KR101886413B1

KR101886413B1 - 히알루론산에 기반한 연조직 충진 조성물의 제조 방법

Info

Publication number: KR101886413B1
Application number: KR1020160031340A
Authority: KR
Inventors: 김장일; 이윤일; 김형구; 이환철
Original assignee: 주식회사 엘앤씨바이오
Priority date: 2016-03-16
Filing date: 2016-03-16
Publication date: 2018-08-10
Also published as: KR20170108194A

Abstract

본 발명은 히알루론산 및 수산화인회석이 화학적으로 가교된 연조직(soft tissue) 충진 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 가교결합을 통해 히알루론산 입자 내부에 생체 유래 무기질 성분인 수산화인회석을 탑재하는 연조직 충진 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 히알루론산 기반 연조직 충진 조성물은 생체 유래 미네랄을 포함하는 수산화인회석을 탑재함으로써, 콜라겐 생성이 증대되고 히알루론산 입자의 탄성률(G')이 증가하여 체내 부피 유지력 및 체내 지속력이 증가할 뿐만 아니라 틴들현상(Tyndall Effect)을 개선하므로, 피부 및 조직을 수복하기 위한 손상 치료제, 생체재료, 인체 내 연조직에 주입할 수 있는 필러(filler)로 사용될 수 있다.

Description

히알루론산에 기반한 연조직 충진 조성물의 제조 방법{MANUFACTURING METHOD OF SOFT TISSUE FILLER COMPOSITION BASED ON HYALURONIC ACID}

본 발명은 히알루론산 및 수산화인회석이 화학적으로 가교된 연조직(soft tissue) 충진 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 가교결합을 통해 히알루론산 입자 내부에 생체 유래 무기질 성분인 수산화인회석을 탑재하는 연조직 충진 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

피부과 또는 성형외과 분야에서, 필러(filler)는 결손된 신체 부위 및 조직을 복원하는 용도뿐만 아니라 미용의 목적으로서도 매우 일상적으로 사용되고 있다. 이러한 필러의 원료는 생체 적합도가 높은 생분해성 생체재료 및 합성재료가 주축을 이루어왔다. 그 중 상용 필러 시장의 대부분을 차지하고 있는 히알루론산(hyaluronic acid, HA)은 피부, 관절, 눈, 혈관, 뇌 등에 존재하는 생체 구성물질로서 높은 안전성이 입증된 생체재료이다. 히알루론산은 수분 함유 능력이 건조상태 무게의 50 ~ 200 배에 달할 정도로 보습성이 뛰어나고 피부에 탄력을 제공할 뿐만 아니라, 염증억제 효과가 뛰어나다. 히알루론산은 다양한 분자량으로 정제될 수 있으며 가교(cross-linking)를 통해 입자의 크기를 조절할 수 있어 다양한 목적의 필러로 개발되어 왔다.

가교되지 않은 히알루론산은 진피 내로 주입되었을 때, 체내의 히알루론산 분해효소(Hyaluronidase) 및 자유 라디칼 등에 의해 히알루론산의 고분자 사슬이 분해되기 때문에 체내에서 수일 정도만 잔류할 수 있다(비특허문헌 1, 비특허문헌 2, 비특허문헌 3). 이러한 이유로 상용 진피 필러들은 대부분 히알루론산의 하이드록실기(Hydroxyl group)에 화학적 가교결합을 유도하여 입자상태로 제조된다. 진피 필러 뿐만 아니라 연조직 충진 필러들의 부드러움 및 조직수복 효과 등은 히알루론산의 하이드록실기를 어떤 종류의 가교제로, 어떤 범위의 가교 밀도를 갖도록 제조하는가에 따라 물리적/화학적/생리학적 성능을 제어할 수 있다. 일반적으로, 가교된 연조직 충진 필러들은 하이드로겔 상태로 연조직 내에 주입된다. 이러한 하이드로겔은 가교 전에 비해 좀 더 단단한 성질을 갖게 되어 기계적인 성질이 개선되므로 연조직 내에서 조직 주변을 잘 들어올리고 채워주는 효과를 보인다. 또한, 가교된 연조직 충진 필러는 가교제를 통해 생성되는 고분자 간 공유결합으로 인해 체내 분해 효소들에 대한 저항성이 증가하여 가교되지 않은 상태 보다 월등히 증가된 체내 유지능력을 갖는다.

상용 연조직 충진 필러들 중에는 합성 수산화인회석(Hydroxyapatite, HAp)을 필러 조성물에 물리적으로 혼합하는 경우도 있는데, 카르복시메틸셀룰로스(Carboxymethyl cellulose, CMC)와 합성 수산화인회석 마이크로 입자를 물리적으로 혼합한 성상의 래디어스(Radiesse^®)와 페이스템(Facetem^®)이 칼슘 수산화인회석 필러(calcium hydroxyapatite filler)의 대표적인 예이다. 치아와 뼈의 성분인 수산화인회석은 수용성 매질 내에 미립구(microsphere) 형태로 섞여 주입 가능한 진피 충진재로 사용되곤 한다. 진피 조직은 주입된 수산화인회석 미립구들과 상호작용하여 진피 내 콜라겐 생성을 자극하고, 각각의 수산화인회석 미립구들을 독립적으로 포획한다. 그 결과, 진피 층의 결손 부위가 부피증대 효과로 보정된다. 주입 가능한 수산화인회석 미립구 진피 충진재는 깊이 패인 주름이나 피부 결손 부위 충진용으로 허가되어 있고, 체내에서 콜라겐 피부 충진재보다 더 오래 유지된다는 결과가 보고되어 있다(1 ~ 2년)(특허문헌 1). 합성 수산화인회석을 사용하는 것은 알러지 반응의 위험성을 대폭 낮출 수 있는 좋은 선택이 될 수 있다. 그러나, 수산화인회석이 생분해성 물질이긴 하나 과도하게 주입될 경우 이물반응으로 인한 육아종성 반응(Granulomatous reaction)을 일으킬 수 있다.

수산화인회석은 자연 상태 산호나 동물의 뼈로부터 얻어낼 수 있고, 간단한 방법으로 합성하여 얻어낼 수도 있다. 자연 유래의 수산화인회석은 원재료를 탈회하는 과정에서 얻어낼 수 있다. 합성 수산화인회석의 경우, 수산화인산 용액과 수산화칼슘 용액을 이용하여 합성할 수 있다. 생체 유래 수산화인회석과 합성 수산화인회석은 모두 화학구조식 Ca₅(PO₄)₃(OH)으로 육방정계(hexagonal) 결정구조를 갖고, hexagonal 6/m 그룹의 dipyramidal 결정 대칭성을 갖는다. 결정 구조는 기본적으로 동일하지만, 생체 유래 수산화인회석은 합성 수산화인회석과는 달리 콜라겐 생성에 필요한 필수 미네랄 성분들을 자연적으로 함유하고 있다. 보고된 바에 의하면, 생체 유래 수산화인회석은 칼슘(Ca), 인(P), 마그네슘(Mg), 스트론튬(Sr), 포타슘(K), 아연(Zn) 등의 미네랄 함유량이 합성 수산화인회석보다 높고, 칼슘/인 몰비율(Ca/P)은 생체유래 수산화인회석이 1.68±0.05로 합성 수산화인회석의 1.57±0.05 보다 높다(비특허문헌 4). 특히, 수산화인회석 성분 중 칼슘은 뼈를 구성하는 I형 콜라겐 생성에 관여하는 미네랄이며, I형 콜라겐은 뼈뿐만 아니라 피부 진피 층의 주요 구성성분이기도 하다.

이에, 본 발명자들은 생체 유래 수산화인회석을 함유하는 히알루론산 기반 연조직 충진 조성물을 제조함으로써, 생체 유래 수산화인회석의 함유로 인해 히알루론산 연조직 충진재의 단점인 틴들현상(Tyndall Effect)을 차단하고 향상된 탄성률로 인해 상용 히알루론산 연조직 충진재보다 체내에서 오래 지속되는 연조직 충진 조성물을 제공한다.

미국 등록특허 US 8,962,002 미국 등록특허 US 9,114,188 미국 공개특허 US 2009/0209456 미국 공개특허 US 2013/0096081

Tezel and Fredrickson, The Science of Hyaluronic Acid Dermal Fillers, J. Cosmet. Laser Ther. 10(1): 35-42 (2008) Kablik, et al., Comparative Physical Properties of Hyaluronic Acid Dermal Fillers, Dermatol. Surg. 35 Suppl 1: 302-312 (2009) Beasley, et al., Hyaluronic Acid Fillers: A Comprehensive Review, Facial Plast. Surg. 25(2): 86-94 (2009) F. Z. Mezahi et al., DISSOLUTION KINETIC AND STRUCTURAL BEHAVIOUR OF NATURAL HYDROXYAPATITE vs. THERMAL TREATMENT Comparison to synthetic hydroxyapatite, Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, Vol. 95 (2009) 1, 21-29

본 발명의 목적은 가교결합을 통해 히알루론산 입자 내부에 생체 유래 수산화인회석을 탑재하는 것을 특징으로 하는 연조직 충진 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 연조직 충진 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 히알루론산과 생체 유래 수산화인회석이 화학적으로 가교되어, 히알루론산 입자 내부에 생체 유래 수산화인회석이 탑재된 연조직 충진 조성물의 제조 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 연조직 충진 조성물의 제조 방법은

(ⅰ) 골(bone) 조직을 산성 용액에 침지한 후 중화하여 수산화인회석을 수득하는 단계;

(ⅱ) 상기 수득한 수산화인회석을 세척한 후 동결건조하여 수산화인회석 분말을 수득하는 단계;

(ⅲ) 염기성 용액 전체에 대하여 상기 수득한 수산화인회석 분말을 1 내지 20 중량%, 그리고 히알루론산을 5 내지 10 중량% 농도로 첨가하여 혼합하는 단계;

(ⅳ) 상기 단계 (ⅲ)의 혼합물에 가교제를 첨가하고 상기 혼합물을 가교 반응시켜 가교된 겔을 수득하는 단계; 및

(ⅴ) 상기 가교된 겔을 일정한 크기로 절단하고 세척한 후 겔 전체에 대하여 수산화인회석이 0.1 내지 4 중량%, 히알루론산이 1 내지 2 중량%가 되도록 수화 용액을 첨가하여 연조직 충진 조성물을 제조하는 단계;를 포함할 수 있다.

용어 "연조직 충진 조성물"은 지방조직, 피부, 근육, 근막, 건, 건막, 인대, 관절낭, 점액낭 등과 같이 골이나 연골이 아닌 조직에 해당하는 연조직이 결손 또는 함몰되었을 경우 물리적인 물성을 이용하여 채움으로써 결손 또는 함몰 부위의 손상을 치료하고 본래 부피로 회복시키는 조성물을 의미한다. 현재는 결손 부위 손상이라는 치료적 관점 외에 미용적 관좀에서 더 다양한 용도로 사용되고 있다.

용어 “히알루론산(hyaluronic acid, HA)”은 동물 등의 피부, 관절액, 연골 등에 많이 존재하는 생체 합성 천연 물질로서 수산화기가 많기 때문에 친수성을 띤 뮤코다당류이다. 물과 결합하여 겔 상태가 되어 관절의 윤활작용이나 피부의 유연성 등에 관여하며 점성이 크므로 세균의 침입이나 독물의 피부 침투를 막는 데에도 중요한 역할을 한다. 피부에 히알루론산이 부족하면 피부가 건조하고 탄력이 없고 주름이 지게 된다. 이 때문에 히알루론산을 주름을 방지하거나 꺼진 부위를 채워주기 위해 필러로 사용하기도 한다. 미생물에서 발현한 히알루론산은 110 만달톤(1,100 kDa) 또는 300 만달톤(3,000 kDa)이며 자외선, 방사선, 전자빔과 같은 물리적인 방법 또는 가교제 등을 이용한 화학적 방법을 통한 가교화 (cross-linking)에 따라 물리적 물성과 생리적 물성의 차이가 나타난다.

상기 히알루론산은 전체 조성물의 0.01 내지 5 중량%로 포함될 수 있으나, 전체 조성물의 1 내지 2중량%로 포함하는 것이 보다 바람직하다. 히알루론산의 함량이 전체 조성물의 2 중량%를 초과하게 되면, 주사기를 통한 체내 주입이 어려울 수 있다. 반면, 히알루론산의 함량이 전체 조성물의 1 중량% 미만이 되면, 연조직 충진 조성물의 체내 보존성 증가를 기대하기 어렵다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 히알루론산은 전체 조성물의 1 내지 2 중량%로 포함되었다.

상기 히알루론산은 1.0 내지 2.0 MDa의 분자량을 가지는 저분자 히알루론산 또는 3.0 내지 4.0 MDa의 분자량을 가지는 고분자 히알루론산일 수 있으며, 1.0 내지 2.0 MDa의 분자량을 가지는 저분자 히알루론산인 것이 바람직하고, 예를 들어 1.3 MDa의 분자량을 가지는 저분자 히알루론산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "수산화인회석(Hydroxyapatite, HAp)"은 생리적 조건 하에서 열역학적으로 가장 안정된 인산칼슘화합물로, 분자식은 Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂이다. 암석 혹은 골격, 치아에서 모두 발견되는 물질로, 조직과 생체 내에서 잘 융합하는 성질이 있어 인공뼈나 인공치아 등 인공장기의 재료로 쓰이는 한편, 세포배양에서 세포지지체로써 골아세포를 비롯하여 각종 세포의 기질배양용 소제로도 응용된다.

본 발명에 따라 동결건조된 수산화인회석은 육방정계 기둥 모양뿐만 아니라 임의의 모양 및 임의의 크기를 갖는 분말상태로 추출된다. 수산화인회석은 히알루론산 입자 내부에 탑재될 때 임의의 상태로 탑재도 가능하지만, 일정한 크기로 정제하여 탑재될 수 있다.

상기 수산화인회석은 전체 조성물의 0.1 내지 4 중량%로 포함될 수 있다. 수산화인회석의 함량이 전체 조성물의 4 중량%를 초과하게 되면, 가교 시에 히알루론산 입자가 포획하지 못하는 수산화인회석 입자들이 발생할 수 있다. 반면, 수산화인회석의 함량이 전체 조성물의 0.1 중량% 미만이 되면, 연조직 충진 조성물의 탄성계수 증가를 기대하기 어렵다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 수산화인회석은 전체 조성물의 1 내지 4 중량%로 포함되었다.

상기 단계 (ⅰ)의 골 조직은 동종 또는 이종의 골 조직으로부터 유래하는 것일 수 있으며, 인간 뼈, 소 뼈, 돼지 뼈, 말 뼈일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 (ⅰ)의 산성 용액은 염산, 질산, 황산, 시트르산 및 아세트산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 염산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 산성 용액의 농도는 0.3 내지 1.0 N인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 (ⅲ)의 염기성 용액은 수산화나트륨, 수산화칼슘 및 암모니아로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 수산화나트륨일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 염기성 용액의 농도는 0.1 내지 0.5 N인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 (ⅳ)의 가교제는 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르(1,4-butanediol diglycidyl ether), 1,4-비스(2,3-에폭시프로폭시)부탄(1,4-bis(2,3-epoxypropoxy)butane), 1,4-비스글리시딜옥시부탄(1,4-bisglycidyloxybutane), 1,2-비스(2,3-에폭시프로폭시)에틸렌(1,2-bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene) 및 1-(2,3-에폭시프로필)-2,3-에폭시시클로헥산(1-(2,3-epoxypropyl)-2,3-epoxycyclohexane)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 가교제는 상기 염기성 용액 전체에 대하여 0.1 내지 4 중량%로 첨가되는 것일 수 있으며, 가교제가 염기성 용액 전체에 대하여 4 중량%를 초과하게 되면, 히알루론산 입자의 탄성이 과도하게 증가하여 필러로써 사용가능한 제형을 만들기 어려울 수 있다. 반면, 가교제가 염기성 용액 전체에 대하여 0.1 중량% 미만이 되면, 히알루론산 입자가 수산화 인회석 입자를 포획할 확률이 현저히 낮아질 수 있다.

상기 단계 (ⅳ)의 가교 반응은 30 내지 70℃에서 1 내지 24시간 동안 이루어지는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 40 내지 60℃에서 1 내지 5시간 동안 이루어지는 것일 수 있다. 상기 온도 또는 시간 범위를 벗어나는 경우, 가교된 히알루론산의 변색이 야기될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 가교 반응은 50℃에서 3시간 동안 이루어졌다.

상기 단계 (ⅴ)의 수화용액은 증류수, 멸균수, 생리식염수, 인산완충용액 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 히알루론산 및 수산화인회석을 수화할 수 있는 공지의 수화 용액이라면 어떤 것이든 이용할 수 있다.

본 발명은 상기 방법으로 제조된 연조직 충진 조성물을 제공한다.

구체적으로, 상기 연조직 충진 조성물은 히알루론산 분말을 가교제와 생체 유래 수산화인회석이 들어있는 염기성 용액에 충분히 수화하여 화학적으로 가교결합함으로써, 히알루론산 입자 내부에 생체 유래 수산화인회석을 탑재한 히알루론산/수산화인회석 입자로 이루어진 연조직 충진 조성물이다.

상기 연조직 충진 조성물은 체내 주입이 가능하므로, 피부 및 조직을 수복하기 위한 손상 치료제, 생체재료, 인체 내 연조직에 주입할 수 있는 필러(filler)로 사용될 수 있다. 더욱 상세하게는, 상기 연조직 충진 조성물은 수술 없이 주사기로 주입 가능한 입자 크기를 갖는 히알루론산 및 수산화인회석을 화학적으로 가교시킨 조성물이므로, 이식 시에 나타날 수 있는 통증, 부종 발열과 같은 급성 염증반응이 적고 수산화인회석 함유로 인하여 생체 보존성이 길다. 따라서 골이식재와 함께 보조재로써 사용될 수 있고, 피부과, 화상외과 및 일반외과에서 손상된 조직을 수복하기 위한 조직수복용재료와 함께 보조재로써 사용할 수 있으며, 성형외과에서 안구함몰, 유방암 치료에 따른 가슴재건 등 다양한 목적의 생체재료와 함께 보조재로써 활용 가능하다.

종래 합성 수산화인회석 마이크로 입자를 사용하는 상용 필러들은 수산화인회석 마이크로 입자의 기능을 진피 세포가 수월하게 입자 표면에 부착되어 자랄 수 있는 플랫폼(platform) 정도로 묘사하고 있으나, 임상적으로는 검증된 바는 없으며 오히려, 생체 유래 수산화인회석이 합성 수산화인회석 마이크로 입자에 존재하지 않는 필수 미네랄 성분을 지니고 있어 칼슘 성분과 함께 피부 콜라겐 생성을 도울 수 있는 우월한 성능을 지녔다고 할 수 있다.

본 발명에 따라, 필수 미네랄이 함유된 생체 유래 수산화인회석은 히알루론산의 가교 용액 내에 분산되어 히알루론산 겔 덩어리 내부에 입자상태로 포획된다. 가교 및 세척이 완료된 후에, 겔 덩어리들을 크기를 균일하게 정립(sizing)하면 히알루론산 입자 내부에 필수 미네랄을 함유한 생체 유래 수산화인회석 입자가 포획된다. 탑재된 수산화인회석은 히알루론산 입자가 체내 히알루론산 분해효소에 의해 생분해되어 체내에 노출되기 전까지는 히알루론산 입자 내부에 안전하게 탑재된 상태로 유지된다. 히알루론산 입자가 체내 생분해되면서, 탑재되었던 수산화인회석들도 자연스럽게 히알루론산 입자 밖으로 방출되어 생분해되고, 주위 조직을 자극하여 콜라겐 생성을 증대한다.

뿐만 아니라, 생체 유래 수산화인회석은 종래 상용 필러의 단점인 틴들현상(Tyndall Effect)을 차단하는 효과가 있으며, 히알루론산 입자의 탄성률(G')을 높여 체내 부피 유지력 및 체내 지속력이 증가된다. 본 발명의 일실시예에서, 본 발명의 연조직 충전 조성물은 대조군인 히알라인(Hyaline^TM)보다 우수한 탄성, 복소점도 및 경(硬)한 성질을 나타내므로 연조직 충진 조성물로서의 물리적 특성이 매우 우수함을 확인하였다(도 5).

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에 따른 히알루론산 기반 연조직 충진 조성물은 생체 유래 미네랄을 포함하는 수산화인회석을 탑재함으로써, 콜라겐 생성이 증대되고 히알루론산 입자의 탄성률(G')이 증가하여 체내 부피 유지력 및 체내 지속력이 증가할 뿐만 아니라 틴들현상(Tyndall Effect)을 개선하므로, 피부 및 조직을 수복하기 위한 손상 치료제, 생체재료, 인체 내 연조직에 주입할 수 있는 필러(filler)로 사용될 수 있다.

도 1은 생체 유래 수산화인회석 분말의 전계방사형 주사전자현미경(Field Emission Scanning Electron Microscope, FE-SEM) 사진이다.
도 2는 생체 유래 수산화인회석 분말의 X-선회절 분석(X-ray Diffraction Spectroscopy, XRD) 결과이다.
도 3은 연조직 충진 조성물의 제조 단계를 나타낸 사진이다.
도 4는 염색된 생체 유래 수산화인회석이 히알루론산 입자 내에 탑재되어 있는 모습을 광학현미경을 사용하여 촬영한 사진이다.
도 5는 연조직 충진 조성물의 점탄성 분석 결과이다; a) 점탄성 특성, b) 점탄성 손실 비율, c) 복소점도.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 생체 유래 수산화인회석 분말 수득

인체 유래 골 조직 10g을 0.6 N 염산 250 mL에 침지하고 실온에서 250 rpm으로 6시간 동안 교반했다. 침전물을 제외한 산성 용액을 회수하고 8,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 부유층 및 침전 잔류물을 제거하여 깨끗한 산성 용액만을 회수했다. 유리 용기에 회수한 산성 용액을 넣고 교반하면서 초기 pH를 측정했다. 3N 수산화나트륨 용액을 천천히 첨가하면서 용액의 pH가 7.0이 되도록 적정했다. 적정된 용액을 약 10 분간 교반한 후, 8,000 rpm으로 10분간 원심분리했다. 침전물만을 회수하여 증류수로 세척한 후, 다시 8,000 rpm으로 10분간 원심분리하고 침전물을 회수했다. 원심분리 및 세척 과정을 3회 이상 반복한 후, 회수한 침전물을 -80℃에서 1시간 동안 동결시키고, 흰색 분말이 얻어질 때까지 동결 건조를 진행했다. 최종적으로 얻어지는 수산화인회석의 수득율은 58%였다.

< 실시예 2> 생체 유래 수산화인회석의 칼슘/인(Ca/P) 몰 비율 측정

수득한 생체 유래 수산화인회석의 칼슘/인(Ca/P) 몰 비율을 구하기 위해, 에너지 분산형 X선 분광법(Energy Dispersive X-ray Spectroscopy, EDX)을 이용하여 전계방사형 주사전자현미경(Field Emission Scanning Electron Microscope, FE-SEM)(JSM-7100F) 및 EDX 장비(Energy Dispersive X-ray Spectroscopy)로 측정하였다.

측정 결과, 실시예 1에서 수득한 생체 유래 수산화인회석의 성분은 표 1과 같았고 수산화인회석의 Ca/P 몰비율은 1.71이었다. 또한, 인 함유율 대비 미네랄 함유율은 표 2와 같았고 인 함유율 대비 마그네슘 함유율은 0.1%, 칼륨 함유율은 0.12%인 것으로 확인하였다(도 1).

단위 : atomic%

Statistics	O	P	Ca
Max	69.16	23.12	37.26
Min	40.80	7.61	7.21
Average	50.51	14.22	24.32
Standard Deviation	16.15	8.00	15.45

단위 : atomic%

Statistics	Mg	P	K
Max	0.27	99.94	0.36
Min	0.00	98.42	0.00
Average	0.09	99.36	0.12
Standard Deviation	0.16	0.82	0.21

< 실시예 3> 생체 유래 수산화인회석을 탑재한 히알루론산 입자 제조

0.2 N 수산화나트륨 용액 10 mL에 수산화인회석 2,000 mg을 넣어 분산시켜 수산화인회석 용액을 제조하였다. 수산화인회석 용액과 히알루론산(분자량 1.3 MDa) 1,000 mg을 주사기 내에서 혼합한 후, 가교제(1,4-butanediol diglycidyl ether) 400 ㎕를 첨가하여 주사기 내에서 혼합하였다. 혼합물이 가교결합하도록 50℃에서 3시간 동안 가교 반응시키고 가교가 완료된 히알루론산 겔을 자른 후(chopping)한 후 세척용 멤브레인에 넣고 증류수로 세척하였다. 세척용 증류수는 1시간에 한 번씩 교체하였고 세척은 총 6회 반복하였다. 세척이 완료된 히알루론산 겔 알갱이들을 주사기에 충진하고 주사기 내 충진되는 히알루론산의 전체 농도가 2%(v/v)가 되도록 증류수를 첨가하여 200 ㎛ 메시(mesh)로 정립(sizing)하였다(도 3).

200 ㎛ 메시의 연조직 충진 조성물(생체 유래 수산화인회석을 탑재한 히알루론산 입자) 0.5 mL을 1 mL의 0.1%(w/v) 알리자린 레드 에스(Alizarin Red S, ARS) 염색 용액으로 10분간 염색했다. 염색된 연조직 충진 조성물을 스트레이너(strainer)에 담아 증류수로 수 회 세척하여 잔류된 염색성분을 제거하였다. ARS 염색된 연조직 충진 조성물 0.05 mL을 슬라이드 글래스 위에 올리고 커버 글래스로 가볍게 덮은 후, 광학현미경으로 200 배율로 관찰하여 히알루론산 입자 내에서 ARS 염색된 수산화인회석을 확인했다(도 4).

< 실시예 4> 연조직 충진 조성물 내에 수산화인회석의 함량 측정

200 ㎛ 메시와 500 ㎛ 메시로 각각 정립하고 최종 히알루론산 농도가 2%(v/v)가 되도록 제작된 연조직 충진 조성물(생체 유래 수산화인회석을 탑재한 히알루론산 입자) 각각 1 mL을 사용하여 조성물 내 수산화인회석의 함유량을 측정했다. 측정 장비로는 PerkinElmer Optima 800 유도결합 플라즈마 원자방출 분광기(Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectrophotometry, ICP/AES)를 사용했다. 합성 수산화인회석을 사용하는 상용 히알루론산 필러 대조군으로 히알라인(Hyaline^TM)(EUmaterials s. r. l, 이탈리아)을 사용했다.

그 결과, 연조직 충진 조성물(1 mL 기준)의 수산화인회석 함유율은 1.4 ~ 1.5 중량% 범위였고, Hyaline^TM(1 mL 기준)의 수산화인회석 함유율은 0.027 중량%였다.

단위 : mg/kg

#	시료명	Ca	SD	RSD	HAp 함량
1	Gel 200 mesh	6121.181	66.387	1.085	15343.779
2	Gel 500 mesh	5669.230	90.552	1.597	14210.887
3	Hyaline^TM	106.373	0.761	0.715	266.643

SD : 표준편차(Standard Deviation)

RSD(%): 상대표준편차(Relative Standard Deviation)

< 실시예 5> 수산화인회석 함유율에 따른 연조직 충진 조성물의 점탄성 분석

수산화인회석 함유율에 따른 연조직 충진 조성물(생체 유래 수산화인회석을 탑재한 히알루론산 입자)의 점탄성 특성을 분석하기 위해, 수산화인회석 함유율이 각각 1 중량%(Sample#1), 2 중량%(Sample#2) 및 4 중량%(Sample#3)인 세 가지 시료를 준비했다. 각각의 시료의 히알루론산 농도는 2%(v/v)로 고정하였고, 대조군으로 사용한 히알라인(Hyaline^TM)의 히알루론산 농도는 2.6%(v/v)였다. 회전 유량계(Rotational rheometer)(TA instrument Ltd., DHR-1)를 이용하여 각 시료의 탄성(storage modulus), 점성(Loss modulus), 탄젠트 델타(tangent delta, tanδ) 값 및 복소점도를 측정하였다.

점탄성 수치를 측정한 결과, 수산화인회석 함유율 2 중량% 시료의 점탄성 수치가 대조군인 히알라인(Hyaline^TM)의 점탄성 수치와 유사하였고, 수산화인회석 함유율 1 중량% 시료의 점탄성 수치는 대조군보다 낮았다. 수산화인회석 함유율 4 중량% 시료의 점성 수치는 대조군의 점성 수치와 유사하였으나, 탄성 수치는 대조군의 탄성 수치보다 월등히 우수하였다(히알라인(Hyaline^TM)의 히알루론산 가교율을 알 수 없으므로, 점탄성 결과만으로 비교)(도 5a).

연조직 충진 조성물의 단단한 정도를 판단할 수 있는 수치로 탄젠트 델타 값이 있는데, 이 수치는 점성계수를 탄성계수로 나눈 값으로 정의된다. 보통 G''/G'으로 나타내는 이 비율은 1에 근접하거나 1 보다 클수록 점성이 강해 잘 흐르는 성질이 있는 것으로 판단할 수 있고, 1 미만으로 작아질수록 탄성이 우세하여 탄력이 강하고 잘 흐르지 않는 성질이 있는 것으로 판단한다. 많은 수의 상용 필러들이 1 보다 작은 탄젠트 델타 값을 지니고 있고, 진피 내에서 볼륨을 유지하며 오래 지속되는 상용 필러들은 보통 0.5 이하의 탄젠트 델타 값을 갖는다.

탄젠트 델타 값을 측정한 결과, 대조군으로 사용한 히알라인(Hyaline^TM)의 탄젠트 델타 값은 0.27로 나타났고, 수산화인회석 함유율 1 중량%, 2 중량% 및 4 중량% 시료들은 모두 대조군보다 우수한 0.1 정도로 나타났다. 따라서, 세 가지 시료들이 대조군에 비해 단단한 성질을 갖고 있으며, 진피 내에서 볼륨을 유지하며 오래 지속될 수 있음을 확인하였다(도 5b).

복소점도를 측정한 결과, 수산화인회석 함유율 4 중량% 시료는 대조군보다 높았고 수산화인회석 함유율 1 중량% 및 2 중량% 시료는 대조군의 측정치와 동등하거나 낮았다. 따라서, 수산화인회석 함유율 4 중량% 시료가 연조직 충진 조성물로서의 물리적 특성이 대조군인 히알라인(Hyaline^TM)보다 우수함을 확인하였다(도 5c).

Claims

(ⅰ) 골(bone) 조직을 산성 용액에 침지한 후 중화하여 수산화인회석을 수득하는 단계;
(ⅱ) 상기 수득한 수산화인회석을 세척한 후 동결건조하여 수산화인회석 분말을 수득하는 단계;
(ⅲ) 염기성 용액 전체에 대하여 상기 수득한 수산화인회석 분말을 1 내지 20 중량%, 그리고 히알루론산을 5 내지 10 중량% 농도로 첨가하여 혼합하는 단계;
(ⅳ) 상기 단계 (ⅲ)의 혼합물에 가교제를 첨가하고 상기 혼합물을 가교 반응시켜 가교된 겔을 수득하는 단계; 및
(ⅴ) 상기 가교된 겔을 일정한 크기로 절단하여 수산화인회석 입자가 내부에 탑재된 히알루론산 입자를 얻고, 세척한 후 겔 전체에 대하여 수산화인회석이 0.1 내지 4 중량%, 히알루론산이 1 내지 2 중량%가 되도록 수화 용액을 첨가하여 연조직 충진 조성물을 제조하는 단계;를 포함하며,
상기 단계 (ⅰ)의 골 조직은 동종 또는 이종의 골 조직으로부터 유래하는 것이며,
상기 단계 (ⅳ)에서 가교제는 상기 염기성 용액 전체에 대하여 0.1 내지 4 중량%로 첨가되는 것인 연조직 충진 조성물의 제조 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 단계 (ⅰ)의 산성 용액은 염산, 질산, 황산, 시트르산 및 아세트산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 연조직 충진 조성물의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (ⅲ)의 염기성 용액은 수산화나트륨, 수산화칼슘 및 암모니아로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 연조직 충진 조성물의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (ⅳ)의 가교제는 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르, 1,4-비스(2,3-에폭시프로폭시)부탄, 1,4-비스글리시딜옥시부탄, 1,2-비스(2,3-에폭시프로폭시)에틸렌 및 1-(2,3-에폭시propyl)-2,3-에폭시시클로헥산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 연조직 충진 조성물의 제조 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 단계 (ⅴ)의 수화용액은 증류수, 멸균수, 생리식염수, 인산완충용액 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 연조직 충진 조성물의 제조 방법.
제1항의 방법으로 제조된 연조직 충진 조성물.
제8항에 있어서, 상기 조성물은 인체 내 연조직에 주입할 수 있는 필러(filler)인 것을 특징으로 하는 연조직 충진 조성물.
제8항에 있어서, 상기 조성물은 인체에 사용되는 골이식재, 조직수복용재료 및 생체재료와 함께 사용하는 보조재인 것을 특징으로 하는 연조직 충진 조성물.