NL8403352A - Inductie van immune respons door immunisatie met ingekapselde antigeen producerende cellen. - Google Patents

Description

NL 32425-Kp/cs ^ *

Inductie van immune respons door immunisatie met ingekapselde antigeen producerende cellen.

De uitvinding heeft betrekking op de productie van antilichamen. Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor het induceren van een immune respons in een proefdier door introductie in het dier van 5 cellen, die een antigeen produceren en afscheiden.

Antilichamen worden thans op brede schaal toegepast voor de zuivering van biologische materialen en bij diagnostische proeven en zijn recentelijk therapeutisch gebruikt voor de behandeling van bepaalde typen lymfoma's en mela-10 noma's. De productie van antilichamen tegen een specifiek antigeen heeft volgens de stand der techniek plaatsgevonden door inspuiting van het antigeen in een proefdier, bijvoorbeeld twee of meer keer, gevolgd door het winnen van het anti-lichaam uit het serum. Meer recentelijk, met het voortschrij-15 den van de hybridomatechnologie, werd in plaats van het verzamelen van antilichamen uit het circulatiesysteem van het dier een monster van lymfocyten van het dier afgenomen, in het bijzonder van de milt, waarna het celmonster wordt samengesmolten met een onsterfelijke cellijn, zoals een myeloma.

20 De samensmeltproducten worden gescreened om levende hybridoma 's te detecteren, die het antilichaam afscheiden. Deze hybridoma's worden dan gekweekt voor het produceren van kolonies, waaruit relatief grote hoeveelheden monoklonaal antilichaam kunnen worden gewonnen.

25 Een belangrijke factor in de voorgaande procedure is de mate van zuiverheid van het antigeen, dat wordt gebruikt voor het induceren van de immune respons. Indien er gezocht wordt naar antilichaam, dat complementair is met een specifiek biologisch materiaal, dat door cellen wordt geproduceerd, 30 zijn concentratie en zuivering van het desbetreffende antigeen uit een groot aantal proteïnen, glycolipiden, glyco-proteïnen, lipoproteïnen en polysacchariden, die aanwezig zijn in de afscheiding, vaak zowel omslachtig als een sleutelfactor bij de succesvolle productie van het beoogde anti-35 lichaam. Afhankelijk van de aanwezigheid van externe materialen in het monster van antigeen, dat gebruikt wordt voor 3403352 4 fc - ' - 2 - immunisatie, produceert het geïmmuniceerde dier een groot aantal antilichamen van verschillende specificiteit, waarbij slechts een gering gedeelte het beoogde antilichaam is. Derhalve is de zuivering van het antilichaam uit de antisera 5 tijdrovend. Bovendien, indien men zoekt naar een lymfocyt, die het beoogde antilichaam produceert, is het noodzakelijk gebruik te maken van uitgebreide screeningsprocedures voor het detecteren van de subset van de beoogde cellen. Bovendien wordt de zuivering van het beoogde antilichaam uit bloed-10 vloeistoffen of isolatie van een subset lymfocyten, die het beoogde antilichaam produceren, vereenvoudigd indien het immuniserende middel een relatief zuiver antigeenmonster omvat.

Bij de productie van antilichaam bij een niet-afgescheiden materiaal, bijvoorbeeld een celoppervlakantigeen 15 (immunoglobuline), of antilichaam, bestemd voor de zuivering van door cellen geproduceerde stoffen, bijvoorbeeld inter-feronen, behoort thans tot het bereik van de deskundige een genetisch gemodificeerde cellijn te produceren, welke het oppervlakantigeen of grotere hoeveelheden van het interferon 20 afscheidt. Zuivering van de celafscheidingen, teneinde het beoogde materiaal te concentreren en tenminste een gedeelte van het externe materiaal te verwijderen, is desalniettemin wenselijk of verplicht.

Recentelijk, zoals bijvoorbeeld vermeld door Hatzubai 25 et al. (Journal of Immunology, Vol. 126, No. 6, Juni, 1981), en Miller et al. (New England Journal of Medicine, 4 maart 1982, blz. 517) is er een veelbelovende methode ontwikkeld voor de behandeling, van bepaalde lymfomatypes. De techniek is gebaseerd op de waarneming, dat tumoren het resultaat zijn 30 van de ongecontroleerde proliferatie van klonen van (B) cellen, die op hun oppervlakte markers dragen beperkt tot een immunoglobulinemolecuul, met ten dele een structuurkarakte-ristiek voor de lymfomakloon. Het onderscheidende immunoglo-bulinegebied (idiotype) van elke lymfomakloon is praktisch 35 uniek en kan tumorcellen onderscheiden van normale cellen bij de patiënt. De tumorcellen scheiden de idiotype-dragende immunoglobulinemolecuul niet af, doch kan zijn afscheiding worden geïnduceerd door samensmelten van de lymfomacel met een myelomacellijn. De door samensmelten verkregen producten 40 (hybridoma1s) zijn gescreened voor afscheiding van de idio- 84 0 33 5 2 - 3 - 4 type-dragende immunoglobuline.

Na kweken en winnen van een ruw product wordt het idiotype gezuiverd via diverse chromatografische technieken, waarna proefdieren worden ingespoten met een kleine dosis van 5 het monoklonale idiotype product, gevolgd door een inspuiting van een verhoogde dosis 3-4 weken later. Enkele dagen daarna wordt de milt van het dier verwijderd en worden de miltcellen samengesmolten met bijvoorbeeld een myelomacellijn. Na screenen en kloneren wordt het anti-idiotype antilichaam ver-10 zameld en gezuiverd in hoeveelheden voldoende voor therapeutische toepassing. Intravasculaire inspuiting van ca. 150 mg antilichaam ging gepaard met uitgebreide remissie.

De behoefte aan antilichaam, dat voor elke patiënt aangepast dient te worden, veroorzaakt ernstige beperkingen 15 op deze kankerbehandelingsbenadering. Zoals aangehaald in het artikel van Miller et al. (boven vermeld), zouden er meer gestroomlijnde procedures voor de bereiding van deze antiidiotype antilichamen wenselijk zijn voor het bevorderen van de toepassing van anti-idiotype antilichamen bij deze kli-20 nische behandeling.

Volgens de onderhavige uitvinding is gevonden, dat een immune respons efficient kan worden geïnduceerd in een dierlijk lichaam ten opzichte van een antigeen materiaal, dat is afgescheiden door een cel, door in het dierlijk lichaam 25 rechtstreeks levende cellen te implanteren, welke cellen zijn ingesloten in een of meer capsulemembranen. De membranen zijn voorzien van poriën met afmetingen, die zodanig zijn, dat antigeen materiaal doorgelaten wordt, waarbij echter de doorgang van de ingekapselde cellen wordt belet. Verrassender-30 wijze is er gevonden, dat een door cellen afgescheiden antigeen, bijvoorbeeld IgG met een molecuulgewicht van 150.000 daltons, of IgM met een molecuulgewicht van 950.000 daltons, de capsulemembranen kunnen passeren en in het dier de ge-eigende immune respons kunnen induceren, waarbij echter de 35 cellen door het immune systeem van de dieren niet worden vernietigd. Bovendien ondergaan de ingekapselde antigeen afscheidende cellen normale metabolisme met inbegrip van mitosis, mits zij worden voorzien van geschikte voedingsstoffen in de kweek voorafgaande aan de inkapseling, na inkapseling en voor 40 implantatie, of na implantatie. Ofschoon elke cel, die een :4 0 33 5 2

ï V

- 4 - antigeen, waarvoor een complementair antilichaam gewenst is, afscheidt, kan worden gebruikt bij het proces, wordt in voorkeursuitvoeringsvormen van de uitvinding een genetisch gemodificeerde prokaryotische of eurkaryotische cel gebruikt, 5 die specifiek is ontwikkeld voor het afscheiden van relatief grote hoeveelheden van het antigeen.

De praktijk van de uitvinding bevordert de productie van antilichaam, aangezien de vaak omslachtige stap van zuivering van het antigeen voor het gereedmaken voor immunisatie-10 doeleinden niet vereist is. In plaats van het beoogde antigeen te zuiveren van het mengsel van immunoglubulinen en andere materialen door de cel afgescheiden, gaat men de cel of de veelheid van cellen inkapselen en de capsules als het immuni-satiemiddel gebruiken. Zo is bijvoorbeeld geen verhoogde in-15 spuiting vereist. Bovendien kunnen de capsulemembranen zodanig worden gebouwd, dat zij een voorafgekozen permeabiliteitsge-bied hebben, zodanig dat in de geïmplanteerde microcapsule veel extern hoog moleculair antigeen materiaal achterblijft en geen externe immune responses induceert. Zo kan bijvoor-20 beeld IgGs in vivo worden toegediend, terwijl IgMs worden tegengehouden, of kunnen pyrogenen worden tegengehouden, terwijl laag moleculair antigeen wordt vrijgemaakt.

Na immuniseren kan het beoogde antilichaam worden gewonnen en wel rechtstreeks uit het bloed afkomstig van het 25 proefdier. Alternatief kan een lymfocyt uit bijvoorbeeld de milt worden gehaald en met een maligne cel, zoals een myeloma-cel, worden samengesmolten en gekloneerd onder oplevering van een culture, waaruit relatief grote hoeveelheden monoklonaal antilichaam kan worden verkregen.

30 Het is een doel van de uitvinding een werkwijze te verschaffen voor het induceren van immune respons in een dier tegenover een gekozen antigeen, waarbij het antigeen geen zuivering behoeft. Een ander doel van de uitvinding is het immuniseren met levende cellen onder voorkoming van immune 35 afstoting van de cellen. Een ander doel van de uitvinding is het verschaffen van een meer gestroomlijnde werkwijze voor het produceren van monoklonale antilichamen. Een ander doel is het induceren van een immune respons in een dierlijk lichaam onder gebruikmaking van een immuniserende vloeibare 8403352 - 5 - c drager, die over een zekere tijdsperiode min of meer continu antigeen loslaat en derhalve normaliter geen "booster” verhoogde inspuiting vereist. Deze en andere doelen en aspecten van de uitvinding zullen duidelijk worden aan de hand van de 5 volgende beschrijving, de tekening en de conclusies.

De enige tekening is een kaart, die de resultaten van een proef vermeldt en waarbij de productie van anti-anti-Azotobacter nitrogenase bij laboratoriumdieren, die zijn geïmmuniseerd met ingekapselde hybridoma, die anti-Azotobacter 10 nitrogenase afscheidt.

Het ruime concept van de uitvinding is het induceren van een immune respons in een proefdier tegenover een antigeen stof, die wordt afgescheiden door een levende cel onder oplevering van antilichamen, complementair met het antigeen, 15 onder vermijding van de omslachtige stappen van verzamelen en zuiveren van de antigeenstof uit de cellen. De uitvinding is praktisch onbeperkt aangaande het te gebruiken type cel of antigeen mits de cel het antigeen afscheidt en het antigeen 6 een raolecuulgewicht heeft minder dan 10 daltons. Er kunnen 20 eukaryotische of prokaryotische cellen worden gebruikt. Genetisch gemodificeerde cellen specifiek ontworpen voor het afscheiden van relatief grote hoeveelheden van het beoogde antigeen verdienen de voorkeur.

Wanneer het dus gewenst is een antilichaam, dat 25 specifiek is voor een bepaalde stof, die door een cel bij lage concentratie wordt afgescheiden, te produceren, kunnen er thans conventionele genetische engineeringstechnieken worden toegepast voor het produceren van een cellijn, die het antigeen in grotere concentraties afscheidt. Geninsertie of 30 hybridomatechnologie kan worden toegepast. Dergelijke technieken zijn beschreven in het Amerikaanse octrooischrift No. 4.232.224, verleend op 2 december 1980, en wel voor geninsertie, terwijl de hybridomavorming is beschreven door Koprowski et al., "Production of antibodies against influenza 35 virus by somatic cell hybrids between mouse myeloma and primed spleen cells," Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74^ 2985 (1977). Indien het gewenst is antilichaam, specifiek voor een interferon, bijvoorbeeld voor zuiveringsdoeleinden van het interferon, te produceren, kan het DNA-fragment, dat codeert 40 voor de interferonproductie, worden gelnserteerd onder ge- 8403352 fc· · - 6 - bruikmaking van een geschikte vector in een prokaryotische celgastheer, bijvoorbeeld Ehcoli, die wordt gekloneerd om een culture te produceren, die het interferon afscheidt.

Indien het gewenst is een antilichaam, dat complemen-5 tair is met een antigeenstof, die niet door een cel wordt afgescheiden, bijvoorbeeld aan een celmembraan gebonden anti-genen (immunoglobulinen), te produceren, kan de cel worden samengesmolten met een maligne cellijn, bijvoorbeeld een myeloma, voor de productie van een hybridoma, die het beoogde 10 antigeen afscheidt.

Wanneer de beoogde cel uitgekozen is, kan deze worden gekweekt voor of na microincapsulering teneinde een cel-kolonie te produceren door mitosis, die een voldoende hoeveelheid van dé antigeenstof afscheidt voor het induceren van een 15 goede immune respons. In het algemeen is het aantal benodigde cellen afhankelijk van de hoeveelheid af te scheiden antigeen, die de cellijn produceert en van het type proefdier, waarin de ingecapsuleerde cellen dienen te worden geïmplanteerd.

De cellen kunnen in het algemeen worden inge.capsu-20 leerd volgens de in het Amerikaanse octrooischrift 4.352.883, Franklin Lim, verleend 5 oktober 1982, beschreven methode. Volgens de Lim-techniek kan een prokaryotische of eukaryo-tische cel of celcultuur met daarin genetisch gemodificeerde cellen en weefsel, worden ingecapsuleerd zonder noemenswaar-25 dige beschadiging. Na incapsulering zijn de cellen gezond, levendig en zij zijn in staat een normaal metabolisme te vertonen, terwijl zij bovendien de materialen, die zij normaal afscheiden, blijven afscheiden na te zijn opgenomen in de capsules en zij kunnen voorts mitosis ondergaan. Recente 30 proeven hebben aangetoond, volgens de ruime beschrijving van het octrooi, dat het mogelijk is de afmetingen van de poriën van de capsulemembranen zodanig te beheersen, dat immunoglo-bulinen, door de cellen afgescheiden, met een molecuulgewicht groter dan ca. 100.000 daltons, de membranen kunnen passeren. 35 Ontdekt is thans, dat dergelijke naar verhouding hoog moleculaire materialen, geproduceerd door ingekapselde cellen, die in een dierlijk lichaam zijn geïmplanteerd, het celmembraan kunnen passeren en een immune respons kunnen induceren. De antigeen afscheidende cellen zijn echter beschermd tegen 40 immunologische afstoting en blijven dus gedurende lange pe- 8403352 * * - 7- rioden vitaal om zodoende als een continue bron van de anti-geenstof te dienen. Ofschoon een tweede inspuiting van inge-capsuleerde cellen of niet ingecapsuleerd antigeen desgewenst plaats kan vinden, is er gewoonlijk geen "booster shot" 5 vereist voor het opvoeren van de immune respons.

Bovendien kunnen de afmetingen van de microcapsule-poriën worden beheerst op de wijze, zoals hier en in het Lim-octrooi beschreven, opdat in hoofdzaak stoffen met een relatief laag molecuulgewicht worden doorgelaten, terwijl alle 10 of tenminste een gedeelte van hoog moleculaire stoffen worden tegengehouden. Tijdens inkapseling kan een zekere beheersing van het molecuulgewicht van de stoffen, die in het dierlijk lichaam worden vrijgemaakt, worden verkregen. Zo kunnen bijvoorbeeld genetisch gebouwde prokaryotische cellen, die zowel 15 1) een beoogd antigeen met een molecuulgewicht beneden bijvoorbeeld 70.000 daltons als 2) pyrogenen met een groter molecuulgewicht en dus grotere effectieve moleculaire afmetingen worden ingecapsuleerd zodanig, dat een belangrijke fractie van de pyrogenen in de capsules worden tegengehouden, terwijl 20 een immune respons wordt ontwikkeld tegen de beoogde laag moleculaire antigeenstof. Bij wijze van een ander voorbeeld is het mogelijk volgens de uitvinding cellen te incapsuieren, die zowel IgG als IgM afscheiden, zodanig, dat de IgG wordt afgegeven in het dierlijk lichaam, terwijl alle of de meeste 25 van de IgM in het intracapsulaire volume wordt tegengehouden. Dienovereenkomstig verschaft de praktijk van de uitvinding op effectieve wijze een mate van "zuivering" van het beoogde antigeen, doordat het antigeen aan het dierlijk lichaam wordt afgestaan in een vorm die minder verdund is door hoog mole-30 culaire stoffen. De zuivering van het antigeen wordt verkregen zonder denaturatie, een algemeen probleem bij conventionele technieken.

De capsules worden bij voorkeur geïmplanteerd, gewoonlijk door inspuiting, bijvoorbeeld in de peritoneale 35 holte van een laboratoriumdier, zoals een rat, muis of een ander zoogdier. Intramusculaire of subcutane implantatie kan eveneens worden toegepast.

De methode voor het incapsuieren van de cellen, die thans de voorkeur verdient, zoals bovenvermeld, is beschreven 40 in het Amerikaanse octrooischrift 4.352.883. Het weefsel- 8403352 * fc - 8 - monster, de cel of celculture, die ingecapsuleerd dient te worden, wordt eerst in fijn verdeelde vorm bereid volgens bekende technieken en dan gesuspendeerd in een waterig medium, geschikt voor het behouden en onderhouden van de aan de gang 5 zijnde metabolische processen van de betrokken cellen. Media, geschikt voor dit doel, zijn in het algemeen commercieel verkrijgbaar. Daarna wordt aan het medium een in water oplosbare stof, die fysiologisch verenigbaar is met de cellen en die wateronoplosbaar kan worden gemaakt onder vorming van een 10 vormbehoudende coherente bolvormige massa of een andere vorm, worden toegevoegd. De oplossing wordt vervolgens tot de cellen bevattende druppels gevormd samen met hun onderhouds- of groeimedium en wordt onmiddellijk wateronoplosbaar gemaakt en gegeleerd onder oplevering van vormbehoudende, typisch bol-15 vormige coherente massa's. Het materiaal, dat wordt gebruikt voor het induceren van gelering van het cultuurmedium kan elk willekeurig niet-toxisch wateroplosbaar materiaal zijn, dat door verandering van de omgevingstemperatuur, pH, iono-gene omgeving of concentratie kan worden omgezet in vormbe-20 houdende massa's. Bij voorkeur is een dergelijk materiaal bovendien een materiaal, dat meerdere gemakkelijk ioniseer-bare groepen draagt, bijvoorbeeld carboxyl- of aminogroepen, die door zoutvorming kunnen reageren met polymeren, die meerdere groepen bezitten, elke door ionisatie groepen met tegen-25 overgestelde lading opleveren. Toepassing van dit type materiaal bevordert de afzetting van een membraan van een geselecteerde poriëngebied zonder beschadiging van de labiele cellen.

De materialen, die thans de voorkeur verdienen voor de vorming van de gegeleerde massa's zijn wateroplosbare 30 natuurlijke of synthetische polysacchariden. Veel van dergelijke commercieel beschikbare materialen zijn geëxtraheerd uit plantaardig materiaal en worden vaak gebruikt als toevoegsels voor diverse voedingsmiddelen. Natriumalginaat verdient thans de voorkeur als wateroplosbaar polysaccharide.

35 Andere geschikte materialen zijn zuurfracties van guargom, arabische gom, carrageen, pectine, tragacanthgom of xanthan-gom. Deze materialen kunnen worden gegeleerd indien meerwaardige ionen worden uitgewisseld voor de zure waterstof of alkalimetaalion, dat normaal geassocieerd is met de carboxyl-40 groepen. De vloeibare, wateroplosbare polysaccharidemoleculen 8403352 - 9 - * worden derhalve "verknoopt" onder vorming van een wateronop-losbaar, vormbehoudend gel, dat vaak opnieuw kan worden opgelost door verwijdering van de verknopingsionen, door ionenuitwisseling of via een sequestreermiddel. Bij voorkeur wor-5 den fysiologisch verenigbare ionen, bijvoorbeeld calcium, gebruikt, omdat hun toepassing weinig nadelige invloed op de vitaliteit en het normale metabolisme van cellen heeft.

Andere polysacchariden zijn in staat snel te wisselen tussen hun wateroplosbare toestand en de gegeleerde wateronoplosbare 10 toestand gewoonweg door de verandering van de pH van het medium, waarin ze zijn opgelost.

Een typisch celcultuurmedium - polysaccharideoplos-sing omvat gelijke volumes cellen in hun medium en een 1-2% oplossing van polysaccharide in fysiologische zoutoplossing. 15 Bij toepassing van het voorkeursnatriumalginaat wordt een 1,0-1,5% oplossing met succes gebruikt.

In de volgende stap van het proces wordt de cellen bevattende polysaccharideoplossing gevormd tot druppels van gebruikelijke afmeting, in het algemeen binnen het traject 20 van 50 microns tot enkele millimeters. Daarna worden de druppels onmiddellijk ondergedompeld in een calciumzoutbad teneinde het gel te verknopen tot vormbehoudende hogere viscositeit bezittende, bolvormige massa's met daarin de gesuspendeerde cel of cellen en zijn medium. De gegeleerde bolletjes · 25 verzamelen zich in de oplossing in de vorm van een afzonderlijke fase en kunnen door wegzuigen worden afgezonderd.

Dan wordt rondom het oppervlak van de gelbolletjes een semipermeabel membraan afgezet. De voorkeursmethode voor het vormen van een membraan omvat het permanent verknopen van 30 de oppervlaktelagen van de bolletjes of andere gegeleerde vormen door hen bloot te stellen aan een waterige oplossing van een polymeer met in het algemeen een molecuulgewicht groter dan 3.000 daltons, welk polymeer groepen draagt, die ionogeen reactief zijn met in de gelmoleculen aanwezige 35 groepen. Wanneer gecarboxyleerde of andere zuurpolysacchari-den worden gebruikt, zijn polymeren met zuurreactieve groepen, zoals aminen, iminen of amiden voor dit doel bruikbaar. Poly-kationogene materialen, zoals polylysine, polyethyleenimine, polyomithine en polyvinylamine verdienen thans voor deze 40 stap de voorkeur. Blootstelling aan de polykationogene mate- 840 33 ö 2 - 10 - rialen resulteert in de vorming van zoutbinding-type bruggen door interactie tussen de anionogene groepen, bijvoorbeeld carboxylgroepen, op de polysaccharide en de kationogene groepen, bijvoorbeeld aminegroepen, op het polymeer.

5 Afhankelijk van het toegepaste type semipermeabel membraanvormingstechniek is het vaak gewenst de capsules zodanig te behandelen, dat de vrije aminogroepen of dergelijke, die anders samenklontering van de capsule zouden veroorzaken, te blokkeren. Dit kan worden bereikt bijvoorbeeld door onder-10 dompeling van de capsule in een oplossing van natriumalginaat.

Volgens de Lim-incapsuleringstechniek kan de permeabiliteit van het membraan ten delen worden beheerst door keuze van het molecuulgewicht van het te gebruiken verkno-pingspolymeer, de duur van de verknopingsbewerkingen en de 15 concentratie van het polymeer in de verknopingsoplossing. Zo zal bijvoorbeeld een oplossing van een polymeer met een laag molecuulgewicht in een gegeven tijd dieper in een gel penetreren dan een hoog moleculair polymeer. In het algemeen kan gesteld worden, dat hoe hoger het molecuulgewicht en hoe ge-20 ringer de penetratie van het polymeer is, hoe groter de poriëngrootte van het verkregen membraan. Zoals boven vermeld, verdienen polymeren met een molecuulgewicht groter dan ca.

3.000 daltons de voorkeur. Volgens een set reactieomstandig-heden, zoals beschreven als in het Lim-octrooi, wordt gebruik 25 gemaakt van polylysine met een gemiddeld molecuulgewicht van ca. 35.000 daltons, opgelost in een concentratie van 0,016 gew.% polylysine in zoutoplossing.

Vastgesteld is, dat de capsulemembranen van het volgens de bovenbeschreven techniek bereide type poriën hebben 30 met afmetingen, die variëren en die absoluut niet verhinderen, dat moleculen van een gegeven effectieve diameter het membraan passeren, terwijl zij kleinere moleculen wel doorlaten. Aangenomen wordt, dat in de poriën bochtige paden voorkomen, en wel door het membraan, gevormd door tussenruimtes tussen 35 de verknoopte polyanionogene en polykationogene materialen, die gebruikt worden voor de vorming van het membraan. Bij een gegeven set reactieomstandigheden en een gegeven paar polykationogene en polyanionogene materialen (of mengsels van dergelijke materialen) vindt er een vrije diffusie plaats 40 van laag moleculaire stoffen door het membraan bij een rela- 8403352 -11- tief hoge snelheid, praktisch ongehinderd door collisies met het membraanmateriaal. Moleculen met een hoger molecuulge-wicht en grotere effectieve moleculaire dimensie diffunderen door het membraan bij een snelheid, die wordt beïnvloed door 5 de laterale dimensies en lengte van de poriën. Binnen deze hogere moleculaire dimensies en de moleculaire dimensietoename neemt de snelheid door het membraan af. De bovengrens van de permeabiliteitsrange is moeilijk precies te bepalen, alhoewel voor elk systeem een moleculaire dimensie bestaat, 10 waarbij de diffusiesnelheid praktisch nul is.

Capsules, ontworpen voor de toepassing in de onderhavige uitvinding, hebben bij voorkeur membranen, die als het ware op maat zijn gemaakt, teneinde te voldoen aan de bovengenoemde semipermeabiliteitseigenschappen. Tijdens het inkap-15 selen kan een zekere mate van beheersing worden verkregen met betrekking tot de permeabiliteit van het capsulemembraan, zodanig dat de diffusie van de beoogde antigeenstof gewaarborgd wordt, terwijl de doorlating van tenminste de cel en bij voorkeur externe stoffen, aanwezig in het cultuurmedium of afge-20 scheiden door de cellen, die binnen het intracapsulaire colume worden vrijgelaten, wordt tegengehouden.

Naast de permeabiliteitsbeheersingstechnieken, zoals beschreven in het Lim-octrooi, zijn er twee andere poreus-heidbeheersingstechnieken ontdekt. ' 25 In een eerste techniek, in het bijzonder geschikt in situaties waar het gewenst is moleculen met een molecuulge-wicht van ca. 20.000-100.000 daltons in het intracapsulaire volume tegen te houden, terwijl lager moleculair materiaal wordt losgelaten, kunnen opeenvolgende membraanvormingsstappen 30 worden toegepast. Zo kunnen bijvoorbeeld de gelmassa's eerst worden ondergedompeld in een oplossing van hoog moleculaire polylysine en vervolgens in een oplossing van laag moleculaire polylysine. Alternatief kan de eerste membraanvorming een polylysinebehandeling met een tussenliggend molecuulge-35 wicht omvatten, gevolgd door een polykationogeen polymeer met een hogere ladingsdichtheid, zoals polyvinylamine. Het effect van deze techniek is het verlagen van de gemiddelde dimensies van de poriën.

De tweede poriëndimensiebeheersingstechniek werd 40 ontwikkeld op basis van de waarneming, dat alginaatgellen in J 3 5 2 - 12 - volume variëren afhankelijk van hun hydratatiegraad, die op zijn beurt afhankelijk is van de ionsterkte van de oplossing, waarmee zij in evenwicht zijn. Een membraan, gevormd rondom een geëxpandeerd alginaatgel is gelijkmatiger dan membranen 5 gevormd rondom ongeëxpandeerde geilen. Dit fenomeen, gekoppeld aan de observatie, dat membranen, gevormd rondom dichte geilen intact blijven wanneer het gel vervolgens wordt geëxpandeerd , maken de synthese van membranen met verhoogde laterale poriëndimensies mogelijk en derhalve de vorming van 10 verbeterde membranen. Wanneer bijvoorbeeld het beoogde anti-geen een molecuulgewicht heeft in de orde van grootte van 200.000 daltons, kunnen de cellen, die het antigeen afscheiden, worden ingekapseld bijvoorbeeld door reactie van een polykationogeen materiaal met middelmatig molecuulgewicht met 15 hoge dichtheid calciumalginaatgelmassa's bevattende cellen.

De capsules kunnen in evenwicht worden gebracht en geëxpandeerd met een oplossing van eenwaardige kationen, teneinde de hydratatiegraad van het gel te verhogen onder expanderen van de capsulemembranen en verhoging van de effectieve porie-20 grootte. De geëxpandeerde capsules kunnen eventueel wederom worden behandeld met een verknopingspolymeer voorafgaande aan implantatie.

Door toepassing van een of een combinatie van de voorgaande technieken is het mogelijk de permeabiliteits-25 eigenschappen van de membranen empirisch zo vast te stellen, dat hun inherente zeefvermogen op een bepaalde waarde wordt gebracht.

Inductie van de immune respons omvat stimulering van lymfocyten door het antigeen in het circulatiesysteem van 30 het proefdier. Het winnen van het antilichaam kan volgens de uitvinding worden bereikt door de lymfocyten, die verantwoordelijk zijn voor de synthese en afscheiding van het beoogde antilichaam, te laten groeien en vervolgens het antilichaam van tijd tot tijd te verzamelen en te zuiveren, af-35 komstig van de bloedvloeistof, onder gebruikmaking van de voor de vakman bekende technieken. Ofschoon de gebruikelijke antilichaam-winningstechniek afdoende is voor kleinschalige antilichaamproductie omvat een voorkeurswinningstechniek de thans gebruikelijke manipulatieve technieken voor de produc-40 tie van monoklonale antilichamen. In dit geval wordt het dier ó 4 0 3 3 5 2 — 13 — na inductie van de immune respons gedood, waarna de lymfo-cyten, bij voorkeur afkomstig van de milt, lymfeknobbels of beenmerg, worden samengesmolten met een onsterfelijke cellijn, zoals een myeloma. Bij voorkeur wordt gebruik gemaakt van een 5 gevestigde maligne cellijn, die weinig of geen immunoglobuline afscheidt. De door samensmelten verkregen producten worden gescreened door vitale hybridoma's, die het antilichaam afscheiden, waarna de hybridoma’s worden gekoneerd voor de productie van hybridomacultures, die relatief grote hoeveelheden 10 monoklonaal antilichaam afscheiden. De productie van hybridoma's verdient de voorkeur wanneer het om grote hoeveelheden antilichaam gaat, die specifiek zijn voor een bepaald anti-geen, bijvoorbeeld in immunoaffiniteitschromatografiekolom-men, bij de productie van diagnostische proefsets, zoals 15 radioimmuno- en enzymimmunoproefsets, alsmede voor therapeutische toepassing, bijvoorbeeld voor de behandeling van lym-foma op de bovenbeschreven methode. Methoden voor de productie van hybridoma’s zijn beschreven, bijvoorbeeld in de volgende artikelen: Koprowski et al, supra; Howard et al, "Iso-20 lation of six monoclonal alloantibodies against histocompabil-ity antigens: clonal competition," Immunology 41 :131 (1980)? en Trowbridge, "Interspecies spleen-myeloma hybrids producing monoclonal antibodies against mouse lymphocyte surface glycoprotein T200,” J. Exptl. Med. 148:313(1978).

25 De uitvinding zal voorts aan de hand van de volgende niet-limitatieve voorbeelden nader worden toegelicht.

Voorbeeld I

Een cellijn, die IgG antilichamen tegen Azotobacter nitrogenase afscheidt, wordt verkregen door samensmelten van 30 miltcellen van een BALB/c muis, geïmmuniseerd met Azotobacter nitrogenase, en een BALB/c muis myelomacellijn, GM 3570 (literatuuraanduiding P3x63Ag8.653). De myelomacellijn, die geen IgG afscheidt, was afkomstig van de Human Genetic Mutant Cell Repository. Myeloma en de anti-Azotobacter nitrogenase 35 afscheidende miltlymfocyten werden samengesmolten onder gebruikmaking van gebruikelijke polyethyleenglycoltechnieken, zoals beschreven in de bovengenoemde literatuur. De door samensmelten verkregen producten werden gescreened voor anti- 3403352 - 14 -

Azotobacter nitrogenase-afscheiding onder gebruikmaking van technieken, welke zijn besproken in de aanvrage Serial No.

613r235, en vitale hybridoma's werden ingekapseld onder gebruikmaking van de volgende techniek.

5 De BALB/c hybridoma (aangeduid als C25) werd gesus pendeerd in een 1,34% (gew./volume) natriumalginaat (NaG-Kelco) in een zoutoplossing. De visceuze suspensie werd overgebracht in een 10 ml spuit, die werd vastgemaakt aan een straalkopdruppelvormend apparaat. Een straalkopapparaat be-10 staat uit een huis, dat is voorzien van een bovenste luchtin-laatmondstuk en een langwerpige holle frictie, die is ondergebracht in een stop. Een spuit, bijvoorbeeld een 10 ml spuit, voorzien van een doseerpomp is aangebracht bovenop het huis met een naald, bijvoorbeeld een 0,025 cm I.D. Teflon-beklede 15 naald, die zich uitstrekt over de lengte van het huis. Het inwendige van het huis is zodanig ontworpen, dat het uiteinde van de naald is onderworpen aan een constante laminaire luchtstroming, die als een luchtmes fungeert. In gebruik wordt de spuit gevuld met de oplossing van het in te capsuleren mate-20 riaal . aangebracht bovenop het huis, waarna de doseerpomp wordt geactiveerd om druppels van de oplossing te forceren naar het uiteinde van de naald. Elke druppel wordt "afgesneden " met behulp van de luchtstroom en valt ca. 2,5 cm in een geleringsoplossing, waarin de druppel onmiddellijk wordt 25 gegeleerd door absorptie van de verknopingsionen. De voor-keursgeleringsoplossing is een calciumionoplossing, bijvoorbeeld 1,2% (gew./vol.) calciumchloride. De afstand tussen het uiteinde van de naald en de calciumchlorideoplossing is groot genoeg om de natriumalginaat/celoplossing de gelegenheid te 30 geven de in fysisch opzicht meest gunstige vorm, te weten een bolvorm, aan te nemen. Lucht binnen de buis wordt doorgelaten via een opening in de stop. De gegeleerde, vormbehoudende bolvormige massa's of tijdelijke capsules, die bij voorkeur een diameter hebben van 50 microns tot enkele millimeters, 35 hopen zich op in de oplossing in de vorm van een afzonderlijke fase en kunnen door wegzuigen worden gewonnen.

De gegeleerde bolletjes werden drie keer gewassen met 150 mM natriumchloride, vervolgens gedurende zes minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd in een 1,875 mg/ml oplossing 8403352 - 15 - van poly-L-lysine (Sigma Chemical Company, molecuulgewicht 65.000 daltons). Na incubatie werden de capsules gewassen in 25 ml 5 mM CHES buffer (2-n-cyclohexylaminoethaansulfonzuur, pH 7,5, in 0,2% (gew./vol.) calciumchloride en 150 mM natrium-5 chloride), een keer in 0,2% (gew./vol) calciumchloride in 150 mM natriumchloride en een keer in 150 mM natriumchloride. De capsules werden vervolgens na-bekleed door incubatie gedurende 4 min bij kamertemperatuur in 0,06% (gew./vol.) NaG in 150 mM natriumchloride, een keer in 150 mM natriumchloride-10 oplossing gewassen en gedurende nog eens 15 min bij kamertemperatuur in 55 mM natriumnitraat in 150 mM natriumchloride geïncubeerd. De oplossing werd gedecanteerd en vervangen door een vers 55 mM natriumcitraat in 150 mM natriumchlorideoplos-sing. De capsules werden bij kamertemperatuur gedurende 6 min 15 geïncubeerd in de tweede natriumcitraatoplossing en twee keer gewassen met 150 mM natriumchloride, een keer gewassen met Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (hoog glucose) en vervolgens met Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (hoog glucose) met 20% foetaal kalfserum (FCS-Dutchland Labora- 20 tories) erin naast penicilline, streptomycine, 1 mM glutamine -5 en 5x10 M mercaptoethanol. De volgens deze procedure gevormde capsules waren permeabel voor IgG (molecuulgewicht ca. 160.000 daltons), doch tegelijkertijd impermeabel voor IgM (molecuulgewicht ca. 900.000 daltons).

25 De ingecapsuleerde cellen werden gekweekt in een kweekfles gedurende verscheidene dagen, gevolgd door disper-geren in een microtiterplaat voorzien van 24 uithollingen samen met groeimedium, Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (hoog glucose) met penicilline, streptomycine, 20% FCS, -5 30 1 mM glutamine en 5x10 M mercaptoethanol bij een concentratie van 20 vol.% capsules en 80 vol.% groeimedium. Intra-capsulaire en extracapsulaire media in elk van de uithollingen werden van tijd tot tijd onderzocht onder gebruikmaking van de volgende proeven teneinde de concentratie van de afge-35 scheiden anti-Azotobacter nitrogenase vast te stellen.

De 96 uithollingen van een EIA-plaat werden voorzien van 100 μΐ van een 10 ug/rnl (1 ug) oplossing van Azotobacter nitrogenase in een fosfaatbufferzoutoplossing. Na incubatie gedurende de nacht bij 4°C werd de overmaat fosfaatbuffer-40 zoutoplossing afgeschud, waarna de uithollingen werden be- 8403352 - 16 - kleed met een 1% runderserumalbumine in PBS-oplossing (BSA-PBS). Na 1 uur werd de BSA-PBS oplossing afgeschud. Monsters werden verdund onder gebruikmaking van de BSA-PBS oplossing, waarna standaards werden bereid door verdunning van een 5 1 pg/ml oplossing van gezuiverde C25 anti-nitrogenase met dezelfde buffer. De monsters liet men gedurende 1 uur bij 37°C incuberen, waarna de uithollingen drie keer met PBS werden gewassen. Een 1:1000 verdunning van geit-anti-muis IgG geconjugeerd met peroxidase in BSA-PBS werd aan elke uitholling 10 toegevoegd. Na een 2 uur durende incubatie bij kamertemperatuur werd elke uitholling vijf keer met PBS gewassen. 100 μΐ van een 4 mg/ml orthofenyleendiamine, 0,2% (vol./vol.) waterstofperoxide in 50 M natriumcitraat, pH 4,5, werd aan elke uitholling toegevoegd. Na 15 min werd de reactie gestopt door 15 toevoeging van 100 pi 4N HCL. De platen werden afgelezen op een plaataflezer voor kleur, teneinde de concentratie van anti-nitrogenase te bepalen.

Na 22 dagen, waarbij de extracapsulaire antilichaam-concentratie ca. 1,9 pg/ml was en de intracapsulaire anti-20 lichaam-concentratie ca. 1 pg/ml, werden de capsules gewassen in Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (Ca/Mg vrij-DPBS) en een 0,5 ml volume capsules in DPBS werd ingespoten in de peritoneale holte van elk van drie C57 BL/6J muizen.

g

De 0,5 ml capsules bevatten ca. 2,5x10 cellen. Tegelijker-25 tijd werd een gelijke concentratie niet-ingecapsuleerde Balb/c x Balb/c hybridoma ingespoten in B6J muizen.

Van de staart van de muizen afkomstig bloed werd onderzocht op anti-anti-Azotobacter nitrogenase op de tweede, derde en zesde dag na implantatie onder gebruikmaking van 30 de volgende procedure. Een 96 uithollingen bevattende EIA-plaat werd gecodeerd door overnacht-incubatie bij 4°C van 100 μΐ 10 pg/ 1 Azotobacter nitrogenase per uitholling. De overmaat PBS werd afgeschud en de uithollingen werden vervolgens na-bekleed gedurende 1 uur met een oplossing van 1% BSA 35 in PBS.. Nadat de BSA-PBS oplossing werd afgeschud werd 100 pl van 10 pg/ml gezuiverde C25 anti-nitrogenase aan elke uitholling toegevoegd en gedurende ca. 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd. De overmaat C25 werd afgeschud, de uithollingen werden drie keer gewassen met PBS en vervolgens 40 100 pl van de serummonsters 1:2 verdund met heparine in 8403352 - 17 - *

BSA-PBS werden in elke uitholling overgebracht. Na 1 uur incubatie bij kamertemperatuur werden de monsters afgeschud, waarna elke uitholling drie keer werd gewassen met PBS en 100 μΐ geit-anti-muis IgM (mu specifiek) geconjugeerd met 5 peroxidase werd toegevoegd aan elke uitholling. Na 1 uur incubatie bij kamertemperatuur werd elke uitholling vijf keer gewassen met PBS en 100 μΐ 4 mg/ml orthofenyleendiamine en 0,02% (vol./vol.) waterstofperoxide in natriumcitraat, pH

4,5, werd aan elke uitholling toegevoegd. Na ca. 15 min werd 10 de kleurontwikkeling waargenomen en de reactie werd gestopt door de toevoeging van 100 μΐ 4N HC1. De platen werden afgelezen op een plaataflezer en vergeleken met controles voor het bepalen van de aanwezigheid van anti-anti-nitrogenase in het serum. In de muizen, ingespoten met niet-ingecapsuleerde 15 cellen, werd geen antilichaam waargenomen. Deze vinding stemde overeen met het feit, dat de BALB/c x BALB/c hybridoma en B6J muizen verschillende histo-onverenigbaarheid allelen hebben.

De resultaten van de proeven bij de drie proefmuizen 20 en diverse controles voor de aanwezigheid van anti-anti-Azotobacter nitrogenase zijn indicatief voor de succesvolle teweegbrenging van een immune respons, geïnduceerd in de dieren door implantatie van de in fig. 1 vermelde micro-capsules. Elk blok in de kaart van fig. 1 stelt een uitholling 25 in een microtiterplaat voor, waarin de proeven zijn uitgevoerd. Het aantal in de bovenlinkerhoek van elk blok van de kaart slaat op de muis, waaruit de bloedvloeistof werd verkregen, het getal in de bovenrechterhoek van elk blok van de kaart slaat op de dag na de implantatie waarop de bloedvloei-30 stoffen werden bemonsterd en het derde getal in elk blok slaat op de optische dichtheidsaflezing van de proef voor het antilichaam, verricht bij 495 nm. Hoe groter de optische dichtheicfeaf1ezing des te groter de concentratie van de anti-anti-Azotobacter nitrogenase in het monster. Uithollingen, 35 gelabelled 1a-1d, waren negatieve controles, die bloedvloei-stoffen bevatten met een zero-concentratie aan het antilichaam. Zoals blijkt uit fig. 1, ontwikkelden al deze dieren een sterke immune respons, met een piek 2-3 dagen na inocu-latie.

8403352 V ^ - 18 -

Voorbeeld II

Een mens-menshybridoma, die menselijk IgM (afkomstig van Biological Response Modifiers Program, National Cancer Institute, Bethesda, Maryland) afscheidde, werd gesuspendeerd g 5 in een concentratie van ca. 10 cellen/ml in 20 ml 1,37% (gew./vol.) natriumalginaat (Kelco) en 0,2 ug/ml Transferrin (Sigma) in 150 mM natriumchloride. De visceuze oplossing werd overgebracht in een 20 ml spuit en vervolgens vastgemaakt aan een straalkop-druppelvormend apparaat, zoals bovenbeschreven. 10 Bolvormige druppels werden gegeleerd door ze in contact te brengen met een 1,2% (gew./vol.) calciumchlorideoplossing. De gegeleerde bolletjes werden drie keer gewassen met 150 mM natriumchloride en gedurende 6 min bij kamertemperatuur ge-incubeerd in een oplossing van 0,25 mg/ml DEAE Dextran en 15 100 mg/ml poly-L-lysine (Sigma, gemiddeld molecuulgewicht ca.

65.000 daltons). De capsules werden gewassen in 50 ml CHES buffer en vervolgens gewassen in 50 ml 0,2% (gew./vol.) cal-ciumchloride in 150 mM natriumchloride. De capsules werden gedurende 5 min geïncubeerd bij kamertemperatuur in 25 ml 20 0,06% (gew./vol.) polyvinylamine in 150 mM natriumchloride, daarna twee keer gewassen in 150 mM natriumchloride, geïncubeerd nog eens gedurende 4 min bij kamertemperatuur in een 0,06% (gew./vol.) natriumalginaat in 150 mM natriumchloride-oplossing en tenslotte nog eens gewaseen met 150 mM natrium-25 chloride. De capsules werden vervolgens gedurende 16 min ge-incubeerd bij kamertemperatuur in een 55 mM natriumcitraat in 150 mM natriumchlorideoplossing, daarna werd de oplossing gedecanteerd en de capsules werden geïncubeerd gedurende nog eens 6 min in een verse natriumcitraatoplossing. De capsules 30 werden dan een keer gewassen met 150 mM natriumchloride, een keer met Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (hoog glucose) en tenslotte met het groeimedium, Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (hoog glucose) met 20% FCS, penicilline en streptomycine erin. De cellen werden vervolgens gekweekt 35 bij 50% (vol./vol.), capsules 80% groeimedium.

De volgende proef werd uitgevoerd voor het bepalen van de hoeveelheid menselijk IgM, afgescheiden door de cellen, alsmede voor het bepalen van de hoeveelheid IgM in het intracapsulaire volume en het extracapsulaire medium. De 96.

40 uithollingen in een microtiterplaat werden bedekt door toe- 840 33 5 2 - 19 - voeging van 100 μΐ van een 1 :500 verdund konijne-anti-mens (kappa-keten) serum (Cappel) in PBS. Na incubatie van de platen gedurende de nacht bij 4°C werd de oplossing uit de uithollingen afgeschud, waarna de uithollingen gevuld werden 5 met een 1% BSA-PBS oplossing. Na 1 uur incubatie bij kamertemperatuur werden de uithollingen leeggemaakt door decanteren van de vloeistof. Intracapsulaire monsters werden bereid door verwijdering van een evenmatig deel van de culture, door wassen van de capsules drie keer in koud (4°C) PBS en 10 door afbreking van de capsules met een A-opruimingshomogeni-seermiddel. De capsuleresten en cellen werden gecentrifugeerd tot een pil bij 2.000 omw./min gedurende 15 min, waarna de daarboven gelegen vloeistof werd verzameld. De extracapsu-laire monsters waren gewoonweg het medium, waarin de cap-15 sules werden opgekweekt.

In een tweevoudige verdunning werden monsters in de achteraf gevulde uithollingen overgebracht en gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd. De uithollingen werden drie keer gewassen met PBS en 100 μΐ van een 1 :500 verdunning 20 van konijn-anti-mens IgM (mu specifiek) geconjugeerd met peroxidase (Cappel) werd aan elke uitholling toegevoegd. Na extra 2 uur bij kamertemperatuur werden de uithollingen vijf keer gewassen met PBS en 100 μΐ van een 4 mg/ml orthofenyleen-diamine, waarna 0,02% (vol./vol.) waterstofperoxide in na-25 triumcitraat, pH 4,5, oplossing werd toegevoegd. Na 15 min werd de reactie gestopt door toevoeging van 100 yl 4N HCL aan elke uitholling. De in het monster verkregen hoeveelheid kleur werd bepaald op een plaataflezer, waarna de hoeveelheid IgM werd bepaald door vergelijking van de kleur met standaard-30 uithollingen met bekende hoeveelheden menselijk IgM.

Uit de bovengenoemde proef blijkt, dat tenminste 5% van de door de cellen gesynthetiseerde IgM zich bevond in het extracapsulaire medium, terwijl de rest in de capsules werd tegengehouden. Vastgesteld werd, dat de cellen ca. 1 micro-35 gram IgM per 10^ cellen per dag konden synthetiseren.

Ondanks de relatief kleine hoeveelheden IgM, die uit de capsules vrijkwamen, werden 0,5 ml capsules intra-peritoneaal in BALB/c muizen ingespoten (de veertiende dag na incapsulering). De immune respons van de muizen werd van 40 tijd tot tijd waargenomen onder gebruikmaking van conventio- 8403352 - 20 - nele ELISA screening procedure, welke bij de deskundige bekend is. Na ca. 12 dagen vertoonden de dieren een aanmerkelijke immune respons. Op dit moment kon hetzij het serum worden gebruikt, hetzij de milt kon worden verwijderd, zoals hierna 5 beschreven, voor het samensmelten met onsterfelijke cellijnen onder vorming van hybridoma's, die anti-mens IgM produceren.

Op de 21ste dag werd de milt van de muizen verwijderd en samengesmolten met de onsterfelijke cellijn GM 3569 myeloma (Human Genetic Mutant Cell Repository) overeenkomstig 10 de gepubliceerde procedures. Samengevat werden ca. 10^ myeloma-cellen gemengd met de cellen afkomstig van één milt, die waren afgezonderd door de milt door een draadzeef te drukken. Gedurende 10 min werd het mengsel gecentrifugeerd bij 1500 xg gesuspendeerd in 25 ml serum-vrij Dulbecco's gemodificeerd 15 Eagle's medium (DMEM-Gibco), nog eens gedurende 10 min gecentrifugeerd bij 1500 xg, opnieuw gesuspendeerd in een extra hoeveelheid van 25 ml DMEM en vervolgens opnieuw gecentrifugeerd.. De verkregen pil werd langzaam gesuspendeerd in 40% polyethyleenglycol 1540 (Baker) in DMEM. Dit mengsel werd ge-20 durende 5 min bij kamertemperatuur gelncubeerd, langzaam met 25 ml DMEM verdund en gedurende 10 min nog eens gecentrifugeerd. Het na samensmelten verkregen mengsel werd opnieuw gesuspendeerd in 25 ml DMEM, opnieuw gecentrifugeerd en opnieuw gesuspendeerd in DMEM met daarin 20% foetaal kalfserum (FCS-25 Flow Labs), penicilline, streptomycine en hypoxanthine, thymidine en aminopterine (HAT).

Het na samensmelting verkregen mengsel werd na vermenging van voedermiltcellen overgebracht in tien microtiter-platen elk met 96 uithollingen. De platen werden bij 370°C 30 gelncubeerd in een vochtige atmosfeer met daarin 90% lucht, en 10% CO2. Na 18 dagen, met inbegrip van 4 wisselingen van medium, werd elk medium uit elke uitholling' onderzocht op aanwezigheid van muis anti-mens IgM onder gebruikmaking van de volgende proef.

35 De uithollingen van EIA platen werden bedekt met 1 yg mens IgM (10 yg/ml in PBS) en bij 4°C gedurende de nacht gelncubeerd. De uithollingen werden leeggemaakt en vervolgens achteraf bedekt met 1% BSA in PBS door incuberen gedurende tenminte 15 min bij kamertemperatuur. De uithollingen werden 40 vervolgens leeggemaakt, waarna 100 μΐ groeimedium van elk van 8403352 - 21 -

de hybridomacultures aan de op geschikte wijze met IgM bedekte uithollingen toegevoegd. Deze platen werden bij 37°C geïncubeerd in een vochtige atmosfeer gedurende 2 uur, waarna de uithollingen werden geledigd, twee keer met PBS gewas-5 sen, waarna 100 μΐ van een 1:1000 (in PBS-BSA) verdunning van (mens IgM geabsorbeerd), peroxidase geconjugeerd met geit-anti-muis IgG aan elke uitholling werd toegevoegd. De platen werden nog eens 2 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd. Na deze incubatie werden de uithollingen vijf keer met PBS ge-10 wassen, waarna 100 μΐ van een 4 mg/ml orthofenyleendiamine, 0,02% (vol./vol.) waterstofperoxide in natriumcitraat, pH

4,5, oplossing werd toegevoegd. 'De reactie werd na 15 min gestopt door toevoeging van 100 μΐ 4N HC1 aan elke uitholling. De aanwezigheid van een kleur in een uitholling wees op de 15 aanwezigheid van muis-anti-mens IgM in de desbetreffende uitholling van de hybridomaplaat. Van de 656 hybridomakolonies (van de 960 uithoudingen) bleken 14 kolonies anti-mens IgM af te scheiden, zoals bepaald volgens deze screeningsproce-dure.

20 De uitvinding heeft ook andere uitvoeringsvormen zonder af te wijken van de geest en omvang daarvan. Dienovereenkomstig zijn ook andere uitvoeringsvormen begrepen in de volgende conclusies.

8403352

Claims (31)

1. Werkwijze voor het induceren van een immune respons in een dierlijk lichaam/ met het kenmerk, dat deze werkwijze de volgende stappen omvat: A. het verschaffen van een levende cel, die een 5 antigeen afscheidt, dat in staat is in het dierlijk lichaam een immune respons te induceren; B. het incapsuleren van de cel in een membraan met poriën en het teweegbrengen van een intracapsulair volume binnen de cel;

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de cel een hybridomacel is.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, gekenmerkt door extra stappen van het voorzien van extra voedingsstoffen en het waarborgen, dat de cel mitosis ondergaat voor het produceren van een veelheid van de cellen.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het ken- 25. e r k, dat de toevoer van voedingsstoffen plaatsvindt voorafgaande aan trap B, terwijl de meerderheid van de cellen wordt geïncapsuleerd in trap B.

5. Werkwijze volgens conclusie 3, met het ken merk, dat de voedselaanvoer plaatsvindt na trap B, waar- 30 bij een meerderheid van de cellen wordt geproduceerd binnen het intracapsulaire volume.

6. Werkwijze volgens conclusie 3, met het ken merk, dat de voedselaanvoer plaatsvindt na trap D.

7. Werkwijze volgens conclusie 2, gekenmerkt 35 door de volgende stappen: F. verwijdering van een lymfocyt,. die een anti-lichaam complementair met het genoemde antigeen produceert, uit het dierlijk lichaam; 840 33 5 2 - 23 - G. samensmelten van de lymfocyten met een onsterfelijke cellijn onder vorming van een hybridoma, die het anti-lichaam produceert; en H. kweken van de hybridoma.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, met het ken merk, dat de onsterfelijke cellijn een myelomacellijn is.

9. Werkwijze volgens conclusie 1, gekenmerkt door een extra stap van winnen van een antilichaam complementair met dit antilichaam uit het circulatiesysteem van het 10 dierlijk lichaam.

10. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken merk, dat het antigeen een molecuulgewic’nt heeft groter dan ca. 100.000 daltons.

10 C. het beheersen van de dimensies van de poriën ten einde de doorgang van het antigeen te waarborgen, doch de doorgang van de cel te beletten; D. implanteren van de ingecapsuleerde cel in het dierlijk lichaam; en

11. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken- 15. e r k, dat de cel bovendien een IgM afscheidt en waarbij de dimensies van de poriën zodanig worden beheerst, dat IgM in het intracapsulaire volume in hoofdzaak wordt tegengehouden.

12. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken- 20. e r k, dat de cel een genetisch gemodificeerde cel is.

13. Werkwijze volgens conclusie 1, gekenmerkt door de volgende trappen: F. verwijdering van een lymfocyt, die een antilichaam complementair met het antigeen produceert, uit het 25 dierlijk lichaam? G. samensmelten van lymfocyten met een onsterfelijke cellijn onder vorming van een hybridoma, die het antilichaam produceert ? en H. kweken van de hybridoma.

14. Werkwijze volgens conclusie 13, met het ken merk, dat de onsterfelijke cellijn een myelomacellijn is.

15. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken merk, dat de cel een prokaryotische cel is.

15 E. het doorlaten van het afgescheiden antigeen door het membraan in het dierlijk lichaam, teneinde een immune respons te induceren.

16. Werkwijze volgens conclusie 15, met het ken-35 m e r k, dat de prokaryotische cel een pyrogeen met een mole- cuulgewicht groter dan ca. 70.000 daltons afscheidt, het antigeen een molecuulgewicht heeft van minder dan 70.000 dal-tons, terwijl tijdens trap C de dimensies van de poriën zodanig worden beheerst, dat tenminste een gedeelte van het 40 pyrogeen in het intracapsulaire volume wordt tegengehouden. g40 33 5 2 * *" ~ - 24 -

17. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de cel een eukaryotische cel is.

18. Werkwijze voor het produceren van monoklonaal anti-lichaam complementair met een antigeen, afgescheiden door een 5 cel, welke werkwijze de volgende stappen omvat: A. incapsuleren van de cel in een membraan omvattende een intracapsulair volume, waarin de cel is gesuspendeerd, het membraan omvat poriën met dimensies voldoende voor het doorlaten van het antigeen, doch voor het tegenhouden van de 10 cel; B. implanteren van de ingecapsuleerde cel in een dierlijk lichaam? C. doorlaten van afgescheiden antigeen door het membraan in het dierlijk lichaam voor het induceren van een 15 lymfocyt teneinde antilichaam te produceren complementair met het afgescheiden antigeen; Do verwijderen van de lymfocyt uit het dierlijk lichaam; E. samensmelten van de lymfocyt met een onsterfe-20 lijke cellijn onder vorming van een hybridoma, die het antilichaam produceert; en F. winnen van het door hybridoma geproduceerde mono-klonale antilichaam.

19. Werkwijze volgens conclusie 18, met het ken-25 me r k, dat de onsterfelijke cel een myeloma is.

20. Werkwijze volgens conclusie 18, gekenmerkt door de extra trap van toevoer van voedingsstoffen aan de cel en het waarborgen, dat de cel mitosis ondergaat voor het produceren van een veelheid van deze cellen.

21. Werkwijze volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat de voedseltoevoer plaatsvindt voor stap A, ter wijl de meerderheid van de cellen wordt ingecapsuleerd in stap A.

22. Werkwijze volgens conclusie 20, met het ken- 35 me r k, dat de voedselaanvoer plaatsvindt na stap B, waarbij een meerderheid van de cellen wordt geproduceerd in het intracapsulaire volume.

23. Werkwijze volgens conclusie 18, met het ken merk, dat de ingecapsuleerde cel subcutaan wordt geïmplan- 40 teerd door inspuiting. : >0 33 5 2 - 25 -

24. Werkwijze volgens conclusie 18, met het ken merk, dat de cel een genetisch gemodificeerde cel is.

25. Werkwijze volgens conclusie 18, met het ken merk, dat de cel een hybridomacel is.

26. Werkwijze volgens conclusie 18, met het ken merk, dat de cel een eukaryotische cel is.

27. Werkwijze volgens conclusie 18, met het ken merk, dat de cel een prokaryotische cel is.

28. Werkwijze volgens conclusie 18, met het k e n- 10 me r k, dat het antigeen een molecuulgewicht heeft groter dan ca. 100.000 daltons.

29. Werkwijze volgens conclusie 18, met het ken merk, dat de cel een glycolipide, glycoprotelne, lipopro-teïne, polysaccharide of proteïne afscheidt met een molecuul- 15 gewicht groter dan ca. 400.000 daltons, terwijl het antigeen een molecuulgewicht heeft van minder dan 400.000 daltons, welke werkwijze voorts de extra stap van beheersing van de dimensies van de poriën van het membraan tijdens stap A heeft, zodanig, dat ten minste een gedeelte van de glycolipide, 20 glycoprotelne, lipoproteïne, polysaccharide of proteïne in het intracapsulaire volume wordt tegengehouden.

30. Werkwijze volgens conclusie 18, met het kenmerk, dat de cel een pyrogeen afscheidt met een molecuulgewicht groter dan ca. 70.000 daltons, terwijl het antigeen 25 een molecuulgewicht heeft van minder dan ca. 70.000 daltons, waarbij de werkwijze een extra stap omvat te weten het beheersen van de dimensies van de poriën van het membraan tijdens de stap Δ, zodanig, dat ten minste een gedeelte van het pyrogeen binnen het intracapsulaire volume wordt tegen-30 gehouden.

31. Werkwijze volgens conclusie 18, met het kenmerk, dat het membraan poriën met zodanige dimensies omvat, dat het antigeen wordt doorgelaten, doch ten minste een gedeelte van hoogmoleculaire stoffen, die door de cel worden 35 afgescheiden, wordt tegengehouden. 8403352