JPS61189218A - カプセル封入方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、細胞または組織のような生物学的活性物質、
あるいは生化学的または化学的活性組成物なカプセル封
入る、方法および活性物質を含むカプセル封入系に関る
、。

生化学的生産と生物工学的応用において、細胞、微生物
などの活性物質の健康と生育力は重要である。これらの
活性物質が、多種の用途のある生物学的および生化学的
活性成分を生産る、ことができるからである。例えば、
細胞は抗体、ホルモン、リンフ才力イン、抗生物質、イ
ンタフエロン、およびその他の生化学剤および化学薬品
を生産る、ことができる。咄乳動物の細胞系統は、細胞
の生育力と成長を促進し且つ望みの微生物学的または生
物学的生成物の連続生産を可能ならしめるための栄養素
を含有る、水性媒体に囲まれることにより成長させられ
る。所謂微粒子担体な利用る、ことが提案された。この
ものは適当な電荷と交換能力を有る、ビーズ玉であって
、その上で細胞の成長を効率良く促進る、。微粒子担体
自身は、細胞の成長と望みの微生物学的生成物の生産を
促進る、ために適当な栄養素を含む水性懸濁液中に保持
るが、それは多くの場合非常に希薄な濃度にある。

その後に望みの生成物を採取る、ことはそのため難しく
且つ時間のかかるものにされる。

微生物学的生成物の採取に伴なう問題を見服る、ために
、ある種の膜の内部に細胞または微生物を封入る、こと
が提案された。その膜は、細胞または微生物によって生
産された微生物学的生成物を封入用カプセルの内に留め
置きながら、栄養物を細胞または微生物によって代謝さ
せる。そのような方法は、例えは、米国特許第４，４０
９．３３１号および第４．３５２．８８３号において開
示されている。生物学的活性物質を囲む半透膜は、ある
分子量以下の物質がその半透膜を通過できるように選択
された透過性を有る、。膜の透過性を調節る、ことによ
り、また望みの生成物の大兄の分子の大きさを知ること
により、活性物質と半透膜の間にその生成物を閉じ込め
ることができる。遺憾ながら、米国特許第４．４０９，
３３１号および第４．３５２，８８３号に記載された方
法は、膜が初めに作られたゲルの玉の表面から形成され
ることを必要とる、。このことは、微生物または細胞が
必要とる、栄養物の拡散がそれによって防害されずに望
みの微生物学的生成物の生成を促進る、ように、玉の内
部がその後で液化されることを必要とる、。さらにまた
、そのゲルの液化は、半透膜と微生物または細胞との間
の空間が細胞の生産または生成物のいずれのためにも利
用できるように非常に強く要望される。典型的な例では
、従来の技術による膜はアルギネート溶液中の細胞浮遊
液から形成され、その液は塩化カルシウム水溶液に滴下
して加えられ、それによって固いゲルのビーズ玉が形成
される。そのビーズ玉は次にＮ−シクロヘキシラミンエ
タンスルホン酸（ＣＨＥＳ　）によって洗浄されてから
、続いて塩化ナトリウムで洗浄される。その後、ポリリ
シン溶液を刃口えて、アルギネート表面とポリマー錯体
を形成る、。この表面は次にＣＨｇ８　／塩化す）　Ｉ
Ｊウムで、続いて塩化カルシウム次に塩化ナトリウムで
洗浄される。その膜はそれからインキュベーター中で保
温されてから、膜内のゲルは続いて塩化ナトリウムによ
る２回の洗浄、保温、クエン酸ナトリウムと塩化ナトリ
ウムによる洗浄、塩化ナトリウムによる洗浄、およびそ
の後最終の洗浄によって液化される。明らかに、このよ
うなカプセルに封入された微生物学的活性成分を形成る
、ための方法は時間がかかり且つ難しいので、液媒体に
浮遊された細胞または微生物を封入したカプセルをうま
く作るためには高度の実駁技術を必要とる、。その上、
これらの複雑な、時間のかかる工程の間に、細胞の生育
力、生産性またはその他の特性が変えられることもあり
得る。

生物学的活性物質を生産る、ことのできる微生物または
細胞をカプセルに封入る、手段であって、細胞または微
生物の内および外への物質移動を促進る、ため固体の担
体を液化る、必要を除く手段を与えることができれば非
常に望ましいことであった。さらにまた、カプセルに封
入された細胞または微生物を形作る、ために必要な工程
の蚊を徹底的に減る、ことのできるカプセル封入の手段
を与えることは望ましいことであろう。その上、広い範
囲の透過度を有る、ことのできる膜の形成な可能にし、
また多種の生物学的または化学的活性分子の単離または
選択的分離を可能にる、ようなカプセル封入手段を与え
ることは望ましいことであろう。

発明の要約 本発明により、生物学的活性組成物または生化学剤、例
えば酵素またはホルモン、などを生産る、ことのできる
細胞、微生物などおよび／または非生化学剤、例えば基
質、反応物または触媒など、はアニオン性ポリマーとカ
チオン性ポリマーの組合せから成るポリマー錯体によっ
てカプセル封入される。「活性物質」という用語はここ
では生物学的活性物質を生産る、細胞、微生物など、あ
るいは酵素、ホルモン、抗体、殺虫剤、触媒、基質、反
応物などのような組成物であって、本発明に従ってカプ
セルに封入される活性物質を包含る、ために使用される
。活性物質はカチオン性ポリマーかアニオン性ポリマー
組成物のいずれかの溶液中に浮遊させられる。活性物質
を含むポリマー組成物はそれから液体粒子に形成され、
例えば毛細管からの滴粒またはＩ！ｌｉ１′霧などの形
で他のポリマーに加えられて、液体の心部を囲む膜から
成るカプセルを形成る、。活性物質は液体の心部に浮遊
させられて膜の内部に収容されている。カプセルはそれ
から洗浄されて、使用の準備をる、かあるいはそれから
適当な媒体中に入れられて使用の時まで貯蔵される。膜
の透過度は、カプセルの調製の際に使用される溶液中の
カチオン性およびアニオン性ポリマーの濃度の調節、カ
チオン性ポリマーまたはアニオン性ポリマーが調製され
る水溶液のＰＨ１各溶液中の対イオンの存在または不在
、およびアニオン性ポリマーおよびカチオン性ポリマー
の分子量ならびに特定のポリマーの選択によって調節さ
れる。

本発明の方法は活性物質を含むカプセルの心部を液化る
、必要を除き、且つまたカプセル封入される活性成分の
生物学的、生化学的または化学的活性に逆作用し得る多
種の試薬により何回も洗浄る、工程の必要も除く。その
上、本発明の方法は広い範囲の分子型および分子量に亘
る広範な種類の生物学的活性分子に応用る、ことができ
る。それはカプセルの周囲に形成される膜の透過度を広
く変化させることができるからである。従って、膜の透
過度を調節る、ことによって種々の性質の生物学的活性
化合物を分離し、単離しまたは選択的に分離る、ことが
可能である。

特定の態様の説明 本発明によると、生物学的活性組成物を含むかまたは生
産る、ことのできる活性物質が、例えば細胞の栄養素の
ような種々の化合物の輸送を可能にし、且つ膜の内部で
生産される化合物を選択的に収容る、ことのできる膜の
内にカプセル封入される。活性物質は細胞、微生物、組
織あるいは化学的または生化学的反応物であり得る。化
成的な適当な細胞は融合細胞、例えばハイプリドーマ細
胞、または組換えＤＮＡ技術によって製造された遺伝的
修飾＃ｌ胞および抗体を生産できるりンバ球細眠な含む
。

その上、バクテリアのような微生物を本発明によってカ
プセルに封入る、ことができる。さらに　　　また、生
物学的活性組成物（例えば酵素、ホルモン、抗生物質、
抗体など）を、膜を通して制御して放出したりまたは望
ましければ膜の内に留め置くことのできるようにカプセ
ルに封入る、ことができる。カプセルに封入された活性
成分は膜によって囲い込まれ、そしてその膜はまた活性
成分のための栄養物を含む水性媒体を収容る、こともで
きる。その水性媒体はまた活性成分によって生産される
微生物学的活性物質を溶解または浮遊させることができ
る。膜の透過度は、栄養物を膜の周囲の媒体から膜によ
って閉じ込められた水性媒体の中へ通すことのできるよ
うになっているので、その結果微生学的活性却成物が活
性成分によって生産されることが可能になる。

活性成分は先ず、（ａ）１種以上のアニオン性ポリマー
または（ｂ）１種以上のカチオン性ポリマーのいずれか
の水溶液中に浮遊させられる。選ばれたアニオン性ポリ
マーまたはカチオン性ポリマーは互いに連結された分子
状反復セグメントから形成されており、この場合それら
のポリマーは鎖に沿つて分布しているセグメント上かま
たは鎖に沿って分布した置換基上に正に荷電る、かまた
は負に荷電る、かいずれかである。荷電したセグメント
の濃度はポリマーが互いに接触した時ポリマーの静電的
相互作用と絡まりによって膜を形成させるようになって
いる。かくして得られた浮遊液を次に他のポリマーに対
して噴霧されるか、滴下る、などして液粒子として加え
、その結果アニオン性ポリマーとカチオン性ポリマーと
の界面に膜が形成される。２種の互いに反対の電荷を有
る、ポリマー間の界面が活性成分を閉じ込めると、それ
によって活性成分はカプセルに封入された状態になる。

化成的な適当なアニオン性ポリマーに含まれるのはアル
ギネート、コラビナン、ヒアルロン酸、カルボキシメチ
ルセルロース、キサンタン、フルセラランおよびスルホ
ン化有機ポリマー（通常塩の形で、例えばす）　ＩＪウ
ム塩）などである。代我的な適当なカチオン性ポリマー
に含まれるのはキトサン、ポリリシン、ポリエチルアミ
ンおよびポリビニルアミン並びにその他の、アニオン性
ポリマ−と相互作用して膜を形成る、ことのできるアミ
ンまたはイミンである。好ましいアニオン性ポリマーは
アルギネートまたはコラゲナンである。好ましいカチオ
ン性ポリマーはキトサンまたはポリリシンである。活性
成分を會む荷電したポリマーの小滴を調節る、ことによ
って、最終のカプセル封入製品の大きさを調節る、こと
ができる。典型的なカプセル封入製品は約５０ミクロン
〜５（１００ミクロンの範囲内の大きさを有る、。細胞
がカプセルに封入される場合には、カプセルの大きさは
生存に酸素を必要とる、＃Ｉ胞に酸素の移動を可能にし
、且つ望みの細胞生産物の有効な単離を可能にる、ため
に十分小さい大きさであり、典壓的には約４（１０〜８
（１０ミクロンの間である。

アニオン性ポリマーとカチオン性ボ・リマーの相互作用
によって形成される膜の透過度の調節は、２種の互いに
反対の電荷を有る、ポリマーの相対濃度、それらポリマ
ーの個々の水性媒体中の濃度、各ポリマー溶液のＰＨ％
ポリマーの分子量および溶液のいずれかに対イオンの存
在または不在などを調節る、ことによってなされる。１
対インオン」という用語は、ポリマーの荷電部分と反応
る、ことにより、そのポリマーと反対の電荷を有る、ポ
リマーとの相互作用を減少させるイオンを意味る、。例
えば、カルシウムイオンはアニオン性ポリマー上のカル
ポキンルイオンと相互作用る、。カルシウムイオンはリ
ン酸イオンによって取り除くことができる。ポリマー濃
度が増加る、と通常透過度の減少を結果として生じる。

アニオン性ポリマー組成物における−の増加は結果とし
て水素イオン濃度の増加を起し、それによりアミン筐た
はイミン基を有る、カチオン性ポリマー上に反応性カチ
オンを形成る、。望みの透過度を有る、膜の達成は工程
のパラメーターを変えることおよびアニオン化合物の導
入によって決定され、液滴または噴霧およびかくして生
成されるカプセルの外側の水性媒体中における分子量と
大きさはこれらの化合物の存在のために規定され得るの
で、その結果膜の分子量／分子の大きさ遮断水準がこの
ようにして決定される。

本発明はまた従来の技術によるカプセルに比較して改良
された機械的特性を有る、正常な膜構造を有る、カプセ
ルを提供る、。ゲル組成物から製造されてから、その後
液化される膜は強度を減じた。これは第一に、大部分の
高分子鎖がゲル化の間に膜の平面内よりもむしろカプセ
ルの内側に向って配向されるという事実によるのである
。ゲルの液化の間には、高分子鎖のこれらの部分は膜の
平面内へ再配向されないので、膜の強度に貢献しないの
である。これに反して、本発明においては、アニオン性
およびカチオン性ポリマーのイオン性部分は対イオンに
よって行動を妨害されないのでこれらの異なるポリマー
が反応的に接触る、全鎖長に沿ってそれらのポリマーは
互いに自由に反応できる。このように作用る、ことによ
って、比較的大きい鎖長のポリマーが膜の平面内に配向
される。本発明のある特別の態様においては、アニオン
性ポリマーを膜の内側よりもむしろ膜の外側に配向させ
ることができる。従って、例えば、アルギネートは外側
の膜弐面を構成る、ことができる。

１に のような結果は従来の技術の方法によっては、アルギネ
ートが初めのゲルのビーズ玉を形成る、必要があるので
不可能である。従って、本発明は使用者にカプセルの形
成においてより広い適応性を与える。本発明の他の一態
様においては、多重膜壁を形成る、ことができ、それに
よって従来技術のカプセルに比較してより大なる強度を
有る、膜を提供る、ことができる。これは、前記の方法
によって膜の外側にアニオン性ポリマーの鎖を有る、カ
プセルを形成る、ことによって達成される。

カプセルは次に周囲の水性媒体から濾過または遠心分離
のような何らか便利な方法によって分離される。カプセ
ルはそれからアニオン性ポリマーと架橋化用の２価金属
イオンの溶液と混合される。

例えば、アニオン性ポリマーとしてのアルギネートの場
合、カルシウムイオンまたはバリウムイオンを架橋化用
の２価イオンとして使用して、アルギネートポリマーの
外側膜を形成る、ことができる。

上記の方法に従ってカプセルに封入された活性成分を製
造した後、それらを浮遊させていた水性媒体から分離し
てから、次に活性成分のための栄養物を含む水性媒体中
に再び導入して、その結果微生物学的活性化合物を生産
させることができる。

またこれに反して、栄養物を事的に分離せずに、カプセ
ルに封入る、活性成分の浮遊液に加えることもできる。

仄の実施例は本発明を例証る、ものであって、本発明を
限定る、こと意図る、ものではない。

実施例■ ０．７５〜１　％　ｗ／ｖのアルギン酸ナトリウムと１
５０　ｍＭ　Ｎａ（Ｊから成るアルヤネ−１・溶液をキ
トサン溶液に滴下して加えた。キトサン溶液は０．０５
〜０．１０　、！９／ｄＡ’のキトサン、１１７　ｍＭ
ＮａＣＪ、０．０１　Ｍ　Ｃａ１ｆ２およびＱ、［１ｉ
　Ｍ　Ｈ（Ｊから成っていた。キトサン溶液のＰＨは６
．５であった。アルギネート溶液をキトサン溶液に滴下
して加えてカプセルを形成させた。そのカプセルをキト
サン溶液中で約　１　分間保温した。カプセルを含むキ
トサン溶液の試料を遠心分離または焼結がラスフイルタ
ーによって分離し、水で洗ってから別々にリン酸緩衝液
、食塩溶液、蒸溜水、または細胞培地であってダルベツ
コの修飾最／ＪＳ必須培地、５チラシ胎児血清および５
％ウシ血清を含むものに移したところ、驚くほど安定で
あることが判った。

その上、カプセルは少なくとも約２（１００　ＰＰＭは
ど高い水準の遠心分離に１０分間耐えられることが判っ
た。この実施例においては、アルギネート溶液は約６．
０センチストークスより高い粘度を有る、ことが望！し
く、一方キトテン溶液は少なくとも約１．５七ンチスト
ークスの粘度を有る、ことが好ましい。

実施例■ 実施例Ｉの手順に従って、キトサン溶液をアルギネート
溶液に滴下して加えることによりカプセルが形成された
。キトサン溶液は１６５％ψのキトサン、２．５％クエ
ン酸およびり、Ｑ　７　Ｍ　ＣａＣｌ２から成っていた
。アルギネート溶液は１．１％ｙ／ｖのアルギン酸ナト
リウムと０．５％硫酸ナトリウムか、または１　％　ｗ
／ｖのアルギン酸ナトリウムを含む溶液のいずれかより
成っていた。実施例■と同じくカプセルはリン酸緩衝液
、食塩水、水および細胞培地の中で安定であり、また少
なくとも２（１００ＰＰＭの水準の遠心分離に１０分間
以上耐えられることが判った。カプセルの心部は、キト
サン溶液中の塩化カルシウムの濃度を下げることによっ
てより一層液状になり且つより一層固体状でなくなる。

実施例Ｉ 実施例Ｉの手順に従って、キトサン溶液をアルギネート
溶液中に滴下して加えることにより液体の心部を有る、
カプセルを得た。使用されたキトサン溶液は０．１％〜
１．５％ψのキトサン、０．０５　Ｍ　ＮａＣＪおよび
０．（１０６　Ｍ　〜０．２　ＭのＣａＣｌ２を含み、
５．５〜６．６の−を有していた。アルギネート溶液は
０．１％〜１．０％のアルギン酸ナトリウムな含んでい
た。

実施例Ｉおよび■と同じく、製造されたカプセルはリン
酸緩衝液、食塩水、水および細胞培地の中で安定である
ことが判った。第１Ｎに示されるように、本発明によっ
て製造されたカプセルの破断強度は、カプセルが形成さ
れた後それを２価イオンで処理る、ことにより増加させ
ることができる。その代りに、２価イオンは、それと相
互作用をしてゲルを作らないイオン性ポリマーと共に加
えることができる。拡散特性も分子配列またはポリマー
の電荷密度に影響る、溶液の条件によって調節る、こと
ができる。実施例１に述べた手順に従って作られた種々
のカプセルの破断強度を第１表に示す。

第１Ｎ　　カプセルの破断強度に及はす２価イオンの効
果カチオン　　　　　カプセルの調製　　　　　　　破
断強度Ｃａ＋２　１．３５％キトサン、０．０５Ｎ溶液
を　　　　　　８０．５％アルギネート溶液中に滴下； カプセルの処理なし Ｃａ＋　２　　上記と同じく調製；７４３０、Ｏｉ　Ｍ
　　ｃａＣＪ２中に１０分間カプセルを処理 Ｂａ＋２　１．３５％キトサン、［］、Ｑ　５　Ｍ　Ｂ
ａ（Ｊ２　　　６９６溶液を０．５％アルギネート溶液
中に 滴下； それ以上の処理なし Ｂａ”　　　上記と同じく調製；　　　　　　　　　　
　　１６０９Ｑ、ｉ　Ｍ　ＢａＣＪ２中に５分間 カプセルを処理

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）イオン性のポリマーからカプセルの心部のゲル化
   を避けながら液体の心部を有するカプセルを製造する方
   法であつて、 少なくとも１種のアニオン性ポリマーと少なくとも１種
   のカチオン性ポリマーより成る群から選択される第１の
   イオン性ポリマーの水溶液から非ゲル液の小滴を形成し
   、前記非ゲル小滴を少なくとも１種の第２のイオン性ポ
   リマーの溶液と接触せしめ、その際第２のイオン性ポリ
   マーとして第１のイオン性ポリマーと反対のイオン電荷
   を有するものを使用し、それによつて第１と第２のポリ
   マーを互いに反応させて前記の小滴をカプセルに封入す
   る膜を形成する諸工程から成ることを特徴とする上記の
   方法。 （２）前記小滴が活性物質を含有する、特許請求の範囲
   第１項に記載の方法。 （３）前記活性物質が少なくとも１つの生きている細胞
   である、特許請求の範囲第２項に記載の方法。 （４）前記活性物質が微生物である、特許請求の範囲第
   ２項に記載の方法。 （５）前記細胞がハイブリドーマ細胞である、特許請求
   の範囲第３項に記載の方法。 （６）前記細胞がリンパ球である、特許請求の範囲第３
   項に記載の方法。 （７）前記微生物が細菌である、特許請求の範囲第４項
   に記載の方法。 （８）前記活性物質が生物学的活性化合物である、特許
   請求の範囲第２項に記載の方法。（９）前記化合物が酵
   素である、特許請求の範囲第８項に記載の方法。 （１０）前記化合物がホルモンである、特許請求の範囲
   第８項に記載の方法。 （１１）生きている細胞を特許請求の範囲第１項に記載
   の方法によつてカプセルに封入し、前記膜を生成物が透
   過しないようにするため膜の透過性を調節し、前記封入
   細胞を収集し、膜を破り、そして前記生成物を採取する
   ことを特徴とする、生きている細胞からの生成物を製造
   する方法。 （１２）前記細胞がハイブリドーマである、特許請求の
   範囲第１１項に記載の方法。 （１３）前記細胞がリンパ球細胞である、特許請求の範
   囲第１１項に記載の方法。 （１４）前記アニオン性ポリマーがアルギネートとカラ
   ゲナンより成る群から選択される、特許請求の範囲第１
   、１１、１２または１３項のいずれかに記載の方法。 （１５）前記カチオン性ポリマーがキトサンとポリリシ
   ンより成る群から選択される、特許請求の範囲第１、１
   １、１２または１３項のいずれかに記載の方法。 （１６）液体の心部を囲むポリマー膜から成り、前記膜
   が少なくとも１種のアニオン性ポリマーと少なくとも１
   種のカチオン性ポリマーとの相互作用によつて形成され
   るものであり、前記ポリマーから成る分子鎖が実質上前
   記膜の中で配向されていることを特徴とするカプセル。 （１７）前記カチオン性ポリマーが液体の心部に隣接す
   る前記膜の内側の表面を形成する、特許請求の範囲第１
   ６項に記載のカプセル。 （１８）前記アニオン性ポリマーが液体の心部に隣接す
   る前記膜の内側の表面を形成する、特許請求の範囲第１
   ６項に記載のカプセル。 （１９）前記液体の心部が活性物質を含有する、特許請
   求の範囲第１６項に記載のカプセル。 （２０）前記活性物質が生きている細胞である、特許請
   求の範囲第１９項に記載のカプセル。 （２１）前記細胞がハイブリドーマである、特許請求の
   範囲第２０項に記載のカプセル。（２２）前記細胞がリ
   ンパ球細胞である、特許請求の範囲第２０項に記載のカ
   プセル。 （２３）前記アニオン性ポリマーがアルギネートおよび
   カラゲナンより成る群から選択される、特許請求の範囲
   第１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２項の
   いずれかに記載のカプセル。 （２４）前記カチオン性ポリマーがキトサンとポリリシ
   ンより成る群から選択される、特許請求の範囲第１６、
   １７、１８、１９、２０、２１または２２項のいずれか
   に記載のカプセル。 （２５）アニオン性ポリマーを２価金属イオンによつて
   架橋化して前記ポリマー膜のアニオン性ポリマー部分に
   形成された第２の膜を含む、特許請求の範囲第１６、１
   ７、１８、１９、２０、２１または２２項のいずれかに
   記載のカプセル。 （２６）アニオン性ポリマーを、カルシウム、バリウム
   およびそれらの混合物より成る群から選択される２価金
   属イオンによつて架橋化して前記ポリマー膜のアニオン
   性ポリマー部分に形成された第２のアルギネートの膜を
   含む、特許請求の範囲第１６、１７、１８、１９、２０
   、２１または２２項のいずれかに記載のカプセル。