KR20210052167A - 골 무기질 성분을 함유하는 복합 탈회골 조성물 및 그 제조공정 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 One-step 공정을 이용한 복합 탈회골 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 복합 탈회골 조성물은 생체유래 골로부터 제조된다. 그리고, 본 발명에 의해 제조된 복합 탈회골 조성물은 골 무기질을 골 본래의 조성 비율대로 조성물에 함유하고, 체내에서 골형성이 이루어지는 환경에 가장 근접한 골 무기질 함량 조건을 제공할 수 있다. 더불어 골형성 단백질(BMP-2)을 포함함으로써 안정적이면서 우수한 골형성 효과를 이끌어낼 수 있다.

Description

골 무기질 성분을 함유하는 복합 탈회골 조성물 및 그 제조공정 {DEMINERALIZED BONE MATRIX (DBM) COMPLEX CONTAINING BONE-DERIVED MINERALS AND MANUFACTURING PROCESS THEREOF}
본 발명은 골 무기질 및 탈회골을 함유하는 복합 탈회골 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 골 무기질, 탈회골 및 고분자 부형재를 함유하는 복합 제형의 골 이식용 조성물에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 생체유래 골(bone)로부터 얻어진 골 무기질이 골 본래와 유사한 조성 비율대로 탈회골과 혼합되어 있는 복합 무기질-탈회골(이하, 복합 탈회골) 조성물, 이를 제조하는 제조 공정인 One-step 공정, 그리고 복합 탈회골 조성물의 제형을 유지시키는 생체유래 고분자 부형재에 관한 것이다.
노령 인구의 증가, 산업사회의 다양화에 따른 외과적 사고율의 증가 및 의료시술의 발전 등과 맞물려, 골 재생용 골이식재의 수요와 필요성이 증가하고 있고, 보다 안전하고 효율적이며 우수한 골 재생능을 가지는 골이식재에 대한 기술의 요구도 더욱 높아지고 있는 추세이다.
통상적으로, 골이식재는 자가골이식재, 이종골이식재, 합성골이식재 및 동종골이식재 등으로 분류할 수 있다. 자가골 이식(autograft)은 비 자가골 이식이나 합성골 이식에 비해 상대적으로 면역반응에서 자유로울 수 있다는 장점을 지닌다. 자가골 이식은 환자 골의 기질뿐만 아니라 자가세포도 함께 이식되기 때문에, 골의 재생능(Osteogenesis) 면에서 다른 이식재에 비해 상대적으로 유리하고, 골유도능(Osteoinductivity) 및 골전도능(Osteoconductivity)이 우수한 장점이 있다. 그러나 시술에 필요한 충분한 양을 수득하기 어렵고, 수득하고자 하는 형태의 자가골을 얻는 것 또한 쉽지 않다. 그리고 골 공여부에서의 부가적인 수술로 인한 절개와 출혈, 혈종과 골절의 발생 및 수혈을 필요로 할 수 있으며, 신경 손상, 감각 소실과 골 공여부의 만성 동통 및 불안정성 등의 문제를 발생시킬 수 있다. 이종골이식재는 골유도능은 없으나 자가골 채취의 단점을 보완하고자 등장하였다. 그러나, 상기 이종골이식재는 골 생성 속도 및 신생골 형성능이 자가골 및 동종골에 비하여 낮은 단점을 가진다. 골유도능이 없는 합성골이식재는 자연산호를 이용하여 탄산칼슘을 추출하거나, 화학적으로 탄산칼슘과 인산칼슘을 사용하여 만들어진다. 칼슘 대 인의 비율(Ca/P ratio)을 1.67로 맞추어 합성하기 때문에 인체 골조직의 Ca/P ratio와 유사하다. 체내 독성이 낮다는 장점이 있으나, 합성재료가 가지는 체내 흡수율 문제나 낮은 강도 등의 문제는 단점으로 남아 있다. 마지막으로, 동종골이식재는 자가골이식재와는 달리, 골을 형성하는 세포가 존재하지 않으므로 직접적인 골재생능은 없다. 또한 골 전구세포가 자극을 받아 조골세포로 분화되는 골유도능이 없으며, 이식되는 환부의 인접 조직에서 골형성을 위한 공간을 제공하는 골전도능만을 가지고 있다. 다만 동종골이식재는 시술에 이용할 수 있는 충분한 이식재의 양을 확보할 수 있기 때문에, 어렵게 자가골을 수득하지 않아도 되는 장점을 지닌다. 이렇게 동종골이식재가 골유도 능력 없이 골전도 능력만을 가지는 이유는 골성분 중 무기질인 인산칼슘에 의해 갇혀진 골 형성 단백질(Bone Morphogenetic Protein, BMP)이 제대로 작용하지 못하기 때문이다. 따라서 BMP가 골유도에 적절하게 관여할 수 있도록 개발된 동종골이식재가 바로 탈회골(Demineralized Bone Matrix, DBM)이다. 일반적으로, 탈회골은 골에서 무기질 성분을 제거하는 탈회과정을 거쳐 만들어진다. 탈회는 보통 산성 용매들을 이용하며, 산성 용매의 종류에 따라 다양한 탈회 방법이 존재한다. 이러한 탈회 공정으로 인하여 탈회골은 본래의 골에서 무기질을 제거한 유기질 성분(세포 외 기질 및 미량의 골 형성 단백질)이 제거되기 때문에, 골 형성에 도움을 주는 골 무기질이 결핍된 상태로 제조되는 공정 상의 단점이 있다.
인체 골의 65~70%를 차지하고 있는 골 무기질은 골 재생에 도움을 주는 성분으로 칼슘(Ca), 인(P), 철(Fe), 칼륨(K), 마그네슘(Mg), 나트륨(Na) 및 아연(Zn) 등으로 구성된다. 상기 골 무기질은 대부분 칼슘과 인으로 이루어진 수산화인회석(Hydroxyapatite, HAp)의 형태로 존재하며 철, 칼륨, 마그네슘, 나트륨, 아연 등의 미네랄들은 미량 함유되어 있다. 합성 HAp 제품들은 칼슘과 인으로만 이루어진 단일 조성으로서, 실제 인체유래 골 무기질의 미네랄 구성비율과는 다를 수밖에 없다.
동종골로부터 얻을 수 있는 골 무기질을 탈회골과 함께 이식하게 될 경우, 인체가 자연상태에서 가지는 골 형성 조건에 매우 근접한 환경을 조성할 수 있게 되는데, 골 무기질로서 수산화인회석 계열 골이식재는 골전도능을 가지고 있고, 동종골이식재로 제조되는 탈회골은 골유도능이 우수한 것으로 알려져 있다. 이에 골 무기질을 탈회골가 함께 이식할 경우 탈회골만을 사용할 경우와 비교하여, 골형성능과 함께 골전도능을 포함하므로 상대적으로 우수한 골형성능을 제공할 수 있다고 판단된다. 골 무기질 성분뿐만 아니라, 탈회골 성분도 함께 포함하도록 조성되는 본 발명의 골이식용 복합 탈회골 조성물은 골형성에 필요한 골전도능 및 골유도능을 동시에 갖추고 있다. 아울러, 골 무기질은 골형성 시에 필수적인 미네랄들을 가지고 있기 때문에 우수한 골형성능을 갖는다.
일반적으로 탈회골 제조 시, 탈회골 만을 수득하고 탈회 후 발생하는 탈회용액을 폐기처리 한다. 또는, 탈회골을 수득하는 과정과 탈회용액으로부터 골 무기질 성분을 추출하는 과정을 별개의 제조과정으로 분리하여 진행하는, 즉, 탈회골 분말과 골 무기질 분말 형태의 두 가지 종류 생성물을 얻어내는 Two-step 공정을 이용한다. Two-step 공정에서, 탈회 직 후, 탈회골과 탈회용액을 완전히 분리하고, 탈회골은 수 회의 세척을 거친 후 동결건조 과정을 통해 분말상태의 탈회골로 수득된다. 한편, 별도로 분리되어 회수된 탈회용액은 여과, 중화, 원심분리, 증류수 세척, 동결건조 등의 과정을 순차적으로 거친 후 미세분말 상태의 골 무기질 분말로 수득된다. 이러한 중복된 제조과정에서, 탈회골과 골 무기질은 최종 수득 전까지 손실이 발생한다. 또한, 탈회골 또는 골 무기질 어느 하나의 수득물을 기준으로 혼합하더라도 골 본래의 조성성분 비율을 맞출 수 없다. 즉, 인위적으로 버려지는 수득물이 없으려면, 탈회골과 골 무기질 혼합 시 임의의 비율로 혼합할 수밖에 없게 된다.
또한, Two-step 공정에서 탈회용액으로부터 골 무기질을 수득하기 위한 필수과정으로 pH 적정을 통한 중화방법이 사용되는데, 일반적으로 NaOH를 사용하며 적정 pH 범위는 6.0~7.5 정도이다. 중화 직후, 탈회용액으로부터 골 무기질 성분들이 침전물로 생성되는데, 탈회골로부터 유리되어 나온 단백질 형태의 일부 생리활성물질들도 골 무기질과 함께 침전물로 생성된다. 일례로, BMP-2는 pH 6.2이상부터 침전물로 생성되며 pH 6.2이하에서는 용해된 상태로 존재하는 것으로 잘 알려져 있다. 골 무기질을 수득하는 종래 기술들은 탈회골로부터 유리되어 나오는 이러한 생리활성물질을 골 무기질과 함께 수득하는 방법을 기술하고 있지 않다. 더욱이, 종래 기술들은 골 무기질 침전과정 직후부터는 증류수를 통한 정제 및 세척 과정을 통해 정제된 골 무기질 분말을 수득하고 있으므로, 증류수로 수 회 세척되는 과정에서 생리활성물질은 증류수에 재 용해되어 소실될 수 있다.
이에 따라, 본 발명에서는 탈회골과 골 무기질을 각각 별도의 수득과정으로 분리하여 수득하지 않고, 하나의 제조법 내에서 탈회골과 골 무기질을 함께 수득할 수 있는 One-step 공정을 제시하고자 하며, 본래의 인체골이 함유하고 있는 무기질 조성비율에 가장 근접한 골 무기질 함량 비율을 유지하는 복합 탈회골 조성물의 제조 방법을 제시하고자 한다.
또한 본 발명에서는, One-step 공정 내에 약산성 용매를 사용하여 BMP-2 등의 생리활성물질 일부를 탈회골 외부로 노출시키는 방법을 제시하고, 탈회골 및 골 무기질 수득 시에, 노출된 생리활성물질이 함께 수득될 수 있는 제조 방법을 제시하고자 한다.
또한 본 발명에서는, 본 발명에 의한 조성물이 체내에 이식될 때, 분말 상태로 흩어지지 않고 환부를 중심으로 잘 응집된 상태로 이식되어 골형성을 극대화할 수 있는 생체적합성 하이드로겔 성상의 부형재 제조에 대한 방법을 제시하고자 한다. 구체적으로, 본 발명에서는 One-step 공정을 통해 수득되는 복합 탈회골 조성물에 생체 유래 고분자인 히알루론산을 포함하는 부형재를 적용하여 성형성이 우수한 페이스트(paste) 성상의 골 이식용 조성물을 제조하는 방법을 제시하고자 한다.
1. URIST, Marshall R. Bone: formation by autoinduction. Science, 1965, 150.3698: 893-899. 2. ALPER, Glenn, et al. Osteogenesis in bone defects in rats: the effects of hydroxyapatite and demineralized bone matrix. The American journal of the medical sciences, 1989, 298.6: 371-376. 3. TAKUWA, Yoh, et al. Bone morphogenetic protein-2 stimulates alkaline phosphatase activity and collagen synthesis in cultured osteoblastic cells, MC3T3-E1. Biochemical and biophysical research communications, 1991, 174.1: 96-101.
본 발명은 생체유래 골로부터 얻어지는 골 무기질을 인체골 본래의 조성 비율에 가장 가깝게 함유한 복합 탈회골 조성물 및 그 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 골성장과 골형성에 효과를 나타내는 생리활성물질을 함유한 복합 탈회골 조성물 및 그 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 골 무기질을 골 본래의 조성 비율대로 함유하는 복합 탈회골 조성물을 One-step 공정으로 제조할 수 있는 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 우수한 응집성과 의료적 목적의 사용 편의성을 증대시키고자, 생체적합성 고분자 부형재를 사용하여 페이스트(paste) 성상의 골 이식용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 골 조직을 산 용액으로 탈회 처리하는 탈회 단계;
상기 탈회 처리된 탈회용액을 알칼리 용액으로 중화하여 골 무기질을 석출시키는 골 무기질 석출 단계;
상기 석출이 완료된 용액을 원심분리하고, 침전물에 산 용액을 첨가하여 BMP-2를 추출하는 BMP-2 추출 단계; 및
상기 BMP-2가 추출된 용액을 알칼리 용액으로 중화하여 탈회골, 골 무기질 및 BMP-2를 석출시키는 복합 탈회골 조성물 제조 단계;를 포함하는 One-step 공정을 이용한 복합 탈회골(Demineralized bone matrix(DBM) complex) 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 전술한 One-step 공정을 이용한 복합 탈회골 조성물의 제조 방법에 의해 제조되며, 탈회골, 골 무기질 및 BMP-2를 포함하는 복합 탈회골 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 전술한 복합 탈회골 조성물; 및
생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물을 포함하는 골 이식용 조성물을 제공한다.
본 발명에서는 탈회골과 골 무기질을 각각 별도의 수득과정으로 분리하여 수득하지 않고, 하나의 제조법(One-step 공정) 내에서 상기 탈회골과 골 무기질을 함께 수득할 수 있으므로, 본래의 인체골이 함유하고 있는 골 무기질 조성 비율에 가장 근접한 골 무기질 함량 비율을 가지는 복합 탈회골 조성물을 제조할 수 있다.
이에 따라, 본 발명에 따른 One-step 공정에 의해 제조된 복합 탈회골 조성물은 생체유래 골로부터 얻어지는 골 무기질을 골 본래의 조성 비율대로 함유하므로, 체내에서 골형성이 이루어지는 환경에 가장 근접한 무기질 함량 조건을 제공할 수 있어 보다 안정적이다. 또한, 골성장과 골형성에 효과를 나타내는 단백질을 충분히 포함하여 골전도능 및 골유도능이 우수하다. 이를 통해, 우수한 골형성 효과를 이끌어낼 수 있다.
또한, 본 발명에서는 복합 탈회골 조성물이 하이드로겔(hydrogel) 성상의 부형재와 혼합되므로, 체내에 이식될 때 분말 상태로 흩어지지 않고 환부를 중심으로 잘 응집된 상태로 이식되어 골형성을 극대화 할 수 있으며, 생체적합성을 부여할 수 있다.
도 1은 One-step 공정과 Two-step 공정에 의해 제조된 복합 탈회골 조성물의 수득율 및 상기 복합 탈회골 조성물 내 BMP-2 함량을 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 복합 탈회골 조성물 중 골 무기질의 SEM 이미지를 나타낸다.
도 3은 골 무기질이 가지는 고유한 결정구조에 대한 X선 회절 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 HA-CMC 부형재(담체)의 제조 과정을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 실시예에 의해 제조된 HA-CMC 부형재 및 복합 탈회골 조성물의 복소점도 측정 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 실시예에 의해 제조된 복합 탈회골 조성물의 ALP assay 결과를 나타낸다.
도 7 및 8은 In vivo 골유도능 평가 결과를 나타낸다.
본 발명은 골 조직을 산 용액으로 탈회 처리하는 탈회 단계;
상기 탈회 처리된 탈회용액을 알칼리 용액으로 중화하여 골 무기질을 석출시키는 골 무기질 석출 단계;
상기 석출이 완료된 용액을 원심분리하고, 침전물에 산 용액을 첨가하여 BMP-2를 추출하는 BMP-2 추출 단계; 및
상기 BMP-2가 추출된 용액을 알칼리 용액으로 중화하여 탈회골, 골 무기질 및 BMP-2를 석출시키는 복합 탈회골 조성물 제조 단계;를 포함하는 One-step 공정을 이용한 복합 탈회골(Demineralized bone matrix(DBM) complex) 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 실시예에서는 One-step 공정으로 복합 탈회골 조성물을 제조하고, 상기 제조된 복합 탈회골 조성물이 본래의 인체골이 함유하고 있는 골 무기질 조성비율에 가장 근접한 골 무기질 함량 비율을 가지는 것을 확인하였다.
또한, 상기 복합 탈회골 조성물과 생체적합성 고분자의 가교물(HA-CMC 부형재)을 포함하는 골 이식용 조성물을 제조하여, 상기 골 이식용 조성물이 우수한 점탄성 특성을 가짐을 확인하였다. 또한, 상기 골 이식용 조성물에 대해 인 비보(in vivo) 실험을 진행하여 본 발명에 따른 조성물이 우수한 골 유도능을 가짐을 확인하였다.
이하, 본 발명에 따른 복합 탈회골 조성물의 제조 방법을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 용어 탈회골(Demineralized Bone Matrix, DBM)은 탈회골 기질로도 불리며, 반투명하고 유연한 고무형태의 물질로서 골 성장을 촉진하는 골 형성 단백질(BMP; Bone Morphogenetic Protein)이 내재되어 있다. 상기 탈회골(DBM)은 골 형성을 촉진할 수 있는 좋은 이식재의 원료가 될 수 있다.
본 발명에서 용어 탈회(Demineralized)는 탈미네랄로, 칼슘 등의 무기질을 포함하는 생체 조직에서 킬레이트제 등을 사용하여 무기질을 추출하는 것을 의미한다. 일반적으로, 뼈 조직을 탈회한 "탈회 용액"에는 인체뼈를 구성하고 있는 인산칼슘 등의 무기질 성분이 다량 포함되어 있다.
본 발명에서 용어 One-step 공정은 복합 탈회골 조성물의 제조 시 탈회골 및 골 무기질을 각각 별도의 수득 과정으로 분리하여 수득하지 않고, 하나의 반응기 내에서 탈회골과 골 무기질을 함께 수득하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명에서는 One-step 공정에 의해 탈회골과 골 무기질이 함께 수득되므로, 상기 함께 수득되는 조성물을 복합 탈회골(복합 무기질-탈회골) 조성물이라 표현할 수 있다.
일반적으로, 골 이식용 조성물은 탈회골 및 골 무기질을 포함하며, 상기 골 이식용 조성물의 제조시 탈회골을 수득하는 과정과 탈회용액으로부터 골 무기질 성분을 추출하는 과정을 별개의 제조 과정으로 분리하여 진행하는 Two-step 공정을 이용한다. 이러한, Two-step 공정을 이용한 제조 방법은 탈회골과 골 무기질의 최종 수득 전까지 손실이 발생하며, 탈회골 또는 골 무기질 어느 하나의 수득물을 기준으로 혼합하더라도 골 본래의 조성성분 비율을 맞출 수 없다는 문제를 가진다. 또한, 기존의 Two-step 공정은 BMP-2와 같은 생리활성물질을 포함하지 않는다.
따라서, 본 발명에서는 One-step 공정을 이용하여 복합 탈회골 조성물을 제조하여, 하나의 제조법 내에서 탈회골과 골 무기질을 함께 수득할 수 있어 공정을 간소화할 수 있으며, 본래의 인체골이 함유하고 있는 무기질 조성 비율에 가장 근접한 골 무기질 함량 비율을 유지할 수 있는 조성물을 제조할 수 있다. 또한, 생체활성물질을 함유하는 조성물을 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 One-step 공정을 이용한 복합 탈회골 조성물의 제조 방법은 (S1) 탈회 단계; (S2) 골 무기질 석출 단계; (S3) BMP-2 추출 단계; 및 (S4) 복합 탈회골 조성물 제조 단계를 포함한다.
본 발명에서는 단계 (S1)을 수행하기 전에 골 조직을 세척하는 세척 단계를 추가로 수행할 수 있다. 세척 용매로 아이소프로필 알코올, 멸균증류수 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 상기 단계를 통해 골 조직 내의 불순물을 제거할 수 있다.
본 발명에서 (S1) 탈회 단계는 골 조직을 산 용액으로 탈회 처리하는 단계이다.
본 발명에서 골 조직은 동종 또는 이종 유래 골 조직일 수 있다. 상기 동종 유래 골 조직은 사람유래의 골 조직을 의미하며, 이종은 인간 이외의 동물, 즉, 돼지, 소, 말 등의 포유류 유래의 골 조직을 의미할 수 있다.
일 구체예에서, 골 조직은 골피질(cortical bone)일 수 있다.
일 구체예에서, 골 조직은 분말로서 제공될 수 있다. 이때, 골 조직의 평균 입경은 20 내지 800 um일 수 있다.
일 구체예에서, 산 용액의 종류는 골 조직을 탈회할 수 있다면 특별히 제한되지 않으며, 염산, EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), 포름산(formic acid), 시트르산(citric acid), 아세트산(acetic acid), 질산(nitric acid) 및 아질산(nitrous acid) 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 산 용액을 사용할 수 있다.
상기 산 용액의 농도 및 사용 함량은 선택된 산에 따라 적절히 조절될 수 있다.
일 구체에에서, 탈회는 골 조직 1g 당 0.5 내지 1.5 노르말농도(N)의 염산 용액 10 내지 50 ml를 사용하여 수행될 수 있다.
일 구체예에서, 탈회는 pH 1 내지 3에서 수행될 수 있다.
또한, 일 구체예에서, 탈회는 1 내지 10 시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명에서 (S2) 골 무기질 석출 단계는 단계 (S1)에서 탈회 처리된 탈회용액을 알칼리 용액으로 중화하여 골 무기질을 석출시키는 단계이다.
상기 단계 (S1)이 완료된 탈회용액은 상층액과 침전물로 구성되며, 이때 침전물은 탈회골을 포함한다. 본 발명에서는 One-step 공정을 이용한 제조 방법을 사용하여, 상기 침전물인 탈회골을 분리하지 않고도 본래 인체 골이 함유하고 있는 골 무기질 조성 비율과 근접한 골 무기질 함량 비율을 가지는 복합 탈회골 조성물을 제조할 수 있다.
일 구체예에서, 알칼리 용액의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 수산화나트륨(NaOH) 및 인산완충용액(phosphate buffered saline) 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다. 또는, 시중에서 판매되는 생리식염수, 0.9% 염화나트륨 용액 및 멸균 증류수를 사용하여 여러번 세척하거나 첨가하여 중화할 수 있다.
일 구체에에서, 골 무기질 석출 단계는 0.5 내지 4.0 M의 수산화나트륨(NaOH) 용액을 사용하여 중화할 수 있다.
일 구체예에서, 중화는 탈회용액의 pH가 5.5 내지 7.0이 될때까지 수행할 수 있다.
또한, 일 구체예에서, 골 무기질 석출 단계는 0.5 내지 4 시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명에서 (S3) BMP-2 추출 단계는 단계 (S2)에서 석출이 완료된 용액을 원심분리하고, 침전물에 산 용액을 첨가하여 BMP-2를 추출하는 단계이다.
상기 원심분리에 의해 단계 (S1)에서 제조된 탈회골이 침전되며, 또한, 단계 (S2)에서 석출된 골 무기질도 침전되어 침전물을 형성한다. 따라서, 본 발명에서는 원심분리를 통해 상등액을 제거하고, 유효 성분을 포함하는 침전물을 수득할 수 있다.
일 구체예에서, 원심분리는 1,000 내지 8,000 rpm에서 10분 내지 30분 간 수행할 수 있으며, 원심분리를 수행한 후 수득된 침전물을 멸균증류수로 세척할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 원심분리 및 세척을 1 내지 3 회 반복 수행할 수 있다.
한편, 골 형성 단백질인 BMP(Bone Morphogenetic Protein)는 골 유도에 관여한다. 이러한 BMP, 특히, BMP-2는 pH 6.2 이상부터 침전물로 생성되며 pH 6.2 이하에서는 용해된 상태로 존재한다. 골 무기질을 수득하는 종래의 기술들은 골 무기질의 침전 과정 직후부터 증류수를 통한 정제 및 세척 과정을 통해 정제된 골 무기질 분말을 수득하고 있으므로, 증류수로 수 회 세척되는 과정에서 생리활성물질은 증류수에 재 용해되어 소실될 수 있다.
본 발명에서는 BMP-2를 추출하기 위한 별도의 공정을 제공함으로써, 탈회골 및 골 무기질뿐만 아니라 생리활성성분이 풍부한 복합 탈회골 조성물을 제조할 수 있다.
일 구체예에서, BMP-2를 추출하기 위한 산 용액으로 전술한 산 용액, 즉, 염산, 구아니딘염산(guanidine hydrochloride), EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), 포름산(formic acid), 시트르산(citric acid), 아세트산(acetic acid), 질산(nitric acid) 및 아질산(nitrous acid) 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 산 용액을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 요소(urea)를 상기 산 용액을 대체하여 사용할 수도 있다.
상기 산 용액의 농도 및 사용 함량은 선택된 산에 따라 적절히 조절될 수 있다.
일 구체예에서, BMP-2 추출은 침전물에 아세트산을 첨가하여 추출할 수 있다.
일 구체예에서, BMP-2 추출은 pH 4 내지 6.5에서 수행될 수 있다. 상기 pH 범위에서 BMP-2가 용이하게 추출되며, 정량이 가능하다.
또한, 일 구체예에서, BMP-2의 추출은 1 내지 72 시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명에서 (S4) 복합 탈회골 조성물 제조 단계는 단계 (S3)에서 BMP-2가 추출된 용액을 알칼리 용액으로 중화하여 탈회골, 골 무기질 및 BMP-2를 석출시키는 단계이다.
일 구체예에서, 알칼리 용액의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 수산화나트륨(NaOH) 및 인산완충용액(phosphate buffered saline) 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 중화는 용액의 pH가 6.2 내지 6.8이 될때까지 수행할 수 있다.
일 구체에에서, 상기 복합 탈회골 조성물 제조 단계는 0.5 내지 4.0 M의 수산화나트륨(NaOH) 용액을 사용하여 중화하여 탈회골, 골 무기질 및 BMP-2를 석출할 수 있다.
또한, 일 구체예에서, 상기 단계는 0.5 내지 72 시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명에서는 단계 (S4) 복합 탈회골 조성물 제조 단계를 수행한 후, 석출된 석출물을 세척하는 세척 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 세척은 석출된 침전물을 멸균증류수로 1 내지 3 회 세척할 수 있으며, 원심분리를 수행할 수도 있다.
또한, 본 발명에서는 단계 (S4) 복합 탈회골 조성물 제조 단계 및/또는 상기 세척 단계를 수행한 후, 건조하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.
일 구체예에서, 건조는 동결건조하여 수행할 수 있으며, 상기 동결건조는 -50 내지 -80℃ 에서 24 내지 96 시간 동안 수행할 수 있다.
본 발명에서 건조물의 수분 함유량은 10% 이하, 바람직하게는 1 내지 8%일 수 있다.
본 발명에 따른 제조 방법에 의해 제조된 복합 탈회골 조성물은 탈회골과 골 무기질이 인체 골 조성 비율에 근사적 범위로 혼합되며, 탈회골과 골 무기질을 각각의 수득 공정을 거치지 않고 단일화(One-step) 공정만으로 복합 탈회골 조성물을 수득할 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 제조 방법을 통해 제조된 복합 탈회골 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 One-step 공정을 이용하여 제조된 복합 탈회골 조성물은 탈회골, 골 무기질 및 BMP-2를 포함하며, 탈회골과 골 무기질이 인체 골 조성 비율에 근사적 범위로 혼합될 수 있다.
일 구체예에서 탈회골의 함량은 조성물 전체 중량 대비 5 내지 30 중량% 또는 10 내지 20 중량%일 수 있다. 또한, 골 무기질은 조성물 전체 중량 대비 10 내지 50 중량% 또는 20 내지 40 중량%일 수 있다.
일 구체예에서, 골 무기질은 칼슘 34 내지 47 중량%, 인 15 내지 21 중량%, 마그네슘 0.358 내지 0.373 중량%, 나트륨 0.079 내지 0.143 중량%, 아연 0.014 내지 0.015 중량%, 칼륨 0.015 내지 0.02 중량% 및 철 0.00015 내지 0.0025 중량%로 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 복합 탈회골 조성물은 BMP-2를 1 ng/g 내지 100 ng/g 포함할 수 있다. 함유량의 최소/최대 차이는 Donor에 따른 variation에 기인할 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 제조 방법에 의해 제조된 복합 탈회골 조성물을 포함하는 골 이식용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 골 이식용 조성물은 상기 복합 탈회골 조성물과 함께 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물을 포함할 수 있다. 상기 골 이식용 조성물은 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물을 포함하여 페이스트 형상을 가지므로, 상기 골 이식용 조성물을 골 이식용 페이스트라 표현할 수 있으며, 또한, 복합 탈회골 페이스트라 표현할 수 있다.
일 구체예에서, 복합 탈회골 조성물은 분말로서 제공될 수 있으며, 상기 분말의 평균 입경은 생체 주입에 적합한 크기로 적절히 조절할 수 있다.
일 구체예에서, 복합 탈회골 조성물의 함량은 골 이식용 조성물 전체 중량(100 중량부) 대비 10 내지 90 중량부, 10 내지 30 중량부 또는 20 내지 30 중량부일 수 있다. 상기 범위에서 우수한 골 재생 능력을 가질 수 있다.
본 발명에서 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물은 골 이식용 조성물의 점탄성 특성을 향상시킬 수 있으며, 체내 부피 유지력을 향상시킬 수 있다. 본 발명에서는 이러한 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물을 부형재(또는 담체)라 표현할 수 있다.
일 구체예에서, 생체적합성 고분자의 가교물은 화학적으로 가교된 한 가지 이상의 생체적합성 고분자를 의미한다.
일 구체예에서, 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물의 분자량은 10 kDa 내지 2 MDa 일 수 있다.
일 구체예에서, 생체적합성 고분자로 콜라겐, 히알루론산, 키토산, 카복시메틸셀룰로스, 알지네이트 및 젤라틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 생체적합성 고분자의 가교물은 콜라겐, 히알루론산, 키토산, 카복시메틸셀룰로스, 알지네이트 및 젤라틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 생체적합성 고분자의 가교물일 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서는 히알루론산(Sodium hyaluronate, HA)과 카르복시메틸셀룰로스(Sodium carboxymethyl cellulose, CMC)의 가교물을 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 생체적합성 고분자는 가교제에 의해 가교되며, 상기 가교제는 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether, BDDE), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether, EGDGE), 헥산디올디글리시딜에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether), 폴리테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르(polytetramethylene glycol diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르(neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리세롤폴리글리시딜에테르(polyglycerol polyglycidyl ether), 디글리세롤폴리글리시딜에테르(diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤폴리글리시딜에테르(glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판폴리글리시딜에테르(tri-methylpropane polyglycidyl ether), 비스에폭시프로폭시에틸렌(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리쓰리톨폴리글리시딜에테르(pentaerythritol polyglycidyl ether), 및 소르비톨폴리글리시딜에테르(sorbitol polyglycidyl ether)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물의 함량은 골 이식용 조성물 전체 중량(100 중량부) 대비 5 내지 90 중량부, 5 내지 30 중량부 또는 5 내지 20 중량부일 수 있다. 상기 범위에서 생체적합성 고분자의 물성을 향상시킬 수 있다.
일 구체예에서, 골 이식용 페이스트의 복소점도는 1,000 내지 100,000 Pa·s일 수 있다. 상기 복소점도는 회전형 레오미터 분석기(진동 수: 0.1~100 Hz, 온도: 25℃, 변형율: 1%)에 의해 측정된 결과값을 의미한다.
복소점도는(complex viscosity)는 진동 측정법에서 계산되는 진동수 의존적 점도로서, 상기 수치는 G'' (점성계수(손실탄성계수), viscous modulus), G'(탄성계수(저장탄성계수), elastic modulus) 및 측정하는 진동수 값이 반영된 수치이다.
일 구체예에서, 본 발명의 골 이식용 조성물은 생체 내로 주입 또는 삽입될 수 있다. 이러한 골 이식용 조성물은 일반적인 의료용 재료로서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 골 이식용 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
상기 골 이식용 조성물의 제조 방법은 복합 탈회골 조성물; 및 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물을 혼합하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 복합 탈회골 조성물은 전술한 제조 방법에 의해 제조된 복합 탈회골 조성물을 사용할 수 있다.
구체적으로, 골 조직을 산 용액으로 탈회 처리하는 탈회 단계;
상기 탈회 처리된 탈회용액을 알칼리 용액으로 중화하여 골 무기질을 석출시키는 골 무기질 석출 단계;
상기 석출이 완료된 용액을 원심분리하고, 침전물에 산 용액을 첨가하여 BMP-2를 추출하는 BMP-2 추출 단계; 및
상기 BMP-2가 추출된 용액을 알칼리 용액으로 중화하여 탈회골, 골 무기질 및 BMP-2를 석출시키는 복합 탈회골 조성물 제조 단계;를 통해 제조될 수 있다.
본 발명에서 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물은 시중에서 시판 중인 제품을 사용할 수 있다. 또한, 상기 가교물은 생체적합성 고분자를 이용하여 실험실 등에서 제조하여 사용할 수 있다.
상기 생체적합성 고분자의 가교물은 생체적합성 고분자를 가교제를 이용하여 가교하는 가교 단계; 및
상기 가교물을 투석하는 투석 단계; 및
상기 투석된 가교물을 분쇄하는 분쇄 단계를 통해 제조될 수 있다.
본 발명에서 가교 단계는 생체적합성 고분자를 가교제를 이용하여 가교하는 단계이다. 상기 단계에서 생체적합성 고분자 및 가교제는 전술한 종류를 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 생체적합성 고분자들은 아미드 결합(amide bond)을 통해 결합될 수 있다.
일 구체예에서, 가교제의 함량은 생체적합성 고분자 대비 0.5 내지 10 중량부일 수 있다.
본 발명에서는 동결건조를 수행하기 전에 가교된 반응물을 세척하는 단계를 추가로 수행할 수 있다. 이때, 세척 용액으로 인산완충식염수(phosphate-buffered saline(PBS)) 및/또는 멸균증류수를 사용할 수 있다.
본 발명에서 투석 단계 전에 가교물을 절단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 투석 단계는 인산완충용액을 사용하여 수행할 수 있다.
또한, 분쇄 단계는 당업계에서 일반적으로 사용되는 분쇄기를 이용하여 수행할 수 있다. 본 발명에서는 분쇄 단계 전에 동결건조를 추가로 수행할 수 있다.
본 발명에서 복합 탈회골 조성물; 및 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물은 물리적 혼합에 의해 혼합될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 물리적으로 혼합된 혼합물 내에서 복합 탈회골 조성물의 함량은 10 내지 90 중량부, 10 내지 30 중량부 또는 20 내지 30 중량부일 수 있다.
또한, 혼합물 내에서 생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물의 함량은 5 내지 90 중량부, 5 내지 30 중량부 또는 5 내지 20 중량부일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 혼합물은 생체적합성 고분자의 가교물을 용매에 용해시킨 후, 복합 탈회골 조성물과 혼합하여 제조할 수 있다. 이때 용매로는 생리식염수를 사용할 수 있다.
본 발명은 상기 혼합물을 멸균하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 멸균 단계를 통해 골 이식용 조성물 내의 면역성을 제거할 수 있으며, 세균 등을 효과적으로 파괴할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 멸균 단계는 방사선을 조사하여 수행할 수 있으며, 방사선의 조사 범위는 10 내지30 kGy일 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 골 이식용 조성물의 사용에 관한 것이다.
본 발명에 따른 골 이식용 조성물은 체내 이식 후 골 재생을 유도할 수 있다.
하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명의 범주는 하기 실시예에 한정되는 것이 아니며 첨부된 특허청구범위에 기재된 사항에 의해 도출되는 기술적 사항을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형, 수정 또는 응용이 가능하다는 것을 당업자는 이해할 수 있을 것이다.
실시예
실시예 1. One-step 공정을 통한 복합 탈회골 조성물의 수득
피질골(cortical bone)을 아이소프로필 알코올(2-Propanol for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur, Merck)로 세척한 후 멸균증류수로 세척하는 전처리 공정을 수행하였다.
이후 0.5 내지 1.5 노르말 농도(N)의 염산 용액(Hydrochloric acid 35.0-37.0%, JUNSEI CHEMICAL CO., LTD.) 10 내지 50 ml을 이용하여 피질골 1 g을 상온에서 4 시간 동안 탈회하였다. 상기 탈회가 완료되어 상층액과 침전물로 구성된 혼합액을 0.5 내지 4.0 M의 수산화나트륨(NaOH, Sodium hydroxide, Merck) 용액을 사용하여 혼합액 내에 골 무기질이 석출되어 탈회골과 함께 침전되도록 유도하였다. 침전 및 석출이 완료된 혼합용액을 1,000 내지 8,000 rpm에서 10 내지 30 분 간 원심분리를 진행하여 상등액을 제거하였다. 상기 원심분리 후 상등액을 제거하고 침전물을 멸균증류수로 세척하는 과정을 1~3회 반복하였다.
세척이 완료된 침전물을 아세트산을 이용하여 BMP-2를 추출하였다. 추출이 완료된 혼합액을 0.5 내지 4.0 M의 수산화나트륨 용액을 사용하여 혼합액의 pH를 6.2 내지 6.8로 적정하여 탈회골, 골 무기질 및 추출된 BMP-2를 석출하였다. 석출된 침전물을 멸균증류수로 1~3회 세척 및 원심분리 한 후, 수분 함유량이 10% 이하, 바람직하게는 1 내지 8%가 되도록 동결건조(lyophilization)를 진행하였다.
동결건조가 완료되어 수득된 물질, 즉, 복합 탈회골 조성물은 탈회골과 골 무기질이 인체 골 조성 비율에 근사적 범위로 혼합되어 있다. 본 발명에서는 탈회골과 골 무기질을 각각의 수득 공정을 거치지 않고, 단일화 공정만으로 복합 탈회골 조성물로서 수득하였다.
비교예 1. Two-step 공정을 통한 복합 탈회골 조성물의 분말 수득
골피질(cortical bone) 10 g, 0.5 N의 염산 200 ml를 실온에서 교반하면서 2시간 탈회처리하였다. 탈회용액을 회수하고, 탈회된 뼈분말은 회수한 후 DBM 가공 공정대로 DBM을 가공하였다.
잔류된 미세한 뼈분말을 제거하기 위해 탈회용액을 여과하였다. (정성여과지; Wet Strengthened Grades, Grade 91, 10um) 마그네틱바(Magnetic bar)를 돌린 상태에서 5 M의 수산화나트륨(NaOH)을 서서히 첨가하면서 수시로 pH 수치를 확인하며, pH가 7.0~7.5일 때 중화과정을 멈추었다. 중화된 용액을 1,500 rpm에서 5 분간 원심분리한 후 상등액을 제거하고 증류수로 5 번 세척하였다(1,500rpm, 5분씩 원심분리). 최종적으로 얻어진 잔류물을 동결건조 또는 고온건조(dry oven)하였다.
상기 가공이 완료된 DBM과 건조를 마친 잔류물을 전량 혼합하여 복합 탈회골 조성물을 수득하였다.
실험예 1. One-step 공정 및 Two-step 공정을 이용한 복합 탈회골 조성물의 수득률 및 BMP-2 함량 비교
실시예 1의 One-step 공정을 통해 제조된 복합 탈회골 조성물 및 비교예 1의 Two-step 공정을 통해 제조된 복합 탈회골 조성물의 수득률을 비교하였다.
도 1의 A는 수득률을 비교한 결과를 나타낸다.
상기 도 1의 A에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 단일화 공정인 One-step 공정을 통해 복합 탈회골 조성물을 제조할 경우, 탈회골과 골 무기질을 각각 수득하는 Two-step 공정에 비해 수득률이 우수한 것을 확인할 수 있다.
또한, 실시예 1의 One-step 공정을 통해 제조된 복합 탈회골 조성물 중의 BMP-2의 함량 및 비교예 1의 Two-step 공정을 통해 제조된 복합 탈회골 조성물 중의 BMP-2의 함량을 비교하였다.
도 1의 B는 BMP-2 함량 비교 결과를 나타낸다.
상기 도 1의 B에 나타난 바와 같이, One-step 공정을 통해 복합 탈회골을 제조할 경우 BMP-2 함량이 우수한 것을 확인할 수 있다.
실험예 2. 인체유래 골 무기질 수득 방법 검증_골 무기질의 SEM 측정
실시예 1에서 수득된 복합 탈회골 조성물 중 골 무기질에 대하여 SEM(Scanning Electron Microscopy) 이미지를 촬영하였다.
도 2는 촬영된 이미지를 나타낸다.
상기 도 2에 나타난 바와 같이, 수득된 골 무기질은 일반적으로 자연상태 골 무기질이 갖는 육각기둥 형태의 결정 구조를 가지는 것을 확인할 수 있다.
실험예 3. 골 무기질의 X-Ray Diffraction(XRD) pattern
실시예 1에서 수득된 복합 탈회골 조성물 중 골 무기질의 X-ray Diffraction Pattern을 측정하여, 골 무기질이 가지는 고유한 결정 구조에 의한 X선 회절 분석 결과를 확인하였다.
도 3은 골 무기질이 가지는 고유한 결정구조에 대한 X선 회절 분석 결과를 나타낸다.
상기 도 3에 나타난 바와 같이, 골무기질의 고유 특성 피크인 2θ = 25.9, 32.0, 39.7에서 피크가 나타나는 것을 확인할 수 있다.
실험예 4. 복합 탈회골 조성물의 칼슘/인(Ca/P) 함량 비율 및 미네랄 함량 비율 측정
실시예 1에 의해 수득된 복합 탈회골 조성물은 탈회골, 골 무기질 및 BMP-2로 구성된다. 본 실험예에서는 수득한 복합 탈회골 조성물에서 골 무기질을 물리적으로 분리한 후, 골 무기질 함량을 분석하였다.
구체적으로, 수득된 물질 1 g 당 0.5 내지 1.5 노르말농도(N)의 염산 용액 10 내지 50 ml을 이용하여 pH를 1 내지 3으로 낮춘 후, 상층액을 취하여 골 무기질이 용해되어 있는 용액을 얻었다. 이후, 0.5 내지 4.0 M의 수산화나트륨(NaOH) 용액을 사용하여 골 무기질을 물리적으로 석출하여 분리하였다. 그리고, 석출물에 대해 유도결합 플라즈마 분광분석기(Inductively Coupled Plasma Spectrometer, ICP-OES. PerkinElmer, Optima 8300)로 상기 골 무기질의 성분을 분석하였다.
분석 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
Figure pat00001
분석 결과, 조성물의 미네랄 함량 비율은 자연상태의 인체에서 구성되는 골 무기질의 미네랄 함량 비율과 유사한 정도를 나타내었다.
칼슘의 함유 비율은 34.369 중량% 내지 47.687 중량%, 인은 15.199 중량% 내지 21.235 중량%로 측정되었는데, 이를 바탕으로 칼슘과 인의 비율인 Ca/P 수치는 2.245 내지 2.265의 범위로 확인되었다. 또한, 생체유래 골 무기질에만 존재할 수 있는 미네랄로 마그네슘은 0.358 내지 0.373 중량%, 나트륨은 0.079 내지 0.143 중량%, 아연은 0.014 내지 0.015 중량%, 칼륨은 0.015 내지 0.02 중량% 및 철은 0.00015 내지 0.0025 중량%로 측정되었다.
한편, 실시예 1에 따라 수득된 조성물은, 탈회 전 원재료인 골 분말 1 g을 탈회하고 골 무기질을 수득하는 One-step 공정을 거쳤을 때 0.45 g으로 측정되었다. 반면 Two-step 공정을 거친 경우에는 0.21 g으로 측정되었다(도 1A) 또한, 추출된 BMP-2의 함량은 BMP-2 assay 결과 One-step 공정을 거쳤을 때 56 ng/g, Two-step 공정을 거친 경우 31 ng/g로 측정되었다(도 1B).
실시예 2. 골 이식용 조성물(복합 탈회골 페이스트)의 제조
(1) 히알루론산/카복시메틸셀룰로스 부형재의 제조
실시예 1에 따라 수득된 복합 탈회골 조성물을 페이스트 형태의 골 이식용 조성물로 제조하였다. 이를 위해, 먼저, N-아세틸글루코사민과 글루쿠론산으로 이루어진 생체유래 고분자인 히알루론산(Sodium Hyaluronate (HA) by Shiseido(CAS 9067-32-7), Japan)과 카복시메틸셀룰로스(Sodium carboxymethyl cellulose(CMC), Sigma-Aldrich)를 가교제인 BDDE(1,4-Butanediol diglycidyl ether, Sigma-Aldrich)와 혼합하여 HA-CMC 부형재(담체)를 제조하였다.
구체적으로, 50℃로 가열된 0.2 N 수산화나트륨 수용액 100 ml에 BDDE 1 내지 10 ml를 첨가하고, CMC 1 내지 10 g을 첨가한 용액에 HA 1 내지 10 g을 첨가한 용액과 혼합하였다. 혼합 용액은 50℃에서 3 시간 동안 가열을 진행하며 가교과정을 거쳤다. 가교 반응이 완료된 혼합물을 인산완충용액(Phosphate Buffered Saline, Lonza Walkersville, Inc.) 5 리터를 채운 beaker에 dialysis membrane(Dialysis tubing cellulose membrane, Typical molecular weight cut-off = 14,000. Sigma-Aldrich)을 이용하여 상온에서 2 시간 동안 투석하였다. 50% EtOH 5 리터로 교체 후 상온에서 1 시간, 이후 다시 멸균증류수 5 리터를 beaker에 채운 후 dialysis membrane을 이용하여 상온에서 72 시간 동안 투석하였다. 이후, HA-CMC 부형재를 동결건조(lyophilization)한 후 분쇄하였다(도 4).
(2) 골 이식용 조성물(복합 탈회골 페이스트)의 제조
페이스트 형태의 복합 탈회골 조성물은 복합 탈회골 조성물의 분말이 10 내지 30 중량%로 함유될 수 있도록 제조하였다.
먼저, 건조가 완료된 HA-CMC 부형재를 멸균생리식염수와 1:9 내지 9:1의 비율로 혼합하여 HA-CMC 용액을 제조하고, 복합 탈회골 조성물의 분말과 HA-CMC 용액을 1:9 내지 9:1의 비율로 최종 혼합하였다.
그 후, 감마선 멸균(25kGy)을 수행하였다.
이를 통해, 복합 탈회골 조성물을 페이스트 형태의 조성물로 제조하였다.
실험예 5. HA-CMC 부형재의 농도와 복합 탈회골 조성물의 분말 함량에 따른 복소점도 확인
감마선 멸균(25kGy)이 완료된 복합 탈회골 페이스트의 복소점도(shear rate mode Rheometer-AR) 측정하였다. 또한, 성형성이 우수한 최적의 조성 비율을 찾기 위해, HA-CMC 부형재 만의 복소점도와, 상기 부형재와 혼합한 복합 탈회골 조성물의 함량에 따른 복소점도를 추가로 측정하였다.
상기 측정 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5의 A는 HA-CMC 부형재의 농도를 3 가지(5 중량%, 10 중량%, 20 중량%)로 조절한 HA-CMC 용액의 복소점도를 측정한 결과를 나타낸다.
상기 도 5의 A에 나타난 바와 같이, HA-CMC 부형재의 함량이 20%일 때, 다른 함량일 경우 대비 보다 높은 복소점도 값을 가지는 것을 확인할 수 있다.
따라서, 성형성에 가장 적합하다고 판단되는 점도를 나타낸 20% 농도의 HA-CMC 부형재를 복합 탈회골 조성물 분말과 혼합하여, 복합 탈회골 페이스트를 제조하였다. 이때, 복합 탈회골 조성물의 분말의 함량을 각각 10 내지 30 중량%로 조절하였으며, 상기 페이스트의 복소점도를 측정하였다.
도 5의 B는 복합 탈회골 조성물의 함량을 3 가지(10 중량%, 20 중량%, 30 중량%)로 조절하여 복소점도를 측정한 결과를 나타낸다.
상기 도 5의 B에 나타난 바와 같이, 복합 탈회골 조성물을 30% 포함할 때, 복소점도는 65,000 Pa.s로 측정되었다. 이는 골 이식재로서 적합하다고 판단되는 수준의 성형성과 응집력을 가질 수 있는 수치이다.
실험예 6. 복합 탈회골 페이스트의 in vitro 골유도능 평가
실시예 2에서 제조된 복합 탈회골 페이스트의 골유도능을 평가하였다.
구체적으로, 전조골세포(preosteoblast)인 MC3T3-E1(C57BL/6 mouse의 어린 태아(embryo/fetus)의 머리뼈 조직(calvaria preosteoblast)에서 분리한 세포 ATCC, CRL-2593, 2594, 2596, 2596)를 이용하여 in vitro 실험을 진행하였다. 성형성이 가장 적합하며 골유도능을 극대화할 수 있다고 판단된 30%의 복합 탈회골 조성물을 포함하는 복합 탈회골 페이스트(20%의 HA-CMC 부형재를 포함하는 HA-CMC 용액 사용)를 사용하여 세포주에서 알칼리성인산분해효소 활성도 분석(ALP-assay, Alkaline phosphatase assay)을 진행하였다. 양성대조군으로 rhBMP-2를 활성대조군으로 탈회골 10 mg을, 그리고 음성대조군으로 HA-CMC 부형재를 사용하였다.
상기 평가 결과를 도 6에 나타내었다.
상기 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 복합 탈회골 페이스트(복합 탈회골 조성물 30%)를 사용한 경우, 활성대조군 및 음성대조군과 비교하여 알칼리성인산분해효소 활성도가 우수한 것을 확인할 수 있다.
실험예 7. 복합 탈회골 페이스트의 in vivo 골유도능 평가
복합 탈회골 조성물 또는 복합 탈회골 페이스트를 nude mouse(BALB/c nude mice male, 체중 22g, 8 주령) 배부 muscle pouch 내에 척추 중앙선 기준으로 좌/우에 하나씩 이식하여 골유도능을 평가하였다.
이때, 실험군 1로 실시예 1에서 제조된 복합 탈회골 조성물을 30% 포함하는 시료(One-step 탈회골 이식재)를, 실험군 2로 비교예 1에서 제조된 복합 탈회골 조성물을 30% 포함하는 시료(Two-step 탈회골 이식재)를, 실험군 3으로 실시예 2에서 제조된 복합 탈회골 페이스트(복합 탈회골 조성물 함량 25%)인 시료(One-step 복합 탈회골 조성물 페이스트)를, 그리고, 실험군 4로 탈회골만을 함유하는 상용 탈회골 의료기기 제품(탈회골만을 함유하는 상용 탈회골 이식재)을 사용하였다.
골재생 정도는 hematoxylin and eosin을 이용한 조직염색사진으로 확인하였으며, 이를 ASTM F 2529 13 “Standard guide for in vivo evaluation of osteoinductive potential for materials containing demineralized bone(DBM)“을 통해 표 2의 기준으로 정량평가를 실시하였다.
본 발명에서 도 7은 실험군들의 골재생 정도를 조직염색사진으로 확인한 결과를 나타낸다.
또한, 이를 표 2의 기준으로 정량평가 한 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 골 무기질이 함께 함유되어 있는 실험군 3(One-step process 복합 탈회골 조성물 페이스트)이 37%의 골유도능을 보여 4등급을 나타내고, 실험군 1(One-step 탈회골 이식재)이 31%의 골유도능으로 4등급을 나타내며, 실험군 2(Two-step 탈회골 이식재)가 20%로 2등급을 나타냈다. 또한, 실험군 4인 상용 탈회골 이식재가 30%로 3등급을 나타냈다. 이를 통해, 실험군 3의 One-step 복합 탈회골 조성물 페이스트가 다른 실험군들에 비해 골유도능이 상대적으로 우수한 것을 확인할 수 있다.
Figure pat00002

Claims (16)

  1. 골 조직을 산 용액으로 탈회 처리하는 탈회 단계;
    상기 탈회 처리된 탈회용액을 알칼리 용액으로 중화하여 골 무기질을 석출시키는 골 무기질 석출 단계;
    상기 석출이 완료된 용액을 원심분리하고, 침전물에 산 용액을 첨가하여 BMP-2를 추출하는 BMP-2 추출 단계; 및
    상기 BMP-2가 추출된 용액을 알칼리 용액으로 중화하여 탈회골, 골 무기질 및 BMP-2를 석출시키는 복합 탈회골 조성물 제조 단계;를 포함하는
    One-step 공정을 이용한 복합 탈회골(Demineralized bone matrix(DBM) complex) 조성물의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    골 조직은 골피질(cortical bone)이며,
    평균 입경이 20 내지 800 um인 것인 One-step 공정을 이용한 복합 탈회골 조성물의 제조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    탈회 단계는 골 조직 1g 당 0.5 내지 1.5 노르말농도(N)의 염산 용액 10 내지 50 ml로 탈회 처리하는 것인 One-step 공정을 이용한 복합 탈회골 조성물의 제조 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    골 무기질 석출 단계는 0.5 내지 4.0 M의 수산화나트륨(NaOH) 용액을 사용하여 중화하는 것인 One-step 공정을 이용한 복합 탈회골 조성물의 제조 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    BMP-2 추출 단계는 침전물에 아세트산을 첨가하여 추출하는 것인 One-step 공정을 이용한 복합 탈회골 조성물의 제조 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    복합 탈회골 조성물 제조 단계는 0.5 내지 4.0 M의 수산화나트륨(NaOH) 용액을 사용하여 중화하여 탈회골, 골 무기질 및 BMP-2를 석출하는 것인 One-step 공정을 이용한 복합 탈회골 조성물의 제조 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    복합 탈회골 조성물 제조 단계를 수행한 후, 석출된 석출물을 건조하는 단계를 추가로 포함하는 것인 One-step 공정을 이용한 복합 탈회골 조성물의 제조 방법.
  8. 제 1 항에 따른 One-step 공정을 이용한 복합 탈회골 조성물의 제조 방법에 의해 제조되며,
    탈회골, 골 무기질 및 BMP-2를 포함하는 복합 탈회골 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    골 무기질은 칼슘 34 내지 47 중량%, 인 15 내지 21 중량%, 마그네슘 0.358 내지 0.373 중량%, 나트륨 0.079 내지 0.143 중량%, 아연 0.014 내지 0.015 중량%, 칼륨 0.015 내지 0.02 중량% 및 철 0.00015 내지 0.0025 중량%를 포함하는 것인 복합 탈회골 조성물.
  10. 제 8 항에 있어서,
    BMP-2를 1 내지 100 ng/g로 포함하는 것인 복합 탈회골 조성물.
  11. 제 8 항에 따른 복합 탈회골 조성물; 및
    생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물을 포함하는 골 이식용 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서,
    복합 탈회골 조성물의 함량은 골 이식용 조성물 전체 중량 대비 10 내지 90 중량부인 골 이식용 조성물.
  13. 제 11 항에 있어서,
    생체적합성 고분자는 콜라겐, 히알루론산, 키토산, 카복시메틸셀룰로스, 알지네이트 및 젤라틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하며,
    생체적합성 고분자의 가교물은 콜라겐, 히알루론산, 키토산, 카복시메틸셀룰로스, 알지네이트 및 젤라틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 생체적합성 고분자의 가교물인 골 이식용 조성물.
  14. 제 11 항에 있어서,
    생체적합성 고분자는 가교제에 의해 가교되며,
    상기 가교제는 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether, BDDE), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether, EGDGE), 헥산디올디글리시딜에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether), 폴리테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르(polytetramethylene glycol diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르(neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리세롤폴리글리시딜에테르(polyglycerol polyglycidyl ether), 디글리세롤폴리글리시딜에테르(diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤폴리글리시딜에테르(glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판폴리글리시딜에테르(tri-methylpropane polyglycidyl ether), 비스에폭시프로폭시에틸렌(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리쓰리톨폴리글리시딜에테르(pentaerythritol polyglycidyl ether), 및 소르비톨폴리글리시딜에테르(sorbitol polyglycidyl ether)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상인 골 이식용 조성물.
  15. 제 11 항에 있어서,
    생체적합성 고분자 또는 생체적합성 고분자의 가교물의 함량은 골 이식용 조성물 전체 중량 대비 10 내지 90 중량부인 골 이식용 조성물.
  16. 제 11 항에 있어서,
    골 이식용 조성물의 복소점도는 1,000 내지 100,000 Pa·s인 것인 골 이식용 조성물.
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