KR20220110186A - 진피 필러 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 물 및/또는 다가알코올을 포함하는 캐리어 유체; 가교된 히알루론산; 및 10-200 μm 범위의 평균 직경을 갖는 가교된 히알루론산의 구형 마이크로입자를 포함하는, 겔 형태의 진피 필러 조성물에 관한 것이다. 필러는 피부 조직에 주입 시 볼륨 제공 효과와 생체 자극 효과를 제공한다.

Description

진피 필러 조성물

본 발명은 진피 필러 조성물, 이러한 조성물의 제조 방법, 주름 치료에 사용하기 위한 진피 필러 조성물 및 의료 요법에 사용하기 위한 진피 필러 조성물에 관한 것이다.

피부의 주름 및 기타 잔주름의 치료는 종종 피부 조직에 진피 필러 조성물을 주입함으로써 이루어진다. 이러한 조성물은 주름을 단순히 메우는(fill) 볼륨 제공 물질(volumizer)로서 또는 일단 주입되면 콜라겐 형성을 적극적으로 유도하는 생체 자극제(biostimulator)로서 작용할 수 있다. 볼륨 제공 물질의 효과는 즉각적이지만 오래 지속되지는 않는다 (전형적으로 1년 미만). 반면에, 생체 자극 효과는 수개월 경과 후에야 나타나고 볼륨 제공 물질의 효과보다 오래 지속된다.

불행히도 진피 필러 주입은 합병증을 유발할 수 있다. 가장 흔한 부작용은 부종, 통증, 홍반, 가려움증 및 반상출혈로 나타나는 국소 주입 관련 부작용이다. 이러한 부작용 효과는 경미하고 일반적으로 1주일 미만 지속되지만 그럼에도 불구하고 불편한다. 더 심각한 합병증이 발생할 수도 있지만 드물다. 예를 들어, 혈관 폐색은 수 시간 또는 수일 내에 발생하여, 국소 조직 괴사 또는 혈관 색전으로 이어질 수 있다. 장기적으로, 진피 필러의 반복적인 주입의 부작용으로 색소 침착과 흉터가 나타날 수 있다.

통증, 자극 및 염증과 같은 합병증의 발생을 줄이려는 지속적인 노력은 생체 자극제를 사용하려는 욕구로 인해 좌절되는데, 많은 생체 자극제의 기저 메커니즘이 주입된 생체 자극제로 인해 조직이 활성화되거나 심지어는 염증 유발되도록 하는 것이기 때문이다. 따라서, 생체 자극이 자극 및 염증과 함께 진행되지 않는 진피 필러가 필요하다. 또한, 많은 생체 자극제는 생분해성이 좋지 않아서, 주입 부위에서 원하지 않는 부작용이 발생할 때 생체 자극제의 제거가 곤란하다.

또한, 하나의 진피 필러 조성물에서 볼륨 제공 물질과 생체 자극제를 결합시키는 것은 어려운 것으로 입증되어 왔다. 이러한 결합의 이점은 볼륨 제공 효과가 끝날 때 생체 자극 효과가 이어지기 때문에 그 효과가 시간 경과에 따라 더 일정하다는 것이다.

발명의 요약

따라서, 본 발명의 목적은 피부에 주입시 통증, 자극 및 염증을 덜 유발하는 진피 필러 조성물을 제공하는 것이다. 특히 상기 조성물이 공지된 진피 필러에 비해 개선된 생분해능을 갖는 것을 목적으로 한다. 또한 하나의 진피 필러 조성물에 볼륨 제공 물질과 생체 자극제를 합치는 것을 목적으로 한다.

이러한 목적 중 하나 이상이 특정 진피 필러 조성물을 적용함으로써 달성될 수 있다는 것이 이제 밝혀졌다.

따라서, 본 발명은 다음을 포함하는, 겔 형태의 진피 필러 조성물에 관한 것이다:

- 물 및/또는 다가알코올을 포함하는 캐리어 유체;

- 가교된 히알루론산의 겔 성분;

- 10 내지 200 ㎛ 범위의 평균 직경을 갖는 가교된 히알루론산의 구형 마이크로입자.

도 1은 본 발명에 따른 진피 필러 조성물에 사용되는 마이크로입자의 현미경 사진을 보여준다.
도 2는 다른 히알루론산 기반의 제형을 주입한 후 여러 시간 간격에 얻은 헤마톡실린 및 에오신 염색된 조직을 보여준다.
도 3은 다른 히알루론산 기반의 제형을 주입한 후 12개월차에 측정된 조직 내 콜라겐 밀도를 보여준다.
도 4는 주입 후 12개월 동안 본 발명의 진피 필러 조성물에 의한 생체 자극 진행을 보여준다.
도 5는 도 4에서 언급한 생체 자극 조사에 관련된 조직의 현미경 사진을 보여준다.

본 명세서에 사용된 용어 "진피 필러"는 연조직 결핍 부위에 볼륨을 추가하도록 고안된 재료 또는 조성물을 광범위하게 지칭한다. 따라서, 동등한 용어로 "연조직 필러" 용어도 사용할 수 있다. 본 발명의 의미 내에서, 용어 "연조직"은 일반적으로 신체의 다른 구조 및 기관을 연결하거나, 지지하거나 둘러싸는 조직에 관한 것이다. 본 발명에서 연조직에는 예를 들어 근육, 힘줄, 성대, 내막 조직, 섬유 조직, 지방, 혈관, 신경 및 활막 조직이 포함된다. 또한, 용어 "진피 필러"는 주입의 위치 및 유형에 대해 어떠한 제한을 부과하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 일반적으로 진피 아래의 여러 수준에서의 사용을 포함한다.

본 발명의 진피 필러는 겔 형태, 즉 겔이다. 본 명세서에 사용된 용어 "겔"은 일반적으로 포유동물의 체온(전형적으로 37 ℃)에서 액체와 고체 사이의 유동성을 갖는 물질을 지칭한다.

본 발명의 진피 필러는 다른 성분, 특히 활성 약학적 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 리도카인 또는 비타민(예: 비타민 B, C 또는 E)과 같은 국소 마취제를 포함할 수 있다.

캐리어 유체는 활성 화합물(예: 주름 치료에 활성임)이 존재하는 매질이다. 캐리어 유체는 물 및/또는 다가알코올을 포함한다. 다가알코올이라 함은 디올 또는 트리올과 같이 1개보다 많은 히드록실기를 함유하는 알코올을 의미한다.

캐리어 유체는 원칙적으로 생리학적으로 허용가능한 캐리어 유체로 고안된다. 물이 상당량 존재하는 경우(예컨대 운반된 유체의 50 중량% 초과를 구성하는 경우), 캐리어 유체는 인산염 완충 식염수(PBS)와 같은 생리 식염수 용액에 의해 전형적으로 생리학적 pH로 또는 그 부근으로 완충된다. 기타 적합한 완충액은 예를 들어 링거 용액(전형적으로 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 및 중탄산나트륨을 포함함) 또는 Tyrode 용액(전형적으로 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 인산이수소나트륨 및 중탄산나트륨을 포함함)이다.

본 발명의 이러한 수성 겔의 pH는 일반적으로 6.4 내지 7.8의 범위, 특히 6.8 내지 7.4의 범위이다. 이러한 pH에는 적절한 pH를 갖는 전술한 완충액을 적용하거나 또는 적절한 양의 산 및/또는 염기를 사용하여 pH를 원하는 값으로 설정함으로써 도달할 수 있다.

본 발명의 진피 필러 내 캐리어 유체의 함량은 일반적으로 진피 필러 자체의 총 중량을 기준으로 적어도 50 중량%이다. 함량은 또한 적어도 60 중량%, 적어도 70 중량%, 적어도 90 중량%, 적어도 95 중량%, 적어도 97.5 중량%, 적어도 98 중량%, 적어도 98.5중량%, 또는 적어도 99 중량%일 수 있다. 함량은 또한 99중량% 이하, 98중량% 이하, 95중량% 이하, 90중량% 이하, 85중량% 이하 또는 75중량% 이하일 수 있다. 바람직하게, 함량은 90 내지 98 중량% 범위이다.

본 발명의 진피 필러 내 다가알코올은 에틸렌 글리콜, 글리세롤, 1,3 프로판디올, 1,4 부탄디올, 만니톨, 소르비톨 및 폴리(에틸렌 글리콜)의 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 진피 필러의 겔 특성은 필러의 일 성분인 가교된 히알루론산 겔에서 대부분 유래한다. 히알루론산은 겔의 성질을 갖는 정도로 가교된다. 당업자는 독창적인 노력을 기울이지 않고 과도한 실험 없이 상기 겔에 도달하는 방법을 알고 있다.

가교된 히알루론산의 겔에서, 히알루론산의 질량 평균 분자량(M_w)은 일반적으로 적어도 50 kDa이다. 일반적으로는 100 내지 10,000 kDa 범위이다. 바람직하게는 200 내지 5,000 kDa 범위 또는 500 내지 3,000 kDa 범위이다.

본 발명의 진피 필러 조성물에서, 가교된 히알루론산 겔을 구성하는 가교된 히알루론산의 함량은 일반적으로 진피 필러 자체의 총 중량을 기준으로 가교된 히알루론산 0.1 내지 10 중량% 범위, 특히 0.5 내지 5.0 중량% 범위, 더욱 특히는 1.0 내지 3.5 중량% 범위이다.

(겔 성분의) 가교된 히알루론산 내 가교는 일반적으로 화학적 가교이다. 이들은 히알루론산과 화학적 가교제의 반응에 의해 형성된다. 예를 들어, 이러한 가교제는 디글리시딜 에테르(예: 1,2-에탄디올 디글리시딜 에테르 또는 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르) 또는 디-에폭시알칸(예: 1-(2,3-에폭시프로필)-2,3-에폭시시클로헥산 또는 1,2,7,8-디에폭시옥탄)이다, 바람직하게, 가교제는 디비닐 술폰 또는 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르이다.

이들 가교제로부터 생성된 가교는 통상적으로 각각의 가교제로부터 유래된다고 한다. 따라서, 본 발명의 진피 필러에서, 히알루론산의 화학적 가교는 디글리시딜 에테르 및 디-에폭시알칸으로 이루어진 군으로부터 선택된 가교제, 바람직하게는 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 또는 디비닐술폰으로부터 전형적으로 유래된다.

본 발명의 진피 필러 조성물 내 구형 마이크로입자는 상이한 형상을 갖는다는 점에서 공지된 진피 필러 조성물에 사용된 마이크로입자와 상이하다. 이러한 진피 필러 적용분야에서 알려진 히알루론산 마이크로입자는 구형이 아닌 반면, 본 발명에 적용된 것들은 도 1에 나타낸 바와 같이 구형이다. 더욱이, 본 발명의 마이크로입자는 또한 다소 연질이며, 눌려질 때 쉽고 가역적으로 변형될 수 있다. 이들은 각각 물을 흡수하거나 방출할 때 쉽게 팽창 또는 수축한다. 이러한 차이는 마이크로입자를 제조하는 상이한 공정의 결과이다. 당해 분야에서, 이는 히알루론산이 가교되어 겔을 형성하고 그 후에 겔은 예를 들어 유발에서 그라인딩 (예: WO2018/159983A1)되어 마이크로입자로 분쇄되는 것에 관한 것이다. 이렇게 얻어진 마이크로입자는 불규칙한 형상을 가져서, 예를 들어, 이들은 날카로운 모서리와 높은 종횡비를 가지고 있다.

본 발명의 마이크로입자는 근본적으로 다른 방식으로 제조된다. 히알루론산은 수성 매질에 용해된다. 이 용액으로부터 물/에틸 아세테이트 에멀젼이 만들어지고, 용해된 히알루론산을 포함하는 물방울이 생성된다. 에틸 아세테이트에 약간 용해되기 때문에 물은 에틸 아세테이트에 의해 물방울에서 빠져나와 히알루론산 소구체를 남긴다. 그 뒤에, 생성된 소구체 내 히알루론산이 가교된다. 그 후, 추가 후처리하여 가교된 히알루론산의 구형 마이크로입자를 생성한다; 후처리에서 과량의 물에 노출되면 이들이 실질적으로 팽윤될 수 있게 한다. 따라서 이들 입자는 매우 규칙적이고 매우 부드럽다.

일부 경우에서, 마이크로입자가 완전한 구형에서 약간 벗어날 수 있다. 예를 들어, 가장 짧은 직경 대 가장 긴 직경의 비는 적어도 0.75, 적어도 0.80, 적어도 0.85, 적어도 0.90, 적어도 0.95, 적어도 0.97, 적어도 0.98, 적어도 0.99 또는 적어도 0.995이다.

동물 연구에서(실시예 6 참조), 가교된 히알루론산과 선형 히알루론산의 겔만을 포함하는 조성물(마이크로입자 없음)에 비해 조성물에 구형 마이크로입자가 존재하는 경우에 최대 1년 기간동안 콜라겐 형성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 이것은 구형 마이크로입자가 생체 자극 효과를 갖는다는 강력한 지표이다. 또한 구형 마이크로입자를 포함하는 조성물의 주입은 구형 마이크로입자가 없는 조성물의 주입와 동일한 수준의 염증을 제공하는 것으로 관찰되었다. 이는 불규칙한 마이크로입자를 갖는 조성물이 주입 후 최대 2주 기간 동안 높은 수준의 염증을 일으키는 것으로 알려졌기 때문에 놀라운 일이다. 따라서, 진피 필러 조성물 내 구형 마이크로입자의 적용은 염증 증가없이 생체자극 증가를 제공한다.

상기와 같은 제조 방법에서 초기 히알루론산의 질량 평균 분자량이 높을수록 원하는 특정 크기의 입자를 얻기가 더 어려운 것으로 나타났다. 예를 들어, 히알루론산이 500 kDa 초과의 질량 평균 분자량을 갖는 경우 15 내지 70 ㎛ 범위의 크기를 갖는 입자를 제조하기가 어려웠으며, 이는 예컨대 낮은 입자 수율과 낮은 공정 효율성을 나타내었다. 이는 처음에는 히알루론산의 질량 평균 분자량을 낮추는 옵션으로 간주되지 않았는데, 이는 다음에서 설명하는 바와 같이 원치 않는 염증 부작용을 유발하는 것으로 알려졌기 때문이다.

히알루론산은 대식세포 발현에 상이한 영향을 갖는 것으로 알려져 있다. 대식세포는 상기 대식세포가 접촉하는 히알루론산의 질량 평균 분자량(M_w)에 따라 표현형 변화를 겪을 수 있다. 대식세포는 500 kDa, 100 kDa 또는 10 kDa와 같이 낮은 질량 평균 분자량(M_w)을 갖는 히알루론산과 접촉할 때 염증전 반응(pro-inflammatory response)을 나타내는 것으로 알려져 있다. 반면에, 높은 질량 평균 분자량(M_w), 전형적으로 500 kDa보다 더 높은 질량 평균 분자량(M_w)을 갖는 대식세포는 히알루론산과 접촉할 때 뚜렷한 항염증 반응을 나타내는 것으로 알려져 있다.

그러나, 본 발명에 있어서 이는 편견으로 나타났다. 이는 놀랍게도, 마이크로입자가 10 kDa 정도로 낮은 질량 평균 분자량(M_w)을 갖는 히알루론산을 포함하는 본 발명의 조성물이 유의미한 염증전 반응을 일으키지 않는 것으로 밝혀졌기 때문이다.

또한, 질량 평균 분자량(M_w)의 감소는 본 발명의 다른 유익한 임의의 효과, 특히 생체 자극제로서의 유효성을 무효화(cancel)하지 않는 것으로 밝혀졌다.

결론적으로, 히알루론산의 질량 평균 분자량(M_w)의 감소는 조성물의 유효성을 포기하지 않으면서 그리고 염증 반응과 같은 기타 바람직하지 않은 효과를 끌어들이지 않으면서 마이크로입자의 보다 실행 가능한 제조 방식을 열었다.

따라서, 가교된 히알루론산의 구형 마이크로입자에서 히알루론산의 질량 평균 분자량(M_w)은 일반적으로 적어도 1.0 kDa이다. 전형적으로, 이는 1 내지 5,000 kDa 범위이다. 이는 또한 1.2 내지 3,000 kDa 범위, 5 내지 2,000 kDa 범위, 2.4 내지 500 kDa 범위, 5 내지 100 kDa 범위 또는 10 내지 1,000 kDa 범위에 있을 수 있다. 바람직하게, 이는 5 내지 500 kDa 범위, 더욱 바람직하게는 10 내지 100 kDa 범위이다.

구형 마이크로입자는 원칙적으로 물을 함유한다. 마이크로입자 내 수분 함량은 일반적으로 50 내지 99 중량% 범위, 전형적으로 75 내지 95 중량% 범위이다. 이는 예를 들어, 99중량% 이하, 98중량% 이하, 97중량% 이하, 95중량% 이하, 90중량% 이하, 85중량% 이하, 80중량% 이하 또는 75 중량% 이하의 범위이다. 이는 또한 60중량% 이상, 75중량% 이상, 80중량% 이상, 85중량% 이상, 90중량% 이상, 93중량% 이상 또는 95중량% 이상일 수 있다.

구형 마이크로입자의 히알루론산 내 가교는 일반적으로 화학적 가교이며, 예를 들면 디글리시딜 에테르, 디-에폭시알칸 및 디비닐 술폰으로 이루어진 군으로부터 선택된 가교제, 특히 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 또는 디비닐 술폰으로부터 유래된다.

본 발명의 진피 필러 내 구형 마이크로입자는 일반적으로 300 ㎛ 이하, 150 ㎛ 이하, 50 ㎛ 이하 또는 40 ㎛ 이하의 평균 직경을 갖는다. 이는 일반적으로 10 ㎛ 이상, 15 ㎛ 이상, 20 ㎛ 이상, 25 ㎛ 이상, 30 ㎛ 이상, 40 ㎛ 이상 또는 50 ㎛ 이상이다. 전형적으로, 이는 15 내지 100 ㎛ 범위, 특히 15 내지 70 ㎛ 범위, 더 특히는 20 내지 55 ㎛ 범위, 그리고 훨씬 더 특히는 30 내지 50 ㎛ 범위이다.

본 발명의 진피 필러 내 구형 마이크로입자의 함량은 일반적으로 0.4 내지 10 체적% 범위, 특히 0.5 내지 8 체적% 범위, 더욱 특히는 1 내지 6 체적% 범위이다.

본 발명의 진피 필러는 진피 필러를 멸균 진피 필러로 제공하기 위해 멸균 공정을 거칠 수 있다. 예를 들어, 이는 고온(예: 증기 멸균에 의함) 또는 고에너지 방사선(예: 감마선 조사)에 노출됨으로써 멸균된다.

본 발명의 진피 필러의 점도는 겔 성분에 사용된 히알루론산의 가교 정도, 마이크로입자의 양과 크기, 및 상이한 성분의 상대적 풍부도, 특히 1) 가교된 히알루론산 겔; 2) 마이크로입자; 및 3) 점도에 영향을 끼치는 최종 첨가제, 예컨대 선형 히알루론산(하기 참조)의 상대적 풍부도와 같은 진피 필러의 특정 특징을 다양하게 함으로써 조정될 수 있다. 진피 필러의 구체적인 적용 분야에 따라, 더 높거나 더 낮은 점도가 설정될 수 있다.

본 발명의 겔의 동적 점도는 일반적으로 10 내지 1100 Pa.s 범위이다. 이는 또한 20 내지 800 Pa.s 또는 30 내지 700 Pa.s 범위일 수 있다. 당업자는 독창적인 노력 없이 일상적인 실험을 통해 특정 점도에 도달하는 데 필요한 조건을 찾을 수 있을 것이다.

본 발명의 겔의 동적 모듈러스(저장 모듈러스)는 일반적으로 1 내지 3,000 Pa 범위, 특히 5 내지 2,500 Pa 범위, 더욱 특히는 15 내지 2,000 Pa 범위 그리고 더욱 특히는 20 내지 1,500 Pa 범위이다.

본 발명의 진피 필러 조성물은 선형 히알루론산을 포함할 수 있다. 이 첨가제의 주요 목적은 점도를 조정하고 그에 의해 필러의 주입성을 최적화하는 데 사용할 수 있다는 것이다.

선형 히알루론산이 존재하는 경우 이는 일반적으로 적어도 250 kDa의 질량 평균 분자량(M_w)을 가진다. 전형적으로, 이는 300 내지 10,000 kDa 범위이다. 바람직하게, 이는 500 내지 5,000 kDa 범위 또는 800 내지 4,000 kDa 범위이다.

선형 히알루론산이 본 발명의 진피 필러에 존재하는 경우, 이는 일반적으로 진피 필러 자체의 총 중량을 기준으로 0.05 내지 5.0 중량% 범위, 특히 0.1 내지 2.0 중량% 범위로 존재한다.

선형 히알루론산(존재하는 경우) 및 가교된 히알루론산은 일반적으로 건조 물질 함량 기준으로 1.0:0.25 내지 1.0:15.0 범위, 특히 1.0:1.0 내지 1.0:10.0 범위의 질량비로 존재한다.

본 발명의 진피 필러의 이점은 필러가 볼륨 제공 효과뿐만 아니라 생체 자극 효과도 제공한다는 점이다. 필러 적용 후에 볼륨 제공 효과는 생체 자극보다 더 단기간에 나타난다. 이는 볼륨 제공 효과만 있거나 생체 자극 효과만 있을 때보다 주름이 메워진 더 변함없는 외관을 제공한다.

또한, 본 발명의 진피 필러가 주입된 환자는 통상적인 진피 필러가 주입될 때보다 적은 부작용, 특히 적은 통증 및/또는 적은 염증을 겪는 이점이 있다. 이러한 부작용 감소가 생체 자극 유효성을 희생시키면서 나타나지 않는 것이 더욱 유리한다. 다시 말해서, 본 발명의 진피 필러 조성물은 염증 증가 및/또는 염증 지속과 함께 나타나지 않는 생체자극 증가를 제공한다.

본 발명의 진피 필러 조성물은 주름 처리를 위한 활성 물질, 즉 피부에서 지속적인 볼륨 제공 효과 및 생체 자극 효과에 기여하는 물질로서 히알루론산 및 이의 유도체만을 함유한다. 예를 들어, 국소 마취제 또는 특정 비타민과 같은 다른 활성 물질의 존재는 주입된 캐리어 유체처럼 지속적인 볼륨 제공 효과를 가질 것으로 생각되지 않는다. 이것은 본 발명의 조성물을 완전 생분해성이 되도록 한다. 더욱이, 실시예에서 입증된 바와 같이, 이것은 높은 안전성 프로파일 및 바람직하지 않은 부작용의 가능성과 중증도의 감소와 결합된다.

본 발명은 또한 다음을 포함하는, 겔 형태의 진피 필러 조성물의 제조 방법에 관한 것이다:

- 가교된 히알루론산의 겔을 제조하는 단계;

- 가교된 히알루론산의 구형 마이크로입자를 제조하되, 상기 구형 마이크로입자는 겔에 존재할 때 10 내지 200 ㎛ 범위의 평균 직경을 갖는 것인 단계;

- 가교된 히알루론산 및 구형 마이크로입자를, 물 및/또는 다가알코올을 포함하는 캐리어 유체와 혼합하여 겔을 형성하는 단계.

본 발명의 방법에서, 가교된 히알루론산의 겔 성분 및 구형 마이크로입자는 일반적으로 별도 제조된 후, 이들이 캐리어 유체와 혼합되어 본 발명의 겔을 형성한다. 따라서, 본 발명의 방법에서 조합되는 적어도 3종의 성분(예를 들어, 선택적으로 선형 히알루론산이 또한 있음)이 존재한다.

이들 성분을 조합하는 여러 방식이 있다. 3종의 중합체는 조합될 때 물이 없을 수 있지만, 이들 중 하나 이상은 4종의 성분 조합시에 물을 함유할 수도 있다.

예를 들어, 가교된 히알루론산이 캐리어 유체에 함유되어 겔을 형성할 수 있는 반면, 선형 히알루론산 및 마이크로입자는 건조 고체로서 이 겔에 첨가될 수 있다. 선형 히알루론산은 종종 건조 고체로 적용되는데, 이는 선형 히알루론산이 통상 본 발명의 방법에 사용하기 위해 준비되는 건조 분말로 구입되기 때문이다. 마이크로입자는 전형적으로 수성 환경에서 제조되어, 습윤 형태의 마이크로입자를 본 발명 방법에서 적용하기 편리하게 만든다. 그러나 이는 다른 성분과 조합되기 전에 건조될 수도 있다.

가교된 히알루론산은 일반적으로 선형 히알루론산을 화학적 가교제, 예를 들어 디비닐 술폰 또는 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르로 처리하여 제조된다. 유사하게, 히알루론산의 구형 마이크로입자는 일반적으로 선형 히알루론산을 가교하여 제조된다. 구형 마이크로입자를 제조하는 공정은 마이크로입자가 공정의 최종 생성물인 진피 필러에 존재할 때 10 내지 200 ㎛ 범위의 평균 직경을 가지도록 수행된다. 수성 환경에서 제조한 직후에 측정한 이들의 평균 직경은 특히 수성 제조 환경이 최종 생성물 내 캐리어 유체와 다를 때 (후자는 예컨대 완충액을 포함할 수 있는 반면 전자는 완충액이 없을 수 있음) 최종 생성물 내 마이크로입자의 평균 직경과 상이할 수 있다.

구형 마이크로입자는 일반적으로 최종 생성물 내 그의 평균 직경이 15 내지 70 ㎛ 범위, 특히 20 내지 55 ㎛ 범위, 더욱 특히는 30 내지 50 ㎛ 범위에 있도록 제조된다. 이는 입자 제조 동안, 입자가 본 발명의 조성물을 제조하기 위해 사용될 때, 특히 입자가 가교된 히알루론산 및 캐리어 유체와 혼합될 때 발생하는 입자의 크기 변화가 이미 고려되었음을 의미한다. 이러한 변화는 전형적으로 예를 들어 염 농도 및 pH를 비롯해서 존재하는 성분의 농도가 다르기 때문에 마이크로입자에 포함된 물의 양이 변할 때 발생한다. 당업자는 최종 진피 필러 조성물 내 원하는 입자 크기에 도달하기 위해 어떠한 입자 크기가 처음에 존재해야 하는지를 알고 있다.

마이크로입자의 제조는 체의 사용을 포함할 수 있다. 그런 다음 구형 마이크로입자를 복수의 체에 걸쳐 체질하여 적절한 평균 직경을 갖는 입자를 생성시킨다. 체질 단계가 수행될 때, 구형 마이크로입자는 일반적으로 습윤 상태이며, 즉 물을 포함한다.

본 발명의 방법은 전형적으로 멸균 단계를 포함하여, 본 발명의 진피 필러를 멸균 진피 필러로서 생성시킨다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 형성된 진피 필러는 승온, 예를 들어 80 내지 140 ℃ 범위의 온도, 특히 100 내지 135 ℃ 범위의 온도로 노출될 수 있다. 노출되는 온도 및 기간은 피부 필러를 너무 많이 분해하지 않으면서 임의의 미생물이 원하는 정도로 파괴되도록 선택된다. 예를 들어, 진피 필러는 15 내지 20분 동안 노출되거나(예: 115 내지 125 ℃ 범위의 온도에서) 2 내지 10분 동안 노출된다(예: 130 내지 140 ℃ 범위의 온도에서).

멸균은 고에너지 방사선, 특히 감마선, 전자선, X선 및 전자기 스펙트럼의 더 높은 자외선 부분과 같은 이온화 방사선에 겔을 노출시킴으로써 달성될 수 있다. 겔이 노출될 수 있는 선량은 예를 들어 15, 25 또는 50 kGy이다.

본 발명은 또한 전술한 바와 같은 방법에 의해 얻을 수 있는 진피 필러에 관한 것이다.

본 발명의 진피 필러는 일반적으로 미용 분야, 특히 피부의 주름 및 잔주름의 미용적 치료에 적용된다. 그러나, 이는 의료 분야에도 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 의료 요법에서 사용하기 위한, 의약(medicament)으로서 사용하기 위한 및/또는 의학(medicine)에서 사용하기 위한 전술된 진피 필러에 관한 것이다.

본 발명은 또한 위축성 여드름 흉터, 지방이영양증, 복압성 요실금, 방광요관 역류, 성대 기능부전, 및/또는 성대 내전술의 치료에 사용하기 위한 전술된 진피 필러에 관한 것이다.

본 발명은 또한 전술한 바와 같은 진피 필러 조성물 유효량을 인간 또는 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 미용적 또는 치료적 목적으로 조직을 메우거나 조직 볼륨을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 연조직은 피부, 근육, 힘줄, 성대, 섬유 조직, 지방, 혈관, 신경 및 활막 조직일 수 있다. 투여는 전형적으로 주사기로 바늘을 통해 진피 필러를 조직에 주입하여 수행된다.

본 발명은 또한 조직 치료를 필요로 하는 개체에서 조직을 치료하기 위한, 전술한 바와 같은 진피 필러의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 여드름 흉터, 지방이영양증, 복압성 요실금, 방광요관 역류, 성대 기능부전 및/또는 성대 내전술의 치료를 필요로 하는 개체에서 여드름 흉터, 지방이영양증, 복압성 요실금, 방광요관 역류, 성대 기능부전 및/또는 성대 내전술을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, 전술한 바와 같은 진피 필러의 용도에 관한 것이다.

실시예

실시예 1. 히알루론산 겔의 제조

13.5 g의 0.25 M 수산화나트륨(NaOH)에 1.5 g의 2,600 kDa 히알루론산(HA)을 함유한 히알루론산 겔을 제조하였다. 모든 HA가 용해된 후, 165 mg의 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르(BDDE)를 용액에 첨가하고 스패튤라로 5분 동안 혼합하였다. 용액을 플라스틱 컵에 넣고 밀폐시키고 50 ℃에서 2시간 동안 오븐으로 옮겼다. 그 다음 겔을 과량의 PBS에 넣고 1.5 중량%의 HA 백분율에 도달할 때까지 수화되도록 두었다.

실시예 2. 가교된 마이크로입자의 제조

50 mg의 10 kDa의 히알루론산을 7.5 mg의 디비닐 술폰과 함께 2 mL의 0.005 NaOH에 용해시키고 실온에서 2시간 동안 방치하였다. 그런 다음, 800 mL 비이커에 400 mL의 에틸 아세테이트를 오버헤드 교반기로 2,000 rpm으로 교반하고 히알루론산 용액을 30 G 바늘을 통해 2분에 걸쳐 첨가하였다. 용액을 1시간 동안 교반되도록 두었다. 그 후 용액을 실온에서 24시간 동안 방치하였다. 정제(진공에서 에틸 아세테이트 제거) 후, 입자를 여과하고 세척하였다. 세척 동안에 입자가 실질적으로 팽윤하여 부드러운 히알루론산 마이크로입자를 생성시켰다.

실시예 3. 3종의 모든 성분의 조합

실시예 1에서 제조한 22 g의 수화된 겔을 50 mg의 1,600 kDa 히알루론산 분말과 스패튤라로 5분간 혼합하였다. 그 후, 실시예 2에서 제조한 90 mg의 입자를 첨가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반하였다.

실시예 4. 마이크로입자 크기 분석

실시예 2에서 제조한 마이크로입자를 Leica 직립형 DM2500 광학현미경을 이용하여 분석하였다. 명시야 200배 확대로 입자를 조사했다. Image J를 사용하여 모폴로지와 크기를 분석하였다. 30 내지 50 ㎛의 평균 구형 입자 크기가 얻어졌다. 도 1은 수득된 마이크로입자의 현미경 사진을 나타낸다.

실시예 5. 겔의 유변학적 분석

실시예 3에서 제조한 생성물을 Discovery Hybrid Rheometer(TA Instruments)로 분석하였다. 25 ℃에서 1,200 pm 갭 높이에서, 저장 및 손실 모듈러스를 측정하였다. 플레이트는 25 mm 직경을 가졌고 1% 스트레인(strain)이 적용되었다. 주파수 스윕은 0.1 Hz에서 5.0 Hz까지 수행하였다. 5.0 Hz에서 겔은 372 Pa의 저장 모듈러스와 52 Pa의 손실 모듈러스를 가졌다.

실시예 6. 생물학적 반응 - 동물 연구

6.1. 설정

본 발명의 진피 필러 조성물의 안전성 및 유효성을 시험하기 위해 동물 연구를 수행하였다. 생체 내 연구는 중국 항저우에 있는 Hangzhou Huibo Science and Technology Co., Ltd에서 2019년 6월 2일부터 2020년 6월 2일까지 수행하였다. 조성물은 뉴질랜드 화이트 래빗에 대해 시험하였고 연구의 진행은 3회의 다른 시점, 즉, 3, 6 및 12개월에 모니터링하였다. 3가지 다른 겔 제형(A, B 및 C)을 시험하였다:

A) 선형 히알루론산이 있는 가교된 히알루론산 겔;

B) 선형 히알루론산이 있는 히알루론산 마이크로입자; 및

C) 선형 히알루론산과 히알루론산 마이크로입자가 있는 가교된 히알루론산 겔(즉, 본 발명의 조성물).

상기 실시예 1 내지 3에 기재된 절차에 따라 3가지 제형을 제조하였다 (제형 B는 가교된 히알루론산을 절차에서 제외시킨 것을 제외하고는 실시예 3의 절차에 따라 제조하였다).

이들 제형을 시험하는 일차 목적은 진피 필러 조성물의 생체 자극 효과에 대한 마이크로입자의 효과를 조사하는 것이었다. 동시에, 염증, 거부 반응 및 캡슐화와 같은 임의의 부작용을 모니터링하였다.

이 연구에 총 21마리의 뉴질랜드 화이트 래빗을 이용하였다. 래빗을 다음과 같이 할당하였다. 시점당 총 한 마리의 래빗을 제형 A에 사용하였다; 시점당 3마리의 래빗을 제형 B와 C에 이용하였다. 0.1 내지 0.2 mL 부피를 동물의 앞다리와 뒷다리 사이에서 척추로부터 약 5cm 떨어진 각 래빗의 등쪽에 침윤시켰다.

히알루론산 겔의 안전성과 유효성을 검증하기 위해 사용한 2가지 염색법은 각각 프리코시리우스 레드(PSR)와 함께 헤마톡실린과 에오신(H&E)이었다. H&E 염색은 겔 침윤 후 조직 구조의 매우 세부적인 상태를 제시하였고, PSR 염색은 관심있는 각 특정 영역에서 콜라겐 섬유의 존재를 부각시켰다.

모든 이미지는 소프트웨어 Image J를 사용하여 처리하였다. 모든 이미지는 10x 배율의 동일 축척으로 분석하였다. 이미지는 스크롤 다운 옵션 내에서 H&E 염색을 사용하여 컬러 디콘볼루션(Color deconvolution)을 통해 처리하였다.관심 영역(ROI) 및 임계값 매개변수를 고정하고 모든 사진에서 사용하였다. 이후, 수집된 수치 데이터는 Excel에서 처리하고 도면에서와 같이 표시하였다.

다음에서, 용어 '히알루론산'은 때때로 'HA'로 약칭된다; 용어 '마이크로입자'는 때때로 MP로 축약된다.

6.2. 결과

첫째, 수득된 데이터를 진피 필러 조성물의 볼륨 제공 유효성에 대해 분석하였다. 이는 가교된 히알루론산 주입로 인한 볼륨 증가이다. 볼륨 제공 효과는 일반적으로 주입 직후에 가장 높은 것으로 알려져 있다. 이후, 가교된 히알루론산이 분해되어 볼륨감 감소를 나타낸다. 염증, 거부 반응, 캡슐화와 같은 부작용 발생에 대한 데이터도 분석하였다.

제형 A 또는 제형 C를 주입하고 시간 경과에 따라 피부를 모니터링하였다. 토끼의 조직은 주입 후 특정 시간 간격(3, 6 및 12개월)에 분석하였다.

주입 후 첫 주에, 관찰된 모든 자극/염증을 각 제형으로 처리된 조직으로 균등하게 나누었다.

도 2는 제형 A 또는 제형 C의 주입 후 3, 6 및 12개월차에 수득한 H&E 염색된 진피층 조직을 보여준다(축척 막대 모두는 0.5 mm의 5개 구획에 걸쳐 0 내지 2.5 mm로 실행됨). 겔은 더 어두운 영역으로 식별되며 그의 윤곽선은 검은선으로 표시된다. 3개월 후에 겔의 많은 부분이 여전히 존재한다. 주입 부위 및 주변부에서 피부 거부 반응이 발생하지 않았다. 진피층은 겔 표면 영역을 둘레에서뿐만 아니라 그 내부/전체에 걸쳐 완전히 둘러싼다. 6개월 후 사진은 겔이 더 희미해진 모습을 보여준다. 1년 후, 겔은 주입 부위에 남지 않아, 겔이 완전 분해되었음을 나타낸다. 이러한 분해 프로파일은 기존의 볼륨 제공 조성물의 분해 프로파일과 일치한다. 섬유성 조직을 통한 겔의 캡슐화는 어느 시점에서도 관찰되지 않았으며, 이는 면역학적 반응이 촉발되지 않았음을 나타낸다. 결론적으로, 이들 시험은 본 발명의 조성물이 효과적인 볼륨 제공 물질이고 본원에서 마이크로입자의 존재가 주입 시 및 주입 후에 바람직하지 않은 부작용을 야기하지 않음을 나타낸다. 이는 입자 내 히알루론산의 질량 평균 분자량(M_w)을 고려할 때 더욱 놀랍다. M_w은 단지 10 kDa에 불과한데, 상기 수치는 신체 내 염증전 반응을 촉발하기 때문에 일반적으로 부적합한 것으로 간주된다. 이러한 낮은 수치는 본 발명의 진피 필러 조성물의 낮은 염증 반응 뿐만 아니라 생체 자극 유효성에 대한 해답일 수 있다고 보인다.

둘째, 수득된 데이터를 피부 필러 조성물의 생체 자극 유효성에 대하여 분석하였다. 이것은 주입된 조성물이 콜라겐 형성을 자극하는 정도이다. 이를 위해, 조직의 PSR 편광 이미지에 기반한 콜라겐 밀도를 주입 부위에서 측정함으로써 각 조직 샘플 내의 콜라겐 섬유의 양을 정량화한다.

도 3은 제형 A, 제형 B 또는 제형 C를 주입한 후 12개월차에 조직에서 측정된 콜라겐 밀도를 보여준다. 제형 A를 사용하여 생체자극 부재(하단 막대)에 해당하는 기준 값을 제공하고, 도 3에서 제형이 B 및 C가 콜라겐 형성을 실제로 시작한다 (각각 중간 막대와 위쪽 막대). 이것은 제형 B 또는 C가 주입된 조직이 제형 A가 주입된 조직보다 더 조밀한 외관을 갖고 더 적은 수의 공극을 갖는 조직 자체의 육안 검사에 의해 뒷받침된다.

더욱이, 제형 C(본 발명)는 생체 자극과 관련하여 제형 B보다 훨씬 더 잘 수행하는 것으로 나타난다. 이는 마이크로입자와 가교된 히알루론산 겔의 시너지 효과의 지표이다. 아마도 겔은 마이크로입자의 생분해를 억제하여 마이크로입자의 활성을 연장시킬 것이다.

셋째, 주입 후 12개월 동안 본 발명의 진피 필러 조성물(제형 C)에 의한 생체 자극 진행에 대하여 수득된 데이터를 분석하였다. 이는 일반적으로 생체 자극이 측정 가능한 효과를 갖기 전에 약간의 시간, 예컨대 1개월 또는 2개월이 소요되는 것으로 알려져 있다.

도 4는 효과가 3개월 후에 중간 정도(moderate)이고 그 후 9개월 후에 거의 3배가 되는, 제형 C에 대한 시간 프로파일을 입증한다.

도 5는 시간 경과에 따라 더 많은 균질성과 더 적은 공극을 나타내는, 도 4의 막대에 해당하는 조직의 현미경 사진을 보여준다 (스케일 막대는 모두 50 ㎛의 5개 구획에 걸쳐 0 내지 250 ㎛에서 실행됨). 이것은 또한 본 발명의 진피 필러 조성물의 생체 자극 효과를 입증한다.

6.3. 결론

상기 데이터는 다음과 같은 결론을 도출한다.

1. 본 발명의 조성물은 12개월 동안 초기 볼륨 제공 효과를 갖고 이어서 생체 자극 효과로 이어진다. 두 효과의 조합은 시간이 경과하더라도 메움(filling)이 일정하게 지각된다는 점이다.

2. 마이크로입자는 생체 자극 효과의 원인이 되고 본원에서 가교된 히알루론산 겔과 시너지 작용을 일으킨다.

3. 본 발명의 조성물은 주입 시 그리고 주입 후에 원하지 않는 부작용을 주지 않으면서 1) 및 2)의 특성을 나타낸다. 이는 불규칙한 형상의 히알루론산 입자를 포함하는 공지 조성물과 대조적이다. 본 발명의 필러에서 구형 마이크로입자의 평활성(smoothness)이 부작용이 없는 원인인 것으로 생각된다.

Claims (17)

1. 겔 형태의 진피 필러 조성물로서,
   - 물 및/또는 다가알코올을 포함하는 캐리어 유체;
   - 가교된 히알루론산의 겔;
   - 10 내지 200㎛ 범위의 평균 직경을 갖는 가교된 히알루론산의 구형 마이크로입자
   를 포함하는, 겔 형태의 진피 필러 조성물.
2. 제1항에 있어서, 캐리어 유체의 함량이 진피 필러 자체의 중량을 기준으로 적어도 90 중량%, 바람직하게는 적어도 95 중량%인 진피 필러 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 가교된 히알루론산의 겔을 구성하는 가교된 히알루론산의 함량이 진피 필러의 총 중량을 기준으로 0.1 내지 10 중량%의 범위, 특히 0.5 내지 5.0 중량%의 범위, 더욱 특히는 1.0 내지 3.5 중량%의 범위인 진피 필러 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 가교된 히알루론산의 겔에서, 히알루론산의 질량 평균 분자량(M_w)이 200 내지 5,000 kDa의 범위, 특히 500 내지 3,000 kDa의 범위인 진피 필러 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 가교된 히알루론산의 구형 마이크로입자에서, 히알루론산의 질량 평균 분자량(M_w)이 5 내지 500 kDa의 범위, 특히 10 내지 100 kDa의 범위인 진피 필러 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 겔 및/또는 마이크로입자 내의 히알루론산이 디글리시딜 에테르, 디-에폭시알칸 및 디비닐 술폰으로 이루어진 군으로부터 선택된 가교제, 특히 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 또는 디비닐 술폰으로부터 유래된 가교를 포함하는 진피 필러 조성물.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 구형 마이크로입자가 15 내지 70 ㎛의 범위, 특히 20 내지 55 ㎛의 범위, 더욱 특히는 30 내지 50 ㎛의 범위의 평균 직경을 갖는 피부 필러 조성물.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 본 발명의 진피 필러 내 구형 마이크로입자의 함량이 0.4 내지 10 부피%의 범위, 특히 0.5 내지 8 부피%의 범위, 더욱 특히는 1 내지 6 부피%의 범위인 진피 필러 조성물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 선형 히알루론산을 추가로 포함하는 진피 필러 조성물.
10. 제9항에 있어서, 선형 히알루론산의 질량 평균 분자량(M_w)이 500 내지 5,000 kDa의 범위, 특히 800 내지 4,000 kDa의 범위인 진피 필러 조성물.
11. 겔 형태의 진피 필러 조성물의 제조 방법으로서,
    - 가교된 히알루론산의 겔을 제조하는 단계;
    - 가교된 히알루론산의 구형 마이크로입자를 제조하되, 상기 마이크로입자는 겔에 존재할 때 10 내지 200 ㎛ 범위의 평균 직경을 갖는 것인 단계;
    - 상기 가교된 히알루론산과 상기 구형 마이크로입자를, 물 및/또는 다가알코올을 포함하는 캐리어 유체와 혼합하여 겔을 형성하는 단계
    를 포함하는, 겔 형태의 진피 필러 조성물의 제조 방법.
12. 제11항에 있어서, 가교가 디글리시딜 에테르, 디에폭시알칸 및 디비닐 술폰으로 이루어진 군으로부터 선택된 가교제, 특히 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 또는 디비닐 술폰으로부터 유래된 것인 방법.
13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 구형 마이크로입자를 적절한 평균 직경을 갖는 입자를 생성하도록 복수의 체에 걸쳐 체질하는 것인 방법.
14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 의료 요법, 미용 요법 또는 에스테틱 요법에 사용하기 위한 진피 필러 조성물.
15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 위축성 여드름 흉터, 지방이영양증, 복압성 요실금, 방광요관 역류, 성대 기능부전 및/또는 성대 내전술의 치료에 사용하기 위한 진피 필러 조성물.
16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 진피 필러 조성물 유효량을 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 미용적 또는 치료적 목적을 위하여 조직을 메우거나(filling) 조직 볼륨을 증가시키는 방법.
17. 개인의 조직을 치료하기 위한, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 진피 필러 조성물의 용도.

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