JPS6041618A - モノクロナル抗体製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ズ紅 抗体は一般に２価であり（多価の場合もある）、この２
価性によって１１１１　１１包表ｉｎｉ　”、の１′）
１体の付イ一、強度か高められる。しかしながら、抗体
の２　（ＩＴｌｉ（ｕは標的細胞の抗原性変異（　ａｎ
ｔ　ｉｇｃｎｉｃ　ｍｏ市山已ｉｏｎ）をしはしは誘発
させるので、細胞−１ノ℃体（１１斤作川用関係する細
胞毒性病原体（（γｉｏｔｏｘ　ｉｃ　ａｇｅｎｔ　ｓ
）、効果器細胞および補体の発生を細ｌ泡か回避できる
手段か用いられる。このような変異を（（１月１−する
−１段として、伝統的な手法により、１個の１・、ｌｌ
）フラグメントを除去し一Ｃｌ価にした抗体か利用され
でいる。

本発明名は全＜′．ｆｉ′．なったアプローチによって
、免疫クロプリンを開裂させてその生成物を分２）１［
することを必要とせずに新規な］価抗体製剤を開発した
。この新しいタイプの抗体製剤は／１イブリ１−−マテ
クノロジーの適用によって入手可能で、事実上、このテ
クノロジーによって生産されるモノクロナル抗体に限定
され、これによって１側坑体を得るのに特に便利なルー
トか得られる。

本発明によれは、２つの軽鎖のうちの１つのみか細胞表
面抗原と結合するＩｇＧ抗体分子を含有し、該抗体分子
の割合を、該抗原と結合する２つの軽鎖を有するＩｇＧ
抗体分子に対して増加させる、細胞表面抗原に対して単
結合活性を有するモノクロナル抗体製剤（＋ｎｏｎｏｃ
ｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｅｐ、ａｒａｔｉｏ
ｎ　）か提供される。

本明細毘では、細胞表面抗原と結合する軽鎖を１つ有す
るこのような抗体を「１側坑体」とよひ、この種の軽鎖
を２つ有する抗体は「２側坑体」とよぷ。単結合活性を
有する本発明による「１側坑体」は、ヨーロッパ特許出
願第００６８７６３号明細書に記載されている双結合活
性を有する抗体とは全く異なるものである。ここで取」
二けている２側坑体か「ホモ２側坑体」であるのに対し
て後者は「ヘテロ２側坑体」である。

大抵の場合は、細胞表面抗原に対してｑ）異的な同一の
重鎮の類但対か１価１ｇＧ抗体分子およびホモ２価１ｇ
Ｇ抗体分子のいずれの場合も存在する。しかしなから、
後者のタイプの分子は抗原に対して特異的な２つの軽鎖
を有するか、前者のタイプの分子は通常、抗原に対して
特異的な第１軽鎖および抗原に対して非特異的な第２軽
鎖を有する。特異的な重鎖と特異的な軽鎖との組合せに
よって、細胞表面抗原に対して有効な結合サイト（ｓｉ
Ｅｃ　）か形成されるか、特異的な重鎖との組合せによ
っては不活性なサイトか形成される。両方の軽鎖を問題
となる細胞表面抗原に対して特異的にし、重９ｒ４の一
方のみを該抗原に対して特異的にすることによって１個
の活性結合サイトのみを形成させることも可能であるか
、このような１側坑体含有混合物は一般に分別か容易で
はなく、従ってこのような抗体は余り重要ではない。

１割合を増加させる」という表現は、２側坑体に対する
１側坑体の割合を、抗体か誘導されるハイブリドーマに
よって最初に生産された抗体混合物中の該割合に比へて
増加さぜることを意味する。１側坑体を分別して得るた
めのモノクロナル抗体混合物を生産するには、２つの同
一な特異的な重鎖および１つの特異的軽鎖と１つの非特
異的な軽鎖を発現するハイブリドーマを使用するのが好
ましい。このようなハイブリドーマによって生産された
抗体中の１側坑体：２価抗体の最初の割合は個々のハイ
ブリトーマに対して極めて広範囲に変化させてもよいか
、最も普通の割合は一般に約２：１である。しかしなが
ら、このようなハイブリドーマから得られる平均的なモ
ノクロナル抗体混合物は、アグレゲートは別として、１
側坑体約５０％、２つの非特異的軽鎖を有する抗体２５
９６および２つの特異的軽鎖を有する抗体２５％を含有
する。１側坑体か多い場合ても、また２側坑体が多い場
合でも、これらの値からある程度ずれるか、ハイブリド
ーマによって生産される２側坑体に対する１側坑体の割
合は１ｏ、１のような高い値にはならない古考えられて
いる、この値は１側坑体に対しては前述の値２：１の５
倍に相当する。

従って本発明には、細胞表面抗原に両方の軽鎖か結合す
るＩｇＧを含む抗体に対する、２つの軽鎖のうちの１つ
のみか該抗原と結合するＩｇＧを含む抗体の割合か１０
：１もしくはそれ以上てあ−る前記の抗体製剤か含まれ
る。

ある特定のバイブリド′−７によって得られる１側坑体
：２価抗体の比の５倍増加は１０：１以下、例えは５：
１のこともあり、この値は】側坑体の普通の最初の割合
よりも低い。しかしながら、本発明の利点を十分に表現
するためには、１０：１以上の割合を利用するのが好ま
しいことか実験によって判明した。好ましくは、この割
合は２５：１．５０：１もしくは特に１００：１あるい
はそれ以上であり（２：１の比に対して１２５倍増加、
２５倍増加もしくは５０倍に相当する）、この増加効果
はさらに１側坑体の割合を５００：］もしくは１０００
：１あるいはそれ以」−に高めることもてきる（２：１
の比に対して２５０倍もしくは５００倍の増加に相当す
る）。

従って本発明には、２つの軽鎖のうちの１つのみか細胞
表面抗原と結合するＩｇＧを含むモノクロナル抗体およ
び両方の軽鎖か該抗原と結合するＩｇＧ　を含む別のモ
ノクロナル抗体とを１０：１もしくはそれ以上、例えは
１００：１もしくはそれ以上、例えは１０００：ｌの割
合て含有する、該抗原に対して単結合活性を有するモノ
クロナル抗体が含まれる。特に、曲者が後者を実質的に
含有しないモノクロナル抗体か好ましい。

１側坑体の割合か増加したモノクロナル抗体製剤の調製
は、１側坑体の第１軽鎖と第２軽鎖との間に血清学的な
差があるときはかなり容易になる。

この差は種々のタイプのいずれてあってもよいか、粕に
アロタイプ、イディオタイプもしくは棟（ｓｐｃｃｉｃ
ｓ　）　の差か好ましい。従って本発明の好ましい態様
には、細胞表面抗原に対１−で特異的な２つの同一の重
鎖、該抗原に対して特異的な第１軽鎖および第１軽鎖と
は血清学的に異なって該抗原に対して非特異的な第２軽
鎖を有するＩｇＧ抗体分子を含有し、該抗体分子の割合
を、該抗原に対して特異的な２つの軽鎖および２つの重
鎖を有するＩｇＧ抗体分子に対して増加させた、該抗原
に対して活性を有するモノクロナル抗体製剤か含まれる
。

本発明による１側坑体ソースとなるハイブリトーマは種
々の方法によって胃でもよい。特定のミエロマ　（ｍｙ
ｃｌｏｍａｓ　）はミニｏ　マツ−７，、％ニミエロマ
か等かれる個体の軽鎖特性を発現し、一般的に（Ａこの
ようなミエロマから得られるハイブリドーマは問題の抗
原に対して特異的な軽鎖はかりてなく、ミエロマの軽鎖
特性をも発現する。軽鎖自体は発現しない他のミニｏマ
はそれから導かれるハイブリドーマに、ミエロマの軽鎖
動性発現能を刊行する。ハイブリドーマへのこのような
軽鎖刊行特性は一般的には不都合と考えらＡ１ている。

従って、英国特許出願第８１２０６２１号明細Ｐ１（Ｇ
１３２０７９３１３Ａ公報）には、ミエロマＹＢ　２／
　３．　Ｏ，Ａｇ　、　２０　は、それか誘導されたミ
工ロマの改良として記載されており、英国特許第２０３
９９４８号のミエロマＹ　３−Ａｇ　］、、　２．　３
は元のミエロマとは異なって、それから誘導されるハイ
ブリドーマにミエロマの旺鎖特性を付与しない。本発明
は、ハイブリドーマに軽鎖を付与するＹ３−Ａｇ　１．
２．３のようなミエロマの能力が、１側坑体のソースと
なるハイブリドーマの生産との関係では有利であるとい
う事実を利用することに部分的には基つく。Ｙ３−Ａｇ
　１．２．３　ミエロマは、ルー・ラット（Ｌｏｕ　ｒ
ａｔ　）　種族のアロタイプの特徴であるカッパー軽鎖
を発現する（Ｙ３−Ａｇ　１．２．３は最初はこの種族
のラットから誘導されたものである）。このミエロマは
、該英国特許および他の特許（例えばヨーロッパ特許第
ｏ。

１４５１９号）との関係で、ｌ−０７８番としてパリの
パスツール研究所にＣＮ　ＣＭと共に寄託されている。

本発明に使用していてもよいミエロマの他の特別な例は
マウスのＰ３−Ｘ６３−Ａｇ　８およびＮＳ１／ｌ−Ａ
ｇ　４−１　ミエロマであり、このようなミエロマはそ
れら自体では軽鎖を発現しないか、ハイブリドーマを生
産する融合に際して、ミエロマ誘導体のマウス軽鎖特性
を発現する能力をハイブリドーマに付与する。これらの
ミエロマは特に、Ｐ３−　Ｘ　６３−Ａｇ８Ｕ　（、Ｃ
ＲＬ　１５９７番）およびＰ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−
１（ＮＳ−１）（１”ｌ　Ｂ　Ｉ　Ｂ番）として寄託さ
れているアメリカン・カルチャー・コレクション（ＡＴ
ＣＣ）（米［１ｆｌ、メリーランド）から入手すること
ができる。

本発明によるモノクロナル抗体製剤の好ましいフオーム
は、軽鎖を発現するミエロマを、問題となる細胞表面抗
原に対して感作された免疫細胞と融合させてハイブリド
ーマを生産させることによって得られる。このようなハ
イブリドーマは一般に、免疫細胞から誘導される１つの
特異的な軽鎖およびミエロマから誘導される複数の非特
異的な軽鎖と共に、免疫細胞から誘導される２つの同一
な重鎖を発現する。ミエロマはいずれの動物種から誘導
してもよい（ここで使用する動物という用語は広義に用
いるもので、ヒトを含む哺乳類および鳥類も含む）。し
かしながら、最も一般的には適当なネイチャーの一方か
得られるマウスもしくはメラットのミエロマまたはヒト
のミエロマが好ましい。ミエロマ細胞と免疫細胞（例え
は肝臓細胞）との融合によるミエロマからのバイブリド
ーマ生産技術は、文献に十分詳細に報告されており、例
えは前記のＹ３−Ａｇ　１．２．３に関する英国特許第
２０３９９４８号明細潜に記載されている。しかしなか
ら、次の２点を強調したい。第一に、ハイカシドーマに
よって発現されたモノクロナル抗体中に存在する２つの
異なったタイプの軽鎖が血清学的に異なった好ましい場
合には、免疫細胞は、ミエロマによって発現された軽鎖
が最初に誘導された個体とは免疫学的に異った個体から
誘導されるべきである。２つの個体が異なった種または
同し種の免疫学的に異なったタイプのものであってもよ
い。従って、ラットのル一種族（１−ｏｕ　Ｉ＋ｔｒａ
ｉｎ）から誘導される前記の”’３−Ａｇ　１．２．３
　ミエロマは例えはマウスまたはラットのＡＱもしくは
Ｉ）Ａ種族のような免疫学的に異なったタイプのラット
からの免疫細胞と融合させてもよい。第２に、本発明は
、例えはイムノグログリンの１ｇＭタイプの多価性を考
慮して、ＩｇＧ　タイプのモノクロナル抗体を必要とす
る。従って、適当なハイブリドーマ用の融合生産物を分
別する場合には、これらのハイブリドーマかＩｇＧ　モ
ノクロナル抗体を確実に生産するようにする必要がある
。

しかしなから、１托瘍特性とハイブリト−マにおける所
望の特異性との類似のコンビ不一ンヨンをおこなうため
には、種々の別のミエロマ／免疫細胞融合法を使用する
ことも可能である。第一に、軽鎖生産性ミエロマを細胞
表面抗原に対して特異的な免疫細胞と融合させる代りに
、ミエロマから誘導される軽鎖を発現するハイブリドー
マを免疫細胞と融合させ、この融合生産物から、抗原に
対して特異的な軽鎖および非特異的なこの軽鎖の両方を
発現するハイブリトーマを分別することか可能である。

あるいは、適当な特異性を有するか、ミエロマから誘導
される軽鎖を発現しないハイブリトーマと融合させ、特
異的な軽鎖とこの非特異的な軽鎖の両方を発現するハイ
ブリト−マを融合生産物から分別することも可能である
。

さらに、本発明によるモノクロナル抗体中に存在する非
特異的軽鎖はミエロマがら直接もしくはハイブリドーマ
を経て誘導するのが最も便利であるか、このようにしな
ければならないことはない。

従って、特異的な軽鎖のみを発現するハイブリドーマを
非特異的軽鎖ソースとしてのハイブリドーマもしくはミ
エロマとの別の融合法として、このハイブリドーマを他
の特ｐ的軽鎖ソース、例えは特異的に感作される必要の
ない肝臓細胞もしくは別の免疫細り包もしくは特異的に
感作される必要がすくてニブスティン−バーウィルス（
Ｅｐｓｔｃｉｎ−Ｉ％ａｒｒ　ｖｉｒｕｓ　）ニよって
形質転換されたリンパ球と融合さぜることもｉＴＪ能て
あり、この方法は、適当なヒトのミエロマの入手か制限
される観点が４すると、ヒ１−の細胞に関しては特にＴ
ｒＩ要である。

それはと重要ではないが、ニブスティン−バーウィルス
によって形質転換されたリンパ球を利用する別の方法は
特異的に感作されたリンパ球を特異的に感作されていな
い肝臓細胞もしくは他の免疫細胞あるいはミエロマもＬ
　＜はハイブリドーマと融合させて、融合の非リンパ球
パートナ−から非特異的軽鎖を誘導するものである。ミ
エロマと免疫細胞を融合するこのような代替法および当
業者に明らかな他の可能な方法はすべて当該分野の猟套
な方法によっておこなってもよい。

選択されたハイブリトーマを使用してモノクロナル抗体
を生体外もしくは生体内で調製する方法も文献、例えは
英国特許第２０３９９４８号明細書等に十分開示されて
いる。このようにして得られるモノクロナル抗体は１側
坑体を含有するか、２つの特異的な軽鎖を有する２側坑
体およｏ２つの非特異的な軽鎖を有する不活性抗体との
混合物である。本発明によるモノクロナル抗体を生産す
るためには、該混合物中に存在する２側坑体の少なくと
も１部を・除去する必要かある。不活性抗体は所望によ
り一部もしくは実質」−全部除去してもよいが、これは
随怠である。何故ならば、これらの抗体は不活性のため
、２側坑体の割合か小さくなるならば、１側坑体との混
合物中に保持させることができるからである。

］、　ｆｉｌｉｉ抗体から２側坑体を分離するには種々
の方／、Ｉ、かある。１つの便利な方法は、抗体、特に
−ｅツクｊｉｌプル抗体を、血／ｌ！ｉ学的に第１軽鎖
とは異なった１Ｏ−ｊｊ、Ｊ、ｌ：的な第２軽鎖に対し
てアフィニティーをイ〕゛する（ｊｌ」、イテイオクイ
ブもしくはアロタイプと（ｊｌ川するアフィニティー・
り「Ｊマドクラフィーを使用するものである。このよう
な第２軽鎖（」もちろん１価および不活性な抗体中にも
存在するか、２側位体中には（Ｙすしない。７′フイニ
−ティーは排他的なものかられずかに選択的なものまで
変化させてもよく、このような抗体か得られるならば後
右も１〆［谷されるか、１）１１者か明らかに望ましｌ
Ｊｌ。使用し７ても」、い抗体としては、ｋ　ｌ　ａ　
およびｋ　ｌ　１）軽鎖ラットアロタイプに対する抗体
、非特異的軽鎖かマウス、例えはマウスのミニｔｌマか
ら誘導されて他の軽鎖およ０千鎖かラン［・、例えはラ
ットの肝臓細胞から誘導された抗マウスＩｇＧ抗体、あ
るいは反対の場合の抗うットＩｇｃ、抗体が例示される
。抗マウス　ＩｇＧ抗体の代りに、以下に述へる蛋白質
入を使用してもよい。ハイブリドーマから生産されるモ
ノクロナル抗体混合物をアフィニティー物質を用いて処
理するに際しては、二）１特異的軽鎖を有する１価およ
び不活性／、ｉ抗体を該アフィニティー物質に対して、
このような軽鎖を（１さないので未結合のままで残存す
るか、−１−９すかに弱く結合する２側坑体よりもより
ツへ）＜結合させる。

抗アロクイブ、抗イデイオタイプもしく（、を杭柱抗体
（；ｔｎｔ　ｉ　−５ｐｃｃ：ｉｃｓ　旧］ｔｉｂｏｄ
））は使用］）１１に、抗ラットＩｇＧ　カラム雪を用
いるアフイニｉイークＵ７トクラフイーによって適当に
精製するのか便利である。幾分重要な別の方法は、ｊ時
定のタイプの蛋白質に対して反応性を有する誘導サボ−
１−物質（ｃｌｃｒｉＶａｔｉｓｃｄ　５ｕｐｐｏｒｔ
　ｍａｔｅｒｉａｌ　）　の別のフオームを使用するこ
とを含む。蛋白質Ａ（Ｓ、；＋ｕｒｃｕｓ　）を二官能
性カップラーを用いてセファ「Ｊ−：ｙ、　（５ｃｐｈ
ａｒｏｓｃ　）のような→Ｊ−ボート物’ＩＩ　ニ結合
さぜ、マウスＩｇＧか強く結合する物質トシ、これをマ
ウスから誘導された抗体の精１（１における抗マウスＩ
ｇＧ　の代替物として使用してもよい。

本発明によるモノクロナル抗体製剤を調製するためのア
フィニティー物質は、免疫吸名剤のベースとして適当な
種々のフオームのポリマー物質に結合させた杭柱抗体、
抗イデイオタイプもしくは抗アロタイプを含んでいＣも
よい。このような物で■は蛋白質のゲルθ５過クロマト
グラフィーに関する文献に記載されており、テキストラ
ン、寒天も（７くはアカ「Ｊ−スをベースとした炭水化
物およびポリｊ′クリルアミドをベースとした月別か含
まれる（人きさおよび形ｖ！！ｔによる所望の分子−に
ＩＦ除艮をイ・」与するために架橋が利用される）。こ
のような物質としてはアカ［ツースをベースとしたセフ
ァロース、テキストランをベースとしたセファテックス
（Ｓ　Ｃ！　１）ＩＩ　；ｌ　ｄ　ｃ　ｘ　）、アクリ
ルアミド誘導体で架橋したアリルテキストランをヘ−ス
としたセファクリル（５ｃｐｂ；ｔｃｒｙｌ　）　Ａ：
ｑの市販品か例示される。

抗体は文献に記載されている神々の方法のいずれかによ
って→ノーボート物質に結合させ、これによって蛋白質
もしくは他の物質をアフィニティークロマトクラフィー
に使用する不溶性固体相→ノーポートに結合させてもよ
い。この化学反応は共有結合をもたらすか、変性しない
ような方法−ＣおこなＪ〕れるので、結合される不安定
な物質の破壊は最小限となる。適当な結合剤には１，４
−ビス（２，３−エボキシプロポギソ）−ブタン型の結
合剤および牛５に臭化シアンか含まれる。これらの結合
剤は前記の炭水化物ｊｌ料のようなｕ＋誘導サす−トイ
４料を使用する場合に適している。あるいは、誘導サポ
ート月別を他の結合剤とイ〕１用１．でもよく、または
反応性官能基を臼゛する誘棉ザポートイ１制を結合剤な
１−で使用してもよい。このタイプの特に便利なアプロ
ーチはファーマシア（Ｐｈ　ａ　ｒｍａ　ｃ　ｉ　ａ　
）社から市販されている臭化シアンで活性化されたセフ
ァ「」−スの使用を含むものである。

アフィニティー分別技術の詳細は特に非特異的軽鎖に対
するアフィニティー物質の親和性肪に応して変化するか
、一般的なカイトランを説明する。

アフィニティー物質を分別されるへき抗細；泡表面抗涼
とモノクロナル抗体混合物に、所望のフラクションを結
合させるのに適した条ｆｌ　７’、例えば連続的に攪拌
しながら４℃で２時間培程する条件下で接触させる。多
くの場合、アフィニティー物質とモノクロナル抗体との
混合物を濃度が２倍のフォスフェート緩街塩水（１″１
３Ｓ）中に入れて非特異的な結合および抗体のａ集を減
少させるのか適当である。このような攪拌は、アフィニ
ティー物質をカラムに導入する前におこなうのがより便
利である。モノクロナル抗体混合物を吸着したアフィニ
ティー物質カラムを溶剛するには、最初は低濃度の溶離
剤を使用して、該物質に結合した非特異的な軽鎖を含ま
ないモノクロナル抗体を除去するのか好ましい（これは
、このアフィニティー物質の活性成分を含む抗体かこの
軽鎖に対してわずかな選択的アフィニティー（ｐｒｅ（
ｅｒｃ旧ｉａｌ；ｔ　ｆ　ｒ　ｉ旧しγ）を示して、排
除的アフィニティー（ｅλｃｌｕ箇ｖｅ　；１ｆｆｉ旧
（γ）を示さない場合は特にそうである）。次いて１価
および不活性モノクロナル抗体の混合物を所定の濃度の
溶離剤を使用してカラムから除去する。従って、例えば
第１溶離を０．５　Ｍ　ＮａＣ１！を含有した０、　１
　Ｍアセテート緩衝液（ＰＩ−１４，０）を用いておこ
ない、第２溶離を１０Ｍグリシン／　ＩＩｃＩ！（ｐＨ
２，５）を用いておこなうのがしはしは適している。

従って１つの好ましい観点においては、本発明には、細
胞表面抗原に対して特異的な第１軽鎖および血清学的に
第１軽鎖とは異なって該抗原に対して非特異的な第２軽
鎖を有するｆＪ　１タイプのＩｇＧ　抗体分子および該
第１軽鎖を２つ有する第２クイブのＩｇＧ抗体分子を含
有しかつ該抗原に対して活性なモノクロナル抗体混合物
を、アロタイプ、イテイオタイプもしくは血清学的に該
第１軽鎖とは異なった該第２軽鎖に特有の種に対する抗
体を保有するアフィニティーカラムと接触させ、第２タ
イプの１ｇ０分子から第１タイプの１ｇ０分子を部分的
もしくは完全に分Ｍｌｔすることを含む、該モノクロナ
ル抗体混合物の分別方法が含まれる。

しかしながら、このような血４１１学的相違に基づくア
フィニティークロマトグラフィー法とは別の方法によっ
てモノクロナル抗体混合物中のフラクションの分離をお
こなってもよい。これらの代替法にはイオン交換クロマ
トグラフィー法および軽鎖の等電点に力（ついて分離を
おこなうクロマトフォカッソング（ｃｈｒｏｍａｔｏｆ
ｏｃｕｓｓｉｎｇ　）法等が含まれ、これらの方法は、
異なった軽鎖間の適当な物理的差異によって、それらの
軽鎖の一方もしくは両方か異なったＩｇＧを分離するの
に使用できる。

このような方法は、２側坑体はがりてなく、不活性抗体
を実質上官まないか、あるいはこれらの抗体の割合か減
少した１価モノクロナル抗体へのルートを提供する。

］二連のようにして調製される１価モノクロナル抗体は
アグレゲー）　（ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ　）を含んでい
てもよく、アグレゲートは貯蔵中に形成されてもよい。

抗体を使用する前にこのようなアクレゲートを、非アク
レゲート抗体の共沈に導く遠心分離もしくｉｌｌ別の方
法によって実質」−除去するのが好ましい。

本発明は、特に種々の診断および治療（予防も含む）へ
の適用との関係において、表面抗原の異なったフオーム
に対して特異的なモノクロナル抗体に対して広範囲に適
用できるものであるか、特に例えば受胎調節や移植免疫
の領域およびネオプラスチック疾患の治療等の粕定の場
合に特に有用である。多くの場合、ヒトの細胞表面抗原
に対するモノクロナル抗体は特に重要であるか、ヒト以
外の哺乳類の細胞表面抗原に対する受胎調節モノクロナ
ル抗体のような悄定の領域においても重要である。

移植免疫の領域にはリンパ球、通常はヒトのリンパ球、
特にｆ　−リンパ球に対して活性な１価モノクロナル抗
体の使用が含まれる。特に有用な抗体はヒトの補体を固
定する抗体、例えはコツボルド（Ｃｏｂｂｏｌｄ　）　
らの論文（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＣｅｌｌｕｌａｒ　Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ　、増刊７Ａ、１９８３．７２）に記載さ
れているハイブリトーマによって生産される抗体である
。このような抗体は種々の領域、例えはドナー／ホスト
相互作用を減少さぜるためのＩｆ髄ツクラフトらのリン
パ球の除去および類似の目的のためのホスト中の血液リ
ンパ球の減少に関するクラフト処置において有用である
。

（−の領域にお＋ｊる別の用途には、白血病リンパ球を
除去するために患名自月の旧制を処置して患者に移１１
？Ｉするこ吉た含まれる。

しかしながら一般に、ネＡプラスチック疾患の処置には
、オオプラスチック細］泡表ｉｆ＋ｉに１１１′異的に
結合４−る抗ハ１！に苅して活性な１価モノクロナル抗
体の使用か含まれ、抗原に結合１．た１１ΦｊＬ７冒ｒ
対する］１１１々の抗体か、例えは米国特許第４．１．
７２，１．２４Ｖ９明細１１目こ記・１戊されている。

１価モノク［＋　ｆル抗体は・とれ自体もしく（」そね
に結合する細ｊ］εｑ、１ユ性剤（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ
　ａｇｅｎ＋　）とイ〕１用してイオプラスチック細胞
に対する標的にし一〇もよい。

１＝述の本発明の適用はすへて特異的な細１泡の破壊の
ための抗体の使用に依存し；ホモ２価ではなくて１価の
抗体の使用によって抗原性モシュレー／ＥＪンを回避し
て効果器♀Ｉ１１胞および特に補体の毒性作用を完全に
利用する。本発明によるモノクロナル抗体の、毒性効果
に依イ了しない別の用途はわＦ々の血液試験法である。

免疫螢光検査による細胞分フ頂技術においては、誤った
結果に導く主要な原因となる（＝１随的な凝■−作用を
伴うことなく、＋＋：＋　１１、に対してモノクロナル
抗体を＋２．レベルて＆１１合させるのか望ましし）。

このようなノブ法に１価モノク「Ｊプル抗体を使用する
ことによって細胞間のクロス結合を減らずことかできる
。本発明に使用ずろ抗体の特異性は赤血球、リンパ球お
よび実施例３の表に訂述した他の細１］；バを含も神々
の血球１−の神々の表面抗原に対するものとすることか
できる〔表中、１）　Ｎ’Ｉ　Ｎは多形数球細１泡核好
中球（＋）（１１＞“ｍ　ｏ　ｒ　ｐ　ＩＩ　０ｎｕｃ
ｌ　ｃａｒ　ｎｃｔ＋ｔ　ｒｏｐｈ　ｉ　Ｉ　ｓ　）　
ノ略５菖テアル］。’ｌ’ｌ’ｌ　会の細胞区分　（ｃ
ｅｌｌ　ｓｏｒ（ｉｎｇ　）　法と共に１も（−くはそ
れ以上の１側坑体を使用−４にと（ζ゛よって、異なっ
たタイプへの細胞区分を著しく改」（Ｊ〕−ることかて
きる。異った血球上に異なったレベルで７１する細胞表
１ｏ抗原に対するｊ価ｔｊ’ｉ：体を使用Ｊるのか一般
的なアプローチである。このような抗体の１例は実施例
１に記載のバイブＩＪ　ｌ・−＝　）’　１１１ｚ！３
４３６　から得られるもので、該抗体は多くの皿球タイ
プ上に生ずる熱安定１．′１表旧位原に対して特異的で
ある。

本発明による１側坑体の応用は多種多様であり、このよ
うな抗体は個々の用途に応し、当該分野の常套の方法に
よって製剤化して使用に供することかできる。しかしな
がら通常は、このような抗体は生理学的に、ダ［容さイ
する希釈剤もしくはギヤリヤー、しはしはフォー−ｖ　
−（ｆｏｒｍｅｒ　）の存在下に例えは燐酸塩緩衝塩水
中で製剤化する。

本発明には、ｌｉｉ、Ｉ記のように定義されたモノクロ
ナル抗体の製剤を上述のようにして薬剤組成物もしくは
他の形態で使用する方法か含ま、れる。

本発明を以上の実施例によって説明する。７実施例１ ）′１い＋３４．３．６て表わされるハイブリ［・−７
４、ホＪ”　７グ（Ｉｌｏａｌｌｇ　）らの論文（１，
１ｌｏｏｄ　、１９８３．６１．５８０）に記載された
方法によって、ラットのミニ「１マラインＹ３−　Ａｇ
　］、、　２．３　およびＣ１３Ａ　／　Ｃａマウス骨
髄細胞で免疫化された！−）Ａラットの胛１臓細胞との
融合によって調製した（該論文では、よりｆｆ１）ｌｔ
ｔなＹｌりｌ１１１３４３かこのハイブリドーマのため
に使用されている）。マウスの多くの血球タイプの表１
１ｉｉ　ｊ−に異なったレベルてＴｊ（Ｉｇする熱安定
性抗原に対して特異的な’１’　Ｂ　Ｍ　３　＝１．３
６モノクロナル抗体（Ｉ　ｇＧ　２　Ｃイソタイプ）の
８合物を生産するために、バイブ１１１’　−？　Ｙ　
ｌ１１３４３６　細胞をポアンクらの方法に、′ｒ、っ
て培養しノこ。

細胞を除ブにした後、ＹＢｔ’＋１３４．、３．６セッ
ク１ノナル抗体混合物を含有した培養−１−バｔを、Ｎ
１５ｌ・＋１５２５遠心機を用いて］　０　、０００　
ｒ　、ｎ、ｍ、で３０分間遠心分離処理にイ、１し、分
子ｉ；ｎ　した生産物を２イ１＼覧度の燐酸塩緩衝塩水
（＋１　Ｂ　Ｓ　）に加え、こイ１をｈｌＲｃ　−ＯＸ
　１２　モノクロナル抗体を（イこ有したセファロース
ゲルに、充」１°ｎ　ｉ、、４潤ゲル１　ｍｌあたり約
５００ｔｔｇの割合て加えた（この抗体は）’　３−　
Ａ　ｇｌ　２３　ミエロマ誘導ｋｌａ　アロタイプ軽鎖
含イ１モノクロナル抗体と有効に結合するか、１）Δラ
ノ（・誘導ｋ　Ｉ　ｔ）　−７−＋Ｊタイプ軽鎖含イ１
モノク電】ナル抗体とは結合しない）。Ｙ　Ｂλ１　：
３４．　：３．６抗体とへｎ＜Ｃ−ｏｘ　１２−　セフ
ァロースゲル１１−の混菖物を一定の回転速度のもとて
４でて２時間培養した。

次いてケルを２倍濃度のＩ’　Ｂ　Ｓを用いて充分に洗
とｆ１シ、溶離用カラスカラムにかけた。

ゲルカラムをＱ、　５　Ｍ　ＮａＣｊ？含有（ｌ　ｌ　
Ｍアセテートａ衝液（ｐＨ４，０）を用いる溶離処理に
イ・］シ、ゲルに弱く結合した２つの特異的な軽鎖を含
有（７た抗体および弱く結合した凝集物を溶離させた。

次いてケルカラム１．□Ｍグリシン／　ｌＩｃ１（＋）
ｌ−１２，５）を用いる溶離処ｍ１に付してカラムから
、２つのミエロマ１誘Ｊ！’３軽鎖含有抗体分子および
１つのミエロマ誘導軽鎖と１つの特異的な軽鎖を含有し
た１、　１１１ｉ抗体分子との混合物を除去した（この
溶離処理によってカラムは再使用可能となる）。種々の
物質を含有するフラクションを、Ｌ　Ｋ　ＢＵ　ｖ　ｉ
　ｃｈｏ　ｒｄを用いる０　１）　２８０　のモニタリ
ンクによって捕集し、これを最初にｒＫ　ａ濃度の５倍
の濃度の１旧３Ｓに対して透析し、次いて好適濃度のＰ
　Ｂ　Ｓに対して透析した。透析物の蛋白質濃度を０１
）　２８０を介して測定し、神々の製剤を以下のように
して試験し、１何位体含有製剤を０１°６　Ｎ　ａ　Ｎ
　３　および０．５％ＢＳＡを含有した１１　Ｂ　Ｓ中
に保存するか、あるいは遠心分離によって濃縮して０１
９６へ；ｔ　Ｎ　３含有ＰＢＳ中で凍結保存するか、も
しくは直接使用に洪した。

カラムからの異なったフラクションについて、面相酵素
連関結合アッセイ（５ｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅｃｎｚｙｍ
ｃ　１ｉｎｋｅｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｓｓａｙ　；　
５ＰＥＬＢＡ）ｉこおいて、マウスの赤血球（ｃ　ｒ　
ｙ　ｔ　ｈ　ｒ　ｏ　ｃ　ｙ　ｔ　ｅ　ｓ　）　ｉ疑Ａ
Ｓおよびマウスの赤血球（ｒｃ（ｌ　ｂｌｏｏｄ　ｃｅ
ｌｌｓ　：Ｒ，ＢＣ）結合を同時に試験した。カラムに
結合しない物質〔分裂物質（ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ
　ｍａｔｃｒｉ’ａｌ）〕は典型的には全ＹＢＭ　３４
．３．６　モノクロナル抗体製剤に比へて凝集活性およ
び結合活性のいずれにおいても低下しており、このこと
は、この製剤の活性部分かゲルに吸収されたこきを示す
。

ｐｔｌ　４．０で溶ρｉ＋）された物質は典型的には強
い訂・集作用と結合作用を示し、２つの特異的な軽「ｊ
を含有する２側坑体とｌ疑集抗体を含有すると考えられ
、この物質は低アフィニティーで結合し、また、カラム
調製に用いた２倍濃度のｌ）　Ｂ　Ｓに比へて最初の溶
離剤の塩濃度が高くかっＩ）Ｈか低いために溶離される
。ｐＨ２，５で溶離された物質は典型的には予想された
１価１ｇＧ特性を示し、２側坑体の存在割合を凝集破壊
処理によって測定したところ１／１２８以下であった。

ＲＢ　Ｃの非常に弱い凝集かＳ　Ｐ　ｌｉ　Ｌ　Ｂ　Ａ
　試験において、飽和および高い結合性のプロシン（非
凝集）との製剤について認められた。この弱い凝集は、
Ｂｅｃｋ＋ｎａｎエアヒュージを用い、抗体力価（ａｎ
ｔｉｂｏｄｙ　ｔｉｔｒｃ　）　を変化させることなく
、１２０，０００　ｇで５分間遠ノし・分離処理に伺す
ことによって破壊された（１００．０００　ｇ　での遠
心分離で沈殿するモノクロナル抗体の場合は、残存凝集
塊を除去する別の方法を使用した）。

Ｍｌζｃ−ｏｘ１２−セファローズゲルの調製ＭＲＣ−
ＯＸ　１２　で表わされるハイブリドーマを、７７ト（
１１ｕｎｄ　）とフォーラ−（Ｆｏｗｌ　ｃｒ　）の論
文（Ｃｃｌｌ　Ｔ’１Ｓｓｕｃ　Ｋｉｎｅｔｉｃｓ　、
　１９８　］　、　１４゜４４５　）に記載の方法によ
り、ＮＳ／１−Ａｇ４−１ミエロマおよびＢａ１ｂｂマ
ウスのＩＩ！　ｎ蔵細胞との融合によって調製した。Ｍ
ＲＣ−ＯＸ　ｉ２モノクロナル抗体を生産するために、
ハイブリドーマＭ　＋ｔ　Ｃ−ｏｘ　１２細胞を、ハイ
ブリドーマＹ　Ｂ　Ｍ　３４．３゜６に関するホアング
らの方法と実質上回し方法によって培養した。

このようにして得られた細胞を含まない培ｉｆ澄を、Ｙ
３／Ａｇ１．２．３とラットの肝臓細胞との融合によっ
て生産されたｌ＼イブリ！・−マから得られた２２Δ−
およびｒ２Ｃ−生産性モノクロナル抗体および正常ラッ
ト’　Ｉ　ｇＧ　との混合物か臭化シアンと共に結合さ
れたセファロースカラムを用いるアフィニティー精製処
理に付した。Ｍ　ＲＣ−ＯＸ１２抗体は０．１Ｍグリシ
ン／　ＩＩ　ＣＥ　（ｐＨ２，５）を用いて溶離させ、
普通濃度のＰＨ５中へ透析した。透析生成物は限外濾過
によって２　”’ｊ　／　＋＋＋ｌ！まて濃縮し、Ｑ、
５ＭＮａＣｌ含有０，１Ｍ重炭酸塩緩衝液（１）１１８
．６）を用いて透ｆｆ１ｔた。この物質を、１３　Ｓ　
Ａキャリヤー　ｏ、　ｓ　ｍｙ　／、ｎｉ　ｔ　有臭化
シアン活性化セファロース（Ｐｈａｒｎｉａｃｉａ社の
活性化形態の市販品）に２”７／ｄで結合させた（最終
比：蛋白質１ｏｍｙ／ｇ乾ハ・（セフｒロース）。この
カンプリンクは大量生産Ｙ各に４１１チされでいるルー
トによっておこなった。

即ち、ＩＱ　３　Ｍ　１１（ニア！　を用いてケルをｊ
膨ａｉ’ｌ洗浄し、蛋白質をケルと共に室温下で回転混
合させなから］７：Ｘｊ：ｒ：させ、１Ｍエタノールア
ミン（ｐｉｌ　８．３　）とＪｌ、に−＝夜培養さぜ、
最後にｌ）　Ｈ８の緩衝液で６Ｌ浄後に１）１１４の緩
衝液で洗浄する操作を３回繰り返した。ＭＲＣ−ＯＸ　
１２　結合セファロースを０１９０　Ｎ　ａ　Ｎ　３　
および１ａ、；１３ＳＡを含有し７た曹通譜度のｌ）Ｉ
へＳと共に４゛Ｃで保育、し、使用ｔｉｉｉに、０２Ｎ
１クリ／ン／　ｔｌｃｊ！　（ｐｉｌ　２．５　）で洗
？’ｒｌ　Ｌ〜、次いて曹通ｊｂ’ｙｊ度のＩゝＩｔｓ
を用いてｂｌ、浄した。

実施例２ １−細胞抗原に対する１側坑体の調製 Ｙ’ｌ’ｌｌ　］　２．５．２２　て表ノー）されるハ
イフリト−マを、ハイフリトーマ）’　Ｉ（Ｉ’、＋　
３４．３．６　の調製に関する実施例１と類似の方法に
より、ラットのミエロマラインＹ３／Ａｇ　１．２３　
およびヒトの１−細胞によって免疫化したＩ）ノルラッ
トの胛１１０細胞との融合によってｌａｄ製した。１゛
３分子の決定子と反応性を有するヒトのＴ細胞と結合す
るが、１へｆａｌｌ胞とは結合しないＹＴＩＩ　ｌ　２
．５．２２　七ツク［Ｊナル抗体（Ｉｇに　２＋）　イ
ンタイブ）ｉｌｄ合物ヲｔ（−、）ｓ；するために、ハ
イブリト−マＹｌｌｌ　１２．５．２２細１抱を、７７
！ｌＶ１３４．６　ハイブリト−マの培ｊ）：ｌこ関す
る実施例１の方法とプ頂似の方法にょっ一ζ培促した。

細胞は５％ｖ／ｖ胎児子牛血ｉ’ｉ’ｆ　（１’ＣＳ　
）を用いて補充したＩ　Ｍ　Ｉ）　Ｍ中で生長融合させ
た。

”ｉ’　Ｂλ１３４．、３．６抗体に関する実施例］に
記・代の方法と同様の方法により、培養−に澄を、ｋＮ
支Ｃ−０Ｘ１２モノクロナル抗体保何セファロース１１
ルｊニーＣのアフィニティークロマトグラフィーによっ
て処理して、１価ＹＴＩ−１１，２，５，２２抗体が増
加したモノクロナル抗体製剤を得た。

実施例３ クリコフオリン−Ａに対する】側坑体の調Ｑ１４１ＹＴ
ｒｌ　８９．１．８で表わされるハイブリドーマを、ハ
イブリドーマＹ’ＲＭ　３４．３．６　の調製に関する
実施イタｌ］】の方法と類似の方法により、ラットのミ
エロマラインＹ３−Ａｇ　１．２．３およびＩ）Ａシソ
１〜の免疫胛ＩＡＩ＋細胞との融合によって調製した（
このパイブリドーマは、実施例２のハイブリトーマＹ’
ｌ’ｌｌ　１２．５．２２　をもたらす回し融合からも
得られる）。グリコフォリン７〜分子と結合しかつ自家
組織補体Ｃａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎ
ｔ　）古共にヒトの赤血球を溶解することができるＹＴ
ＩＩ８９１８　モノクロナル抗体（１ｇＧ２１ｊ　イン
タイブ）　ｌ］、ｉ１合物を生産するために、バイブリ
ド゛−マｙ’口１８９．　］、、　８　を、）７８Ｍ　
３４．３．６　ハイブリト−マの培養に関する実施例１
の方法と類似の方法によって培養した。

培谷Ｉ−澄を、ＹＢＭ　３４３．６　抗体に関する実施
例Ｊの方法と同様の方法により、ＭＲＣ−ＯＸ１２Ｘ１
２モノクロナル抗セフアロースウル−してのアフィニテ
ィークロマトグラフィーによって処理し、１価Ｙ−Ｉ’
ｌｌ　Ｆ３９．１．８　抗体の増加したモノクロナル抗
体ヌノ剤をｔ；Ｉた。これらの１側坑体は少なくとも補
体と共にヒトの赤血球を殺すのに有効であり、飽和結合
を増加させ、（弱い）ｄ集油性を失わせる。

実施例４ 実施例１に記載のようにして得られた１価）′Ｉい１３
４３６　モノクロナル抗体製剤を限外ｉＪ５過によツｃ
　２５０１１ｇ　／’＋ｎｌまて濃縮さぜ、次のイｌに
して、抗体製剤］−ｍｌあたり１００μｇの割合でビオ
チンサクシンイミトエステルと結合さぜたしビオチニル
化した（　１）ｉｏｔｉｎｙｌａｔｃｄ　）　ＹＢＭ３
４．３．６抗体はＭ　ＩζＣ−０Ｘ］２　抗体と結合し
ないので、１側坑体のアフイニディー精製は、ビオチニ
レーションに先行さぜなけれはならない〕。Ｂ　Ｓ　Ａ
を含有しなｕｌＰＢ５中の抗体製剤を中成酸塩緩衝液（
ｐｆ−１８，３）甲へ透析し、ビオチ／→ノークンンイ
ミ１゛エステルを乾燥ジメチルフメルムアミト中にγべ
加し、この混合物を旧３Ｓ中へａＦ　した。ｔｌｌられ
たビオチニル化抗体製剤を、ヘソクマンエアヒュージを
用いて］、００．０００ｇで５分間の遠心分離処理にイ
・］シ、分離した生成物２００　ｔｒ　ｉを、Ｂ　Ｓ　
Ａ０５９６、ＮａＮ３　ｏ、　２％および熱不活性化正
常ラビット血清（’ＨＩＮＲ５）５％を含有した１４Ｅ
ＰＥＳ緩衝剤処理イーグル培地（Ｅｌ−１）に、抗体２
５０μｇ／ｍｌ培地の割合で加え、これをＲＢＣ欠失の
なイ（ｎｏｔ　ＲＢＣｄｅｌｅｔｅｄ　）全マウス骨髄
からの細胞（２ｘ　１０７）へ添加した。４℃で９０分
間培養後（１５分間ことに農機）、細胞を同じ培地中で
洗浄し、遠心分離によって沈降させ、同じ培地中に再懸
濁させた細胞ペレットにアヒジンーフルオレセインイソ
チオシアネート（５０μｇ／ｍｌ：シグマ）２ｍｌを加
えた。沈降と凝集を防くために穏やかに攪拌しながら細
胞を４℃で３０分間培養し、次いてビオチン含有培地、
即ちイスコブの変性ドウルヘツコ培地（ｌ５ｃｏｖｅ’
ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄｌ）ｕｌｌ〕ｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅ
ｄｉｕｍ　；　ＩＭＤＭ　）　８ｍｌを添加することに
よって反応を停止させた。ヨー化プロピジウム１ｍｌあ
たり、ＢＳＡｏ、５％　およびＮ　ａ　Ｎ　３０、２９
６含有熱不活性化ＳＩＭＤ’Ｍ　（ＩＭＤＭ　中の重炭
酸塩緩衝液をＮａＣＪで置きかえ、ｐ　Ｈを７．２に緩
衝剤調節したもの）５０μｇ含む培地中で細胞を洗浄後
、フェノールレッドを含まない細胞区分（ｃｅｌｌ　ｓ
ｏｒｃｉｎｇ　）用培地中に）Ｖ濁させた。

前述の１価モノクロナル抗体製剤の利用によって、典型
的には顕微鏡観察によって４つ以上の細胞の凝集体は認
められず、過剰量の全試薬と飽和結合が保証される。０
ｒｔｈｏ　Ｉ（５０コンピューター・コンドロールド・
サイトフルオロクラフ（２、（’）ＯＯ細胞／秒）を用
いて、４つのパラメーター解析を複数の試料についてお
こなった。細胞遠心分離処理並びにメイーグルンバルズ
（Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄｓ　）　およびギームサ（
Ｇｉｃｍｓａ　）　ｙ、ティンをおこなった後に区分け
されたフラクション中で得られた細胞のテイファレンシ
ャル・カウントよりカバリ−についての典型的な数値を
以下の表−１に示す。螢光に基ついた３つの区分フラク
ション間の細胞分布を赤芽球（核化を有する好塩基性細
胞）、成熟（ｍａｔｕｒｉｎｇ　）正赤芽球〔コンデン
ス細胞核および好酸性ステイニング・テクリ−（ｄｅｇ
ｒｅｅｓ　ｏｆ　ｏＸｙｐｈｉｌｉｃ　ｓｃａｉｎｉｎ
ｇ　）　）および赤血球もしくはＲＢＣについて示す（
これらは赤血球シリーズにおける形態的分化の主要な３
区分を表わす）。各細胞タイプにつ０ての計算された平
均および標準偏差を分布値の下方に示す。

表−１から、ＹＩ３Ｍ　３４．．３．６抗体に対する抗
原は赤芽球の大部分の上で弱く発現する力Ｓ（細）１包
の６９９６の平均螢光は５７±２４）、わず力）な部分
は明らかに強く発現しく細胞の２５％の平均螢光は７３
７±３１１）、これによって全体の平均は２３１±１１
３に高められること力）わ力）る。正赤芽球は最も高い
螢光レベルを示すか（５２８±２１７Ｌ成熟ＲＢＣは抗
原発現の中間レベルを示す（平均２１２±６７）。

第１図および第２図は、１側坑体製剤の、非分別ＹＢＭ
　３４．３．６　モノクロナル抗体混合物製剤に比へた
改良を示す。各図のＸ軸はほぼ細胞の大きさに等しイｎ
ｒＪ方散乱（ｆｏｒＷａｒｄ　５ＣａｔＬｅｒ）を示す
ノドグラムを表わし、ｙ軸は螢光を表わし、λ、）・軸
の各プロットは、単一細胞か細胞ソーターのレーザービ
ームを通過するときに得られる測定値を表わす（領域］
は赤血球に相当し、領域２はリンパ球／核形成された赤
血球に相当し、領域３はミクロ−単核白血球細胞に相当
する）。１価Ｙ　ＢＭ　３４．３．６　製剤か、骨１涌
中の異なった細胞個体数の分９！Ｉ［（ｒｃＳｏｌｕ口
０１１）口語１１署しい改良を示すノドグラムを与え、
また、２側坑体による凝集によって失なわれる比較的少
；１；の赤血球を保持する（第１図および第２図の：Ｉ
および１〕てかこまれる領域を比較ずれは明らかなよう
に、領域・岬」で（Ｊ赤血球は失なわれている）ことか
わかる。

実施例５ 実施例２のようにして得られた１価ＹＩ’ｌｌ　１２５
．２２製剤の細胞毒性を、５０％■ヅＶ　飽和（流酸ア
ンモニウム溶液を用いる常套の沈殿法によって実施例２
て言及した未処理細胞を含まないｊメー在１−澄から得
られた抗体の細胞５ｊ性とり、ドのようにして比較した
。２種の抗体製剤（１５０／１ｇ　／ｎ２ｐ　ＰＢＳ）
を、Ｆ　ｉ　ｃ　ｏ日−ｆｌ　ｙ　＋）凹ｕｅ十での遠
心分：’ｉｌｌによって赤血球を除去した脱、）裁維素
静脈血から得られたヒトの５１０１　ラヘル化末梢血液
すンノ々球（Ｐ旧−）を用いて培地（Ｓ　ＩＭＩ）Ｍ　
−１５９０ＦＣ５］１で滴定した。室温で３０分間培伴
後、５１λ１１）八・■＋５％Ｉ”　ＣＳ中のラビット
もしくはヒトの血Ｗ’ｉ　イ＋ｌｉ体を添加して１／１
０　まて希釈し、３７℃で６０分間培養を続行した。次
いて細胞をベレント化し、上澄を除去して力／マカウン
テインクにイ・」シた、第３図は、１）ＩＪ記２棟の抗
体製剤についてのリンパ球からの５１．Ｃｒ放出によっ
て１ｌＵＩ定された細１地の比致死率（５ｐｅｃｉｆｉ
ｃ　ｋｉｌ１口＋ｇ　）を参照スタンタートと比較した
ものである。使用した参照スタンタートはモノクロナル
抗体ＣＡｔ１１１１’Ａｌ’ｌｌ　］　（コソボルドら
の前記文献参照）の製剤（５０μｇ／、−７）で、該製
剤は′ｊ”細胞もＢ細胞も殺す。従って、５］、　に　
ｒ比放出率はこの参照スタンダードを用し）で得られる
値１００％に対するものである。Ａ、Ｂ、ＣおよびｌＥ
はそれぞれ１価１ｇＧ（ラビットの補体）、」１澄１ｇ
Ｇ（ラビットの補体）、１価１ｇＧ（ヒトの補体）およ
び上澄１ｇＧ　（ヒトの補体）の場合を示す。ヒトの補
体を使用しようと、ラビットの補体を使用しようと、未
分別製剤に比へて］　価Ｙｌ’ｌ−１１２，５，２２製
剤に関して（ま細胞Ｍ千生か著しく増加することかわか
る。

実施例６ ＹＴＩｌｌ　２．５．２２　１価および上澄１ｇを実質
上実施例２に記載のようにして調製した。１価および未
分別上澄製剤およびこれらの種々の割合の混合物の、実
施例５に記載の末梢血液リン／”球に対する致死能を、
全’　ｇ　’ＩＩＡ　Ｊｕ約２０μｇ／ｍｌから出発し
、ラビットの補体の代りにヒトの血ａ♀ｉＩｊ体を使用
し、５］ｃｒ　ラヘル化リンパ球を用いて滴定すること
によって試験した。各製剤中の１価物質と２価物質のだ
いたいの割合は、コツボルド（Ｃｏｂｂｏｌｄ　）とワ
ルド７７　（Ｗａ　ｌｄｍａｎｎ　）の論文（ＮａＬｕ
ｒｅ、　１９８４．３０８．４６０〜４６２）に記載の
ＥＬＩＳＡアッセイを用いて評価した。

ＹＴＩｌｌ２．５．２２　の上澄は抗原結合活性を有す
る１価型の物質を約１５〜２０９６含有しくこれは通常
の場合よりも少ない）、一方、２価物質は分別された１
ｇ中には検出されなかった。

得られた結果を、第４図に第３図の場合と同様にして示
す。Ａは検出可能な２側坑体を含有しない（２側坑体に
対する１側坑体の比〉１００：１）実施例２の１価製剤
に相当し、Ｆは２側坑体に対する１側坑体の比か〈１：
１の未分別」１澄に相当し、Ｂ−Ｅは２側坑体に対する
１側坑体の比かこれらの中間の場合に相当する。即ち該
比は次の通りである： Ａ　）１００　：　Ｉ Ｂ　２５　：　１ Ｃ７：　１ １）　３　：　ｌ Ｅ　２　：　Ｉ Ｆ　（１：１ 第４図から、ＹＴＨ１２，５，２２の場合には、１側坑
体＝２価抗体の比か７：１以上になると。

致死能が著しく改良されるが、最も効果的な溶解は検出
可能な２価物質を含有しない製剤を用いることによって
おこなわれることか認められる。

本発明によって、免疫グロブリンを開裂させてその生成
物を分離することを必要とせすに新規な１側坑体製剤か
得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は未分別ｙＢＭ３４．３．６　についての前方散
乱（Ｘ軸）と螢光（ｙ軸）との関係を示す。 第２図は１価ＹＢＭ３４．３．６　についてのｎｆｊ方
散乱（Ｘ軸）と螢光（ｙ　ＩＩｊｂ　）との関係を示す
。 第３図は種々の補体を含有する１側坑体についての抗体
θ度（Ｘ軸）と　Ｃｒ比放出率（ｙ軸）との関係を示す
。 第４図は１側坑体と２側坑体を種々の割合で含有した製
剤についてのＩｇＧの概略濃度（Ｘ軸）と５Ｉ　Ｃ，、
比放出率（γ軸）との関係を示す。 特許出願人　ナショナル　リサー升ディベロップメント
・ｙ ／θθ］ ／　２θ　４θ　６θ　８θ　／θθ 六ｑラテ丑グ乱（〜斤日月智“リーイス′）勿・２ ゴ４θＩＡ−＝。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、２つの軽鎖のうちの１つのみが細胞表面抗原と結合
   するＩｇＧ　抗体分子を含有し、該抗体分子の割合を、
   該抗原と結合する２つの軽鎖を有するＩｇＧ　抗体分子
   に対して増加させることによって製剤の結合活性か増加
   する、細胞表面抗原に対して単結合活性を有するモノク
   ロナル抗体製剤。 ２該割合を５倍もしくはそれ以上に増加させる第１項記
   載のモノクロナル抗体製剤。 ３２つの軽鎖のうちの１つのみか細胞表面抗原と結合す
   る１、ｇＧ抗体分子を、該抗原と結合する２つの軽鎖を
   有するＩｇＧ抗体抗体分子対して１０：１もしくはそれ
   以上の割合で含有する、細胞表面抗原に対して単結合活
   性を有するモノクロナル抗体製剤。 ４、該割合が１００：　１もしくはそれ以上である第３
   項記載のモノクロナル抗体製剤。 ５．２つの軽鎖のうちの１つのみか抗原と結合するＩｇ
   Ｇ抗体分子の割合が、いずれの軽鎖も抗原に結合しない
   ＩｇＧ　抗体分子に対して付加的に高められる第１項か
   ら第４項いずれかに記載のモノクロナル抗体製剤。 ６、　いずれの軽鎖も抗原に結合しないＩｇＧ抗体分子
   を実質上含有しない第５項記載のモノクロナル抗体製剤
   。 ７　細胞表面抗原に対して特異的な２つの同一な重鎮、
   該抗原に対して特異的な第１軽鎖、および血清学的に第
   １軽鎖とは異なって該抗原に対して非特異的な第２軽趙
   を有するＩｇＧ抗体分子を含有し、該抗体分子の割合を
   、該重鎖を２つ有しかつ抗原に対して特異的な該第１軽
   鎖を２つ有するＩｇＧ　抗体分子に対して増加させるこ
   とによって製剤の結合活性か増加する、細胞表向抗原に
   対して活性を有するモノクロナル抗体製剤。 ８、該割合か５倍もしくはそれ以上に増加される第７項
   記載のモノクロナル抗体製剤。 ９、細胞表面抗原に対して特異的な２つの同一の重鎖、
   該１ゲ１原に対して特異的な第Ｊ軽鎖、おまひ血／ｌ’
   ｉ学的に第１軽鎖とは異なって該抗原に対してＪ「’ｌ
   ’、’ｉ異的な第２軽鎖を有するＩｇＧ抗体分子を、該
   重鎖を２つ有しかつ抗原に対して特異的な該第１φｒ鎖
   を２つ有するｉｇｃ、抗体分子に対して」０：１もしく
   　ｉｌｌそれ以、−１−の割合で含有する、ｉｌｌ１胞
   表面抗１１；−ｉに対して活性を有するモノクロナル抗
   体製剤。 １０　該割合か１００：］もしくはそれ以−トである第
   ９項記載のモノクロゾル抗体製剤。 】１　抗原に対して特異的な２つの同一な重鎖、４ノ１
   原に対１７て特異的な第１軽鎖、および血清学的に第１
   軽鎖とは異なつ−ＣＣ接抗）７Ｈに対して非特異的な第
   ２軽鎖を有するＩｇＧ抗体分子の割合か、抗１工１（に
   対して特異的な該重鎖を２つ自しかつ抗原に対して非ｌ
   ｔ、ｌｌＷ的な該第２軽鎖を２つ有するＩｇＧ抗体分丁
   −に対してイ・」加面に高められる第７項から第１０項
   いずれかに記載のモノクロナル抗体製剤。 １２、４’ｉ”１原に対して特異的な２つの重鎖およＯ
   ・抗原に対（７て非特冗的な２つの第２軽鎖を有する１
   ｇ（・　抗体分子−を実質上含有しない第１１項記載の
   モノクロナル抗体製剤。 １３　製剤か、融合によって生産された］１インリドー
   マにミニ０マの軽鎖４−１Ｉ寸４Ｆをイ＾ｊｊ〕１−る
   ミニ「」＼・を含む該バイブリド−７から誘袢される第
   ７項から第１２項いずれかに記載のモノクロゾル抗体製
   剤。 ■・４．血球表面上の抗原に対して活性を有する第１枳
   から第１３項いずれかに記・１戊のモノクロナル抗体製
   剤。 １５　血球かリンパ球である第１４項記載のモノクロナ
   ル抗体な１剤。 １６　製剤か、不利プラスチック細［泡表面と特異的に
   結合（７た抗原に対して活性な第１項から第１３項いず
   れかに記載のモノクロナル抗体４１）ｊ剤。 １７　細１１１シ表面抗１ｊ１１に対して特異的な第１
   軽鎖および血清学的に第１軽鎖とはｙ、３なって接抗１
   ；ｊに対して非情異的な第２軽鎖を有しかつ該４つ“ｌ
   原に対して活性な第１のタイプのＩｇＧ抗体分子および
   ２つの該第１軽鎖を有する第２のタイプのＩｇＧ抗体分
   子を含有するモノクロナル抗体混合物を、アｌ」タイプ
   、イテイオタイプもしくは血清学的に該第１軽鎖とは異
   なった該第２軽鎖に勃有の種に対する抗体を保有するア
   フィニティーノコラムと接触させ、第２タイプのＩｇＧ
   分子から第１タイプのＩｇＧ　分子を分離することを含
   む、１該モノク１コナル抗体混合物のうｌ別方法。 １８　ｔｍ胞表面抗原に対して活性−Ｃあ１〕で該抗原
   と結ｎ−する１つの軽鎖を有する第１タイプのＪｇＧ抗
   体分ｊ′−および該抗原と結合する２１）の軽鎖をイ〕
   する第２タイプのＩｇＧ　抗体分子を含有するモノクロ
   ナル抗体ｍ合物を、２一つの異なった軽鎖の等電点の差
   にノｊ（ついて分１へ１（をおこなう処理に付すことを
   含む、Ｊモノクロナル抗体混合物の分別方法。 ］９　第１タイプの１ｇに抗体分子および−０すれの軽
   鎖も抗１１；（と結合しない第３タイプのＩｇＧ抗体分
   子との間θ）分別もおこなう第１８項記載の方ｌ去。 山　実施例１．２もしくは３に実質上記載された一ｅノ
   クロナル抗体製剤。