抽出 この物質を３％トリトンＸ−１００中で２４時間抽出した。水でよく洗浄して 洗浄剤を除去した。次いで、この物質を３〜４体積のエーテル−エタノール（１ ：１ｖ／ｖ）中で２４（±２）時間抽出して、脂質含量を最小にした。脂質抽出 した物質を水中でよく水して、エーテルおよびエタノールを除去した。 Ｄ．酸および塩基の抽出 この物質を酸および塩基で抽出して、非コラーゲン物質を除去した。塩基抽出 は、３〜４体積の０．１Ｍ ＮａＯＨを使用して室温において１．０Ｍ Ｎａ₂ ＳＯ₄の存在下に２４（±２）時間おだやかに撹拌しながら実施した。塩基抽出 後、ｐＨを０．１Ｍ ＨＣｌで中和した。次いで、濃乳酸を０．２Ｍの最終濃度 に添加することによって、ｐＨを２．５に調節した。酸抽出を撹拌しながら２４ （±２）時間実施した。酸抽出したコラーゲン繊維を蒸留水でよく洗浄した。 Ｅ．コアセルベーション 次いで、ｐＨをｐＨ６．５〜７．０の間のその等電点に０．１Ｍ ＮａＯＨで 調節することによって、部分的に膨潤したフィブリル物質をコアセルベートした 。コアセルベートしたコラーゲン繊維を濾過により収獲し、濾過した物質を冷蒸 留水でよく洗浄した。高度に精製されたコラーゲン（Ｉ型コラーゲン）を凍結乾 燥し（まず−１０℃、＜２００μｍＨｇの真空において２４時間、次いで２０℃ 、＜２００μｍＨｇの真空において２４時間）、室温において乾燥繊維として貯 蔵した。 Ｆ．粉砕および篩がけ 精製されたコラーゲン繊維物質をまず真空乾燥して（２０℃、＜２００μｍＨ ｇの真空において２４時間）、貯蔵の間に吸収した湿分を温度し、次いでトマス ・ウィリイ・ミル（Ｔｈｏｍａｓ ｗｉｌｅｙ Ｍｉｌｌ）（Ｔｈｏｍａｓ Ｓ ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ニュージャージイ州スウェデスボロ）中で粉砕した。粉砕 したコラーゲン粒子をメッシュ大きさ４０（４５０μｍ）とメッシュ大きさ４０ ０（４０μｍ）との間で篩がけして、４０〜４５０μｍの直接を有する粒子を集 めた。−４０〜−７０モル／モルへの正味電荷密度の変更 １０ｇのこうして得られたコラーゲン粒子を、１．１Ｍ ＮａＯＨ溶液中で三 重螺旋の安定化塩として１．０Ｍ Ｎａ₂ＳＯ₄の存在下に室温において一定に撹 拌しながら２４時間脱アミド化した。脱アミド化コラーゲン繊維を、約ｐＨ５に 前もって調節した蒸留水でよく洗浄して、膨潤を最小にした。脱アミド化し、洗 浄したコラーゲン繊維を集め、空気乾燥した。 正味電荷（Ｚ）を測定する方法は、帯電したタンパク質分子および分子間溶媒 の双方に電気的中性の条件を適用することに基づく。正味電荷は下記の方程式に 基づいて計算される：Ｚ＝Γ_Cl−Γ_Na、ここでΓは、コラーゲンが極性残基をも たなかった場合存在したであろう量を越える、分子間空間中のナトリウムイオン および塩素イオンの過剰を表す。典型的なΓは下記のようにして決定される： 真空乾燥したコラーゲン粒子の１ｇの試料を、放射性ナトリウム（²²Ｎａ）ま たは塩化物（³⁶Ｃｌ）の存在下に室温において震盪しながら、過剰量の０．１６ Ｍ ＮａＣｌ溶液と２４時間平衡化する。次いで、秤量したアリコートの上澄み 液を採って、溶液１ｍｌ当たりの放射能のモル数を測定する。次いで、湿潤コラ ーゲン試料を秤量してポリプロピレン試験管の中に入れ、放射性物質を２４時間 痕跡を残さない溶液で抽出した。ベータ放射線を液体シンチレーションカウンタ ーでアッセイし、そしてガンマ放射線をガンマ分光光度計でアッセイする。反応 したコラーゲン試料をＰ₂Ｏ₅上で７２時間乾燥することによって、コラーゲンの 重量を得る。Γを下記式に従い計算する。 Γ（モル／モル）＝［ｍ＊／Ｃ＊−ｇ_t／ρ］Ｃ×Ｍ_c×１０^-3／ｇ_c ここでｇ_cおよびｇ_tは分析した試料中の、それぞれ、コラーゲンおよび溶液の重 量であり、ｍ＊は存在する²²Ｎａまたは³⁶Ｃｌの量であり、Ｃ＊およびｃは平衡 における反応溶液中の²²ＮａおよびＮａ⁺または³⁶ＣｌまたはＣｌ^-のモル濃度を 表し、Ｍ_cはコラーゲンの分子量であり、そしてρは平衡溶液の密度である。 上記方法により測定した、種々のバッチからの脱アミド化コラーゲン粒子の正 味電荷は、−４０モル／モル〜−７０モル／モルの範囲であることが見出された 。 コラーゲン粒子の平均等電点を下記のようにして測定した：１ｇのコラーゲン 試料を１００ｍｌの０．０７Ｍ乳酸溶液、ｐＨ２．５中に均一に分散させ、均質 化させた。０．５％ＮＨ₄ＯＨ溶液を分散したコラーゲンにゆっくり添加した。 相の完全な分離が起こるまで、コラーゲン分散液のｐＨを連続的に監視した。完 全な分離における溶液のｐＨを、コラーゲン調製物の平均等電点の推定値として 採用した。種々のバッチからの脱アミド化コラーゲン粒子についての等電点は、 ｐＨ４．４〜約５．０の範囲であることが見出された。 真空乾燥したプロピオン酸ビニルの１ｇの試料を試験管の中に秤量して入れ、 これにリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４をゆっくり添加した。各０．２５ｍｌ の溶液が添加された後、試験管を倒立させた。試験管を倒立させたときコラーゲ ン粒子と溶液との間に透明相が分離しないで、最大量の溶液が試料の中に吸収さ れたとき、飽和点に到達した。相分離なしに吸収された溶液の最大体積を、コラ ーゲン送達マトリックスの吸収容量（乾燥コラーゲンの１ｇ当たりの溶液のグラ ム単位）として採用した。試料は約１０ｇ溶液／ｇコラーゲンの溶液吸収容量を 有した。 実施例２コラーゲン粒子の製造 上記実施例１に記載する方法と同一の方法において、コラーゲン粒子を製造し た。−４０〜−１００モル／モルへの正味電荷密度の変更 １０ｇのこうして得られたコラーゲン粒子を、２００ｍｌの半飽和酢酸ナトリ ウムｐＨ８中で室温において２〜４時間インキュベートした。溶液のｐＨを１Ｍ ＮａＯＨを使用する調節により約８に維持しながら、コラーゲン粒子を含有す る酢酸ナトリウム溶液に２０ｍｌの酢酸無水物を４〜８時間でゆっくり添加した 。次いで、アセチル化コラーゲン粒子を、脱イオン、蒸留水で広範に洗浄し、使 用するまで空気乾燥した。 種々のバッチからのアセチル化コラーゲン粒子の正味電荷を、上記実施例１に 記載する同一方法により測定し、−４０モル／モル〜−１００モル／モル範囲で あることが見出された。 実施例３コラーゲン粒子の製造 上記実施例１に記載する方法と同一の方法において、コラーゲン粒子を製造し た。−１００〜−２００モル／モルへの正味電荷密度の変更 １０ｇのこうして得られたコラーゲン粒子を、２００ｍｌの３％重炭酸ナトリ ウム溶液中で室温において一夜インキュベートした。５ｇの量の微細な粉末状コ ハク酸無水物を、撹拌しながら４〜８時間かけて徐々に添加した。この系を１Ｍ ＮａＯＨの徐々の添加によりｐＨ範囲８〜８．５に保持した。撹拌をさらに４ 〜８時間続けた。次いでスクシニル化コラーゲン粒子を、脱イオン、蒸留水で広 範に洗浄し、空気乾燥し、使用するまで貯蔵した。 種々のバッチからのスクシニル化コラーゲン粒子の正味電荷を、上記実施例１ に記載する同一方法により測定し、−１００モル／モル〜−２００モル／モル範 囲であることが見出された。 実施例４コラーゲン粒子の製造 上記実施例１に記載する方法と同一の方法において、コラーゲン粒子を製造し た。４０〜２５０モル／モルへの正味電荷密度の変更 １０ｇのこうして得られたコラーゲン粒子を、５００ｍｌのメチルアルコール 中で０．１Ｎ ＨＣｌ存在下に室温において２４時間インキュベートした。メチ ル化コラーゲン粒子をメタノール中で数回洗浄して、空気乾燥した。 種々のバッチからのメチル化コラーゲン粒子の正味電荷を、上記実施例１に記 載する同一方法により測定し、＋４０モル／モル〜＋２５０モル／モル範囲であ ることが見出された。 実施例５骨形態形成タンパク質の送達 ２，０００μｇの骨形態形成タンパク質（「ＢＭＰ」）をまず１ｍｌの中性生 理食塩水中で均一に混合した。次いで、１ｇの実施例１からのコラーゲン粒子を ＢＭＰ溶液（１ｍｌの蒸留水中に溶解した）と混合した。さらに１ｍｌの生理食 塩水を混合物にゆっくり添加してペースト様物質を得た。 ＢＭＰを含有するペースト様物質を成体のビーグル犬に下記の手順に従い投与 した：腰椎部位を標準的外科的手順に従い用意し、ドレープして、棘突起、背中 の脊椎板および隣接する面を露出させた。棘突起の表面、背中の脊椎板および面 を高速バーで脱皮質して、新鮮な出血する骨を露出させた。完全に混合したペー スト様マトリックスを脱皮質した脊椎板の部位の中に挿入して、脊髄の融合を促 進させた。 他の態様 上記説明から、当業者は本発明の必須の特徴を容易に確認することができ、そ して本発明の精神および範囲から逸脱しないで本発明を種々の用途および条件に 合致させるように種々の変化および変更を行うことができる。したがって、他の 態様も請求の範囲内に入る。 例えば、副題の発明の詳細な説明の下に記載した方法において、ポリアニオン 性またはポリカチオン性のポリマーを使用して、非常に高い正味電荷密度（例え ば、−１，０００または＋１，０００モル／モル）を有するコラーゲン粒子を得 ることができる。このような粒子、それらの製造、およびそれらの使用は、また 、同等の態様の理論の下に本発明の精神の範囲内に入る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． コラーゲン粒子を含んでなるコラーゲンを基礎とした送達マトリックス であって、前記粒子の各々は５μｍ〜８５０μｍの直径を有し、そして、ｐＨ約 ７．０の水溶液中に懸濁させたとき、−２０モル／モルコラーゲン〜−５００モ ル／モルコラーゲンの正味電荷密度を有するコラーゲン送達マトリックス。 ２． 前記粒子の各々が１５μｍ〜６００μｍの直径を有する、請求項１に記 載のコラーゲン送達マトリックス。 ３． 前記粒子の各々が−４０モル／モルコラーゲン〜−４００モル／モルコ ラーゲンの正味電荷密度を有する、請求項１に記載のコラーゲン送達マトリック ス。 ４． 前記粒子の各々が−１００モル／モルコラーゲン〜−３００モル／モル コラーゲンの正味電荷密度を有する、請求項３に記載のコラーゲン送達マトリッ クス。 ５． 前記粒子の各々が−４０モル／モルコラーゲン〜−４００モル／モルコ ラーゲンの正味電荷密度を有する、請求項２に記載のコラーゲン送達マトリック ス。 ６． 前記粒子の各々が−１００モル／モルコラーゲン〜−３００モル／モル コラーゲンの正味電荷密度を有する、請求項５に記載のコラーゲン送達マトリッ クス。 ７． コラーゲン粒子を含んでなり、ここで前記粒子の各々は５μｍ〜８５０ μｍの直径を有し、そして、ｐＨ約７．０の水溶液中に懸濁させたとき、＋２０ モル／モルコラーゲン〜＋２５０モル／モルコラーゲンの正味電荷密度を有する 、コラーゲンを基礎とした送達マトリックス。 ８． 前記粒子の各々が１５μｍ〜６００μｍの直径を有する、請求項７に記 載のコラーゲン送達マトリックス。 ９． 前記粒子の各々が＋５０モル／モルコラーゲン〜＋２００モル／モルコ ラーゲンの正味電荷密度を有する、請求項７に記載のコラーゲン送達マトリック ス。 １０． 前記粒子の各々が＋１００モル／モルコラーゲン〜＋１６０モル／モ ルコラーゲンの正味電荷密度を有する、請求項９に記載のコラーゲン送達マトリ ックス。 １１． 前記粒子の各々が＋５０モル／モルコラーゲン〜＋２００モル／モル コラーゲンの正味電荷密度を有する、請求項８に記載のコラーゲン送達マトリッ クス。 １２． 前記粒子の各々が＋１００モル／モルコラーゲン〜＋１６０モル／モ ルコラーゲンの正味電荷密度を有する、請求項１１に記載のコラーゲン送達マト リックス。 １３． コラーゲン調製物を断片化して粒子を形成し、そして 各々の前記粒子が、ｐＨ約７．０の水溶液中に懸濁させたとき、−２０モル／ モルコラーゲン〜−５００モル／モルコラーゲンまたは＋２０モル／モルコラー ゲン〜＋２５０モル／モルコラーゲンの正味電荷密度を有するように、前記粒子 を化学的に変性する、ことを含む、コラーゲン送達マトリックス用コラーゲン粒 子の製造法。 １４． 変性工程の前または後に、５μｍ〜８５０μｍの直径を有する粒子を 選別することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。 １５． １５μｍ〜６００μｍの直径を有する粒子を選別する、請求項１４に 記載の方法。 １６． コラーゲン粒子、生物活性剤、および水溶液を混合してペースト様物 質を形成することを含むコラーゲン粒子の使用方法であって、前記粒子の各々は ５μｍ〜８５０μｍの直径を有し、そして、ｐＨ約７．０の水溶液中に懸濁させ たとき、−２０モル／モルコラーゲン〜−５００モル／モルコラーゲンまたは＋ ２０モル／モルコラーゲン〜＋２５０モル／モルコラーゲンの正味電荷密度を有 する方法。 １７． 前記粒子の各々が１５μｍ〜６００μｍの直径を有する、請求項１６ に記載のコラーゲン送達マトリックス。 １８． ペースト様物質を生物活性剤で治療すべき被検体に送達することをさ らに含む、請求項１７に記載の方法。 １９． 送達工程を注射器で実施する、請求項１８に記載の方法。 ２０． 送達工程をカニューレで実施する、請求項１８に記載の方法。 ２１． 送達工程をカテーテルで実施する、請求項１８に記載の方法。 ２２． 送達工程を外科的移植で実施する、請求項１８に記載の方法。