JPH06504535A

JPH06504535A - ターゲット特異的物質としての赤血球及びトロンボー赤血球

Info

Publication number: JPH06504535A
Application number: JP4502274A
Authority: JP
Inventors: エス．コラー，バリー
Original assignee: ザリサーチファンデーションオブザステイトユニバーシティオブニューヨーク
Priority date: 1990-11-09
Filing date: 1991-11-12
Publication date: 1994-05-26
Also published as: FI932114A; AU9058891A; KR930702341A; CA2095925A1; WO1992008804A1; AU651643B2; EP0558645A1; FI932114A0; EP0558645A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本明細書で開示される発明は、国立衛生研究所により授与された研究奨学金Ｎ）ＩＬＢＩ　１９２７８の下に政府援助を部分的に受けてなされたものである。１、発明の分野本発明は、活性化されていない血小板ではなくて、活性化された血小板に選択的に結合する能力を有する、トロンポー赤血球（ｔｈｒｏｍｂｏ−ｅｒｙｔｈｒｏｏｙｔｅｓ）と呼ばれるものの新規組成物に関する。トロンポー赤血球は血小板減少（血液の血小板欠乏）哺乳動物の出血を制御する点で、及び標識、治療用薬剤並びに遺伝物質を選択された標的に取り込み（ｕｐｔａｋｅ）及び運搬させるために有用である。さらに、本発明はターゲット指向赤血球及び化合物を取り込みそして運搬させる際のその使用に関する。哺乳動物は、損傷部位で生産され又は放出される作用物質で活性化される血小板を生成することにより出血を制御する。活性化は、血小板を凝塊又は血餅へ凝集させるために必要である。血小板の活性化は複雑な過程であり、これには血小板表面にて血漿タンパク質フィブリノーゲンに対する受容体を生成させること又はさらすことが含まれる。フィブリノーゲンは複数の結合部位を有しており、同時に２以上の血小板と結合して凝集を開始する。血小板の表面に存在し、活性化過程の間にさらされる血小板受容体はＧＰＩｌｂ／Ｉｌｌ＆である。血小板数の低い患者は、出血を制御するために、しばしば血小板の輸注を必要とする。１０００年にデュークは、血小板を含有する全血液の輸血は血小板減少による出血を抑制しうろことを示唆するデータを提供した（Ｄｕｋｅ、　１９１０．　Ｊ、　Ａｍ、　Ｍｅｄ、　Ａｓ５ｏｃ、　６０：　１１８５−１１９２）　、しかしながら、全身照射処理により血小板減少症にされた動物において血小板輸注の効果に関し疑う余地のないデータが得られたのは１９５０年代になってからであった（Ｃｒｏｎｋｉｔｅら、　１９５９．血液学における進歩、第２巻、トカチン編、　Ｇｒｕｎｅ　ａｎｄ　５ｔｒａｔｔｏｎ、　ＮＹ、第２３９−２５７頁）。血小板の入手及び保存の困難性のため、その後まもなく、研究者は新鮮な血小板の代用物をめるようになった。凍結乾燥した血小板及び分解した血小板に関してなされた研究は、これらの生成物が出血を抑制しえないことを示した（Ｃｒｏｎｋｉｔｅら、上掲：Ｊａｃｋｓｏｎら、１９５９．　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、３８：　１６８９；　Ｈｊｏｒｔら、１，９５９゜Ｐｒｏｃ、　ＳＯＣ，ＥＸ＋）、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、　１０２：　３ｌ−３５）。リン脂質が凝固反応を促進させる際に血小板の代用となりうろことが見い出されたとき、大豆のホスファチドのセファリン分画が血小板減少症の子供における血小板の代用物として研究された（Ｓｈｕｌｍａｎら、　１９５５゜Ａｎｎ、　Ｎ、Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７５：　１９５．アブストラクト）。予備的報告によれば、成る患者においては臨床的改善が示唆されたけれど（Ｓｃｈｕｌｍａｎら、上掲）、動物実験では効果が確認できず、この方法は結局放棄されてしまった（Ｋａｈｎら、　１９８５．　Ｂｌｏｏｄ　６６：　１−１２．　アブストラクト）。自己由来の血小板を凍結保存したものは同種異系免疫（ａｌｌｏｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）及び同種同系免疫（ｉｓｏｉｍｍｕｎｉｚａｔｉ。ｎ）に関連する困難を有する患者において成功裏に使用されてきたが（Ｓｃｈｉｆｆｅｒら、　Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　２９９．７−１．２）　、血小板収率は新鮮な血小板を有するものよりも低く、がっ、その方法は他の処理の必要性並びに保存スペースの利用性から限定される（Ｍｕｒｐｈｙ、　１９９１．輸血医学の原則、　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ、　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、第２０５−２１．３）。血小板生理学の進展した理解は、血小板代用物を得るための他の方法をもたらした。幾つかの実験は血小板膜タンパク質をインビトロの実験においてリポゾームに導入することを可能にした（ｒ’ａｒｉＳｅ及びＰｈ１ｌｌｉｐｓ、　１９８５．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６０：　１７５０１７５６；Ｂａ１ｄａｓｓａｒｅら、１９８８．　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅａｔ、７５：　３５−３９；　Ｒｙｂａｋ、１９８６、　Ｔｈｒｏｍｂ、　ｔｌａｅｗ＋ｏｓｔａｓ、　５５：　２４０−２４５）。より最近になって、リーバツク　（Ｒｙｂａｋ）及びジンズリ−（Ｒｅｎｚｕｌ　ｌｉ）は、ＧＰ！ｂ、　ＧＰＩＩｂ／１１１ａ及びＧＰＩＶを含め１５種のタンパク質を含む血小板膜のデオキシコーレート抽出物をスフィンゴミエリン　フォスファチジルコリン、モノシアリロガングリオンド又は卵フォスファチドから製造した単ラメラの小さな（５０〜２０００ｍ）リポゾームに組み込んだ（８１ｏｏｄ　５ｕｐｐ１．　Ｉ・４７３ａ、アブストラクト）。両方の調製物を動脈内に注入すると血小板減少症のラットにおいてヒトの血小板が奏する程度に出血を減少させたが、いずれも出血時間を完全に通常のものとはしなかった。興味あることに、ＧＰＩＩｂ／ｌ１ｌａ単独で含有するりボゾームは効果的でなかった（Ｒｙｂａｋ及びＲｅｎｚｕｌｌｉ、　１９９０．　Ｂｌｏｏｄ　５ｕｐｐ１．１：　４７３ａ、アブストラクト）。この方法は重要な機序についての情報を提供しうるが、治療上の干渉としてこれはインビボでの短かい生存可能性及び網内系の可能性のある閉塞を含む、リポゾームの一般的な問題を生ずることがありうる（Ｋａｈｎら、　１９８５、　Ｂｌｏｏｄ　６６：　１−１２．アブストラクト）。加えて、血小板が出発物質であるゆえ、血小板取得の問題及び感染性疾病の伝播の危険性は解消されない。最後に、仮に全血小板抽出物が必要とされるときは、免疫原性が治療のために繰り返し使用する機会を制限するかもしれない。というのは血小板はクラスＩ　ＨＬＡ抗原を有しており（Ｍｅ　Ｆａｒｌａｎｄ及びアスター、　１９９１．輸血医学の原則、　ＷｉＩｌｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｔｎｓ、バルチモ乙第１９３−２０４頁）、また幾つかの血小板の糖タンパク質は多形性だからである（Ｌｏｐｅｚ及びＬｕｄｗｊｇ、　１９９１、Ｃｌ１ｎ、Ｒｅｓ、３９：　３２７）。アガム（Ａｇａｍ）及びリブン（Ｌｔｖｎｅ）は、フィブリノーゲンでコーティングされた受動の固定血小板が天然の新鮮な血小板の血小板凝集を増大させる機能を果すことができるという彼らの知見に基づく手法を採用した（Ａｇａｍ及びＬｉｖｎｅ、　１９８３．　Ｂｌｏｏｄ、　６１：　１８６；Ａｇａｍ及びＩ、１ｖｎｅ、＋９８４．　Ｔｈｒｏｎｂ、　ｔｌａｅｍｏｓｔａｓ、　５１：　１４５−１４９；　Ａｇａｍ及びＬｉｖｎｅ、　１９８８．　Ｔｈｒｏｍｂ、　ｔｌａｅｍｏｓｔａｓ、　５９：　５０４−５０６）。彼らは、活性化された血小板が放出反応に遭遇し、相互作用を生じさせるためにその表面上のトロンポスポンジンをさらさなければならず、固定された血小板−トのフィブリノーゲンと活性化された血小板上のトロンポスポンジンの間で最終的な相互作用が生じると結論した（Ａｇａｍ及びＬｉｖｎｅ、　１９８３．　Ｂｌｏｏｄ　６１：　１８６；　Ａｇａｍ及びＬｊｖｎｅ、　１９８４、　Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、　５１：　１４５−１４９；　Ａｇａｍ及びＬｉｖｎｅ、　１９８８．　Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、　５９：　５０４−５０６）。このことは、この固定化過程はフィブリノーゲンがＧＰＩＩｂ／ｌ１ｌａと直接に相互作用し得ないようにこれを変化させるが、トロンポスポンジンと相互作用しうるフィブリノーゲン分子の無傷の部位を残すことを示している。この方法は、これが血漿からフィブリノーゲンを精製することに依存し、このため、血液から生ずる疾病を伝播する危険を有するという重大な制限を伴う。加えて、ホルムアルデヒドは発癌可能性を有しうる細胞毒性剤であるから（Ｆｅｒｏｎら、　１９９１．　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ｒｅｓ。２５９　：３６３−３８５）、インビボの使用のためには最も好ましい架橋試薬ではないかもしれない。本発明に至るまで、血小板の輸血は血小板減少による出血を防止し、かつ治療するための唯一の効果的な治療法であった（）ｌｅｙｍａｎら、　１９９１．輸血医学の原則、Ｗｉｌｌｉａｍ　＆　Ｗｉｌｋｅｎｓ、バルチモア。第２２３−２３１頁）。米国において毎年輸血された血小板の単位数は、１９６０年代に血小板輸血療法が広く導入されて以来、急速に増大した：事実、僅か１９８０年と１９８７年の間に、その数はほぼ倍増し、６００万単位／年を越えるに至っている（Ｓｕｒｇｅｎｏｒら、　１９９０．　Ｎ、　Ｂｎｇｌ。Ｊ、　Ｍｅｄ、　３２２：　１６４６−１６５１）　、この大きな成功にもかかわらず、血小板輸血療法は多くの極めて重大な制限及び欠点を有している＝１）調達の困難さ及び比較的短かい貯蔵寿命（５〜７日）の故えに供給がしばしば制限される（Ｍｕｒｐｈｙ、　１９９１．輸血医学の原則。Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｅｒｓ、バルチモア、第２０５−２１３頁）；２）通常複数単位が各輸血ごとに投与されるため、肝炎やエイズを生ずるウィルスの如き血液から派生する病原体を伝播する危険性がある（Ｈｅｙｍａｎら、上掲）：　３）恐らくは白血球の混入による、熱性反応が繰り返し輸血を受ける患者において一般的である（Ｓｎｙｄｅｒら、１９９１、輸血医学の原則、　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｅｒｓ、バルチモア、第６４１−６４８頁）；　４）ランダムなドナーの血小板に治療抵抗性を示し、ＨＬ　Ａ抗原に適合した単一ドナーの血小板に代える必要がある患者に、同種異系免疫を生じさせ、そして、ＨＬＡに適合した血小板輸血でさえも普遍的に成功するものではない（ｌｌｅｙｍａｎら、上掲）。フィブリノーゲンと血小板の間の相互作用は従来の研究の主題であった。例えば、血小板はフィブリノーゲン−コーティングしたポリアクリロニトリルビーズと血小板表面のフィブリノーゲン受容体を含むメカニズムを介して相互作用を生ずる（Ｃｏｌｌｅｒら。＋９８０．　Ｂｌｏｏｄ、　５５：　１６９−１７８頁の第１７７−１７８頁に渡るパラグラフを参照）。アガムとりパンは（１９８３，Ｂｌｏｏｄ　６１：　１８６−１９１頁）、フィブリノーゲンが結合した固定血小板は、活性化血小板との選択的な反応により、活性化血小板の凝集に関与することを示した。ルオスラーチ（Ｒｕｏｓ［ａｈｔｉ）らの米国特許第４７９２５２５号明細書は、細胞と相互作用するフィブリノーゲンの如きタンパク質の能力は、フィブリノーゲン構造内のＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−３ｅｒのアミノ酸配列と関係があることを示した。ルオスラーチらの特許は、さらに、基体に適切に固定されたときには、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−３ｅｒの配列を含むテトラペプチドが基体に細胞を付着させる性質を有することを示している。このテトラペプチドはいずれの端部においても付加的なアミノ酸により伸長させることができ、そして、テトラペプチドを構成するアミノ酸の極めて限定された置換可能性が示唆された。ルオスラーチらにより示された現実の適用は血小板凝集であった。出血を制御する血小板の既知の役割及びフィブリノーゲンと血小板の間の相互作用の既知の役割にもかかわらず、上述のように、かかる輸血のあらゆる不利益を有する血小板の輸注以外には血小板減少症の患者における出血を制御する最新の方法は存在しない。それゆえ、豊富かつ安全なヒトの血小板の代用物の利用可能性は大きい利益をもたらす。しかしながら、かかる代替方法は血管の損傷部位において血栓を形成するための血小板の特異性を保持させ、無差別の血栓の生成が起こらないように確保することが極めて重要である。本発明以前には、豊富で安全なヒトの血小板代替物は見い出されていなかった。代替方法は、十分な血小板を得るために必要な大量の血液を減少させるために必要である。理想的な方法は、血液から生ずる疾病の可能性を減少させるために、患者自身の血液細胞を使用することであろう。加えて、放射性ラベル化された分子、診断及び治療剤を特定の標的組織に正確に移送することは、重要な実験的かつ臨床的問題である。したがって、本発明の目的は、特定の標的物に正確に作用物質を移送させるために使用することができる細胞を少量の血液、特に自己由来の血液から入手することの困難性を解決することである。他の目的は、活性化血小板に選択的に結合することができ、インビボの活性化されていない血小板には結合しない物質の組成物を提供することである。活性化とは、これにより血小板がより凝集を受けやすくなる過程のことである。血小板が活性化される過程は、特に、インビボではほとんど理解されていない。活性化過程は、ＡＤＰ、エピネフリン、コラーゲン、トロンビン及びトロンボキサンＡ２のような多くのアゴニストにより引き起こされる。作用物質が活性化及び非活性化血小板の両方に無差別に結合することは、患者を血栓（血液凝塊）の危険性にさらし、これは、心臓や脳を含む重要な器官における組織の死をもたらしめるものである。３、本発明の概要本発明は血小板の凝集を促進させ、出血を防止するための新規な化合物及び方法を提供する。本発明は、本発明により製造されるＲ　−Ｇ　−Ｄ　（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）配列（ここでは、包括的に“ＲＧＤペプチド”と称する）を含有する成る種のペプチド及びポリペプチドに結合した赤血球が選択的に活性化血小板に結合し、非活性化血小板とは結合しないという驚くべき発見に基づく。誘導された赤血球の二面性の認識において、本明細書ではこれらを“トロンボ−赤血球（ｔｈｒｏｍｂｏ−ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ）”という。本発明の方法及び化合物は、損傷部で特異的な血小板凝集を促進させる豊富で安全な物質を提供することにより、従来技術の血小板代用物に係る問題を克服する。本発明の方法に従うことにより、驚くべきことにその流動特性に重大な変化を有しないトロンボ −赤血球が生成された。加えて、予想に反して、そして好適な一面において、トロンボ−赤血球は赤血球の表面上のグリコホリンＡ及びグリコホリンＢに特異的に架橋結合したＲＧＤペプチドの大多数を有し、血小板ＧＰＩｌｂ／ｌ１ｌａ受容体を介して活性化血小板と選択的に相互作用を生じうる変化した膜表面を有するトロンボ−赤血球を生成する。本発明のトロンポー赤血球において、Ｒ−Ｇ− Ｄ配列のＮ−末端Ａｒｇは、ＲＧＤペプチドが架橋結合している赤血球タンパク質から９〜５０オングストローム、より好適には１０〜４０オングストローム、及び最も好適にはＩＩ〜２５オングストロームの間隔をもつべきである。結果として、活性化血小板は赤血球と凝集して血栓又は血塊を生成する。ヒトを含む哺乳動物においてインビボでかかる血栓又は血塊が生ずると、それらは出血を制御する際に有意義であり、特に小さな偏部からの出血を制御する際に有意義である。さらに、本発明は細胞内含有物をラベル又は作用物質を含む組成物で置換することにより修飾した赤血球に向けられる。このような修飾赤血球は本明細書では“ 担体赤血球”と呼ばれる。この担体赤血球は、ターゲット指向性物質に結合することによりかかるラベル又は生物学的活性物質を特定の組織へ移送する際に使用する。成る態様において、担体赤血球はトロンボ−赤血球であり、こうして、本発明に従って製造されるＲＧＤペプチドと結合させることにより特定の組織、特に活性化血小板を標的とする。他の態様において、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、レクチン、炭水化物又はステロイドのような様々のターゲット指向性分子は、担体赤血球又は、特に担体トロンボ−赤血球に結合第１図。コントロール赤血球及びトロンポー赤血球の浸透脆弱性。コントロール赤血球及びトロンポー赤血球の溶解は種々の塩濃度を含有する溶液中に２０分間インキュベートした後で測定した。結果は、蒸留水中で生じた溶血（これを１００％と定義する）に比較して表わされる。データは３個の別個の実験から得られる。第２図。トロンボ−赤血球及びコントロール赤血球のエクタサイトメーター（Ｂｋｔａ、ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）分析。トロンボ−赤血球を上述のようにして調製し、１５分、３０分、６０分及び１２０分のインキュベーションの後に試料をとり出した。次に、トロンボ−赤血球を０．１５Ｍ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　）リス／ＨＣＩ、５　ｍＭ　ＫＣＩ、　１０ｍＭグルコース、１％牛血清アルブミン、ｐＨ７，４中で洗い、約３３％までのへマドクリットで再懸濁した。３個の異なる赤血球のコントロールを調製した＝１）上記緩衝液で単に洗っただけの赤血球、２）ペプチドとインキュベートし、ｍａｔ−ｓａｃ−ＨＮＳＡとはインキュベートしていない赤血球、３　）　ｍａｌ−ｓａｃ−ＨＮＳＡとインキュベートし、ペプチドとはインキュベートしていない赤血球。各試料の変形可能指数（ｄｅｆｏｒｍａｂｉ−１ｉｔｙ　１ｎｄｅｘ）を、２２ｃｐ粘度の等張媒質中で剪断率の関数として測定した。トロンポー赤血球試料及びコントロール試料のすべてが本質的に重ね合わせが可能な曲線を与えたが、簡潔化のために洗浄したコントロール赤血球及び１．２０分のトロンボー赤血球試料のみが示される。２００個以上の正常な試料のプラトーの変形可能指数（平均±ＳＤ）　も示され、すべての実験した試料はこの正常な範囲内にあった。第３図。ペプチド架橋結合に関与するトロンボ−赤血球膜タンパク質の分析。赤血球に３Ｈ−ペプチドを架橋させた後で、細胞を洗い、溶解させた。次に、トロンボ−赤血球ゴーストをドデシル硫酸ナトリウム中に溶解し、１２．５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動させた。ゲルは順次、過ヨウ素酸シッフ染色法（Ｐ、　Ａ、　Ｓ、　）で染色し、写真にとり、クーマシーブルーで染色し、写真にとり、次いで沈澱及び蛍光水溶液との反応によるフルオログラフィーのために調製した。次いで、ゲルを乾燥し、Ｘ−線フィルムのカセットに一７０℃で７日間放置した。Ｐ、　Ａ、　Ｓ、染色はＭｒ８７，０００．４２．０００及び２２．０００の主要バンドを示し、これはフルオログラフィーにより同定された放射活性のバンドに相当した。第４図。血小板−トロンボ−赤血球の共凝集アッセイ。トロンボ−赤血球及びコントロール赤血球は第８．１節で記載したとおりに調製し、１０％のへマドクリットに調節した。クエン酸を添加した血小板に富んだ血漿を調製しく約５００．０００血小板／μｌ）、抗体７Ｅ３　（抗ＧＰ　Ｉ　ｌｂ／　Ｉ　Ｉ　Ｉａ＋抗ａｖβ、ビトロネクチン受容体；４０μｇ／ｍｌの最終濃度）　、ＥＤＴＡ　（１０＋ｎＭ最終濃度）　、ＲＧＤＦ（３００ｕｇ／ｍｌ最終濃度）又は緩衝液（０，１，５Ｍ　ＮａＣｌ、　Ｏ，Ｏｌ、Ｍ　トリス／ＨＣＩ、０．０５％ナトリウムアジド、ｐＨ７，４）とともに２２℃で３０分インキュベートした。アッセイはマイクロタイターウェルに５０μｌのＰＲＰを添加し、次いで選択されたウェルに１０μｌのＡＤＰを加え、最後にトロンボ−赤血球５μｌを加えて実施した。マイクロタイタープレートを２２℃で２７Ｏｒｐｍにて約６分間回転させ、次いでプレートの写真をとった。ＡＤＰを含まない試料における血小板凝集又は血小板−赤血球の共凝集の非存在を観察する。ＡＤＰ処理により、トロンポー赤血球は血小板とともに混合した集塊内に入った。ＡＤＰ刺激したコントロール赤血球試料を注意深く点検すると小さな白色の血小板の集塊が見られたが、これは血小板の活性化及び凝集は生じたが、コントロール赤血球は集塊の中に入らなかったことを示している。第５図。血小板−トロンボ−赤血球の相互作用。血小板−トロンポル赤血球の共凝集アッセイを実行した後で、試料をガラススライドＬに拡散させ、空気乾燥させ、ライト染色で染色した。光学顕微鏡法を、油浸レンズにて１０００倍で実施した。血小板とトロンボ−赤血球との緊密な会合、つまりトロンボ−赤血球間に交互嵌合（ｔｎｔｅｒｄｔｇｉｔａｔｅｄ）　した血小板を観察する。ＰＲＰ十：ｌントロール赤血球の場合は、ＡＤＰでの活性化は血小板凝集をもたらすが、コントロール赤血球は凝集の中に入らなかった。第６図。コントロール赤血球及びトロンボ−赤血球とゲル−濾過血小板との相互作用。第８６１節で記載されたとおりにして調製された、ゲル−濾過した血小板（４５０μｌ　：　３４０，０００／μｌ）及びコントロール赤血球又はトロンボ−赤血球（２０μｆ＋ｌＯ％へマドクリット）をアブリボメータ−（ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒ）キュベツト中で攪拌し、次いでＡＤＰ（４，３μＭ最終濃度）を添加した。このアッセイにおいて、赤血球は光学密度に有意に寄与する。コントロール赤血球は血小板凝集体中に入らず、そのため、この試料では光学密度が僅かしか減少しない。これに対して、トロンポー赤血球はＡＤＰ−活性化血小板と相互作用を生じ、光学密度の劇的な減少を生ずる。しかしながら、トロンボ −赤血球は３７℃で攪拌しても非活性化血小板とは相互作用を起こさない。最後に、血小板を抗体１０Ｅ５と予めインキュベートすると、この抗体はＧＰＩ　Ｉｂ／Ｉ　Ｉｌａと反応するが、血小板−血小板及び血小板−トロンボ−赤血球の相互作用を阻止する。ゲル濾過緩衝液（４５０μｍ）及びコントロール赤血球（２０μｍ）の混合物は、フルスケールの偏向（ｄｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）を確立するために使用した。第７図。コントロール赤血球及びトロンボ−赤血球とコラーゲンに付着した血小板との相互作用。ゲル濾過した血小板はコラーゲンをコーティングしたマイクロタイターウェル上で濃密な層（ｄｅｎｓｅ　ｌａｗｎ）を形成させ、次いで洗浄後、コントロール赤血球又はトロンボ赤血球（５０μｊ７：１０％へマドクリット）を２２℃で１時間ウェルに添加した。最後に、非付着性のコントロール赤血球及びトロンボ赤血球を洗い流した。コントロール赤血球については、血小板の濃密層がその領域に単一の付着性赤血球のみをもつように見られる。これとは著しく対照的に、トロンボ−赤血球は付着血小板に広範囲に結合した。付着血小板へのトロンポー赤血球の結合は抗体１０Ｅ５　（２０μｇ／ｍｌ）で抑制され、この抗体はＧＰＩｌｂ／ｌ１１ａ又はペプチドＲＧＤＦ　（４００μｇ／ｍｌ）に対して特異的である。示した実験は１２個以」二の別個の実験を表わす。第８Ａ図。（Ｇ）ｎ−ＲＧＤＦビーズ凝集の評価。第９．１節で記載したようにして、血小板に富んだ血漿（ＰＲＰ、７０μｌ）をＧ。 −ＲＧＤＦビーズ（ビーズ０．２２ｍｇを含む５μｎ）と反応させ、２６Ｏｒｐｍで回転させた。時間が増大するにつれて、凝集は一層進んだ。示した例は、凝集の度合を判断するために使用された半定量的な尺度を示すために、異なる時間間隔で選択された。また、ビーズ凝集物を３分間沈降させた後の上澄み液の血小板の数を示している。第８Ｂ図。ＰＲＰ中の（Ｇ）ｎ−ＲＧＤＦビーズの凝集。実験は、Ｇｌ−ＲＧＤＦ、Ｇｌ−ＲＧＤＦ、及びＧｔ−ＲＧＤＦビーズを使用して上述のように実施した。反応は左側で示されている時点で停止させ、マイクロタイタープレートの写真をとった。凝集の程度の度合は各ウェルの右側に示されている。Ｇ、−ＲＧＤＦビーズに関しては最小の凝集が、Ｇ、−ＲＧＤＦビーズに関しては中程度の凝集が、そして、Ｃｚ−ＲＧＤＦビーズでは最初の８分で広範な凝集が観察される。第９Ａ図。ＰＲＰによる（Ｇ）ｎ−ＲＧＤＦビーズの凝集。実験は本文中で示したとおりにして、ＰＲＰ及びＧ、−ＰＧＤＦ（ｎ−１５）　、Ｇａ　ＲＧＤＦ　（ｎ＝１．７）　、Ｇｓ　ＲＧＤＦ　（ｎ＝１５）及びＧｅ　ＲＧＤＦ　（ｎ＝１６）ビーズを用いて実施された。プロットした値は、平均±ＳＥＭである。第９Ｂ図。ＰＲＰによる（Ｇ）ｎ−ＲＧＤＦビーズの凝集。実験は本文中で示したとおりにして、ＰＲＰ及びＧ、、−ＲＧＤＦ　（ｎ−９）　、Ｇ１７−ＲＧＤＦ　（ｎ＝７）　、及びＧ、、−ＲＧＤＦ　（ｎ＝７）ビーズを用いて実施された。プロットした値は、平均±ＳＥＭである。第１０Ａ図。ＡＤＰで予備処理されたＰＲＰによる（Ｇ）ｎ−ＲＧＤＦビーズの凝集。ＰＲＰはＧ、−ＲＧＤＦ　（ｎ＝８）、Ｇ、−ＲＧＤＦ　（ｎ、＝７）　、Ｇ、−ＲＧＤＦ　（ｎ＝８）　、又はＧ、−ＲＧＤＦ　（ｎ＝９）ビーズを添加する前にＡＤＰ（６，７μＭ）とともに２２℃で３０秒間インキュベートした。プロットした値は、平均±ＳＥＭである。第１０Ｂ図。ＰＧＥＩで予備処理されたＰＲＰによる（Ｇ）ｎ−ＲＧＤＦビーズの凝集。ＰＲＰはＧＩ　ＲＧＤＦ　（ｎ−７）　、Ｇｓ−ＲＧＤＦ　（ｎ−７）　、Ｇｓ　ＲＧＤＦ　（ｎ＝７）　、又はＧｌ−ＲＧＤＦ　（ｎ＝７）ビーズを添加する前に、Ｐ　Ｇ　Ｅ　＋　（０，１４μＭ）　テ３０分間インキュベートした。プロットした値は、平均±ＳＥＭである。第１ＯＣ図。天然の血小板、ＡＤＰで予め処理された血小板及びＰＧＥ、で予め処理された血小板によるＧ３−ＲＧＤＦビーズの凝集。実験は上記Ａ及びＢに記載したとおりにしで実施した。プロットした値は、平均±ＳＥＭである。第１１Ａ図。ＰＲＰによる凝集に対する（Ｇ）、−ＲＧ、ＤＦペプチドのビーズ表面密度を減少させる効果。Ｇ、−ＲＧＤＦペプチドをグラフに示された異なるミリモル濃度でビーズに結合させた。結合の効率はすべてのペプチドにとり類似していた（結合の効率については第■ 表を、ペプチド間の最大平均距離については第Ｖ表を参照されたい）。ＰＲＰによるビーズの凝集については本文に示したとおりにして試験した。プロットした値は単一の実験結果である。第ＪＩＢ図。ＡＤＰで予め処理したＰＰＰによる凝集に対するＧ９−　Ｒ，Ｇ　Ｄ　Ｆペプチド密度を減少させる効果。ビーズを添加する前にＰＲＰをＡＤＰ（６，７μＭ）で２２℃にて３０秒間予め処理することを除いて、八で示したようにして実験を行った。プロットした値は、単一の実験結果である。第１２図。ＡＤＰの存在又は非存在時でのゲル−濾過血小板（ＧＦＰ）によるＧ、−ＲＧＤＦ及びＧ１．−ＲＧＤＦの凝集。天然のＧＦＰ（７０μｆ）を５μ／のＧ、−ＲＧＤＦビーズ（ｎ＝５）又はＧ、、□ＲＧＤＦビーズ（ｎ＝３）のいずれかと反応させた。他の実験において、Ｇ、−ＲＧＤＦビーズ（ｎ＝３）又はＧ、、−ＲＧＤＦビーズ（ｎ、＝２）を添加する前に、ＧＦＰはＡＤＰ（６，７ μＭ）で２２℃にて３０秒間予備処理した。プロットした値は、平均±ＳＥＭである。第１３Ａ図。モノクローナル抗体１０Ｅ５、Ａ　２　Ａ−及び７Ｅ３で予め処理したＰＲＰによる（Ｇ）＊　ＲＧ　Ｄ　Ｆビーズの凝集。実験は、２０μｇ／ｍｌの１ＯＥ５　（ｎ＝５）　、２０μｇ／ｍ１ＡｚＡｓ　（ｎ＝５）　、又は２０μｇ／ｍｌの７Ｅ３　（ｎ＝４）で３０〜６０分間予め処理したＰＲＰを用いて実施した。プロットした値は、平均±ＳＥＭである。第１３Ｂ図。モノクローナル抗体１０Ｅ５、Ａ　２　Ａ　ｅ、又は７Ｅ３で予め処理し、次いでＡＤＰで予め活性化したＰＲＰによる（Ｇ）。 −ＲＧＤＦビーズの凝集。実験は、ビーズを添加する前に血小板をＡ、ＤＰ（６，７μＭ）で３０秒間予め処理したことを除き、Ａのとおりに実施した。プロットした値は平均±ＳＥＭである。第１４図。概略図１＝トロンボ−赤血球の調製。第１５図。概略図２ニトロンポ一赤血球の調製。第１６図。概略図３・トロンボ−赤血球の調製のための２段階方法。５、発明の詳細な説明本発明は、本明細書で提示されているように、ＲＧＤを含有するペプチド又はポリペプチド（“ＲＧＤペプチド”）に結合した赤血球であり、そして、非活性化血小板ではなくて、活性化された血小板に選択的に結合することが可能であり、活性化された血小板及びトロンポー赤血球の共凝集（ｃｏ−ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を引き起こす、トロンボ−赤血球に関する。活性化された血小板への高度に選択的なこの結合は、活性化及び非活性化の両方の血小板にずっと少ない選択性で結合する、溶液中のＲＧＤペプチド又はビーズ表面の長いＲＧＤペプチドの態様とは対照的である。活性化血小板に対するトロンボ−赤血球の特異性は、外因性の活性化剤の非存在下においてインビトロで示すことができる（下記第８節）。本発明のトロンポー赤血球は、損傷部位に特異的な、インビボでの血小板の凝集を促進させるための豊富で安全な物質を提供することにより、従来の血小板代用物に関連する問題を克服する。こうして出血が制御でき、また、出血は防止し得る。自己由来のトロンボ−赤血球の投与を含む好適な一面において、従来方法において存在した感染性物質の伝播及び副作用となる同種異系免疫反応の可能性が排除される。トロンボ−赤血球は、赤血球に結合したペプチド中の特定の間隔を置いて配置されたＲ−Ｇ−Ｄ配列を介して活性化血小板に結合する。赤血球からＲＧＤペプチド内のＡｒｇのＮ−末端部までの距離は結合プロフィールに影響を与え、好適には約９から約５０オングストローム、より好適には約ｌＯから約４０オングストローム、及び最も好適には約１１から約２５オングストロームである。この距離は、ポリペプチド中のアミノ酸の伸長されたコンフォメーションを想定しつつ、標準の結合間隔を使用して直線分子として架橋剤及びＡｒｇのＮ−末端でのペプチド配列を考慮することにより推定される。この距離は、赤血球とリンカ−分子の間の共有結合から、結合の長さを含めて、Ｒ，Ｇ　Ｄペプチド中のＡｒｇのＮ −末端までのセグメントの長さを表わす。驚くべきことに、トロンボ−赤血球はまた、未処理の赤血球細胞のレオロジーから有意に異なることのないレオロジー特性を示す。さらに、本発明の好適な態様において、トロンポー赤血球は賢くべきことに、赤血球表面上のグリコホリンＡ及びグリコホリンＢに架橋結合した大多数のＲＧＤペプチドを有する。この点て、グリコホリンに対する特異的な結合は重要な利点を提供する。なぜならば、これは赤血球表面上に極めて多くのコピー数で存在しく赤血球表面上たり６００．０００から１００万）、これはＲＧＤペプチド−リンカ−の高度に効果的な結合を可能とするからである。さらに、グリコホリンは赤血球の生理学において規定しうる役割を有しないから、これは恐らく赤血球の生理的又は流動学的特性にゆがみを与えることなく、これに結合したＲＧＤ−ペプチドリンカ−をもつことかできる。本発明の他の態様において、抗体又は生理学的リガンドのようなターゲット指向性分子をトロンボ−赤血球又は赤血球に結合させることにより、ターゲット指向赤血球及びターゲット指向トロンボ−赤血球が提供される。好ましい一面において、ターゲット指向赤血球は担体赤血球であり、これは処理されてその内容物を放出しく赤血球の“ゴースト”を形成する）、そして、その膜を再び閉じる前に作用物質を取み入れ、その結果、それらの内部に加える作用物質のインビボ運搬体として使用することができる。本明細書で使用されるとき、“ターゲット指向性分子（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）”とは、赤血球（又はトロンポー赤血球）に結合することができ、そして、受容体又は他の認識分子又は細胞等に特異的な分子の如きインビボで見い出される分子に特異的に結合する分子のことをいう。特定の態様において、ターゲット指向性分子はペプチド、例えば、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｒ−Ｇ　−Ｄ　）配列を含有するペプチドである。かかるペプチドが第５．１．１節に記載されているものであり、そして第５．１節に記載されているとおりの赤血球に結合されたものであり、流動学的特性及び活性化血小板に対する特異性を細胞が維持することとなる態様において、この細胞はターゲット指向されたトロンボ −赤血球である。このようなターゲット指向トロンボ−赤血球は血栓中の活性化血小板と反応し、血栓のイメージング（ｉｍａｇｉｎｇ）又は血栓への治療剤の運搬を可能とする。しかしながら、ターゲット指向赤血球はトロンボ−赤血球である必要はない。他の態様において、ターゲット指向性分子は抗体、又は抗体のフラグメント、レクチン、ステロイド又は炭水化物である。例えば、同一のインビボの位置へ赤血球を指向させるために２個の異なった分子を使用することにより、２以上のターゲット指向性分子が使用しうる。５、ｌ、トロンボ−赤血球の調製トロンボ−赤血球を製造するために、本発明の方法に従ってポリペプチドが調製され、そして、下記にて記載される方法に従い多官能性分子を通して赤血球に共有結合される。しかし、なから、結合反応が完了したときに、通常のレオロジー特性及び血管の損傷部位で血栓を形成する血小板の特異性、即ち、活性化血小板と選択的に相互作用する能力の双方を保持することの特異な能力についてトロンボ−赤血球を試験しなければならないことに留意すべきである。本発明のトロンボ−赤血球により示されるレオロジー特性と未処理の赤血球のそれとの間に有意差がないことは、１以上の以下の特性においてトロンボ−赤血球と未処理の赤血球の間に有意差が存在しないことを検出することにより観測され得る二表面積／容積比、細胞内水分、及び／又は］ζ記の実施例８に記載されるとおりのレーザー回折エクタザイトメトリー　（ｅｋｔａ、ｃｙｔ。ｍｅｔｒｙ）又は本分野で既知の他の方法により試験しうるような膜剪断剛性。トロンボー赤血球が活性化血小板に選択的に結合する能力を示すために使用され得るインヒドロアッセイの例は第８．１．５及び８，１８節に記載されている。好適な一面において、本発明のトロンボ−赤血球は主にグリコホリンＡ及びグリコホリンＢを介して細胞表面に結合し、その結合したＲＧＤペプチドを介して活性化血小板上のＧＰＩＩｂ／ｌ１ｌａ受容体と相互作用する能力を有する。成る種の哺乳動物は、トロンポー赤血球を製造するための赤血球を提供しうる。ヒト及びサルの赤血球は使用するのに好適であるー・方、ヒヒ、犬及びラットの赤血球は有用でないように思われる。赤血球は当該分野で既知の方法により精製かつ濃縮可能である。限定されるものではないが、典型的には実施例の方法により、血液を患者から取り出し、クエン酸のような抗凝固剤に添加する。次いて血液を遠心分離し、血漿上澄みをピペットにより除き、赤血球を残す。約ｐ１１６から約ｐ）１８の緩衝液及び約０．１５Ｎのイオン強度の緩衝液、好ましくはリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を添加し、混合物は赤血球を洗うために再び遠心分離される。この方法は、赤血球が十分に純化される迄、数回繰り返される。しかしながら、赤血球の破損を避けるために、洗浄工程は最小限に保たれる。ポリペプチド及び赤血球は、次いで、それぞれ多官能性分子に共有結合される。有機溶媒に感受性の赤血球の溶解を避けるためにすべての操作は好ましくは水溶液中で実施される。ｐＨは６から８の間、好適には６．５と７．５の間にずべきである。各々の型の基と直接に反応するヘテロニ官能性の架橋剤を使用するのが好まし、い。良好に作用するヘテロ三官能性試薬はＭａｌ〜５ａｃ−ＨＮＳＡ　（１−ヒドロキシ−２−ニトロベンゼンー４−スルホン酸ナトリウム塩のＮ〜マレイミド −６−アミノカプロイルエステル）であり、これはバケムバイオサイエシス社（Ｂａｃｈｅｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ。Ｉｎｃ）、フィラデルフィア、ＰＡから入手しうる。得られた細胞について、本発明のトロンボ−赤血球に関連する流動特性及び活性化血小板への結合の特異性に関して試験する限りにおいて、当該分野で既知の他の架橋剤を使用することかでき、下記の第５．１．２節に記載される。当初は、ＲＧＤペプチド及び赤血球を多官能性分子に添加する順序は重要でないと考えられていた。従って、当初は第６節で示されるように、３つの成分は単純に１つの反応混合物中で組み合わされた。第６節に記載されている一段階反応の動力学は、本発明のトロンボ−赤血球が製造され、それらは活性化血小板に結合することを示した。しかしながら、一段階反応の動力学は、この一段階方法が予測（７えないことを示している。第１に、赤血球のスルフヒドリル（チオール）基は、ペプチドのスルフヒドリル（チオール）基とＭａ、　ｌ−８ａｃ−）ＩＮＳＡリンカ−の間の所望の反応よりはむしろ、Ｍａｌ−３ａｃ−ＨＮＳＡリンカ−と反応することが可能であった。赤血球細胞表面タンパク質の架橋か生したのであろう。この可能な競合的で望ましくない反応は赤血球を傷つけ、そして、ペプチドに結合させるために利用可能なリンカ−を減するであろう。したかって、より好適な二段階方法か工夫され、概略図３　（第１６図）に示されるとおりに試験され、第７節に記載される。好適な一段階方法において、ＲＧＤポリベプヂドーリンカーは最初別個に調製され、次いて赤血球上のタンパク質と反応する。例えば、これは次のようにして実施しうる：赤血球を約ｐＨ７，４において緩衝液中に維持する。これは赤血球の浸透圧による損傷を防く。ポリペプチド−リンカ−は別個に約６．０のｐＨで調製される。ペプチドスルフヒドリルをリンカ−と結合させた後、反応溶液のｐＨを約７，４に上げる。ｐＨ７，４における溶液中のペプチド−リンカ−複合体は赤血球の懸濁液に添加することができ、こうして、赤血球タンパク質上の遊離アミノ基をリンカ−の第２の反応基と反応させる。ペプチド−リンカ−複合体は凍結乾燥し、後の使用のために保存できる。別法として、ペプチド−リンカ−複合体は、通常の化学的方法により、ペプチド合成の後で連続する工程として架橋基を結合させることで化学的に合成される。ペプチドに結合するリンカ−が、赤血球の反応性官能基への結合に利用できる結合箇所を有する限りにおいて、この複合体は本発明において適切である。特定の面において、ＲＧＤペプチド−リンカ−中間体は後で赤血球に結合させるために保存しうる。赤血球のＲＧＤペプチドの密度が血小板との反応を支持しつるのに十分高くなることを確保するために、ペプチドは赤血球に対して大いにモル過剰に添加されなければならない。例えば、赤血球に添加されるＲＧＤペプチドのモル過剰は、約０．５ＸＩＯ”から約２０Ｘ］、０”、好適には約ｌＸｌ０”から約１０ＸＩＯ ’、そしてより好適には約３Ｘ１．０”から約７ＸＩＯ’とすべきである。好ましくは、各赤血球に結合するポリペプチドの数は、０．０１　Ｘ　ｔｏ’程度の少ない結合がなされたポリペプチドも官能性のトロンボ−赤血球を生成可能ではあるが、約０．０５　Ｘ　１０’、好適には約ｌＸｌ０’から約２０Ｘ１０’までとすべきである。結合反応が完了した後で、好適には過剰の架橋剤は完全に洗浄することにより除去される。さらに、残りの反応部位に反応させるため洗浄工程の間にアルブミン又は自己由来の血清が添加され、次いで洗浄工程で除去される。赤血球はその表面にアミノ基及びスルフヒドリル基をともに有する。これらの基のいずれも多官能性分子の官能基の一つと共有結合を形成させるために使用しうる。別法として、カルボキシル基が、例えばカルボジイミド活性化により、多官能性分子の１つの官能基に共有結合を形成させるため使用することができる。多官能性分子の他の官能基はＲＧＤペプチドに共有結合させる。好適には、アミノ基が通常多官能性分子に結合するであろう。特定の一面において、ＲＧＤペプチドの結合部位がシスティンである場合には、アミノ基とスルフヒドリル基のいずれかが多官能性分子に結合しうる。結合がスルフヒドリル基に行われる場合には、アミノ基は例えばアセチル化により保護されるべきである。（本頁以下余白）５　、１．１．本発明のＲＧＤペプチド本発明に従って赤血球と結合させるためのＲＧＤペプチドは、好ましくは天然に存在するＩ７−アミノ酸およびグリシンからなるアミノ酸配列で、次の式（１）で示される。Ｒ，−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｒｔ ■ 〔式中、Ｒ１は１つのアミノ酸または２以上のアミノ酸の配列を表し、特定の実施例では、Ｒ５はＸＹ（Ｚ）ｎ、ここでＸ、ＹおよびＺはそれぞれ個別に１つのアミノ酸を表し、ｎは０またはｌを表す；Ｒ７はＯＨ，Ｎ１１２またはアミノ酸のどれか、もしくは２以上のアミノ酸の配列を表す。特定の実施例では、Ｒ２はセリン、トレオニンおよびシスティン以外のアミノ酸、またはそれらのアミドを表す。もう一つの実施例では、Ｒ９は２以上のアミノ酸で、Ａｓｐに結合している配列の最初のアミノ酸がセリン、トレオニンおよびシスティン以外のものか、または任意の遊離カルボキシル基のアミドを表す。〕式Ｉにおいて、Ｒ５およびＲ２は任意のアミノ酸またはそれらの配列でよい。アミノ酸は天然に存在するものが好ましい。最も一般的な天然に存在するアミノ酸を表１に示す。（本貫以下余白）表　■ 天然アミノ酸およびその略号しかし、式ＩにおけるＲ１およびＲ２は２０の天然アミノ酸に限定されるわけてはない。他の例では、Ｒ１およびＲ２は非古典的アミノ酸または環状ペプチドもしくは擬態ペプチド（化学的ペプチド類似体）でもよい。非古典的アミノ酸には次のものがあるが、これに限定されるわけではない；一般のアミノ酸のＤ−異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システィン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロへキシルアラニン、β−アラニン、そしてβ−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸や一般的なアミノ酸類似体のような修飾アミノ酸。さらに、ＲＧＤ配列中のＡｒｇおよび／またはＡｓｐはＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）アミノ酸のどちらでもよい。Ｒ，がＸＹ（Ｚ）、である特定の例において、Ｘはどのアミノ酸でもよく、特にバリンである必要はない。好ましくはＸは天然に存在するアミノ酸がよく、最も望ましくはシスティンまたはグリシンがよい。特定の例において、Ｙはどのアミノ酸でもよく、特にトレオニンである必要はない。好ましくはＹは天然に存在するアミノ酸がよく、最も望ましくはグリシンがよい。特定の例において、Ｚはどのアミノ酸でもよいが、好ましくは天然に存在するアミノ酸がよい。Ｚは好ましくはグリシンがよいが、Ｘがバリンを、および／またはＹがトレオニンの場合、Ｚはグリシンである必要はない。上に述べたように、Ｒ２はＯ）ＩまたはＮＯ３でもよい。他の例において、Ｒ２は１つのアミノ酸でもよく、好ましくは天然に存在するＩ７−アミノ酸またはグリシンがよい；特定の例において、Ｒ２はセリン、トレオニンおよびシスティン、そしてそれらのアミドを表さない。好ましい例において、Ｒ７はフェニルアラニンまたはフェニルアラニンのアミドを表す。さらに別の例ではＲ２は１以上のアミノ酸の配列でよいが、特にＡｓｐのカルボキシル官能基に接する、最初のアミノ酸がセリン、トレオニンおよびシスティン、そして配列中のいずれかの遊離カルボキシル基とのアミド以外のものであればよい。Ｒ２がアミノ酸の配列である場合、配列中のアミノ酸の数に必ずしも制限はない。さらに、赤血球に結合させるポリペプチドはどんな大きさでもよく、オリゴペプチドまたはタンパク質の範鴎に入るものも含まれる。好ましくは、ポリペプチドはアミノ酸数がおよそ１０００以Ｊｌこならないほうがよい。まとめて述べると、Ｒ，およびＲ７ともに、−上述したアミノ酸の配列を表す。特定の例において、Ｒ２はセリン、トレオニンおよびシスティンでない。好ましい具体例とＬ５て、例えばＲ，がＸＹ　（Ｚ）ゎの場合、Ｘはシスティンまたはグリシンを表し、Ｙはグリシ゛ノ、Ｚはグリシンを表す。さらに好ましい例として、Ｘがシスティンまｔ、−はグリシンを、Ｙがグリシン、Ｚがグリシンを表し、Ｒ７がフェニルアラニンまたはフェニルアラニンのアミドを表す。最も好ま（１、い例では、ＸがＳ／スティン、Ｙがグリシン、Ｚがグリシン、Ｒ７がフェニルアラニンのアミドを表す、。Ｒ１がＸＹ（Ｚ）、のとき、Ｘ、ＹおよびＺが任意のトリペプチド配列を表すことがある。このトリペプチドはＶａｔ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙである必要はない。ポリペプチドは当技術分野で知られた方法によって調製することができる。簡単に例を示すと、固相ペプチド合成法は、Ｃ−末端アミノ酸のカルボキシル基をある樹脂にカップリングさせ、続いて、Ｎのα位を保護したアミノ酸を添加することからなっている。保護するための基は当技術分野で知られた任意の、または以下の章、５．１．２で述べるものでよい。ペプチド鎖を延長するために、新しい別のアミノ酸を添加する毎に、その前に添加したアミノ酸の保護基を除去する。アミノ酸を適切な樹脂にカップリングさせる方法は、Ｒｉｖｉｅｒその他により、米国特許第４２４４９４６号に述べられている。こうした固相合成法は、例えばＭｃｒｒｉｆｉｅｉｄ、　１９６４゜Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　８５：　２１４９；　Ｖａｌｅその他、　１９８１．５ｃｉｅｎｃｅ　２１３：１３９４−１３９７；　Ｍａｒｋｉその他、　１９８１．　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓａｃ、　１０３：　３１７８および米国特許第４３０５８７２号および第４３１６８９１号に述べられている。５．１．２．架橋剤ポリペプチドは多官能性分子、すなわち多官能性架橋物質を介（７て赤血球に結合される。ここで使用される用語“多官能性分子“には、１以上の反応性基を有している分子の他に、ホルムアルデヒドのような、単官能基でもｌ官能基が１回以上連続して反応することのできる分子も含まれる（ただしホルムアルデヒドは発癌性を有するため、使用することはない）。ここで使用される用語“反応性基 ”は、架橋物質上の官能基であって、架橋物質とペプチドまたはタンパク質問に共有結合を形成するため、ペプチド、タンパク質または炭水化物上の官能基と反応する基を表す。用語“官能基”は、有機化学における通常の意味である。使用することのできる多官能性分子は生物適合性の架橋物質、すなわち１ｎｖｉｖｏで非発癌性、非毒性、そして実質的に非免疫原性のものである。当技術分野で知られたもの、およびここで述べられる多官能性架橋物質は、動物試験を行なって簡単に生物適合性を調べることができる。多官能性分子は好ましくは２官能性がよい。ここで使用される用語“２官能性分子”は２つの反応性基を有する分子を意味する。２官能性分子にはへテロ２官能性またはホモ２官能性がある。好ましくは、２官能性分子はＲＧＤペプチドと赤血球を方向性を有して結合させることのできる、ヘテロ２官能性がよい。多官能性分子は、ポリペプチドおよび基質とｐＨ６〜８緩衝水溶液などの水溶液中で反応させるため、十分に水溶性であることが特に望ましい。典型的な例では、多官能性分子はポリペプチドのＸおよび赤血球の表面のアミノまたはスルフヒドリル基と共有結合する。しかし、本発明では、カルボン酸またはヒドロキシル基のような他の官能基と反応性のある多官能性分子をも意図している。ホモ２官能性分子は少なくとも２つの同じ反応性官能基を有している。ホモ２官能性分子上の反応性官能基には、例えばアルデヒド基や活性エステル基がある。アルデヒド基を有するホモ２官能性分子には、例えばゲルタールアルデヒドやスバラルデヒド（ｓｕｂａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）を含んでいる。架橋剤としてのゲルタールアルデヒドの使用について、Ｐｏｚｎａｎｓｋｙらにより、５ｃｉｅｎｃｅ　２３．１３０４−１３０６（１９８４）に述べられている。少なくとも２個の活性エステル単位を有するホモ２官能性分子には、ジカルボン酸およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドのエステルを含んでいる。これらＮ−スクシンイミジルエステルの例として、ジスクシンイミジルスペレートおよびジチオ−ビス−（スクシンイミジルプロピオネート）、そしてこれらの可溶性のビススルホン酸、およびナトリウム塩やカリウム塩なとのビススルホン酸塩がある。これらのホモ２官能性試薬はＰｉｅｒｃｅ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ。１！ｌ１ｎｏｌｓより入手できる。ヘテロ２官能性分子は、少なくとも２個の異なる反応性基を有している。この反応性基は、ペプチド上および赤血球の表面のタンパク質上の異なる官能基と反応する。反応性基と反応するペプチドおよび赤血球タンパク質の異なった２つの官能基は通常、アミノ基、例えばリシンのεアミノ基、およびスルフヒドリル基、すなわちシスティンのチオール基である。しかし、ペプチドおよび赤血球タンパク質上のカルボン酸およびヒドロキシル官能基もまた、架橋物質と反応することができる。ヘテロ２官能性分子の反応性基がアミノ基と共有結合する場合、その共有結合は通常アミドまたはイミド結合である。アミノ基と共有結合する反応性基は、例えば活性化されたカルボキシレート基、ハロカルボニル基またはエステル基である。好ましいハロカルボニル基はクロロカルボニル基である。エステル基は好ましくは例えばＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル基またはＭａｌＳａｃ−ＨＮＳＡの開基である。他の典型的な官能基は、チオール基、チオール基に変化しうる基またはチオール基と共有結合を形成する基のいずれかである。この共有結合は通常チオエーテル結合またはジスルフィドである。チオール基と共有結合を形成する反応性基は、例えばチオール基と反応する二重結合または活性化されたジスルフィドである。チオール基と反応しうる二重結合を有する反応性基には、マレイミド基がある。ただし、アクリルニトリルなどの他の基でもよい。反応性ジスルフィド基には、例えば２−ピリジルジチオ基または５．５゛−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）基でもよい。反応性ジスルフィド結合を有するヘテロ２官能性試薬の例には、次のものが含まれる二Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ビリジルージチオ）プロピオネート（Ｃａｒｌｓｓｏｎ他、　１９７８．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、　１７３：　７２３−７３７）、ナトリウム−３−４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α− メチルベンジルチオスルフェート、および４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−（２−ピリジルジチオ）トルエン。Ｎ−スクシンイミジル３− （２−ピリジルジチオ）プロピオネートが好ましい。チオール基と反応する二重結合を有する反応性基を含むヘテロ２官能性試薬の例としては、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートおよびスクシンイミジル−ｍ−マレイミドベンゾエートが含まれる。他のへテロ２官能性分子には、スクシンイミジル−３−（マレイミド）プロビオネートスルフォスフシンイミジル−４−（ｐ−マレイミド−フェニル）ブチレート、スルフォスフシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチルシクロヘキサン） −１−カルボキシレート、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステルが含まれる。スクシンイミジル−ｍ−マレイミドベンゾエートのスルフオン酸ナトリウム塩が好まい１゜上

【こ述べたヘテロ２官能性試薬およびそれらのスルフォン酸塩の多く（′！、Ｐｉｅｒｃｅより入手てきる。これらおよび他の他官能性試薬の製造および使用に関して、次の文献または当技術分野で入手しうる他の文献により、さらに情報を得ることができる：Ｃａｒｌｓｓｏｎ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９７８．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　１７３：　７２３−７３７゜Ｃｕｍｂｅｒ、　Ｊ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　［＋ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１１２：　２０７−２２４゜Ｂｌａｔｔｌｅｒ、　Ｗ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　ｆ９８５．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２４：　１５１７−１５２゜Ｌｉｕ、　Ｆ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９７９．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１８：６９０−６９７゜Ｙｏｕ！ｅ、　Ｒｊ、　ａｎｄ　Ｎｅｖｉｌｌｅ、　Ｄ、Ｍ、　Ｊｒ、、　１９８０．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７７：　５４８３−５４８６゜Ｌｅｒｎｅｒ、　Ｒ，Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８１．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　Ｕ、Ｓ、Ａ。７８：　３４０３−３４０７゜Ｊｕｎｇ、　Ｓ、Ｍ、　ａｎｄ　Ｍｏｒｏｉ、　Ｍ、、　１９８３．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｔｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ７６１：１６２゜Ｃａｕｌｆｉｅｌｄ、　Ｍ、Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　８１：　７７７２−７７７６゜５ｔａｒｏｓ、　Ｊ、Ｖ、、　１９８２．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２１：　３９５０−３９５５゜Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｔ、、　１９７９．　Ｆｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０１：　３９５−３９９゜Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８２．　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９２：　１４１３−１４２４゜Ｐｉｌｃｈ、　Ｐ、Ｆ、　ａｎｄ　Ｃｚｅｃｈ、　Ｍ、Ｐ、、　＋９７９．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。２５４：　３３７５−３３８１゜Ｎｏｖｉｃｋ、　Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２＋　８４８３−８４８７゜Ｌｏｍａｎｔ、　Ａ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｆａｉｒｂａｎｋｓ、　Ｇ、、　１９７６、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１０４：２４３−２６１゜Ｈａｍａｄａ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｔｓｕｒｕｏ、　Ｔ、、　１９８７．　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１６０：　４８３−４８８゜Ｈａｓｈｉｄａ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４．　Ｊ、　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｔｏｃｈｅｍ、　６：　５６−６３゜さらに、架橋方法について、ＭｅａｎｓおよびＦｃｅｎｃｙ、　１９９０．　Ｂｉ。ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、　Ｃｈｅｍ、　１　：　２−１２で検討されている。ヘテロ２官能性試薬を介して、ペプチドを基質に結合させる代表的な戦略を、概略図１および２　（それぞれ図１４および１５）　Ｇこ示しである。概略図１において、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）がＲＧＤペプチドで処理される。ポリペプチドのＸ上の遊離のアミノ基１個力（スクシンイミジルオキシ基と置換し、対応する３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル（ＦＤＰ）アミドを形成する。２−ピリジルジチオ基が例えばジチオトレイトールで開裂されて、対応するチオプロピオニル（ＴＰ）アミド（ｎ）が形成すると考えられる。次に、５ＰＤＰを少なくとも１個のアミノ基を有する赤血球で処理して、対応するＰＤＰアミド（ｎ［）を形成する。遊離のスルフヒドリル基を有する■を、スルフヒドリル基と二重結合を形成する基、すなわちピリジルジチオ基を有する■で処理して、２つの多官能性分子を介してペプチドが基質（赤血球タンノくり質）に共有結合している化合物（ＩＶ）を生成する。概略図２において、本発明のポリペプチドがスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート　（ＳＭＣＣ）で処理され、対応するＮ−マレイミドメチルシンクロヘキサン−１−カルボキシレートアミド（Ｖ）を生成する。 ■が赤血球表面のタンパク質の遊離のスルフヒドリル基と反応し、多官能性分子を介してペプチドと赤血球が共有結合した化合物■となる。好ましくは、ＳＭＣＣの代わりにＭＡＬ−３ａｃ−ＨＮＳＡが用いられる。本発明のポリペプチドのスルフヒドリル基を多官能性試薬に結合させることも可能である。これはＸはシスティンのときに生じ得る。このような場合で、多官能性分子がスルフヒドリル基と同様にアミノ基とも反応するヘテロ２官能性分子であるときには、システィン残基の遊離のアミノ基は保護される。この保護基は当技術分野で知られている多数の保護基の中のどれでもよい。例えば、ポリペプチドを無水酢酸で処理して遊離のアミノ基にアセチル基を付加してもよい。または、ポリペプチドをカルボベンゾキシクロライドで処理して、カルボベンゾキシ基を付加してもよい。他の有用なＮ−保護基として、ホルミル、Ｌ−ブトキシカルボニル−、トリフルオロアセチル−、トシル−１ｐ−ニトロカルボベンゾキシ−、シクロペンチルオキシカルボニル−１およびフェノキシカルボニル基がある。５．２．出血の制御のためのトロンポー赤血球の使用本発明のトロンボ−赤血球は、ｉｎ　ｖｉｖｏで出血の制御のために使用することができる。特に、トロンポー赤血球はヒトを含む哺乳動物の血小板減少症患者の軽傷からの出血の制御のために使用することができる。好ましくは、出血制御には自己由来のトロンポー赤血球が投与される。あまり好ましくはないが、同種異系の投与でもよい。特定の実施例において、哺乳動物の体重１ｋｇあたり０．２８６−３．５７ｍ１の血液を採取する。次に赤血球を洗浄し、濃縮する。洗浄した赤血球を、上記量５．１で述べたように、多官能性分子を介して、ＲＧＤペプチドに共有結合させる。その結果生成したトロンボ−赤血球を、普通の輸血方法によって、哺乳動物中に入れる。一実施例では、本発明のトロンポー赤血球は、血小板減少症の治療、すなわち、患者の不足血小板を増加させるのに、使用される。他の例では、本発明のトロンポー赤血球を、例えば、外傷に際し、または外科手術中、出血の制御を助けるために、ヒトを含む哺乳動物中に入れる。哺乳動物への投与のためのトロンボ−赤血球は、Ｆ記章５．４で述べるように医薬組成物とすることが望ましい。トロンボ−赤血球は哺乳動物に対して、静脈または動脈ポーラス注射により、または静脈点適により、投与することができる。投与するトロンボ−赤血球の数、すなわち投与量は、哺乳動物の血小板減少症の程度によって決まるもので、当技術分野の専門家によ−）て、ケースバイケースで決定される。好まし、くは、トロンポー赤血球の数は、健康体に比較した血小板減少患者の血小板数の不足分を補う量である。（本頁以Ｆ余白）５．３．ターゲット指向担体赤血球本発明によると、本発明に従って調製された赤血球または特にトロンポー赤血球を修飾して担体赤血球を形成するように赤血球に組み込まれている（すなわち赤血球ゴーストに取り込まれる）標識または生物学的に活性な薬剤を種々の標的組織に送達する。一実施態様において、担体赤血球は担体トロンポー赤血球である（すなわち、細胞内含有物が標識または薬剤を含む組成物により置換され、続いて膜が再密封されたトロンポー赤血球）。担体赤血球はその大きなサイズ（マクロファージのようなスカベンジャー細胞によるリポソームの非特異的エンドサイト−シスの問題を回避し、そして、例えば低浸透圧条件下での完全な浸透性溶解から赤血球を保護する広範囲にわたる細胞骨格が存在するので）によりリポソームよりも有利である。さらに、赤血球の細胞表面膜内在性タンパク質はターゲラ）・指向性分子を架橋するための便利な足場を提供する。さらに重要なことは、赤血球は本質的に生物学的適合性があるので、担体赤血球もまた生物学的適合性があるように思われる。５　、３．１．　ターゲット指向送達のための材料多数の異なる分子、巨大分子または巨大分子材料を特定のターゲトに送達するために本発明の担体赤血球に組み込むことができる。一実施態様において、画像剤を担体赤血球に組み込める。画像剤は重金属、Ｘ線画像のためのコントラスト剤、磁気共鳴画像剤および放射性画像のための放射性核種（すなわちアイソトープ）を含むがこれらに限定されない。別の実施態様において、担体赤血球を１またはそれ以上の治療剤と共に与えることができる。例えば、限定するものではないが、治療剤は化学療法剤、酵素、神経毒、成長因子、神経栄養性因子、ホルモン、血栓溶解剤または任意の薬剤である。一般に、必要とする部位への薬剤の特異的なターゲット指向性は、さらに効果的な治療となる。なぜなら、より多い治療用量が全身的に寛容し得る以上に送達されるからである。例えば、より多い用量の化学療法剤が生物（例えばヒト）により全身的に寛容される以上に腫瘍に局部的に送達される。別の実施例において、血栓溶解剤を全身的に投与された場合制御不可能な出血を招くような濃度で血栓症の部位に投与することができる。別の実施態様において、担体赤血球を核酸配列と共に与えることができる。例えば、限定するものではないが、核酸はターゲット細胞への送達のためのアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡである。別の実施態様において、核酸は例えば遺伝子療法のための遺伝子または受精のための全ゲノムのような遺伝子情報である。担体赤血球を精子と共に与えるかまたは精子と融合して精子ハブロイドゲノムを得る。さらに別の実施態様において、担体赤血球はプラスミド、または修飾ウィルスまたは送達のためのターゲット指向のウィルス核酸を含む。５　、３．２．　ターゲット指向性分子本発明はターゲット指向性分子を赤血球または赤血球ゴーストと結合することを提供する。ここで用いられる“ターゲット指向性分子”とはｉｎ　ｖｉｖｏで投与された場合所望の場所に局在化する分子を意味する。上記５．１．２．項に記載された赤血球とペプチドの結合のためのクロスリンカ−を用いてターゲット指向性分子と赤血球を結合する；さらに、担体でないトロンボ−赤血球とは対象的に、担体赤血球や担体トロンボ−赤血球は赤血球を制御する流動学的性質を保持する必要はない。材料を担体赤血球に導入する前かまたはその後にターゲット指向性分子を赤血球と結合する。種々の実施態様において、ターゲット指向性分子またはペプチド、タンハク質、抗体、レクチン、炭水化物またはステロイドである。一実施態様において、ターゲット指向性分子はターゲット細胞上のレセプターのペプチドリガンドである。特定の実施態様において、ターゲット指向性分子は上記５．１．１．項に記載されたペプチド配列であるかまたはその変異体である（それは例えば内皮細胞、癌細胞、または卵（例えばＲＧＤ配列を認識するレセプターを有するヒトの卵）のような細胞の表面上のレセプターと結合する）。担体トロンボ−赤血球の使用に関する特定の実施態様において、ターゲット指向性分子は上記に記載されているように付着されたペプチドＲ１−ＲＧＤ−Ｒ，であり、赤血球ターゲット指向性薬剤を血栓溶解剤と共に与えるそのようなトロンボ−赤血球は活性化血小板を標的とするので特に血栓症の治療に有用である。別の実施態様において、ターゲット指向性分子は抗体である。好ましくは、ターゲット指向性分子はモノクローナル抗体である。一実施態様において、赤血球との架橋を容易にするために抗体を２つのＨ鎖およびＬ鎖の異種二量体を還元するか、またはＦ　（ａｂ’　）　ｔフラグメントを還元して還元スルフヒドリルを介して赤血球と架橋する。別の実施態様において、抗体の炭水化物部分を赤血球またはトロンボ−赤血球との付着のために直接または誘導体を介して利用できる。ターゲット指向性分子として用いられる抗体は細胞表面抗原に特異的である。一実施態様おいて、抗原はレセプターである。例えば、メラノーマ細胞のような癌細胞のレセプターに特異的な抗体を用いることができる。別の実施態様において、例えばリンパ球抗原、ＣＤ（クラスター分化）抗原およびレセプター（例えばＴ細胞抗原レセプター）のような白血球表面抗原に特異的な抗体を赤血球ゴーストと結合することができる。細胞抗原に特異的な、当業者に知られているいかなる抗体もターゲット指向性分子として用いることができる。所望の抗体が入手できない実施態様において、その抗体を調製できる。当業者に知られている種々の方法を赤血球を修飾するのに用いられる標的抗原に特異的な抗体の産生のために用い、ターゲット指向赤血球を調製することができる。そのような抗体はポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単一鎖、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーを含むがこれらに限定されないのであるが、モノクロ−カル抗体またはそのフラグメントが好ましい。抗体の産生に関して、ウサギ、マウス、ラット等を含むがこれらに限定されない種々の宿主動物を標的抗原マーカーを用いた注射により免疫化する。一実施態様において、標的抗原を免疫原性担体に結合する。別の実施態様において、標的抗原エビ）−ブ（例えばハプテン）をキーホール・リムペット・ヘモシアニンのような担体に結合する。ここで用いられているように、“エピトープは特異的免疫活性（例えば抗体結合）能力のある抗原のフラグメントである。宿主の種によるが、例えばフロイント　（完全および不完全）水酸化アルミニウムのような無機質ゲル、リゾレシチン、プルロックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、ジニトロフェノールのような界面活性剤およびＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ− Ｇｕｅｒｉｎ）やＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍのような有用なヒトアジュバントとなりうるちのを含むがこれらに限定されない種々のアジュバントを用いて免疫応答を増加させる。標的抗原に対するモノクローナル抗体は培養した連続継代細胞株による抗体分子の産生を提供する、任意の方法を用いることにより調製できる。これらは、Ｋｏｈｌｅ、ｒおよびＭｉｌｓｔｉｎ（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ２５６：　４９５− ４９７）により最初に記載されたハイブリドーマ法、さらに最近のＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３＋　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　４：　７２）およびＥＢｖハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ　ｅｔ　ａｌ、。１９８５、　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　ＴｈｅｒＦＬｐｙ、　Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｊｓｓ、Ｉｎｃ、、　ｐｐ、７７ −９６）を含むがこれらに限定されない。本発明の別の実施態様において、標的抗原に特異的なモノクローナル抗体を最近の技術（ＰＣＴ／ＵＳ９０１０２５４５）を用いて無菌動物中で産生ずる。本発明によるとヒト抗体を用い、ヒトハイブリドーマ（Ｃｏｔｅ　ｅｔａｌ、、　１９８３．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８０：　２０２６−２０３１１）を用いることによりまたはｉｎ　ｖｉｔｒｏでヒトＢ細胞をＥＢＶウィルスで形質転換すること（Ｃｏｌｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　ｉｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ、　Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　ｐｐ、７７− ９６）により得ることができる。事実、本発明による、標的抗原に特異的なマウス抗体分子からの遺伝子を適切な生物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と接合させることにより“キメラ抗体″（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８４．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８１：　６８５１−６８５５；　Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８４．　Ｎａｔｕｒｅ　３１２：　６０４−６０８；　Ｔａｋｅｄａｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　Ｎａｔｕｒｅ　３１４：４５２−４５４）の産生のために開発された技術を用いることができる；そのような抗体はこの発明の範囲内である。本発明によると、単一鎖抗体（米国特許第４．９４６．７７８号）の産生のために記載された方法を採用して標的抗原特異的単一鎖抗体を産生できる。本発明の別の実施態様はＦａｂ発現ライブラリー（Ｈｕｓｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．５ｃｉｅｎｃｅ　２４６：　１２７５−１２８１）の構築のために記載された技術を用いて、標的抗原に所望の特異性を有するモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントの迅速て簡単な同定を可能にする。標的抗原に特異的な部位を含む抗体フラグメントを既知の技術により産生ずる。例えば、そのようなフラグメントは、抗体分子のペプシン消化により生成されるＦ　（ａｂ’　）　２フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成されるＦａｂ’　フラグメントを含むがこれらに限定されない。好ましくは還元フラグメントを用いる。なぜならこれらはそのスルフヒドリル基を介して赤血球タンパク質と結合できないからである。本発明はさらに赤血球と結合した例えばレクチン、炭水化物、タンパク質およびステロイドのような他のターゲット指向性分子の使用を提供する。５　、３．３．担体赤血球の調製ターゲラ上指向性のために本発明を用いることに重要となるのは赤血球の一時的に“漏出”する能力である。これらの修飾赤血球を漏出することによりその中身を放出し所望の分子、小さな細胞、例えば精子、ウィルス、薬剤または変異した遺伝子材料を取り込む；その後で赤血球は再密閉される。当業者によく知られているように、この方法に対する多くの改変法およびパリニージョンを用いることができ、従って本発明は全てのそのようなバリエーションを含むものと意図される。赤血球を上記５．１１項に記載されたように調製することができる。任意の哺乳動物がそのような赤血球の源となる。選択された標的組織に搬送するために分子を赤血球に組み込むために、当業上知られている任意の方法を用いて赤血球からその中身を漏出させて（すなわち赤血球ゴーストを調製）続いて再密閉される前に新しい分子を取り込む。そのような方法は次の参考文献に記載されている＝　（社説）、１９８８．　Ｌａｎｃｅｔ　ｐｐ、１４３７−４４３８；　Ｂ＋’ｅａｒｌｅｙら、ｉｎｏ。Ｊ、Ｐｂａｆｒｎ、Ｐｈａｒ’ｍａｃｏｌ　４２：　２９７−３０７；　Ｔｏｎｅｔｔｉら、１９９０．　Ｂｉｏｔｅｃｈ。Ａｐｐｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１２：　２６’ｌ−２６９；　ＵｐｄｉｋｅおよびＲｏｋａｎｉａ、　１９８３．　Ｊ。Ｌａｂ、Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、ｐｐ、６７９−６９１；　Ｒａｍ５ｅｙら、１９８６．　Ｃｌ１ｎ、Ｒｅｓ、３４：４６８Ａ。一実施態様において、限定するのではな〈実施例として次の方法を用いることができる：再密閉した赤血球をＳｏｄｉｕｍ　ｐｕｍｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ＡＴＰ：ＡＤＰ　ｅｘｃｈａｎｇｅ：Ｔｈｅ　５ｉｄｅｄ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｓｏｄｉｕｍ　ａｎｄ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍｉｏｎｓ”、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＧｅｎｅｒａｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　８０：　９ｉ５−９３７（１９８２）においてＫａｐ　ｆａｎにより記載された方法および“Ｖｏｌｕｍｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　Ｋ　１ｎｆｌｕｘ　ｉｎ　ｈｕｍａｎｒｅｄ　ｃｅｌｌ　ｇｈｏｓｔｓ”、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、　９２：　６８５−７Ｎ（１９８８）において５ａｃｈｓにより記載された方法と同様のゲル濾過法により調製した。修飾した細胞を血漿から分離し、ｌ・リス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）でｐＨ５，５に調整された、０．ｉｍＭＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）およびｉｏｍＭ　Ｐ　Ｉ　ＰＥＳ　（ピペラジン−Ｎ−Ｎ“−ビス（２− エタンスルホン酸）を含む１５０ｍＭ塩化コリン液で洗浄した。細胞を細胞懸濁物のｐＨが６゜Ｏになるまで繰り返し洗浄した。続いて細胞を洗浄液中で５０％へマドクリットにし、カラムに通すまで氷上に保存した。カラムは４５Ｘ’１０ｃｍであり旧ｏ　Ｇｅｌ　Ａ５０ビーズ（Ｂｉｏ　Ｒａｄ　Ｉｎｃ。Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　Ｃｅｒｉｔｅｒ、　ＮＹ）を充填（７てあり、床容量は３５リットルである。カラムは冷水筒で包み約１℃に維持する。ゲルを７０ｍＭＰ　Ｉ　Ｐ　Ｅ　Ｓ、’１１．２ｍＭ塩化コリンおよび０．ｉｍＭＥＤＴＡを含む溶液で平衡化する。その溶液をトリス（緩衝液Ａ）でｐＨ６，０に調整する。トロンボ−赤血球ゴーストを調製するために、その塩化コリン濃度が１５０ｍＭ（緩衝液Ｂ）であること以外は緩衝液Ａと同し溶液２００ｍ１をカラムに通（７、続いて細胞懸濁物７５７５−１Ｏ０通ず。細胞はカラムで溶血（〜（ヘモグロビンや他の材料等の中身を漏出引る）、細胞内容物はビーズにより保持される。ゴーストを緩衝液Ｂて溶出（７、水−して集める。ぞれらを遠心分離（４０，０００ｇで１０分間）と−上清の吸引により濃縮し、１本または２本のチューブに集め緩衝液Ａ中に再懸濁する。ゴーストを再び遠心分離（７、■−清を取り除き、ゴーストを再密閉液に分注４る。これらは２％量（ゴースＩ・を含む最終量）の５００ｍＭ　ｈリスＨＥＰＥＳ　（４−ｆ：２−ヒドロキシメチル〕−１−ピペラジンエタンスルホン酸）液（３７℃上リスによりｐＨ８，０に調整した５００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ）　、０．５ｍＭ　＋リスＥＧＴＡ　（エチレングリコール　ビス−〔β−アミノエチルエーテル〕Ｎ、　Ｎ’　−四酢酸）　、５０ｍｇ／１００ｍ１のアルブミンおよびトロンボ−赤血球に組み込むために予定された分子を含む。ゴーストは懸濁物の量の１ｏ−４ｏ％を占める。ゴース＋懸濁物を０℃で５分間保ち、続いて３７℃で６０分間インキュベー＋した。再密閉トロンボ−赤血球ゴーストを０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，１Ｍ　ＮａＰＯ＜　、１ｍｇ／ｍｌ　ヒトアルブミン、ｐＨ７，４中で３度洗浄することにより懸濁物から分離し、それでｉｎ　ｖｉｖｏまたはｉｎ　ｖｉｔｒｏでの使用準備ができた。担体赤血球に導入される分子は５．３．１．項に記載されている。担体赤血球内に組み込まれる分子の送達を容易にすることが望まれる一実施態様において、赤血球の脂質組成を既知の方法により操作し細胞膜を不安定にするかまたは他の方法（例えば表面シアル酸残基を加熱するかまたは取り除く）で処理して担体赤血球のｉｎ　ｖｉｖｏの半減期を減少させる。５　、３．４．ターゲット指向担体赤血球の投与本発明は標的担体赤血球を当業上知られている任意の経路を介して被験者への投与を提供する。例えば、赤血球ターゲット思考薬剤をリポソームを投与するために用いられる任意の経路を介して投与することができる。別の実施態様において、２−３の経路を挙げると心室内、腹腔内、筋肉内、皮下、静脈内または動脈内に赤血球標的剤を投与することができる。好ましくは、投与は静脈内または動脈内になされる。好ましい実施態様において、ターゲット指向担体赤血球を、ターゲット指向赤血球と医薬上許容される担体または賦形剤（下記５．４１１項参照）を含む医薬組成物として投与する。５．４．トロンボ−赤血球またはターゲラＩ・指向担体赤血球を含む医薬組成物本発明はトロンポー赤血球またはターゲット指向担体赤血球を、好ましくは医薬上許容される担体または賦形剤と混合して哺乳動物に投与することを意図しでいる。そのような混合物は本発明の医薬組成物を含む。本発明に用いられる医薬上許容される担体または賦形剤は次の特徴を有する水溶液を含む：約ｐＨ６とｐＨ８との間のｐＨ；修飾赤血球に適切な浸透環境を維持するための約ｏ、　ｉｓＮのイオン濃度；そして生理学的適合性。医薬」−許容される担体または賦形剤は修飾赤血球を粉砕または可溶化してはならない。例えば油、乳化剤、洗浄剤、または細胞膜を溶解する濃度の界面活性剤を含んではならない。上記の制限範囲内において、医薬上許容される担体または賦形剤は水溶液または懸濁液中のデスキトロース、グルコース、デンプン、ラクトース等を含む。（本頁以下余白）６、実施例ニトロンボー赤血球の調製及びテスト血液（ｌｏｒｎｌ）を注射器及び１９ゲージの針によりヒトから採血し、０．１ｍｌの４０％クエン酸三ナトリウムを含むポリプロピレン製試験管内へ入れた。この血液を、約２．ＯＯＯＸｇで１０分間、２２℃において遠心し、この上清血漿を除去した。この赤血球ペレットを緩衝液Ａ（０，１５ＭのＮａＣＩ、０．０５Ｍのリン酸、５ｍＭのグルコース、２ｒｎＭのＫＣＩ、ｐＨ７，４）で、約２，０００Ｘｇで′ｔ℃において１０分間の反復遠心により３回洗浄した。６０％の容量が赤血球からなるような（６０％へマドクリット）濃度で同一の緩衝液中に含まれる洗浄した赤血球の０．５ｍｌアリコートを取り出した。このアリコートを、以下に示すポリペプチドの２．９ｍｇ／ｍｌ溶液を含む０．５ｍｌの緩衝液Ｂ（０，１，５ＭのＮａＣｌ、０．ＯＩＭのＮａ−リン酸、ｐ）（７，０）と混合したニアセチル−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇ］、ｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−アミド続いて、緩衝液り中に含まれる１０ｍｇ／ｍｌのＭａｌ−３ａｃ−ＨＮＳＡ、（１−ヒドロキシ−２−二トロベンゼン−４−スルフオン酸ナトリウム塩のＮ−マレイミド−６−アミノカプロイルエステル；　Ｂａｃｈｅｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｉｎｃ、　；　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、　ＰＡ）の５０Ｍｍ分注を添加し、更に、この反応を、２２℃において２時間、震盪しながら進行させた。インキュベーション後、０．５ｍｌを取り出し、緩衝液Ａで３回洗浄した。結果として生じるトロンポー赤血球を、１０％のへマドクリットになるように緩衝液Ａ中に再懸濁させた。赤血球の対照試料を、ペプチドもしくはＭａｌ−５ａｃ −ＨＮＳＡを添加しないこと以外は相同に処理した。このアッセイは、５０μ】のクエン酸化した血小板に富む血漿（０，０１容量のクエン酸三ナトリウムで抗凝血化させである全血液を、７００Ｘｇで３．５分間、２２℃において遠心し、血小板を含まない血漿を用いて、細胞数をｍ１当たり３．０ＸＩＯ＠血小板に合わせることにより調製した）、及び、血小板を活性化するための５μＩのアデノシンニリン酸（ＡＤＰ）（１００μｍの保存溶液）を添加した、もしくは、添加しない５μｍのトロンポー赤血球を含んでいた。赤血球の凝集は、マイクロタイタープレート中の試料を、２２℃において様々な期間、２６０ｒｐｍで回転させた後の顕微鏡的調査に基づいて、１−４＋までに等級分けした。２−３分においては、トロンボ−赤血球は、ＡＤＰの非存在下では０−１＋の凝集を、そして、ＡＤＰの存在下では４＋の凝集を示した。これらの値は、残りの６分の観察時間について不変のままであった。対照赤血球は凝集しなかった。７、実施例：　トロンボ−赤血球の調製についての２段階法実施例６において記載されている１段階反応の動力学は、本発明のトロンボ−赤血球を調製することができ、かつ、これらが活性化した血小板に結合することを説明した。しかしながら、この１段階反応の動力学は、この１段階反応は良く見ても予測が立たないものであると思う理由を提供するものである。第１に、赤血球のスルフヒドリル（チオール）基は、ペプチドのスルフヒドリル（チオール）基とＭａｌ−３ａｃ −ＨＮＳＡリンカ−との間の希望する反応よりはむしろ、Ｍａｌ−８ａｃ−ＨＮＳＡリンカ−と反応し得る。この競合する可能性がありかつ希望しない反応は、赤血球に損傷を与え、かつ、ペプチドに対する結合のために利用可能なリンカ− を少なくするであろう。従って、より好ましい２段階法を、概略図３（図１６）及び本明細書中に記載しであるように、考案しテスト（７た。赤血球の調製−血液（ｌ　０ｍ１）を、注射器及び１９ゲージの針によりヒトから採血し、０．１ｍｌの４０％クエン酸三ナトリウムを含むポリプロピレン試験管内に入れた。この血液を、約２゜０００Ｘｇで１０分間、２２℃において遠心し、上清血漿を除去した。赤血球ペレットを、緩衝液Ａ（０，１５ＭのＮａＣ＋、０゜０５Ｍのリン酸、５ｍＭのグルコース、２ｍＭのＫＣＩ、ｐＨ７゜４）で、約７００Ｘｇで２２℃において５分間の反復遠心により、３回洗浄した。６０％の容量が赤血球からなるような（６０％へマドクリット）密度で同一緩衝液中に含まれる洗浄した赤血球の０．５ｍｌアリコートを取り出した。ペプチド−リンカ−の調製−上述の６項において示した公式を有する２、０ｍｇ／ｍｌのポリペプチドの溶液の０．　５アリコートを、緩衝液Ｂ（０，１５ＭのＮａＣ］、０．０１ＭのＮａリン酸、ｐＨ６，０）中で調製した。この溶液に対して、緩衝液Ｂ中に含まれる１０ｍｇ／ｍｌのＭａｌ−３ａｃ−ＨＮＳＡ（１− ヒドロキシ−２−ニトロベンゼン−４−スルフオン酸ナトリウム塩のＮ−マレイミド−６−アミノカプロイルエステル；　Ｂａｃｈｅｍ　Ｂｉ。５ｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ、；　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、　ＰＡ）の５０　Ｉｔ　Ｉアリコートを添加した。この反応は、ｐＨ６，０において、２２℃において５分間進行させ、従って、ペプチド−リンカ−複合体を形成した。将来利用するために、このペプチド−リンカ−複合体を凍結乾燥し、更に、約−７０℃に保存することができた。このペプチド−リンカ−複合体を、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）の０．１Ｍ溶液でｐＨ７，４に調節した。結合させたペプチドを含む０．５ｍｌアリコートを添加し、先に記載したように調製した赤血球の０．５ｍｌアリコートと混合し、この混合物を２２℃及びｐＨ７，４において１２０間震盪した。インキュベーション後、このトロンボ−赤血球を、緩衝液Ａ中で３回洗浄した。結果として得られるトロンボ−赤血球を、１０％のへマドクリットになるように、緩衝液Ａ中に再懸濁させた。赤血球の対照試料を、ペプチドもしくはＭａ　１−３ａｃ−ＨＮＳＡを添加しなかったこと以外は同様に処理した。アッセイは、クエン酸化させた血小板を豊富に含む血漿１００μｌ（０，０１容量のクエン酸三ナトリウムで抗凝血化させである全血液を、７００Ｘｇで、２２ ℃において３．５分間遠心し、血小板を含まない血漿を用いて、数をｍ１当たり３．０ＸＩＯ８血小板に合わせることにより調製した）、及び、血小板を活性化するための１０μｍのアデノシンニリン酸（ＡＤＰ）（１００μｍの保存溶液）を添加した、もしくは、添加しないｌＯμｌのトロンボ−赤血球を含んでいた。赤血球の凝集は、マイクロタイタープレート中の試料を、２２℃において様々な期間、２６Ｏｒｐｍで回転させた後の顕微鏡的調査に基づいて、】−４＋までに等級分けした。２−３分目においては、トロンボ−赤血球は、ＡＤＰの非存在下では０−１＋の凝集を、ＡＤＰの存在下では４＋の凝集を示した。これらの値は、残りの６分の観察時間について不変のままであった。対照赤血球は凝集しなかった。８、実施例ニトロンボー赤血球の詳細な特徴決定本実施例は、ＲＧＤ−含有ペプチドでコードンた赤血球は血小板と相互反応し、かつ、重要なことには、この相互反応は、無差別の血栓形成の危険性を減少するための必要条件である、活性化された血小板に選択的であることを示している。ペプチドＡｃ　−ＣＧＧＲＧＤＦ−ＮＨ２はｔ　−ｂｏｃ化学及び４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂を使用する自動ペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４３０Ａ；　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）で作成した。５つの合成の内の４つのものについては、カップリング溶媒はジメチルフォルムアミドであるが、５番目のものにおいてはＮ−メチルピロリドンであった。保護基は、アスパラギン酸についてはβベンジルエステルであり、アルギニンについてはトシルであり、かつ、システィンについては４−メチルベンジルであった。２重カップリングは、この合成の内の３つにおいてはフェニルアラニンを用いて、更に、全ての合成においてはアルギニンを用いて実行した。このペプチドが無水酢酸を用いての反応によってまだ樹脂上に存在している間にアミノ末端をアセチル化した。この樹脂からのペプチドの開裂は、硫化ジメチル、パラチオクレゾール、及び、アニソールの存在下において、無水ＨＦを用いて行い、−１０℃で開始した。ＨＦ開裂後、このペプチド−樹脂混合物を、エーテルのみて（最初の２つの合成）か、あるいは、エーテルとジクロロメタンで（後の３つの合成）洗浄し、続いて、酢酸中に抽出し、後に凍結乾燥化した。ＨＰＬＣ分析（ｃ−８カラム、２２０　ｘ　４　、　６　ｍｍ、　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３００ＲＰ）により、各合成における単一の優勢なピークが２２０ｎｍにおける総吸光度の４５〜５７％を示すことが証明された。数種の実験については、このペプチドを、使用前にＨＰＬＣにより精製した。高速原子衝撃質量分析（キセノンガンパラメーターニアｋＶ、ｆｍＡ、０．４ｍＡのイオン電流；質量分析器バラメータｍ：加速ポテンシャル６ｋＶ、質量領域　１３２−１．１７２、解像度　１，５００、スキャン速度　１０秒７１０回；　凍結乾燥した試料をグリセリンもしくはチオグリセリン支持体に移した）を５つのペプチド類の内の２つについて実行し、これにより、このペプチドは期待された質量（７５１）を有することが証明された。カップリング実験のためのペプチド濃度を、システィンを標準として使用して、５．５゛　−ジチオ−ビス−（２−二トロ安息香酸）（エルマン試薬；Ｐｉｅｒｅｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で、遊離のスルフヒドリル基を滴定することにより決定した。放則能標識したペプチドを、ペプチドアセチル化反応（０，３ｍｇの樹脂）を、４．．７５ｍ１のジクロロメタン及び０．２５ｍ１のジイソプロピルエチルアミンの混合物中で、０．０５ｒｎモル（２５ｍＣｉ）の”　Ｈ−無水酢酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、、　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅ１ｇＭ５．　ＩＬ　）を用いて、２２℃において攪拌しながら１２０分実行（７、その後、更に別の５分間にわたり０．５ｍｌ　（５ｍモル）のラベル化していない無水酢酸を添加することにより調製した。この樹脂をその後、かき乱さないように浮遊させ、遊泳液を除去し、ジクロロメタン中に溶解している１０％の無水酢酸（〜５ｍモル）５ｍｌをその樹脂に添加して更に５分間反応させた。続いて、この樹脂を濾過し、最初にジクロロメタンで、続いて、メタノールで洗浄し、更に、スカベンジャーの存在下においてＨＦを用いてその樹脂から開裂させた。この３Ｈ−ペプチドは、ｍモルのペプチド当たり１．３Ｘ１０ ”ｄｐｍＯ比活性を有していた。ＨＰＬＣ分析により、８３％の放射活性がペプチドのピークと共に溶出したことが証明された。８、　１．　２．　トロンポー赤血球の調製トロンポー赤血球の調製。交差結合法は〜１）このペプチドを、ヘテロ２官能性の交差結合試薬であるｌ−ヒドロキシ−２−二トロベンゼン−４−スルフォン酸（ｍａｌ−ｓａｃ−ＨＮＳＡ；Ｂａｃｈｅｒｎ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、　Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、　５ｗ１ｔｚｅｒｌａ、ｎｄ　）のＮ−マレイミド−６アミノカブロイルエステルに対して、そのペプチド上の遊離のスルフヒドリルと交差結合試薬のマレイミド分子との間の反応を介して結合し、さらにその後、２）このペプチド−クロスリンカ−を、赤血球に対しで、赤血球のアミノ基とアミノカプロイルエステルとの間の反応を介して結合させ、結果として、ｍａｌ−ｓａｃ−ＨＮＳＡからの強力な吸収試薬１− ヒドロキシ−２−ニトロベンゼン−４−スルフォン酸ジアニオンの放出を生じた。このマレイミド−スルフヒドリル反応中のエステルの加水分解を最小限にするために、６．０のｐＨを最初の反応について選択した。エステルと赤血球のアミノ基との間の反応の速度を上げるため、及び、赤血球のだめの生理学的ｐ　Ｈを保証するために、第２反応については７，４のｐＨを選択した。全血液を注射器により採取し、最終容量が１０ｍ１になるように、０．１ｒｎｌの４０％クエン酸三ナトリウムもしくはｌ、２ｍｌのＣＰＤＡ−１抗凝血剤（８９ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１６ｍＭのクエン酸、１６ｍＭのＮａＨ７ＰＯ，，１６０ｍＭのデキストローズ、２ｍＭのアデニン）のいずれかを含むポリプロピレンの試験管内に入れた。この血液を、血小板に富む血漿（ＰＲＰ）のために、７　（１０Ｘ　ｇで３．５分間、２２℃で遠心した。ＰＲＰを除去した後、この粘液を１６００Ｘｇで１０分間、２２℃において再遠心し、結果として生じる、血小板を殆ど含まない血漿（Ｐ　Ｐ　ｒ’）を除去した。続いて、軟膜層を除去して棄却し、その赤血球を、緩衝液Ａ（１４０ｍＭのＮａＣ１，５ｍＭのＫＣｌ、１．ＯｍＭのグルコース、１０ｍＭのＮａリン酸、ｐｉ４７．４）で５０ｍ１の容量にした。続いて、この赤血球を、緩衝液Ａ中で３回洗浄し、同一緩衝液中に１０％のへマドクリットになるように再懸濁させた。３ｍｌの試料を、小さなポリプロピレン試験管内に移し、７００Ｘｇて５分間、２２℃で遠心し、２．５ｍｌの上清緩衝液をその後除去し、０．５ｍｌの６０％へマドクリ・ソト溶液（３，３ＸＩ０ｇ赤血球）が残るようにした。いくつかの実験においては、やや異なる緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａリン酸、２ｍＭのＫＣＩ、５ｍＭのグルコース、ｐＨ７，４）を利用したが、結果は同一であった。続いて、このＡｃ　−ＣＧＧＲＧＤＦ−ＮＨ２ペプチドを〜２゜Ｏｍｇ／ｍｌ　（２，６ｍＭ）の濃度で緩衝液Ｂ（１５０ｍＭのＮａｃＩ、１０ｍＭのＮａリン酸、ｐＨ６，０）中に溶解し、ＩＭのＮａＯＨでｐＨ６゜０に再調節した。続いて、ｍａｌ−ｓａｃ−Ｎ　■（Ｓ　Ａを緩衝液Ｂ中に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、更に０．５ｍｌのペプチド溶液（１，３Ｈモル）及び０．０５ｍ１のｍａｌ−ｓａｃ−ＮＨ８Ａ（１，１Ｈモル）を室温において１０分間・インキュベートした。この溶液のｐＨをその後、０．１ＭのＮａＯＨで７．４にまで上昇させ、更に、この溶液を、直ちに、緩衝液Ａ中に溶解している０、５ｍｌの赤血球に添加した。続いて、この試験管を様々な期間、通常２時間であるがある場合においては１８時間、２２℃において緩やかに震盪させた。他の実験においては、この反応を１段階で行い、ペプチド、クロスリンカ−１及び、赤血球を、ｐＨ７，４−７，５において一緒にインキュベートした。反応が完結した後、トロンボ− 赤血球を緩衝液Ａ中で３回洗浄した。トロンポー赤血球を直ちに使用するか、あるいは、４℃に保存した。エルマン試薬でモニターした予備実験（ｍａ　１−５ａｃ−ＨＮＳＡのマレイミド基とペプチド上のスルフドリル基との間の反応を査定するため）により、等モル（２ｍＭ）濃度のクロスリンカ−とペプチドとをｐＨ６，０において使用した場合、マレイミド−システィン反応は５分以内に〉９５％が完結していたことが示された。これらの予備的反応も叉、クロスリンカ−上のアミノ−反応性部分の加水分解の指示薬としての、ｍａｌ−ｓａｃ−ＨＮＳＡからの１−ヒドロキシ− ２−二トロベンゼン−４−スフロン酸ジアニオンの放出について、４０５ｎｍでモニターした（Ａｌｄｗｉｎ　ａｎｄ　Ｎ１ｔｅｃｋｉ、１９８７　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１６４：４９４−５０１　）　ｏ　これらの実験の終了時には、試料を、２価イオン（同上）の完全な放出を起こさせる０、０５倍容量の５ＮのＮａＯＨで処理し、反応中に放出された総ジアニオンのパーセント率を確立した。この結果から、ｍａ　ｌ　−５ａｃ−ＨＮＳＡ上のアミノ−反応基の〜１％より少ないものが、ｐＨ６，０における１０分間のマレイミド−システィン反応中に加水分解されたことが示された。８、　１．　３．ペプチド結合の定量化各トロンポー赤血球に対して交差結合しているペプチド分子の数を決定するために、放射標識したペプチドを、標識していないペプチドと組み合わせて使用した。選択した時間間隔で、トロンポー赤血球をインキュベーション混合物から除去し、緩衝液Ａ中で３回洗浄し、続いて低浸透圧溶解に供して赤血球ゴーストを産生じた。これは、最初に、赤血球を１０％の緩衝液Ａ（つまり、最初の濃度の１０％に希釈した緩衝液Ａ）で、０℃においてインキュベートし、続いて、３８，０００Ｘｇで２０分間、０℃で遠心して、上清液及び細胞破片からなる堅く赤いボタン状物の両方を除去し、残存しているピンク色のゴーストを、１％の冷却した緩衝液Ａ中に再懸濁させ、冷却した１％の緩衝液Ａ中で２回洗浄した。いくつかの実験においては、０．５ｍＭのＥＤＴＡを添加して緩衝液を洗浄し、赤血球ゴーストの再密閉を防いだ。最終的には、赤血球ゴーストを、０．１−０．４ｍｌの１％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ）中に可溶化させ、この溶液を６ｍｌのシンチレーション液（Ｕｌｔｉｍａ　Ｇｏｌｄ；　Ｐａｃｋａｒｄ）に添加し、液体シンチレーション計数機（Ｐａｃｋａｒｄ　１９００ＣＡ、　Ｄｏｗｎｅｒｓ　Ｇｒｏｂｅ、　ＩＬ　）内で計数した。続いて赤血球当たりに結合したペプチド分子の数を、トロンポー赤血球内に特異的に取り込まれた放射活性から算出したＵつまり、全部のトロンボ− 赤血球インキュベーション混合物（赤血球＋ペプチド十クロスリンカ−）との反応後のゴーストに関連する放射活性　マイナス　非特異的対照（赤血球子ペプチド）のゴーストに関連する放射活性である］。ある実験においては、１０％及び１％の溶菌緩衝液は、プロテアーゼ阻害剤であるＰＭＳＦ　（Ｊ、ｍＭ）　、ｏイベブチン（０，’５ｍＭ）、及び、ＥＤＴＡ（０，５ｍＭ）を含む。ちょうど０．５ｍＭのＥＤＴＡを含む１％の溶菌緩衝液中での余分の最終洗浄をこの実験においては利用したが、それは、このゴーストは懸濁するのが難しく、更に３７ ℃における可溶化を、２００μｍ（７）ｌ　０ＸＳＤＳ＋２０μ１（７）Ｏ。１ＭのＮａＯＨ−４−２００μｌの組織可溶化剤（ＴＳ−２，０，５Ｎ　；　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｍｏｕｎｔ　Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、　ＩＬ　）の混合物を用いて行ったためである。続いてこの可溶化したゴーストを、１８ｍ１のシンチレーション液に添加して、計数した。８、　１．　４．ペプチドが交差結合する赤血球蛋白質の同定純粋な３Ｈ−ペプチド（１，３μモル）を１．２０分間、先に記載したような２段階反応において赤血球と反応させた。このトロンポー赤血球をその後、ＥＤＴＡ　（０，５ｍＭ）を含む冷却した低張性緩衝液を使用して溶菌させ、結果として生じるゴーストを、その後、１００μｍの１．　７％ＳＤＳ中で１５℃において溶解し、更に、 −８０℃で凍結させた。溶菌以前に取り出してきた試料についての血小板−トロンボ−赤血球の共役凝集アッセイ（以下を参照せよ）により、トロンポー赤血球はこのアッセイにおいて活性であることが証明された。次に、可溶化したトロンボー赤血球の２０μｍの試料を解凍し、２０μｌの試料混合物及び２μｍの２− メルカプトエタノールと混合し、３分間１０ｏ℃にまで加熱し、Ｌａｅｍｍｌ　ｉの方法（１９７０，Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−６８２）によりポリアクリルアミドゲル（３％の重層、１２．５％の分解ゲル）で電気泳動した。このゲルをその後、２５％のイソプロパノ−ルー１０％の酢酸中で一晩固定化することによる過ヨウ素酸−シッフ法で染色し、１０％の酢酸で洗浄し、３％の酢酸中の１％の過ヨウ素酸で６０分間インキュベートし、水で４回洗浄し、暗所で６０分間シッフ染色液と反応させ、０．１ＭのＨＣｌ中の１％のＮａ２Ｓ２０、で３回洗浄した。このゲルを、その後、７％の酢酸中で、４℃において一晩保存し、写真撮影し、クーマシーブルーで染色し、脱染色し、更に、再度撮影した。最終向には、このゲルを３０％のメタノール、１０％の酢酸中で３０分間、３回固定化し、蛍光強度測定調製用キット（Ｅｎｔｅｎｓｉｆｙ、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）の沈殿化用試薬（溶液Ａ）中で３０分間インキュベートし、更に、水性の蛍光試薬（溶液Ｂ）中で３０分間インキュベートすることにより、蛍光強度測定用に調製した。このゲルをその後乾燥させ、ＸＸＲ−５フイルム（Ｅａｓ　ｔｍａｎＫｏｄａｋ、　Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、　ＮＹ）を有するカセット内に、７日間、−７０℃下において入れておいた。８、　１．　５．血小板−トロンボ赤血球の共役凝集アッセイ血小板の凝集進展を開始させるトロンボ−赤血球の能力を査定するために、マイクロタイターアッセイを開発した。血小板に富む血漿（Ｐ　Ｒ，Ｐ　）を０．０１倍容量の４０％のクエン酸ナトリウムで抗凝血化させた血液から調製し、血小板を殆ど含まない血漿で、３．５ｘ１．０＠／ｍｌの血小板数に調節した。このＰＲＰのアリコート（５０もしくは１００μｌ）をマイクロタイターウェルに添加し、その後、５もしくは１０μｍのＡＤＰ（１００μＭの保存溶液）を選択したウェルに対して添加し、その後、５もしくはｉｏμｍのトロンボ−赤血球（緩衝液Ａ中での１０％へマドクリット）を添加した。このマイクロタイタープレートをその後、２７０ｒｐｍで、２２℃において、０．　５と２０分との間の様々な期間回転させ、更に、血小板−トロンポー赤血球の共役凝集の程度を、拡大鏡を利用して、０− ４＋の程度について肉眼で査定した。この反応の選択性を査定するために、幾つかの実験においては、ＰＲＰを、ｌｏｍＭのＥＤＴＡ、３００μｇ／ｍｌのペプチドＲＧＤＦ、もしくは、フィブリノーゲンの結合を遮断して血小板を活性化するＧＰＩｌｂ／ＩＩＩａレセプター及びα９β。ビトロネクチンレセプターの両方に対する２０μｇ／ｍｌの抗体（７Ｅ　３）で予めインキュベートした（Ｃｏｆｆｅｒ、　１９８５．　Ｊ、　Ｃ１ｔｎ。Ｉｎｖｅｓｔ、　７６：１０１−１０８；　Ｃｏ１１ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９１．　Ｂｌｏｏｄ　７７：７５−８３）。血液塗抹標本を幾つかの実験における試料から作成し、更に標準的なライト染色（［（ｅｍａｓｔａｉｎ、　Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ　Ｄａｔａ、　Ｗａｙｎｅ、　ＰＡ）で染色した。トロンボ−赤血球の血小板との共役凝集についてのより定量的なデータを取得するためにこのアッセイを凝集針に適応させた。ＰＲＰをＡＣＤ−Ａで抗凝血化させた全血液（８，５：　１．　５）から調製して、修飾化したチロ−デス緩衝液（１４０ｍＭのＮａＣ１，３ｍＭのＫＣＩ、１２ｍＭのＮａＨＣＯａ　、０．４ｍＭのＮ　ａ　８２　Ｐ　０１　、Ｉ　Ｏｍ、ＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＭ　ｇ　Ｃｌ　２．０．２％のウシ血清アルブミン、５ｍＭのグルコース、ｐＨ７゜４）を使用して、セファ−ロース２　Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）のカラムを通してゲル濾過した。試料は、４５０μＩのゲル濾過した血小板＋２０μｌのトロンボー赤血球（１０％ｌ＼マドクリット）もしくは対照赤血球（つまり、クロスリンカ−は含まないでペプチドとインキュベートした赤血球）からなるものであった。極大透過を４５０μＩの緩衝液＋２０μ ｍの対照赤血球で設定した。血小板をＡＤＰ　（４，３μＭの最終濃度）もしくはエビネフェリン（１０ＭＭ）で活性化させた。８、　１．　６．溶血の査定トロンボ　赤血球調製中の赤血球の溶血を、任意の遊離ヘモグロビンとりューコマラカイトグリーン（Ｋｏｄａｋ；　３　、　３　Ｍの酢酸中に含まれる０、１％のｐ、　ｐ’　−ベンジルイデネビスー　（Ｎ、　Ｎ−ジメチルアニリン））の反応により査定した。結果として生じる化合物を、６１７ｎｍの吸光度により検出するが、この波長はｍａｌ−ｓａｃ−ＨＮＳＡジアニイオンにより妨害されない波長である。標準物は、脱イオン水中に含まれる既知の量の赤血球を溶血させることにより調製した。このアッセイは、１０μｍの試料（遠心して完全なままの赤血球を除去した後の反応混合物の上清）、１ｍｌのりューコマラカイトグリーン、及び、１ｍｌの０゜１％Ｈ２０，からなる。１０分後に各試料の吸光度を６１７ｎｍで読み取った。８、　１．　７．浸透脆弱性トロンボ−赤血球、対照赤血球、及び、未処理の赤血球を、様々な濃度のＮａＣｌ溶液に添加した。２２℃で２０分おいた後、この試料を遠心し、更に、上清液の吸光度を５４０ｎｍにおいて査定した。結果は、パーセント溶血として表わし、１００％溶血を、水に添加した赤血球の試料の吸光度として定義した。精製したタイプ１ラツトの皮膚コラーゲンに対する血小板の吸着を始めとするアッセイの第１段階を、血小板を放射能照射することを除いては以前に記載したように実行した（Ｃａｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ。１９８９、　Ｂｌｏｏｄ　７４：１８２−１９２　）　、簡潔に述べると、２ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下でのゲル濾過した血小板の試料（１００μｌ；５゜５ｘｌＯ’／ｍｌ）を、コーラゲンで予めコートしであるマイクロタイタープレートのウェルに添加し、更に、その血小板を１時間、２２℃において吸着させた。このウェルをその後学にして、緩衝液（０，１５ＭのＮａＣ１，ｏ、ＯＩＭのトリス／ＨＣＩ、０．５％のウシ血清アルブミン、５ｍＭのグルコース、ｐＨ７゜４）で３回洗浄した。対照赤血球もしくはトロンボ−赤血球（５０μｌ；１０％へマドクリット）をその後、この時点で２ｍＭのＭ　ｇ　Ｃｌ　ｘを補足した同一緩衝液を含むこれらのウェルに添加した。６０分後、このウェルを空にして、先に示したように３回洗浄した。このウェルをその後、ノルマスキー光学鏡を装備した顕微鏡を利用して４００倍拡大で肉眼的に調査した。フィブリノーゲンの結合及び血小板の凝集を遮断するＧＰｉＩｂ／１ｉｒａに対する２０μｌ／ｍｌの抗体（１０Ｅ　５　）　（Ｃｏｆｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７２：３２５−３２８）　、及び、４ｏｏμｇ／ｍ＋のペプチドＲＧＤＦの、血小板に対するトロンボ−赤血球吸着についての効果をこれらの試薬類をトロンボ−赤血球に対して添加することによりテストし、その直後に、トロンボ−赤血球をマイクロタイタープレートに添加した。８、　１．　９．　ｔ−ロンボー赤血球の容量及び表面特性の査定トロンボ−赤血球及び対照赤血球についてレーザー回折エクタサイトメトリー（Ｅｋｔａｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を、主に、以前に記載しであるように（Ｍｏｈａｎｄａｓ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８０．　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　６６：５６３ −５７９；　Ｃ１ａｒｃｋ　ｅｔ　ａｌ、　１９８３．　Ｂｌｏｏｄ　６１：８９９−９１０）　、スト−ニープルツクからバークレイまで４℃の冷却小包で翌日配達側により送された試料を使用して実行した。対照赤血球もしくはトロンポー赤血球（０，１５ＭのＮａＣｌ、０．ＯＩＭのトリス／ＨＣＩ、５ｍＭのＫＣＩ、１０ｍＭのグルコース、１％のウシ血清アルブミン、ｐＨ７，４の緩衝液中に含まれる２０μＩの〜３３％懸濁液）を、２９０ｍ０５ｍに調節しであるリン酸緩衝化したＮａＣＩ（粘土＝２２ｃｐ）中に溶解している３、５ｍｌの４％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドンに添加した。この試料をその後装置内に入れ、変形指数（円形から楕円形への細胞形の変化の測定）を、細胞を増加剪断率（０− １，０３７ｓ　’）に供している際に継続的に測定した。ｌ・ロンボー赤血球反応を実行した後の上清液は、０．４０±０゜０９％（平均値±ＳＤ　；　ｎ＝６）の赤血球溶血を有し、これは対照反応における０、１３ ±０．０４％（ｎ＝６）と比較される。浸透脆弱性の研究によっては、トロンポー赤血球と対照赤血球との間には僅かな差異のみが示され（図１は、３回の別々な実験のデーターを含む）、更に、対照赤血球は未処理の赤血球とは異ならなかった。レーザーエクタサイトメトリーによって、トロンボ−赤血球は、対照赤血球及び未処理の赤血球と同一の変形特性を有していた（図２）。対照赤血球とトロンポー赤血球の両方共は、２００個体を越える研究から決定された正常範囲（０，６±０゜０２：平均値±ＳＤ）内であるプラトー値を有していた。８．２．２．”Ｈ−ペプチドを用いる研究トロンボ−赤血球光たりに結合したペプチド分子の数を決定するための５種類の別々の実験の結果を表ＩＩに示した。赤血球に対する”　Ｈ−ＣＧＧＲＧＤＦペプチドの結合＊この反応に利用した’ 　Ｈ−ＣＧＧＲＧＤＦペプチド及び交差結合試薬（ｍａ　ｌ−５ａｃ−ＨＮＳＡ）のμモル数を示している。各反応混合物は、〜３．３Ｘ１．０’個の赤血球を含んでいた。時間の関数として、トロンポー赤血球光たりに結合した’Ｈ−ペプチドはとんとん増加してゆき、反応は、９０−１２０分の時間点において緩慢になった、もしくは停止した。３．３Ｘ１０９個の赤血球当たりに、１，３μモルのペプチド及び１．１ｎモルのクロスリンカ−を使用した極大特異的取り込みは、トロンボ− 赤血球当たり０．５−１．４Ｘ１０’個のペプチド分子であり、これは、〜０．３−０．７％の添加されたペプチドを意味する。対照赤血球とのペプチドの非特異的会合は、クロスリンカ−薬を省いである対照試料により判定したところによると、特異的取り込みのく３％であった。単一の段階において反応を行った３つの実験において、その結果を、２段階反応を使用して行ったものと比較１７た。放射標識化したトロンポー赤血球をＳＤＳ中に可溶化し、更に、ポリアクリルアミノゲル電気泳動に供した研究においては、３本の同定可能な放射活性バンドが存在した（図３）。最も強力なものはＭｒ　８７　ｋＤに存在し、これは、主要な過ヨウ素酸−シッフ（１）　Ａ　Ｓ　）　−染色バンド（ＰＡＳ−１）に相当する（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ａｎｄ　Ｍａｄｄｙ、　１９８２．　ｉｎ　Ｒｅｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ−Ａ　Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、　Ｅｌｌｏｒｙ　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ、　ｅｄｓ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、　ＮＹ、　ｐｐ、　６７−９３）　ｏ第２のものはＭｒ４２に、Ｄに存在し２、第２のＰＡＳ −陽性バンド（ＰＡＳ　−２）に相当し、更に、第３のものはＭ　ｒ　２２　ｋ　Ｄに存在する弱いバンドであり、第３のＰＡＳ−陽性バンド（ＰＡＳ　−３）に相当する。８、　２．　３．血小板−トロンボ−赤血球相互作用２０を越える個別の実験において、ペプチド−クロスリンカ−を赤血球と１２０分間インキュベートすることにより調製したトロンボ−赤血球は、ＡＤＰを使用する血小板−トロンボー赤血球共役凝集アッセイにおいて陽性反応を生しるため、エビネフエリン及びトロンビンを、より少ない数の実験においてテストしたところ、それらは、赤色の共役凝集物として顕微鏡的に可視できる血小板−トロンボ−赤血球相互作用を刺激化するのに有効であることも見いだされた（図４）。染色した塗抹標本の顕微鏡調査により、血小板とトロンボ−赤血球との間の密接な会合が確証され（図５）、血小板の凝集物は、トロンポー赤血球間の橋渡しとして作用していた。それとは対照的に、トロンボ−赤血球は、拮抗剤を添加しない際には、血小板とは相互作用を行わず、これにより、活性化された血小板についてのトロンボ−赤血球の選択性が証明された。クロスリンカ−とは反応させずにペプチドと反応させである対照赤血球は、活性化していない、もしくは、活性化した血小板のいずれとも相互反応しなかった（図４）。これらの試料中に含まれる血小板を活性化した場合、純粋な血小板凝集物は顕微鏡的に同定することが可能であり（図５）、顕微鏡的には、これらは、小さい白色の塊に見えた（図４）。経時実験においては、１５分という短い交差結合用インキュベ・−ジョンは、このアッセイにおいて陽性反応を生じるトロンボ−赤血球を産生ずるのに充分なものであることが見いだされたものの、反応は強くはなくなる傾向にあった。これらの研究において使用されるクエン酸抗凝血化剤の、混乱を招くような任意の効果を除外するために、このアッセイもやはり、ヘパリン（４Ｕ／ｍｌ）もしくはヒルジン（ＩＯＵ／ｍｌ；Ｓ　ｉ　ｇｍａ　）を含むＰＲＰ抗凝血化剤を使用して実行し、類似した結果が取得されたが、予期されたように、トロンビン− 誘導活性はこれらの抗凝血化剤では生じなかった。これらのアッセイは、正常血漿を含むため、フィブリノーゲンは活性化されたＧＰＩＩｂ／Ｉ　Ｉ　Ｉａレセプターに対（２て結合するのに利用可能であり、従って、トロンボ−赤血球が、ＧＰＩＩｂ／ｌ１ｌａレセプターについてフィブリノーゲンと効果的に競合することかできたということを特筆するのは重要である。数種の阻害剤を用いて、トロンボ−赤血球が活性化した血小板のＧＰＩｌｂ／ＩＪＩａレセプター上のＲＧＤ結合部位に対して実際に結合するのかどうかを査定した。実際には、共役凝集は、液相のＲＧ　Ｄペプチド、ＧＰＩｌｂ／１ｌｌａ、及び、血小板に対するフィブリノーゲンの結合と、Ｒ，Ｇ　Ｄコートしたビーズと血小板間の相互作用との両方を遮断するαヤβ３ヒドロネクチンレセプターに対するモノクローナル抗体（Ｃｏｆｆｅｒ、　１９８５．　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。Ｉｎｖｅｓｔ、　７６：　１０１−１０８：　Ｃｏｆｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９１．、　Ｂｌｏｏｄ　７７：７５−８３）及び、ＥＤＴＡ、インテグリンレセプターを有する全てのりガントの相互作用を阻害する強力な２価陽イオン性キレート剤、により阻害された（図４）。より定量的なデータを取得するために、凝集測定機内でゲル濾過した血小板及びトロンポー赤血球を使用するアッセイを開発した。図６は、トロンポー赤血球はＡＤＰ−活性化した血小板と相互作用するが、対照赤血球はしない、ということを証明する実験の結果を示す。トロンポー赤血球は、攪拌及び３７℃の温度にもかかわらず、活性化していない血小板とは相互作用を行わなかった。フィブリノーゲンの血小板に対する結合を遮断し、かつ、血小板のＲＧＤ−コートしたビーズとの相互作用を部分的に遮断するＧＰＩｌｂ／ＩＴｌａに対するモノクローナル抗体である１０Ｅ　５　（Ｃｏｆｆｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、１９８３．　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、７２：３２５−３３８）　Ｉよ、血小板とトロンボ− 赤血球との間の相互作用を阻害した。このアッセイにおいては血漿蛋白質をゲル濾過段階において除去し、そのため、活性化された血小板に対する結合についてトロンボ　赤血球と競合する外因性のフィブリノーゲンは殆ど存在しないか、あるいは、全く存在しなかった。ｉｎ　ｖｉｖｏにおける止血は、血管が損傷を受ける場合、内皮下層の蛋白質、特にコラーゲンに対する血小板の吸着により開始するものと考えられている（Ｃｏｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｂｌｏｏｄ、　７４：１８２−１９２）。その後血小板は、吸着した血小板の上で凝集するが、それは恐らく、吸着した血小板の内腔表面上のＧＰＩ　Ｉ　ｂ／Ｉ　Ｉ　Ｉ　ａレセプターが、フィブリノーゲン及びフォン＝ウイレブランド因子（Ｐｌｏｗ　ａｎｄ　Ｇｉｎｓｂｅｒｇ、　１９８９．　Ｐｒｏｇ、　ｌｌｅｍ、　Ｔｈｒｏｍｂ、　ｌｏ：１１７−１５６）のような吸着性糖蛋白質を高い親和性で結合させるような変形を行った結果であろう。我々は、そのため、コラーゲンに対して吸着している血小板に対して結合するトロンボ−赤血球の能力をテストした。我々の以前の研究のように（Ｃａｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、上述）、密集した芝生のようになっている血小板は、２ｒｎＭのＭ　ｇ　Ｃ］　２の存在下においてコラーゲンに対して吸着した。その後、対照赤血球を添加した際、赤血球はほとんど一つも血小板に結合しなかった（図７）。それとは極めて対照的に、トロンボ−赤血球は、血小板層の上に存在して、密集した層を形成しており、かつ、この反応を実際に、抗体１０Ｅ５もしくはペプチドＲＧＤＦにより完全に阻害することができた（図７）。８．３　討論以前の方法が失敗に終わっている研究で成功する試みにおいて。我々は、ペプチドＡ　ｃ　−ＣＧ　Ｇ　ＲＧ　Ｄ　Ｆ　−Ｎ　Ｈ２，を、ヘテロニ官能性の交差結合試薬を利用し、表面にあるアミノ基を介して赤血球に対して共有結合させた。赤血球当たり約０．　５−１．　５Ｘ１０＠個のペプチド分子が１２０分後には交差結合した。このペプチドは糖蛋白質類に対して選択的に交差結合したように思われ、これらの糖蛋白質は、Ｉ）ＡＳ　−１，、ＰＡＳ　− ２、及び、ＰＡＳ　−３領域に存在し、そのため、このペプチドはグリコホリンＡ（この２量形態が主にＰＡＳ−１の原因となっており、この単量体形は主にＰＡＳ　−２の原因となっている）、及び、関連する糖蛋白質であるグリコホリンＢ（これは主にＰＡＳ　−３の原因となっている）に対して交差結合していることが最も強く考えられる（Ａｎｓｔｅｅ、　１９９０．　Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ、　５８：ｌ−２０）　。赤血球当たり推定で０．２−１．　ＯＸ　１０　’個のグリコホリンＡの分子が、更に、赤血球当たり〜０．２５ＸｌＯ’個のグリコホリンＢの分子他存在するということは興味深く、これにより、交差結合しているペプチド分子の数と、グリコホリンＡ＋グリコホリンＢ分子の数との間にはＩ・ｌの化学量論が存在する可能性が生じる。トロンポー赤血球を、様々な方法で分析した。交差結合反応自身は、単に赤血球を洗浄するよりは、はんのいく分多めの各面を産生じた。更に、浸透脆弱性においては最小の変化のみが存在した。赤血球膜内、及び、赤血球の細胞質の水和状態における変化に対して感受性である技術であるレーザー回折エクタサイトメトリーは、インビトロにおいて変化した赤血球及び様々な疾患を有する患者からの赤血球の分析に有効な手段である（Ｍｏｈ旧１ｄａｓ　ｅｔａｌ、、１９８０．　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｒ＋ｖｅｓｔ、６６：５６３−５７３；　Ｃ１ａｒｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、＋９８３、　Ｂｌｏｏｄ　６１：８９９−９１０；　Ｐａ５ｖｏｌ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｂｌｏｏｄ　７４：１８３６−ｉ８４３）。短縮しているインビボの赤血球生存率に関連した多くの疾患において異常な値が得られた（Ｃ１ａｒｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｂｌｏｏｄ　６１、　＋８９９−９１０）。従って、トロンボ−赤血球は、このアッセイにおいて未処理の赤血球とは区別されるものであることは特筆に価する。トロンボ−赤血球は、ＡＤＰで活性化した血小板、エピネフエリン、もしくは、トロンビンと選択的に相互作用して、血小板と赤血球との混合物を含む巨大な凝集物を産生ずる。ＧＰＩｌｂ／ＩＩＩａに対するモノクローナル抗体及び液相のＲＧＤペプチドを用いる研究により、赤血球上のＲＧＤペプチドは、血小板上に存在する活性化したＧＰＩｌｂ／ｌ１ｌａレセプターに対して結合することが示される。この相互反応は、血漿フィブリノーゲンの正常量の存在下においてさえ生じ、これにより、トロンポー赤血球は、活性化されたＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａレセプターに対する結合についてフィブリノーゲンと効果的に競合することができるということが示される。更に、この相互作用はクエン酸化したＰＲＰ中における血小板に限定はされず、それは、ヘパリンもしくはヒルジンのいずれかで抗凝血化した血液から調製したＰＲＰ中に存在する血小板もやはり、トロンポー赤血球と相互作用することができるためである。血管損傷の部位（第１に血小板が血管壁内の吸着性蛋白質に対して吸着する）におけるインビボでの状況に類似した状況９ＬＭより刺激するために、我々は、コラーゲンに対して吸着している血小板に対して吸着するトロンボ−赤血球の能力をもテストした。トロンボ−赤血球はこの吸着性血小板に対して簡単に結合したが、対照赤血球は結合せず、更に、ＧＰＩｌｂ／ＩＩＩａに対するモノクローナル抗体及びＲＧＤペプチドを用いる研究は、ＲＧＤペプチドの活性化されたＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａレセプターとの相互作用を伴うメカニズムを再び指示するものであった。これらのインビトロでの研究は、新鮮な血小板に代わる可能性のある代用物としてのトロンポー赤血球の利用性の明白な指標である。正常個体の循環器系中には血小板の２０倍もの赤血球が存在するため、５０ｍ１の血液中に含まれる赤血球の、トロンポー赤血球への転換は、１リツトルの血液中に存在する血小板、すなわち、約２単位（因習的単位）の血小板が存在するのと等量のトロンボ−赤血球を産生ずる。更に、赤血球は血小板より９倍大きいため、５０ｍ１の血液は、質量でいうと１８単位（因習的単位）の血小板に等価にものを生しる。赤血球洗浄の技術が既に血液銀行における標準的慣習になっており、かつ、交差結合反応は、選択したペプチドの密度に依存して１．−２時間以内に行うことができる。従って、トロンボ−赤血球は、同厚の、半一人工的な血小板代用品として機能することができる。血小板吸着及び凝集におけるこれらの機能に加えて、血小板は止血を左進させるという他の貢献をしており、そのため、トロンボ−赤血球もやはり、止血反応を左進させるのに役立つか否かを問うことは適切である。血小板が担う機能の一つは、共役凝集反応が起こる表面として作用することである（Ｗａｌｓｈ　ａｎｄ　Ｓｃｈｍａｉｅｒ。１９８７、Ｉｎ　Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ：　Ｂａ５ｉｃ　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、　Ｃｏｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ｅｄｓ、、　Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、　ｐｐ、　６８９−７０３）。特有な血小板レセプター及び血小板の非特異的リン脂質膜の両方がこの機能に関与しているが、更に、どの程度各々が貢献しているかは不明である（Ｗａｌｓｈ　ａｎｄ　Ｓｃｈｍａｉｅｒ、　１９８７．　Ｉｎ　Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ：　Ｂａ５ｉｃ　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、　Ｃｏｌｍａｎ　ｅＬ　ａｌ、、　ｅｄｓ、、　Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、　Ｐｈ１１ａｄｅｌｐｈｉａ、　ｐｐ、　６８９−７０３）　。赤血球膜もやはり一定の条件下では共役凝集反応を左進する役目を果たすことができ、そのため、トロンポー赤血球もやはり、トロンビン形成を促進することができることがある（Ｚｗａａｌ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９１＋２３−３］）。赤血球が、エイコサノイド代謝を伴う血小板との共同的な生化学的相互作用を介して血小板の活性化を左進することができる（Ｓａｎｔｏｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９１．　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　８７：５７１−５９１）という最近の発見により、トロンポー赤血球が、残存している血小板の機能を亢進することができるという他の有力なメカニズムが提供されている。刺激された場合、血小板は、その密集した顆粒からＡＤＰを放出し、ＡＤＰ−誘導性血小板活性化を誘導するが、赤血球はＡ、　Ｄ　Ｐに富んでおり、そのため、ＡＤＰが、止血栓に絡まったようになるトロンボ−赤血球からもれ出ることができる。結局のところ、血小板活性化の強力な阻害剤として血管壁内の細胞により産生される酸化窒素の同定により、トロンポー赤血球は血小板機能を左進することがあるという他の可能性のあるメカニズムが示唆されるが、それは、遊離のヘモグロビン及び赤血球中のヘモグロビンが酸化窒素の効果を中和することが証明されているためである（Ｈｏｕｓｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　Ｂｌｏｏｄ　７６：９５３−９５８）。９、血小板に対するＲＧＤ結合についてのビーズモデルポリアクリルニトリルビーズにそれらのアミノ末端を介して共有結合している一般構造（Ｇ）、−Ｒ，ＧＤＦ　（ｎは、グリシン残基の数に等しい）のペプチドについて本明細書中に記載されている一連の研究においては、ペプチドの長さが、血小板と相互作用するビーズの能力に深く影響を与えることを発見した。従って、ｎ＝１であるペプチドでビーズをコートすると、そのビーズと、活性化していないもしくは活性化した血小板との間には非常に僅かな相互作用が生じる一方、ｎ＝９である場合には、活性化していない血小板と活性化した血小板の両方で、強い相互作用が生じた。ペプチドがｎ＝３を有する場合、相互作用は血小板活性化の状況によりかなり左右され、ＰＧＥ１て処理した血小板は殆ど反応しないか全く反応しないが、ＡＤＰで処理（７た血小板は活発に反応する。具体的には、血小板インテグリン（表ＩＩＫを参照のこと）のＲＧＤ結合領域についての追加的な情報を得るために、スペーサーとしての様々な数のグリシン残基を含む一連のＲＧＤペプチド［（Ｇ）、−ＲＧＤＦＩを、それらのアミノ末端のグリシン残基を介してポリアクリロニトリルビーズ上に固定化（７、血小板と相互作用するこれらのビーズの能力をその後評定した。グリシン残基の数の関数としてのこれらビーズの分別的血小板凝集効果は、ベース条件Ｆ及び血小板拮抗剤及び阻害剤の存在ドにおいて、Ｉ〈ＧＤ結合部位の探査を可能にしていた。更に、我々は、様々なインテグリンレセプターに対する一連のモノクローナル抗体を、その相互作用を阻害するそれらの能力について分析することができた。表■　血小板　インテグリン　レセプター→−血小板表面面積は２２．２　Ｂ　 ’及びレセプター間は等間隔であると仮定９．１．材料および方法血液を注射器で採取し、０．Ｏ１容量の４０％クエン酸三ナトリウムを入れたポリプロピレン製の試験管に入れた。２２℃、〜７００Ｘｇで３．５分間遠心することにより血小板の多い血漿（ｐ！ａｔｅｌｅｔ　″ｒｉｃｈ　ｐｌａｓｒｒ＋ａ：ＰＲＰ）を調製し、血小板の少ない血漿（ｐｌａｔ、ｅｌｅｔ−ｐｏｏｒ　ｐｌａｓｍａ　：　ＰＰＰ、２２℃、１６００Ｘｇで１０分間遠心することにより調製）を用いて３ＸｌＯ”／ｌに調製した。ＰＲＰをセファロース２Ｂカラム上に置き、ＣａＣｌ２を加えず、かつ２ｍｍ０＋、／薯　ＭｇＣＩｚを含む修飾Ｔｙｒｏｄｅ溶液（１３８ｍ、ｍｏ１／ｌ　ＮａＣ１，２，７ｍｍｏｌ／川　ＫＣｌ、０．４ｔｎｍｏ　］／］　ＮａＨ２ＰＯ，、ｌ　２ｍｍｏ　ｌ／Ｉ　ＮａＨ２Ｏ＋、２ｍｍｏｌ／Ｉ　ＭｇＣ１ｚ、０．２％　ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％　グルコース、Ｉ　Ｏｍｍｏ　Ｉ／ｌ　１（ＥＰＥＳ。ｐＨ７，４）で溶出することにより、前述の方法（Ｃｏｆｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．８１ｏｏｄ　７４：１８２）でゲル濾過血小板（ｇｅｌ−ｆｉｔｔｒａオｅｄ　ｐｌａｔｅｌｅｔｓ：ＧＦＰ）を調製した。９、　１．　２．ペプチドｔ−Ｂｏｃを用いる固相合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ、ｅｍｓ、フォスターシティ−、カリフォルニア、モデル４３０Ａ）で、ペプチド（Ｇ）。− ＲＧＤＦを２回合成し、樹脂から切り出した後のペプチドが遊離のカルボキシル基よりもカルボキシ末端アミドを含むように、４−メチルベンズヒドリルアミン（４−ＭＢＨＡ）樹脂を用いた。アスパラギン酸およびアルキニンの側鎖保護基にはそれぞれベンジルエステルおよびトシルを用いた。最初の合成では、ペプチドＧ、ＲＧＤＦを製造し、樹脂の２０％を除去し７て１４Ｆで切り出した。次いで樹脂上で２個のグリシンをペプチドに加え、さらに２０％を除去してＨ１”で切り出した。この工程を繰り返して全ペプチド（Ｇ、　、Ｇ、　、Ｇ５、Ｇ、およびＧ、ＲＧＤＦ）を合成した。第２の合成では、同様の一般法を用いたが４つの異なる合成物・Ｇ、およびＧ　３　ＲＧ　Ｄ　Ｆ　：　Ｇ　ｓおよびＧ　７ＲＧ　Ｄ　Ｆ　：　Ｇ　９、Ｇ１１およびＧ、５ＲＧＤＦ　；並びにＧ＋ｓ、Ｇ　ｔ＋およびＧ　ｌ　９　ＲＧ　Ｄ　Ｆからなる。アルギニン、フェニルアラニン、第１の合成における５番目とそれ以降の全てのグリシン残基、並びに第２の合成における４番目とそれ以降の全てのグリシン残基にはダブルカップリングを用いた。ペプチドはＨＦを用いてアニソールおよびジメチルスルフィドの存在下に（容量比］０：１＝１）樹脂から切り出した。その際、最初の温度は一１０℃であり、水−塩の混合物中に氷を加えることによって切り出し中の温度を一２℃以下に維持した。ペプチドをエチルエーテルで洗浄し、次いで３０％　ＨＡｃで２回、１０％　ＨＡｃで２回抽出した。抽出物を集めて　〜１０％　ＨＡ　ｃの最終濃度まで希釈して凍結乾燥した。Ｃ８逆相カラム（Ａｑｕａｐｏｒｅ　ＲＰ−３００゜Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、孔サイズ３００人、７μ球状シリカ、４．６Ｘ２２０ｍｍ）を用いるＩ−（Ｐ　Ｌ　Ｃで、４０分にわたって溶出するようにプログラムされた０、１％トリフルオロ酢酸中の０．６０％アセトニトリル勾配てペプチドの均質性をアッセイした。第１の合成の平均純度は７２±５％（平均上標準誤差）であり、第２の合成では８０±３％であった。Ｇ、、ＲＧＤＦがＨＰ　Ｌ　Ｃにより最も低い均質性（５６％）を示したので、同じ材質のより大きなカラム（１０Ｘ２５０ｍｍ）を用いるプレバラティブ？（Ｐ　Ｌ　Ｏによりこれを９５％以上の均質性まで精製した。ビーズ凝集アッセイにおける粗Ｇ　＋　＊　ＲＧ　Ｄ　Ｆペプチドと精製Ｇ　、、ＲＧ　Ｄ　Ｆペプチドの機能的活性は同じであった。追加アミノ末端チロシンを含むフィブリノーゲンγ−鎖ドデカペプチド（アミノ酸４００−４１１）（Ｙ−ＨＨＬＧＧＡＫＱＡＧＤＶ）は、ニューヨーク州、スト−ニープルツク、ニューヨーク州立大学のＥｌｌｉｎｏｒ　Ｐｅｅｒｓｃｈｋｅ博士から恵与された。ＲＧＤ配列を含み、かつＧ　Ｐ　Ｉｌ　ｂ　／　ＩＩＩ　ａへのフィブリノーゲンの結合を阻害するヘビ毒ペプチドであるトリグラミン（ｔｒｉｇｒａｍｉ　ｎ）　（ｔ（ｕａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｊ、　Ｂｉａｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２＋１６１５７）は、ペンシルバニア州、フィラデルフィア、テンプル大学の５ｔｅｐｈａｎ　Ｎｉｅｗｉａｒｏｗｓｋｉ博士から恵与された。ＨＰＬＣ溶出ピークを回収し、減圧下にサンプルを乾燥しく５ｐｅｅｄ　Ｖａｃ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ、ＳａｖａｎｔＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｉｎｃ、、ファーミングデール、ニューヨーク）、これをメタノール（Ｇ、−、ＲＧＤＦ）または２５％ＨＣＩ　（Ｇ、、、ＲＧＤＦ）に再溶解することによって第２の合成で製造したペプチドについて高速原子衝撃（ＦＡＢ）マススペクトルを測定した。Ｇ１−１．ＲＧＤＦペプチドについては、マススペクトルプローブを５０％グリセリン１５０％チオグリセリンマトリックス１μｍでプレコーティングし、次いでペプチド溶液１μＩを加えた；　Ｇ　ｗ−１ｓ　ＲＧ　Ｄ　Ｆペプチドについては、プローブをチオグリセリンマトリックス１μｌでプレコーティングし、次いでペプチド溶液１μｍを加えた。高速原子衝撃マススペクトルはＫｒａｔｏｓ　ＭＳ８９０／ＤＳ９０マススペクトルシステム（ラムゼー、ニューシャーシー）を用いて発生させた。高速キセノン原子源としてサドルフィールドイオン源（Ｉ　ｏ　ｎ、Ｔ　ｅ　ｃ　ｈ、ミドルセックス、イギリス）を用い、これは？ｋＶで操作するときに１ｒｎＡのイオン電流を生じる。マススペクトロメーターを６．８ｋＶで操作し、プロトン化により分子に１　ａｍｕ加えるよう調整した後、ｌＯ秒／１０個のスキャン速度を用いて陽性イオンモードでヨウ化セシウムによるマス領域の較正を行った。第２の合成で製造した全てのペプチド（Ｇ１．、、、ＲＧＤＦ）の測定分子量は予測した分子量と正確に一致した。第１の合成で製造したペプチドの同定を確認するために、第１と第２の合成における対応するペプチドのｌ＝１混合物をＨＰＬＣで分析したところ、これら全てが単一のピークを示した。放射性標識モノクローナル抗体の血小板への結合に対するＲＧＤ含有ペプチドの効果を評価するために、ペプチドＲＧＤＳをＰｅｎｆｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｔｅｓ（ベルモント、カリフォルニア）から購入するか、あるいは上記のようにして合成した。γ−鎖デカペプチド（４０２−４１１）とＲｕｇｇｅｒｉら（Ｒｕｇｇｅｒｉ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８３：　５７０８）によって記載されたポリアルギニンＲＧＤＶペプチドの１つ（ＬＧＧＡＫＱＡＧＤＶ　（Ｒ）、ＲＧＤＶ）との複合体である長いペプチドも同様に試験した。このペプチドは上記の方法で合成し、ＨＰＬＣで６７％以上の吸光度を含む単一の主要ピークを示した。ペプチドの長さを測定するにはＢＩＯＧＲＡＰＨ分子モデリングコンピュータープログラム（Ｂｉｏ　Ｄｅｓｉｇｎ、Ｉｎｃ、、パサデナ、カリフォルニア；バージョン１．３４）を用いた。計算は伸長した形とアルファへリックス配座の両方のペプチドについて行い、これら２つの極端な可能性をカバーするようにした。溶液中でのペプチドの正確なコンホメーションは分からないが、グリシン残基の回転自由度のために、ＲＧＤＦに付着したグリシンが多数のランダムなコンホメーションをとっていると推定している。しかしながら、ビーズ上にある高密度のペプチドの固定性がこのコンホメーションの自由度を制限しているかも知れない。上述した方法（Ｃｏｆｆｅｒ、　１９８０．　Ｂｌｏｏｄ　５５：１６９）によりフィブリノーゲンビーズ凝集アッセイを実施した。簡単に述べると、Ｍ。５ｅｓｓｏｎの方法（Ｍｏｓｅｓｓｏｎ、　１９６２．　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ５７：２０４）で精製したフィブリノーゲン（ロフト番号ＰＲ２５４８、Ｃｕｔｔｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バークレー、カリフォルニア）を、ビーズスラリ−１，ｍｌ（６７ｍｇのビーズを含有）（Ｍａｔｒｅｘ　１０２；Ａｍ１ｃｏｎ、ダンバース、マサチューセッツ）当たりフィブリノーゲン３ｍｇの比率で、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基を含む１゜３μ ポリアクリロニトリルビーズとカップリングした。カップリング完了後ビーズを０゜０５％アジドナトリウム（Ｔ　Ｓ　Ａ）を含む０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ／ＨＣＩ、ｐＨ７，４でよく洗浄し、ＴＳＡに再懸濁して４ ℃で保存した。アッセイを実施するには、丸底の９６ウエルミクロタイタープレート上で、クエン酸化ＰＲＰ　（３Ｘ１０”／１）３５μｍをＴＳＡ中のペプチド３５μｌとともに２２℃で少なくとも１０分インキュベートした。次いで結合フィブリノーゲン　〜０．４μｇを含むビーズ５μｌ　（ビーズ当たり５Ｘ１０ ’分子）を加えてプレートを２６Ｏｒｐｍで回転した。凝集度は時間の関数として目視により０から１００％の間で評価した。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに結合してフィブリノーゲン結合を阻害する抗体１０　Ｅ　５　（Ｃｏｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌｌ、　１９８３．　Ｂｌｏｏｄ　６１：９９）は１〇 −２０Ｍｇ／ｍｌで用いるときにこのアッセイでビーズ凝集の完全な阻害をもたらすので、ペプチドの代わりに１０Ｅ５を含むサンプルをポジティブコントロールとして各アッセイに含めた。ペプチドの代わりにＴＳＡバッファーを含むネガティブコントロールも各アッセイに含め、このコントロールは常に４分後に最大凝集（１００％）に達したので、溶液中のペプチドＧ１−、ＲＧＤＦの阻害効果も４分後に評価した。より長いペプチドＧ、、−，，ＲＧＤＦはこの条件では溶解性に乏しく、この方法では試験できなかった（以下の記載参照）。９．１．．４．　ビーズへのペプチドの共有カップリング乾燥ジオキサン中のポリアクリロニトリルビーズ（６７ｍｇ）（Ｍａｔｒｅｘ　１０２、ロット番号ＪＣ１２３６および１２３９）１ｍｌを２２℃、１０．０００％ｇで１分遠心した。上清のジオキサンを捨ててビーズを０．０５Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５゜５で２回すばやく洗浄した。次いでペレット状ビーズを０．０５Ｍ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ６，５中のＧ１、Ｇ８、Ｇ５、Ｇ７またはＧ、Ｒ，ＧＤＦペプチドの４．０５ｍＭ溶液１ｍｌ中に再懸濁して４℃で一夜振とうさせた。ＩＨグリシンエチルエステル（ｐＨ８）０．１容量を２２℃で３０分間加えることにより残っている反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基をブロックした。次いでビーズをＴＳＡ、ｐＨ７，４でよく洗浄し、ＴＳＡｌ、５ｍｌ中に再懸濁して４℃で保存した。Ｇ　ｌ　ｌ、Ｇ１３、Ｇ１□、Ｇ−およびＧ、ＩＲＧＤＦペプチドは酢酸バッファーには部分的にしか溶解しないが、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）　ｐＨ２，５には２２℃または３７℃で完全に溶解した。そこでＧｌｌ、Ｇ１３、Ｇ；６、Ｇｌ、およびＧｌｔＲＧＤＦペプチドは０．１％　ＴＦＡ、ｐＨ２，５中のビーズと７２時間カップリングさせた。比較のためにＧｌ　、Ｇ１、Ｇ、　、Ｇ、およびＧ、ＲＧＤＦペプチドもこの条件でビーズにカップリングさせたが、これらのビーズは酢酸バッファー中でカップリングさせたビーズと同様のカップリング効率および血小板凝集活性を示した（以下の記載参照）。コントロールとしてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、実質的にグロブリンを含まない、Ｓｉｇｒｎａ社）を３（１７ｚＭでビーズ１ｍｌとカップリングさせた。ビーズ上でのペプチドの密度を減少させる効果を評価するための別の実験では、カップリング前にＧ、ＲＧＤＦおよびＧ。ＲＧＤＦペプチドを０．４８Ｍから４．０５ｒｎＭＯ間の濃度に希釈した。カップリング効率はカップリング前とカップリング後のサンプルのペプチドピークの面積を比較することによってＨＰ　Ｔ、　Ｃにより評価した。４．０５ｍＭペプチドを用いる標準法での結果を表■に示す。ｐＨ６，５におけるＧ１、Ｇ３、Ｇ６、Ｇ７およびＧ。ＲＧ　Ｄ　Ｆペプチド、並びにｐ　ｉｉ　２゜５におけるＧｘｓＧｌｓ、Ｇ　＋　ｉ、Ｇ　＋　ｔおよびＧ１９ＲＧＤＦペプチドはそれぞれ　〜７４％および〜９１％の効率でカップリングした。表■ ポリアクリロニトリルビーズへのペプチドのカップリング効率Ｇ、、、−ＲＧＤＦ　４．０５　酢酸　、　ｐＨ６，５７３土１ｍ（ｎ４５１および７５土４（ｎ −５１Ｇｌｌｌ１ｌ−ＲＧＤ　Ｆ　４　、ＯＳ　ＴＦ　Ａ　’　９１土Ｓ　（ｎｍｓ　＞Ｇ、−ＲＧＤＦ　２　酢酸虫　、　ｐＨ６，５９４Ｇ、−ＲＧＤＦ　１　酢酸Ｑ　、　ｐＨ６，５９７に、−ＲＧＤＦ　０．５　酢酸ｊｋ　、　ｐＨ６，５９８ｃ、−ＲＧＤＦ　Ｏ、０００４−０、５酢酸基　、　ｐＨ６，５＞９８Ｇ、− ＲＧＤＦ　２　酢酸ｊλ　、　ｐＨ６，５８８Ｇ、−ＦｔＧＤｒ　１　酢酸４　、　ｐＨ６，５９２Ｇ、−ＲＧＤＦ　０．０００４−０．５　酢酸ｆλ　、　ｐＨ６，５９８Ｇ、−１’１ｃｏｙ　＜０．５　酢酸４　、　ｐ）１６．５　＞９８アルプミ：１０・０３　酢酸４　、　ｐＨ６，５９８壷平均上障準誤差今トリフルオロ酢酸これらのペプチドの平均カップリング効率が８０％と仮定すると、ビーズ各６７ｍｇ　（（４，０５Ｍモル／ｍ１）（６，０２ｘ１０１７分子／μモル）（０，８））に対して　〜ｌ、９Ｘ１０”ペプチド分子が結合したことになり、この分子数はビーズ上のＮ−ヒドロキシスクシンイミド基の　〜４０％を表し、高い力・ノブリング効率であることを示す。ビーズの推定表面積は６ｍ２／ｇであるので２ペプチドはビーズ上で　〜４．６人離れている（（６ｍ”　７ｇ）Ｘ　（０，０６７ｇ）＝０．　４ｍ２　；　１０．４ｍ”＝０．６３ｍまたは６．３ＸＩＯ’人：↓１．９ＸｌＯ”分子＝１．３８Ｘ１０’分子、（６，３Ｘ　１０　’ 入）／（１，３８Ｘ１０’分子）−４，６人／゛分子）（表Ｖ）。これが表す極めて高いペプチド密度は、液相中でて分子が４．６人離れていると仮定したときの等モル濃度に結果を解釈するのが最も適当てあり、結果は１７Ｍ溶液である。比較のため、各種濃度での液相ペプチドの平均距離を、ビーズ上のフィブリノーゲン分子、血漿中のフィブリノーゲン分子、ビーズトのアルブミン分子および血漿中のアルブミン分子と並へて示す。表■ リガンド密度と濃度ビーズ６７″ｔｇｔ°　分子間の加えた量　カップリング効率　平均距離固定化アルブミン３．０ＸＩＯ２９８４７１，６Ｘ　１０”９．１．５．モノクローナル抗体表■は抗体、その特異性および使用濃度を表す。これらは全て既に性状決定がなされている：抗体１．０　Ｅ　５　（Ｃｏｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、７２：３２５）　、　７　Ｅ　３　（Ｃａｌｌｅｒ　Ｂ、Ｓ、、１９８５゜Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　７６：１０１）　、６　Ｄ　］　（Ｃｏｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｂｆｏｏｄ　６１：９９）および６　Ｆ　１　（Ｃｏｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｂｌｏｏｄ　７４：１８２）は実験室から得；抗体Ａ２Ａｌ　（Ｂｅｎｎｅｔ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８３．　Ｐｒ。ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、８０：２４１７）はペンシルバニア大学のＪｏｅｌ　Ｂｅｎｎｅｔｔ博士からの恵Ｊｊ：抗体ＰＡＣ− １（Ｓｈａｔｔｉｌ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６０：１１０７）はペンシルバニア大学の５ａｎｆｏｒｄ　５ｈａｔｔｔｌ博士からの恵与；抗体ＬＭ　６０９　（Ｃｈｅｒｅｓｈ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋＋＋、　２６２：１７７０３）はスクリブスリサーチイシスティチュートのＤａｖｉｄＣｈｅｒｅｓｈ博士からの恵与；抗体Ｇ　ｏ　Ｈ３（Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇ　ｅｔａｌ、、　１９８８．　Ｎａｔｕｒｅ　３３６：４８７）はオランダ赤七字のＡ、Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇ博士からの恵与；そして抗体ｍＡ　ｂ　ｌ　６　（Ａｋｉｙａｍａｅｔ　ａｔ、、１９８９．　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０９：８６３）はメリーランド州、ベセスダ、ＮＩＨのＫｅｎｎｅｔｈ　Ｙａｍａｄａ博士からの恵与である。ビーズ添加の３０−６０分前に指示された濃度の抗体とともに血小板をインキュベートした。活性化血小板とのみ結合するＰＡＣ−１（Ｓｈａｔｔｉｌ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　Ｊ、　Ｂｔｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６０：１１０７）の場合、抗体添加前５分間は撹拌せずにＡＤＰ　（最終濃度６．７μＭ）で血小板を活性化した。表■ Ｇ、−Ｒ，ＧＤＦビーズアッセイにおけるモノクローナル抗体およびペプチド試験Ａｎヒ抗体１１トリグラミン　４．５　ｐｇ／ｍｌ　Ｏ丸底９６ウエルのポリメチ１ノン製ミクロタイタープレート中の３Ｘ１０’血小板／１のＰＲＰまたはＧＦＰ７０μｍに、よく混合したビーズ懸濁物５μＩ　（０，２２ｍｇビーズ）を加え、０から３０分の各種時間（０，５，１，２，４，６，８，１０，１２，１５，２０，２５，３０分）プレートを２６０ｒｐｍで回転した（Ｏｒｂｉｔ　５ｈａｋｅｒ、Ｌａｂ　Ｌｉｎｅ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、メルロースパーク、イリノイ）。上記の時間にウェルを底から拡大鏡袋ｆｉｔ（Ｃｏｏｋｅ　Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　ＳｙｓｔｅｍＸＤｙｎｅｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＩｎＣ，、アレキサンドリア、ヴアージニア）を用いて観察し、ビーズ凝集の程度を０％（目視できる凝集なし、コントロールであるアルブミンコーティングビーズと区別できない）から１００％（全凝集）までを目視て評価した（図８Ａ）。ビーズ凝集物を３分間沈降させた後、上清から５μｌを取り、上清血漿またはバッファー中の血小板数を測定した。血小板数は凝集の過程で減少し、これは凝集物への血小板の取り込みが増大したことを示唆する（図８）。いくつかの実験では、ビーズ添加３０秒前に６．７ＩＭＡＤＰで血小板を活性化し、その他の実験では、血小板を０゜１４７１Ｍ　ＰＧＥｌ（Ｓ　ｉ　ｇｍａ、セントルイス）とともに３０分間ブレインキュベートした。コントロール実験はＥＤＴＡ　（１０ｍＭ）の存在下では全く凝集が起こらないことを示唆した。凝集の過程で上清中のラクテートデヒドロゲナーゼレベルにはほんのわずかな増加しかみられず、これは血小板とビーズの相互作用により有意の血小板溶血がもたらされなかったことを示唆する。９、　１．　７．血小板からの１４ｃｍセロトニンの放出クエン酸化ＰＲＰ（３ｘ１．Ｏ目／１）を”Ｃ−５−セロトニン（１０μｃｉ／ｍｌストック溶液、最終濃度２Ｏ−２５ｎＣｉ／ｍｌ、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、ボストン、マサチューセッツ）とともにテフロンコーティングした撹拌棒で穏やかに撹拌（〜１０１００ｒｐして２２℃で３０分間インキュベートした。ＰＲＰ（７）ｐＨを常に〜７．６ｏに維持するために、インキュベーションを始める直前にＰＲＰを５％ＣＯ２，９５％空気で覆った。イミブラミン（Ｓｉｇｍａ）５μ Ｍを加えてセロトニンの取り込みを終結させ、さらに５分間撹拌を続けた。この条件下における全取り込みは添加セロトニンの７０−８０％であった。８分間振とうした後ＰＢＳ、ｐＨ７，４中の冷２％バラホルムアルデヒド７０μｌをウェルに加えて、ミクロタイタープレートを２２℃、１１００Ｏｘで５分間遠心する以外は上記と同様の方法で凝集アッセイを四重試験で行った。上清の上部５０μ ｌ　（各ウェルの全容量は１４５μｍ）をシンチレーション液に入れてシンチレーションスペクトロメーターで測定した。いくつかの実験では、セロトニン取り込みの間にＰＲＰをアセチルサリチル酸（５０ＭＭ）またはＰＧＥ、（０，１４ＭＭ）とともにプレイン初期の７Ｅ３および】ＯＥ５結合率に対するＲＧＤ含有ペプチドの効果を評価するために、本質的には上記の方法（Ｃｏｌｌｅｒ、　Ｂ。Ｓ、、　＋９８５．　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７６：１０１　）で ”５Ｉ−７Ｅ３および””！−１０Ｅ５を用いて研究を行った。ＲＧＤＳまたはＬＧＧＡＫＱＡＧＤＶ　（Ｒ）＠　ＲＧＤＶペプチドを２２℃、各種濃度で１− ５分間クエン酸化ＰＲＰ　（〜３　Ｘ　１．０８／ｍ　Ｉ）とともにインキュベートし、次いて非飽和濃度の抗体（１，，５−２，５μｇ／ｍ１）を１−２分間加えた。ＰＲＰを２０％蔗糖を用いて遠心して結合抗体を遊離抗体から分離し、血小板ペレットと上清の両方をカウントした。結果はバッファーコントロールと比較した抗体結合の増加または減少として表した。可溶性Ｇ　＋　−ｏ　ＲＧ　Ｄ　Ｆペプチドの血小板−フィブリノーゲン相互作用を阻害する能力をフィブリノーゲンビーズアッセイで試験した（表■）。表■ フィブリノーゲンビーズアッセイにおける溶液中の遊離（Ｇ）。−ＲＧＤＦペプチドの最小阻害濃度グリシン残基の数が増加するにつれて能力がはっきりと減少し、ＲＧＤＦペプチドはＧ９−ＲＧＤＦペプチドよりも約ｌθ倍強力であった。長いペプチドの能力の低下は拡散係数の低下だけでは説明できないように思われる。なぜなら、Ｇ、−ＲＧＤＦペプチドの分子量（７８６）はＲＧＤＦペプチドの分子量（４３５）の２倍よりも小さいからである。９．２．２．ペプチドビーズ凝集アッセイアルブミンでコーティングしたビーズはたとえＡＤＰを加えても血小板によっては凝集しなかった。これはＡＤＰを加えるときに形成する血小板集合物中にビーズが非特異的に取り込まれるのではないことを示唆する。図８および９のデータは、ＰＲＰによる（Ｇ）　、、、−Ｒ，ＧＤＦビーズの凝集度を時間とグリシン残基の数の関数として示したものである。グリシン残基の数が１から１３に増加するとき全血小板凝集活性と凝集速度はともに劇的に増加したが、グリシン数がさらに１９まで増加するにつれて活性は減少した。Ｇ、− ＲＧＤＦビーズはＧ、−ＲＧＤＦビーズとＧ、−ＲＧＤＦビーズの中間の値を示し、Ｇ１、−ＲＧＤＦとＧ、、−ＲＧＤＦビーズはＧ　＋　ｓ　−”−ＲＧ　ＤＦビーズと同様の値を示した。したがつＣ、フィブリノーゲンビーズアッセイの阻害において液相で試験するとき、たとえ短いＲＧＤＦペプチドがＧ、−ＲＧＤＦペプチドよりも強力であるとしても、固定化Ｇ９−ＲＧＤＦペプチドは固定化された短いペプチドよりも血小板凝集においてはるかに強力であった。長いペプチド（Ｇ　、、−およびＧ、９−ＲＧＤＦ）における血小板凝集活性の減少は顕著であり、これは多分ペプチドが折り畳めるほど十分な自由度をも、っているか、あるいは相互に作用していることを示唆している。（Ｇ）ゎ　−ＲＧＤＦビーズより先に血小板にＡＤＰを添加すると、全ての種類のビーズにおいて凝集速度と凝集程度がともに増加した（図１ＯＡ）。ＡＤＰ刺激によって、３０分間で４４±６％（ｎ＝１７）から９６±４％（ｎ−７）へとＧｌ−ＲＧＤＦビーズが全凝集程度において最大の増加を示した。したがって、ＡＤＰによる血小板の前活性化はＲＧＤ−結合部位の親和性を増加し、および／またはその血小板表面からの距離を減少すると思われる。ＰＧＥ、　とともにｌ）　ＲＰをブレインキュベーションすると、ＰＲＰの（Ｇ）、−ＲＧＤＦビーズ凝集能力を有意に減少させた（図１０Ｂ）。Ｇ　ｌ−ＲＧ　Ｄ　ＦおよびＧ、ｔ−ＲＧＤＦビーズの凝集は完全に停止したが、長いビーズによる凝集はあまり影響を受けなかった；実際、Ｇ、−ＲＧＤＦビーズは３０分で７５±１６％（ｎ−７）凝集であり、６１％−ＲＧ　Ｄ　Ｆビーズは同じ時間で８８±１３％（ｎ＝４）であった。したがって、ｌ）　Ｇ　Ｅ　、による血小板活性化の阻害によっては、血小板と長い（Ｇ）　、、−Ｒ，ＧＤＦビーズとの間の相互作用は有意に阻害されなかった。Ｇ、−ＲＧＤＦベブヂドでコーティングしたビーズは血小板活性化の機、能としての血小板相互作用において最も顕著な相違を示（７た。すなわち、ＰＧＥ、は相互作用を完全に阻害し、一方ＡＤＰは凝集速度と程度をともに劇的に増加した（図１０Ｃ）。したがって、Ｇ　３− ＲＧＤＦペプチドは、ＲＧ　Ｄ受容体部位の活性化の状態を報告する際の決定的長さあるいは融通性をもっていると思われる。ビーズ表面上でのペプチド数の減少により凝集反応が減少した（図１１）が、ペプチド数をほぼ１０倍減少させたときでも実際には完全凝集が達成された。ペプチド数が約１００倍減少したときでさえ、Ｐ　ＲＰでの凝集がいくらか起こ〕だ。ＡＤＰで前活性化すると全てのビーズ調製物で凝集の増強が見られ、約１００倍少ないペプチドを含むビーズでさえ完全凝集が達成された。密度計算（表■）によれば、非活性化血小板の完全凝集にはビーズ」二で１３Å以下のペプチド− ペプチド間の距離が必要であり、一方ＡＤＰ活性化血小板の完全凝集には４１Å 以下のペプチド−ペプチド距離が適当であることをデータは示している。ビーズ凝集に対する遊離ＲＧＤＦおよびγ−鎖ペプチドの阻害効果も検討した。長いペプチドを含むビーズの凝集を阻害するには高濃度のＲＧＤＦが必要であり（表■）、また短いペプチドを含むビーズには低濃度のＲＧＤＦが必要であった。例えば、Ｇ。 −ＲＧＤＦビーズでは４１．ｔｔＭのＲＧ　Ｉ）　Ｆが凝集を停止させたが、一方Ｇ、−ＲＧＩ）Ｆビーズにおいて凝集停止に４００μＭが必要であり、７個またはそれ以上のグリシン残基を含むビーズでは凝集停止には３−４ｍ、ＭのＲＧＤＦが必要てあった。低濃度のＲＧＤペプチドは不完全な阻害をもたらし、これは血小板凝集の初期に最も顕著であった。フィブリノーゲンγ−鎖ドデカペプチド誘導体も（Ｇ）ゎ−ＲＧＤＦビーズの凝集を阻害した。すなわち、モル数換算すると、γ−鎖ペプチドの阻害能力はＲＧＤＦペプチドの阻害能力よりもやや低かった（表■）。９．２．３．セロトニンの放出ＰＲＰ中の血小板と長い固定化ペプチドとの相互作用はセロトニンの放出をもたらし、放出度は凝集度と相関していた（表■）。（本頁以下余白）表■ （Ｇ）。−ＲＧＤＦビーズと相互作用する血小板の多い血漿中の血小板からの８分間でのセロトニンの放出ビーズ上のペプチド　セロトニン放出（最大％〉−！ヨ７９Ω−〇　１−ＲＧＤＦ　Ｏ會１慟Ｇ、−ＲにＤＦ　’　］フＣ，−ＲＧＤＦ　９　７５Ｇ、−Ｍ；ＤＦ　１６　８ＢＧ、−ＲＧＯＦ　１００惨２回または３回の実験の平均値アセチルサリチル酸（５０１ｚＭ）とともに血小板をブレインキュベーション（７てもこのパターンに変化はなかった。しかしながら、ＰＧＥＩは全てのビーズにおける８分間の凝集における放出を停止させたが、長いビーズにおける凝集応答は依然５０％に達した。したがって、放出反応は凝集には必要ではないが、応答を増幅し、また加速するのかも知れないと推論される。９．２．４．ＧＦＰとＲＧＤＦビーズとの相互作用凝集がペプチドの長さに依存し、かつＡＤＰで血小板を活性化することにより増強されるという点において、ゲル濾過血小板は、ＰＲＰで観察されたのと同様のビーズとの相互作用パターンを示した（図１２）。これらのデータは、凝集にはビーズと血漿タンパク質との相互作用は必要ではないことを示唆している。しかしながら、ＰＲＰと比べてＧＦＰには凝集にいくらかの差異があった。したがって、短いペプチドを含むビーズを用いると、ＧＦＰによる凝集はＰＲＰよりも遅く、かつ小さい。これとは対照的に、長いペプチドを含むビーズを用いると、いずれの血小板調製物を用いても究極的な凝集程度は最大であったが、Ｇ　Ｆ　Ｐによる凝集はＰＲＰでの凝集よりもいくらか活発であった。血小板機能に対するゲル濾過の効果、血漿タンパク質の存在および、／またはｐＨの相違（Ｐ　Ｒｉ、）のｐＨは〜７．７０であり、ＧＦＰのｐＨは７゜４０であるンが多分これらのささいな相違を説明するのであろう。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａと相互作用し、かつフィブリノーゲンの血小板への結合を阻害するモノクローナル抗体１０Ｅ５、Ａ　２Ａ−１７Ｅ３、およびＰＡＣ−１は全て、ＡＤＰ活性化を行ったとしても、ＰＲＰ中における血小板のＧ　ＩＲＧ　Ｄ　Ｆ　、　Ｇ　２　ＲＧ　Ｄ　ＦおよびＧ、−ＲＧＤＦビーズとの相互作用を９０％以上阻害した。しかしながら、長いビーズを用いると、抗体の阻害能力における相違は明らかとなった。図１．３Ａに示すように、Ｇ、−ＲＧＤＦビーズを用いると、Ｉ　ＯＦ２は初期の凝集応答を顕著に遅らせたが、３０分までにコントロール値の〜６０％に達した。ｌ　ＯＦ２は血小板集合をブロックするので、これは血小板の集合が凝集が起きるためには必要ではない、ことを示すものである。１０Ｅ５の濃度を３倍に増加（６０Ｈｇ／ｍＩまで）してもこのパターンに変化はなかった。Ａ、　２　Ａ、、は、より大きいがまだ不完全な阻害をもたらし、３０分での凝集は３８％のみにとどまった。７Ｅ３は最大の阻害をもたらし、３０分で検出しうる凝集を全く生じなかった。ＡＤＰで刺激した血小板でアッセイを実施すると、Ｉ　ＯＦ２およびＡ２Ａ、は特に初期の段階でやや阻害が少なくなったが、コントロールと比較するとまだ相違は劇的であった（図１．３Ｂ）。７Ｅ３はこれらの条件下でまだ完全阻害をもたらすことができた。しかしながら、Ｇ　ｌ＋−１Ｇ１１−、Ｇｌ？−ＲＧＤＦビーズおよびＡＤＰ活性化ＰＲＰを用いると、７Ｅ３でも凝集を完全に阻害することはできず、３０分後には１．１−２５％に達した（データ示さず）。７Ｅ３の阻害能力についての１つの可能な説明としては、これがＧ　Ｐ　ＩＩ　ｂ　／　ＩＩＩ　ａに加えてａｖ／ＩＩＩａ　ＶｎＲと反応することである（Ｃａｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９１．　Ｂｌｏｏｄ　７７：７５ＨＣｈａｒｏ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋ｎ、　２６２：９９３５）　、これを確かめるため、我々はａｖ／　ｍ　ａとは反応するがＧ　Ｐ　ＩＩ　ｂ　／　ＩＩＩ　ａとは反応せず、またａ、／ｍａ機能をブロックすることのできる抗体ＬＭ　６０９　（Ｃｏｌｌｅｒｅｔ　ａ、１．、１９９１．前出；　Ｃｈｅｒｅｓｈ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｊ、　Ｂｊｏｌ、　Ｃｈｅｍ。２６２　：１７７０３）の効果を研究した。抗体７Ｅ３もａ、／Ｉ［［ａ機能を阻害することができ、かつ７Ｅ３とともに血小板をブレインキュベーションすると”’Ｉ−ＬＭ　６０９の結合を減少させ、これは７Ｅ３とＬＭ　６０９がａ、１ｍａ上の近い部位で結合することを示唆する。ＬＭ　６０９だけではビーズ凝集に何ら効果をもたらさず、１ＯＥ５（抗−ＧＰ１１ｂ／ＩＩ［ａ）およびＬＭ６０９９（抗−ａｖ／Ｉ［ｒａ）との組み合わせは１０Ｅ５単独よりも阻害が少なかった。７Ｅ３はａｖ／ｎｌ［ａとも反応するので、これらのデータは７Ｅ３がその他の抗体よりもＧ　Ｐ　ＩＩ　ｂ　／　ＩＩＩ　ａに対するより強力な阻害物質である、という仮説を指示しない。Ｇ、−ＲＧＤＦおよびＧａ　ＲＧＤＦビーズの凝集を効果的に阻害するＰＡＣ− １は、長いビーズで試験したとき、その他の３抗体よりもはるかに阻害活性が少なかった。例えば、Ｇ、−ＲＧＤＦとでは、３０分で８％の阻害を生じたのみであった（表■）。したがって、ＰＡＣ−１がＲＧＤ−結合部位に結合することを示唆する証拠（Ｔａｕｂ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４：２５９）があるにもかかわらず、これはその他の抗体よりも阻害活性が少なかった。血小板ＧＰＵｂ／ｍａ受容体をほぼ飽和すると報告されている濃度（Ｈｕａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｊ、　Ｂｔｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２：＋６１５７）の約２倍であるトリグラミン３−４．５ｕｇ／ｍＩ　（〜０．６μＭ）は、短いビーズで凝集を阻害したが、長いビーズでは初期で阻害したのみであり、３０分では全く阻害が観察されなかった（表■）。可溶性ＲＧＤＦペプチドでは〜２００μｇ／ｍ１　（〜４００μＭ）で同様の阻害パターンが観察され、フィブリノーゲンの血小板への結合阻害において、トリグラミンがＲＧＤＳペプチドよりも約５００倍強力であることを示すＨｕａｎｇら（前出）のデータと一致した。そのリガンド内でＲＧＤ−含有配列を認識することのできるその他の血小板上のインテグリン受容体に対する全ての抗体［Ｇ。）（３（抗−１ｃ／ｌ１ａ）　、ｍＡｂ　１６　（抗−１ｃ＊／ｌ１ａ）、および６ＦＩ　（抗−１ａ／ＩＩａ）］は、ビーズ凝集を阻害しなかった（表■；各抗体につき３つの異なる実験を行った）。非−インテグリン受容体ＧＰＩｂに対する抗体である６Ｄ１も凝集に何ら効果をもたらさなかった。これらのデータは受容体と（Ｇ）。−ＲＧＤＦペプチドとの相互作用が観察された凝集に寄与しないことを示唆するが、ＲＧＤ結合部位への接近をブロックすることなしに受容体への大分子リガンドの結合を阻害する方法でこれらの抗体が受容体と結合することが可能であるので、この結論を緩和されなければならない。（本頁以下余白）９　、２．６．７Ｅ３および１０Ｅ５の結合に及ぼすＲＧＤペプチドの作５ｎＭまでの濃度のＲＧＤＳとのクエン酸化ＰＲＰのインキュベーションは７Ｅ３結合の初速塵を阻害しなかった：事実、２．５　ｍＭでは６３％の速度の増加（ｎ＝１）であり、０．５−１　ｍＭでは２１％の増加（ｎ　＝　４　）であって速度は一貫して増加した（５ｍＭでは６６％の速度増加（ｎ　＝　２　））。同じような濃度のＲＧＤＳは１ＯＥ５結合にほとんどまたは全く作用を及ぼさず、ひとつの実験においては５％速度を減少し、他の２つの実験においては２％と２４％速度を増加した。しかしながら、より長いＲＧＤペプチド［ＬＧＧＡＫＱＡＧＤＶ（Ｒ）ｇＲＧＤＶ］は７Ｅ３と１０Ｅ５両方の結合の初速塵を一貫して阻害した。ペプチドの濃度の増加と共に２０μＭでの最大−７３％阻害（ｎ＝２）まで、７Ｅ３結合の初速塵の漸増阻害を示し７Ｅ３に及ぼす作用はさらに顕著であった。これよりさらに高いペプチドの濃度（８０ｌＩＭ　−１，６７ｍＭ）は阻害を有意に増加しなかった（７６％；ｎ；８）。２０７１Ｍまでのペプチドの濃度は血小板に対する１０Ｅ５の結合切速度を漸進的により大きな阻害を生じ４３％阻害でプラトーに達したニアＥ３に関しては、ペプチド濃度をさらに増加させても阻害を増加しなかった（８０７４　Ｍ　−１，６７ｍＭ＝　４６％；　ｎ＝４）。９．３．検討粘着性糖タンパク質に含まれるＲＧＤ配列と血小板表面のレセプターとの相互作用は正常な血小板機能に必須であると考えられる。本研究において、我々はこれらの相互作用を仲介する血小板レセプターの構造的プローブとして種々の長さの固定ＲＧＤペプチドを用いた。我々は最短の固定ペプチド（Ｇ、−ＲＧＤＦ）がＰＲＰにおいて未活性化または活性化血小板と最小の反応をするが長いペプチド（＞Ｇ、−ＲＧＤＦ）は未活性および活性血小板の両方とうまく相互作用する（しかし後者は活発な相互作用である力りことを見い出した。さらに、これら長いペプチドとの相互作用は、恐らくレセプタークラスターを生じることにより血小板放出反応を誘発し得る。ＰＧＥ、による血小板活性化の阻害は短いペプチドを含むビーズとの血小板の相互作用を止めるが、長いペプチドで被覆されたビーズとの血小板の相互作用を部分的にのみ阻害した。中間サイズのペプチド（Ｇ　ｓ　ＲＧ　Ｄ　Ｆ　）はＰＧＥＩで前処理した血小板とは事実」二相互作用がなく、天然の血小板とはゆっくりで不完全な相互作用でありそしてＡＤＰ活性化血小板とは活発で大規模な相互作用があり血小板の活性化状態に対しては最大の感度を示した。長い固定化ペプチドの血小板と相互作用する強化された能力とは対照的に、溶液中の長いペプチドは血小板とフィブリノーゲン被覆ビーズとの間の相互作用を阻害することにおいて短いペプチドよりも強くはなかった。これはグリシン残基数の増加によって与えられた固有の親和上の有利性の結果と（７て固定化された長いペプチドが血小板との強化された相互作用を示さない、ことを示す。事実、それらは親和性に関して固有の不利な点を克服しなければならなかった。ビーズ上のペプチド密度の相異もまた観察された相異を説明することはできない。なぜならペプチドは大体同し密度で全て固定化しており希釈研究はペプチド密度における小さな相異がほとんど作用しないことを示した。従って、長いペプチドはより効果的なようであった。なぜなら、それらはし・セプターのＲＧＤ結合部位により容易に近づくことができるからである。長いペプチドの長さの増加と柔軟性の増加の両方がレセプターと相互作用する、この強化された能力に寄与し得る。任意の条件Ｆての血小板と相互作用する、最短のペプチドの最小能力は、ＲＧＤ結合部位がレセプターの表面から少なくとも数オングストローム引っ込んでいることを示す。ペプチドの長さを増加するにつれて漸増する相互作用の勾配はＲＧＤ部位が種々の深さに並んでいることを示している。なぜならレセプター自体血小板から種々の距離であるかまたはＲＧＤ結合部位がレセプターにおいて種々に引っ込んでいるかどちらか一方だからである。反応性の増加がＧ、−ＲＧＤＦとＧ、−ＲにＤＦビーズとの間で最も顕著でかつペプチドの長さを９グリシン残基以上に増加した後、血小板反応性における増加はほとんどないので、レセプターの大部分はＧ、　−ＲＧＤＦおよびＧ　ｏ　ＲＧ　Ｄ　Ｆペプチドの届くところに位置しているようである。この範囲のペプチドが代表する最大長を推定するために、我々はグリシンがαらせんコンホメーション（この場合、グリシンは、はんの１．５５人しか離れていない）であるよりむしろｌグリシン残基に付き３．５人を有する伸長したコンホメーションを採っていると仮定する。従って我々はＲＧＤ結合部位の主要部位はビーズの表面から〜１．１．．３２人伸長しているペプチドにより届くと結論する。Ｇ、３−ＲＧＤＦより長いペプチドを含むビーズと起る凝集の増加が微小でさえもないので、我々は実際上全てのレセプターはビーズの表面から〜４６人伸長しているペプチドにより届くと結論する。ＡＤＰ活性化後の応答の増加は活性がＲＧＤ結合部位を血小板表面に近づくように動かすかまたは、恐らく立体的妨害によりレセプターのＲＧ　Ｄペプチドに対する親和を増加させることを示す。後者の過程を上に重なり収縮している領域が開くかまたは結合部位へのさもなければねじれた経路がまっすぐになることとして視覚化し得る。ＰＧＥＩにより生じた凝集応答の減少は、それがＲＧＤ結合部位をさらに引っ込ませるかまたは恐らくより大きな立体的妨害の結果として低親和性になるかどちらか一方を示す。しかしながら、ＰＧＥＩ前処理してさえ長いビーズはかなりの凝集を生ずることができるということを強調することが重要である。ひとつの可能な説明は、血小板ｅＡＭＰを増加するＰＧＥＩのような薬剤による最大の阻害下においてさえ、レセプターはＲＧＤ含有リガンドと相互作用できるコンホメーションとできない他のものとの間のダイナミックな平衡状態にあるということである。適切なコンホメーションのレセプターを介してのビーズ上のＲＧＤペプチドに対する血小板の結合は、その時血小板がビーズ表面にとどまるのを可能にするが、別のレセプターは正しいコンホメーションを一時的に採る。ＲＧＤペプチドの密度は非常に高いので、レセプターはＲＧＤペプチドを見つけて、たとえそのレセプターが適切なコンホメーションにとどまっている時間が短くとも相互作用するようである。このように各相互作用は血小板が長くとどまるようにし、さらに別の相互作用を容易にし、その過程を促進し完全凝集になるまで続く。または、あるいはさらに、長いペプチドの長さおよび柔軟性により、充分な時間があれば、それらが自分自身をさもなければ近づけないレセプターのＲＧＤ結合部位に入り込むのを可能にする。ビーズ上の非常に高密度のベブチドはまた低親和性相互作用にさえ都合よく働くであろう。１０．実施例：赤血球と結合したモノクローナル抗体上記５，３１項で記載しているように、種々のターゲット指向性分子を赤血球と結合してターゲット指向赤血球、特にターゲット指向担体赤血球を産生ずる。本実施例は、モノクローナル抗体を赤血球に結合することにより赤血球の血小板に対する標的を示す。全血を最終量１０ｍ１になるようにＣＰＤ−Ａ　Ｉ抗凝血物質１．２ｍｌを含むチューブに集めた。血液を７００Ｘｇで３．５分間、２２℃で遠心分離した。血小板を多く含んだ血漿（ＰＲＰ）を取り除き、１７００小板の少ない血漿（ＰＰＰ）を取り除き、赤血球２ｍｌを残した。赤血球を緩衝液Ｃ（１４０ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＫＣＬＳｌｏｍＭ　ＮａＰＯ＋、および１０ｍＭグルコース、ｐＨ７，４）中で３度洗浄し、１０％へマドクリットになるように緩衝液Ｃ中に懸濁した。１０、１．２．モノクローナル抗体１０Ｅ５血小板糖タンパク質ＧＰＩＩｂ／ｌ１ｌａ特異的モノクローナル抗体１０Ｅ５の１．　Ｉｍｇ／ｍｌ溶液を調製した（上記８および９項参照）。約１ｍｌの１０Ｅ５溶液に＋２５　ｉ標識した１０Ｅ５抗体１０ｕｌ　（２１μｇ／ｍｌ）を加えた。非放射性および放射標識１０Ｅ５抗体溶液を１２．０００−１４．０００分子量カットオフ透析チューブを用いて透析した。緩衝液ＣをＮ、バブルでガス抜きし、Ｉ（＋−Ｄ　Ｇクロマトグラフィー支持体（ＢｉｏＲａｄ　Ｅｃｏｎｏｐａｃ）　ｌ０ｍ１で平衡化した。１０Ｅ５を２−メルカプトエタノール１μｌ　（約１４ｍＭ）を加え２２°Ｃで６０分間インキュベートして（一対のＨ鎖−Ｌ鎖の一価分子を含む種々の形態に）還元した。還元１０Ｅ５を緩衝液Ｃで溶出したＩＯ−Ｄ　Ｇカラムを用いてクロマトグラフィーにかけた。それぞれ０．５ｍｌずっ２ｏフラクション集めた。フラクション＃　５−８　（２，２ｍ１）は放射性でありがっ０゜５３ｍｇの抗体（１，７７ｘ　１０１０５ｃｐを含んでいた。これらの貯めたフラクションから、ゲル電気泳動およびエルマンアッセイのために７５μｌ取り出した。１．０．１．３．モノクローナル抗体の赤血球とのカップリング赤血球３ｍ１（１０％へマドクリット）を４３０Ｘｇで４分間、２２℃で遠心分離した。ベレットを緩衝液Ｃに３０％へマドクリット（１ｍｌ）となるように懸濁した。赤血球に、緩衝液０５０μ！中に新しく調製したｌｏｍｇ／ｍｌ　ｍａｔ−ｓａｃ−ＨＮＳＡ　Ｏ，５ｍｇを加えた。反応混合物を２２℃で１２０分間振盪し、続いて緩衝液Ｃて４度洗浄し、緩衝液Ｃ中で１ｍｌになるように懸濁した。続いて赤血球の２５０μ！アリコートを還元１０Ｅ５抗体０．５３ｒｎｇ　（２，１ｍｌ）と３０分間２２℃で反応させた：反応混合物の上をＮ２でおおった。ｍａｌ−ｓａｃ−ＨＮＳＡとカップリングした対照赤血球を緩衝液Ｃ（抗体なし）と３０分間２２℃で反応させた。１０Ｅ５または緩衝液のみと反応させた後、細胞を４分間、４３０×ｇで、２２ ℃で遠心分離した。上清を取り出し冷凍保存した。細胞を緩衝液Ｃで３度洗浄し放射能を測定した。１０Ｅ５抗体の比活性に基づく計算は、ｌ赤血球に付き約１３６０抗体分子が結合するこ血小板共凝集アッセイを行った。赤血球１００μｌ　（１０％へマドクリット、結合した１０Ｅ５、ｍａｌ−ｓａｃ−ＨＮＳＡ対照および未修飾対照）を混合し１０分間インキュベートした。混合細胞を８分間回転させ、新しい試料の微視的細胞結合を４００Ｘ位相差顕微鏡を用いて、ただちに測定した。さらに血液塗抹標本を調製し、染色し、オイルイマーションレンズを用いて１００ＯＸで顕微鏡により観察した。顕微鏡検査は、血小板と相互作用する１０Ｅ５結合赤血球と相互作用しないｍａｌ−ｓａｃ−結合赤血球とを明瞭に区別した。１０Ｅ５結合赤血球の血小板との結合が特異的であることを示すために、共凝集アッセイを可溶性１．０Ｅ５抗体の存在下で行った。試料の顕微鏡検査は、可溶性１０Ｅ５と事前にインキュベートした場合、血小板が１０Ｅ５結合赤血球と結合しないが、可溶性１０Ｅ５の非存在下では血小板は１０Ｅ５結合赤血球との相互作用を再び示すことが明らかとなった。＋０．２．検討これらの結果は赤血球はターゲット指向性分子と結合することにより、特定の細胞を標的にてきることを明瞭に示す。この場合、ターゲット指向性分子は血小板上の糖タンパク質ＧＰＩＩｂ／１ｌｌａに特異な一価モツクローナル抗体１０Ｅ５に還元する。本発明はごこに記載された特定の実施態様により範囲を限定されるものではない。なぜならそのような実施態様は本発明の態様の唯一の実例を意図するものではないからであり、また機能的に等価なとのような実施態様も本発明の範囲に入る。事実、ここで示されかつ記載されたものに加えて本発明の種々の改変は上述の記載とそれに付随した図面により当業者には明らかであろう。そのような改変は本発明の請求の範囲に入るものと意図される。種々の参考文献がここに引用されており、その開示を本明細書に完全なまま参考文献として編入している。（来貢以下余白）［ＮａＣｌ３　（％）変形可能指数一一一一一一一一　−・ＰＡ、Ｓ、＋　ＰＡ、Ｓ、　フルオログラムトロンボ赤血球コントロール赤血球ＦＩＧ、　８ＢＰＲＰ中の（Ｇ）ｎ−ＲＧＤＦビーズ凝集時間（分）時間（分）時間（分）０１２　４　６　８　（０１２’３０時間（分） ■ Ｖ工国際調査報告 −−−１−ｍ−ｊ″ＦＣｒ／ｌ！１４１　／ｌｌｌ１１ｉ＋Ｉｌ−−−＾−−Ｈａ訂瓜】１ｍ℃ ＰＣＴ／Ｕミ　９１／の６４３のｚ＋＋蕩−＆−−ｊ番　番コ　ｒｖｒｒ　Ｐ二τｌτ７ｆｉ／フ；２Ｔｈｅ　ｃｌａｉｍｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　イＩＶＰ　ａｒｅｌｕｏｔ　ｈａｖｅ　ｔｈｅ　ｅｈｓｉｒｓｃｔｅｒｉｔｔｉｅｓ＋　ｖｆ＝・　Ｓユ１１ユ＋Ｔ−ニー？７．　ｉ：、　ａｎｄ　Ｅラ　―ｒｅ、ピｒａｖｈ　ｔｒ　ａ　ｍｍｔｈＣｄ　ｉｔ、ｒ：：：ｔ８′二二二＋＊；ｌ　Ｌユｅｅピｉｒ；９．　ｃ二ａｔｚｉｆｉｅｄ　＝ｒ、Ｃ二ａｇｉ　Ｅｈの４．　ｃｖｈ：二ａｃｔ　４゜ｔａｒ９ｅｔｐｄ　＠Ｐｒｙｔｈｒｏｅｙｔｒ、ｅ二５ａｓｓｉ？ｉｅｃ！　ｉｃ　Ｃ１ａｓｓ　４＝！、ｔ＝＊＝二ａＬＬ　：４Ｃ，：。ＩＶ、　Ｃユａ１ｍｔ　６８．　Ｅｌ？、　ａｎｄ　Ｅ、＋Ｅａ　ａｒｅ、　ピｒａＷｆ＋　’ｙＣ＆　ｍ？’−ｈＣ−ご　４６ｒｔｒｐｓｔｉｎａ　ａ　ｄｉｓｅａｓｅ、ｅユａｓａｉｆｌｐｄ　ｉｎ　Ｃａｍｍｍ　！５４−　ｆ−ｕｂζ ：＆８＃　ニーＰＣ７，’ピＳ　９１．ｚＳ８４３Ｇ’Ｄｅｔａｉ１ｅｄ　ｒｅａｓｏｎｓ＋　ｆｏｒ　ｈｏユｄｉｎａ　１ｍｃ−ｋ　ｏｆ　ｕｎｉｔｖ　ｏｆ　１ｎｖｅｎｔｌｏｎ

Claims

【特許請求の範囲】

１．（ａ）赤血球；（ｂ）該赤血球に第１官能基で共有結合により結合された多官能性生体適合性分子；および（ｃ）式：Ｒ１　【配列があります】Ｒ２〔式中、Ｒ１はアミノ酸または１個より多いアミノ酸の配列を表し、そしてＲ１は多官能性分子の第２官能基に共有結合で結合しており、Ｒ２はＯＨ、アミノ酸またはそのアミド、もしくは１個より多いアミノ酸の配列を表す〕を有するポリペプチド；を含み、活性化血小板に選択的に結合できることを特徴とするトロンボー赤血球。
２．匹敵する未処理の赤血球の流動学的性質と有意な差がない流動学的性質をもつことをさらに特徴とする、請求項１記載のトロンボー赤血球。
３．前記有意差の欠如はレーザー回折エクタサイトメトリーにより証明される、請求項２記載のトロンボー赤血球。
４．赤血球と多官能性分子上の第１官能基間の共有結合（結合の長さを含む）からポリペプチド中のＡｒｇのＮ末端までのセグメントの長さが、該セグメントを直線として測定するとき、９−５０オングストロームである、請求項１記載のトロンボー赤血球。
５．前記セグメントの長さが１０−４０オングストロームである、請求項４記載のトロンボー赤血球。
６．前記セグメントの長さが１１−２５オングストロームである、請求項４記載のトロンボー赤血球。
７．多官能性分子の第１官能基がグリコホリンＡダイマー、グリコホリンＡモノマー、およびグリコホリンＢより成る群から選ばれる赤血球上の分子に結合している、請求項１記載のトロンボー赤血球。
８．Ｒ２がフェニルアラニンである、請求項１記載のトロンボー赤血球。
９．（ａ）赤血球；（ｂ）該赤血球に第１官能基で共有結合により結合された多官能性生体適合性分子；および（ｃ）式：ＸＹ（Ｚ）ｎ【配列があります】Ｒ〔式中、Ｘ、ＹおよびＺは独立してアミノ酸を表し、そしてＸは多官能性分子の第２官能基に共有結合で結合しており、ｎは０または１を表し、ＲはＯＨ、アミノ酸またはそのアミド、もしくは１個より多いアミノ酸の配列を表す〕を有するポリペプチド；を含み、活性化血小板に選択的に結合できることを特徴とするトロンボー赤血球。
１０．記載した順序で、次の工程：（ａ）式：Ｒ１【配列があります】Ｒ２〔式中、Ｒ１はアミノ酸または１個より多いアミノ酸の配列を表し、Ｒ２はＯＨ、アミノ酸またはそのアミド、もしくは１個より多いアミノ酸の配列を表す〕を有するポリペプチドに多官能性生体適合性分子を約６．０のｐＨで結合させること、その際ポリペプチドヘの多官能性分子の結合は該分子上の第１官能基とＲ１間の共有結合の形成によるものである；（ｂ）生成した多官能性分子−ポリペプチド複合体のｐＨを約７．４のｐＨに調整すること；および（ｃ）多官能性分子−ポリペプチド複合体を赤血球と約７．４のｐＨで結合させること；を含み、その結果多官能性分子上の第２官能基と赤血球との間に共有結合が形成される、トロンボー赤血球の製造方法。
１１．請求項１０の方法により製造されたトロンボー赤血球。
１２．匹敵する未処理の赤血球の流動学的性質と有意な差がない流動学的性質をもつことをさらに特徴とする、請求項１１記載のトロンボー赤血球。
１３．前記有意差の欠如はレーザー回折エクタサイトメトリーにより証明される、請求項１２記載のトロンボー赤血球。
１４．赤血球と多官能性分子上の第２官能基間の共有結合（結合の長さを含む）からポリペプチド中のＡｒｇのＮ末端までのセグメントの長さが、該セグメントを直線として測定するとき、９−５０オングストロームである、請求項１１記載のトロンボー赤血球。
１５．前記セグメントの長さが１０−４０オングストロームである、請求項１４記載のトロンボー赤血球。
１６．前記セグメントの長さが１１−２５オングストロームである、請求項１４記載のトロンボー赤血球。
１７．多官能性分子の第２官能基がグリコホリンＡダイマー、グリコホリンＡモノマー、およびグリコホリンＢより成る群から選ばれる赤血球上の分子に結合されている、請求項１１記載のトロンボー赤血球。
１８．多官能性分子が１−ヒドロキシ−２−ニトロベンゼン−４−スルホン酸ナトリウム塩のＮ−マレイミド−６−アミノカプロイルエステルであり、ポリペプチドがアセチル【配列があります】アミドである、請求項１１記載のトロンボー赤血球。
１９．多官能性分子の第２官能基が赤血球のアミノまたはスルフヒドリル基と共有結合を形成することにより赤血球に結合される、請求項１１記載のトロンボー赤血球。
２０．多官能性分子上の第１官能基がＲ１のアミノ酸またはスルフヒドリル基と共有結合を形成することによりＲ１に結合する、請求項１１記載のトロンボー赤血球。
２１．Ｒ２がフェニルアラニン、トリプトファン、トレオニン、およびそれらのアミドより成る群から選ばれる、請求項１１記載のトロンボー赤血球。
２２．Ｒ１が【配列があります】またはそのアセチル化誘導体である、請求項２１記載のトロンボー赤血球。
２３．記載した順序で、次の工程：（ａ）式：ＸＹ（Ｚ）ｎ【配列があります】Ｒ〔式中、Ｘ、ＹおよびＺは独立してアミノ酸を表し、ｎは０または１を表し、ＲはＯＨ、アミノ酸またはそのアミド、もしくは１個より多いアミノ酸の配列を表す〕を有するポリペプチドに多官能性生体適合性分子を約６．０のｐＨで結合させること、その際ポリペプチドヘの多官能性分子の結合は該分子上の第１官能基とＸの間の共有結合の形成によるものである；（ｂ）生成した多官能性分子−ポリペプチド複合体のｐＨを約７．４のｐＨに調整すること；および（ｃ）多官能性分子−ポリペプチド複合体を赤血球と約７．４のｐＨで結合させること；を含み、その結果多官能性分子上の第２官能基と赤血球との間に共有結合が形成される、トロンボー赤血球の製造方法。
２４．有効量の請求項１記載のトロンボー赤血球を哺乳動物に投与することから成る、哺乳動物における出血の制御方法。
２５．有効量の請求項３記載のトロンボー赤血球を哺乳動物に投与することから成る、哺乳動物における出血の制御方法。
２６．有効量の請求項４記載のトロンボー赤血球を哺乳動物に投与することから成る、哺乳動物における出血の制御方法。
２７．有効量の請求項１１または１６記載のトロンボー赤血球を哺乳動物に投与することから成る、哺乳動物における出血の制御方法。
２８．哺乳動物がヒトである、請求項２４記載の方法。
２９．哺乳動物がヒトである、請求項２７記載の方法。
３０．トロンボー赤血球が前記ヒトに由来するものである、請求項２８記載の方法。
３１．トロンボー赤血球が前記ヒトに由来するものである、請求項２９記載の方法。
３２．次の工程：（ａ）哺乳動物１ｋｇあたり約０．２８６−３．５７ｍｌの赤血球含有血液を採取すること；（ｂ）該赤血球を洗浄すること；（ｃ）該赤血球を多官能性生体適合性分子を介して約０．０５×１０６−２０× １０６／赤血球のポリペプチドに結合させること、ここで該ポリペプチドは式：Ｒ１【配列があります】Ｒ２〔式中、Ｒ１はアミノ酸または１個より多いアミノ酸の配列を表し、Ｒ２はＯＨ、アミノ酸またはそのアミド、もしくは１個より多いアミノ酸の配列を表す〕を有する；および（ｄ）赤血球−結合ポリペプチドを哺乳動物に投与すること；を含む、哺乳動物における出血の制御方法。
３３．請求項１または３記載のトロンボー赤血球および製剤上許容される担体または賦形剤を含有する医薬組成物。
３４．請求項１１または１６記載のトロンボー赤血球および製剤上許容される担体または賦形剤を含有する医薬組成物。
３５．請求項３３記載の医薬組成物をヒトに投与することから成る、ヒトにおける出血の制御方法。
３６．請求項３４記載の医薬組成物をヒトに投与することから成る、ヒトにおける出血の制御方法。
３７．トロンボー赤血球が前記ヒトに由来するものである、請求項３４記載の方法。
３８．式：ＸＹ（Ｚ）ｎ【配列があります】Ｒ〔式中、Ｘ、ＹおよびＺは独立してアミノ酸を表し、ｎは０または１を表し、そしてＲはＯＨまたはＮＨ２；セリン、トレオニンまたはシステイン以外のアミノ酸またはそのアミド；もしくは１個より多いアミノ酸の配列（アスパラギン酸に結合される該配列中の第１のアミノ酸はセリン、トレオニンまたはシステイン以外のものである）、または遊離カルボキシル基のアミドを表し、ここでＲがフェニルアラニンである場合、ＹまたはＺのいずれかがグリシンではない〕を有するポリペプチド。
３９．Ｘがシステインおよびグリシンより成る群から選ばれる、請求項３８記載のポリペプチド。
４０．Ｒがフェニルアラニン、トリプトファン、およびそれらのアミドより成る群から選ばれる、請求項３８記載のポリペプチド。
４１．ｎが１で、ＹおよびＺがグリシンである、請求項３８記載のポリペプチド。
４２．Ｘが生体適合性リンカー分子に共有結合により結合されており、その際ペプチドに結合されるリンカーが少なくとも１つの遊離反応性官能基を含む、請求項３８記載のポリペプチドを含むポリペプチドー架橋剤組成物。
４３．架橋剤の遊離反応性基がスルフヒドリルおよびアミンより成る群から選ばれる官能基と反応性である、請求項４２記載のポリペプチドー架橋剤組成物。
４４．（ａ）内部に標識を含む再閉鎖された赤血球ゴースト；および（ｂ）共有結合により該赤血球ゴーストに結合されたターゲット指向性分子；を含む、ターゲット指向赤血球。
４５．標識が放射性核種、重金属、および磁気共鳴イメージング剤より成る群から選ばれる、請求項４４記載のターゲット指向赤血球。
４６．（ａ）内部に生物学的活性物質を含む再閉鎖された赤血球ゴースト；および（ｂ）共有結合により該赤血球ゴーストに結合されたターゲット指向性分子；を含む、ターゲット指向赤血球。
４７．生物学的活性物質が化学療法剤、薬物、酵素、神経毒、血栓溶解剤、成長因子、神経栄養因子、ホルモン、および核酸より成る群から選ばれる、請求項４６記載のターゲット指向赤血球。
４８．ターゲット指向性分子がペプチドまたはタンパク質、抗体、レクチン、炭水化物、およびステロイドより成る群から選ばれる、請求項４４または４６記載のターゲット指向赤血球。
４９．ターゲット指向性分子がモノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項４４または４６記載のターゲット指向赤血球。
５０．モノクローナル抗体が血小板抗原に結合する、請求項４９記載のターゲット指向赤血球。
５１．ターゲット指向性分子が配列【配列があります】を含むポリペプチドである、請求項４４または４６記載のターゲット指向赤血球。
５２．生物学的活性物質が血栓溶解剤であり、ターゲット指向性分子が配列【配列があります】を含むポリペプチドである、請求項４６記載のターゲット指向赤血球。
５３．赤血球ゴーストが多官能性生体適合性分子に多官能性分子上の第１官能基を介して共有結合で結合されており、多官能性分子が多官能性分子上の第２官能基を介して式：Ｒ１【配列があります】Ｒ２〔式中、Ｒ１はアミノ酸または１個より多いアミノ酸の配列を表し、そしてＲ１は多官能性分子の第２官能基に共有結合で結合しており、Ｒ２はＯＨ、アミノ酸またはそのアミド、もしくは１個より多いアミノ酸の配列を表す〕を有するポリペプチドに共有結合で結合されており、生成する赤血球ゴーストが活性化血小板に選択的に結合できることを特徴とする、請求項４４または４６記載のターゲット指向赤血球。
５４．請求項４４または４６記載のターゲット指向赤血球、および製剤上許容される担体または賦形剤を含有する医薬組成物。
５５．次の工程：（ａ）赤血球にその細胞内内容物を放出させること；（ｂ）工程（ａ）で作られた赤血球に物質を導入すること；（ｃ）工程（ｂ）で作られた赤血球の膜を実質的に閉じること；および（ｄ）ターゲット指向性分子を該赤血球に共有結合により結合させること；を含む、ターゲット指向赤血球の製造方法。
５６．結合工程（ｄ）を工程（ａ）の前に行う、請求項５５記載の方法。
５７．結合工程（ｄ）を工程（ｃ）の後に行う、請求項５５記載の方法。
５８．物質が標識または生物学的活性物質である、請求項５５記載の方法。
５９．ターゲット指向性分子がモノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項５８記載の方法。
６０．治療上有効な量の請求項４６記載のターゲット指向赤血球を哺乳動物に投与することから成り、生物学的活性物質が治療薬である、哺乳動物における病気または疾患の治療方法。
６１．有効量の請求項４５記載のターゲット指向赤血球を哺乳動物に投与することから成る、哺乳動物における病気または疾患の診断方法。
６２．出血を制御するための請求項１、１０または１２記載のトロンボー赤血球を含む組成物。
６３．病気または疾患の治療方法において使用するための、生物学的活性物質が治療薬である請求項４６記載のターゲット指向赤血球を含む組成物。
６４．病気または疾患の診断方法において使用するための、請求項４５記載のターゲット指向赤血球を含む組成物。
６５．出血を制御する医薬を製造するための、請求項１記載のトロンボー赤血球を含む組成物の使用。
６６．病気または疾患を治療するための、生物学的活性物質が治療薬である請求項４６記載のターゲット指向赤血球を含む組成物の使用。
６７．病気または疾患を診断するための、請求項４５記載のターゲット指向赤血球を含む組成物の使用。