JPS59205985A - 細胞により産生される非分泌物質の回収方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、細胞により産生される生物学的物質の精製方
法に関するものである。さらに詳細には、本発明は、細
胞により産生されかつ多数の望ましくない高分子量汚染
物を含有しない非分泌物質の取方法に関するものである
。

細胞生物学の通歩は、多数の生物学的活性物質の濃度が
外囲媒体におけるよりも細胞の内部において実質的に大
きいことを示している。これらの物質は、それらの分子
量、電荷又はその他の理由により細胞膜を通して容易に
移動されないか或いは簡単には細胞により分泌されない
。これら産生物の回収方法は、細胞膜の破壊又は溶解を
必要とする。細胞溶解の際、媒体は細胞断片及び望まし
くない高分子量汚染物により汚染される。非分泌物質の
濃度は細胞成分の全濃度に対比して比較的小さいので、
興味ある物質の回収は困難である。

本明細書中に使用する「非分泌物質」という用語は、細
胞内で回収可能な多量にて産生され、分泌されないか或
は分泌されてもほんの一部である物質を意味する。

関連する問題は、細胞溶解の際の細胞からのパイロジエ
ン、すなわち、発熱誘発物質の放出である。多くの原始
核細菌、特にダラム陰性エンテロバクテリヤは、発熱性
の内毒素を生成する。これらのダラム陰性細菌、たとえ
ばイー・コリ、バチルス及びシュードモナスはＤＮＡ組
換技術において使用される基本的細菌であるため、これ
ら細菌により生成される発熱性内毒素は重大な問題であ
る。これらの発熱性物質は、主として５　Ｘ　１０Ｓダ
ルトンより大きい分子量を有する脂性多糖類である。興
味ある多くの酵素及びその他の非分泌物質はパイロジエ
ンよりも小さい分子鎖を有し、したがって細胞溶解の際
に放出される汚染物の分子篩法か精製及び回収の助けと
なる。

米国特許第４．４０９．５５　ｆ号公報は、細胞により
産生される物質の製造方法を開示している。さらに詳細
には、この特許公報は、細胞により分泌される低分子量
物質がマイクルカプセルの半透膜を通過して拡散しかつ
最少量の汚染物と共にカプセル外の媒体中に回収しうる
こと、並びに細胞により分泌される高分子量物質がマイ
クロカプセル内に捕獲されて、細胞を溶解させることな
くカプセル膜の破壊によって回収しうろことを開示して
いる。

本発明の目的は、汚染物を実質的に含有しない非分泌物
質の回収方法を提供することである。本発明の他の目的
は、パイルジエン生成微生物からの非分泌物質の実質的
にパイロジエンを含まない回収方法を提供することであ
る。さらに他の目的は、包囲マイクロカプセルの膜を破
壊することなくカプセル化細胞の細胞膜を溶解させる方
法を提供することである。さらに他の本発明の目的は、
遺伝学的に改変した細菌から低分子量の非分泌物質を回
収する方法を提供することである。

本発明のこれら及びその他の目的及び特徴は、以下の記
載及び添付図面から明らかとなるであろう０ 発明の要約 本発明は、低濃度の高分子量汚染物と高特異活性とを有
する粗度生物として細胞により産生される非分泌物質の
回収方法を提供する。本発明は、天然若しくは遺伝学的
に改変したパイルジエン生成細菌により産生される低分
子量の非分泌物質を回収するのに特に有用である。本発
明の方法は、興味ある低分子量物質を急速に通過させう
るが、望ましくない高分子量汚染物の通過を阻止又は防
止するような透過性を有する膜の内部に細胞をカプセル
化する工程を含む。カプセル化された細胞を水性培地中
に懸濁させて、カプセル化膜内にて代鉗と細胞増殖と有
糸分裂とを行わせる。カプセル容積を実質的に満たすよ
う増殖するが、マイクロカプセル膜を破裂しないような
細胞コロニーを形成させる。次いで、ａＩ胞膜をカプセ
ル膜の破壊なしに溶解させ、かつ興味ある物質をカプセ
ル膜を通して外囲のカプセル外流体中に拡散させ、ここ
で粗度生物として回収する。細胞膜を溶解させる好適手
段は、カプセル膜を破壊しない表面活性剤にカプセルを
懸濁させることである。

天然又は遺伝学的に改変した原始核細胞が、本方法で使
用するのに好適な細胞である。何故なら、本方歩はパイ
ロジエン生成細胞により産生される物質を回収するのに
特に有用であるからである。

たとえば、内毒素のような高分子量パイロジエンの大部
分はカプセル内に残留する一方、低分子量物質はカプセ
ル膜の細孔を通して急速に拡散する。

膜の細孔は迷路からなり、興味ある低分子量物質は膜を
通過しうるが、望ましくない高分子量汚染物を阻止する
。

説明 最も広義の態様では、本発明は細胞断片、核酸、多糖類
、脂質及び蛋白質を含む高分子量の汚染物を半透膜の内
側に保持すると共に非分泌の比較的低分子量の物質を膜
に通して拡散させることによる、細胞により産生された
非分泌物質の特に精製された状態における回収方法を特
徴とする。

本方法は、強力な汚染物の分子量よりも小さい分子量を
有する興味ある物質を産生ずる任意の細胞系に応用する
ことができる。この方法は、天然若しくは遺伝学的に改
変したいずれかの原始核細胞を非分泌物質の源泉として
培養するのに特に適している。原始核細胞に対する栄養
要求は、主として、半透膜を通過して容易に移動し細胞
増殖と有糸分裂とを容易化させて興味ある物質を多餓に
産生させる低分子量の分子である。細胞コロニーは、カ
プセルを実質的に満たすがカプセル膜を破壊しないよう
な程度まで増殖する。

上記したように、組換ＤＮＡ技術の殆どはダラム陰性エ
ンテロバクテリヤを宿主生物として使用してきた。これ
ら細菌の多くは、細胞溶解の際に放出される発熱性の内
毒素を生成する。これら発熱性培養物により産生される
興味ある物質を使用しうる形態で得るためには、一般に
パイロジエンを除失せねばならない。はぼ全てのパイロ
ジエンは５Ｘ１０４ダルトンより大きい分子量を有する
。

したがって、分子量の逆関数である速度で分子の移動を
可能にするか、或いは高分子量汚染物を通過させないよ
、うな透過性を有する半透膜は、低分子量産生物の精製
を著しく促進することができる。

本発明の他の有利な面は、培養物の無菌性を維持しかつ
それにより培養物若しくは産生物の汚染の可能性を減少
させるのが容易な・ことである。細胞により産生される
物質の量は極めて少量であるため、培養物の汚染が主た
る問題となる。カプセル化は、汚染に対する物理的バリ
ヤを与える。

本方法は、細胞による産生される物質特に比較的低分子
慰物質の広範な種類に応用することができる。この方法
により除去しうるパイロジエンの例は、たとえばイー・
コリにより生成されるｎｄ質蛋白質のような内毒素を包
含する。本方法の効果に対する１つの制約は、興味ある
物質が排除しようとするパイロジエン若しくはその他の
汚染物よりも小さい分子量をもたねばならないことであ
る。

本発明の方法は、一部において、持続生存性に悪影響を
与えることなく細胞を半透膜内にカプセル化しつる能力
に依存する。１つの好適なカプセル化技術を以下詳細に
示す。

細胞のカプセル化 次のマイクルカプセル化技術を順次に使用して、生存細
胞培養物を生成させた。細胞培養物の持続生存性は、充
分な栄養分と酸素とがカプセル化膜を通して移動するこ
とを必要とする。さらに、マイク四カプセル膜は汚染性
細菌を培養物から排除する。カプセル膜は、細胞生存性
に影響を与えないｐＨ条件で形成させねばならない。マ
イクロカプセルはその寸法を広く変化させうるが、１０
０〜１０００ミクロンの範囲のカプセルにより最良の結
果が得られた。

細胞をカプセル化するには、この細胞と生理学的に適合
しかつ水溶性にしりる水溶性物質が個々の細胞又は細胞
群の周囲に形状保持性の凝集塊すなわち「一時的マトリ
ックス」を形成する。次１）で、この「一時的マトリッ
クス」を処理して、より永続性の半透膜を細胞の周囲に
沈着させると共に、細胞生存性を確保することができる
。水溶性物質は典型的には０．５〜２％の程度で塩水中
の細胞の懸濁物に加えられ、得られた混合物を液滴に成
形する。これら液滴を水不溶性にしかつゲル化させて、
一時的マトリックスを形成する。この−詩的マトリック
スには、より永続性のカプセル膜を設け、好ましくは水
溶性物質が液体となるような条件を確立してカブ七ル内
部を再液化させる。

再液化工程は、栄養分の物質移動と細胞増殖とを可能に
する。

一時的マトリックスを形成させるのに使用する物質は任
意の非毒性かつ水溶性物質とすることができ、これはイ
オン環境若しくは濃度の変化により形状保持°酢物質に
変換することができる。さらに、この物質は複数の容易
にイオン化されるアニオン成分、たとえばカルボキシル
基を含有すべきであり、これらは複数のカチオン性基を
有する重合体と塩形成により反応することができる。下
記に説明するように、この種の物質の使用は透過性の選
択上限を有する永続性カプセル膜を難なく一時的マトリ
ックスの表面層へ沈着させることを可能にする。

一時的マトリックスを形成させるための現在好適な物質
は、酸性かつ水溶性の天然若しくは合成多糖類重合体若
しくはガムである。この種の物質は市販されている。こ
れらは典型的には植物材料から抽出され、しばしば各種
食品に対する添加物として使用される。アルギン酸ナト
リウムが現在好適な水溶性ガムである。１５０，０００
＋ダルトンの範囲の分子量を有するアルギン酸塩を使用
しうるが、その分子寸法及び粘度のため一般に最終成形
されたカプセル膜を透過することができない。

それより低い分子量のアルギン酸塩、たとえば５０．０
００〜８０，０００ダルトンのものは、充分な多孔度を
有する膜を通しての拡散によりカプセル内容積から容易
に除去されるので好適である。

他の使用しうる重合体はグアヤガム、カラギーナン、ペ
クチン、トラガヵントガム又はキサンタンガムの酸性７
ラクシヨンを包含する。

これら物質はグリコシド結合した糖類連鎖からなってい
る。それらの遊離酸基は、しばしばアルカリ金属イオン
、たとえばナトリウム型で存在する。たとえばカルシウ
ム若しくはアルミニウムのような多価イ、オンをアルカ
リ金属イオンと交換する場合、水溶性多糖類分子が「架
橋」されて水溶性の形状保持性ゲルを形成し、このゲル
はイオン交換又は金属イオン封鎖剤による多価イオンの
除去の際に再可溶化することができる。酸性ガムと塩を
生成しうるほぼ全ての多価イオンを使用しうるが、生理
学的に適合するイオン、たとえばカルシウムを使用する
のが好適である。これは、組織を生存状態で保持する傾
向を有する。その他の多価カチオンも使用しうるが、マ
グネシウムイオンはアルギン酸ナトリウムをゲル化させ
る際に有効でないことが判明した。

マイクロカプセルを形成させる典型的なプロトコールは
、先ず生理食塩水における選択重合体の０．５〜２．５
％（ｗ／ｖ　’）溶液に細胞を懸濁させることを含む。

アルギン酸ナトリウムを使用する場合、０．６〜２．４
％（ｗ／ｖ）溶液を使用して成功を収めた。次いで、細
胞を含有する重合体溶液を所望寸法の液滴に成形し、そ
してこれら液滴を直ちにゲル化させて形状保持性の物質
、たとえば必らずしも必要ではないが好ましくは球状又
は長球状に成形する。この液滴の形成は、たとえば次の
例のような公知方法により行なうことができる。

多価カチオンの水溶液、たとえば１５％ＣａＣ１２（、
／ｖ）溶液を含有するチューブに、液滴形成装置を備え
たストッパを装着する。この装置は上部空気流入ノズル
を有するハウジングと、ストツノぐに摩擦嵌入させた長
形中空体とからなっている。

ステップポンプを備えた１０ＣＣのシリンジにはノＡウ
ジングの上部にて針（たとえば内径α０１インチのテフ
ロン被覆針）を取付け、これを７１ウジングの長手方向
に貫通させる。ハウジングの内部は、針の先端がエアナ
イフとして作用する一定の空気層流を受けるように設計
する。使用に際し、カプセル化すべき物質を含有する溶
液を満たしたシリンジを用い、ステップポンプを作動さ
せて溶液の液滴を針の先端から段階的に押出す。各液滴
は空気流により「切断」されかつ約２．５鋸落下してＣ
ａＣｌ２溶液中に入り、ここで直ちにカルシウムイオン
の吸収によってゲル化される。針の先端とＣａＣｌ２溶
液の表面との間隔は、この場合アルギン酸ナトリウム／
細ｆ！懸濁物が最も物理的に好適な形状、すなわち球（
最小表面積に対する最大容積）となりうるのに充分な大
きさである。チューブ内の空気は、ストッパにおける開
口部から流出する。この過程はゲルの「架橋」を生ぜし
め、かつ懸濁組織とその媒体どを含有する高粘度がっ形
状保持性の一時的保護マ）　ＩＪタックス形成する。

これらマトリックスは溶液中に分離相として集まり、吸
引によって分離することができる。

次の工稈において、表面層を「架橋」させることにより
一時的マトリックスの表面の周囲に半透膜を沈着させる
。これは、ゲル化した一時的マトリックスをゲル分子に
おけるアニオン性官能基と反応性のカチオ・ン性基を有
する重合体の水溶液に露呈させて行なうことができる。

たとえば遊げｆイミン若しくはアミン基のような酸性反
応基を有する重合体が好適である。この状況において、
多糖類ガムは、カルボキシル基とイミン若しくはアミン
基との間の相互作用（塩結合形成）により架橋される。

透過性は、使用する架橋性重合体の分子１ｕを選択しか
つ重合体溶液の濃度と露呈時間とを調整することにより
所定範囲内に制御することができる。低分子量を有する
重合体の溶液は、所定時間内に、高分子量重合体よりも
深く一時的カプセル中へ浸透する。架橋剤の浸透程度は
、得られる透過性と相関した。一般に、分子量が高くが
っ浸透度が小さい程、孔の大きさは大となる。広鵜にお
いて、４０００〜１００．０００ダルトン若しくはそれ
以上の分子量範囲の重合体を、反応の持続時間、重合体
溶液の濃度及び所望の透過度に応じて使用することがで
きる。平均分子量約３５，０００ダルトンのポリリジン
を使用する場合、一群の好適な反応条件は、１０１６７
％のポリリジンを含有する生理食塩水溶液を攪拌しなが
ら２分間反応させることからなっている。これは、約１
ｏｎ、ｏｏ。

ダルトンの透過性の上限を有するカプセル膜をもたらす
。所定の系における透過性を制御するのに適した最適反
応条件は、上記の指針に基づき実験的に容易に決めるこ
とができる。この方法を用いれば、膜の透過性上限を選
択レベルに設定することが可能である。

適する架橋性重合体の例は、天然若しくは合成の遊離ア
ミノ基若しくはイミノ基を有する蛋白質及びポリペプチ
ド、ポリエチレンアミン、ポリエチレンイミン及びポリ
ビニルアミンを包含する。

Ｄ型及びＬ型のポリシリンを使用して成功を収めた。た
とえばポリアルギニン、ポリシトルリン又はポリオルニ
チンのような蛋白質も使用することができる。より高い
範囲の陽荷電密度の重合体、たとえばポリビニルアミン
はゲル分子のアニオン性基に著しく付着して、安定な分
子を形成し、カプセル膜は一層破壊困難となる。

さらに、カチオン性重合体若しくはガムの付加的被覆を
用いて、さらに孔の大きさを調節することができる。こ
の付加的な被覆は一時的マトリックスを形成するのに使
用したと同じ重合体とすることができ、或いは上記の任
意の重合体、たとえばポリビニルアミン被覆をアルギン
酸ナトリウム／ポリ−１−リジンマイクロカプセルに使
用することができる。

ゲルの希薄溶液による処理は遊離アミ７基をカプセルの
表面に結び付け、さもないとこれはカプセルに対し凝固
傾向を付与する。

カプセル化のこの時点において、集取されたカプセルは
、重合体のゲル化溶液と細胞種類に適合する培地と細胞
とを包囲した半透膜からなっている。物質移動はカプセ
ル内及びカプセル膜を横断して促進されねばならないの
で、ゲルをその水溶性型まで再液化するのが好適である
。これは、ゲルが液体となる条件を再確立し、たとえば
カルシウム若しくはその他の多価カチオンを内部ゲルか
ら除去して行なうことができる。カプセル内の媒体は、
アルカリ金属イオンと水素イオンとを含有する燐酸緩衝
塩液にカプセルを浸漬するだけで再可溶化することがで
きる。−価のイオンは、カプセルを溶液中へ攪拌しなが
ら浸漬すると、ゲル内のカルシウム若しくはその他の多
価イオンと交換する。クエン酸ナトリウム溶液を同じ目
的で使用することができ、二価イオンを封鎖するのに役
立つ。

上記のようにカプセル化された一ａ胞培養物を、関与す
る特定細胞種類の全ての要件を満たすよう格別に設計し
た培地に懸濁させることができ、かつ正常な代謝を受は
続ける。典型的には、細胞の増殖を促進するために一般
に使用される成分は比較的低分子量のものであり、容易
にカプセル膜を通して細胞の微小環境中へ拡散し、ここ
で細胞膜を透過する。カプセル内の媒体中に分泌された
細胞の代謝生産物は、カプセル膜の透過性の上限より低
い分子量を有する場合は、同様に・この膜を通して拡散
しかつカプセル外の媒体中に集まる。

カプセル化した細胞は、慣用の培養物と同一の温度、ｐ
Ｈ及びイオン環境の条件下で培養することができる。培
養物の増＋ｆ４速度は、マイクロカプセル化法により阻
害されない。細胞培養物は、カプセルを細胞で満たすが
カプセル膜を破壊しない。

細胞の溶解 培養物が増殖した後に、興味ある非分泌物質の大部分は
まだ細胞内に含有されている。この物質を得るためには
、細胞を増殖培地から取り出して、カプセル膜を破壊す
ることなく細胞膜を溶解させる。溶解の好適方法は、カ
プセル膜を破壊しないが細胞膜を溶解させるような表面
活性剤に細胞を再懸濁させることである。ドデシル硫酸
ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム及び非イオン
性表面活性剤を包含する多数の表面活性剤を使用して成
功を収めたが、原始核細胞と共に使用するのに好適な表
面活性剤はグアニジン塩酸塩である。

驚ろくことに、たとえばドデシル硫酸ナトリウム、デオ
キシコール酸ナトリウム及びグアニジン塩酸塩のような
イオン相互作用を阻害しないように設計した表面活性剤
はマイクロカプセル膜を破壊せず、実際に原始核細胞を
含む用途に対し好適である。

典型的方法において、カプセルは吸引により培地から分
離され、綬衝塩水により洗浄されかつ等容量のたとえば
４Ｍグアニジン塩酸塩と混合される。このＶ、濁物をカ
プセルが全液体容量の約協となるまで２Ｍグアニジン塩
酸塩で希釈し、次いで懸濁物を３７℃で培養しそして産
生物を上澄液から回収する。

以下の例により本発明の詳細な説明しかつその効果を示
すが、これらのみに限定されない。

例１ この例は、カプセル化技術を標準の培養技術、すなわち
辿伝学的に改変した細菌に対するモノ拡散懸濁物と比較
することにより、原始核細胞に閃する本発明の方法の効
果を示す。この実験に使用した細菌ＨＢ１０１／ｐＢＲ
３２２−’ｍｐγは、ペニシリナーゼ生成プラスミドｐ
ＢＲ３□２の導入により改変したイー・コリ（菌株に−
１２）である。アンピシリン耐性であるこの細菌は、本
発明につき有用な３Ｅｔ　ｌＲ学的に改変した細胞を示
している。■（Ｂｌｏｌは発熱性の脂性多糖類、すなわ
ち約５　Ｘ　１０’ダルトンより大きい平均分子量を有
する内り素を生成する。この内毒緊は、生体内での使用
を目的とする産生物の精搏に：！５いて重大な問題であ
る。僅か約２０％のベニシリナーゼがこれら細胞により
分泌され、桟部は細胞内に保持される。プラスミドｐＢ
Ｒ３゜２から産生されるペニシリナーゼは、約３×１０
４ダルトンの分子量を有する。

本方法の第１工程は＋ｉ４Ｂ　ＩＱをカプセル化するこ
とである。ＨＢｌｏｔ／　ｐ　Ｂ　Ｒ３２２−ａｍｐγ
の培養物を、凍結保存物から標準ルリアプロス培地（Ｌ
Ｂ）にて１晩培養した。ＬＢブロスは１０ｆ／ｌのトリ
トン（ディフコ・ラボラトリーズ社）とｓｒ／ｌの酵母
抽出物（ディフコ社）と１０ｆ／ｌの塩化ナトリウム（
シグマ・ケミカル・カンパニー社）と２５η／１のアン
ピシリン（シグマ社）とを含有した。この培地は、上記
の成分を溶解させかつ混合物を０．２２ミクロンのフィ
ルタ（ゲルマン・ラボラトリーズ社）に通して濾過滅菌
することにより作成した。この培地はＨＢＩＯＩ細胞の
増殖を促進すると共に、他の非アンピシリン耐性の菌株
を除去する。

懸濁物１−をプリンタマン３２００型マイクロ７ユージ
において３分間遠心分離し、細菌の小ペレットを得た。

この細菌を０．１５Ｍの塩化ナトリウムＱ、２ｄ中に再
懸濁させ、そして１６％（、／マ）アルギン酸ナトリウ
ム（ケルコＬＶ社、ロット屋５５０７２Ａ）溶液２０ｍ
ｊ中に充分混合した。アルギン酸塩−細菌の混合物を液
滴形成装置（前記したと同様）に強制通過させかつ得ら
れた液体微小球を１２％（ｗ／ｖ）ＣａＣ１２溶液と接
触させてアルギン酸塩をゲル化させることにより、一時
的マトリックスを形成させた。この一時的マトリックス
を０．１５　Ｍ塩化ナトリウム溶液で反復洗浄し、そし
てｏ、５ｙ７ｔのポリ−１−リジン（シグマ社、６．５
　Ｘ　１０４ダルトンの分子量）溶液に６分間入れてカ
プセル膜を形成させた。次いで、これらカプセルを０２
％（ｗ／ｖ　）　ＣａＣ１２，０，０１４％（ｗ／ｖ）
ＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ７，４）（Ｎ−シクロヘキシルア
ミノエタンスルホン酸、シグマ社）にて洗浄し、次いで
０，２％ＣａＣｌ２　（ｗ／ｖ）で洗浄した。これらカ
プセルを塩水中の０，６％（Ｗ／マ）ＰＶＡ（ポリサイ
エンス社）に５分間入れることにより、ポリビニルアミ
ン（ＰＶＡ）の第二の被覆を付加した。

次いで、これらカプセルを塩水中で２回洗浄し、そして
０．０６％（Ｗ／マ）アルギン酸ナトリウム／塩水溶液
に４分間入れた。塩水でさらに２回洗浄シタ後、カプセ
ルを５５ｍＭクエン酸ナトリウム−塩水溶液で２回洗浄
し、最初の洗浄を１６分間かつ第２の洗浄を６分間行な
った。さらに塩水で２回洗浄を行なった後、カプセルを
新、鯉なＬＢブ四スに再懸濁させ、このＬＢブνスはア
ルギン酸塩の再ゲル化を防止するため最終濃度１０ｍＭ
までクエン酸ナトリウムを追加した。これら細胞を３７
℃にて２４時間培養した後に回収した。

第１図は、カプセル化細胞対慣用の懸濁培養物に関する
比較増殖速度を示している。再培養物の試料を種々の時
間間隔で採取し、増殖速度を５５０ｎｍの吸収を測定す
ることにより決定した。増殖速度は実質的に同一であり
、このことはカプセル化技術が細胞の生存性に悪影響を
与えないことを示している。カプセルは約８００μの平
均寸法を有し、各カプセルは約１０’個までの細胞を含
有した。

細胞培養物の増殖後、吸引によりカプセルをＬＢプロス
から分離し、無菌燐酸緩衝塩液（ＰＢＳ）で反復洗浄し
た。カプセルの容積を測定し、そして等量のＰ、Ｂ　Ｓ
における４Ｍグアニジン塩酸塩（シグマ社）を加えた。

得られた懸濁物を、カプセル容積が液体容積の約１０％
となるまで２Ｍグアニジン塩酸塩で希釈した。カプセル
をコスタ−Ｔ−１５０型培養フラスコにおいて３７℃で
培養し、上澄液及びカプセルの試料を種々の時間間隔で
採取した。各間隔において、３ｍｌの懸濁カプセル溶液
を培養物からピペットにより抜取った。上澄液を１つの
試料として抜き取り、かつ等４飛の新鮮な２Ｍグアニジ
ン塩酸塩をカプセルに加えた。

ライ−トンの７　ｍｇダウンス・ホモゲナイザーを用い
てカプセル膜を破壊した。ダウンス・ホモゲナイザーは
限定公差のプランジャーを有するガラス管で、プランジ
ャー押し下げる際に、公差よりも厚さの大きい物質をプ
ランジャー−管の界面で砕く。卓上遠心分雛器を使用し
て、カプセル膜と細胞膜断片とを遠心分離し、得られた
上澄液をカプセル内試料として採取した。

各試料を酵素湯度と内毒素濃度との両者につき試験した
。酵素濃度を試験するには、試料を容積１　ｍｌまで水
で希釈し、そして水中１％ゼラチン１ｍεを加えた。次
いで、ゼラチン／試料の混合物を燐酸緩衝液（ｐＨ６５
）における２　ｍｇ　／　ＬのペニシリンＧの５−に加
え、そして３０℃にて３０分間培養した。０．０１７Ｎ
の沃素と０．６Ｍの沃化カリウムと１．７５　Ｍの酢酸
ナトリウムとの混合物（ｐ　Ｈ４，０）　１０　ｍｅを
混合吻に加え、さらに１０分間培養した。得られた着色
溶液を、色が完全に消失するまで０．０１７　Ｎチオ硫
酸ナトリウムで滴定した。この分析は、ベニシロ酸と遊
離沃素との間の反応に基づいている。試料中に仔年−す
るペニシリナーゼは加えたペニシリンと反応して、ベニ
シロ酸を生成する。次いで、ベニシロ酸は遊離沃素と反
応して沃素を溶液からＲう。さらに、チオ硫酸ナトリウ
ムは遊離沃素と反応して、色を除去するのに要するチオ
硫酸塩の量が溶液中のベニシロ酌量の尺度となり、かつ
間接的にペニシリナーゼ活性の尺度となる。溶液を透明
にするのに必要なチオ硫酸塩が少ない程、元の溶液中に
存在するベニシリナーゼ活性は大きくなった。ペニシリ
ナーゼ活性は１、単位時間当りにベニシロ酸に変換され
るペニシリンの単位により測定される。

内毒素の濃度は、無菌水で希釈した内毒素溶液１００　
ｍｌを滅菌試験管に入れかつ等量の水中のりルムスーア
メボサイテクーリゼート（ＬＡＬ、ケープ・コツト・ア
ソシエーツ社）を加えることにより分析した。試験管を
３７℃で１時間培養し、凝固物の形成につき観察する。

試験管の転倒によりほぐしえない凝固物が形成される場
合、内毒素の陽性を示す。この試料を一連に希釈して数
値を与える。

第２図は、カプセル化培養物を慣用の懸濁培養物と比較
した全ベニシリナーゼ活性のグラフである。培養物に対
する全ベニシリナーゼ活性は実質的に同一であり、この
ことはカプセル化技術がペニシリナーゼ産生に対し悪影
特を与えないことを示している。

第３図は、カプセル半透膜を通過するペニシリナーゼの
拡散速度を示している。カプセルを０時点で２Ｍグアニ
ジン塩酸塩中に入れ、そしてカプセル内及びカプセル外
の液体を種々の時間間隔でペニシリナーゼ活性につき試
験した。第６図に示したように、上澄液における初期ペ
ニシリナーゼ濃度は低いものであるが、このペニシリナ
ーゼは半透膜における細孔を通して拡散し、経時的にカ
プセル外の培地中に現われる。ペニシリナーゼのカプセ
ル内の濃度は減少し、これはカプセル膜を通過するペニ
シリナーゼの実際の移動を示している。

第４図は、特に第３図と組合せた場合、本発明の効果を
示しており、すなわちパイ四ジエンの移動に対するバリ
ヤを形成すると共に、カプセル膜を通過する酵素の移動
を可能にする。第４図は、内毒素のカプセル外濃度がカ
プセル内濃度よりも少なくとも１桁低いことを示してい
る。これらの図面は、カプセル膜が内善素の通過を阻止
すると共に、ペニシリナーゼの自由な移動を可能にして
培養物からのベニシリナーゼの回収を容易化させること
を示している。さらに、第４図は、慣用の培養物からの
上演液が本発明のカプセル外の液体中に存在するよりも
約１００倍多い内毒素を含むことを示している。

例２ この例は、本明細書中に開示した方法が成熟核細胞と原
始核細胞との両者に対し有効であることを示している。

この実験に使用した細胞系はフレンド赤面白血病細胞系
（ＦＥＬ７４５）のねずみ赤面白血病細胞系であり、こ
れは懸濁培養で容易に増殖する。Ｆ　Ｅ　Ｌ７４．細胞
は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処理するとヘ
モグロビンを生成するよう誘発される。生成したヘモグ
ロビンは約６．３×１０４ダルトンの分子量を有し、細
胞溶解まで実質的に！ｍ胞内に保持される。

この実験は、カプセル化培養物対懸濁培養物における生
物生存性とヘモグロビン精製の容易性とを比較する。Ｆ
ＥＬ７４．細胞の培養物をマイクロカプセルで５分間遠
心分離し、そして得られたペレットを１２％（Ｗ／マ）
塩化ナトリウム（シグマ社）に再懸濁させた。アルギン
酸塩−細胞の混合物を液滴形成装置（前記と同様）に強
制通過させ、がつ得られた液体微小球を１．０２％（ｗ
／マ）ＣａＣ１ｇ溶液と接触させてアルギン酸塩をゲル
化することにより、一時的マトリックスを形成させた。

得られた一時的マトリックスを２回洗浄し、先ず７５ｍ
ＭのＣａＣｌ２における５ｍＭＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨｙ
、　５）で洗浄し、次いで第２の７５　ｍＭ　ＣａＣ１
ｚ溶液で洗浄した。Ｑ、１５モルのＮａＣ１中＋７）ポ
ＩＪ　−１−リジン（マイルス・ラボラドリース社、分
子量４２．６００ダルトン）のα０５％（ｗ／ｖ　）溶
液を攪拌しながら３分間で添加すると、永久カプセル膜
が形成された。得られたカプセルを３回洗浄し、先ず７
５ｍＭのＣａＣｌ２における５　ｍ　ＭＣＨＥＳ緩衝液
（ＰＨ７，５）で洗浄し、次いで７５ｍＭｅａｃ１２で
洗浄し、かつ最後にα１５ＭのＮ　ａ　Ｃ１で洗浄した
ちこれらカプセルを塩水中のα０３％（ｗ／、）のアル
ギン酸ナトリウムと共に４分間培養し、次いで１０％（
ｗ／ｖ　）胎児牛血清（Ｆｅ２）（）ｐ−・ラボラドリ
ース社）と抗生物質とを含有する培地（ＲＰＭＩ−１６
４０，フロー・ラボラドリース社）により２回洗浄した
。マイクロカプセルを培地と共に組織培養フラスコ中に
入れて５％Ｃ０２雰囲気中で３７℃にて培養した。

第５図は、カプセル化細胞対慣用の懸濁培養物の比較増
殖速度を示している。培養物を種々の時間間隔で採取し
、そして細胞数を計数した。培養物に対する細胞密度は
実質的に同じであり、このことはカプセル化技術が細胞
増殖に悪影響を与えないことを示している。

ヘモクロビン産生は、０Ｍ８０（マリンクロット・ケミ
カル社）での処理により培養物で誘発された。８　Ｘ　
１０５個の細胞／　ｍｅの密度を有する培養物を培地中
で１％ＤＭＳＯと共に４８時間培養し、１．５％ＤＭＳ
Ｏと共にさらに２４時間培養し、最後に２％ＤＭＳＯと
共に２４時間培養した。これら培養物を０．１５　Ｍの
ＮａＣ１で洗浄し、そして５０　ｍ　Ｍのトリス（ｐ　
Ｈ７，０）と２５ｍ、ＭのＫＣＩと５ｍＭのＭｇＣｌ２
と１ｍＭのＢ−メルカプトエタノールとＩ］、３％（ｗ
／ｖ）のトリトン−１００とを含有する５倍容量の溶解
緩術液に再懸濁させた。

培養物を４℃にて１０分間づつ２回培養して、各培養期
間の前後に綬和に渦運動させた。これら培養物を４℃で
１０．ＱＯＯＸｇにて１０分間遠心分離し、上澄液を集
めた。ヘモグルビン含有量を４１４ｎｍにて分光光度分
析し、積重うウリー法によって全蛋白質を分析した。

第１表 ヘモグロビン濃度　全蛋白質濃度 懸濁物比較　　　２．５９　　　２５．２　　０．１０
２第１表は本発明による方法の効果を示している。

懸濁培養物及びカプセル化培養物により生成されるヘモ
グロビンの量はほぼ等しいが、カプセル化培養物に対す
るヘモグロビン／蛋白質（Ａ／Ｂ）の比は懸濁培養物に
対するＡ／Ｂ比の３倍より大である。Ａ／Ｂ比は、上澄
液の特異的ヘモグロビン活性の尺度である。この実験は
、マイクロカプセルが高分子鎖の蛋白質と脂質と多糖類
と核酸とを保持することにより興味ある物質の高い特異
活性をもたらすことを示している。

本明細書中に示した方法は興味ある非分泌物質が比較的
低い分子量を有する場合に特に有用であるが、実質的に
分泌されない物質と高分子量の汚染物とを含む任意の系
についても使用できるであろう。当業者は、本明細書の
教示にしたがい本方法に対する種々の変更を行なうこと
ができ、これらの変更も本発明の範囲内に包含される。

に改変したパイロジエン含有細菌の増殖曲線図であり、
細菌のカプセル化が慣用の懸濁培養と比較して増殖速度
に悪影響を与えないことを示し、第２図は興味・ある物
質の細胞内産生が慣用の懸濁培養又はカプセル化培養に
おける増殖のいずれであるかに関係なく実質的に同一で
あることを示すグラフであり、 第３図は細胞膜を溶解させた後の半透性カプセル膜を通
過するペニシリナーゼの放出速度を示すグラフであり、 第４図は細胞を溶解させた後のカプセル外流体、カプセ
ル内流体及び慣用の懸濁培地におけるノぐイロジエン濃
度を示すグラフであり、 第５図は成熟核細胞培養の増殖曲線図であり、カプセル
化技術が慣用の懸濁培養と比較して増殖速度に悪影響を
与えないことを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）生細胞により産生される非分泌物質を回収しかつ
   低饋度の高分子量汚染物を有する粗度生物として前記物
   質を回収するに際し、 Ａ、前記物質を通過させうるが前記高分子量汚染物の通
   過を妨げるような透過性を有するカプセル膜の内部に前
   記細Ｉ１．ルをカプセル化し、Ｂ、カプセル化した細胞
   、を水性培地、中に懸濁さぜ、 Ｃ０前記細胞を前記カプセル膜内で代謝させ、Ｄ、前記
   細胞の細胞膜を前記カプセル膜の破壊なしに溶解させ、 Ｅ、前記物質を優先的に前記カプセル膜を通してカプセ
   ル外の流体中へ拡散させ、 Ｆ、前記物質を前記カプセル外の流体から回収する 工程から成ることを特徴とする非分泌物質の回収方法０ （２）　　カプセル化工程囚）を、重合体鎖上の複数の
   カチオン性基と水溶性重合体上の複数のアニオン性基と
   を反応させて水不溶性の塩結合マトリックスを形成させ
   ることによりカプセル膜を形成させて行なう特許請求の
   範囲第１項記載の方法・（３）　　カプセル化工程（Ａ
   ）を、 （ａ）　　細胞に対し生理学的に適合しかつ複数のアニ
   オン成分を有する水溶性重合体を含有する水性媒体に前
   記細胞を懸濁させ、 υ）　この懸濁物を細胞を含有する液滴に形成し、（Ｃ
   ）　　液滴を生理学的に適する多価のカチオンの溶液に
   露呈させて、液滴を個々の形状保持性かつ水不溶性の一
   時的マトリックスとしてゲル化させ、（ｄ）　　この一
   時的マトリックスの表面層を架橋させて前記液滴の周囲
   に半透透性カプセル膜を形成し、その際液滴を前記アニ
   オン成分に対し反応性の複数のカチオン性基を含む重合
   体に露呈させる工程により行なう特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 （４）細胞をカプセル膜内で有糸分裂させて細胞コルニ
   ーを生成させ、前記カプセル膜を破裂させることなくこ
   のカプセル膜内の容積を実質的に満たす工程をさらに含
   む特許請求の範囲第１項記載の方法。 （５）細胞膜の溶解を、表面活性剤中にカプセル化細胞
   を懸濁させることにより行なう特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 （６）表面活性剤が非イオン性表面活性剤、グアニジン
   塩酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナ
   トリウム又はその混合物の水溶液である特許請求の範囲
   第５項記載の方法。 （７）細胞が遺伝学的に改変した細胞からなり、か・　
   つ汚染物がパイロジエンからなる特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 （８）　　カプセル膜が、前記物質の分子量よりも大き
   くかつ前記高分子量汚染物の分子量よりも低い透過性の
   上限を有する特許請求の範囲第１項記載の方法。 （９）　　カプセル膜が複数の迷路孔を画成し、かつこ
   れらの孔が分子を通過させうる速度が前記分子の分子量
   の逆関数である特許請求の範囲第１項記載の方法。