KR101769019B1 - 골재생 유도조성물, 골재생 유도 차폐막 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 황다랑어 껍질 추출물, 젤란검, 인산칼슘계 무기물 및 인산완충식염수를 포함하는 골재생 유도조성물에 관한 것이다 또한, 상기 골재생 유도조성물로 제조되는 골재생 유도 차폐막 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

골재생 유도조성물, 골재생 유도 차폐막 및 이의 제조방법{GUIDED BONE REGENERATION COMPOSITION, GUIDED BONE REGENERATION MEMBRANE AND METHOD FOR MANUFACTURING THE SAME}

본 발명은 황다랑어 껍질 추출물, 젤란검, 인산칼슘계 무기물 및 인산완충식염수를 포함하는 골재생 유도조성물, 골재생 유도 차폐막 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

인간을 포함한 척추동물은 뼈의 재생 능력을 가지고 있지만, 질병이나 사고 또는 노화 등에 의해 뼈의 일부가 손실되어 수복되지 않는 경우에 손실된 뼈의 수복을 돕기 위하여 뼈가 손실된 부분에 채워져 손실된 뼈의 수복을 돕는 다양한 골이식재료가 개발되어 이용되고 있다. 특히, 이러한 골이식재료는 치아의 임플란트 시에 식립 부위의 골밀도가 낮거나 골이 비어있는 경우에도 이용된다.

일반적으로 골 결손부 재건을 위해 오랫동안 골유도재생술이 사용되어 왔다. 이러한 골유도재생술을 위해서는 골에 결손이 생겼을 때 자연적인 재생과정을 증대시키고, 손상된 골세포들의 접착, 성장 및 분화를 위한 적합한 환경을 제공해주어야 한다. 또한 유기물인 성장인자, 콜라겐 및 단백질과 무기물인 칼슘포스페이트와 같은 물질의 적절한 조화가 필요하다. 또한, 수술 시에 손쉽게 조작이 가능해야 하며, 수술 이후에도 강도와 성질이 생체 내에서 그대로 유지될 수 있어야 한다.

상기와 같은 골이식재료를 제조하기 위하여 일반적으로 골결손부의 재생을 위해 특정 부위에 골이식재를 채운 후 차폐막으로 처리하는 방식으로 연조직의 개입을 막아 골 재생유도 활성을 높이는 방법을 사용하였다. 하지만 보편적으로 사용되는 골이식재는 가루형태로 한정됨에 따라 봉합과 같은 수술과정에서 적용한 위치에서 벗어나거나 혈액이나 여러 외부적인 작용으로 인해 골 결손부에서 쉽게 흩어진다는 문제가 있었다. 이러한 골이식재의 분산이 골 재건의 효과를 반감시켜 골이식재의 효과를 확실히 보지 못한다는 어려움이 있었다.

또한, 차폐막이 적절히 고정되지 못한 경우, 치유과정에서 골이식재가 흩어지거나 연조직의 개입을 허락하여 골 치유의 저해요인으로 작용되었다.

이로 인해 골재생 유도소재로써 골재생 유도 차폐막의 적절한 효과를 위한 골 결손부의 형태와 범위에 따라 맞춤식의 차폐막의 필요성이 대두되어 왔으며, 이를 위해 3차원적 구조의 스펀지 형태로 스캐폴더를 제조하는 등 다양한 시도를 보이고 있으나, 그 효과는 미흡한 것으로 보고되고 있다.

본 발명은 기존 골이식재료의 문제점을 개선하고, 황다랑어 껍질 추출물, 젤란검, 인산칼슘계 무기물 및 인산완충식염수를 포함하여 골이식 후 일정기간동안 형태를 유지하는 강도를 가지고, 황다랑어 껍질 추출물과 젤란검 복합체에 인산칼슘계 무기물이 균질 분산되어 우수한 골 결손부위의 골 재생력을 유도시킬 수 있는 골재생 유도 조성물 및 골재생 유도 차폐막을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 화학적 가교제를 사용하지 않고 물리적으로 망상 결합구조를 형성할 수 있고, 생체적합성이 우수하여 골 결손 완화, 개선 및 치유효과가 우수한 골재생 유도 조성물 및 골재생 유도 차폐막을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 골재생 유도조성물은 황다랑어 껍질 추출물, 젤란검 및 인산칼슘계 무기물을 포함할 수 있다.

상기 황다랑어 껍질 추출물과 젤란검은 10:90 내지 90:10중량비로 포함할 수 있다.

상기 골재생 유도조성물은 인산완충식염수를 더 포함할 수 있다.

상기 골재생 유도조성물은 에틸렌다이아민테트라아세트산에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 혼합물을 더 포함할 수 있다.

상기 골재생 유도조성물은 황다랑어 껍질 추출물 10 내지 40중량%, 젤란검 30 내지 60중량% 및 인산칼슘계 무기물 10 내지 40중량% 포함할 수 있다.

본 발명의 골재생 유도 차폐막은 망상 결합구조를 가지는 젤란검과 황다랑어 껍질 추출물 복합체에 인산칼슘계 무기물이 균질 분산된 것일 수 있다.

상기 망상 결합구조는 젤란검과 황다랑어 껍질 추출물 각각에 존재하는 관능기가 알칼리 토금속 이온에 의해 결합된 것일 수 있다.

본 발명의 골재생 유도 차폐막의 제조방법은 a) 황다랑어 껍질 추출물, 젤란검 및 인산칼슘계 무기물을 포함하는 혼합조성물을 용매에 용해시키는 단계;

b) 상기 혼합조성물이 용해된 용액으로 막을 제조하는 단계; 및

c) 상기 막에 인산완충식염수를 처리하여 골재생 유도 차폐막을 제조하는 단계;

를 포함할 수 있다.

상기 황다랑어 껍질 추출물은

ⅰ) 황다랑어에서 껍질을 분리하여 산으로 처리하는 단계;

ⅱ) 상기 처리된 황다랑어 껍질을 물로 중화 및 중탕하는 단계; 및

ⅲ) 상기 중탕한 용액을 농축하여 투석하는 단계;

를 포함하여 추출하는 것일 수 있다.

상기 a)단계에서 인산완충식염수는 알칼리 토금속 염화물을 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 b)단계에서 상기 막은 열건조를 통하여 제조되는 것일 수 있다.

상기 a)단계에서 혼합조성물은 에틸렌다이아민테트라아세트산을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 골재생 유도 조성물은 화학적 가교제를 사용하지 않고 물리적으로 망상 결합구조를 형성할 수 있고, 우수한 생체적합성을 가짐에 따라 현저히 향상된 골 결손 완화, 개선 및 치유효과를 제공할 수 있다는 장점이 있다.

또한, 본 발명의 골재생 유도 차폐막은 망상 결합구조를 가지는 젤란검과 황다랑어 껍질 추출물 복합체에 인산칼슘계 무기물이 균질 분산되어 있어 인산칼슘계 무기물의 타 부위로의 이탈 및 분산을 방지하여 집중적인 골 재생효과를 유도할 수 있다는 장점이 있다.

또한, 본 발명의 골재생 유도차폐막은 골이식 후 일정기간동안 형태를 유지하는 강도를 가짐에 따라 고정력이 우수하여 골 결손부위에 우수한 골 재생력을 제공할 수 있다는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 골재생 유도 차폐막의 주사전자현미경 관찰사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 골재생 유도 차폐막의 원자간력 현미경(AFM)으로 측정된 표면거칠기 결과이다. 도 2의 (a)는 비교예 1, 도 2의 (b)는 비교예 2 및 도 2의 (3)은 실시예 1이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 골재생 유도 차폐막의 적외선분광법의 결과이다. 도 3의 (a)는 비교예 1, 도 3의 (b)는 비교예 2 및 도 3의 (3)은 실시예 1이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 골재생 유도 차폐막의 X-선 회절분석의 결과이다. 도 4의 (a)는 비교예 1, 도 4의 (b)는 비교예 2 및 도 4의 (3)은 실시예 1이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 골재생 유도 차폐막의 열중량 분석의 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 골재생 유도 차폐막의 인장강도 측정 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 골재생 유도 차폐막의 알칼리성 인산분해효소를 이용한 활성도의 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 랫트실험의 CT스캔 사진을 이용한 골재생율의 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 가토실험을 통한 골재생율의 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 가토실험을 통한 조직염색을 확인한 결과이다. 도 10의 (a)는 비교예 1, 도 10의 (b)는 비교예 2 및 도 10의 (3)은 실시예 1이다. NB: 신경세포체(nerve cell body), BM: 골수 (bone marrow) 및 CT: 염색부위(chemotherapy)을 나타낸다.

이하 실시예를 통해 본 발명에 따른 골재생 유도조성물, 골재생 유도 차폐막 및 이의 제조방법에 대하여 더욱 상세히 설명한다. 다만 하기 실시예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 참조일 뿐 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니며, 여러 형태로 구현 될 수 있다.

또한 달리 정의되지 않는 한, 모든 기술적 용어 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자 중 하나에 의해 일반적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 설명에 사용되는 용어는 단지 특정 실시예를 효과적으로 기술하기 위함이고, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명은 골재생 유도조성물, 골재생 유도 차폐막 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 대하여 구체적으로 설명하면, 다음과 같다.

본 발명의 골재생 유도조성물은 황다랑어 껍질 추출물, 젤란검 및 인산칼슘계 무기물을 포함할 수 있다.

인산칼슘계 무기물은 가루형태로 한정되어 골 결손부위에 골이식재로 제공됨에 따라 봉합과 같은 수술과정에서 적용한 위치에서 벗어나거나 혈액 등의 여러 외부적인 작용으로 인해 골 결손부위에서 쉽게 흩어진다는 문제가 있었다. 이러한 인산칼슘계 무기물의 분산이 골 재건의 효과를 반감시켜 인산칼슘계 무기물의 효과를 확실히 보지 못한다는 어려움이 있다.

이를 해결하기 위하여 인산칼슘계 무기물을 골 결손부위에 자연적인 재생과정을 증대시킬 수 있도록 생체 내에서 형태 및 강도를 유지할 수 있도록 하는 방안이 필요한 실정이다.

이에 본 발명에서는 황다랑어 껍질 추출물과 젤란검을 인산칼슘계 무기물과 함께 혼합하여 골 결손 치유효과를 증대시키고, 생체적합성이 우수할 뿐만 아니라 골 결손부위에 제공된 후 일정기간동안 형태 및 강도를 유지하면서 우수한 골 재생력을 제공할 수 있는 골재생 유도 차폐막을 제조하였다. 상기 골재생 유도 차폐막은 생체적합성이 우수하고, 인산칼슘계 무기물만을 제공할 때보다 골재생 유도 차폐막에 필요한 강도를 가지며, 다량의 골 형성 단백질을 보유함에 따라 더욱 우수한 골 재생력을 가질 수 있게 된다. 또한, 황다랑어 껍질 추출물, 젤란검 및 인산칼슘계 무기물을 포함하는 막에 인산완충식염수를 더 포함하여 처리함에 따라 생체적합성이 더욱 향상되고, 골재생 유도 차폐막의 고정력을 더욱 향상시킬 수 있게 된다.

본 발명의 골재생 유도조성물은 골재생 유도 차폐막으로 제조될 때 포함된 황다랑어 껍질 추출물, 젤란검 및 인산칼슘계 무기물을 포함하여 혼합 및 인산완충식염수로 처리함에 따라 젤란검과 황다랑어 껍질 추출물의 복합체에 인산칼슘계 무기물이 균질 분산된 망상 결합구조 형상으로 제조된다. 이러한 형상에 의하여 우수한 생체적합성을 가질 뿐만 아니라 현저히 향상된 골 결손 완화, 개선 및 치유효과를 나타내게 된다. 이에 따라 골 결손부위에 우수한 골 재생효과를 유도하여 골세포 재생 및 골 결손 부위 재건 시, 손상 전과 같은 수준으로 재생 및 재건될 수 있다. 또한, 세포나 조직의 종류에 관계없이 부착능력도 우수하여 골 결손부위에서 우수한 고정력으로 골 결손부위의 골 재생력을 더욱 향상시킬 수 있다.

본 발명의 상기 골재생 유도조성물은 생체재료 중 미생물 유래 다당류인 젤란검(Gellan gum, GG)을 골재생 유도조성물에 포함하고자 한다. 상기 젤란검은 글루콘산, 람노오스, 포도당이 1 : 1 : 2로 구성된 복합 다당류로서, 인체 내 수분과 결합하는 형태의 약물 전달 원료 물질 및 기본 약물제제로 활용하는 연구에 응용되고 있다. 상기 젤란검은 무색투명하며, 산과 열에 잘 견디고, 이온 첨가를 통하여 막의 인장강도가 조절될 수 있다. 상기 젤란검은 열을 가해야 용해되고, 여러 번 열을 가해도 막 인장강도는 저하되지 않는다. 상기 젤란검의 유동학적 구조적 특성이 밝혀지면서 여러 가지 분야에서 각광받는 소재로 인정받고 있다. 상기 젤란검은 생체 적합성이나 물리화학적 특성이 뛰어나서 조직공학에 사용될 뿐만 아니라 제조 과정이 쉬워서 필름, 하이드로겔, 미립구, 마이크로캡슐 및 스폰지 등 다양한 형태로 사용될 수 있다. 이와 같이 상기 젤란검은 황다랑어 껍질 추출물 및 인산칼슘계 무기물과 혼합하고 인산완충식염수로 처리하여 골재생 유도 차폐막을 제조하면, 생체적합성이 우수하고, 골 결손부위에 제공된 후 형태 및 강도가 유지되면서 우수한 골 재생력을 발현시킬 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따라 상기 젤란검의 분자량은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 중량평균분자량 10,000 내지 1,000,000g/mol일 수 있고, 바람직하게는 100,000 내지 1,000,000g/mol일 수 있다. 상기 범위의 분자량을 가질 경우 골재생 유도 차폐막으로 제조되었을 때, 인장강도를 향상시켜 골 결손 부위에서 형태를 유지할 수 있어 바람직하다.

또한, 상기 젤란검과 더불어 본 발명은 해양소재인 황다랑어(yellowfin tuna) 껍질 추출물을 포함한 골재생 유도 조성물을 제공하고자 한다. 상기 황다랑어 껍질 추출물은 세포독성이 없고, 그 자체로 접착력을 가지고 있어 상처부위 등 생체에 직접 사용이 가능하다. 그리고 황다랑어 껍질 추출물에는 아미노산, 단백질 및 황산콘드로이친(Chondroitin　Sulfate)이 풍부하여 생물체의 손상부위에 도포시 조직 접착뿐만 아니라 재생효과도 우수하다. 예를 들어, 황다랑어에서 추출되는 아미노산은 조직 재생을 촉진하는 폴리펩타이드로 세포 증식 효과가 탁월하다. 특히, 상기 아미노산은 L-아미노산인 Glycyl-L-proline성분을 풍부하게 포함하고 있어 골 재생효과가 우수하다. 또한, 상기 황산콘드로이친은 세포 외 구조물질(ECM)을 구성하고 있는 성분 중 가장 중요한 성분으로 조직 재생 또는 노화방지 효과가 있어 관절염 치료제 및 화장품에도 중요한 소재로 사용될 수 있다. 본 발명의 일 양태에 따르면, 황다랑어 껍질에서 추출한 황다랑어 추출물에는 60㎎/g 이상의 아미노산이 함유되어 있고, 5㎎/㎖이상의 단백질이 함유되어 있으며 20중량% 이상의 황산콘드로이친이 함유되어 있어, 기존에 알려진 골재생 유도 차폐막의 용도로 사용하는 소재보다 조직 재생 등의 효과가 우수하여 특히 의료용인 골이식재료로써 매우 적합할 수 있다. 이와 같이 상기 황다랑어 껍질 추출물은 젤란검 및 인산칼슘계 무기물과 혼합하고 인산완충식염수로 처리하여 골재생 유도 차폐막을 제조하면, 골 재생의 활성을 향상시켜 골재생 유도 능력을 증대시키고, 골재생 유도 차폐막의 골과의 접착능력이 향상되어 적용된 골 결손부위에 우수한 고정력을 가질 수 있어 집중적인 골 재생을 유도할 수 있어 바람직하다.

본 발명의 일 양태에 따라 상기 젤란검은 골재생 유도조성물 고형분 총 중량에 대하여, 30 내지 80중량% 포함할 수 있고, 바람직하게는 40 내지 80중량% 포함할 수 있고, 더 바람직하게는 45 내지 70중량% 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 범위로 포함할 경우 인산칼슘계 무기물 등의 구성성분의 분산성이 향상되고, 골 결손부위에 제공된 후 형태 및 강도를 유지하고 골 결손부위에 조직세포 등의 침입으로부터 분리시켜 골 치유효과를 향상시켜 바람직하다.

본 발명의 일 양태에 따라 상기 황다랑어 껍질 추출물은 골재생 유도조성물 고형분 총 중량에 대하여, 1 내지 40중량% 포함할 수 있고, 바람직하게는 1 내지 35중량% 포함할 수 있고, 더 바람직하게는 1 내지 30중량%포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 범위로 포함할 경우 골과의 접착력 향상에 따라 골 결손부위에 우수한 고정력으로 집중적인 골 치유효과를 향상시켜 바람직하다.

본 발명의 일 양태에 따라 상기 황다랑어 껍질 추출물과 젤란검은 10:90 내지 90:10중량비로 포함할 수 있고, 바람직하게는 10:90 내지 30:70중량비로 포함할 수 있다. 상기 범위로 골재생 유도조성물에 황다랑어 껍질 추출물과 젤란검을 포함하면 골재생 유도 차폐막의 인장강도를 향상시켜 골 결손부위에 우수한 고정력을 제공할 수 있어 골 재생력을 더욱 향상시킬 수 있어 바람직하다.

본 발명의 일 양태에 따른 상기 인산칼슘계 무기물로는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 상기 인산칼슘계 무기물은 자가골, 동종골, 이종골 및 합성골 대체물 등에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 혼합물에서 얻어 사용할 수 있다. 구체적인 예를 들어 인산칼슘계 무기물은 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite), 탄산아파타이트(Carbonated apatite), 인산삼칼슘(TricalciumPhosphate), 인산수소칼슘(Calcium Hydrogen Phosphate), 제1인산칼슘(Monocalcium phosphate), 제2인산칼슘(Dicalcium phosphate), 2수소인산칼슘(Calcium dihydrogen phosphate), 제3인산칼슘(Tricalcium phosphate), 제10인산칼슘(Octacalcium phosphate) 및 피로인산칼슘(Calcium pyrophosphate) 등에서 선택되는 어느 하나 또는 둘이상의 혼합물을 포함하는 것일 수 있다.

상기 자가골(Autogenous bone)은 환자 자신에게서 얻어지는 골을 사용한 인산칼슘계 무기물을 말하며, 동종골(Allogenic bone)은 동종의 다른 개체에서 얻어진 인산칼슘계 무기물을 말하는 것으로서 보통 죽은 사람의 뼈에서 얻어진다. 또한, 상기 이종골(Heterogenous bone)은 다른 종의 동물에서 얻어지는 인산칼슘계 무기물을 말하는 것으로서, 유기질을 태워서 석회화된 형태로 사용되거나 탈회를 하고 남은 유기기질의 형태로 사용되기도 한다. 상기 이종골은 대부분 우골(Bovine)에서 얻어지며 산호에서 얻어지는 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite, 수산화인회석)가 사용되기도 한다. 상기 인산칼슘계 무기물은 생분해성 및 생체적합성이 우수하여 뼈 충진재로써 많이 사용되고 있다. 이를 골 결손부위에 이식한 후에 인산칼슘이 혈액과 뒤섞여 분해되면서 제공되는 칼슘이온이 골의 형성을 촉진시킬 수 있다. 그러나 보편적인 인산칼슘계 무기물은 가루형태로 제공됨에 따라 골 결손부위에서 이탈하면서 흩어져 골 결손부위에 집중적인 골 재생 치유효과가 저하되는 문제점이 있었다. 이에 본 발명의 골재생 유도조성물로, 인산칼슘 무기물에 황다랑어 껍질 추출물 및 젤란검을 혼합하고 인산완충식염수를 처리하여 골재생 유도차폐막을 제조함에 따라, 인산칼슘계 무기물의 분산 및 이탈을 방지하면서 골 결손부위에 집중적으로 골 재생 치유효과를 제공할 수 있어 골재생력이 우수하여 바람직하다.

본 발명의 일 양태에 따라 상기 인산칼슘계 무기물은 골재생 유도조성물 고형분 총 중량에 대하여, 10 내지 40중량% 포함할 수 있고, 바람직하게는 15 내지 35중량% 포함할 수 있고, 더 바람직하게는 20 내지 35중량% 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 범위로 포함할 경우 골 재생력이 향상되어 바람직하다.

본 발명의 일 양태에 따라 상기 골재생 유도조성물은 인산완충식염수를 더 포함할 수 있다. 상기 인산완충식염수는 황다랑어 껍질 추출물, 젤란검 및 인산칼슘계 무기물의 혼합조성물을 용해 후 건조하여 형성된 막에 첨가하여 처리하도록 포함할 수 있다. 상기 인산완충식염수는 일정량의 Ca^{2 +}, Mg^{2 +} 또는 이들의 혼합물에서 선택되는 알칼리 토금속 이온의 염화물을 포함하는 체액 성분이므로 순수한 물을 사용하여 제조된 조성물보다 인산완충식염수가 포함된 조성물의 생체 적합성을 높일 수 있다. 본 발명에 포함된 황다랑어 껍질 추출물 및 젤란검의 음전하를 띄는 -COOH 그룹이 2가 양이온인 인산완충식염수 내의 알칼리 토금속 이온과 반응하면 정전기적 결합에 의해 코일-헬릭스 전이현상을 거쳐 망상 결합구조가 형성될 수 있다. 이와 같이 제조된 골재생 유도 차폐막은 골 결손부위에 제공되어 일정기간동안 형태가 유지되면서 차폐막으로써의 강도를 가질 수 있어 골 결손부위에 골재생 유도 차폐막을 제공하였을 때, 우수한 고정력으로 골 치유효과를 증대시킬 수 있어 바람직하다.

본 발명의 일 양태에 따라 상기 인산완충식염수는 바람직하게는 Ca^{2 +}, Mg^{2 +} 또는 이들의 혼합물을 포함하는 인산완충식염수인 D-PBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)일 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따라 상기 인산완충식염수는 상기 골재생 유도조성물 100 중량부에 대하여, 50 내지 300중량부 포함하여 처리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 범위로 포함할 경우 골재생 유도 차폐막의 형태를 유지할 수 있는 강도가 가질 수 있어 바람직하다.

본 발명의 일 양태에 따라 상기 골재생 유도조성물은 용해 및 분산을 위하여 잔량의 용매를 더 포함할 수 있다. 상기 용매로는 증류수, 정제수 등에서 선택되는 물을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따라 상기 골재생 유도조성물의 구성성분들이 균일하게 분산되어 전체적으로 균일한 효과를 갖는 골재생 유도차폐막을 제공하도록 하기 위하여 에틸렌디아민테트라아세트산 (ethylenediaminetetraacetic acid)을 더 포함할 수 있다. 이를 더 포함하면, 골재생 유도 조성물의 균일한 분산성을 유도하여 골조직 세포가 골 결손 부위에 균질하게 분포될 수 있어 골 치유효과를 향상시킬 수 있어 바람직하다. 또한, 일 양태에 따라 상기 에틸렌다이아민테트라아세트산에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 혼합물은 분산성 향상을 위하여 골재생 유도 조성물 고형분 총 중량에 대하여, 0.01 내지 10중량% 포함할 수 있고, 바람직하게는 0.01 내지 5중량% 포함할 수 있고, 더 바람직하게는 0.01 내지 1중량% 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이를 확인하기 위하여 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이 주사전자현미경(SEM, JEOL Ltd, JSM-7500F, Japan) 및 원자간력현미경(AFM, Park system, XE-100, South Korea)을 통하여 골재생 유도 차폐막의 구성성분이 균일하게 분포되어 제조됨을 확인하였다. 도 1에 도시된 바와 같이 본 발명의 골재생 유도 차폐막은 균일하게 구성성분이 분산된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 2에 도시된 바와 같이 본 발명의 골재생 유도 차폐막은 인산칼슘계 무기물 및 황다랑어 껍질 추출물과 젤란검으로만 이루어진 막보다 균질한 표면을 갖는 것을 확인하였다. 구체적으로 표면거칠기(Rq)를 측정하였을 때, 인산칼슘계 무기물은 53.97±4.15㎛이고, 황다랑어 껍질 추출물과 젤란검으로만 이루어진 막은 1.07±2.31㎛이고, 본 발명의 골재생 유도차폐막은 45.83±6.3㎛인 것을 통하여 본 발명의 골재생 유도 차폐막은 인산칼슘계 무기물이 균질하게 분산되어 있는 것을 알 수 있었다.

본 발명의 골재생 유도 차폐막은 구체적으로 설명하면, 망상 결합구조를 가지는 젤란검과 황다랑어 껍질 추출물 복합체에 인산칼슘계 무기물이 균질 분산된 것일 수 있다. 인산칼슘계 무기물은 보편적으로 가루형태로 골이식재로 제공됨에 따라 골 결손부위에서 이탈하면서 흩어져 골 결손부위에 집중적인 골 재생 치유효과가 저하되는 문제점이 있었다. 본 발명의 골재생 유도 차폐막은 젤란검과 황다랑어 껍질 추출물 복합체에 인산칼슘계 무기물이 균질 분산됨에 따라 골 결손 부위에 제공되었을 때, 차폐막으로써의 인장강도가 우수하고, 인산칼슘계 무기물의 분산 또는 이탈이 발생하지 않고 집중적으로 균일한 골 재생 효과를 제공할 수 있어 바람직하다.

본 발명의 일 양태에 따라 상기 망상 결합구조는 젤란검과 황다랑어 껍질 추출물 각각에 존재하는 관능기가 알칼리 토금속 이온에 의해 결합된 것일 수 있다. 바람직하게 상기 알칼리 토금속이온은 Ca^{2 +}, Mg²⁺ 또는 이들의 혼합물에서 선택될 수 있다.

이와 같이 상기 망상 결합구조는 본 발명에 포함된 황다랑어 껍질 추출물 및 젤란검의 관능기인 음전하를 띄는 -COOH 그룹이 2가 양이온인 인산완충식염수 내의 알칼리토금속 이온과 반응하면서 정전기적 결합에 의해 코일-헬릭스 전이현상을 거쳐 망상 결합구조가 형성된 것일 수 있다. 상기와 같은 망상 결합구조가 형성된 골재생 유도 차폐막을 형성함에 따라 골 결손 부위에 제공되었을 때, 일정기간동안 형태가 유지될 수 있는 강도를 가짐으로써 골 결손부위에 골재생 유도차폐막을 제공하였을 때, 우수한 고정력으로 골 치유효과를 증대시킬 수 있어 바람직하다.

또한, 상기와 같이 인산완충식염수로 처리함에 따라 화학적 가교제를 사용하지 않고 물리적으로 망상 결합구조가 형성되면서 점도를 높일 수 있고, 인산칼슘계 무기물이 응집 또는 침전되지 않고, 균질하게 망상 결합구조 내에 분산될 수 있다. 이에 따라, 황다랑어 껍질 추출물, 젤란검 및 인산칼슘계 무기물을 포함함으로써 우수한 생체적합성을 가져 현저히 향상된 골 결손 완화, 개선 및 치유효과를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 골재생 유도 차폐막은 골이식 후 일정기간동안 형태 및 강도를 유지하여 우수한 골 재생력을 제공할 수 있다.

본 발명의 골재생 유도 차폐막의 제조방법을 구체적으로 설명하면,

a) 황다랑어 껍질 추출물, 젤란검 및 인산칼슘계 무기물을 포함하는 혼합조성물을 용매에 용해시키는 단계;

b) 상기 혼합조성물이 용해된 용액으로 막을 제조하는 단계; 및

c) 상기 막에 인산완충식염수를 처리하여 골재생 유도 차폐막을 제조하는 단계;를 포함할 수 있다.

일반적으로 다당류의 화학반응에 의한 가교는 다당류 용액에 2 이상의 관능기를 가지는 가교시약을 작용하게 함으로써 행할 수 있다. 그러나 다당류의 대부분이 실질적으로 물 외에는 용해되지 않기 때문에, 수중에서 효율적으로 가교를 진행시킬 수 없다. 이에 반해 본 발명의 상기 황다랑어 껍질 추출물, 젤란검 및 인산칼슘계 무기물을 포함하는 혼합조성물에 인산완충식염수를 처리한 차폐막은 가교시약을 이용하지 않고 물리적으로 망상 결합구조를 형성하고, 점성을 높여 골 결손부위에 장기간 머무를 수 있는 형태 및 강도를 가짐에 따라 우수한 골 재생력을 유도할 수 있는 골재생 유도 차폐막을 제조할 수 있어 바람직하다.

본 발명의 일 양태에 따라 상기 인산완충식염수는 상기 막 100 중량부에 대하여, 50 내지 300중량부의 함량으로 처리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 양태에 따라 상기 황다랑어 껍질 추출물은 하기 추출방법을 포함하여 추출하는 것일 수 있다.

ⅰ) 황다랑어에서 껍질을 분리하여 산으로 처리하는 단계;

ⅱ) 상기 처리된 황다랑어 껍질을 물로 중화 및 중탕하는 단계; 및

ⅲ) 상기 중탕한 용액을 농축하여 투석하는 단계;

본 발명의 일 양태에 따라 상기 단계를 거친 후 ⅳ) 상기 투석 후 동결 건조하여 분말화하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 상기 분말화 단계를 거칠 경우 황다랑어 껍질 추출물을 추출분말형상으로 보관하여 제공할 수 있다.

상기 산은 일 양태에 따라 약산일 수 있으며, 상기 약산은 예를 들어, 아세트산, 탄산, 시트르산, 아스코르브산, 옥살산 및 구연산 등에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 아세트산일 수 있다.

더욱 구체적으로 설명하면, 일 양태에 따라 황다랑어 껍질 추출물은 황다랑어에서 황다랑어 껍질을 분리하여 아세트산을 처리하는 단계, 아세트산 처리 후, 물로 중화시키고 중탕하는 단계 및 중탕한 용액을 농축 후 투석하는 단계를 포함하는 황다랑어 껍질 추출방법으로 제조할 수 있다. 상기 황다랑어 껍질 추출물은 투석과정 후 동결건조하여 분말 상태로 보관할 수 있고, 황다랑어 껍질 분말을 상기 골재생 유도조성물과 물에 용해시키는 등 단순혼합하여 즉시 골재생 유도 차폐막으로 사용할 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따라 상기 아세트산 처리 단계는 0 내지 10℃, 1 내지 10℃, 2 내지 10℃, 2 내지 10℃, 2 내지 8℃ 바람직하게는 4 내지 8℃에서 5 내지 7시간 동안 수행할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 아세트산 용액 처리에 의해 팽윤된 황다랑어 껍질은 흐르는 물로 10시간 이상, 12시간 이상 바람직하게는 10 내지 12시간 동안 중화시킨 후, 물을 추가로 첨가하여 중탕단계를 거치게 된다. 상기 중탕 단계는 50 내지 80℃, 50 내지 70℃ 바람직하게는 60 내지 70℃에서 3 내지 4 시간 동안 수행할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 중탕 단계 후 농축하기 전에 필요에 따라 여과지를 사용하여 중탕한 용액에 포함된 불순물을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 농축 과정은 중탕한 용액 또는 중탕한 용액을 여과지로 거른 용액을 단계는 50 내지 80℃, 50 내지 70℃ 바람직하게는 60 내지 70℃에서 최초 사용한 황다랑어 껍질 무게에 이를 때까지 농축할 수 있다. 농축 후 투석과정을 거쳐 수득한 황다랑어껍질 추출물은 접착력을 가지고 있어 이를 그대로 사용할 수 있고, 동결 건조를 통해 분말형태로 보관할 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따라 상기 a)단계에서 인산완충식염수는 알칼리 토금속 염화물을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 인산완충식염수는 일정량의 알칼리 토금속 이온을 포함하는 염화물을 포함하는 체액 성분이므로 순수한 물을 사용하여 제조된 조성물보다 인산완충식염수가 포함된 조성물의 생체 적합성을 높일 수 있다. 바람직하게 상기 알칼리 토금속이온은 Ca²⁺, Mg²⁺ 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따라 상기 인산완충식염수는 Ca^{2 +}, Mg^{2 +} 또는 이들의 혼합물을 포함하는 인산완충식염수인 D-PBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)일 수 있다. 상기 인산완충식염수는 일 양태에 따라 알칼리 토금속 염화물을 50 내지 500㎎/ℓ포함할 수 있고, 바람직하게는 100 내지 400㎎/ℓ포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로는 염화칼슘은 40 내지 300 ㎎/ℓ, 염화마그네슘을 10 내지 200 ㎎/ℓ의 함량을 갖는 염화물에서 선택되는 어느 하나 또는 이 둘의 혼합물을 포함하는 인산완충식염수일 수 있다. 바람직하게는 염화칼슘은 100 내지 300 ㎎/ℓ, 염화마그네슘을 10 내지 100 ㎎/ℓ의 함량을 갖는 염화물에서 선택되는 어느 하나 또는 이 둘의 혼합물을 포함하는 인산완충식염수일 수 있다.

상기 인산완충식염수는 알칼리 토금속 이온을 포함함에 따라 본 발명에 포함된 황다랑어 껍질 추출물 및 젤란검의 음전하를 띄는 -COOH 그룹이 2가 양이온과 반응하여 정전기적 결합에 의해 코일-헬릭스 전이현상을 거쳐 망상 결합구조가 형성된 골재생 유도 차폐막을 형성할 수 있다. 이와 같이 제조된 골재생 유도 차폐막은 골 결손부위에 제공되어 일정기간동안 형태가 유지되면서 차폐막으로써의 강도를 가질 수 있어 골 결손부위에 골재생 유도 차폐막을 제공하였을 때, 우수한 고정력으로 골 치유효과를 증대시킬 수 있어 바람직하다.

특히, 상기 망상 결합구조를 가지는 젤란검과 황다랑어 껍질 추출물 복합체에 인산칼슘계 무기물을 균질 분산시켜 골재생 유도 차폐막을 제조하면 골 결손부위에의 골재생력 향상으로 우수한 골 재생효과를 발현하여 골세포 재생 및 골 결손 부위 재건시, 손상 전과 같은 수준으로 재생 및 재건될 수 있다. 또한, 세포나 조직의 종류에 관계없이 부착능력도 우수하여 다양한 골 결손부위가 있는 주위 조직에서도 우수한 고정력을 발현할 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따라 상기 b)단계에서 상기 막은 열건조를 통하여 제조되는 것일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 황다랑어 껍질 추출물, 젤란검 및 인산칼슘계 무기물을 용매에 용해시킨 후 열건조를 통하여 건조시켜 막을 제조할 수 있다. 상기 열건조는 일 양태에 따라 80 내지 150℃에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 90 내지 120℃에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 양태에 따라 상기 골재생 유도조성물의 구성성분들이 균일하게 분산되어 전체적으로 균일한 효과를 갖는 골재생 유도 차폐막을 제공하도록 하기 위하여 상기 a)단계에서 혼합조성물은 에틸렌다이아민테트라아세트산에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 혼합물을 더 포함할 수 있다. 이를 더 포함하면, 골재생 유도 조성물의 균일한 분산성을 유도하여 골조직 세포가 골 결손 부위에 균질하게 분포될 수 있어 골 치유효과를 향상시킬 수 있어 바람직하다.

본 발명의 골재생 유도 차폐막은 차폐막에 포함된 황다랑어 껍질 추출물, 젤란검, 인산칼슘계 무기물 및 인산완충식염수의 각각의 성분이 가지는 독립적인 특성들만 그대로 가지는 것이 아니라, 각각의 성분이 가지는 고유의 특성과 함께, 각각의 성분의 혼합 및 처리에 의해 발생하는 여러 특성을 가질 수 있다. 이러한 특성은 높은 물리적 특성 향상, 우수한 골 재생 유도효과 등으로 나타낼 수 있다. 이에 따라 골 결손부위에의 골재생력 향상으로 우수한 골 재생효과를 발현하여 골세포 재생 및 골 결손 부위 재건 시, 손상 전과 같은 수준으로 재생 및 재건될 수 있다. 또한, 세포나 조직의 종류에 관계없이 부착능력도 우수하여 다양한 골 결손부위가 있는 주위 조직에서도 우수한 고정력을 발현할 수 있다.

이하 실시예를 통해 본 발명에 따른 골재생 유도조성물, 골재생 유도 차폐막 및 이의 제조방법에 대하여 더욱 상세히 설명한다. 다만 하기 실시예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 하나의 참조일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 여러 형태로 구현될 수 있다.

또한 달리 정의되지 않은 한, 모든 기술적 용어 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자 중 하나에 의해 일반적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 설명에 사용되는 용어는 단지 특정 실시예를 효과적으로 기술하기 위함이고 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

또한 명세서에서 특별히 기재하지 않은 첨가물의 단위는 중량%일 수 있다.

[제조예 1]

황다랑어 껍질 추출물 제조

황다랑어(Thunnus albacares)를 손질하여 황다랑어 껍질만 분리하여 무게(100g)를 잰 뒤, 10배량의 0.2N 아세트산(acetic acid)에 담궈 냉장실에서(4~8℃) 6시간동안 담가 놓았다. 용액에 팽윤된 황다랑어 껍질을 꺼내 흐르는 물로 12시간 동안 중화시켰다. 중화시킨 껍질 300g에 4배의 물을 첨가한 뒤 60℃ 에서 4시간 중탕하였다. 중탕 후, 용액 내에 포함된 불순물 제거를 위해 여과지(Filter paper)를 사용하여 여과를 진행하였다. 여과한 용액을 다시 70℃에서 가열시켜 최종적으로 손질한 껍질 무게로 농축시켰다. 농축 후 컷오프(cutoff) 사이즈 14 kDa 멤브레인 튜브(membrane tube)를 이용하여 4℃에서 증류수(1 L, 2회, ~10시간/회)로 투석을 진행하였다. 투석이 종료된 후 동결건조를 진행하여 단백질이외의 대부분의 불순물을 제거하고 동결건조하여 파우더 형태로 황다랑어 껍질 추출물 얻어 데시케이터(desicator)에 보관하였다. 상기 황다랑어 껍질 추출물은 L-아미노신인 Glycyl-L-proline성분을 88.61중량% 함유함을 확인하였다.

[실시예 1] GG/TS-BGM

3차증류수 100㎖에 상기 황다랑어 껍질 추출물(Tuna skin, TS)과 젤란검((Gellan gum, GG) (Gelzan^CM, Mw = 1,000 kg/mol, Sigma Aldrich)을 0.3:0.7중량비로 제조하여 1g 투입하였다. 이종골(Mega-Oss Bovine, BGM) 300㎎과 에틸렌다이아민테트라아세트산(ethylene diaminetetraacetic acid, EDTA)을 0.01g을 추가 투입하였다. 상기 혼합조성물을 포함하는 용액을 100℃에서 완전히 용해시킨 후, 6well plate에 캐스팅한 후 60℃의 열 건조기에서 건조시켜 막을 형성하였다. 상기 건조된 막에 D-PBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, calcium chloride, magnesium chloride, pH=7.4(10X), Gibco Inc, NY, USA)를 3㎖ 첨가하여 가교된 얇은 골재생 유도 차폐막을 제조하였다.

[실시예 2]

상기 실시예 1에서 황다랑어 껍질 추출물과 젤란검의 중량비를 0.1:0.9로 제조한 것을 제외하고는 동일하게 실시하였다.

[비교예 1] BGM

이종골(Mega-Oss Bovine,BGM)을 가루상태로 사용하였다.

[비교예 2] GG/TS

상기 실시예 1에서 이종골을 사용하지 않은 것을 제외하고는 동일하게 실시하였다.

[실험예 1] 골재생 유도차폐막의 성분분석

도 3에 도시된 바와 같이 적외선 분광분석기(FTIR Spectrum GX, USA)를 이용하여 실시예 1(GG/TS-BGM), 비교예 1(BGM) 및 비교예 2(GG/TS)의 표면 기능기를 확인하였다. 비교예 1의 경우 3573㎝^-1과 631㎝^-1에서 OH 흡수밴드를 관찰하였다. 또한, 실시예 1 및 비교예 1에서 940~1120㎝^-1, 566㎝^{- 1}및 603㎝^-1에서 인산염(Orthophosphate, PO₄) 피크를 관찰하여 인산칼슘계 무기물을 포함하고 있는 것을 확인할 수 있었다.

도 4에 도시된 바와 같이 결정구조를 확인하기 위하여 X-선 회절분석기(D/Max Ultima III, RigakuCo., Japan)를 사용하여 실시예 1(GG/TS-BGM) 비교예 1(BGM) 및 비교예 2(GG/TS)의 X-선 회절분석을 확인하였다. 시료는 필름 형태로 CuKα radiation에서 40 kV, 40 mA에서 scan range는 2θ 5내지 80°에서, scan speed는 4 ℃/min로 설정하여 결정구조를 분석하였다. 이종골의 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite, HA)와 β-TCP(β-Tricalcium phosphate)의 고유 피크를 실시예 1에서 관찰되는 것을 확인하고, 비교예 2와 비교하였을 때, 본 발명의 골재생 유도차폐막에 이종골이 젤란검 및 황다랑어 껍질추출물의 복합체에 균질하게 분산되어 있음을 확인할 수 있었다.

도 5에 도시된 바와 같이 열중량분석기(TGA, Mettler Toledo, TGA-SDTA 851e, USA)를 이용하여 실시예 1(GG/TS-BGM) 비교예 1(Col 1 vs BGM) 및 비교예 2(GG/TS)의 중량변화를 확인하였다. 비교예 1의 경우 800℃까지 중량변화를 보이지 않고 안정한 상태를 나타내는 반면, 비교예 2의 경우 30-135℃구간에서 물 분자가 증발하고, 230-500℃ 구간에서 탄소가 분해된 것을 확인할 수 있었다. 이를 바탕으로 실시예 1을 확인하였을 때, 500℃이상의 구간에서 탄소가 분해된 후 남은 중량으로 확인하면 인산칼슘계 무기물이 30중량% 담지되어 있음을 확인할 수 있었다.

이를 통하여 본 발명의 골재생 유도 차폐막의 구성성분들이 서로간의 결합력이 우수한 것을 확인할 수 있었다. 이에 따라 본 발명의 골재생 유도 차폐막은 균일한 골재생력을 발현할 수 있고, 골 결손부위에 제공되더라도 분산되거나 이탈되는 것을 방지하여 더욱 우수한 골 치유효과를 발현할 수 있다.

[실험예 2] 골재생 유도차폐막의 인장강도 측정

도 6에 도시된 바와 같이 실시예 1(GG/TS-BGM 0.7:0.3), 실시예 2(GG/TS-BGM 0.9:0.1) 및 비교예 2(GG/TS)의 인장강도를 확인하기 위하여 인장시편을 제작한 뒤, UTM(ultimate tensile test machine, TO-102, Testone Co., Korea)를 이용하였다. 이때 사용된 시편은 24 시간동안 초순수에 담궈 충분히 팽윤시킨 상태에서 각각 측정하였다. 본 발명의 실시예의 구성인 이종골을 포함하더라도 인장강도의 큰 차이를 보이지 않고, 골재생 유도 차폐막으로 사용하는데 필요한 인장강도를 나타내는 것을 확인하였다. 이와 같은 인장강도는 골 결손 부위에 제공되었을 때, 일정기간동안 형태 유지되는 강도를 가질 수 있으며, 이와 동시에 골 결손 부위에 우수한 고정력으로 형태가 유지되어 집중적으로 결손 부위의 골 치유효과를 발현할 수 있다. 또한, 실시예 1의 조성이 실시예 2보다 더 우수한 인장강도를 가짐에 따라 실시예 1의 골재생효과가 더욱 우수한 것을 확인할 수 있었다. 이에 따라 본 발명의 골재생 유도 차폐막은 사용하는 목적에 따라 비율을 달리하여 다양하게 활용 가능할 것으로 보인다.

[실험예 3] 골재생 유도차폐막의 염기성 인산분해효소 활성 측정

조골세포는 세포막에 알칼리성 인산 분해 효소(alkaline phosphatase, ALP)를 가지고 있고, 이 효소는 세포의 외막과 석회화 조직에서 높은 농도로 발견되어 석회화 과정 동안 무기인산은 운반, 세포 분열이나 분화의 조절자 역할을 하며 조골세포 활성의 표지인자로 널리 알려져 있다. 조골세포의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 도 7에 도시된 바와 같이 조골세포 활성의 지표효소로 널리 알려진 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphate, ALP)를 측정하였다. 구체적으로 세포를 7일, 14일 동안 실시예 1(GG/TS-BGM) 및 비교예 2(GG/TS)의 막과 함께 배양하여 ALP activity Kit(Takara, Japan)를 사용하여 분석하였다. MC3T3-E1 세포를 6-well plate에 각 well당 1×10⁵개씩 분주한 후 10% FBS(Fetal Bovine Serum, GIBCO), 1% 항생제(Penicillin G sodium) 50㎛/㎖, 아스코르빈산(ascorbic acid), 10mM 베타-글리세로인산나트륨 수화물(sodium β-glycerophosphate)가 첨가된 α-MEM(α-minimum essential medium, GibcoBRL, USA)으로 2일간 100% 습도조건에서 95%의 공기와 5% CO₂를 계속 공급하면서 배양하였다. 각 세포배양액 0.1㎖에 0.1M 글리신 NaOH 버퍼(pH=10.4) 0.2㎖, 15nM pNPP(p-Nitrophrnyl phophate, sigma, USA) 0.1㎖, 0.1% Triton-X/saline 0.1㎖와 멸균된 증류수 0.1㎖를 혼합하여 37℃에서 30분간 배양한 후, 0.1N NaOH를 0.6㎖ 첨가하여 이들의 반응을 중지시켰다. 96-well plate에 200㎕씩 넣고 ELISA 리더로 410㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphate, ALP)의 활성도는 골 분화 초기에 가장 높은 활성도를 갖기 때문에, 파종 후 7일, 14일 동안 활성도를 측정하였다. 실시예 1과 비교예 2를 비교하였을 때, 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphate, ALP)의 활성도는 실시예 1의 경우 11.28±1.75이며, 비교예 2의 경우 5.51±0.5인 것으로부터 2배차이로 현저하게 본 발명의 골재생 유도 차폐막의 조골세포 활성도가 우수한 것을 확인할 수 있었다. 이는 시간이 지남에도 불구하고 형태유지, 강도 및 생체적합성이 탁월함에 따라 본 발명의 골재생 유도 차폐막의 골재생력 및 골치유효과가 현저히 우수함을 확인시켜주었다.

[실험예 4] 골재생 유도차폐막의 골재생 효과 확인

도 8에 도시된 바와 같이 in vivo 랫트시험을 통하여 골 재생도를 확인하였다. 먼저, 수컷 랫트의 두개골에 6㎜ 크기의 손실 부위를 내어 비교예 2(b) 및 실시예 1(c)을 각각 이식하여 봉합하고, 한달 후에 골 재생 정도를 마이크로 CT스캔을 이용하여 측정하였다. 도 8에 도시된 바와 같이 무처리군(a)와 비교예 2(b) 및 실시예 1(c)을 비교하였을 때, 실시예 1이 가장 높은 골 재생율을 가지면서, 본 발명의 골재생 유도 차폐막의 골재생력 및 골치유효과가 현저히 우수함을 확인시켜주었다.

다음으로, 가토 14마리의 두개골에 8㎜ 크기의 손실 부위를 내어 실시예 1(GG/TS-BGM) 및 시중에 판매되고 있는 차폐막(Bio-Gide, Osteohealth Co., 미국)을 이식하여 봉합하고, 한달 후에 골 재생도 및 조직 염색을 통하여 재생여부를 관찰하였다. 도 9에 도시된 바와 같이 무처리군(CON) 및 시중판매 차폐막 Bio-Gide에 대비하여 현저히 우수한 골 재생도를 갖는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 10에 도시된 바와 같이 조직 염색을 통하여 관찰하였을 때, 인산칼슘계 무기물을 포함하지 않는 시중에 판매되고 있는 차폐막(Bio-Gide, Osteohealth Co., 미국)(b)은 흡수성 차폐막의 양상을 보이며 차폐막이 점차 분해되는 것을 관찰하였다. 이에 반해, 본 발명의 실시예 1의 골재생 유도 차폐막은 골 결손 부위에 콜라겐이 성장하지 않고, 골 결손 부위가 골재생 유도 차폐막에 의해 결합조직세포의 침입으로부터 분리되면서 보호되어 골조직세포가 자랄 수 있는 공간을 제공함으로써 골이 형성 및 복구되는 것을 관찰하였다.

본 발명의 골재생 유도 차폐막은 우수한 생체적합성을 가지며, 골 결손 부위에 이식 후 형태를 유지하는 강도를 나타내어 골 결손 부위에 결착되면서 집중적으로 골 재생력을 향상시킬 수 있어 우수한 골재생 치유효과를 유도할 수 있다. 이에 따라, 손쉬운 겔화 및 생체적합성의 특성을 가지면서 골재생효과가 우수하여 골재생 유도 차폐막으로써 유망한 재료로써 적용될 수 있다.

이상과 같이 본 발명에서는 특정된 사항들과 한정된 실시예를 통해 골재생 유도조성물, 골재생 유도 차폐막 및 이의 제조방법이 설명되었으나, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다.

따라서, 본 발명의 사상은 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등하거나 등가적 변형이 있는 모든 것들은 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.

Claims (12)

1. 아미노산, 단백질 및 황산콘드로이친을 포함하는 황다랑어 껍질 추출물, 젤란검, 인산칼슘계 무기물 및 알칼리 토금속 염화물을 포함하는 인산완충식염수를 포함하는 골재생 유도조성물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 황다랑어 껍질 추출물과 젤란검은 10:90 내지 90:10중량비로 포함하는 골재생 유도조성물.
3. 삭제
4. 제 1항에 있어서,
   상기 골재생 유도조성물은 에틸렌다이아민테트라아세트산을 더 포함하는 골재생 유도조성물.
5. 제 1항에 있어서,
   상기 골재생 유도조성물은 황다랑어 껍질 추출물 10 내지 40중량%, 젤란검 30 내지 60중량% 및 인산칼슘계 무기물 10 내지 40중량% 포함하는 골재생 유도조성물.
6. 젤란검과 황다랑어 껍질 추출물 각각에 존재하는 관능기가 알칼리 토금속 이온에 의해 결합된 망상 결합구조를 가지는 젤란검과 황다랑어 껍질 추출물 복합체에 인산칼슘계 무기물이 균질 분산된 것이고,
   상기 황다랑어 껍질 추출물은 아미노산, 단백질 및 황산콘드로이친을 포함하는 골재생 유도 차폐막.
7. 삭제
8. a) 아미노산, 단백질 및 황산콘드로이친을 포함하는 황다랑어 껍질 추출물, 젤란검 및 인산칼슘계 무기물을 포함하는 혼합조성물을 용매에 용해시키는 단계;
   b) 상기 혼합조성물이 용해된 용액으로 막을 제조하는 단계; 및
   c) 상기 막에 알칼리 토금속 염화물을 포함하는 인산완충식염수를 처리하여 골재생 유도 차폐막을 제조하는 단계;
   를 포함하는 골재생 유도 차폐막의 제조방법.
9. 제 8항에 있어서,
   상기 황다랑어 껍질 추출물은
   ⅰ) 황다랑어에서 껍질을 분리하여 산으로 처리하는 단계;
   ⅱ) 상기 처리된 황다랑어 껍질을 물로 중화 및 중탕하는 단계; 및
   ⅲ) 상기 중탕한 용액을 농축하여 투석하는 단계;
   를 포함하여 추출하는 것인 골재생 유도 차폐막의 제조방법.
10. 삭제
11. 제 8항에 있어서,
    상기 b)단계에서 상기 막은 열건조를 통하여 제조되는 것인 골재생 유도 차폐막의 제조방법.
12. 제 8항에 있어서,
    상기 a)단계에서 혼합조성물은 에틸렌다이아민테트라아세트산을 더 포함하는 골재생 유도 차폐막의 제조방법.

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