CN116761640A - 羟磷灰石钙粒子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及已在一定温度范围内烧结并且未在该范围以上的温度下处理的羟磷灰石钙粒子。此外，本发明涉及包含这样的粒子的可注射组合物及其用途。令人惊讶的是，发现本发明的粒子在生物刺激方面优于本领域已知的羟磷灰石钙粒子。

Description

羟磷灰石钙粒子及其用途
技术领域
本发明涉及已在一定温度范围内烧结的羟磷灰石钙粒子，其未在该范围以上的温度下进行处理。优选地，本发明涉及在910℃至1030℃范围内的温度下烧结的羟磷灰石钙粒子。优选地，所述粒子未在高于1030℃的温度下处理。此外，本发明涉及包含这样的粒子的可注射组合物及其用途。令人惊讶的是，发现本发明的粒子在生物刺激方面优于本领域已知的羟磷灰石钙粒子。
背景技术
近年来，面部和身体的整形，特别是减少不想要的皱纹，得到了越来越多的关注。例如，皱纹填充、乳房重建或隆胸、嫩肤、其它类型的软组织填充，都是经常进行的。在这种情况下，为了避免手术干预的需要，可以在皮下或在皮肤的更深层内注射种种不同的真皮填充剂。
填充材料已经用于这些目的中的一部分。然而，许多填充成分的主要缺点在于这样的材料生物降解迅速并且填充材料不适合长期解决方案，或者在于不会生物降解而是使施用的对象的身体起防御反应。许多填充材料是生物异源物质，并不类似组织。
希望填充的组织区域中的至少一部分最终由施用的对象的自身组织和/或细胞外基质填充。这可以通过诸如可注射羟磷灰石钙(CaHA，Ca5(PO4)3(OH))粒子这样的产品来实现。例如，US 6,537,574和WO 2001/012247中描述了这样的填充剂。包含羟磷灰石钙粒子的商品是(Merz Pharmaceuticals GmbH，德国法兰克福)。/>是一种具有优异的生物刺激性质的真皮填充剂。该填充剂包含羟磷灰石钙粒子和羧甲基纤维素钠(NaCMC)凝胶载体。注射/>可以通过刺激成纤维细胞导致新胶原形成。
这些羟磷灰石钙粒子刺激成纤维细胞的潜力是胶原产生量的关键。在施用的对象中，刺激胶原的产生。由胶原替代降解的羟磷灰石钙粒子，这可以导致长期的皱纹填充效果。WO 2008/088381教示了包含羟磷灰石钙粒子的增稠组合物，所述羟磷灰石钙粒子在1150℃下烧结。US 6,537,574和WO 2001/012247描述了可注射的羟磷灰石钙粒子应该通过使粒子成形并将其在约1050至1200℃下进行至少一小时的烧结步骤来制备。任选地，还可以另外施行在约800至1000℃下约一小时的预烧结步骤，以最大限度地减少凝聚。Eslami等(Iranian Journal of Pharmaceutical Sciences，2008，4(2)：127-134)描述了在900℃下对长度小于100nm的羟磷灰石钙纳米晶针的处理。
Nieh等(“多孔羟磷灰石和羟磷灰石包覆层的合成与表征(Synthesis andcharacterization of porous hydroxyapatite and hydroxyapatite coatings)”，会议：2001年矿物、金属与材料学会年会暨展览(Conference:2001Minerals,Metals&MaterialsSociety Annual Meeting&Exhibition)，新奥尔良，LA(US)，2001年2月11-15日)教示了制备在不同温度下烧结的羟磷灰石钙包覆层和大尺寸粒子，其孔隙尺寸优选为100至200μm，可用作骨模型以及植入物包覆层。
van Loghem等(The Journal of Clinical Aesthetic Dermatology，2015，8(1):38-49)总结了的几种积极效果。通过给对象皮下施用/>(羟磷灰石钙粒子)，可以有效治疗皱纹。表明用这样的产品可以进行面部填充(参见Jacovella，Clinical Interventions in Aging，2008，3:161-174)。胶原是由该组织区域的成纤维细胞生成的，施用该羟磷灰石钙粒子没有显著的不良副作用(参见Coleman等，DermatologicSurgery，2008，34:S53-S55；Berlin等，Dermatologic Surgery，2008，34:S64-S67)。
发现施用羟磷灰石钙粒子具有持久的体量增加效果，即使在羟磷灰石钙降解后依然如此。胶原的产生受到刺激。发现注射后几个月，I型和III型胶原显著增加(Yutskovskaya和Kogan，Journal of Drugs in Dermatology，2017，16:68-74)。
在药学/美容上可接受的真皮填充剂会带来被对象自身的组织和/或细胞外基质填充，并带来长期的目标活性。特别希望进一步改善羟磷灰石钙粒子。例如，希望进一步提高真皮填充剂的生物活性，例如胶原刺激效果。
发明内容
意外地发现，经过烧结、但未经历超过1030℃温度的羟磷灰石钙粒子具有特别高的胶原刺激效果。
因此，本发明的第一方面涉及在910至1030℃范围内的温度下烧结并且未经历超过1030℃温度的羟磷灰石钙粒子。
因此，可以不加热到超过1030℃的温度，该温度还可能改变材料性质，优选不加热到超过所述指定的烧结温度。本发明还涉及已在910至1030℃范围内的温度下烧结且未经历超过1030℃温度的羟磷灰石钙粒子，其中通过筛分或光散射进行测定，重均粒径为1-500μm。
本发明的羟磷灰石钙粒子可以具有轮廓分明的较高表面积，这可以实现增加成纤维细胞的胶原合成，因此具有特别高的生物刺激作用。
用于本文中时，术语“羟磷灰石钙”、“羟基磷灰石钙”和“碱性正磷酸钙”、“羟基磷酸钙”、“磷酸三钙”、“羟磷灰石”、“羟基磷灰石”和“三元磷酸钙”以及缩写“CaHA”和“HAp”在本领域中通常理解的最广泛意义上应该可互换地理解。羟磷灰石钙可分别由式Ca5(PO4)3(OH)和Ca5[OH|(PO4)3]表示。
所述羟磷灰石钙粒子可具有任何形状。它们可以是球状、椭球状、晶状、随机(即不规则状)、或其两种或更多种的混合。在一个优选的实施方式中，所述羟磷灰石钙粒子(基本上)是球状的或(基本上)椭球状的。在一个优选的实施方式中，所述羟磷灰石钙粒子(基本上)是球状的。
在一个优选的实施方式中，所述羟磷灰石钙粒子是D比超过0.7的球状。因此，所述羟磷灰石钙粒子的D比优选超过0.7、更优选超过0.8、特别是超过0.9。在这种情况下，D比为1.0表明完美的圆度。
如本文所用的术语“球状”可以在最广泛的意义上分别被理解为基本小球状或球形。这并不一定意味着完美的球体，但表征了粒子没有尖锐或有棱角的边缘。优选地，D比超过0.7更优选超过0.8，特别是超过0.9。因此，在所有三个空间方向上的伸展通常基本相同。
D比可通过任何手段来测定。如本文所用，它通常通过显微成像(也称为：通过显微镜检)来测定。为此目的，拍摄了单个粒子的显微图像。软件进行测量。
在一个优选的实施方式中，所述羟磷灰石钙粒子的羟磷灰石钙粒子具有多孔表面。因此，所述羟磷灰石钙粒子的表面优选不光滑且不具有覆瓦状外观。优选地，所述羟磷灰石钙粒子的表面具有许多空洞。优选地，所述羟磷灰石钙粒子的内部也具有许孔隙/空洞。因此，所述羟磷灰石钙粒子优选是多孔的。
所述孔隙可以是任何尺寸的。在一个优选的实施方式中，通过汞孔隙率法进行测定，所述羟磷灰石钙粒子的表面具有在表面上的平均直径在10和500nm之间的孔隙。或者，所述平均直径可通过显微镜检来测定。在一个优选的实施方式中，通过汞孔隙率法进行测定，所述羟磷灰石钙粒子的表面具有在表面上的直径在10和100nm直径之间的孔隙。在一个优选的实施方式中，通过汞孔隙率法进行测定，所述羟磷灰石钙粒子的表面具有在表面上的平均直径在10和400nm之间的孔隙。优选地，通过汞孔隙率法进行测定，所述羟磷灰石钙粒子的表面具有在表面上的平均直径在20和300nm之间、30和250nm之间、或50和220nm之间的孔隙。
优选地，每个羟磷灰石钙粒子在其表面具有至少10个或至少100个这样的孔隙。应理解，这样的孔隙的存在并不排除任选存在一个或多个具有其它尺寸的孔隙。可用于孔隙测定的显微镜检优选是扫描电子显微镜检(SEM)。
所述羟磷灰石钙粒子可具有任何粒度。优选地，在本发明的上下文中，所述羟磷灰石钙粒子适合于注射。换句话说，所述羟磷灰石钙粒子优选是可注射的羟磷灰石钙粒子。因此，所述羟磷灰石钙粒子的平均粒径通常在微米范围内(也就是微球体)，从而，平均粒径在1至1000μm范围内。
在一个优选的实施方式中，通过光散射进行测定，所述羟磷灰石钙粒子的平均粒径为1至500μm、或5至500μm、1至150μm、或2至100μm、或5至80μm、或10至60μm、或15至50μm、或20至45μm、或25至45μm。
在一个优选的实施方式中，通过筛分或光散射进行测定，所述羟磷灰石钙粒子的重均粒径为1至500μm、或1至500μm 1至150μm、或2至100μm、或5至80μm、或10至60μm、或15至50μm、或20至45μm、或25至45μm。
优选地，落在上述尺寸范围内的羟磷灰石钙粒子占羟磷灰石钙粒子总质量的至少80重量％和/或至少80％数量的羟磷灰石钙粒子落在上述尺寸范围内。
如本文所用的粒度可通过任何手段(例如，光散射(光衍射)、筛分、显微镜检等)来测定。本文中所示的数值是指通过光散射(PSA)测定的(体积)平均尺寸范围。
在一个优选的实施方式中，粒度通过光散射来测定。
在另一个实施方式中，粒度通过筛分来测定，即通过试验筛和机械筛分样品并对级分进行称重以测定高于或低于所使用的试验筛的重量％。
所述羟磷灰石钙粒子可以在910-1030℃范围内的任何温度下烧结，其中所述羟磷灰石钙粒子优选不经历超过烧结温度的温度。
在一个优选的实施方式中，所述羟磷灰石钙粒子在910至995℃、或920至995℃、或930至990℃、或940至985℃、或950至980℃、或960至975℃范围内的温度下烧结，并且其中所述羟磷灰石钙粒子经历的温度没有超过烧结温度的温度。
在一个优选的实施方式中，所述粒子没有经历大于995℃、或大于985℃、或大于980℃、或大于975℃的温度。在一个优选的实施方式中，所述粒子没有经历大于最高烧结温度的温度。
所述羟磷灰石钙粒子所经历的烧结时间可以与烧结温度和/或平均粒径相适应。优选地，将所述羟磷灰石钙粒子烧结数小时。优选地，将所述羟磷灰石钙粒子烧结到获得均匀的固体粒子为止。在一个优选的实施方式中，将所述羟磷灰石钙粒子烧结1至24小时。在一个优选的实施方式中，将所述羟磷灰石钙粒子烧结2至12小时、或3至16小时。在一个优选的实施方式中，将所述羟磷灰石钙粒子烧结1小时至2小时、1小时至3小时、2至4小时、3至5小时、4至6小时、5至7小时、6至8小时、7至9小时、8至10小时、9至11小时、10至12小时、11至13小时、12至14小时、13至15小时、14至16小时、或12至24小时。
在一个优选的实施方式中，将所述羟磷灰石钙粒子在960至975℃的温度下烧结1至24小时。在一个优选的实施方式中，将通过光散射测定的平均粒径在25至45μm范围内的羟磷灰石钙粒子在960至975℃的温度下烧结1至24小时。
在一个优选的实施方式中，将通过光散射测定的平均粒径在25至45μm范围内和通过显微镜检测定在表面上具有直径为10至500nm的孔隙的羟磷灰石钙粒子在960至975℃的温度下烧结1至24小时。
可选地，所述羟磷灰石钙粒子除了在CaHA粒子晶体结构中的钙之外还可包含一种或多种其它金属离子，如选自氟、钠、锂、钾、硅、镁及其两种或更多种的组合的金属离子。这可能任选对新胶原形成产生积极的效应。
所述羟磷灰石钙粒子可通过本领域中已知的任何手段制备。合适的程序在例如US6,537,574和WO 2001/012247中描述。在一个优选的实施方式中，小尺寸的羟磷灰石钙晶粒/晶体的浆料可以被喷雾干燥。
这样的浆料可具有可用于通过喷雾干燥制备羟磷灰石钙目的的任何含量的羟磷灰石钙。在一个实施方式中，所述浆料中羟磷灰石钙的含量被设定为5至80重量％、10至60重量％或20至40重量％。
在一个优选的实施方式中，为此目的，可以通过喷嘴泵送所述浆料以形成球状粒子，可引导所述粒子通过热风塔以去除水分。粒子的尺寸可以通过选择喷嘴来设置。还可以通过筛分不同的级分来进一步改善粒度。
所得到的未烧结的粒子可以在本发明要求的温度、如本文中限定的910到1030℃范围内的温度下烧结数小时，直到所述烧结已经将先前的亚微米晶粒/晶体烘烤成均匀的固体粒子为止。因此，所述晶粒/晶体通常会融合，从而提高硬度。在一个优选的实施方式中，烧结时间在1小时至24小时范围内。
在一个优选的实施方式中，烧结时间在1小时至2小时、1小时至3小时、2至4小时、3至5小时、4至6小时、5至7小时、6至8小时、7至9小时、8至10小时、9至11小时、10至12小时、11至13小时、12至14小时、13至15小时、14至16小时或12至24小时范围内。粒子的尺寸可通过筛分不同的级分来进一步改善。
如本文所用的t可用于制备所述羟磷灰石钙粒子的亚微米晶粒/晶体的羟磷灰石钙粒子浆料可通过任何手段制备。例如，它可以通过在水或水缓冲液或水溶液和/或有机溶液中淘析任选可商购的的亚微米晶粒尺寸的羟磷灰石钙粉末来制备。替代地或补充地，也可以制备所述晶粒/晶体或优选亚微米尺寸的晶粒/晶体。
这可以通过将可溶性钙盐(例如，硝酸钙、氯化钙等)的一种或多种可溶性溶和可溶磷酸氢或磷酸二氢盐(例如，磷酸氢二铵)的一种或多种可溶性溶液混合来实现。所述混合可以在强力混合下，以获得小尺寸的晶粒/晶体。任选地，可以将pH调节到碱性pH。然后，可以直接获得浆料。任选地，也可以将浆料老化数小时。任选地，可以通过一个或多个离心/洗涤步骤来洗涤晶体。获得小尺寸羟磷灰石钙晶体的详细程序描述在Eslami等(IranianJournal of Pharmaceutical Sciences,2008,4(2):127-134)中。任选地，所述浆料还可包含一种或多种润湿剂和/或可以添加粘合剂如聚山梨酸酯、草酸钠、聚乙烯醇、糊精和/或碳蜡。
任选地，所述羟磷灰石钙粒子可内部包含和/或可包被一种或多种刺激新胶原形成的作用剂，例如刺激新胶原形成的多肽和/或小分子量化合物。
如上文指出，本发明的羟磷灰石钙粒子可通过注射施用于对象，特别是对象的皮肤和/或软组织。
因此，本发明的另一方面涉及一种可注射组合物，所述组合物包含下列组分(或由它们组成)：
(A)一种或多种类型的本发明羟磷灰石钙粒子作为组分A；和
(B)一种或多种药学上可接受的载体作为组分B；
(C)任选的一种或多种局部麻醉剂作为组分C；以及
(D)除组分A、B和C之外的任选的一种或多种药学上可接受的添加剂作为组分D。
应理解，在本发明的羟磷灰石钙粒子的上下文中展示的定义和优选实施方式准用于可注射组合物。
如本文所用的术语“组分”和“成分”可以在最广泛的意义上互换地理解为本发明的组合物的一部分。
如本文所用的术语“药学上可接受的的”可以在最广泛的意义上理解为在制药和/或美容背景下可合理使用。应理解，药学上可接受的的组分或组合物通常也将固有地可用作美容可接受的。药学上可接受的的组分或组合物具有低毒性，可以施用于人或动物(通常是哺乳动物)身体，而不会对该人或动物造成严重伤害。
优选地，本发明的可注射组合物是药学和/或美容可接受的组合物。本发明的组合物可具有任何盖仑形式。在本发明的一个实施方式中，本发明的可注射组合物是液态或粘性的。在另一实施方式中，本发明的可注射组合物是糊状的。这样的组合物可以被认为是真皮填充剂。
在一个优选的实施方式中，所述可注射组合物可注射到皮肤中或其它软组织中。优选地，所述可注射组合物可用于改善皮肤或其它软组织。在一个优选的实施方式中，可注射组合物是可皮肤(下)/真皮(下)注射的。优选地，所述可注射组合物适合注射到哺乳动物、特别是人中。优选地，本发明的组合物优选是(基本上)无菌的，并且优选是无热原的。
如本文所用的术语“液态”、“粘性”和“糊状”可根据本领域的一般理解来理解。优选地，如本发明的上下文中使用的“液态”是指粘度小于10mpa(兆帕-秒，在标准条件、20℃、1013.25hPa下)。
优选地，如本发明的上下文中使用的“粘性”是指粘度为10至1000mPas(在标准条件、20℃、1013.25hPa下)。术语“粘性”、“凝胶”和“凝胶状”应该可互换地理解。优选地，如本发明的上下文中使用的“糊状”是指粘度为1000至1,000,000mPas(在标准条件、20℃、1013.25hPa下)。这些粘度值可以通过任何手段例如通过旋转/振荡粘度计、例如根据DIN53019-4：2016-10来测定。根据本发明，当所述可注射组合物是液态、粘性或糊状的可注射组合物时，所述羟磷灰石钙粒子(组分A)优选分散在所述可注射组合物中，即，在所述可注射组合物的液态、粘性或糊状组分中。因此，液态、粘性或糊状的可注射组合物通常是分散体。
本发明的可注射组合物包含一种或多种药学上可接受的载体作为组分B，其中至少一种载体优选是糊状、粘性或液态的载体。
本发明的药学上可接受的载体(组分B)可以是药学上可接受的的任何载体，因此是对人或动物(通常是哺乳动物)身体无毒的任何载体。
所述一种或多种糊状、粘性或液态载体可以是糊状、粘性或液态的任何药学上可接受的载体。例如，所述一种或多种糊状、粘性或液态载体可任选包含一种或多种药学上可接受的的溶剂，例如甘油、水、水性缓冲液(例如，盐水或磷酸盐缓冲盐水)、二甲基亚砜(DMSO)、乙醇、植物油、石蜡油或其组合。在本发明的一个实施方式中，所述一种或多种糊状、粘性或液态载体可包含无热原缓冲液如生理盐水溶液或缓冲的生理盐水溶液，或由其组成。
在一个优选的实施方式中，所有药学上可接受的载体(组分B)的总和包含相对于组分B为至少10重量％、至少20重量％、至少50重量％、至少60重量％、至少70重量％、或至少80重量％、或至少90重量％的一种或多种糊状、粘性或液态载体。
如本文所用的的以重量计的含量(例如重量％)通常是指组分本身。在固体物质的情况下，它通常是指相应组分的干物质(重量％，相对于干物质)。
在本发明的一个实施方式中，所述药学上可接受的载体(组分B)包括相对于组分B为至少50重量％、至少60重量％、至少70重量％、或至少80重量％、或至少9重量％的甘油。所述一种或多种类型的羟磷灰石钙粒子(组分A)可以分散在该载体中。
如本文所用的组分的重量百分比(重量％)和重量比通常指的是组分的干物质。术语“干物质”、“干重”和“固体含量”可以在本领域中通常理解的最广泛的意义上可互换地理解。本领域技术人员将注意到，干物质可以指相应组分在没有溶剂/稀释剂和其它组分时的重量。当相应的组分溶解、悬浮或与其它组分形成(水)凝胶时，也可以考虑干物质。在这种情况下，可以计算理论干物质，即可以从总重量减去溶剂/稀释剂和其它组分的重量。
在一个优选的实施方式中，所述一种或多种药学上可接受的载体(组分B)选自一种或多种多糖衍生物或其药学上可接受的盐、一种或多种多糖或其药学上可接受的盐、甘油、水、一种或多种水性缓冲液、及其组合或两种或更多种的组合。
在一个优选的实施方式中，所述一种或多种药学上可接受的载体(组分B)包含一个或多个液态、粘性或糊状组分，例如甘油、水、一种或多种水性缓冲液、及其组合或两种或更多种。这可以使所述可注射组合物可注射。
所述一种或多种多糖或其衍生物或药学上可接受的盐可优选具有增稠性质。所述一种或多种多糖或其衍生物或其药学上可接受的盐可具有任何分子量。优选地，它们的分子量在1kDa至10mda范围内，更优选在5kDa至5MDa范围内。也可以使用多糖或其衍生物或盐的混合物。这样的混合物可以是相同或不同类型的多糖或其衍生物或盐，并且可以具有不同的分子尺寸。多糖或其衍生物或其药学上可接受的盐可以是非交联或交联的。
如本文所用的平均分子量可通过适合于此目的的任何常规手段来测定，例如凝胶渗透色谱法(GPC)、尺寸排阻色谱法(SEC)、测量增稠效应(粘度测定法)、质谱法等。多糖或其衍生物或其药学可接受的盐的可溶性级分的平均分子质量优选通过凝胶渗透色谱法(GPC)来测定。多糖或其衍生物或其药学上可接受的盐的不溶性、凝胶形成性级分的平均分子质量，优选通过常规实验(例如，在25℃下在Ubbelohe粘度计上通过EP专著方法)测量增稠效应(粘度测定法)来测定。如本文所用的1000kDa(千道尔顿)是1MDa(兆道尔顿)。
所述多糖或其衍生物或药学上可接受的盐可任选与所述一种或多种糊状、粘性或液态的药学上可接受的载体相结合形成凝胶。所述多糖或其衍生物或其药学上可接受的盐可任选与所述一种或多种糊状、粘性或液态载体相结合形成水凝胶。所述多糖或其衍生物或药学上可接受的盐可任选部分或完全溶解于所述一种或多种粘性或液态的载体。所述一种或多种类型的羟磷灰石钙粒子(组分A)可分散在所述一种或多种糊状、粘性或液态载体中。
在一个优选的实施方式中，组分B包含下列组分或由下列组分组成：
(B1)一种或多种液态、粘性或糊状的药学上可接受的载体，特别是选自甘油、水、一种或多种水性缓冲液及其组合或两种或更多种中的液态、粘性或糊状的药学上可接受的载体；以及
(B2)一种或多种固态的药学上可接受的载体，优选一种或多种多糖或其衍生物或其药学上可接受的盐，特别是选自纤维素衍生物(例如，羧甲基纤维素、羧乙基纤维素)、纤维素、及其两种或多种的混合物的多糖或衍生物。
组分B可包含以任何含量比的组分B1和B2.在一个优选的实施方式中，组分B包含下列组分或由下列组分组成：
相对于组分B为0.1至99重量％、或50至99.9重量％、或75至99重量％的B1；和
相对于组分B为0.1至99重量％、或0.1至50重量％、或1至25重量％的B2。
在一个优选的实施方式中，所述一种或多种药学上可接受的载体(组分B)选自(一种或多种类型的)羧甲基纤维素或其药学上可接受的盐、甘油、水、一种或多种水性缓冲液、及其组合或两种或更多种。
在一个优选的实施方式中，所述一种或多种药学上可接受的载体(组分B)包含羧甲基纤维素或其药学上可接受的盐和甘油，或由它们组成。。
如上所述，本发明的组合物可任选包含一种或多种局部麻醉剂作为组分C。因此，在本发明的一个实施方式中，所述可注射组合物包含一种或多种局部麻醉剂(组分C)。
局部麻醉剂(组分C)可以是任何局部麻醉剂。优选地，局部麻醉剂(组分C)如果存在的话，选自：利多卡因(lidocaine)、氨布卡因(ambucaine)、阿莫拉酮(amolanone)、阿米洛卡因(amylocaine)、丁氧普鲁卡因(benoxinate)、苯佐卡因(benzocaine)、贝托卡因(betoxycaine)、苯柳胺酯(biphenamine)、布比卡因(bupivacaine)、布他卡因(butacaine)、氨苯丁酯(butamben)、布坦卡因(butanilicaine)、丁胺卡因(butethamine)、丁托西卡因(butoxycaine)、卡替卡因(carticaine)、氯普鲁卡因(chloroprocaine、可卡乙碱(cocaethylene)、可卡因(cocaine)、环美卡因(cyclomethycaine)、二丁卡因(dibucaine)、二甲异喹(dimethysoquin)、二甲卡因(dimethocaine)、地哌冬(diperodon)、达克罗宁(dycyclonine)、芽子定(ecgonidine)、芽子碱(ecgonine)、氯乙烷、依替卡因(etidocaine)、β-优卡因(beta-eucaine)、尤普罗辛(euprocin)、非那可明(fenalcomine)、福莫卡因(formocaine)、海克卡因(hexylcaine)、羟丁卡因(hydroxytetracaine、对氨基苯甲酸异丁酯、甲磺酸亮氨卡因(leucinocainemesylate)、左沙屈尔(levoxadrol)、马比佛卡因(mepivacaine)、美普卡因(meprylcaine)、美布卡因(metabutoxycaine)、氯甲烷、麦替卡因(myrtecaine)、纳帕因(naepaine)、奥他卡因(octacaine)、俄妥卡因(orthocaine)、奥昔卡因(oxethazaine)、对乙氧卡因(parethoxycaine)、芬那卡因(phenacaine)、苯酚、哔哌卡因(piperocaine)、匹多卡因(piridocaine)、聚多卡醇(polidocanol)、普拉莫星(pramoxine)、丙胺卡因(prilocaine)、普鲁卡因(procaine)、丙泮卡因(propanocaine)、丙对卡因(proparacaine)、丙哌卡因(propipocaine)、丙氧卡因(propoxycaine)、假可卡因(psuedococaine)、吡咯卡因(pyrrocaine)、罗哌卡因(ropivacaine)、水杨醇、丁卡因(tetracaine)、托利卡因(tolycaine)、三甲卡因(trimecaine)、唑拉明(zolamine)，及其两种或更多种的组合和其盐。
替代性的局部麻醉剂及其组合和盐也可用作组分C。在一个优选的实施方式中，所述局部麻醉剂(组分C)是利多卡因或包含利多卡因。这里也可以使用两种或更多种上述麻醉剂的组合，例如利多卡因和其它“卡因”麻醉剂如丙胺卡因的组合。局部麻醉剂可以使得更舒适地注射到对象中。
如上所述，本发明的组合物可任选包含除组分A、B和C之外的一种或多种药学上可接受的添加剂作为组分D。因此，在本发明的一个实施方式中，所述可注射组合物包含除组分A、B和C之外的一种或多种药学上可接受的添加剂(组分D)。
这样的药学上可接受的添加剂(组分D)可以是对人或动物(通常是哺乳动物)身体(基本上)无毒的任何其它作用剂。这样的药学上可接受的添加剂(组分D)可任选是对生物刺激有影响的生物活性成分，如对胶原产生(新胶原产生因子)和/或细胞增殖(细胞增殖因子)有影响。这样的药学上可接受的添加剂(组分D)也可以是不具有生物刺激活性的成分。
例如，药学上可接受的添加剂(组分D)可以是选自刺激新胶原形成的一种或多种作用剂的生物活性成分，例如一种或多种透明质酸或其药学上可接受的盐、一种或多种多肽或其药学上可接受的盐、以及一种或多种刺激新胶原或其药学上可接受的盐的小分子量化合物。
所述一种或多种透明质酸或其药学上可接受的盐、一种或多种多肽或其药学上可接受的盐可具有任何分子量。
优选地，所述一种或多种透明质酸或其药学上可接受的盐的分子量可以在1kDa至10MDa范围内、更优选在5kDa至5MDa的范围内、或在0.3MDa至5MDa范围内、或在0.3MDa至1MDa的范围内，或在1MDa至5MDa范围内。应当理解，也可以使用透明质酸或其药学上可接受的盐的混合物。这样的混合物可具有不同的分子尺寸。透明质酸或其药学上可接受的盐可以是非交联或交联的，或者可以是交联和非交联的混合物。
优选地，所述一种或多种多肽或其药学上可接受的盐的分子量可以在0.5kDa至500kDa范围内。
小分子量化合物的分子量优选不大于1000Da、不大于750Da或不大于500Da。细胞增殖因子可改善细胞浸润到所施用的本发明组合物中。
例如，药学上可接受的添加剂(组分D)可以是不具有生物刺激活性的成分。这样的药学上可接受的添加剂(组分D)可示例性地选自：一种或多种去污剂(例如，十二烷基硫酸钠(SLS)/十二烷基硫酸钠(SDS))、一种或多种着色剂(例如，TiO2、食用色素)、一种或多种维生素、一种或多种盐(例如，钠、钾、镁、钙和/或锌盐)、一种或多种湿润剂(例如，山梨糖醇、甘油、甘露糖醇、丙二醇、聚葡萄糖)、一种或多种酶、一种或多种防腐剂(例如，苯甲酸、羟苯甲酯)、一种或多种质构剂(texturing agents)(例如，聚乙二醇(PEG)、山梨糖醇)、一种或多种乳化剂、一种或多种分离剂、一种或多种抗氧化剂、一种或多种草本和植物提取物、一种或多种稳定剂、一种或多种聚合物(例如羟丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚乙二醇(PEG))、一种或多种摄取介质(例如聚乙烯亚胺(PEI)、二甲基亚砜(DMSO)、细胞穿透性肽(CPP)、蛋白质转导结构域(PTD)、抗微生物肽等)、一种或多种抗体、一种或多种复染染料(一种或多种例如荧光素、荧光素衍生物、Cy染料、Alexa Fluor染料、S染料、罗丹明、量子点等)、一种或多种细胞增殖因子、一种或多种顺势疗法成分、及其两种或更多种的组合。
染料可改善注射的定位(例如，药学上可接受的的荧光染料如荧光素或罗丹明)，或者可以改善原本发白的本发明的组合物的不可见性(例如，通过使其呈肉色)。
所述任选的其它组分C和/或D可以部分或全部包含在所述可注射组合物的液态、粘性或糊状组分中，或者可以分散在其中。在一个优选的实施方式中，本发明的可注射组合物是凝胶。因此，优选它是凝胶状的，即糊状或粘稠的可注射组合物。
所述组分A和B以及任选的C和任选的D可以以任何含量范围和比率包含在所述可注射组合物中。
在一个优选的实施方式中，所述可注射组合物包含相对于所述可注射组合物为至少1重量％、或至少5重量％、或至少10重量％、或至少20重量％、或至少30重量％、或至少40重量％、或至少50重量％的一种或多种类型的羟磷灰石钙粒子作为组分A。
在一个优选的实施方式中，所述可注射组合物包含相对于所述可注射组合物为1至80重量％、5至90重量％、10至80重量％、20至77重量％、30至75重量％、40至73重量％、50至72重量％、50至80重量％或55至70重量％的一种或多种类型的羟磷灰石钙粒子作为组分A。与组分A有关的重量百分比是指组分A的干物质。
在一个优选的实施方式中，所述可注射组合物包含相对于所述可注射组合物至多80重量％、1至80重量％、2至75重量％、3至70重量％、4至65重量％、5至60重量％、10至55重量％、20至50重量％或30至50重量％的一种或多种类型的药学上可接受的载体作为组分B。
在一个优选的实施方式中，所述可注射组合物包含相对于所述可注射组合物至多10重量％、0.001至10重量％、0.001至5重量％、0.01至3重量％或0.1至2重量％的一种或多种局部麻醉剂作为组分C。在纯形式的组分C是固体化合物的情况下，则关于组分D的重量百分比可以指组分C的干物质。
在一个优选的实施方式中，所述可注射组合物包含相对于所述可注射组合物至多10重量％、0.001至10重量％、0.01至5重量％或0.1至2重量％的除组分A、B和C之外的一种或多种药学上可接受的添加剂作为组分D。在纯形式的组分D是固体化合物的情况下，则关于组分D的重量百分比可以指组分D的干物质。
在一个优选的实施方式中，所述可注射组合物包含下列组分或由下列组分组成：
(A)相对于所述可注射组合物，相对于干物质，1至80重量％的一种或多种类型的羟磷灰石钙粒子作为组分A；
(B)相对于所述可注射组合物，1至80重量％的一种或多种药学上可接受的载体作为组分B；
(C)相对于所述可注射组合物，0至10重量％的一种或多种局部麻醉剂作为组分C；以及
(D)相对于所述可注射组合物，0至50重量％的除组分A、B和C之外的一种或多种药学上可接受的添加剂作为组分D。
在一个优选的实施方式中，所述可注射组合物包含下列组分或由下列组分组成：
(A)相对于所述可注射组合物，相对于干物质，1至80重量％的一种或多种类型的本发明羟磷灰石钙粒子作为组分A；
(B)相对于所述可注射组合物，1至80重量％的一种或多种药学上可接受的载体作为组分B，所述载体包含至少一种糊状、粘性或液态载体；
(C)相对于所述可注射组合物，0至10重量％的一种或多种局部麻醉剂作为组分C；以及
(D)相对于所述可注射组合物，0至50重量％的除组分A、B和C之外的一种或多种药学上可接受的添加剂作为组分D。
在一个优选的实施方式中，所述可注射组合物包含下列组分或由下列组分组成：
(A)相对于所述可注射组合物，相对于干物质，1至80重量％的一种或多种类型的的平均粒径为15至50μm的羟磷灰石钙粒子作为组分A；
(B)相对于所述可注射组合物，1至80重量％的一种或多种药学上可接受的载体作为组分B，组分B包含下列组分或由下列组分组成：
(B1)50至99.9重量％的一种或多种液态、粘性或糊状的药学上可接受的载体，特别是选自甘油、水、一种或多种水性缓冲液及其组合或两种或更多种中的液态、粘性或糊状的药学上可接受的载体；以及
(B2)0.1至50重量％的一种或多种固态的药学上可接受的载体，优选一种或多种多糖或其衍生物或其药学上可接受的盐，特别是选自纤维素衍生物(例如，羧甲基纤维素(CMC)、羧乙基纤维素(CEC))、纤维素、及
其两种或多种的混合物的多糖或衍生物；
(C)相对于所述可注射组合物，0至3重量％的一种或多种局部麻醉剂作为组分C；以及
(D)相对于所述可注射组合物，0至50重量％的除组分A、B和C之外的一种或多种药学上可接受的添加剂作为组分D。
任选地，本发明的可注射组合物可以被包装。例如，它可以包装在注射器(一次性使用的)、小瓶等中。用户手册可以任选添加到这样的包装中。因此，本发明还涉及包含本发明的可注射组合物和用户手册的药盒，用于美容和/或治疗用途。
如上文指出，本发明的羟磷灰石钙粒子和/或可注射组合物可任选用于美容(非治疗)和治疗目的。如上文指出，本发明的羟磷灰石钙粒子和/或可注射组合物特别可用作软组织填充剂，特别是真皮填充剂。因此，本发明还涉及本发明的羟磷灰石钙粒子和/或可注射组合物在改善对象面部或身体的目标部分的皮肤和/或轮廓的外观中的用途。特别是，本发明还涉及本发明的羟磷灰石钙粒子和/或可注射组合物作为软组织填充剂，特别是真皮填充剂的用途。
本发明的羟磷灰石钙粒子和/或可注射组合物可用于获得增加和延长胶原产生(新胶原形成)。这些结果表明，这样的组合物特别好地适合于增加胶原的表达。所述羟磷灰石钙粒子和/或可注射组合物可具有特别好的生物刺激作用。这可以导致皮肤质量提高，这可包括例如改善皱纹、皮肤粗糙度、皮肤紧实度和/或衰老迹象和面部轮廓。因此，它是一种特别合适的真皮和/或软组织填充剂。
因此，本发明还涉及本发明的羟磷灰石钙粒子和/或可注射组合物作为填充剂、特别是真皮和/或软组织填充剂的用途。本发明还涉及所述羟磷灰石钙粒子或可注射组合物在改善对象面部或身体的目标部分的皮肤和/或轮廓的外观中的用途。
本发明的另一方面涉及一种用于改善对象面部或身体的目标部分的皮肤和/或轮廓的外观的美容方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供本发明的可注射组合物；以及
(ii)将所述可注射组合物注射到对象面部或身体的目标部分的皮肤中。
应理解，在本发明的羟磷灰石钙粒子和可注射组合物的上下文中展示的定义和优选实施方式准用于所述美容方法。
本发明还涉及在改善对象面部或身体的目标部分的皮肤和/或轮廓的外观的方法中使用的本发明的可注射组合物，所述方法包括以下步骤：
(i)提供所述可注射组合物；以及
(ii)将所述可注射组合物注射到所述面部或身体的目标部分的皮肤中。
术语“对象”(也称：“个体”或“患者”)可以在最广泛的意义上理解为人或动物，通常是哺乳动物，优选人类或家养哺乳动物，其可以接受用本发明的注射组合物的美容方法或治疗方法。如本文所用的术语“哺乳动物”可以从最广泛的意义上理解为任何哺乳动物。优选地，哺乳动物是人或家畜，例如选自小鼠、大鼠、牛、猪、狗、猫、马的动物。特别优选地，如本文所用的对象是人。被施用本发明的可注射组合物的人或动物也可以被称为患者，与他/她的健康状况无关，也不管临床症状是否存在。
注射到面部或身体的目标部分的皮肤中可以是在皮肤的任何部分中注射。在本发明的一个实施方式中，本发明的组合物施用于(特别是注射到)软组织。在本发明的一个实施方式中，本发明的组合物施加于(特别是注射到)真皮区域，如表皮之下或皮下组织之上，并且同样可以被注射到皮下(subcutaneously)/真皮下、皮下(hypodermically)或真皮内、或一些组合。在本发明的一个实施方式中，本发明的组合物在皮下、皮真下和/或真皮内施用(特别是注射)。在一个优选的实施方式中，注射到面部或身体的目标部分的皮肤中是皮下或真皮内注射。注射可以通过任何方式进行，例如通过注射器。
改善对象的面部或身体目标部分的皮肤和/或轮廓的外观的目的可以在最广泛的意义上理解。
在一个优选的实施方式中，所述美容或治疗方法的进一步特征在于，它是一种用于选自以下目的的方法：填充皱纹，改善面部线条，乳房重建或隆胸，嫩肤，丰臀，颧骨重塑，软组织填充，填充面部皱纹，改善眉间纹，改善鼻唇沟，改善木偶纹，改善下颌角、口角，改善唇周皱纹，改善鱼尾纹，改善眉，颧和颊脂肪垫的真皮下支撑，改善泪沟，鼻子，丰唇，丰颊，口周区域填充，疤痕如痤疮疤痕填充，眶下区填充，解决面部不对称，改善下颌线条，隆下颌，及其两种或更多种的组合。
在一个优选的实施方式中，所述美容方法是一种填充皱纹或改善面部线条的方法、特别是填充皱纹的方法。在一个优选的实施方式中，该美容或治疗方法的进一步特征在于，它是一种填充对象的目标皱纹的方法，所述方法将所述可注射组合物皮下或真皮内注射到的目标皱纹中。
在一个优选的实施方式中，所述美容方法是一种填充对象的目标皱纹的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供本发明的可注射组合物；以及
(ii)将所述可注射组合物皮下或真皮内注射到目标皱纹中。
上述美容或治疗方法的目的可以通过任何细胞机制来实现。在一个优选的实施方式中，所述步骤(ii)是将所述可注射组合物注射到真皮下皮肤的结缔组织中，从而刺激胶原的产生，所述胶原特别是选自III型胶原、I型胶原、或I和III型胶原的组合的胶原。
如本文所用，在诸如胶原型的蛋白质的上下文中，术语“产生”可以在最广泛的意义上理解为诸如一种或多种胶原类型的蛋白质的生成。这也可以理解为蛋白质表达。
如本文所用，诱导某种胶原类型(特别是I型胶原和/或III型胶原)的产生可以在最广泛的意义上理解为与未施用本发明的可注射组合物的可比细胞或可比组织相比，表达率增加了至少1重量％、至少2重量％、或至少5重量％、或至少10重量％、或至少20重量％、或至少50重量％、或至少100重量％。
胶原(特别是I型胶原和/或III型胶原)通常由成纤维细胞产生。因此，所述细胞优选是成纤维细胞，或所述组织优选是含有成纤维细胞的组织。
所述注射步骤(步骤(ii))可以是将所述可注射组合物注射到真皮下皮肤的结缔组织中。在一个优选的实施方式中，所述步骤(ii)是将所述可注射组合物注射到真皮下皮肤的结缔组织中，从而刺激胶原的产生，所述胶原特别是选自III型胶原、I型胶原、或I和III型胶原的组合的胶原。
如上文指出，本发明的羟磷灰石钙粒子和/或可注射组合物也可用于治疗目的。因此，本发明的一个方面涉及本发明的羟磷灰石钙粒子和/或可注射组合物供药物中使用。
本发明的另一个方面涉及本发明的羟磷灰石钙粒子和/或可注射组合物用于在治疗与结缔组织病理性恶化相关的病理情况的方法中使用。
换句话说，本发明还涉及一种治疗与对象的结缔组织病理性恶化相关的病理情况的方法，其中所述对象被施用足量的本发明的羟磷灰石钙粒子和/或可注射组合物。
本发明的另一方面涉及本发明的羟磷灰石钙粒子或可注射组合物用于在替代或再生骨材料(即，骨和骨移植物)、充实(implementing)/固定牙根或填充牙齿的方法中使用。
换句话说，本发明还涉及一种在对象中替代或再生骨材料、充实/固定牙根或填充牙齿的方法，其中所述对象被施用足量的本发明的羟磷灰石钙粒子和/或可注射组合物。
应理解，在上述的羟磷灰石钙粒子、可注射组合物和美容方法的上下文中展示的定义和优选实施方式准用于供所述用途的可注射组合物和所述治疗方法。
在一个优选的实施方式中，所述结缔组织的病理情况选自：尿失禁，膀胱输尿管返流，声带增大，脂肪增多，特别是在患有人类免疫缺陷病毒(HIV)的患者中，与结缔组织的年龄相关或病理性恶化有关的病理情况(也称为：与年龄相关的结缔组织恶化有关的病理情况或与结缔组织的病理性恶化有关的病病理情况)，及其两种或更多种的组合。
在一个优选的实施方式中，替代或再生骨材料包括将本发明的羟磷灰石钙粒子或可注射组合物注射到在对象中要治疗的骨结构中或附近。替代或再生骨材料也可以是移植骨。
在一个优选的实施方式中，充实/固定牙根包括在牙齿的锚固结构中施用(例如注射)本发明的羟磷灰石钙粒子或可注射组合物。
在一个优选的实施方式中，牙根填充包括在牙齿的待填充空洞(例如，天然发生的空洞或钻出或磨出的空洞)中施用本发明的羟磷灰石钙粒子或可注射组合物。
所描述的附图、实施例和权利要求书进一步说明了本发明。
附图说明
图1显示了在970℃下烧结的羟磷灰石钙粒子的尺寸分布，其平均粒径为约30μm。描绘了相对尺寸分布实线)和累积尺寸分布(虚线)。可见，尺寸分布相当窄。绝大多数粒子的直径为25至45μm。
图2显示了在100倍放大的显微镜图像中，在1170℃下烧结的羟磷灰石钙粒子(图2A，比较例)和在970℃下烧结的羟磷灰石钙粒子(图2B，根据本发明)的比较。比例尺描绘的是100μm。显而易见，这两种烧结温度都导致了基本上球形的粒子和清晰的尺寸分布。
图3显示了在500倍放大的显微镜图像中，在1170℃下烧结的羟磷灰石钙粒子(图3A，比较例)和在970℃下烧结的羟磷灰石钙粒子(图3B，根据本发明)的比较。显而易见，这两种烧结温度都导致了基本上球形的粒子和清晰的尺寸分布。在970℃下烧结的羟磷灰石钙粒子的表面上可以观察到孔隙(可见暗斑)(图3B，根据本发明)。相反，在1170℃下烧结的羟磷灰石钙粒子(图3A，比较例)的表面基本上是光滑的。
图4显示了在5200倍放大的显微镜图像中，在1170℃下烧结的羟磷灰石钙粒子(图4A，比较例)和在970℃下烧结的羟磷灰石钙粒子(图4B，根据本发明)的比较。比例尺描绘了100μm。在970℃下烧结的羟磷灰石钙粒子的表面上可以观察到孔隙(可见暗斑)(图4B，根据本发明)。相反，在1170℃下烧结的羟磷灰石钙粒子(图4A，比较例)的表面基本上是光滑的。
图5显示了与在尺寸和烧结温度(70℃、1070℃和1170℃)方面不同类型的纯羟磷灰石钙(CaHA)粒子一起温育72小时后，每个成纤维细胞的平均III型胶原表达。对照(CTRL)表示在可比条件下温育的未受刺激的成纤维细胞。荧光信号以任意单位(AU)描绘。
图6显示了与2mg/ml通过在不同温度(1170℃或970℃)下烧结而制备的平均粒径为25至45μm的可比羟磷灰石钙(CaHA)粒子一起温育后，成纤维细胞在温育72小时后(图6A)和温育7天后(图6B)的III型胶原表达。对照(CTRL)表示在可比条件下温育的未受刺激的成纤维细胞。荧光信号以任意单位(AU)描绘。
图7显示了与2mg/ml通过在不同温度(1170℃或970℃)下烧结而平均粒径为25至45μm的可比羟磷灰石钙(CaHA)粒子一起温育后，成纤维细胞在温育72小时后(图7A)和温育7天后(图7B)的I型胶原表达。对照(CTRL)表示在可比条件下温育的未受刺激的成纤维细胞。荧光信号以任意单位(AU)描绘。
图8显示未经处理的成纤维细胞培养。灰点显示III型胶原表达低的细胞。黑点指示III型胶原表达高的细胞。可见，几十个细胞中只有两个具有III型胶原高表达。
图9显示了用本发明的在970℃下烧结的平均直径为25至45μm的羟磷灰石钙粒子处理的成纤维细胞培养物。灰点显示III型胶原表达低的细胞。黑点指示III型胶原表达高的细胞。可见，大量细胞具有III型胶原高表达。
图10显示了对成纤维细胞培养物中III型胶原表达的影响。用在不同温度下烧结的粒子处理细胞，并与对照(Ctrl)样本进行比较。表明了显示III型胶原高表达的细胞(COLIII高细胞)的百分比(A)。另外，与设置为100％的未处理细胞的对照样本(Ctrl)相比较来描绘每个显示III型胶原高表达的细胞(COLIII高细胞)的III型胶原(COLIII)表达(B)。
具体实施方式
羟磷灰石钙(CaHA)粒子的制备和分析
羟磷灰石钙浆料的制备
a.)羟磷灰石钙(CaHA)浆料的制备:
如Nieh等(Nieh，Choi和Jankowski，“多孔羟磷灰石和羟基磷灰石包覆层层的合成与表征(Synthesis and characterization of porous hydroxyapatite andhydroxyapatite coatings)”，会议：2001年矿物、金属与材料学会年会暨展览会，(Conference:2001Minerals,Metals&Materials Society Annual Meeting&Exhibition)，新奥尔良，LA(美国)，2001年2月11-15日)所述，通过水性浆料沉淀羟磷灰石钙(CaHA)。因此，首先通过在pH为约11的碱性水溶液(例如，通过NH4OH)中通过混合来混合钙和磷(例如，Ca(OH)2和H3PO4)而制备结晶CaHA粉末并进行沉淀。在室温下沉淀出CaHA晶体。如Nieh等所述，通过使用去离子水去除多余的反应物和副产物来纯化沉淀的CaHA浆料。将纯化的CaHA浆料通过倾析工序浓缩，并使用诸如球磨机的方法进一步减小浆料中的CaHA晶体的尺寸。
b.)基于商业羟磷灰石钙的浆料的替代性制备：在本发明中，使用了亚微米晶粒尺寸的羟磷灰石钙粉末。这样的亚微米晶粒尺寸的羟磷灰石钙粉末是可从例如MilliporeSigma和Merck KGaA(Darmstadt，德国)商购的。所述羟磷灰石钙粉末的浆料通过将所述粉末与水混合来制备。浆料中羟磷灰石钙的含量被设定为20至40重量％。
c.)基于生成的羟磷灰石钙纳米晶体的浆料的替代性制备：
3重量份的硝酸钙四水合物溶解在约44重量份的水中。将1重量份的磷酸氢二铵溶解在31重量份的水中。将得到的磷酸氢二铵水溶液在剧烈搅拌下缓慢添加到所述硝酸钙水溶液中。将得到的溶液的pH用氢氧化钠至pH 11。可以将所述浆料老化几个小时。任选地，所述晶体可以通过一个或多个离心/洗涤步骤洗涤。这样的程序在Eslami等(IranianJournal of Pharmaceutical Sciences,2008,4(2):127-134)中进行了描述。浆料中羟磷灰石钙的含量被设定为20至40重量％。
从浆料中制备和烧结羟磷灰石钙(CaHA)粒子
如Nieh等所述，利用雾化器/喷雾干燥器将CaHA浆料形成为微球。因此，将所述浆料压过喷嘴进入温暖的空间。利用空气分级或机械筛分来去除超出期望的直径阈值的CaHA粒子。其余的CaHA粒子如Nieh等所述以目标温度和时间进行烧结，以控制颗粒的结晶结构/孔隙率。将烧结的CaHA粒子造粒，然后洗涤/干燥/筛分，以获得由期望的尺寸范围的单一CaHA粒子组成的粉末。
羟磷灰石钙(CaHA)粒子的制备也可以如US 6,537,574和WO2001/012247中所述进行。
羟磷灰石钙粒子的分析
将在970℃下烧结的平均粒径为25至45μm的羟磷灰石钙粒子(根据本发明)与在1170℃下烧结的比较粒子(比较例)进行比较。尺寸和形状分布通过显微镜手段分析并通过测量光散射法进行定量分析。
图1描绘了尺寸分布测量的典型示例。在此可见，尺寸分布相当窄。绝大多数粒子的直径为25至45μm。
将从每个样品的三个级分拍摄的扫描电子显微镜(SEM)图像用于确定粒子-和体积-加权的尺寸分布。因此，在放大倍数为500下，每个级分拍摄多达400张SEM图像，并由自动图像分析软件Imaged(1.51j8版)进一步处理。在定义了参数如Feret直径和纵横比(D比)后，为所有级分图像提供图像处理。平均结果最终表示了基于至少50,000多个鉴定的粒子的粒子加权和体积加权的尺寸分布。
下表1描绘了定量测量的结果。没有发现尺寸>125μm的粒子。
表1.在不同烧结温度下制备的平均粒径为25至45μm的羟磷灰石钙(CaHA)粒子的定量比较
所述结果在图2至4中描绘。可见这两种烧结温度都导致了基本上球形的粒子和清晰的尺寸分布。然而，惊讶地发现，在970℃下烧结的羟磷灰石钙粒子(根据本发明)的表面上可以观察到孔隙(可见暗斑)，而在1170℃下烧结的羟磷灰石钙粒子(比较例)的表面基本上是光滑的。
实施例2
羟磷灰石钙(CaHA)粒子对细胞培养物的整体I和III型胶原表达的效果
材料和方法
材料
人类原代成纤维细胞/成人/单一供体/乳腺，PromoCell，#412Z020–P3)；
成纤维细胞生长培养基：包含1mM维生素C和1重量％的PenStrep(青霉素-链霉素)的细胞培养基；
抗Ⅲ型胶原抗体：兔多克隆抗体，用作一抗(Invitrogen，PA5-34787)；
抗兔抗体：AlexaFluor488标记的山羊二抗，检测兔一抗(Invitrogen，A11034)；
Dako抗体溶液(Agilent，US)；
DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚(SIGMA，D9542)；和
CellMask：深红色质膜染色(Invitrogen，C10046).
细胞培养和样品制备
以5000个细胞/孔的密度接种成纤维细胞。将细胞在成纤维细胞生长培养基中37℃下以标准条件培养24小时。24小时后，添加200μl含透明质酸的样品。所述样品含有不同量的透明质酸。一些样品还含有22mg/ml的羟磷灰石钙粒子(CaHA)。
细胞培养和样品制备
使用人类原代成纤维细胞(成人，单一供体)。将细胞在成纤维细胞生长培养基中37℃下以标准条件培养24小时。24小时培养后，添加含有在不同温度(970℃、1070℃和1170℃)下烧结的羟磷灰石钙(CaHA)粒子的溶液各200μl。所述粒子在尺寸上也部分不同，从<25μm开始、25-45μm、45-75μm、75-125μm和>125μm。分别在72小时和7天后将细胞除去培养基，用冷甲醇(-20℃)固定细胞10分钟。然后，将固定的细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤3次，4℃保存。
胶原蛋白染色和定量：
使用针对III型胶原和I型胶原的两种特异性抗体。将固定的细胞温育，并使用成象器分析荧光信号进行定量。对于III型胶原的定量，分析了孔板中细胞的平均表达，因为信号与细胞在同一平面水平上。与此相反，I型胶原的表达按整个孔的平均荧光来评价，因为I型胶原网络是在细胞上方的平面水平上形成的。
此外，对III型胶原的表达进行了单细胞分析。在此，对每个单细胞单独进行分析，对III型胶原高表达细胞的数量进行定量，并对那些III型胶原高表达细胞的III型胶原表达进行评价。
去除固定细胞的上清液。然后，在室温(RT)下，用100μL/孔的封闭缓冲液(含5重量％白蛋白的PBS)处理细胞2小时。除去封闭缓冲液。然后，添加70μl/孔的各抗胶原抗体的溶液(使用6.7μg/ml的抗胶原III型一抗(抗胶原III型抗体，多克隆，宿主兔；L ThermoFisher Scientific；PA5-34787)在Dako抗体溶液(1:100)中的溶液，相应地抗胶原I型抗体(抗胶原I型抗体[COL-1]，单克隆，宿主小鼠；Abcam；ab90395)在Dako抗体溶液(1:100)中的溶液)并在卧式混合器上4℃避光温育过夜。
第二天，将处理过的固定细胞用PBS洗涤三次。随后，添加70μl/孔的各标记二抗的溶液(例如，添加在Dako抗体溶液(1:100)中含有10μg/ml的AlexaFluo488标记的抗兔二抗和为了共染色在Dako抗体溶液(1:100)中的AlexaFluo546标记的抗小鼠抗体)并在RT下避光温育1小时。将处理过的固定细胞用PBS洗涤三次。随后，添加70μl/孔在PBS中1:1000稀释的CellMask深红质膜染色(5μg/ml)。将固定细胞在RT下避光温育30分钟。随后，添加70μl/孔的1μg/ml DAPI的PBS溶液(1μg/ml，对2mg/ml等份的1:2000稀释)。将固定细胞在RT下避光温育10分钟。将处理过的固定细胞用PBS洗涤三次。
在成象器上测定相应二抗的荧光信号，以对信号进行量化。此外，还制备了显微图像。结果如下所示。
结果
结果如图5至图7所描绘。令人惊讶的是，在较低温度(这里：970℃)下烧结的羟磷灰石钙粒子显示出对新胶原形成的影响更大，即增加I型胶原以及III型胶原的形成。在所有样品中都发现了这种效果。对于平均粒径不大于75μm，特别是不大于45μm的较小尺寸的粒子诱导的III型胶原表达，这种效果特别显著。此外，令人惊讶地发现，在较低温度(这里：970℃)下烧结的羟磷灰石钙粒子在短时间温育如果72小时后，与在1170℃下烧结的比较羟磷灰石钙粒子相比，诱导的I型胶原生成显著增加。
总之，发现本发明的羟磷灰石钙粒子以优于现有技术的羟磷灰石钙的功效增加了新胶原形成。对于I型胶原和III型胶原而言，胶原产生增加特别有效，这两种胶原蛋白代表了皮肤中的优势胶原，也是皮肤质量改善的主要驱动力。这提供了包含本发明的羟磷灰石钙粒子的可注射组合物可以用作特别有效的填充剂的证据。这对于改善对象的面部或身体的目标分的皮肤和/或轮廓的外观可能特别有益。
实施例3
单细胞分析中羟磷灰石钙(CaHA)粒子对细胞的I型和III型胶原表达的效果
方法
如上所述在96孔细胞培养板中培养2D成纤维细胞。将细胞在不处理的情况下进一步温育，作为对照，或者用在一定烧结温度下制备的羟磷灰石钙粒子样品处理并进一步温育。
如上所述对I或III型胶原染色。然后，制备显微镜图像，并鉴别显示出I或III型胶原高表达的细胞和显示出I或III型胶原低表达的细胞。
结果
令人惊讶地发现，与未经处理的细胞相比，用经970℃烧结二制备的羟磷灰石钙粒子处理的成纤维细胞显示出非常多的细胞数量，而用经更高温度(1070℃和1170℃)烧结而制备的可比的羟磷灰石钙粒子处理的细胞表达大量的III型胶原(参考图10A)。此外，每个细胞的III型胶原表达也增加(参考图10B)。
因此，本发明的羟磷灰石钙粒子令人惊讶地激活了更多数量的细胞进行胶原表达，并且每个细胞表现出更高的胶原表达。
总体实验发现
令人惊讶地发现，与在更高温度下烧结的粒子相比，本发明的羟磷灰石钙粒子具有更高的孔隙率。考虑到所有结果，令人惊讶地发现本发明的羟磷灰石钙粒子在刺激和提高胶原生成方面特别有效。这是在细胞水平上以及在整个细胞培养物中发现的。胶原形成
胶原生成与作为皮肤和软组织填充剂的有益的适用性有关(参考van Loghem等，The Journal of Clinical Aesthetic Dermatology，2015，8(1):38-49；Coleman等，Dermatologic Surgery，2008，34:S53-S55，Berlin等，Dermatologic Surgery，2008，34:S64-S67)。本发明的羟磷灰石钙粒子主要或完全由无毒且得到广泛认可的羟磷灰石钙构成。因此，显然本发明的羟磷灰石钙粒子可用作特别有效的皮肤和软组织填充剂。

Claims (15)

1.羟磷灰石钙粒子，其已在910至1030℃范围内的温度下烧结并且未经历大于1030℃的温度。
2.根据权利要求1所述的羟磷灰石钙粒子，其中所述羟磷灰石钙粒子是球状或椭球状的，更优选是球状的，特别是D比超过0.7的球状。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的羟磷灰石钙粒子，其中所述羟磷灰石钙粒子具有多孔表面。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的羟磷灰石钙粒子，其中通过汞孔隙率法进行测定，所述羟磷灰石钙粒子的表面具有在表面上的平均直径在10和500nm之间的孔隙。
5.根据权利要求1至4中的任一项所述的羟磷灰石钙粒子，其中通过光散射进行测定，所述羟磷灰石钙粒子的平均粒径为1至500μm、或5至500μm、或1至150μm、或2至100μm、或5至80μm、或10至60μm、或15至50μm、或20至45μm、或25至45μm。
6.根据权利要求1至5中的任一项所述的羟磷灰石钙粒子，其中所述羟磷灰石钙粒子已在910至995℃、或920至995℃、或930至990℃、或940至985℃、或950至980℃、或960至975℃范围内的温度下烧结，并且其中所述羟磷灰石钙粒子未经历超过所述烧结温度的温度。
7.根据权利要求1至6中的任一项所述的羟磷灰石钙粒子，其中所述羟磷灰石钙粒子被烧结1至24小时、2至12小时、或3至16小时。
8.一种可注射组合物，所述组合物包含：
(A)一种或多种类型的根据权利要求1至7中任一项所述的羟磷灰石钙粒子作为组分A；和
(B)一种或多种药学上可接受的载体作为组分B；
(C)任选的一种或多种局部麻醉剂作为组分C；以及
(D)除组分A、B和C之外的任选的一种或多种药学上可接受的添加剂作为组分D。
9.根据权利要求8所述的可注射组合物，其中所述一种或多种药学上可接受的载体选自一种或多种多糖衍生物或其药学上可接受的盐、一种或多种多糖或其药学上可接受的盐、甘油、水、一种或多种水性缓冲液、及其组合或两种或更多种。
10.根据权利要求8或9中任一项所述的可注射组合物，其中所述一种或多种药学上可接受的载体选自羧甲基纤维素或其药学上可接受的盐、甘油、水、及其组合或两种或更多种。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的可注射组合物，其中所述可注射组合物由下列组分组成：
(A)相对于所述可注射组合物，相对于干物质，1至80重量％的一种或多种类型的羟磷灰石钙粒子作为组分A；
(B)相对于所述可注射组合物，1至80重量％的一种或多种药学上可接受的载体作为组分B，所述载体包含至少一种糊状、粘性或液态载体；
(C)相对于所述可注射组合物，0至10重量％的一种或多种局部麻醉剂作为组分C；以及
(D)相对于所述可注射组合物，0至50重量％的除组分A、B和C之外的一种或多种药学上可接受的添加剂作为组分D。
12.一种用于改善对象面部或身体的目标部分的皮肤和/或轮廓的外观的美容方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供根据权利要求8至11中任一项所述的可注射组合物；以及
(ii)将所述可注射组合物注射到对象面部或身体的目标部分的皮肤中。
13.根据权利要求12所述的美容方法，其中所述方法的进一步特征在于，它是一种用于选自以下目的的方法：填充皱纹，改善面部线条，乳房重建或隆胸，嫩肤，丰臀，颧骨重塑，软组织填充，填充面部皱纹，改善眉间纹，改善鼻唇沟，改善木偶纹，改善下颌角、口角，改善唇周皱纹，改善鱼尾纹，改善眉，颧和颊脂肪垫的真皮下支撑，改善泪沟，鼻子，丰唇，丰颊，口周区域填充，疤痕如痤疮疤痕填充，眶下区填充，解决面部不对称，改善下颌线条，隆下颌，及其两种或更多种的组合，
特别是其中所述方法是一种填充对象的目标皱纹的方法，所述方法将所述可注射组合物皮下或真皮内注射到的所述目标皱纹中。
14.根据权利要求12或13中任一项所述的美容方法，其中所述步骤(ii)是将所述可注射组合物注射到真皮下皮肤的结缔组织中，从而刺激胶原的产生，所述胶原特别是选自III型胶原、I型胶原、或I和III型胶原的组合的胶原。
15.根据权利要求1至7中任一项所述的羟磷灰石钙粒子或提供根据权利要求8至11中的任一项所述的可注射组合物，供在治疗与结缔组织病理性恶化相关的病理情况的方法中使用，优选其中所述病理情况选自：尿失禁，膀胱输尿管返流，声带增大，脂肪增多，特别是在患有人类免疫缺陷病毒(HIV)的患者中，与结缔组织的年龄相关或病理性恶化有关的病理情况，及其两种或更多种的组合。
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