JPS59500350A - ビ−ドポリマ−による生物学的物質のカプセル化法 - Google Patents
ビ−ドポリマ−による生物学的物質のカプセル化法Info
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- JPS59500350A JPS59500350A JP58500933A JP50093383A JPS59500350A JP S59500350 A JPS59500350 A JP S59500350A JP 58500933 A JP58500933 A JP 58500933A JP 50093383 A JP50093383 A JP 50093383A JP S59500350 A JPS59500350 A JP S59500350A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ビードポリマーによる生物学的
物質のカプセル化法
、本発明は、動物細胞、植物細胞、バクテリア、海藻類、真菌類、ビールス又は
蛋白質の如き生物学的物質をビードポリマーでカプセル化することにより固定化
する方法に係る。
近年、生物学的物質の固定化に可成りの興味が抱かれて来た。生物学的物質をカ
プセル化するために使用される最も普通のポリマーはアルギン酸塩、ポリアクリ
ルアミド、カラギーナン、寒天又はアガロースである。これらの内で、球状のカ
プセル封入体を容易に製造L 得るのはアルギン酸塩とカラギーナンだけである
。
このカブ−ピル封入は親イオン性ゲル化によって、即ちアルギン酸塩の場合には
カルシウム溶液中に、又カラギーナンの場合にはカリウム溶液中に滴下すること
により行われる。しかしながら、この方法の場合には1例比較的大径(直径2〜
3mm)のビード即ち滴状体であって、イオン(それぞれカルシウム及びカリウ
ムイオン)の存在する場合にのみ安定なビードが得られる。
寒天、アガロース、コラーゲン、ポリアクリルアミド、ゼラチン又はフイブリノ
ゲンの使用される場合に、生物学的物質は通常これらポリマー又はポリマー溶、
夜と混合v#、次いで該ポリマーがゲル化される。適当な寸法のものを得るため
に、このゲルは分断され、場合により安定性を高めるために更に架橋反応に付さ
れる。
このようにして製造された調製物の場合には、分1j+処理中に生起するカプセ
ル封入物質の漏洩損失があり、且つその異類混交に基因しカラム処理に際して流
動・主の低いことが見出された。
酵素なカプセル封入した球状ポリアクリルアミドは、酵素及び触媒と共に疎水性
相中にモノマー溶液2公散ぎせる、ビード重合法により製造することができる(
スエーデン国特許第7204481−1号明細筈参照)。この疎水性相は有機溶
媒(トルエン+クロロホルムにより代表される)と乳化剤とを包含している。こ
れらの溶媒及び乳化剤は共に変性作用’1−1ii”するので、この方法は比較
的活′注の低い物質に関して適するて過ぎない。
従って、球状ポリマー粒子製造用であって更に穏やかな分散媒体が強く要望され
て来た。本発明は、有機溶媒を、次の分散媒体即ち動物性又は植物性の飽和又は
不飽和油脂、トリーn−ブチルホスフェート、液状シリコーン、パラフィン油及
びフタル酸ジブチルエステルの何れかに変えるならば、活性を宥する生物学的物
質をその生存能力を完全に維持し、生長可能性を維持した侭でカプセル化し得る
ことを開示するものである。これら分散媒体の内の成る種のものは、球状ポリマ
ー粒子の製造に従来から使用されて来た。米国特許第4169804号明細書に
は、アルブミン溶液を植物油中に分散させ次いで】40°Cに加熱するか或いは
アルブミンポリマーをアルデヒドにより架橋させて磁性微小球体テ製)貴する方
法が開示すねている。しかしながらこの技術的方策:・ま感性乃至活性を有する
生物学的物質のカプセル封入に使用することは出来ない、何故ならば高温処理或
いはアルデヒドによる架橋処理の何れも生物学的物質の不活性化を招くからであ
る。
文献[バイオテクノロジー、レターズXVBiotechnologyTJtt
erS“」第3巻第65〜70頁、1981年には、パラフィン油中にポリウレ
タンモノマーを分散させることにより球状ポリウレタン粒子を製造する方法が記
載されている。この文献によれば、モノマー混合物中にバクテリアを包含させる
ことにより、接触活性を育する調製物が得られる(バクテリアがその増殖性を維
持しているか否かシま疑わしく、更にバクテリアが担体に共有結合されるに至っ
ている虞れが高いが)。他方、これらの穏和な分散媒体を固定化法に使用される
適宜の担体と組合せることにより、本明細書に記述されるように、生存率が10
0%であり生長可能性が維持された調製物が得られるのである。寒天によりカプ
セル化法された植物細胞に関する、種々の分散媒体(でよる変性作用ル至効果に
ついては表1に比較して示されている。
この表から、これら分散媒体が通例の球状ポリマー粒子製造用の標準法(スエー
デン国特許第7204481−1号明細書ンにおいて使用される媒体と比較して
生存能力を維持するものであることが理解されよう。表2には、この関係をポリ
アクリルアミドによりカプセル化された酵母に適用した場合も示されている。
分散媒体と共に用いられるポリマーは生物学的物質の活性に基いて選択される。
成る種の蛋白質のような不活性物質は、ポリマーによりカプセル化された後、ホ
ルムアルデヒドでポリマーに共有結合されることができ、この方法は殊疋ポリマ
ーがゼラチンやチトサンの場合に適用される。酵母細胞のように瓦較的高い活性
を■する生物学的物質は生存能力を維持しつつポリアクリルアミドでカプセル化
することができる。tlF+細胞、海藻項又は動物細胞のように活性の更に高い
系については、寒天、アガロース、カラギーナン、ゼラチン、コラーゲン又はフ
ィブリンのポリマーで有効にカプセル化される。
動物細胞には互いに異なる主として2型式の細胞即ち浮懸型細胞と面依存型細胞
とがある。面依存型細胞は生存し及び生長するためには面知附着していなければ
ならない。本発明において、フラーゲン又(・まフィブリンにより形成される繊
維質体が、必要とぎれる上記の面として使用され、この結果として面依存型@物
細胞がカプセル化条件下で生存及び生長可能となる。面依存型細胞は、アガロー
スでカプセル化する場合には生長することはできないが、アガロースをフィブリ
ン又はコラーゲンと混合することにより面依存型細胞のカプセル化用ポリマーと
してアガロースを匝用することもできる。浮懸型動物細胞に関してはこのような
要件は存在せず、従ってアガロース、5” 7’−’−ゲン又はフィブリンを粗
し・てカプセル化し、生存性を維持し生長させることができろ。動物細胞の潜在
的利用分野は極めて多岐に亘るので(ワクチン、蛋白又はホルモンの製造及び各
種前駆体の変換〕、大規模に使用され得るシステムを開発することが重要である
。
カプセル封入された動物細胞は、遊場細胞と比較すると、製造技術の観点から多
くの利点を有する。例えばカプセル封入された動物細胞はカラム処理法で容易に
製造でき、又他の反応形式と比較する場合にも連続製箔に容易に適合ぎせ得る点
で有利である。
生物学的物質をカプセル封入して形成2gるビードの寸法は、ポリマー溶液を分
散きせる分散力に応じて広汎な制限範囲内で変えることができる。
例1(寒天又はアガロースを使用)
加熱により寒天又はアガロースを水中に溶解させる(5.6%W/V ) Oこ
のポリ々−溶g (s ml、ンを50°Cの温度になし植物細胞(2グ)と混
合し、次(・で大豆油(40rnl)中に分散させる。適当な寸法のビードが形
成されたならば、混合物を5°Cに冷却し、ビート−を水洗加熱によりカラギー
ナンを0.9%NaCl溶液中に溶解ぎせる(3.1%V■)。例1記載の方法
でビードを製造する。
0、I M HAc / 0.’l M NaAc混合溶液中にチトサンを溶解
でせる。このポリマー・溶液(8rTf!、)を酵母細胞(2nl)又は酵素(
パーオキシダーゼ10 my / ml、2m7りと混合し、次いで大豆油(4
oy)中に分散だせてホルムアルデヒド(37%w/v溶孜、2.2 d )を
添3JOシ、その後30分間に亘り攪拌する。架橋反応により形成されたビード
を水洗する。
アクリルアミド(17,6t )とビスアクリルアミド(]、2 f )とをト
リス緩衝液(100m1%、 0.05 M 、、pH7)中に溶解ぎせる。こ
のモノマー溶液(8ml)を酵母細胞又は酵素(パーオキシダーゼ、10刃/−
12d )及び過硫酸アンモニウム40.4 S’/ml、 20μt)と混合
して大豆油(40+r、、g)中に分散させる。ビード寸法が適当な大きざにな
った際にTEMED (100μl)を添加する。重合形成されたビードを水洗
する。
例5(ゼラチンを使用)
ゼラチン(15%W、/V )を加熱により水に溶解ぎせる。
このポリマー溶液を37°Cの温度となし、酵母細胞(2−)と混合し、次いで
大豆油(40rnl )中に分散ぎせる。
15 、”Cに冷却した後に、ビードを水洗する。
例6(ゼラチンカプセル)
ゼラチン(15%w/v )を燐酸塩緩衝液(0,1M、 pH8〕中に溶解さ
せる。このポリマー溶液(8Tnl)ヲ37°Cの温度とし細胞(植物細胞2f
?〕と混合し、次いで水溶゛注架橋剤(トルエンジイソシアナート、2.5%W
/V)を含有する大豆油(40qu!、 )中に分散させ、30分間後に得られ
ろビードを水洗する。37°Cに加熱すると、架橋反応しなかったゼラチンは溶
液fヒして完全なシェル状物を残存ぎせるっこのようにして固定化された植物細
胞は架橋剤により影響を受けず、呼吸作用に関連して95%に達する生存率ご有
する。
例7(フィブリ/ケンを使用)
フイブリノゲン溶液(1ゴ、2%W7”V )をフイブリノゲン緩衝液(1nl
)及び牛胎児血清(0,31nl)と混合する。次いで動物細胞(0,7ml
)及びトロンビン(1,50)とを添加する。得られた混合物をパラフィン油(
40rll )中に分散させ、15分後に生成ビードを培養媒体で洗浄し、カプ
セル封入【ヒ細胞テ37°Cで培養した。
例8
加熱によりアガローゼをPBS (s%w/v)中に溶解させる。このポリマー
溶4g (s mJ )を37゛Cとし、動物細胞(57)と混合し、次いでパ
ラフィン油(40+nl)中に分散させる。冷却後、生成するビードを培養媒体
で洗浄し、カプセル封入化細胞を37°Cで培養する。
例9
コラーゲン2希塩酸中に溶解ぎせる。このポリマー溶液(5°Cに冷却されたも
の、2艷)と、10倍容の媒体i pHを中性化する水酸化す) IJウム溶液
及び動物細胞(2yd)と混合する。該混合q#をパラフィン油(40−)中に
分散ぎせる。37°Cに混合物を加熱してゲル化ぎせ、得られるビーFを培養媒
体で洗謬し、カプセル封入化細胞を37℃で培養する。
表 1
寒天でカプセル封入化された植物細胞の呼吸作用に関する疎水性相の作用
犬 豆 油 100
トリーn−ブチルホスフェート 100フタル酸ジブチルエステル 82
ポリアクリルアミドによりカプセル封入された酵母細胞に関する疎水性相の作用
大 豆 油 100
国際調査報告
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)ビードポリマーによりカフ“セル化することにより動物細胞、植物細胞、 バクテリア、海藻類、真菌類、ビールス又:・マ蛋白質の如き生物学的物質を固 定化する水溶液に添加され、該ポリマー又はモノマーがゲル化され、次いで該ポ リマー又はモノマー水溶液が水に溶解しない穏和な分散媒体中に分散されること を特徴とする方法。 (2、特許請求の範囲第1項に記載の方法において、水溶性でない穏和な分散媒 体として植物性又は動物性の飽和又は不飽和油脂、)!J−n−ブチルホスフェ ート、液状シリコーン、パラフィン油又はフタル酸ジブチルエステルが使用され ることを特徴とする方法。 (3)特許請求の範囲第1又は2項に記載の方法においリマーが用いられること を特徴とする方法。 (4)特許請求の範囲第3項に記載の方法において、ポリマーが殊に寒天、アガ ローズ、カラy−ナン、チトサン、ゼラチン、コラーゲン及びフイブリノゲンか ら選択されたものであることな特徴とする方法。 (5)特許請求の範囲第1〜4項の何れか1つ((記載の方法において、冷却、 架橋化1.中和後の加熱又は酵素の作用((よりポリマーがゲル化されることを 特徴とする方法。 (6)特許請求の範囲第1又は2項て記載の方法において、七ツマ−としてアク リルモノマーが使用され且つ触媒の添加によりゲル化されることご特徴とする方 法。 (7)特許請求の範囲第1〜6項の何れか1つに記載の方法において、動物細胞 、植物細胞、バクテリア、海藻類、真菌類、ビールス又は蛋白質が生物学的物質 として使用されることを特徴とする方法。 (8)特許請求の範囲第1〜7項の何れか1つに記載の方法において、粒子寸法 が0.05〜3 mm 、好ましくは0.1〜1.0朋のビードか得られたとき に分散処理を終了することな特徴とする方法。 (9)動物細胞、植物細胞、バクテリア、海藻類、真菌類、ビールス又は蛋白質 の如き固定比された生物学的物質であって、生存状態であり生長可能性の維持さ れた生物学的物質がビードポリマーによりカプセル化されており、これが水に溶 解しない穏和な溶媒中に分散して調製されたものであることを特徴とする、固定 化された生物学的物質。
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