SE454780B - Sett att framstella interferoner och monoklonala antikroppar medelst semipermeabelt inkapslade celler - Google Patents

Description

20 25 30 35 454 780 2 malt erfordras för att uppehålla den pågående viabilite- ten och metabolismen hos de alstrande cellerna. Alter- nativt kan uppfinningen användas för att uppsamla sub- stansen av intresse i ett medium, vilket innehåller relativt små mängder av lâgmolekylära näringsämnen eller cellmetaboliska produkter.

Sättet omfattar stegen avseende inkapsling på känt sätt av celler inom ett membran, vilket är permeabelt för näringsämnena, joner och andra relativt làgmolekylära ma- terial som krävs för normal metabolism och pågående viabi- litet hos cellerna. Membranet kan vara eller behöver inte vara permeabelt för substansen av intresse som avsönd- ras av cellerna, men har i varje fall en övre gräns för permeabilitet som är tillräcklig för att medge passage av molekyler med en molekylvikt av någon utvald storleksordning, i allmänhet under ca 2,0 x 105 dalton.

De så framställda kapslarna suspenderas i ett konven- tionellt, vattenhaltigtkulturmedium, och de inkapslade cellerna får undergå normal in vitro metabolism.

Substanser med en molekylvikt under den övre permeabili- tetsgränsen för membranet, vilka avsöndras av cellerna, tränger igenom membranet och samlas i kulturmediet.

Lämpligen inkluderas högmolekylära substanser, såsom serumproteiner, vilka erfordras för hälsa och viabili- tet hos många typer av cellkulturer från högre djur, men vilka typiskt inte själva konsumeras, i mikrokapslar- na, där de är instängda och hindras från att diffundera in i kulturmediet. Substansen som cellkulturen konsumerar under metabolism och som har en tillräckligt låg mole- vikt för att medge diffusion genom kapselmembranerna, passerar från kulturmediet. Cellernas metaboliska pro- dukter med tillräckligt små molekylstorlekar för att kunna passera genom membranet diffunderar in i mediet som är på utsidan om kapslarna. Om substanserna av intres- se har en molekylvikt som är under den övre permeabilitets- gränsen, diffunderar de in i det extrakapsulära mediet, där de kan skördas relativt lätt beroende på frånvaron p 10 15 20 25 30 35 454 780 3 av kontaminerande material med högre molekylvikt som finns i den tidigare kända teknikens oinkapslade cell- kulturer. Om substansen av intresse har en molekylvikt som överskrider den övre permeabilitetsgränsen för membranerna, då samlas den i kapslarna, vilka sedan isoleras från mediet och söndras för âtervinningsproce- durer.

Uppfinningen är huvudsakligen obegränsad med hän- syn till de typer av celler som kan inkluderas inom kapselmembranerna. Det är specifikt avsett att kulturer av celler från vävnad från alla högre djur samt mikro- organismer skall kunna användas. Sammansmälta celler, t ex hybridomceller, eller genetiskt modifierade celler som åstadkommits genom exempelvis den rekombinerade DNA-teknologin som är på frammarsch, kan på samma sätt inkapslas utan svårighet. Kort sagt, förutsatt att det existerar ett kulturmedium som är lämpat för att upp- rätthålla in vitro den ifrågavarande celltypen, kan den celltypen utnyttjas i enlighet med de här beskriv- na teknikerna. Exempel på de typer av substanser som kan framställas i enlighet med sättet enligt uppfin- ningen inbegriper interferoner och monoklonala anti- kroppar.

Sättet enligt uppfinningen omfattar inkapsling av viabla celler suspenderade i ett vattenhaltigt kulturmedium inom membraner, vilka karaktäriseras av en övre gräns för permeabilitet som är tillräcklig för att medge passage av de näringsämnen som krävs för cellmetabolism och pågående viabilitet. Membranerna innesluter viabla celler som placerats i ett medium, vilket inkluderar alla komponenter som krävs för att upprätthålla cellernas metabolism och vilka är av en storleksordning som överskrider membranets övre permeabilitetsgräns. Kulturmediet omfattar komponenter 10 15 20 25 30 35 454 780 4 som krävs för att upprätthålla viabilíteten hos celler- na, vilka har en molekylvikt under membranernas övre permeabilitetsgräns.

Följaktligen är ett ändamål med uppfinningen att åstadkomma ett sätt att framställa en substans som valts bland interferoner och monoklonala antikroppar och som alstras av levande celler. Ett annat ändamål med uppfinningen är att åstadkomma ett sådant sätt vid vilket de producerande cellerna finns inom en skyddande, hälsosam mikroomgivning som innesluts av ett semipermeabelt membran, vilket är ägnat att separera produkter av cellmetabolism från högmolekylära material som krävs för viabilitet och upprätthållande av cel- lerna. Ett annat ändamål är att åstadkomma ett för- bättrat sätt att framställa interferoner och monoklonala antikroppar från cellkulturer. Ytterligare ett annat ändamål är att alstra monoklonala antikroppar och interferoner i ett serumfritt medium.

Dessa och andra ändamål med och särdrag hos före- liggande uppfinning klargöres i den följande beskriv- ningen och de åtföljande ritningarna, där fig 1 är ett schematiskt diagram som illustrerar uppfinningen och fig 2 är ett diagram som visar resultaten av de experiment som beskrivits i exempel 5.

BESKRIVNING Den vidsträckta uppfinningsidên är att anbringa ett semipermeabelt membran kring individuella celler eller grupper av celler för att tillhandahålla en mikroomgivning för cellerna komplett med cellkulturmediet och avskild av membranet från ett utanförliggande vattenhaltigt medium. Celler av däggdjurs ursprung erfordrar typiskt för fortgående hälsa och viabilitet närvaro av serum- proteiner, av vilka en andel har en molekylvikt som överskrider ca 65000-l50000dalton. I den tidigare kända tekniken avseende oinkapslade cellkulturer disper- geras material av intressefsom avsöndrats från cellerna, M 10 15 20 25 30 35 454 780 5 i kulturmediet och blandas med både högmolekylära och lågmolekylära komponenter. Eftersom mängderna av cell-astrade produkter typiskt är rätt så små blir isolering av substansen av intresse en mödosam renings- uppgift. Vidare är däggdjurscellkulturer notoriskt känsliga för kontamination av bakteriella eller andra källor. Detta nödvändiggör att odling utföres med användning av olika tekniker för att upprätthålla sterilitet och ofta att antibiotika inkluderas i mediet.

I enlighet med utövande av föreliggande uppfinning lindras de föregående svårigheterna genom inkapsling av kulturens celler inom semipermeabla membraner som har en utvald permeabilitetgräns, vilken i allmänhet inte är större än ca 200 000 dalton, dvs membranet innehåller porer. vilka medger substanser med en maxi- mal molekylvikt vid eller under den övre permeabilitets- gränsen att genomkorsa membranet, medan däremot sub- stanser med molekylvikt över den övre permeabilitets- gränsen spärras från att genomkorsa membranet. Detta möjliggör att man kan inkapsla celler tillsammans med kulturmedium som innehåller alla komponenter som krävs för pågående viabilitet, metabolism och t o m mitos, och att man sedan kan suspendera de så inkapslade cellerna i ett kulturmedium, vilket innehåller lågmolekylära substanser som konsumeras av cellerna, men som inte behöver inkludera de erfordrade högmolekylära sub- stanserna.

Typiskt intar inte celler från högre organismer högmolekulära serumproteiner och liknande, utan behöver dem snarare i omedelbar närhet för pågående normala biologiska responser. Salter, aminosyror och andra faktorer med låg molekylvikt, vilka intas eller meta- boliseras av cellerna,passerar fritt genom membranet och kan fyllas på efter behov genom enkel ändring av kulturmediet utanför kapslarna. Av cellmetabolism av- söndrade produkter med en molekylvikt under membran- 10 15 20 25 30 35 454 780 6 permeabilitetens övre gräns samlas i det extrakapsu- lära mediet, där, beroende på frånvaron av material med hög molekylvikt i mediet, skördning och isolering av metaboliska produkter av intresse förenklas. Skörd- ning av produkter av intresse med en molekylvikt över den övre permeabilitetsgränsen underlättas även beroende på att sådana produkter samlas inom kapslar- na och inte dispergeras i den extrakapsulära volymen.

Uppfinningstanken vid tillämpning på lägre molekylära cellprodukter illustreras schematiskt i fig l. Såsom visas är en cell 10 belägen inom ett kap- selmembran 12 med porer 16. Faktorer med hög molekyl- vikt 18 innesluts inom membranet 12 och får fritt cirkulera inom membranets gränser i mediet 14. Kompo- nenterna 20 som behövs av cellen samt metaboliska produkter 22, inbegripet substansen av intresse 22', cirkulerar fritt både i det intrakapsulära och det extrakapsulära mediet och passerar genom membranets porer 16. Såsom erfordras på en periodisk (eller konti- nuerlig) basis, kan det extrakapsulära mediet till- sammans med alla av dess komponenter separeras genom aspiration eller liknande från själva kapslarna och ersättas med färskt medium. Det uppsamlade mediet kommer att vara väsentligen fritt från högmolekylära komponenter 18, vilket underlättar skördnings- och iscleringsprocedurerna. Därtill förblir cellen 10 skyddad inom den intrakapsulära mikroomgivningen vid alla tidpunkter.

I vissa fall: t ex för att stimulera inkapslade cellers produktion av en särskild substans av intresse,erfordras det att cellerna utsätts för högmolekylära komponenter med molekyldimensioner som är för stora för att passera igenom membranet. Ett exempel är produktionen av interferon från humana fibroblaster, leukocyter eller lymfoblastoidceller, vilka induceras~ för att avsöndra interferon genom behandling med vissa virus eller högmolekylära nukleinsyror. I ett sådant 10 15 20 25 30 35 454 780 7 fall, om den övre permeabilitetsgränsen för membranerna är lägre än molekylvikten för den inducerande faktorn, måste cellerna underkastas interferoninduktion före inkapsling, eller måste kapselmembranerna, efter od- ling av cellerna, selektivt söndras för att tillåta att sådana högmolekylära material kan intas av cellen.

I den samtidigt inlämnade svenska patentansökningen .nr 8201557-9 beskrives ett sätt att selektivt söndra vissa typer av kapselmembraner, vilka kan användas för dessa och andra ändamål utan skada för cellerna.

Sättet enligt uppfinningen är beroende av ens förmåga att bilda semipermeabla membraner kring celler utan att samtidigt negativt påverka deras pågående viabilitet. Ett lämpligt inkapslingssätt anges i detalj 'nedan.

CELLINKAPSLING Vävnaden eller cellerna som skall inkapslas sus- penderas i ett vattenhaltigt medium, vilket är lämpligt för upprätthållande eller understödjande av pågående metaboliska processer hos den involverade särskilda vävnaden eller celltypen. För detta ändamål lämpliga medier är kommersiellt tillgängliga. Medeldiametern hos materialet som skall inkapslas kan vidsträckt variera mellan nâgra få pm till flera millimeter. Bästa resul- tat erhålles emellertid med kapslar av en storlek i området 300-1000 um. Langerhans cellöar från däggdjur har typiskt en diameter av 50 till 200 um. Individuella celler, såsom fibroblaster, leukocyter, lymfoblastoider, bukspottskörtel-B-celler, -a-celler, -A-celler, olika förhållanden därav, eller andra vävnadsenheter, kan efter önskan inkapslas. Även mikroorganismer kan in- kapslas, inbegripet de som har genetiskt modifierats genom rekombinerad DNA eller andra tekniker.

Den pågående viabiliteten hos sådant levande mate- rial beror bl a på tillgängligheten av erfordrade näringsämnen, syreöverföring, frånvaro av toxiska sub- stanser i mediet, och mediets pH. Hittills har det 10 15 20 25 30 35 454 780 8 inte varit möjligt att hålla sådant levande material i en fysiologiskt kompatibel omgivning under samtidig inkapsling. Problemet har varit att de för membran- bildning erfordrade betingelserna har varit letala eller skadliga för vävnaden, och före uppfinningen enligt US patentansökningen serienummer 24 600 fanns inget förfarande för membranbildning som tillät väv- nad att överleva i ett tillstånd av god hälsa.

Man har emellertid upptäckt att vissa vatten- lösliga substanser, som är fysiologiskt kompatibla med levande vävnad, kan göras vattenolösliga för att bilda en formbevarande, sammanhängande massa- och kan användas för att bilda en "temporär kapsel" eller skyddande barriärskikt kring individuella celler eller grupper av celler, och att denna temporära kap- sel kan behandlas för att avsätta ett mera permanent, semipermeabelt membran kring cellerna utan att cellerna skadas. En sådan substans tillsättes, typiskt vid en koncentration i storleksordningen nâgra få viktpro- cent, till vävnadskulturmediet, vilket även innehål- ler celler av kulturen, serumkomponenter (om så er- fordras) och eventuellt ett cellulosasubstrat, såsom kollagen eller ett annat högmolekylärt, vattendisper- gerbart material som verkar såsom ett förankringssub- - strat. När kollagen användes bör koncentrationen vara inom omrâdet ca 10 pg/ml till ca l mg/ml, men är före- trädesvis i storleksordningen 100-500 pg/ml.

Lösningen formas sedan till små droppar, som innehållervävnad tillsamman med dess medium, och göres omedelbart vattenolösliga samt gelas, åtminstone i ett ytskikt. Därefter förses de formbevarande, tempo- rära kapslarna med ett mera permanent membran, vilket självt efteråt selektivt kan söndras om man önskar frigöra vävnaden utan skada. När materialet som användes för bildning av de temporära kapslarna tillåtsrkan det inre av kapseln bildningen av det permanenta membranet. Detta göres återförvätskas efter 10 15 20 25 30 35 454 780 9 genom att återupprätta de betingelser i mediet vid vilka materialet är lösligt.

Materialet som användes för att bilda de tempo- rära kapslarna kan vara något nontoxiskt, vattenlös- ligt material, som genom en förändring av jonomgiv- ningen eller -koncentrationen kan omvandlas till en formbevarande massa. Materialet bör även innehålla ett flertal, karboxylgrupper, vilka kan reagera genom saltbildning lättjoniserade anjoniska enheter, t ex med polymerer som innehåller ett flertal katjoniska grupper. Såsom nedan kommer att förklaras, möjliggör användningen av denna typ av material att man kan av- sätta ett permanent membran med en utvald övre gräns- för permeabilitet utan svårighet i ytskikten av den temporära kapseln.

De för närvarande mest föredragna materialen för bildning av de temporära kapslarna är sura, vatten- lösliga, naturliga eller syntetiska polysackarider.

Sådana material är kommersiellt tillgängliga. De är typiskt extraherade från vegetabiliskt material och användes ofta som tillsatser till olika födoämnen.

Natriumalginat är den för närvarande mest föredragna polysackariden. Alginat med ett molekylviktom- råde av 150 000+ dalton kan användas, men beroende på dess molekyldimensioner och viskositet kommer det van- ligen att sakna förmåga att genomtränga de färdigt bildade kapselmembranerna. Alginat med lägre molekyl- vikt, t ex 50 000- 80 000 dalton, avlägsnas lättare från den intrakapsulära volymen genom diffusion genom ett membran med tillräcklig porositet och är därför föredraget. Andra användbara polysackariderainkluderar sura fraktioner av guar-gummi, karagënin, pektin, dragant- gummi eller xantan-gummi.

Dessa material omfattar glykosidbundna sackarid- kedjor. Deras fria syragrupper förekommer oftast i alkalimetalljonform, t ex natriumform. Om alkalimetall- jonen utbytes mot en multivalent jon, såsom kalcium 10 15 20 25 30 35 454 780 10 eller aluminium, "tvärbindes“ de vattenlösliga poly- sackaridmolekylerna för att bilda en vattenolöslig, formbevarande gel, vilken kan återlösas vid avlägs- nande av jonerna genom jonbyte eller via ett sekveste- ringsmedel. Ehuru väsentligen vilkan som helst multi- valent jon som kan bilda ett salt med den sura poly- sackariden kan fungera, föredrages att fysiologiskt kompatibla joner, t ex kalcium, användes. Detta tende- rar att bevara vävnaden i det levande tillståndet.

Andra multivalenta katjoner kan användas. Magnesiumjoner är ineffektiva vid gelning av natriumalginat.

En typisk lösningskomposition omfattar lika voly- mer av en cellkultur i dess medium och l eller 2 % lösning av polysackarid i fysiologisk saltlösning. När natriumalginat användes har en 1,2-1,6 % lösning använts med framgång. Om cellerna som skall inkapslas är av den typ som erfordrar vidhäftning vid ett för- ankringssubstrat för att undergå mitos, och om celler- na skall odlas inom kapslarna, då kan kollagen eller något annat högmolekylärt, vattendispergerbart protein eller polypeptid, antingen naturligt eller syntetiskt, inkluderas i cellkulturen, och kommer att inneslutas inom den intrakapsulära volymen av de färdigbildade kapslarna. Om en polymer med ett flertal katjoniska grupper, t ex polylysin, utnyttjas för detta ändamål, reagerar de katjoniska grupperna med anjoniska säten på den vattenlösliga polysackariden för att bilda en väsentligen vattenolöslig matris hopslingrad med polysackariden. Föredragna koncentrationer av sådana material är i storleksordningen 100-500 pg/ml av suspen- sion (inklusive polysackaridlösning).

I nästa steg av inkapslingsförfarandet, formas polysackaridlösningen, vilken innehåller vävnaden, till srnå droppar av den önskade storleken. Därefter gelas drop- parna omedelbart för att bilda formbeständiga massor, företrädesvis men ej nödvändigtvis till sfärisk eller sfäroidal form. Droppformningarna kan utföras genom 10 15 20 25 30 35 454 780 ll kända metoder. Exempel på ett förfarande följer.

Ett rör, som innehåller en vattenhaltig lösning av multivalenta katjoner, t ex 1,5 % CaCl2-lösning, förses med en kork som är försedd med en dropphild- ningsapparat. Apparaten består av ett hus med ett övre luftintagsmunstycke och en lângsträckt, ihålig kropp som är friktionsinpassad i korken. En 10 cm3 spruta som är utrustad med en stegpump, är monterad ovanpå huset med, t ex, en teflonöverdragen nål, som har en innerdiameter av 0,025 cm och som passerar genom husets längd. Husets insida är så utformad att nâlens spets är utsatt för en konstant laminär luft- ström, vilken verkar som en luftkniv. Vid användning, med sprutan full av lösning, vilken innehåller mate- rialet som skall inkapslas, drivs stegpumpen för att i inkrement tvinga droppar av lösning från nâlens spets. Varje droppe "skärs av" av luftströmmen och faller ca 2,5 cm in i CaCl2-lösningen, där den omedel- bart gelar genom absorption av kalciumjoner. Avstån- det mellan nålens spets och CaCl2-lösningensyta är tillräckligt stort, i detta fall, för att tillåta natriumalginat/cellsuspensionen att anta den fysika- liskt mest gynnsamma formen; en sfär (maximal volym med minimal ytarea). Luft inom röret strömmar ut genom en öppning i korken. Detta resulterar i "tvär- bindning" av gelen och i bildningen av en högviskös, formbevarande, skyddande, temporär kapsel, som inne- håller den suspenderade vävnaden och dess medium.

Kapslarna samlas i lösningen som en separat fas och kan separeras genom aspiration.

I förfarandets nästa steg avsättes ett semiperme- abelt membran kring de temporära kapslarnas ytor genom “tvärbindning" av ytskikt. Detta kan åstadkommas genom att de gelade, temporära kapslarna utsätts för en vattenhaltig lösning av en polymer, vilken innehåller katjoniska grupper som är reaktiva med anjoniska funktionaliteter i gelmolekylerna. Polymerer som inne- 10 15 20 25 30_ 35 454 780 12 håller syrareaktiva grupper, såsom fria imin- eller amingrupper, är föredragna. I denna situation tvär- bindes polysackariden genom interaktion (saltbind- ningsbildning) mellan karboxylgrupperna och amin- eller imingrupperna. Permeabiliteten kan regleras inom vissa gränser genom val av den använda tvärbind- ningspolymerens molekylvikt och genom justering av polymerlösningens koncentration samt exponeringens varaktighet. En lösning av en polymer med en låg molekylvikt penetrerar, under en given tidsperiod, längre in i de temporära kapslarna än en polymer med hög molekylvikt. Tvärbindningsmedlets penetrationsgrad har korrelerats med den resulterande permeabiliteten.

I allmänhet gäller attjtlhögre molekylvikt och mindre' penetration desto större är porstorleken. Vidsträckt gäller att polymerer inom molekylviktsområdet 3000-l00,000 dalton eller större kan användas, be- roende på reaktionens varaktighet, polymerlösningens koncentration och den önskade permeabilitetsgraden.

Ett framgångsrikt set av reaktionsbetingelser med användning av polylysin med medelmolekylvikt av ca 35 000 dalton, innebar reaktion i 2 min, under om- röring, med en fysiologisk saltlösning, som innehöll 0,0l67 % en övre permeabilitetsgräns av ca 100 000 dalton. polylysin. Detta resulterade i membraner med Optimala reäktionsbetingelser som är lämpliga för reglering av permeabiliteten i ett givet system kan lätt bestämmas empiriskt med vägledning av de före- gående riktlinjerna. Med användning av denna metod är det möjligt att bestämma membranernas övre per- meabilitetsgräns vid en utvald nivå under ca 200 000 dalton.

Exempel på lämpliga tvärbindningspolymerer inklu- derar proteiner och polypeptider, antingen naturliga eller syntetiska, med fria amino- eller iminogrupper, polyetylenaminer, polyetyleniminer, och polyvinyl- aminer. Polylysin, i både D- och L-formerna, har an- 10 15 20 25 30 35 454 780 13 vänts med framgång. Proteiner, såsom polyarginin, polycitrullin eller polyornitin är också funktions- dugliga. Polymerer i det högre området av positiv laddningstäthet, t ex polyvinylamin, vidhäftar kraf- tigt vid gelmolekylernas anjoniska grupper för attbilda stabila membraner, men membranerna är rätt svåra att söndra.

Behandling med en utspädd lösning av polysackarid binder upp fria aminogrupper på kapslarnas ytor, som annars kan ge kapslarna en tendens att klumpa ihop.

I detta skede av inkapslingen kan kapslar upp- samlas som omfattar ett semipermeabelt membran, vilket omger en gelad lösning av polysackarid, cell- typkompatibelt kulturmedium, celler och valfritt en inre matris av kollagen eller annat förankrings- substrat. Eftersom massöverföringen bör främjas inom kapslarna och genom membranerna, är det före- draget att återförvätska gelen till sin vattenlösliga form. Detta kan göras genom återupprättande av de betingelser under vilka polysackariden är en vätska, t ex genom avlägsning av kalciumkatjoner eller andra multífunktionella katjoner ur den invändiga gelen.

Mediet i kapseln kan âterlösas genom enkel nedsänk- ning av kapslarna i fosfatbuffrad saltlösning, som innehåller alkalimetalljoner och vätejoner. Monovalenta katjoner byter med kalciumjoner eller andra multi- funktionella joner inom polysackariden, när kapslarna nedsänkes i lösningen under omröring. Natriumcitrat- lösningar kan användas för samma ändamål och tjänar till att avsksilja de divalenta jonerna.

Cellkulturer,som inkapslats såsom ovan beskrivits, kan suspenderas i kulturmedier som är specifikt ut- formade för att uppfylla alla behov hos den ifråga- varande särskilda celltypen och fortsätter att genom- gå normal in vitro metabolism. Om kulturen erfordrar en omgivning med högmolekylära komponenter, såsom 10 15 20 25 30 35 454 780 14 serumkomponenter kan dessa uteslutas ur det extra- kapsulära mediet. Typiskt är komponenterna som normalt intas av cellerna relativt lågmolekylära och diffun- derar lätt genom kapselmembranerna in i cellernas mikroomgivning, där de genomtränger cellmembranet.

Produkter från cellernas metabolism, vilka avsöndras in i det intrakapsulära mediet, diffunderar lika- ledes genom kapselmembranet, om de har en molekylvikt under kapselmembranets övre permeabilitetsgräns, och samlas i det extrakapsulära mediet.

De inkapslade cellerna kan odlas under sådana betingelser beträffande t ex temperatur, pH och jon- omgivning som är identiska med de för konventionella kulturer. Därtill kan cellalstrade produkter skördas från det extrakapsulära mediet eller från kapslarna genom konventionella tekniker. Odlingstekniken som här beskrivits har emellertid följande fördelar. l. Kulturens celler skyddas från skjuvkrafter och mekanisk skada och från kontamination av faktorer med dimensioner som överskrider membranernas övre permeabilitetsgräns. Detta betyder att hanteringe- och sterilitetskrav som normalt är förbundna med odlingsprocedurer kan något lättas, ty mikroorganismer kan inte nå de inkapslade cellerna och virusinfekterade celler behöver inte kontaminera andra celler. 2. Kapslarna immobiliserar 1 själva verket cel- lerna inom en omgivning i vilken inneslutna högmole- kylära material inspärrats, varvid dock lågmolekylära cellnäringsämnen och produkter lätt avlägsnas och införes. Detta tillåter att näringsbuljongen inter- mittent eller kontinuerligt kan uppsamlas och utökas- efter behov, utan att cellerna störs. 3. Substanser av intresse, som alstrats av cellerna, återvinnes lättare. Avsöndrade cellprodukter med mole- kyldimensioner som är tillräckligt små för att genom- tränga kapselmembranerna samlas i det extrakapsulära mediet i blandning med näringsämnen,Högmolekylära 10 15 20 25 30 35 454 780 15 serumkomponenter och liknande frigöres emellertid inte in i det extrakapsulära mediet, varigenom återvinning av en cellprodukt av intresse förenklas. Avsöndrade cellprodukter med molekyldimensioner som överstiger membranernas övre permeabilitetsgräns samlas inom kapslarna. Naturligtvis kan även cellprodukter som inte avsöndras genom cellmembranet vara av intresse.

Dessa kan återvinnas i relativt koncentrerad form genom isolering av kapslarna och därefter selektiv söndring av kapselmembranerna med användning av exem- pelvis den teknik som nedan beskrives, och om så krävs genom söndring av cellmembranerna. 4. Den intrakapsulära volymen tillhandahåller en omgivning som är lämpad för celldelning. Suspensions- kulturer har observerats genomgâ mitos inom kapseln.

Förankringsberoende celler, som normalt odlas i ett tvådimensionellt monoskikt, förökas för att bilda en ordnad skara inom kapseln. Sådana celler använder mem- branets invändiga ytor som ett substrat och/eller förankras på de högmolekylära materialen som ovan an- givits, vilka är belägna inom kapseln. Detta leder till signifikanta ökningar av celltäthet jämfört med konventionella kulturer. Den pågående viabiliteten hos sådana cellanhopningar underlättas av det faktum att förhållandena av ytarea till volym hos kapslarna kan vara rätt så stora, och sålunda har alla celler tillträde till erfordrade näringsämnen, syre, etc.

I vissa situationer skulle det vara fördelaktigt att selektivt söndra kapselmembranerna för att fri- göra cellerna utan skada. Ett betydande exempel är framställningen av interferon (INF). Celler som har förmåga att alstra INF måste utsättas för vissa virus eller nukleinsyror vid prepareringen för INF-alstrings- steget. I flera INF-induktionsförfaranden tillsättes reagens till kulturen för att inhibera proteinsyntes.

Följaktligen måste odlingsprocessens tillväxtstadium utföras under betingelser som är rätt olika de vid 10 15 20 25 30 35 454 780 16 INF-induktionssteget. Om de för INF-induktionen an- vända substanserna har en molekylvikt som överstiger den övre permeabilitetsgränsen för kapselmembranerna (vilket är fallet. med virusinduktioner) kan inte induktionsprocessen åstadkommas i den inkapslade cellkulturen. Följaktligen skulle INF-alstrande celler, om de odlades inom kapseln, måsta frigöras genom söndring av membranet för att kunna under- kastas induktionsprocessen.

SÖNDRING AV MEMBRANER Celler som inspärratsi membraner av den typ som ovan angivits kan frigöras genom ett förfarande som utnyttjar kommersiellt tillgängligareagens med sådana egenskaper att de ej signifikant negativt påverkar de inkapslade cellerna. Först separeras kapslarna från sitt suspensionsmedium och tvättas omsorgsfullt för att avlägsna alla kontaminerande ämnen som finns på mikrokapslarnas utsida, varpå de dispergeras, under omröring i en blandad lösning av enatomiga, multivalenta katjoner, såsom kalciumjoner, och en strippningspolymer med ett flertal anjoniska enheter, såsom ett salt av en polysulfonsyra eller polyfosforsyra. Heparin, en naturlig, sulfonerad polysackarid, är föredraget i detta steg. Den anjoniska laddningstätheten hos strippningspolymeren som an- vändes bör vara lika med eller företrädesvis högre än laddningstätheten hos det polyanjoniska materialet som ursprungligen användes för att bilda membranerna- Polymerens molekylvikt bör vara åtminstone jämförbar med och företrädesvis större än molekylvikten för den polymer som har ett flertal katjoniska grupper och som användes vid bildning av membranet. Inom suspensionen av kapslar i den blandade lösningen konkurrerar kalciumjoner med de för bildning av membranet använda polykatjoniska polymerkedjorna om anjoniska säten på den vattenlösliga polysackariden. Samtidigt tävlar heparinet eller annan polymer med ett flertal anjoniska 10 15 20 25 30 35 454 780 17 enheter lösta i lösnignen med polysackariden, i membra- net om katjoniska säten på polymerkedjorna. Detta resulterar i ett vattendispergerbart eller företrädes- vis vattenlösligt komplex av t ex polylysin och hepa- rin, och i association av de enatomiga katjonerna med gelens molekyler.

Detta steg gör membranet mottagligt för upplösning vid efterföljande exponering för ett sekvesteringsmedel, vilket fullbordar söndringsprocessen genom upptagning av enatomiga joner från gelen. Kapselmembranspillror, vilka kvarblir i mediet, om sådana förekommer, kan med lätthet separeras från cellerna.

Den för närvarande mest föredragna lösningen för det första steget av den selektiva söndringsprocessen omfattar 1,1 % kalciumklorid (vikt/volym) och mellan 500 och 1500 enheter heparin per milliliter lösning. En volym av mikrokapslar sättes till denna lösning, vilken volym är tillräcklig för att utgöra ca 20 till 30 % av suspensionens totala volym. Kalciumklorid och heparin är föredragna för söndring av membraner av cellinne- hållande kapslar, eftersom båda reagensen är fysiolo- giskt kompatibla med flertalet celler och därför mini- meras faran för cellskada. Blandningar av aluminium- salter eller andra multivalenta katjoner (men inte Mg+f-joner) kan även användas tillsammans med polysul- fonsyra- eller polyfosforsyrasalterna av den typ som ovan angivits.

I allmänhet kan koncentrationerna av enatomiga joner och anjonisk polymer, som användes i detta steg, vidsträckt variera. Optimala koncentrationer kan lätt bestämmas empiriskt, och beror på exponeringstid samt den särskilda polymer som användes för bildning av membranerna.

Det för närvarande föredragna sekvesteringsmedlet för utförande av den selektiva söndringen är natrium- citrat, ehuru andra alkalimetallcitratsalter och alka~ limetall-EDTA-salter även kan användas. När natrium- citrat användes är den optimala koncentrationen i stor- 10 15 20 25 30 35 454 780 18 leksordningen 55 mM. Det är föredraget att lösa citratet eller annat sekvestreringsmedel i isotonisk saltlösning för att minimera cellskada.

Uppfinningen kommer vidare att förstås från föl- jande icke begränsande exempel.

EXEMPEL l: INSULINFRAMSTÃLLNING Langerhans cellöar erhâlhaæfrån humankadaver eller djurpankreas och sättes till en fullständig vävnads- kultur (CMRL-1969 Connaught Laboratories, Toronto, Canada) vid en koncentration av ca 103 cellöar/ml.

Vävnadskulturen innehåller alla näringsämnen som be- hövs för fortsatt viabilitet hos cellöarna samt amino- syrorna som utnyttjas av B-cellerna för framställning av insulin. Fyra tiondelar av en milliliter av en sus- Pefl$i0fl aV 103 Cêllöär/ml suspension sättes sedan ti1J.0,5nfl av 1,2 % natriumalginat (Sigma Chemical Company) i fysiologisk_saltlösning.

Därefter användes en 1,5 % kalciumkloridlösning för att gela droppar av lösningen som bildats såsom ovan angivits. Droppar i storleksordningen 300-400 um i diameter, som kommer ut från nâlens spets, gelar omedelbart när de kommer in i kalciumlösningen. De gelade kapslarna överföres sedan till en bägare, som innehåller 15 ml av en lösning, vilken omfattar en del av en 2 % 2-(cyklohexylamino)etansulfonsyra-buffertlös- ning i 0,6 % NaCl (isotonisk, pH=8,2) utspädd med 20 delar l % CaCl2. Efter 3 min av nedsänkning i lös- ningen tvättas kapslarna 2 ggr i l % CaC12.

Kapslarna överföras sedan till en 32 ml lösning, som omfattar l/80 av 1 % polylysin (medelmolekylvikt 35 000 dalton) i fysiologisk dekanteras polylysinlösningen. Kapslarna tvättas med saltlösning . Efter 3 min l % CaCl2, och återsuspenderas valfritt i 3 min i en lösning av polyetylenimin (molekylvikt 40 000-60 000), som framställts genom spädning av en förrådslösning av 3,3 % polyetylenimin i morfolinopropansulfonsyrabuffert (0,2M, pH=6) med tillräckligt av l % CaCl2 för att ge 10 15 20 25 35 454 780 19 en slutlig polymerkoncentration av 0,12 %. De resul- terande kapslarna, som har "permanenta" semipermeabla membraner, tvättas sedan 2 ggr med l % CaCl2, 2 ggr med fysiologisk saltlösning och blandas med 10 ml av 0,12 % alginsyralösning.

Kapslarna har motståndskraft mot hopklumpning, 'och många kan ses innehålla Langerhans cellöar.Ge1 på ¿nSi¿an av kapslarna _ återförvätskas genom nedsänk- ning av kapslarna i en blandning av saltlösning och citratbuffert (pH 7,4) under 5 min. Till sist suspen- deras kapslarna i CMLR-69 medium.

Under mikroskop ser man att dessa kapslar består av ett mycket tunt membran, vilket omger en cellö, inom vilken man kan se individuella celler. Molekyler med en molekylvikt upp till ca 100 000 kan genomkorsa membranerna. Detta medger att syre, aminosyror, näringsämnen och plasmakomponenter, som användes i kulturmedier (dvs lågmolekylära, fetala kalvplasma- komponenter) når cellöarna och medger att insulin kan avsöndras.

Efter upprepade tvättningar i fysiologisk salt- lösning suspenderas mikrokapslar,som framställts i enlighet med det ovan angivna förfarandet och som innehåller ca 15 cellöar,i 3 ml av CMRL-1969. När de var 8 dygn gamla, i närvaro av 600 ml/dl glykos, avsöndrade kapslarna in i det extrakapsulära mediet, vid en körning, 67 enheter/ml insulin på 1,5 h. I en andra körning alstrades på samma tidsenhet 68 enheter/ml insulin.Ex1vecka gamla kapslar, i samma medium, men i närvaro av 100 mg/dl glukos, avsöndrade i en första körning 25 enheter/ml insulin på 1,2 h och avsöndrade i en andra körning 10 enheter/ml.

EXEMPEL 2: INF-B-FRAMSTÄLLNING Humana fibroblaster som erhållits genom behandling av human förhudsvävnad med trypsin och EDTA under 5 min vid 37°C på känt sätt, suspenderas i ett fullständigt odlingsmedium (CMLR 1969, Connaught Laboratories) som 10 ß' 20 25 m_ 35 454 780 20 utökats med 40 % (vol/vol) renat fetalt kalvserum, 0,8 % natriumalginat (Sigma) och 200 ug/ml renat kalvskinnskollagen. Cellsuspensionens täthet är ca 1,5 x 107 celler/ml. Temporära alginatkapslar bildas såsom anges i exempel 1. Semipermeabla membraner avsättes i kapslarnas ytskikt genom att suspendera dem i en 0,005 % (vikt/vol), vattenlösning av polylysin, vikt 43 000 dalton) under 3 min.

De resulterande kapslarna suspenderas i CMLR-1969, som utökats med 10 % fetalt kalvserum. De föregående stegen utföres alla vid 37°C. Efter inkubation vid (molekyl- samma temperatur kan man vid undersökning av kapslar- na under mikroskop finna att de innehåller fibroblaster, som har genomgått mitos och uppvisar tredimensionell fibroblastàäçmorfologi inom mikrokapslarna.

I Efter 4-5 dygn av inkubation underkastas de in- kapslade fibroblasterna en INF-8-superinduktionstek- nik enligt Vilcek-förfarandet. Under en 5 % CO2-atmos- fär (95 % luft) inkuberas kapselsuspensionen vid 37°C under 1 h i närvaro av 100 pg/ml Poly I-Poly C, en dubbelsträngad RNA (känd INF-8-inducerare), tillgäng- lig från PL Biochemicals, Milwaukee, Wisconsin, och 50 pg/ml cykloheximid (proteinsyntesinhibitor, Calbiochem, La Jolla, California-). Efter l h tvättas de suspenderade kapslarna i ett medium (CMLR-1969), som innehåller 50 pg/ml cykloheximid, och återsuspen- deras sedan i samma lösning under 3 h vid 37°C under en 5 % C02-atmosfär. Efter det att denna inkubation är avslutad upprepas tvättningssteget och kapslarna återsuspenderas i ett medium, som innehåller 50 pg/ml cykloheximid och 5 ug/ml actinomycin D (en känd RNA- syntesinhibitor, Calbiochem) och inkuberas i 2 h vid 37oC under en 5 % C02-atmosfär. Kapslarna tvättas se- dan 2 ggr i medium och suspenderas i serumfritt medium vid 37°C under 18-24 h, under vilken tid fibroblasterna avsöndraINF-ß,som har en molekylvikt i storleksordningen 21 000 dalton, och kan skördas från det extrakapsulära mediet. 10 15 20 25 30 35 454 780 21 EXEMPEL 3: INF-B-FRAMSTÄLLNING Förfarandet enligt exempel 2 upprepas, med undan- tag för att kapselmembranerna före induktionen selek- tivt söndras så att Poly I.Poly C lättare kan få till- träde till fibroblasterna. Söndringsförfarandet ut- föres pâ följande sätt. 10 ml portioner av mikrokapselsuspensioner, som innehåller ca 500-1000 kapslar per ml, får av- sättas och suspensionsmediet avlägsnas genom aspi- ration. Kapslarna tvättas 2 ggr med fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH=7,4). De tvättade kapslarna blandas sedan med 3,0 ml alikvot av PBS, som inne- håller 1000 enheter/ml heparin och 1,l % (vikt/vol) CaCl2. Suspensionen omröres vid 37°C i 3 min, var- efter kapslarna får avsättas. Det överliggande lagret avlägsnas genom aspiration och kapslarna tvättas 2 ggr med 3,0 ml av 0,l5M NaCl. Efter aspiration av den andra tvättlösningen blandas kapslarna med 2,0 ml av en blandad lösning, som omfattar lika volymer av 110 mM natriumcitrat och O,l5M NaCl 1pH=7,4). Bland- ningen handvirvlas under l min för att inducera upplösning av membranerna, varefter cellerna tvättas 2 ggr 1 medium.

Cellerna suspenderas sedan i medium, underkastas induktionsförfarandet som angivits i exempel 2 och återinkapslas såsom anges i exempel 2. Kapselsus- pensionen inkuberas sedan i serumfritt medium under 18-24 h, under vilken tid INF-B avsöndras från cellerna, genomtränger kapselmembranerna och samlas i det extrakapsulära mediet.

Om exemplen 2 och 3 utföres med Poly I-Poly C (SS) (sedimenteringsvärde, Poly I och Poly C samman- löpande för att bilda dubbelsträngad RNA) resulterar de i följande INF-B-produktionsnivåer, i enheter av INF-B/ 105 celler; lO 15 20 25 30 35 454 780 g 22 Exempel 2 l¿ 2¿ ' 25 25 Exempel 3 2 500 2 500 Om exemplen 2 och 3 utföres med Poly I-Poly C (128) (sedimenteringsvärde, dubbelsträngad såsom inköpt) resulterar de- iföljande INF- B-produktions- nivåer, i enheter av INF-B/105 celler: Exempel 2 l¿ g¿ g 25 25 Exempel 3 2 500 2 500 Den hundrafaldiga ökningen av produktionen med användning av förfarandet enligt exempel 3 jämfört med det enligt exempel 2 tror man beror på, åtminstone delvis, det faktum att Poly I.Poly C har bättre till- träde till cellerna i förfarandet enligt exempel 3; EXEMPEL 4: Förfarandet enligt exempel 2 upprepas, med undan- tag för att kapslar, som inte innehåller kollagen, användes. De inkapslade cellerna odlas i konventionell monoskiktkultur, behandlas med trypsin och induceras med Poly I.Poly C (SS) och mikroinkapslas samtidigt. gDet extrakapsulära mediet befinnes innehålla 2 500 enheter INF-B/l0s celler.

EXEMPEL 5: Hybridoma celler erhållna från Herman Eisen vid MIT odlades till en täthet av 3,0 x 106 celler hade smälts samman från mussplenceller och mus- Monoklonala antikroppar celler/ml. Dessa myelomceller på ett sätt som numera är välkänt inom tekniken och utgjorde en odödlig cellinje, som vid odling alstrade antikroppar mot dinitrofenylbovin- serumalbumin. 3 ml alikvoter av cellsuspensionen upp- gjordes genom att 2,1 ml av en suspension som innehöll 1,4 % natriumalginat sattes till 0,6 ml fetalt kalv- (150 mM) saltlösning.

Droppar av suspensionen gelades omedelbart i CaCl2- serum och 0,3 ml fysiologisk -lösning och behandlades sedan med en 0,016 vikt% 10 15 20 25 30 35 454 780 23 lösning av poly-Irlysin. Innehållet i de resulterande kapslarna âterförvätskades genom nedsänkning i en lösning av en del 110 mM natriumcitrat och 3 delar 150 mM saltlösning under 6 min. Kapslarna som inne- höll hybridoma celler suspenderades sedan i en bland- ning av RPMI-1640-medium (Gibco), som innehöll 20 % värmeinaktiverat fetalt kalvserum.

Cellsammanräkningar av inkapslade och oinkapslade hybridoma kulturer, och mängden av monoklonal anti- kropp som alstrats av både de inkapslade och oinkapsla- de kulturerna, bestämdes periodiskt. Resultaten visas i grafisk form i fig 2.

EXEMPEL 6: INF-a från leukocyter 30 ml av gul hinna hos stelnat blodserum på koagu- lerande blod, erhållet från amerikanska röda korset, behandlades med 3,0 ml av 5 % EDTA och upprepade 10 min exponeringar för 0,83 % NH4Cl vid 4°C för att upplösa de röda blodkropparna. En 5 min centrifugering (1200 r/min vid 4°C) mellan NH4Cl-behandlingar se- parerade spillror från de kvarvarande intakta leuko- cyterna. Sedan suspenderades cellerna i MEM (minium essentiellt medium, serumfritt - Gibco), späddes med en faktor av 100 och färgades med tryptanblått under 15 min. En cellsammanräkning som utfördes på ett prov visade att ca 1,3 x 109 leukocyter per 30 ml av gul hinna överlevde. Cellerna suspenderades sedan vid en täthet av l x 107 som utökats med 2 % värmeinaktiverat fetalt kalvserum. celler/ml i ett medium Induktion utfördes genom exponering av cell- suspensionen för Sendai-virus (olika koncentrationer i hemagglutinerande enheter/ml - Flow Laboratories, Md.) under l h vid 37°C och under omröring. Viruset sepa- rerades sedan från cellerna genom centrifugering vid rumstemperatur, och cellerna återsuspenderades i lika volymer av MEM - 4 % värmeinaktiverat fetalt kalvserum och l,4 % natriumalginat. Kapslar bildades 10 15 20 25 30 35 454 780 24 såsom ovan angivits och återsuspenderades sedan i seriumfritt medium och serumhaltigt medium. Det före- kom inga signifikanta skillnader mellan mängderna av INF som detekterades i dessa testprovers extra- kapsulära medium. INF-produktionsnivåer var även identiska i oinkapslade kontrollkulturer. Resulta- ten från dessa experiment visas nedan.

Alstrat INF enheter 107 celler Enheter Sendai-virus (HA enheter/ml) 600 10 300 20 150 33 75 50 EXEMPEL 7: INF-u från lymfoblastoider Namalwa-celler från American Type Culture Collec- tion odlades både i konventionella kulturer och inom mikrokapslar i RPMI-l640“medium utökat med 10 % värme- inaktiverat fetalt kalvserum. Volymer av cellsus- pensionerna underkatades sedan INF-induktion och produktionsprocedurerna,varvideauvolym var inkapslad och den andra var oinkapslad. Kulturerna innehöll väsentligen lika antal celler. Till både de inkapslade och oinkapslade kulturerna sattes 25 mg/ml bromo- deoxiuridin i dubbeldestillerat vatten för att in- hibera mitos. Efter inkubation i 36 h vid 37°C tvät- tades båda kulturernas celler och suspenderades sedan i RPMI-1640-medium utökat med 2 % värmeinaktiverat fetalt kalvserum.

Den inkapslade kulturen behandlades sedan för selektiv söndring av kapselmembranerna. Kapslarna tvättades 3 ggr i fysiologisk saltlösning, inkuberades i 1000 enheter/ml heparinlösning, som innehöll 1,1 % CaCl2 under 10 min vid 37°C och återtvättades sedan i saltlösning. De tvättade kapslarna inkuberades därefter i 5 min vid 37°C med utspädd natriumcitrat- lösning 1 fysiologisk saltlösning. Skakning av kapsel- 10 15 20 25 30 35 454 780 25 suspensionen vid detta skede resulteradei upplösning av membranerna och frigöring av Namalwa-cellerna.

Cellsuspensionen centrifugerades sedan för avlägsning av spillror och tvättades flera gånger i citrat fysio- logisk saltlösning.

Båda kulturerna suspenderades därefter i färskt RPMI-1640-kulturmedium utökat med 2 % värmeinaktiverat fetalt kalvserum och buffert(pH=7,4) vid en täthet av 1,0 x lO6“celler/ml.

Till både den konventionella kulturen och den förut inkapslade kulturen sattes sedan Bankowski- -stammen av Newcastle Disease viruset i amnionvätska.

Viruset var vid en koncentration av 1,0 x lO8 pfu/ml och inköptes från Poultry Health Laboratories, Davis, Californien. 1 ml av viruset tillsattes för varje 10 ml av cellsuspension. Kulturerna inkuberades under 24 h vid 37°c.

Den konventionella kulturen delades sedan i 5 delar (l-5 nedan); den förut inkapslade kulturen delades i 4 delar (6~9 nedan). Var och en av de 9 alikvoterna av kultur analyserades för INF-produktion, efter de nedan angivna behandlingarna. l. obehandlad 2. återsuspenderad i RPMI-1640-medium med 2 % värmeinaktiverat fetalt kalvserum 3. återsuspenderad i RPMI-1640-medium, serumfritt 4. inkapslat tillsammans med RPMI-1640-medium och 5 % värmeinaktiverat fetalt kalvserum - kapslarna suspenderade i serumfritt medium 5. inkapslad tillsammans med RPMI-1640-medium och 5 % värmeinaktiverat fetalt kalvserum - kapslarna suspenderade i medium med 2 % fetalt kalvserum 6. återsuspenderad i serumfritt medium 7. återsuspenderad i medium som innehöll 2 % värmeinaktiverat fetalt kalvserum 454 780 8. återinkapslad tillsammans med medium plus 5 % värmeinaktiverat fetalt kalvserum - kapslarna suspenderade i serumfritt medium 9. âterinkapslad tillsammans med medium plus 5 % 5 värmeinaktiverat fetalt kalvserum - kapslarna suspenderade i medium plus 2 % serum.

Följande tabell anger mängden av celler som erfordrades i var och en av cellkulturerna l-9 för att producera en enhet av INF-az 10 1 30 6 40 2 45 7 40 3 - 8 1000, 360 4 680 9 200, 100 5 7 2000 15 Andra utföringsformer omfattas av följande patentkrav.

Claims (23)

10 15 20 25 30 454 vant' 27 PATENTKRAV

1. Sätt att framställa en substans som valts bland interferoner och monoklonala antikroppar och som alstras av levande celler, k ä n n e t e c k - n a t därav, att det omfattar stegen: A. inkapsling pà känt sätt av cellerna inom mem- braner med en utvald övre permeabilitetsgräns; B. suspendering av de inkapslade cellerna i ett vattenhaltigt kulturmedium; C. låta cellerna undergå metabolism in vitro och avsöndra substansen; och D. skörda substansen anthmæn fràn det vattenhaltiga mediet eller från inom membranerna. Q

2. Sätt enligt kravet l, n a t därav, att inkapslingssteget (A) genomföres genom att membranet bildas genom reaktion mellan kat- k ä n n e t e c k - joniska grupper pà polymerkedjor och anjoniska grupper på en polysackarid för att bilda ett vattenolösligt, semipermeabelt membran.

3. Sätt enligt kravet l, n a t därav, att inkapslingssteget (A) genomföres k ä n n e t e c k - genom att 1) cellerna suspenderas i ett vattenhaltigt medium som är fysiologiskt kompatibelt därmed och som inne- håller en polysackarid med ett flertal anjoniska en- heter; 2) suspensionen formas till droppar som innehåller cellerna; 3) dropparna utsätts för en lösning av multi- valenta, fysiologiskt kompatibla katjoner för att gela dropparna som fristående, formbevarande, vatten- olösliga temporära kapslar; och 4) ytskikt hos de temporära kapslarna tvärbindes för att alstra semipermeabla membraner kring dropparna 10 15 20 25 30 35 454 780 28 genom att de utsätts för en polymer som omfattar ett flertal katjoniska grupper, vilka är reaktiva med de anjoniska enheterna.

4. Sätt enligt kravet 3, k ä n n e t e c k n a t därav, att det omfattar ett ytterligare steg avseende återupplösning av gelen inom det i steg 4) alstrade membranet.

5. Sätt enligt kravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att substansen har en molekylvikt under den utvalda övre permeabilitetsgränsen och att sättet omfattar ett steg avseende att substansen tillåtes diffundera genom membranerna in i det vattenhaltiga mediet samt att substansen skördas därifrån.

6. Sätt enligt kravet l eller 5, k ä n n e t e c k- n a t därav, att cellerna inkapslas tillsammans med ett fullständigt cellkulturmedium som är tillräckligt för att upprätthålla cellerna och för att medge bio- syntes av substansen in vitro.

7. Sätt enligt kravet l eller 5, k ä n n e t e c k- n a t därav, att det i steg (B) använda vattenhaltiga mediet är ett fullständigt cellkulturmedium som är tillräckligt för att upprätthålla cellerna och för att medge biosyntes av substansen in vitro.

8. Sätt enligt kravet 6, k ä n n e t e c k n a t därav, att en komponent med en molekylvikt som över- skrider membranernas övre permeabilitetsgräns er- fordras av cellerna för att medge in vitro biosyntes av substansen, varvid sättet omfattar ett ytterligare steg avseende inkapsling av komponenten tillsammans med cellerna.

9. Sätt enligt kravet l eller 5, k ä n n e t e c k- n a t därav, att cellerna är däggdjursceller.

10. Sätt enligt kravet l eller 5, k ä n n e t e c k- n a t därav, att det omfattar ett ytterligare steg avseende att cellerna tillâtes undergå mitos inom kapseln. 10 15 20 25 30 35 454 780 29

11. ll. Sätt enligt kravet 1 eller 5, k ä n n e t e c k - n a t därav, att cellerna är celler som blivit gene- tiskt modifierade.

12. Sätt enligt kravet l eller 5, k ä n n e - t e c k n a t (A) alstras sfäroidala mikrokapslar med en diameter därav, att under inkapslingssteget under ca 0,5 mm.

13. sätt enligt kravet 1 eller 5, k ä n n e - t e c k n a t därav, att de i steg (A) inkapslade cellerna erfordrar kontakt med en komponent, vilken har en molekylvikt som överskrider membranernas övre permeabilitetsgräns, för att upprätthålla produktion av substansen, varvid komponenten inkapslas tillsammans med cellerna i steg (A) och det i steg (B) använda vattenhaltiga kulturmediet är väsentligen fritt från nämnda komponent.

14. Sätt enligt kravet 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att den utvalda övre permeabilitetsgränsen är under ca 1,5 x 105 dalton.

15. Sätt enligt kravet 1, k ä n n e t e c k - n a t därav, att cellerna omfattar hybridoma celler, att substanen omfattar monoklonala antikroppar med en molekylvikt som överskrider den valda övre permea- bilitetsgränsen och att antikropparna skördas från inom membranerna.

16. Sätt enligt kravet 1, k ä n n e t e c k ~ n a t därav, att i steg A. inkapslas viabla celler suspenderade i ett vattenhaltigt kulturmedium inom membraner med en övre permeabilitetsgräns som är till- räcklig för att medge passage av näringsämnen, vilka erfordras av cellerna, varvid membranerna innesluter suspenderade viabla celler placerade i ett medium, vilket inkluderar alla komponenter (A) som behövs för att upprätthålla viabilitet hos de celler, vilka har en storlek som överskrider membranernas övre permea- bilitetsgräns, och varvid det vattenhaltiga kulturmediet i steg B. omfat- 10 15 20 1454 780 30 tar alla komponenter (B) som behövs för att upprätt- hålla viabilitet hos cellerna med en molekylvikt under membranernas övre permeabilitetsgräns.

17. Sätt enligt kravet 16, k ä n n e t e c k - n a t därav, att komponenterna (A) omfattar serum- komponenter.

18. Sätt enligt kravet 16, k ä n n e t e c k - därav, att cellerna är däggdjursceller.

19. Sätt enligt kravet 16, k ä n n e t e c k - n a t därav, att cellerna är mikroorganismer.

20. Sätt enligt kravet 16, k ä n n e t e c k - n a t därav, att cellerna är celler som blivit gene- n a t tiskt-modifierade.

21. Sätt enligt kravet 16, k ä n n e t e c k - n a t därav, att cellerna är hybridoma celler.

22. Sätt enligt kravet 16, k ä n n e t e c k - n a t därav, att cellerna är celler som har förmåga att avsöndra in vitro en interferon. '

23. Sätt enligt kravet 16, k ä n n e t e c k - n a t därav, att cellerna är celler som har förmåga att avsöndra in vitro en monoklonal antikropp.