JPS6188893A - 細胞により産生される物質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、細胞によシ産生されるタイプの生物質を製造
する方法に関する。

細胞生物学の発達によって、種々の高等生物の細胞が、
病気の治療ないし診断において有意な潜在的若しくは明
白な有用性を示す物質を少量産生することがわかってい
る。かかる物質の例は文献に多く記されており、それに
は、ホルモン、インク−フェロ／およびリン小力インの
如キ（・Ｅ々の生物学的応答改変剤並びに、診断テスト
に用いられる抗体の如きｆｌｉｔ物質が含まれる。また
、抗生物質を大微生産するのに、微生物系統の雌胞培養
が長い間用いられてきた。

特に、高等動物からの細胞培養においては、バクテリア
その曲（・てよる汚染の危険が常（て存在する。

まだ、はとんどの場合、ボ（Ｂ胞の培養によって産生さ
れる興味深い物質の量は非常に少く、しかもそれは、血
清たん白質および他物質の複雑な混合物を含む培養基に
集まる。これは、興味深い物質の単離ないし精製を困難
なものとする。

概記するに、本発明は、生きている細胞によって産生さ
れる物質の製造系および製造方法を提供する。本発明の
実施によって、培養する細胞のための保獲環境がもたら
され且つ混入異質成分をほとんど含まない培養基に興味
ちる物質を集める手段が提供されるという二つの個有な
利点が達成される。本発明は、興味ある物質を、より高
分子量の血清たん白質その他、産生性細胞の継続的生存
能力および代謝を保持するのに通常必要とされる類似物
から分離するのに使用されうる。別法として、本発明は
、比較的少量の低分子量栄養又は細胞代謝生成物を含む
培養基に興味ある物質を集めるのに使用されうる。

本方法は、細胞の標準的代謝作用ないし璧）・＆的生存
能力に必要な栄養、イオンおよび他の比較的低分子量の
旧料金透過しうる膜の中に細胞を・封入、カプセル化す
る工程を含む。この膜は、細胞が分泌した興味ある物質
を透過してもよく透過しなくてもよいが、いずれにせよ
、分子量が一般に、約２０　Ｘ　１０”ダルトンよりも
小さな成る選定レベルにある分子の通り抜けないし貫通
を許容するのに十分な透過度上限を有する。このように
して産生されたカプセルを次いで、慣用の水性培養基に
懸濁させて、該カプセル内の細胞に通常のインビトロ代
謝作用を行わせる。細胞によって分泌された、分子量が
膜の透過度上限よりも小さな物質は膜を通り抜けて培養
基中に集まる。有利なことに、高等動物からの多種の細
胞培養物の生存能力ないし保健に必要なしかも典型的に
はそれ自体消費されない血清たん白質の如き高分子量物
質をマイクロカプセルに入れ、そこに閉じ込めて該物質
が培養基中に拡散しないようにすることができる。細胞
培養物が代謝の際消費する物質が、カプセル膜を通って
拡散しうるのに十分低い分子量を有するとき、それは培
養基を出て膜を貫通する。また、膜の通り抜けを許容す
るのに十分小さな分子寸法を有する、細胞の代謝生成物
は、カプセル外部の培養基中へと拡散する。興味ある物
質が、透過度上限よりも小さな分子量を有する場合、そ
れはカプセル外培養基中に拡散し、その培養基中で比較
的容易に収得されつる。なぜなら、従来法のカプセル化
しない細胞培養物に存在する汚染注高分子計材料がない
からである。興味ある物質が膜の透過度上限よりも大き
な分子量を有するとき、それはカプセル内に蓄積するの
で、後刻、その回収に備えてカプセルを培養基から分離
し、破壊することができる。

本発明は、カプセル膜内に封入することのできる細胞の
種類に関して本質上制約がない。特に、企図されること
は、微生物や、高等動物全ての組織からの細胞の培養物
が使用されうることでちる。

１合細胞、例えばハイズリビーマ細胞又は、例として最
近の組換えＤＮＡ技法により製せられる遺伝学的改変日
胞も同じく容易にカプセル化することができる。要する
に、懸案のタイプの細胞をインビトロ維持することので
きる培養基があれば、その細胞は、ここをて開示する方
法に従って用いられうる。本発明の方法および本発明の
系に従って製造することのできる物質の種類は、インシ
ュリン、グリコーゲン、プロラクチン、ソマトスタチン
、チロキシン、ステロイドホルモン、脳下垂体ホルモン
、インターフェロン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、Ｐ
ＴＨおよびモノクローナル抗体である。

が、本発明はこれに限定されない。

本発明の方法に使用する系は、生存性細胞をカプセル封
入しこれを水性培養基に懸濁させたものよりなる。カプ
セル化した細胞は、該細胞の継続的生存能力ないし代謝
に必要な栄養の貫通を許容するのに十分な透過度上限に
よって特徴づけられる膜を有する。この膜は、細胞の代
謝を維持するのに必要なしかも、膜の透過度上限よりも
大きい寸法範囲にある成分全てを含む培養基に配分され
た生存性細胞を封入する。培養基は、膜の透過度上限よ
りも小さな分子ｔｅ有する、細胞の生存能力を維持する
のに必要な成分を含む。

従って、本発明の一つの目的は、細胞Ｑてよって産生さ
れるタイプの生物質を製造する系および方法を提供する
ことである。本発明の別の目的は、かかる系にして、産
生性細胞を健康的な保護小環境に入れこれを、該細胞の
代謝生成物と、細胞の生存能力ないし保全に必要な高分
子量物質とを分けるのに役立つ半透膜によって閉じ込め
た系を提供することである。本発明の他の目的は、細胞
培養物から生物学上活性な物質を製造するための改良方
法を提供することである。本発明の更に池の目的は、抗
体ホルモン、インターフェロン、す／ホカインの如き生
物学的応答改変剤を血清不含培衣基中で製造することで
ある。

如上および他の目的並びに本発明の特徴は以ドの記載と
添付図面より明らかとなろう。

本発明の広い概念は、細胞培養基による完全な、細胞の
ための小環境を、半透膜によって外部の水性培舊基から
分離するように側々の細胞若しく・；は細胞群周囲に半
透膜を介在させることでちる。−））乳類からの細胞は
代表的には、その継ｆｊ６的な生存能力ないし健康を推
持するために血、′ｆｔたん白質の存在を必要とし、そ
の一部分は約６５，０００〜１５０，０００ダルトンよ
りも大きな分子殿ヲ有する。従来法のカプセル化しない
細胞培養においては、細胞から分泌された興味ある物質
を培養基中に分散させ、これを高分子量成分、低分子量
成分の両者と混合せしめる。典型的には、細胞産生物の
量はかなり少いだめ、興味ある物質の単離′＋々製は困
難な仕事となる。更に、哨乳類細胞の培養は、バクテリ
ア等による汚染に対してまぎれもなく敏感でちる。

そのため、無菌状態を保持する種々の技法を用いて培養
を行わねばならず、また往々培養基中に抗体を含ませね
ばならない。

本発明のプラクテイスに従えば、上記問題は、一般に約
２００，０００よりも大きくない選択された透過度範囲
を有する半透膜の中に培養細胞全カプセル化することに
よって軽減される。すなわち、半透膜は、最大分子量が
透過度上限と同じか又はそれより小さな物質をして該膜
を貫通させる多孔質のものである。而して、透過度上限
よりも大きな分子量の物質は膜を通り抜けることができ
ない。

このことから、継続的生存能力、代謝作用、更には有糸
分裂に必要な成分全てを含有する培養基と一緒に細胞を
カプセル化することができ、次いでこのようにカプセル
化された細胞を、該細胞により消費される低分子量物質
を含む（しかし所要の高分子量物質を含む必要のない）
培養基中に翌濁させることができる。

典型的には、高等生物からの細胞は、高分子量の血清た
ん白質を摂取せず、継続的な標準生物学的応答のために
近似したものを要求する。細胞により摂取され或は代謝
作用の行われる塩、アミノ酸、その他低分子量の要素は
膜を自由に通り抜け、また必要に応じカプセル外培養基
を単に変えることで補給されうる。膜の透過度上限より
も小さな分子量を有する、細胞の代謝作用による分泌物
はカプセル外培養基中に蓄積する。この培養基（ては高
分子量の物質がないため、興味ある代謝物の収得ないし
単離は簡素化される。また、透過度上限よりも大きな分
子量２有する興味ある生成物の収得も、該生成物がカプ
セル内部に在ってカプセル外容積中に分散していないこ
とで促進される。

低分子量の細胞産生物に適用したときの本発明概念を添
付図面に概略例示する。第１図に示す如く、細胞１０は
、孔１６を有するカプセル膜１２内に配置されている。

高分子量の要素１８も膜１２内部に封入され、その中に
在って培養基１４内を自由に循環する。細胞に必要な成
分２０や、興味ある物質２２′を含む代謝生成物２２は
、カプセル内培養基、カプセル外培養基いずれにおいて
も自由に循環し、また孔１６全通って膜を横切る。周期
的（ないし連続的）基準での作業が必要とされるとき、
カプセル外培養基はその成分全てと一緒に、カプセルそ
のものから吸引等によって分離され、新たな培養基に置
き換えられる。集められた培養基には、高分子量の成分
１８が事実上なく、かくして収得、単離の手順が簡素化
される。しかも、細胞１０は、常時カプセル内部の小環
境内に在って保進され定ま＼である。

いくつかの場合において、例えば、カプセル化した。；
田胞による特定の興味ある物質の産生全刺激するために
、該細胞を、膜の貫通には大きすきる分子寸法の高分子
量成分にさらすことが要求される。一つの例は、ヒトの
線維芽細胞、白血球又は、成る種のウィルス若しくは高
分子量核酸による処理でインターフェロンを分泌するよ
う誘発されるリンパ芽細胞からのインターフェロン製造
である。

このような場合、もし膜の透過度上限が誘発性要素の分
子量よりも低ければ、細胞を、カプセル化に先立ちイン
ターフェロン誘発に付すか或は、二廿胞培養ののちカプ
セル膜全選択的に破壊して高分子量材料を細胞によって
摂取させるかせねばならない。米国出願番号２４３，５
８４に相当する同日出順の明細書には、かかる目的ない
し他の目的のため、細胞を損うことなく用いられうる特
を重なカプセル膜の選択的破壊方法が開示されている。

本発明の方法は、＋１８胞周囲に半透膜を形成しうると
同時にその継続的生存能力に悪影響しない方法に依拠す
る。一つの適当なカプセル化方法ヲ以下に詳述する。

細胞のカプセル化 カプセル化しようとする組織ないし細胞を、保全に適し
た或は、かかわり合う特定タイプの組織若しくは細胞の
継続的代謝作用を保持するのに適し之水性培養基に懸濁
させる。この目的に適した培養基は市販されている。カ
プセル化しようとする原料の平均径は数μｍ〜数罷数回
範囲く変動しうる。しかしながら、最良の結果は、３０
０〜１０００μｍ範囲の大きさのカプセルを以て達成さ
れる。

咄乳類のランゲルハンス島は、典型的には５０〜２００
μｍの径である。線維芽細胞、白血球、リンパ芽細胞、
膵臓のβ細胞、α細胞、β細胞の如き個々の細胞、これ
ら細胞の種々の比の混成物又は他の組織単位を所望に応
じカプセル化することがセル化することができる。

このような生物の継続的生存能力は殊に、所要栄養の入
手性、酸素移動、培養基中の有毒物の不在および培養基
のｐＨに依存する。それ故、かかる生物を生理学上相客
しつる環境に保持ししかも同時にカプセル化することは
従前不可能であった。

問題は、膜形成の所要条件が組織に対し有害若しくは致
死的であるということだった。而して、ギ且織を健康状
態で生き残らせる膜形成の方法は、米国出願番号２４，
６００の発明前何ら出現しなかった。

しかしながら、生きている組織と生理学上適合し得しか
も、それ自体水不溶化して保形性凝着塊を形成すること
のできる成る種の水溶性物質が、個々の細胞若しくは細
胞群周囲に保護バリヤ一層すなわち「一時カプセル」を
形成するのに用いられ、またこの一時カプセルが、細胞
を損うことなく細胞周囲に、より恒久的な半透膜を沈着
させるべく処理されうろことが発見された。かかる物質
は組織培養基に対し数重量％程度の濃度で加えられる。

なお、この培養基には、培養細胞と必要に応じ血清成分
が含まれ、また随意成分として、コラーゲンの如き細胞
基質又は、固定基質として作用する水分散性高分子量物
質が含まれる。コラーゲンを用いる場合、その濃度を約
１０μｆ／ｒｎｉ〜約１ｍｇ／ｍｌ範囲内とすべきであ
るが、好ましくは１００〜５００μｆ　／　ｍｅ程度と
する。

次いで、組織をその培養基と一緒に含む上記溶液を小滴
形状にし、これを直ちに水不溶化し、そして少くとも表
面層をゲル化させる。しかるのち、この保形性一時カプ
セルに゛、よシ恒久的な膜企付与する。もし組織を、損
うことなく放出することが望まれるなら、引続いて膜そ
のものを選択的に破壊することができる。一時カプセル
の形成に用いられる材料に依っては、この恒久的な膜を
形成したあとカプセル内部を再液化させてもよい。これ
は、培養基中に、該材料がｍけうる条件を確立させるこ
とによって遂行される。

一時カプセルの形成に用いられる材料は、イオン環境又
はイオン濃度の変化によって保形性のものに転化しうる
水（容性無毒材料ならいずれであってもよい。又、この
材料は、複数のカチオン基金有する重合体と反応して塩
形成することのできる複数の易イオン化アニオン部分例
えばカルボキシル基を含むべきである。あとで説示する
如く、この種の材料を用いることにより、一時カプセル
の表面層において、選択された透過度上限を有する恒久
的な膜を、困難を伴わずに沈着させることができる。

一時カプセルを形成するのに現在好ましい材料は、水に
可溶の天然ないし合成の酸性多糖類コ゛ムであり、かか
る材料は市販されている。これらは典型的には、植物か
ら抽出され、各種食品の添加剤として往々用いられてい
る。アルギン酸ナトリウムが今日好適な水溶性ゴムでち
ゃ、１５０，０００ダルトン以上の分子量範囲にあるア
ルギン酸塩を用いることができるが、しかし該塩はその
分子叶寸法および粘度故に、最終的に形成されたカプセ
ル膜全透過することは通常不可能である。こわよりも低
分子量例えばｓｏ、ｏｏｏ〜ｓｏ、ｏｏｏり９ルトンの
アルギン酸塩は、十分な多孔性を有する膜を経てカプセ
ル内部容積から、拡散によって、よシ容易（こ除去され
、それ故に好ましい。使用しうる他のゴムに、ダアーガ
ム、カラジーナン、Ｒクチン、トラガカントイム又はキ
サンタンゴムが包きされる。

これらの材料は、グリコンド結合した糖類鎖を含む。そ
の遊離酸基は往々、アルカリ金属イオン形例えばす）　
ＩＪウムイオン形状で存在する。もしカルシウム若しく
はアルミニウムの如き多価イオンがこのアルカリ金属イ
オンと交換するなら、水溶性多糖類分子は「架橋」され
て、水に不溶の保形性ゲルを形成し、そして該ゲルは、
イオン交換により或は金属イオン封鎖剤を通してイオン
を除去するとき再溶解せしめられうる。酸性ゴムと塩形
成することのできる多価イオンなら本質止金てが作動性
であるが、生理学上相客しうるイオン例えばカルシウム
を用いることが好ましい。これは組織を生きている状態
で保全しやすい。他の多価カチオンも使用することがで
きる。ただし、マグネシウムイオンはアルギン酸ナトリ
ウムをゲル化するのに有効でない。

代表的な溶液組成物は、培養基中等容量の細胞培養物と
生理的食塩水中１ないし２係のゴム溶液よシなる。アル
ギン酸ナトリウム金用いるとき、１２〜１６チ溶液が首
尾よく使われている。もし、カプセル化しようとする細
胞が有糸分裂するのに固定基質への付着を要求する種類
のものなら、また該細胞がカプセル内部で増殖されるべ
きものなら、コラーゲンか或は、水に分散しうる天然な
いし合成の高分子量たん白質若しくはホリ又プチドを細
胞培養物に含ませることができ、そして最終的に形成さ
れたカプセル内部の容積中に留められる。この目的に、
複数のカチオン基金有する重合体例えばポＩＪ　ＩＪシ
ンが用いられる場合、該カチオン基は水溶性ゴムのアニ
オン箇所と反応して、ゴムと絡み合わされた実質上水に
不溶のマトリックスを形成する。かかる原料の好ましい
濃度は、懸濁物（ゴム溶液を含む）１ｍＪ当９１００〜
５００μｍ程度である。

次工程のカプセル化において、組織と含むコ゛ム溶液は
所望寸法の小滴形状にされる。しかるのち、該小滴は直
ちにゲル化されて好ましくは球状ないし扁球状を保持す
るものとなるが、しかし必ずしもかかる形態を呈さない
。小滴形成は既知の方法によって実施されうる。その手
ｉｌ＠ＩＩＰ１１は以下の如くである。

多価カチオンの水溶液例えば１５係のＣａＣｌ。

溶、夜を入れたチューブに、小滴形成装置を保持するス
トッパーを嵌合させる。この装置は、上方空気取入口と
細長い中空体とを中に摩擦嵌合させたハウジングよりな
る。このハウジングの頂部に、段階式ポンプを備えた１
０ＣＣ注入器を、例えば長さ方向に沿いハウジングを貫
通するテフロン被覆された内径０．０１ｉｎ針によって
取付ける。ハウジングの内部は、針の先端が、エアナイ
フとして機能する一定の空気層流にさらされるように設
計されている。使用時、注入器に、カプセル化しようと
する原料を含む（容液全満たし、針の先端から浴液の小
滴を増分的に強制押出すべく段階弐月でンプを作動させ
る。空気流れによって、液滴同士を［切り一１ｅＪＬ、
而してこの、夜温はＣａＣ１゜溶１夜中約２．５　ｃｍ
に落下し、そこでカルシウムイオンを吸収して直ちにダ
ル化する。この場合、針の先端とＣａｄｌ。石液面との
距；Ｉｔは、アルギン酸す）　ＩＪウム／細胞懸濁物を
して物理的に１νも有利な形状である球体（最小の表面
積に最大容積）を呈させるに十分長い。ストッパー中の
開口部を通ってチューブ内の空気が流出する。これはゲ
ルの「架橋」をもたらし、また懸濁せる組織とその培養
基を含む高粘度保形性保護一時カプセルの形成をもたら
す。カプセルは別個の相として溶液中に蓄積し、吸引に
よって分離されうる。

次の処理工程において、この一時カプセルの表面周囲に
、表面層を「架橋」することによって半透膜を沈着させ
る。これは、ゲル化した一時カプセルを、該ゲル分子中
のアニオン官能基と反応しうるカチオン基を有する重合
体の水＠液にさらすことによって遂行されうる。遊離イ
ミンないしアミン基の如き酸反応性基を有する重合体が
好ましい。この状況において、多糖類ゴムは、カルボキ
ンル基とアミン若しくはイミン基との相互作用（塩結合
形成ンによって架橋される。用いられる架橋性重合体の
分子量を選定し且つ重合体イ容液の濃度および暴露時間
を調節することにより、通過度を範囲内に制御すること
ができる。低分子Ｉｔ　６有する重合体の溶液は、一定
期間では、高分子量重合体の場合よりも一層、一時カプ
セル内部に侵入する。架橋剤の侵入度は、得られる透過
度と相関関係がある。一般に、分子量が高く侵入が少い
ほど、細孔寸法は大きい。反応の期間、重合体浴液の濃
度および所望される透過度に依拠して、広くいえば３，
０００から１００．０００ダルトン以上の分子量範囲内
の重合体を用いることができる。平均分子量約３５，０
００ダルトンのポリリシンを用いるとき、一つの好首尾
な反応条件組合せとして、ポリリシン含量０．０１６７
％の生理的食塩水溶液を２分間攪拌しながら反応させる
ことが挙げられる。これは、約１００，０００ダルトン
の透過度上限を有する膜をもたらす。所定の系で透過度
を制御するのに最適な反応条件は上記指針にかんがみて
実験によシ容易に決定されうる。この方法を用いるなら
、膜の透過度上限を約２０Ｑ　０００ダルトンよシも小
さな選定レベルに設定することができる。

適当な架橋用重合体の例には、遊離アミン若しくはイミ
ノ基を有する天然ないし合成のたん白質およびポリＲプ
チド、ポリエチレンアミン、ポリエチレンイミンおよび
ポリビニルアミンが含捷れる。現在、ＤおよびＬ両形の
ポリＩＪシンが首尾よく使われている。ポリアルゲニン
、ポリシトルリン又は４１Ｊオルニチンの如きたん白質
も弁作動することができる。正電荷の濃度がより高い範
囲にある重合体例えばポリビニルアミンはゲル分子のア
ニオン基に激しく結合して安定な膜を形成するが、しか
しこの膜は破壊するのにかなシむづかしい。

コ゛ムの稀溶液で処理すると、カプセルの表面に遊離ア
ミノ基が結合するが、処理しないなら、カプセル同士が
凝集しやすくなる。

カプセル化でのこの時点において、カプセルを集めるこ
とができる。それは、コ゛ム、細胞、細胞と相客しうる
培養基並びに随意成分としてのコラーゲン若しくは別の
固定基質の内部マトリックスの溶液ゲル化物を囲繞する
半透膜よりなる。カプセル内部のまた膜を横切っての物
質移動を促進すべき故、ゲル化物全再液化してその水溶
性形状に戻すことが好ましい。これは、ゴムが液状をな
す条件を再確立させることによシ、例えば内部ゲルから
カルシウム又は他の多価カチオンを除去することによっ
て遂行されうる。また、アルカリ金属イオンおよび水素
イオンを含むりん酸塩緩衝剤人９食塩水にカプセルを単
に浸漬することによって、カプセル内の培養基を再尋解
させることができる。

而して、カプセルを攪拌下溶液に浸漬するとき、−価イ
オンはコ゛ム内部のカルシウム若しくは他の多価イオン
と交換する。同じ目的にくえん酸ナトリウム溶液ヲ用い
ることができ、そしてこのものは金属イオン封鎖剤とし
て二価イオンを失活させるのに役立つ。

上記の如くカプセル化した細胞培養物は、関連せる特定
細胞タイプの要件全てを満たすべく特に設計された培養
基に懸濁され得、それによって該培養物は標準的なイン
ビトロ代謝を示し続ける。

もし、培養物が血清成分の如き高分子量成分の環境全必
要とするなら、この成分をカプセル外培養基から省くこ
とができる。細胞によって通常摂取される成分は典型的
には、比較的低分子咄であり、該成分が細胞膜を透過す
るときそれはカプセル膜を横切って細胞の小環境内に容
易に拡散する。カプセル内培養基中に分泌された、細胞
の代謝生成物は、もしそれがカプセル膜の透過度上限よ
りも小さな分子量を有するなら同様に該膜を（黄切って
拡散し、カプセル外培養基中に蓄積する。

カプセル化された細胞は、在来の培養物と同じ条件例え
ば温度、ｐＨおよびイオン環境のもとで培養することが
できる。また、細胞の産生物も、慣用技法によってカプ
セル外培養基から或は力′セル内から収得することがで
きるが、ここ（こ開示する培養技法は次の如き利点を有
する。すなわち、■　培養中の細胞は、膜の透過度上限
よりも大きな寸法を有する要素による汚染から保証され
、まだ剪断力ないし機械的損傷からも保護される。

これは、培養法に通常付帯する取扱い要件ないし滅菌要
件が幾分緩和されうろこと全意味する。々ぜなら、微生
物は、カプセル化されたイ■Ｉ胞に；？ｊ’　Ｌ得ず、
またウィルス感染した細胞が他〆］１１胞全イ゛η染す
ることもないからでちる。

２　カプセルは、高分子が原料が留めおかれている環境
内で細胞を事実上不動にし、しかもより低分子量の細胞
栄養や産生物が容易に取り出され或は導入される。この
ことから、細胞を損うことなく、栄養流体培養基を既述
の如く間欠的に或は連続的に集め、また補給することが
可能となる。

：３　細胞によって産生された興味ある物質は、一層容
易に回収される。高分子量の血清成分等はカプセル外培
養基中に解放されず、カプセル内に蓄積する。かくして
興味ある細胞生成物の回収が簡素化される。すなわち、
膜の透過度上限よりも大きな分子寸法を有する分泌され
た細胞産生物はカプセル内に蓄積する。熱論、細胞膜外
に分泌されない細胞産生物にも、興味あるものがある。

これらの産生物は、カプセルを単離し引続き例えば後述
の技法を用いてカプセル膜を選択的に破壊し、必要に応
じて細胞膜を破壊することにより比較的濃厚な形状で回
収することができる。

４　カプセル内容積は、細胞分割によく適した環境を供
与する。懸濁物培養は、カプセル内部で有糸分裂するこ
とが観察されている。標準培養においては二次元の単層
で増殖する固定基質依存細胞がカプセル内に配列すべく
増加する。かかる−１田胞は基質として膜の内面を用い
且つ（或は）、カプセル内部に配置された既述の高分子
母材料に係留する。これは、在来の培養物と比較したと
き細胞密度の有意な増加をもたらす。かかる細胞群の継
続的生存能力は、カプセルの表面積対容積比がかなり大
きく、かくして細胞膜てが所要栄養、酵素等への近づき
を得るという事実によって促進される。

成る特定の状況において、細胞を、損うことなく開放す
るためにカプセル膜を選択的に破壊することが有利であ
る。注目しうる一つの例はインターフェロン（ＩＮＦ）
の製造にある。ＩＮＦｉ産生ずることのできる細胞は、
ＩＮＦｆｉ造工程に両工程、用意された成る種のウィル
ス又は核酸に付されねばならない。また、いくつかのＩ
ＮＦ誘発方法では、たん白質合成を抑制するだめの試薬
を培養物に添加する。従って、培養の増殖工程は、ＩＮ
Ｆ誘発工程とは全く異なる条件下で実施されねばならな
い。

もし、ＩＮＦ誘発に用いられる物質がカプセル膜の透過
度上限よりも大きな分子量であるなら、（ウィルス誘発
の場合のように）誘発処理は、カプセル化された細胞の
培養物中で遂行され得ない。従って、工ＮＦ＆生性細胞
は、これをカプセル内で増殖するとき誘発処理に付さし
めるために膜の破壊によって解放されねばならない。

膜の破壊 と述せるタイプの膜内に留めおかれた７圃胞は、このカ
プセル化細胞に有意には悪影響しない性質を有する市販
試薬を用いる方７’ｂｂζよって放出せしめられうる。

先ず、カプセルをその懸濁培養基から分流し、十分に洗
浄して、マイクロカプセル外部に存在する汚染物を全て
除去し、次いで、このマイクロカプセルを、カルシウム
イオンの如き単原子多価カチオ／と、ポリスルホン酸塩
若しくはボリリ／し酸塩の如き複数のアニオン部分を有
するストリッピング重合体との混合８液（で攪拌下で分
散させる。この工程に好ましいのは、天然のスルホン化
多糖類へバリンである。用いられるストリッピング重合
体のアニオン電荷濃度は、膜を形成するのに当初用いら
れたポリアニオン原料の電荷密度に等しいか、好ましく
は該密度よりも高くあるべきである。重合体の分子量は
、少くとも、膜形成時に使用せる複数のカチオン基を有
する重合体の分子量に相応し、好ましくは該分子量より
も大きくあるべきである。上記７昆合１・容Ｃ夜中のカ
ブ七ル懸濁物内では、水溶性ゴム上のアニオン箇所（て
ついて、カルシウムイオンが膜形成に使用せる多カチオ
ン重合体鎖と競合し、同時に重合体鎖上のカチオン箇所
について、＠液中に俗解せるヘパリン若しくは、複数の
アニオン部分を有する能の重合体が膜内のゴムと競合す
る。これは、例えばボＩＪ　ＩＪシンおよびヘパリンの
水分散性好ましくは水溶性錯体にして、ゲ゛ルの分子に
より単原子カチオンと結合したものをもたらす。

この工程によって、膜は、後続の金属イオン封鎖剤に暴
露されるとき溶解しやすくなる。なお、この金属イオン
封鎖剤は、ゲルから単原子イオン全吸収することによっ
て破壊処理全完了させる。

培養基中にカプセル膜の破片が残存するとしても、それ
は細胞から容易に分離することができる。

選択的な破壊処理の第一工程で現在好ましい溶液は１１
％（ｗ／ｖ　）の塩化カルシウムと、溶液１ｍｌ当り５
００〜１，５００単位のヘパリンを含む。懸濁物の全容
積に対し約２０〜３０％を占めるに十分なこの溶液にマ
イクロカプセル１容を加える。細胞全収容せるカプセル
膜を破壊するのに塩化カルシウムとヘパリンが好ましい
。なぜなら、両試薬はほとんどの細胞と生理学上相客し
得、それ故に細胞損傷の可能性を最小限におさえるから
である。

アルミ−ラム塩又は他の多価カチオン（但しＭｇ廿イオ
ンを除外）の混合物も亦、既述タイプのポリスルホン酸
塩若しくはポリシん酸塩と一緒に用いることができる。

一般に、この工程で用いられる単原子イオンおよびアニ
オン重合体の濃度は広範囲で変動することができる。最
適濃度は実験によって容易に決定されうる。而して、そ
れは、膜形成に用いられる特定の重合体および暴露時間
によって異なる。

現在、選択的破壊を行なうのに好ましい金属イオン封鎖
剤はくえん酸ナトリウムであるが、しかしくえん酸およ
びＥＤＴＡの他のアルカリ金属塩を用いることもできる
。くえん酸ナトリウムを用いる場合、その最適濃度は５
５　ｍＭ程度である。くえん酸塩又は他の金属イオン封
鎖剤を等張件の食塩水に溶かして細胞排傷を最小限にお
さえることが好ましい。

更に、本発明は下記の非制限例から理解されよう。

例１：インシュリンの製造 ヒト死体又は動物の膵臓からランゲルハンス島を取得し
、これをｌ　ｍｌ当り約１０３個の高濃度で完全な組織
培養（ＣＭＲＬ−１９６９、カナダ国トロント所在のＣ
ｏｎｎａｕｇｈｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に加え
る。

この組織培養には、インシュリン製造のためβ細胞によ
って用いられるアミノ酸のみならず、島の継続的生存能
力に必要な栄養全てが含まれている。

次いで、ｌ　ｍｌ当シ１０３個濃度の島懸濁物０．４　
ｍｌを生理的食塩水中１．２　％のアルギン酸ナトリウ
ム（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）
　０．５　ｍ１１！容に加える。

そのあと、１５係の塩化カルシウム溶液ヲ用いて、既述
の如く形成した浴液の小滴をゲル化させる。針の先端よ
り出てくる、径が３００〜４００μ程度の小滴はこのカ
ルシウム溶液に入ると直ちにゲル化する。次いで、ゲル
化したカプセルを、０．６％のＮａＣｌ中２係の２−（
シクロヘキシルアアミノ）エタンスルホン酸緩衝剤溶液
（等張性、ｐＨ＝８．２）１部を１チの９ａＣｌ。２０
部で稀釈してなる溶液１５ｍ１の入ったビー力に移し入
れる。３分間の浸漬後、カプセルを１係のＣａＣ１゜で
２回洗浄する。

次いで、該カプセル金、生理的食塩水中１係のポリリシ
ン（平均分子量３５，０００ダルトン）　１／８０より
なる溶液３２ｍｅに移す。３分後、ポリリシン溶液をデ
カンテーションする。カプセルを１％のＣａＣ１□で洗
浄し、これを随意、モルホリノプロパンスルホン酸緩衝
）夜中３．３％のポリエチレンイミン原液（０，２Ｍ１
７）Ｈ＝６）を０．１２％の最終重合体濃度とするのに
十分な１％ＣａＣ］２で稀釈して製せられるポリエチレ
ンイミン（Ｍ　Ｗ　４０．０００〜６０．０００　）溶
液に３分間再懸濁させる。得られた「恒久的」半透膜を
有するカプセルを次いで１％のＣａｄｌ。

で２回、生理的食塩水で２回洗浄し、そして０１２チの
アルギン酸溶液ＩＱｍＪと混合する。

カプセルは凝集化に抵抗し、多くはランダル・・ンス島
を含むとみることができる。カプセル内部のゲルは、該
カプセルを食塩水とくえん酸發衝１夜（ｐＨ７，４）と
の混合物に５分間浸漬すること（でよって再液化する。

最後に、該カプセルｆ、ＨＧＭＬＲ−６９培養基に懸濁
させる。

顕微鏡下で、これらのカプセルは、個々の細胞をその内
部にみることのできる島を囲った非常に薄い膜よりなる
ことがわかる。約十万までの分子量を有する分子は膜を
横切ることができる。このことから、培養基中に用いら
れる血葉成分（すなわち低分子量のウシ胎児性血漿成分
）、栄養、アミノ酸および酸素が島に到達し、インシュ
リンを分泌させる。

生理的食塩水中で反復洗浄後、上記手順に従って製せら
れた、約１５個の島を有するマイクロカプセルｆ　ＣＭ
ＲＬ　−１９６９３ｍｅに懸濁させる。６００　ｍ９／
ｄｅ濃度でグルコースを存在させて８日経たのち、カプ
セルは、カプセル外培養基中に１回の実験で１５時間中
６７単位／ｍｌのインシュリンを分泌した。２回目の実
験では、同じ時間内で６８単位／ｍｅのインシュリンを
産生した。また、同じ培養基中、１００　ｍｑ／　ｄｌ
濃度でグルコースを存在させて１週間経たカプセルは最
初の実験で１２時間中２５単位／ｍｉのインシュリン全
分泌し、２回目の実、験では１０単位／ｍｌを分泌した
。

例２　：　ＩＮＦ−βの製造 ヒトの包皮組織と既知方法によシトリプシンとＥＤＴＡ
で５分間３７Ｃで処理して得た繊維芽細胞を、４０％（
ｖ／ｖ　）の精製したウシ胎児性血清、０８チのアルギ
ン酸ナトリウム（シグマ）および２００μｆ／ｍｅの精
製子ウシ皮コラーゲンを補った完全培養基（Ｇ　ＭＬ　
Ｒ−１９６９Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ　Ｌａｔｎｒａｔｏｒ
ｉｅｓ）に懸濁させる。細胞懸濁物の密度は約１．５　
Ｘ　１０７個細胞／　ｍｌである。例１に記載の如く、
アルギン酸塩の一層カプセルを形成する。これヲポリリ
ンン（ＭＷ４３．０００ダルトン）の０．００５　％　
（Ｗ／ｖ　）水溶液に３分間懸濁させることによって、
カプセルの表面層に半透膜を沈着させる。

得られたカプセルを、１０チのウシ胎児性血清を補った
ＧＭＬＲ−１９６９培養基に意濁させる。上記工程は全
て３７Ｃで行なう。同じ温度でインキュベートしたのち
、カプセルを顕微鏡下で試験するとき、それは、有糸分
裂を行なって、マイクロカプセル内に３次元の線維芽細
胞形態を示す細胞を含むことがわかる。

４〜５日間インキユヘートシ、たのち、カプセル内の繊
維芽細胞をＶｉｌｃｅｋ法によるＩＮＦ−β超誘発技術
に付す。５係のＣＯ□（９５チの空気）雰囲気下、ウィ
スコンシン州ミルウオーキ所在のＰＬＢｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓより入手される二重ラセンＲＮＡ（既知のＩＮ
Ｆ−β誘発剤）ポリニーポリＣ１００μｙ−／ｍｌとシ
クロヘキシイミド（たん白質合成抑制剤、カリフォルニ
ア州うジョラ所在のＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ　）５０μｆ
　／ｍｌの存在下３７ｔｒで１時間インキュベートする
。１時間後、懸濁せるカプセルを、シクロヘキシイミド
５０１１ｇ−／ｍｅｆ含む培養基（ＧＭＬＲ−１９６９
）で洗浄し、次いで再び、同じ溶液中に５％Ｃ○２雰囲
気下３７Ｃで３時間懸濁させる。このインベーションが
完了したとき、洗浄工程を繰返し、シクロヘキシイミド
５０μｆ／ｍｅとアクチモミシ７Ｄ（既知のＲＮＡ合成
抑制剤、Ｃａｌｂｉｃｃｈｅｍ　）５μｆ／ｍｌを含む
培養基にカプセルを再懸濁させて、５６ｉ）ＣＯ２雰囲
気下３７′ｃで２時間インキュベートする。次いで、カ
プセルを培養基で２回洗浄し、血清不含培養基に３７Ｃ
で１８〜２・１時間懸濁させる。この間、繊維芽細胞は
ＩＮＦ−βを分泌する。

これは２１，０００グルトン程度の分子量を有し、カプ
セル外培養基から収得される。

例３　：　ＩＮＦ−βの製造 例２の手順を反復したが、但し誘発に先立ち、カプセル
膜を選択的に破壊して、ポリニーポリＣが繊維芽細胞に
一層容易に近づきうるようにする。

破壊工程は次のように実施する。

ｌ　ｍｌ当り約５００〜１０００個のカプセルを含むマ
イクロカプセル懸濁物ＩＱｍｉ部分を沈降させ、懸濁培
養基を吸引によって除く。該カプセルをりん酸塩緩衝剤
入り食塩水（ＰＢＳ、　ｐＨ＝　７．４　）で２回洗浄
する。次いで洗浄したカプセルを、ヘパリン１０００単
位／ｍｅおよびＧａＣ１２ｉ１％　（ｖｒ／　ｖ）　ｆ
含むアリコート３．０ｍｌと混合する。この懸濁物ヲ３
７Ｃで３分間かき混ぜたのち、カプセルを沈降させ、上
澄み液の吸引除去後、該カプセル’ｔｏ、１５ＭのＮａ
０１３．０　ｍｌで２回洗浄する。２回目の洗浄Ｋ　ｑ
吸収したのち、カプセルに、等容量の１１０　ｒｎＭ　
（えん酸ナトリウムと０．１５　Ｍ　Ｎａ１ｌよりなる
混合溶液（ＰＨ７，４）２．０ｍ１ｆ混合する。該混合
物を１分間手で渦動させて膜の溶解を誘い、そのあと細
胞を培養基で２回洗浄する。

次いで、細胞を培養基に懸濁させ、例１に記載の誘発工
程に付したのち、再度例１に記載の如くカプセル化する
。次いで、カプセル野濁物亡血清不含培養基中で１８〜
２４時間インキュベートし、その間細胞からＩＮＦ−１
３が分泌され、このものはカプセル膜を通り抜けてカプ
セル外培養基中に蓄積する。

例２および例３を、ポリニーポリＣ（５Ｓ）（沈降値、
二重ラセンＲＮＡ＝ｉ構成すべくアニールされたボリエ
とポＩＪ　Ｃ）　’に用いて実施するとき、それは下記
のＩＮＦ−β産生量（細胞１０５当りのＩＮＦ−β単位
数）をもたらす： ｌ　　　　　　」ユ 例１　　　２５　　　　　２５ 例３　　　２，５００　　　　２．５００例２および例
３を、ポリニーポリｃ　（１２ｓ）（沈降値、購入時二
重ラセン）を用いて実施した場合、それは下記のＩＮＦ
−β産生量（細胞１０５個当りのＩＮＦ−β単位数）を
もたらす：１　　　　　　　」工 例２　　　２５　　　　　２５ 例３　　　　２５００　　　　２．５００例３の手順を
用いたとき例２の場合よりも産生量が１００倍高いこと
の少くとも部分的根拠は、例３の手順によるときポリＴ
−ポＩＪ　Ｃが細胞に、より近づきやすいという事実に
あると信じられる。

例４ 例２の手順を繰返すが、但しコラーゲンを含まないカプ
セルを用いる。カプセル化した１細胞を在来の単層培養
基中で増殖させ、トリビンで処理し、ポリニーポリｃ　
（５Ｓ）で誘発し、同時にマイクロカプセル化した。カ
プセル外培養基は、細胞１０５個当り２．５００単位の
ＩＮＦ−βを含むことがわかった。

例５：モノクローナル抗体 ＭＩＴのＨｅｒｍａｍ　Ｅｉｓｅｎ　より入手したハイ
ブリド−マ細胞を３．０Ｘ１０　　個細胞／　ｍｅの密
度に培養した。この細胞は、従来技術で今日よく知られ
た方法によりマウスの牌細胞とマウスの骨髄腫細胞から
融合され友もので、培養中ジニトロフェニルウシ血清ア
ルブミンに対する抗体を産生じた不死の細胞系を構成す
る。ウシ胎児性血清０．６　ｍｌと生理的食塩水（１５
０ｍＭ）　０．３　ｍｌに１４係のアルギン酸ナトリウ
ムを含有する懸濁物２．１　ｍｌを加えることによって
、細胞懸濁物３ｍｌアリコートを調製した。この懸濁物
の小滴を直ちにＣａＣｌ２溶液中でゲル化し、次いでポ
リＬリシンの０．０１６重量係溶液で処理した。得られ
たカプセルの内部を、１１０ｍＭのくえん酸す）　ＩＪ
ウム１部と１５０ｍＭの食塩水３部の溶液に６分間浸漬
することによって再液化した。

次いで、ハイブリドーマ細胞を含むカプセルを、２０％
の熱失活ウシ胎児性血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培養
基（Ｃ１ｂｃｏ）の混合物中に懸濁させた。

ハイブリド−マ培養物のカプセル化した場合としなかっ
た場合の細胞のカウント数および、これらカプセル化培
養物と未カプセル培養物により産生されたモノクローナ
ル抗体の量全周期的に測定した。その結果を第２図のグ
ラフに示す。

例６：白血球からのエトＩＦ−α アメリカンレッドクロス（Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｒｅｄ
Ｃｒｏｓｓ）から取得せる軟膜３０　ｍｌ　ｔ　５　％
　（Ｄ　ＥＤＴＡ３、ｏｍｔ、テ処理し、４　’Ｃ）０
８３　％　Ｎ　８４Ｇ　ｌ　ヘノ反復１０分間暴露に付
して赤血球を溶解させた。ＮＨ４Ｃｌによる処理の合い
間に５分間の遠心処理（４ｒで１２００ｒｐｍ）　ｆ行
なった結果、残存せる完全な白血球から残層が分離され
た。次いで、細胞Ｑ　ＭＥＭ（最小必須培養基、血清不
含、Ｇｉｂｃｏ）に懸濁させ、１００の要素によって稀
釈し、トリブタン青で１５分間染色した。試料について
行なった細胞のカウントは、軟膜３０ｍ１当り１．３　
Ｘ　１０　個の白血球が生き残ったことを示した。次い
で、該細胞を、２チの熱失活ウシ胎児性血清を補なった
培養基に１Ｘ１０個拙胞／ｍｅの濃度で懸濁させた。

この細胞懸濁物を攪拌下センダイウィルス（各種濃度の
ヒーム凝集（ＨＡ）単位／ｍｅ、メリーランド所在のＦ
ｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）に３７Ｕで１時
開暴露することにより、誘発工程全実施した。次いで、
室温で遠心処理することにより、細胞からウィルスを分
離し、細胞を等容量のＭＥＭ−４％熱失活ウつ胎児性血
清と１４係アルギン酸す）　ｌ）ラムに再懸濁させた。

カプセル企既述の如く形成し念のち、これを血清不含培
養基と血清含有培養基（こ再懸濁させた。これら試験試
料のカプセル外培養基中で検出されたＩＮＦ量に有意な
差はなかった。

また、未カプセル対照培養物におけるＩＮＦ産生量も同
じであった。これらの実験結果を下に示す：センダイウ
イルス　　　　ＩＮＦ産生単位アメリカンタイプカルチ
ヤーコレクシヨ／（Ａ＋ｍｅｒｉｃａ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ
１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　）からのナマルワ
（Ｎａｍａｌｗａ　）細胞を慣用培養基中で増殖させ、
また同細胞をマイクロカプセル封入後、１０％熱失活ウ
シつ児性匍清を補ったＲＰＭＩ−１４６０培養基中で増
殖させた。ｌ容の未カプセル細胞懸濁物、またカプセル
封入した細胞懸濁物をＩＮＦの誘発産生処理に付した。

培養基には実質上等数の細胞が含まれた。未カプセル細
胞培養基とカプセル化細胞培養物に、２回蒸留した水中
２５ｍｔ）／ｍｌ濃度のブロムデオキシウリジンを加え
て有糸分裂を抑制した。３７ｒで３６時間のインキュは
−シロ／後、両細胞培養物を洗浄し、次いで２多熱失活
ウシ胎児性血清を補ったＲＰＭＩ　−１６４０培養基に
懸濁させた。

次いで、カプセル化細胞培養物を処理して、そのカプセ
ル膜を選択的に破壊した。該カプセルを生理的食塩水で
３回洗浄し、１．１チのＣａＣ１□を含む１０００単位
／　ｒｎｌヘパリン溶液中３７Ｃで１０分間インキュイ
ードしたのち、食塩水で再洗浄した。

洗浄せるカプセルを次いで、生理的食塩水中稀くえん酸
ナトリウム溶液とともに３７Ｃで５分間インキュ（−ト
シた。この時点でカプセル懸濁物を攪拌したところ、膜
の溶解とナマルワ綿胞の解放がもたらされた。次いで、
細胞懸濁物を遠心処理して残層を除き、くえん酸塩／食
塩水で数回洗浄した。

そのちと、両培養物を、１．　ＯＸ　１０６細胞／ｍｅ
の密度で、２％熱失活ウつ胎児性血清と緩衝１ｆｆｌ（
ｐＨ７，４）を補った新た力ＲＰＭＩ−１６４０培養基
中に悲濁させた。

在来の培養物と以前カプセル化した培養物に、羊水中ノ
ニューキャツスル病ウィルスのバ／コフスキ（Ｂａｎｋ
ｏｗｓｋｉ　）株を加えた。このウィルスは、１、０　
Ｘ　１０　　ｐｆｕ／　１ｎｅの濃度であり、カリフォ
ルニア州ディビス所在のボウルトリーヘルスラボラトリ
ーズ（Ｐｏｕ、１もｒｙ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ　）より購入した。イ側泡１°罰濁物ＩＱ
ｍｌ毎にウィルス１ｍｅ金加えた。培養物を３７Ｃで２
４時間インキュに一トし念。

次いで、旧用培養物を五つの部分（下記１〜５）に分け
、また以前カプセル化した培養物は四つの部分（下記６
〜９）に分けた。培養物の９アリコートを各々、下記処
理後ＩＮＦ産生に関して試験した。

■　処理せず ２２係の熱失活ウシ胎児性血清を含むＲＰＭＩ’−１６
−１０に再晋濁 ３　血１ｎ不含ＲＰ　Ｍ　ニー１６　＝１０　Ｋ　再懸
濁・１．　　ＲＰＭＩ−１６４Ｑ培養基と５多熱失活ウ
ン胎児性血〃ｔと一緒にカプセル化し、生成せるカプセ
ルを血清不含培養基中に懸濁 ５、　　ＲＰＭＩ−１６４０培養基と５多熱失活ウシ胎
児性血清と一緒にカプセル化し、得られたカプセルを、
２チウン胎児性血清を含む培養基中に懸濁６　血清不含
培養基に再懇濁 ７．２多熱失活ウシ胎児性血清を含む培養基に再懸濁 ８、培養基＋５チ熱失活ウシ胎児性血清と一緒に再カプ
セル化し、得られたカプセルを血清不含培養基に懸濁 ９　培養基＋５係熱失活ウン胎児性血清と一緒に再カプ
セル化し、得られたカプセル全培養基＋２係血清中に懸
濁 細胞培養物１〜９各々におけるＩＮＦ−α１単位を産生
するのに必要な細胞量を次表に示す：３　　−　　　　
　　８　　１０００．３６０４　　６８０　　　　　９
　　２００．１００他の具体化も、前掲特許請求の範囲
内で実施される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の概念を例示する略図であり、第２図
は例５に記載の実験結果を示すグラフである。 第１図中主要な部分を表わす符号の説明は以下の通りで
ある： １０：細胞　　　　　　１２：カプセル膜１４：培養基
　　　　　１６：孔 １８：高分子量の要素又は血清成分 ２０：細胞に必要々成分 ２２′：興味ある物質　　２２：代謝生成物Ｃ９ｋｈテ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生きている細胞によつて産生される物質を製造する
   方法であつて、 Ａ、該細胞を、選択された透過度上限を有する膜の中に
   封入、カプセル化し Ｂ、該カプセル化せる細胞を水性培養基に懸濁させ、 Ｃ、該細胞にインビトロ代謝を行わせ且つ前記物質を分
   泌させ、 Ｄ、該カプセル内に上記物質を蓄積させ、 Ｅ、該物質を前記カプセルの中より取得する 諸工程からなる方法。 ２、カプセル化工程（Ａ）が、水不溶性の塩結合せるマ
   トリツクスを生成すべく重合体鎖上のカチオン基と水溶
   性ゴム上のアニオン基とを反応させて膜を形成すること
   により遂行される特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、カプセル化工程（Ａ）が、 １）細胞を、該細胞と生理学上相容し得しかも複数のア
   ニオン部分を有する水溶性ゴムを含有する水性培養基中
   に懸濁させ、 ２）該懸濁物を、細胞を含む小滴に形成し、 ３）この小滴を、生理学上相容しうる多価カチオンの溶
   液にさらして、該小滴を、ばらばらな或は離散した、水
   に不溶の保形性一時カプセルとしてゲル化し、 ４）この一時カプセルを、前記アニオン部分と反応しう
   る複数のカチオン基を有する重合体にさらすことにより
   該カプセルの表面層を架橋して前記小滴周囲に半透膜を
   生成する 諸工程によつて遂行される特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ４、工程４）で形成された膜の中のゲルを再溶解させる
   追加工程を含む特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５、細胞が、該細胞を維持し且つ物質のインビトロ生合
   成を許容するのに十分な完全細胞培養基と一緒にカプセ
   ル化される特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、工程（Ｂ）で用いられる水性培養基が、細胞を維持
   し且つ物質のインビトロ生合成を許容するのに十分な完
   全細胞培養基である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７、物質のインビトロ生合成を許容するために、膜の透
   過度上限よりも大きな分子量を有する成分を細胞が必要
   とし、而して細胞と一緒に該成分をカプセル化する追加
   工程を含む特許請求の範囲第５項記載の方法。 ８、細胞が哺乳類の細胞である特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ９、カプセル内で細胞に有糸分裂を行わせる追加工程を
   含む特許請求の範囲第１項記載の方法。 １０、細胞が、遺伝子操作された細胞である特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 １１、カプセル化工程（Ａ）において、約０．５ｍｍ以
   下の径を有する球状マイクロカプセルが形成される特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 １２、工程（Ｅ）で収得される物質が、インシユリン、
   グルカゴン、プロラクチン、トマトスタチン、チロキシ
   ン、ステロイドホルモン、脳下垂体ホルモン、インター
   フエロン、ＦＳＨおよびＰＴＨよりなる群から選ばれる
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 １３、工程（Ｂ）で収得される物質が、ホルモン、イン
   ターフエロン、リンホカインおよび抗体よりなる群から
   選ばれる特許請求の範囲第１項記載の方法。 １４、工程（Ａ）でカプセル化される細胞が、物質の産
   生を保持するために膜の透過度上限よりも大きな分子量
   を有する成分との接触を必要とし、而して工程（Ａ）で
   は、この成分を細胞と一緒にカプセル化し、工程（Ｂ）
   で用いられる水性培養基には該成分が実質的にない、特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 １５、選択された透過度上限が約１．５×１０＾５ダル
   トンである特許請求の範囲第１項記載の方法。 １６、細胞がハイブリドーマ細胞よりなり、物質が、選
   択された透過度上限よりも大きな分子量を有するモノク
   ローン抗体よりなり、該抗体が膜内から収得される特許
   請求の範囲第１項記載の方法。