SE454181B - Sett att spjelka saltbryggor i kapselmembran for frigoring av innehallet, serskilt levande celler - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 454 181 2 stöda tillväxt av de ifrågavarande cellerna, kan de mikroinkapslade cellerna fritt inta substanser som krävs för metabolism och diffunderar genom membranet och att avsöndra sina metaboliska produkter genom kapselmembra- net in i det omgivande mediet.

Sammanfattning av uppfinningen _ Föreliggande uppfinning är inriktad på ett sätt att selektivt söndra vissa membraner som syntetiseras under den mikroinkapselprocedur som angivits 1 den ovan- nämnda ansökningen, utan någon detekterbar skada åt - det inkapslade kärnmaterialet. Mera preciserat utövas sättet enligt uppfinningen på membraner, vilka omfattar en vattenolöslig matris, som bildats från åtminstone tvâ vattenlösliga komponenter: en polymer, vilken in- kluderar multipla katjoniska enheter (polykatjonisk polymer, t ex polyetylenamin); och en polymer med multip- la anjoniska enheter (polyanjonisk polymer, t ex na- triumalginatgummi). De två komponenterna är förbundna med varandra genom saltbryggor mellan de anjoniska och katjoniska enheterna för att bilda matrisen.

Sättet enligt uppfinningen omfattar stegen avseen- de exponering av membrane: av den typ som ovan angivits för en lösning av katjoner, företrädesvis monoatomiska eller mycket làgmolekylära multivalenta katjoner, och en lösning av en strippningspolymer med ett flertal anjoniska enheter. Företrädesvis sammanblandas dessa lösningar. Polymerens anjoniska laddning bör vara till- räcklig för att söndra saltbryggorna och bör företrädes- vis vara lika med eller större än laddningstätheten av membranets polyanjoniska polymer. Lösningen bringas i kontakt med kapslarna för att tillåta katjonerna, t ex kalcium eller aluminium, att tävla med den polykat- joniska polymeren i kapselmembranet om anjoniska säten på den polyanjoniska polymeren. Samtidigt tävlar stripp- ningspolymeren, som har ett flertal anjoniska enheter, lO l5 20 25 30 35 454 181 3 med den polyanjoniska polymeren om katjonsäten pà poly- merkedjorna. Detta resulterar i "försvagning" eller "uppknäppning“ av kapselmembranerna. För att fullborda söndringen tvättas kapslarna och de exponeras sedan för ett sekvesteringsmedel för att avlägsna katjoner associerade med den polyanjoniska polymeren. Det före- dragna sekvesteringsmedlet är ett kelatineringsmedel, såsom citratjoner eller EDTA-joner. Om, såsom är fallet i en viktig utföringsform, kapslarna innehåller viabla celler, är det föredraget att blanda sekvesteringsmedlet med en isotonisk saltlösning.

Den för närvarande föredragna katjonen är kaclium.

Exempel på strippningspolymeren med ett flertal anjoniska grupper, som användes i den blandade lösningen, inklude- rar polysulfonsyror eller (företrädesvis) deras salter, antingen naturliga eller syntetiska. Utomordentliga resultat har erhållits med användning av heparin, en naturlig polymer som innehåller ett flertal sulfonatgrup- per. Polymerer, vilka innehåller polyfosforsyra- eller polyakrylsyrasaltenheter kan även användas. Det för närvarande föredragna sekvesteringsmedlet är natrium- citrat.

Uppfinningen avser även ett sätt att inkapsla viabla celler inom en skyddande omgivning och att sena- re frigöra cellerna. Sålunda tillhandahåller uppfin- ningen det som kan beskrivas som en förpackning som håller levande cellkulturer av vilket som helst ursprung i en steril, stabiliserande omgivning, i vilken de kan undergà normal metabolism och till och med mitos och från vilken de senare kan frigöras.

Följaktligen är en avsikt med föreliggande upp- finning att tillhandahålla ett Sätt för inkapsling av levande celler inom permeabla membraner och senare se- lektiv söndring av membranerna för att frigöra cellerna.

En annan avsikt är att tillhandahålla ett sätt att se- 10 15 20 25 30 35 454 181 4 lektivt söndra membraner. Ett annat föremål för uppfin- ningen är att söndra membranerna utan att skada när- belägen levande vävnad. Ytterligare ett annat föremål för uppfinningen är att tillhandhålla ett sätt att in- kapsla och senare frigöra finfördelade material, vätskor och lösningar.

Dessa och andra föremål för och särdrag hos upp- finningen blir uppenbara från följande beskrivning av vissa viktiga utföringsformer.

Beskrivning Det selektiva membransöndringssättet enligt upp- finningen praktiseras på membraner som består av en saltbrygga-bunden matris av en polykatjonisk polymer och en polyanjonisk Polymer. Vanligen har membranerna en sfäroidal form som definierar ett inneslutet inre, som innehåller en inkapslad substans. Sättet kan emel- lertid även praktiseras på membraner av denna typ som har annat ens sfärioidal form.

Ehuru väsentligen vilket som helst material (som är kompatibelt med vattenhaltiga omgivningar) i vätske- form eller fast form kan inkapslas och senare frigöras utan skada genom sättet enligt föreliggande uppfinning, ligger dess för närvarande ansessa mest betydande an- vändning i dess förmåga att inkapsla och senare frigöra - levande system, såsom cellkulturer. Följaktligen kommer den efterföljande beskrivningen att huvudsakligen handla om inkapsling och frigöring av celler. Fackmännen på området kan med lätthet anpassa sättet enligt uppfin- ningen till inkapsling av mindre ömtàliga material.

Inkapsling Vävnaden eller cellerna som skall inkapslas suspen- deras i ett vattenhaltigt medium, vilket är lämpligt för upprätthållande och för understödjande av de pågåen- de metaboliska processerna hos den ifrågavarande sär- skilda celltypen. För detta ändamål lämpliga medier 10 l5 20 25 30 35 454 181 5 är välkända för fackmännen och är ofta kommersiellt tillgängliga. Medeldiametern hos cellmassan eller något annat material som skall inkapslas kan vidsträckt varie- ra mellan nâgra få um till l mm eller mera. Langerhans cellöar från däggdjur har exempelvis typiskt 50 till 200 um diameter. Vävnadsfragment och individuella cel- ler, såsom fibroblaster, leukocyter, lymfoblastoider, bukspottskörtel beta-, -alfa- eller -delta-celler, Lan- gerhans cellöar, hepatocyter eller celler av annan väv- nad kan inkapslas om så önskas. Även mikroorganismer - kan inkapslas, inbegripet de som har genetiskt modifie- rats genom rekombinerad DNA eller andra tekniker.

Den pågående viabiliteten hos sådant levande mate- rial beror bl a på tillgängligheten av erfordrade nä- ringsämnen, syreöverföring, frånvaro av toxiska sub- stanser i mediet och mediets pH. Därför har det inte varit möjligt att upprätthålla sådant levande material i en fysiologiskt kompatibel omgivning under samtidig inkapsling. Problemet har varit att de betingelser som erfordras för membranbildning har varit letala eller skadliga för vävnaden, och före uppfinningen enligt den ovan angivna ansökningen har det inte förekommit någon metod för membranbildning som tillåtit vävnad att överleva i ett tillstànd av god hälsa.

Man har emellertid upptäckt att vissa vattenlös- liga substanser, som är fysiologiskt kompatibla med levande vävnad och som kan göras vattenolösliga för att bilda en formbevarande, sammanhängande massa, kan användas för att bilda en “temporär kapsel" eller ett skyddande barriärskikt kring individuella celler, grup- per av celler eller vävnader. En sådan substans sättes typiskt vid en koncentration i storleksordningen l-2 vikt% till vävnadskulturmediet. Lösningen formas sedan till droppar, som innehåller vävnaden tillsammans med dess upprätthållnings- eller odlingsmedium, och göres omedelbart vattenolösliga samt gelas, åtminstone i ett 10 15 20 25 30 35 454 181 6 ytskikt. Därefter förses de formbevarande temporära kapslarna med ett mera permanent membran, vilket i enlig- het med föreliggande uppfinning senare selektivt kan söndras för att frigöra den inkapslade vävnaden utan skada. När materialet som användes för att bilda de temporära kapslarna tillåter kan kapselinnehállet åter- förvätskas efter bildningen av det permanenta membra- net. Detta göres genom àterupprättande av de betingel- ser i mediet vid vilka materialet är lösligt.

Materialet som användes för att bilda de tempo- * rära kapslarna kan vara vilket som helst nontoxiskt, vattenlösligt material, vilket genom förändring av den omgivande jonomgivningen eller cellkoncentrationen kan omvandlas till en formbevarande massa. Materialet om- fattar även ett flertal, lättjoniserade, anjoniska en- heter, t ex karboxylgrupper, som kan reagera genom salt- bindningsbildning med polymerer, vilka innehåller ett flertal katjoniska grupper. Såsom nedan kommer att för- klaras möjliggör denna typ av material avsättning av det permanenta membranet med en utvald permeabilitet (inbegripet väsentligen icke poröst till en nivå av flera hundra tusen dalton).

Det för närvarande föredragna polyanjoniska ma- terialet för bildningen av den temporära kapseln är sura, vattenlösliga, naturliga eller syntetiska poly- sackaridgummin. Många sådana material är kommersiellt tillgängliga. De extraheras typiskt från vegatibiliska material och användes ofta som tillsatsmedel till olika livsmedel. Natriumalginat är den för närvarande före- dragna anjoniska polymeren. Alginat i molekylviktsom- rådet av 150 0OO+ dalton kan användas, men kommer be- roende på sina molekyldimensioner vanligen att sakna förmåga att genomkorsa de slutligt bildade kapselmem- branerna. För att göra kapslar utan instängt, vätske- formigt alginat, kan alginat med lägre molekylvikt, u 10 15 20 25 30 454 181 7 t ex 40 000 - 80 000 dalton, användas. I den färdiga kapseln kan alginatet lättare avlägsnas från den in- trakapsulära volymen genom diffusion genom ett membran med tillräcklig porositet. Andra användbara polyanjoni- ska gummin inkluderar sura fraktioner av guargummi, karagênin, pektin, dragantgummi eller xantangummi.

Dessa material omfattar glykosidbundna sackarid- kedjor. Deras fria syragrupper är ofta närvarande i alkalimetalljonform, t ex natriumform. Om en multiva- lent jon, såsom kalcium, strontium eller aluminium, * bytes mot alkalimetalljonen, “tvärbindes" de vätske- formiga, vattenlösliga polysackaridmolekylerna för att bilda en vattenolöslig, formbevarande gel, vilken kan àterupplösas vid avlägsning av jonerna genom jonbyte eller via ett sekvesteringsmedel. Ehuru väsentligen varje multivalent jon som kan bilda ett salt med det sura gummit är funktionsdugligt, är det föredraget att använda fysiologiskt kompatibla joner, t ex kalcium.

Detta tenderar att bevara vävnaden i ett levande till- stand. Andra multivalenta katjoner kan användas för mindre ömtàliga material. Magnesiumjoner är ineffektiva vid gelning av natriumalginat.

En typisk lösningssammansättning omfattar lika volymer av en cellsuspension i dess medium och l till 2 % lösning av gummi i fysiologisk saltlösning. När natriumalginat användes har en 1,2 till 1,6 % lösning använts med framgång.

I inkapslingsförfarandets nästa steg formas gummi- lösningen, som innehåller vävnaden, till droppar med en önskad storlek som är tillräcklig för att innesluta cellerna som skall inkapslas. Härefter gelas dropparna omedelbart för att bilda formbevarande sfäriska eller sfäroidala massor. Droppformningen kan utföras genom kända tekniker.

I 10 15 20 25 30 35 454 181 8 Ett rör, som innehåller en vattenhaltig lösning av multivalenta katjoner, t ex 1,5 % CaCl2-lösning, förses med en propp, vilken håller en droppformnings- apparat. Denna apparat omfattar ett hus med ett övre luftintagsmunstycke och en långsträckt ihålig kropp som är friktionsanpassad till proppen. En lO cm spruta, som är utrustad med en stegpump, är monterad ovanpå huset med t ex en 0,025 cm innerdiameter Teflon-över- dragen nål som passerar genom husets längd. Husets inre är så utformat att nàlens spets utsättes för en konstant laminär luftström, som verkar som en luftkniv. Vid an- vändning, med sprutan full av lösning som innehåller materialet som skall inkapslas, drivs stegpumpen för att i inkrement tvinga droPP\r av lösning från nâlspet- sen. Varje droppe "skärs av" av luftströmmen och faller ca 2,5 cm in i CaCl2-lösningen, där den omedelbart gelar genom absorption av kalciumjoner. Avståndet mellan nàlens spets och CaCl2-lösningens yta är tillräckligt stort, i detta fall, för att tillåta natriumalginat/cellsuspen- sionen att inta den fysikaliskt gynnsammaste formen; en sfär (maximal volym för minimal ytarea). Luft innan- för röret läcker ut genom en öppning i proppen. betta resulterar i "tvärbindning" av gelen och i bildningen av en högviskös, formbevarande, skyddande temporär kap- sel, som innehåller den suspenderade vävnaden i dess medium. Kapslarna samlas i lösningen som en separat fas och separeras genom aspiration.

I sättets nästa steg avsättes ett membran kring de temporära kapslarnas yta genom tvärbindning av yt- skikt. Detta göres genom att de temporära kapslarna som omfattar polyanjon utsätts för en vattenhaltig lös- ning av en polymer som innehåller katjoniska grupper, vilka är reaktiva med anjoniska funktionaliteter i den polyanjoniska polymeren. Polymerer, vilka innehåller reaktiva katjoniska grupper, såsom fria amingrupper, eller kombinationer av amin- och imingrupper, är före- 10 15 20 25 30 35 454 181 9 dragna. I denna situtation tvärbindes polysackaridgum- mit genom interaktion (saltbindningsbildning) mellan karboxylgrupperna och amin- eller imin-grupperna hos den polykatjoniska polymeren. Fördelaktigt kan perme- abiliteten regleras inom vissa gränser genom val av den använda tvärbindningspolymerens molekylvikt och genom variering av exponeringstiden samt koncentrationen av polymerlösning. En lösning av polymer med en låg molekylvikt, penetrerar, under en given tidsperiod, längre in 1 de temporära kapslarna än en högmolekylär- polymer. Tvärbindningsmedlets penetrationsgrad har kor- relerats med den resulterande permeabiliteten. I allmän- het gäller att ju högre molekylvikt och mindre pene- tration desto större porstorlek. Längre exponeringar och mer koncentrerade polymerlösningar tenderar att minska det resulterande membranets övre permeabilitets- gräns. Polymerens medelmolekylvikt är emellertid den dominerande faktorn. I stort sett gäller att polymerer inom moiekyiviktsomràaet lo ooo till ioo ooo dalton eller större kan användas, beroende på reaktionens varak- tighet, polymerlösningens koncentration och den önska- de permeabilitetsgraden. En sats av framgångsrika reak- tionsbetingelser, med användning av lysin med en medel- molekylvikt av ca 35 000 dalton, innebar reaktion i 3 min, under omröring, av en fysiologisk saltlösning, som innehöll 0,016? % lysin. Detta resulterar i mem- braner med en övre permeabilitetsgräns av ca 100 000 dalton. I allmänhet bildar högmolekylära material mem- braner som är svårare att sedan söndra i jämförelse med làgmolekylära material. Den tvärbindande, polykat- joniska polymerens laddningstäthet påverkar även por- storleken och lättheten med vilken membranet kan söndras.

I allmänhet bildar material med hög laddningstäthet mindre porösa membraner, vilka är svårare att söndra. optimala reaktionsbetingelser lämpliga för reglering 10 15 20 25 30 35 454 181 lO av permeabilitet i ett givet system kan lätt bestämmas empiriskt med hjälp av föregående vägledning.

Exempel pà lämpliga tvärbindningspolymerer inklu- derar proteiner och polypeptider, antingen naturliga eller syntetiska, med fria aminogrupper eller kombina- tioner av amino- och iminogrupper, polyetylenaminer, polyetyleniminer och polyvinylaminer. Polylysin, både i D- och L-formerna, har använts med framgång. Prote- iner, såsom polyarginin, polycitrullin eller polyor- nitin, är även användbara. Polymerer i det högre om- - rådet av positiv laddningstäthet (t ex polyvinylamin) vidhäftar kraftigt vid de polyanjoniska molekylernas anjoniska grupper och är svårare att söndra.

Vid detta skede av inkapslingen kan man uppsamla kapslar som omfattar ett "permanent" semipermeabelt membran kring en gelad gummilösning, celltypkompatibelt kulturmedium och cellerna. Om ändamålet är helt enkelt att bevara cellerna i en skyddande omgivning behöver inga ytterligare steg utföras. Om emellertid massöver- föring skall främjas inom kapslarna och genom membraner- na är det föredraget att àterförvätska gelen till sin vattenlösliga form. Detta kan göras genom att de be- tingelser under vilka gummit är i vätskeform återupp- rättas, t ex genom avlägsning av kalciumjoner eller andra multifunktionella kattjoner från gelen. Mediet i kapseln kan áterlösas helt enkelt genom nedsänkning av kapslarna i fosfatbuffrad saltlösning, vilken inne- häller alkalimetalljoner och vätejoner. Monovalenta joner byter med kalciumjoner eller andra multifunktionel- la joner inom gummit när kapslarna nedsänkes i lösningen under omröring. Natriumcitratlösningar kan användas för samma ändamål och tjänar till att avskilja de di- valenta jonerna. Gummimolekyler med en molekylvikt under membranernas övre permeabilitetsgräns kan sedan avlägs- nas från den intrakapsulära volymen genom diffusion.

I» 10 15 20 25 30 35 454 181 ll Till sist kan det vara önskvärt att behandla kaps- larna för att binda upp fria aminogrupper av den typ som annars kan ge kapslarna en tendens att klumpa ihop.

Detta kan göras exempelvis genom nedsänkning av kaps- larna i en utspädd lösning av natriumalginat.

Från det föregående framgår det att inga kraftiga reagens, extrema temperaturer eller andra betingelser som är skadliga för cellernas hälsa och viabilitet be- höver användas vid membranbildningssättet. Sålunda kan även känsliga celler, såsom däggdjurshepatocyter, leu- kocyter, fibroblaster, lymfoblaster och celler från olika endokrina vävnader inkapslas utan svårighet. Natur- ligtvis kan även celler av mikrobiellt ursprung, såsom jäst, mögel och bakterier, vilka är bättre anpassade till att överleva i fientliga omgivningar, samt inerta reagens, fastämnen, eller biologiskt aktiva material, inkapslas utan skada.

Inkapslade celler av den typ som ovan beskrivits kan suspenderas i upprätthållningsmedium eller odlings- medium för lagring eller odling och kommer att förbli fria från bakterieinfektion. Om de är suspenderade i odlingsmedium kommer celler som undergàr mitos in vitro att göra det inom kapslarna. Normal in vitro metabolism fortsätter, förutsatt att de faktorer som krävs för metaboliska processer har tillräckligt låg molekylvikt så att de kan penetrera kapselmembranet, eller är in- kapslade tillsammans med cellerna. Cellernas metaboliska produkter (om de har en molekylvikt under den övre per- meabilitetsgränsen) penetrerar membranet och samlas i mediet. Cellerna kan i inkapslad form lagras, tran- sporteras eller odlas efter önskan, och kan frigöras från sin skyddande omgivning utan skada genom följande sätt att selektivt söndra membranerna.

Söndring av membran I enlighet med uppfinningen kan det inkapslade materialet frigöras genom ett tvàstegssätt, vilket in- 10 15 20 25 30 35 454 181 12 volverar kommersiellt tillgängliga reagens med egenskaper som inte negativt påverkar de inkapslade cellerna.

För det första separeras kapslarna från sitt suspen- sionsmedium, tvättas omsorgsfullt för avlägsning av alla kontaminerande ämnen och dispergeras sedan, under omröring, i en separat eller företrädesvis blandad lös- ning av katjoner, såsom kalciumjoner eller andra mono- atomiska (multivalent katjon med låg molekylvikt) och en strippningspolymer med ett flertal anjoniska enheter, såsom polysulfonsyragrupper. Polymerer som innehåller” fosforsyra- eller polyakrylsyraenheter kan även användas.

Heparin, en naturlig sulfonerad polysackarid, är före- draget för söndring av membraner som innehåller celler.

Den använda strippningspolymerens anjoniska laddning måste vara tillräcklig för att söndra saltbryggorna.

Sålunda kan den anjoniska laddningstätheten vara lika med eller företrädesvis större än laddningstätheten för den inre polyanjoniska polymeren (t ex gummit), som ursprungligen användes för bildning av membranerna.

Strippningspolymerens molekylvikt bör vara åtminstone jämförbar med och företrädesvis större än molekylvikten för den inre polykatjoniska polymeren, som användes för bildning av membranet. Inom suspensionen tävlar kalciumjonerna med den inre polykatjoniska polymeren, som omfattar membranet, om anjoniska säten pà den poly- anjoniska polymeren. Samtidigt tävlar strippningspoly- meren, som lösts i lösningen, med det polyanjoniska gummit i membranet om katjoniska säten pá den polykat- joniska polymeren. Detta resulterar i ett vattendis- pergerbart eller företrädesvis vattenlösligt komplex av t ex polylysin och den polyanjoniska polymeren, och i association av katjonerna med gelmolekyler.

Detta steg gör membranet mottagligt för senare exponering för ett sekvesteringsmedel, vilket fullbor- dar söndringsprocessen genom att ta upp di- eller tri- valenta joner från gelen. Typiskt kan kapselmembran- 10 15 20 25 30 35 454 181 13 spillror, om sådana förekommer, vilka kvarblir i mediet lätt separeras från cellerna.

Den för närvarande föredragna lösningen för det första steget i den selektiva söndringsprocessen om- fattar l, l % kalciumklorid (vikt/volym) och mellan 500 till 1500 enheter av heparin per ml av lösning.

En volym av mikrokapslar sättes till denna lösning vil- ken är tillräcklig för att utgöra mellan ca 20 % och 30 % av suspensionens totala volym. Kalciumklorid och heparin föredrages när man söndrar membraner av cell-* innehållande kapslar, ty båda reagensen är fysiologiskt kompatibla med de flesta celler och minimerar möjlig- heten till cellskada. Blandningar av aluminiumsalter eller andra multivalenta katjoner (men inte Mg++-joner) kan även användas tillsammans med polysulfonsyrasaltet eller annat syrasalt av den typ som ovan angivits.

I allmänhet kan koncentrationen av jonerna-och anjonisk polymer i lösningen, som användes i detta steg, vidsträckt variera. Optimala koncentrationer kan lätt bestämmas empiriskt. Den lägsta fungerande koncentra- tionen för en särskild sats av inkapslade celler före- drages.

Det för närvarande föredragna sekvesteringsmedlet för utförande av den selektva söndringen är natrium- citrat, ehuru andra alkalimetallcitratsalter och alka- limetall-EDTA även kan användas. När natriumcitrat an- vändes är den optimala koncentrationen i storleksord- ningen 55 mM. När kapselmembranerna som söndras inne- häller viabel vävnad är det föredraget att citratet löses i isotonisk saltlösning, för att minimera cell- skada.

Uppfinningen kommer att ytterligare förstås från följande icke begränsande exempel.

Kapselbildning EXEMPEL 1: Inkapsling av bukspottskörtelvävnad Langerhans cellöar erhålles från råttbukspottskör- tel och sättes till en fullständig vävnadkultur (CMRL lO l5 20 25 30 35 454 181 14 -1969 Connaught Laboratories, Toronto, Canada) vid en koncentration av ca 103 cellöar per milliliter. Väv- nadskulturen innehåller alla näringsämnen som krävs för fortsatt viabilitet av cellöarna samt de aminosyror som utnyttjas av cellerna för framställning av hormo- ner. Fyra tiondelar av en milliliter av en cellössus- pension som innehåller ca 103 sättes sedan till en halv milliliter volym av 1,2 % natriumalginat (Sigma Chemical Company) i fysiologisk saltlösning. - Därpå användes en 1,5 % kalciumkloridlösning för att gela droppar i storleksordningen 300-400 um i dia- meter. Efter det att den överliggande lösningen avlägs- nats genom aspiration överföres de gelade dropparna till en bägare, som innehåller 15 ml av en lösning, vilken omfattar en del av en 2 % 2-(cyklohexylamino)- etansulfonsyra-buffertlösning i 0,6 % NaCl (isotonisk, pH = 8,2) utspädd med 20 delar l % CaCl2. Efter 3 min av nedsänkning tvättas kapslarna 2 gånger i l % CaC12. cellöar per milliliter Kapslarna överföres sedan till en 32 ml lösning, som innehåller l/80 av l % polylysin (medelmolekylvikt 35 000 amu) i fysiologisk saltlösning. Efter 3 min de- kanteras polylysinlösningen. Kapslarna tvättas med 1 % CaCl2 och återsuspenderas eventuellt under 3 min i en lösning av polyetylenimin (molekylvikt 40 000-60 000) vilken framställts genom utspädning av en 3,3 % förràds- lösning av polyetylenimin i morfolinopropansulfonsyra- buffert (0,2M, pH = 6) med tillräckligt l % CaCl2 för att ge en slutlig polymerkoncentration av 0,12 %. De resulterande kapslarna, med "permanenta" semipermeabla membraner, tvättas sedan två gånger med l % CaCl2, 2 gånger med fysiologisk saltlösning och blandas med lO ml av 0,12 % alginsyralösning.

Kapslarna motstàr klumpning och kan ses innehålla Langerhans cellöar. Gel på insidan av kapslarna återför- vätskas genom nedsänkning av kapslarna i en blandning 10 15 20 25 30 35 454 181 15 av saltlösning och citratbuffert (pH 7,4) under 5 min.

Till sist suspenderas kapslarna i CMRL-69 medium.

Under mikroskop observeras dessa kapslar omfatta ett tunt membran, vilket omger en cellö inom vilken individuella celler kan ses. Molekyler med en molekyl- vikt upp till ca 100 000 kan genomkorsa membranerna.

Detta tillåter syre, aminosyror, näringsämnen och plas- makomponenter som användes i kulturmedier (t ex fetala kalvserumkomponenter) med làg molekylvikt, att nå cell- öarna och tillåter att insulin kan avsöndras. - EXEMPEL 2: Inkapsling av hepatocyter Förfarandet enligt exempel l upprepades med undan- tag för att 0,5 ml av en levercellsuspension, som inne- höll ca 105 celler per milliliter, användes istället för 0,4 ml cellösuspensionen. Levercellernas pågående viabilitet pàvisades genom färguteslutningstekniken (uteslutning av tryptanblàtt) och genom deras obser- verade förmåga att kontinuerligt alstra urinämne. Det är känt att levervävnad, in vitro, kan inta toxiner fràn sin omgivning. Följaktligen avgiftar cellerna to- xiner med en molekylvikt som är tillräckligt làg för att passera genom de semipermeabla membranerna.

EXEMPEL 3: Inkapsling av aktivt kol Förfarandet enligt exempel l upprepas med undantag för att partikelformigt aktivt kol suspenderas direkt i natriumalginatlösningen, den halva millitern av väv- nadssuspension uteslutes och polylysin med en medel- molekylvikt av 35 000 användes som ett tvärbindnings- medel. Så länge som kolpartiklarna är mindre än den minsta innerdiametern hos kapillären som användes för att alstra dropparna erhålles kol med hög ytarea omgivet av ett semipermeabelt membran. Dessa hindrar effektivt flykt av kolspàn eller koldamm, och kan ändå användas för att absorbera material med något förut utvalt mole- kylviktsomràde från fluidum som passerar genom kapslar- nä. 10 15 20 25 30 35 454 181 16 EXEMPEL 4: Inkapsling av humana fibroblaster Humana fibroblaster, erhållna genom behandling av human förhudsvävnad med trypsin och EDTA under S min vid 37°C på känt sätt, suspenderas i ett fullstän- digt odlingsmedium (CMLR 1969, Connaught Laboratories) utökat med 40 % (vol/vol) av renat_fetalt kalvserum, 0,8 % natriumalginat (Sigma) och 200 mg/ml renat kalv- skinnskollagen. Cellsuspensionens täthet är ca 1,5 x 10 celler/ml. De temporära alginatkapslarna bildas såsom ovan angivits. Semipermeabla membraner avsättes i kaps= larnas ytskikt genom suspendering av dem i en 0,005 % (vikt/vol) vattenhaltig lösning av poly L lysin, (mole- kylvikt 43 000 dalton) under 3 min.

De resulterande kapslarna suspenderas i CMLR-1969, utökat med 10 % fetalt kalvserum. De föregående stegen utföres alla vid 37°c. after inkubation via samma tem- 7 peratur finner man att kapslarna, om de undersökes under mikroskop, innehåller fibroblaster, vilka har undergátt mitos och uppvisar tredimensionell fibroblastisk morfo- logi inom mikrokapslarna.

Selektiv söndrig av membranerna EXEMPEL 5 Mikrokapslar från något av exemplen l-4 kan behand- las enligt följande för att selektivt söndra kapselmem- branerna utan att skada det inkapslade kärnmaterialet. 10 ml portioner av mikrokapselsuspensioner, som innehåller ca 500-5000 kapslar per ml, får avsätta sig och suspensionsmediet avlägsnas genom aspiration. Kaps- larna tvättas 2 gånger med Sèltlösning. De tvättade kapslarna blandas sedan med en 3,0 ml alikvot av salt- lösning, som innehåller heparin i varierande koncentra- tioner såsom nedan kommer att anges och l,l % vikt/vol CaCl2. Kapslar som har alginat inneslutet däri uppvisar, efter det att detta steg fullbordats, en_ge1ad, formbe- varande inre kärna. Suspensionen omröres vid 37°C i 10 min, varefter kapslarna får avsätta sig, det överlig- u 10 15 20 25 30 35 454 181 l7 lande lagret avlägsnas genom aspiration och kapslar- na tvättas två gånger med 3,0 ml av 0,15 M NaCl. Efter aspiration av den andra tvättlösningen blandas kapslar- na med 2,0 ml av en blandad lösning, som innehåller lika volymer av ll0 mn natriumcitrat och 0,15 M NaCl pH = 7,4).

Kapselmembraner, som hade behandlats med 1000 en- heter/ml heparin och virvlats i NaCl-Na-citratlösning under 1 min var fullständigt desintegrerade. Samma resul- tat uppnås med kapslar som behandlats med 2000 enheteryml heparin under 2 min, efterföljt av 15-30 s av handvirv- ling. Lägre koncentrationer av heparin föredrages efter- som möjligheten till cellskada minskas. Efter upplös- ning av membranerna kan varje membranspillra avlägsnas genom aspiration och tvättning. Efter det att de fri- gjorda cellerna ätersuspenderats i kulturmediet kan de testas genom uteslutningstekniken med användning av färgen tryptanblàtt och man kommer att finna att de är i ett tillstånd av god hälsa och viabilitet, var- vid endast relativt få celler uppvisar färgupptagning.

EXEMPEL 6 Kapslar framställda i enlighet med exempel 3 be- _handlas, efter tvättning, med en 3,0 ml lösning, som innehåller 1000 enheter/ml heparin och 1,0 % AlCl3 under 6 min under omröring. Efter aspiration av det överlig- gande lagret frigöres kärnmaterialet genom virvling av kapslarna med en 0,lM lösning av natriumcitrat under 30-90 s.

EXEMPEL 7 Sättet enligt exempel 6 upprepas med undantag för att 0,lOM EDTA (natriumform) vid ett pH av 7,0 användes istället för natriumcitratet, vilket ger en snabb söndring av kapselmembranerna.

EXEMPEL 8 Kapslar framställda i enlighet med exempel 3 be- handlas, efter tvättning, med en 3,0 ml vattenhaltig 454 181 18 lösning som innehåller 10 mg/ml av polyvinylsulfat (mo- lekylvikt ca 50 000 dalton) och 1 % CaCl2. Efterbehand- ling med 0,10 M natriumcitrat ger en väsentligen full- ständig upplösning av kapslarna.

Andra utföringsformer är inom följande patentkravs skyddsomfàng. 9.5

Claims (14)

10 15 20 25 30 35 454 181 19 PATENTKRAV

1. l. Sätt att söndra ett permeabelt kapselmembran, för frisättning av ett inkapslat material, varvid kapselmembranet omfattar en matris av en polykatjonisk polymer och en polyanjonisk polymer, vilka polymerer är bundna till varandra genom saltbryggor mellan de anjoniska och katjoniska grupperna; k ä n n e t e c k n a t därav, A. att membranet exponeras för en lösning av polyvalenta katjoner och en polyanjonisk strippnings- polymer som har tillräcklig laddning för att söndra saltbryggorna; B. att katjonerna tillåtes tävla med den po1ykat~ joniska polymeren om anjoniska säten på den polyanjo- niska polymeren, och att den polyanjoniska strippnings- polymeren tillâtes tävla med den polyanjoniska polyme- ren om katjoniska säten på den polykatjoniska polyme- och C. att katjoner associerade med den polyanjoniska ren; polymeren avskiljes efter steg B.

2. Sätt enligt kravet 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att avskíljningssteget (C) utföres genom expo- nering av membranerna för en lösning som innehåller ett kelateringsmedel.

3. Sätt enligt kravet 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att kelateringsmedlet väljes bland citratjoner och EDTA-joner.

4. Sätt enligt något av kraven 1-3, k ä n n e - t e c k n a t därav,_att den polykatjoniska polyme- ren omfattar en màngfald aminogrupper.

5. Sätt enligt kravet 4, k ä n n e t e c k n a t därav, att den polyanjoniska polymeren omfattar ett surt, vattenlösligt gummi.

6. Sätt enligt kravet 5, k ä n n e t e c k n a t därav, att den polykatjoniska polymeren omfattar ett alginat. 10 15 20 25 30 35 454 181 20 _ e

7. Sätt enligt kravet 4, k ä n n e t e c k n a t därav, att strippningspolymeren omfattar heparin och att katjonerna i lösning omfattar Ca++.

8. Sätt enligt något av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t därav, att den polykatjoniska polymeren väljes bland: a) proteiner med ett flertal aminosyraenheter som har fria aminogrupper; b) proteiner med ett flertal aminosyraenheter * som har fria iminogrupper; c) polypeptider med ett flertal aminosyraenheter som har fria aminogrupper; d) polypeptider med ett flertal aminosyraenheter som har iminogrupper; ' e) polyvinylaminer; f) polyetyleniminer; g) polyetylenaminer; och h) blandningar därav.

9. Sätt enligt kravet 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att strippningspolymeren väljes bland: a) polysulfonsyror; b) polyfosforsyror; c) salter därav; och d) blandningar därav.

10. Sätt enligt något av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t därav, att strippningspoly- meren är en polymer med polysulfonsyrasaltgrupper.

11. ll. Sätt enligt något av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t därav, att en polykatjonisk strippningspolymer som har en högre laddningstäthet än laddningstätheten hos kapselmembranets polyanjoniska polymer, användes.

12. Sätt enligt kravet 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att kapselmembranet avgränsar en mikrokapsel som innehåller en eller flera levande celler.

13. Sätt enligt kravet 12, k ä n n e t e c k - n a t- därav, att den polykatjoniska polymeren omfattar 10 454 181 21 ett protein, att det vattenlösliga gummit omfattar natriumalginat, att katjonerna i lösning omfattar kalcium och att den polyanjoniska strippningspolymeren omfattar heparin.

14. Sätt enligt kravet 13, k ä n n e t e c k n a t därav, att avskiljningssteget utföres med citrat löst i en lösning som är fysiologiskt kompatibel med cellen eller cellerna.