ES2352180T3

ES2352180T3 - Anticuerpo monoclonal de anti-tenascina humana.

Info

Publication number: ES2352180T3
Application number: ES03743010T
Authority: ES
Inventors: Rita c/o Sigma-Tau Industrie DE SANTIS; Anna Maria c/o Sigma-Tau Industrie ANASTASI
Original assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Current assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Priority date: 2002-02-26
Filing date: 2003-02-20
Publication date: 2011-02-16
Anticipated expiration: 2023-02-20
Also published as: US20050106145A1; US20040005643A1; AU2003215900A1; ATE480564T1; MXPA04008216A; US8048417B2; JP2005534615A; EP1478667B1; CA2475395C; US20110020219A1; KR20040086426A; EP1478667A1; CY1111108T1; WO2003072608A1; DE60334076D1; PL372803A1; AR038700A1; CN1639192A; PL213216B1; PT1478667E

Abstract

El anticuerpo monoclonal anti-tenascina humana cuyas secuencias de la región variable de la cadena pesada y de la región variable de la cadena ligera son SEC ID N.º: 1 y SEC ID N.º: 2, respectivamente, y los fragmentos proteolíticos de los mismos que se unen a un epitopo antigénico dentro de la repetición similar a EGF de tenascina humana C.

Description

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales anti–tenascina humana, los procedimientos y materiales para obtenerlos, el uso de dichos anticuerpos para la preparación de medios de diagnóstico y medicamentos para el diagnóstico y el tratamiento, respectivamente, de tumores que expresan tenascina y de los materiales que comprenden dichos anticuerpos adecuados para usar en el campo médico. Antecedentes de la invención La especificidad de la terapia de tumores a menudo es una etapa limitante en determinar el éxito de un tratamiento. De hecho, la aparición de efectos tóxicos y la tolerabilidad reducida de ciertos agentes anticancerígenos limitan su uso y la calidad de vida de los pacientes. La reducción de toxicidad está ligada directamente a la selectividad del tratamiento para las células cancerosas. Los anticuerpos monoclonales representan los medios ideales para el marcaje como objetivo de los tumores de forma específica y, cuando se combinan con el sistema de amplificación de avidita/biotina, constituyen una manera extremadamente potente y selectiva para suministrar restos activos en el sitio tumoral. Tenascina es una de las proteínas de la matriz extracelular y muestra la expresión restringida de sitio durante embriogénesis y se puede encontrar en tejidos adultos durante la curación de heridas y la tumorogénesis, así como en vasos sanguíneos tumorales formados recientemente. La tenascina está ausente en el tejido adulto normal, pero se expresa en el estroma de una gran diversidad de tumores sólidos, tales como gliomas (Burdon, y col., cancer Res. 43: 2796– 2805, 1983), tumores mamarios (Chiquet–Ehrismann, y col, 1986), carcinomas de pulmón (Natali y col., Intl. J. Cancer 54: 56–68, 1989), fibrosarcomas y carcinomas de células escamosas (Ramos D.M y col., Int. J. Cancer 75: 680–687, 1998). La tenascina se encuentra en gliomas, pero no en tejido cerebral normal. Para una discusión sobre tenascina, se puede hacer referencia al documento WO 92/04464, Wistar, y a las referencias relacionadas. De acuerdo con la enseñanza del documento EP 0 496 074, G. Paganelli y col. desarrollaron una estrategia de pre–marcaje como objetivo de tres etapas para el tratamiento sistémico y locorregional de los tumores (Cremonesi M y col., EUR. J. Nucl. MED. 26 (2): 110–120, 1999; Paganelli G. y col., EUR. J. Nucl. MED. 26 (4): 348–357, 1999; Paganelli G., y col. Cáncer Biother. & Radiopharm. 16 (3):227–235, 2001). Otras referencias sobre el procedimiento de pre–marcaje como objetivo de tres etapas son los documentos WO 94/04702 y US 5.578.287. El tratamiento de pre–marcaje como objetivo de tres etapas se basa en administración intravenosa, secuencial de un anticuerpo monoclonal anti–tenascina biotinilado, estreptavidina, y biotina marcada con 90Y con las dos administraciones de búsqueda de avidina y de albúmina biotinilada antes de estreptavidina y de biotina marcada con 90Y, respectivamente, para reducir el fondo no específico. La selectividad del enfoque de pre–marcaje como objetivo de tres etapas de Paganelli depende del uso de un anticuerpo monoclonal anti–tenascina. El marcaje como objetivo de la matriz extracelular, comparado con el marcaje como objetivo de los antígenos de células tumorales, presenta la ventaja de no estar afectado por la modulación antigénica de células tumorales representando así un objetivo ideal para terapia antitumoral. Las dosis y la coordinación temporal de las administraciones del tratamiento de pre–marcaje como objetivo de tres etapas se han fijado para lograr proporción de distribución tumoral/no tumoral óptima. Los datos obtenidos a partir del glioblastoma 48 (GBM) o de los pacientes de astrocitoma anaplásico (AA), incluidos en el estudio de Paganelli, mostraron una carencia sustancial de toxicidad, con la excepción de alguna reacción alérgica a estreptavidina (que se puede superar usando avidina), y mostraron indicación preliminar de eficacia terapéutica. De hecho, 2 meses después del final de tratamiento, el 25% de los pacientes mostraron una reducción en el tamaño tumoral (Respuesta Completa (reducción tumoral >50%) = 6%; Respuesta Parcial (reducción tumoral <50%) = 11%; respuesta Menor (reducción tumoral <25%) = 8%) y el 52% de los pacientes no hubieron progresado, con una proporción de respuesta global de por encima del 77%. En algunos de estos pacientes, cuya esperanza de vida era menos de seis meses, la respuesta persistió durante más de un año (Paganelli y col., 1999). El papel de anticuerpo biotinilado anti–tenascina es localizar en el sitio de tumor y presentar biotinas para mediar la posterior acumulación de avidina y de 90–Y–biotina. Se revelan anticuerpos anti–tenascina, por ejemplo, en los documentos US 5.624.659, Duke University, JP 2219590, Rikagaku, el documento anteriormente mencionado WO 92/04464 y en el documento US 6 335 014 que revela el uso de anticuerpos monoclonales de tenascina anti– humano en procedimientos de tratar y evitar metástasis. Se describe un anticuerpo anti– tenascina en Siri A. y col., Nucl. Acids Res. 19 (3): 525–531, 1991; Balza E y col., FEBS 332: 39–43, 1993 y su uso para los propósitos terapéuticos se revela en los anteriormente mencionados Cremonesi M. y col., Eur. J. Nucl. Med. 26 (2): 110–120, 1999; Paganelli G. y col., Eur. J. Nucl. Med. 26 (4): 348–357, 1999; Paganelli, G y col., Cancer Biother. & Radiopharm. 16 (3): 227–235, 2001. El clon usado para generar el anticuerpo anti–tenascina en la técnica se conoce como BC4. El presente solicitante encontró el clon BC4 inadecuado para el desarrollo industrial y los propósitos reguladores debido a la producción de una cadena ligera adicional, no funcional (lo más probablemente de origen de mieloma parental) cuyo nivel de expresión se incrementó a la presión de cultivo de escalamiento, evitando así la purificación de anticuerpo a gran escala.

Sumario de la invención Se ha encontrado ahora que se puede producir un anticuerpo monoclonal de tenascina anti– humano que soluciona los problemas mencionados anteriormente, a saber se puede producir un anticuerpo monoclonal que carece de la expresión de cadenas ligeras no funcionales. Por lo tanto, este anticuerpo es un objeto de la presente invención, conjuntamente con un procedimiento para obtener dicho anticuerpo, su uso en terapia, en particular para la preparación de un medicamento útil para el tratamiento de enfermedades caracterizado por la expresión de tenascina, tales como tumores. Descripción de la invención La presente invención proporciona un anticuerpo y fragmentos de anticuerpos que pueden contener también marcadores adicionales y agentes de diagnóstico, composiciones que contienen estos anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, y las composiciones de diagnóstico y terapéuticas que los contienen, su uso en terapia y diagnósticos y procedimientos de preparar estos anticuerpo y fragmentos de anticuerpo. La presente invención también se refiere a DNA que codifica anticuerpo y fragmentos, vectores que contienen DNA, células huésped que contienen vectores, proteína codificada por DNA que codifica proteína de SEQ ID N.ºs: 1 y 2; DNA que codifica proteína y fragmentos; CDR específicas y proteínas que comprenden o que contienen CDR. De acuerdo con la presente invención, dicho anticuerpo se caracteriza porque las secuencias de la región variable de las cadenas ligera y pesada son SEC ID N.º: 1 y SEC ID N.º: 2, respectivamente. Estas secuencias se muestran en las Figuras 10 y 11. En atención a la brevedad, el anticuerpo preferido de acuerdo con la presente invención será identificado con el nombre ST2146. Mientras que la presente invención se centra en ST2146, como ejemplificación de la presente invención, alguien de habilidad ordinaria en la técnica apreciará que, una vez dada la presente divulgación, se pueden producir fragmentos de anticuerpos de ST 2146 y se pueden usar dentro el alcance de la presente invención. En vista del párrafo anterior, la presente invención por lo tanto proporciona un anticuerpo (en lo sucesivo también llamado ST2146) según se define en la reivindicación 1 o un fragmento de anticuerpo o una quimera de anticuerpos (tal como, por ejemplo, una quimera ratón–humano) o una molécula de inmunoglobulina que une específicamente tenascina. La presente invención proporciona un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo o una quimera de anticuerpo según se definen en la reivindicación 2 o una molécula de inmunoglobulina que comprende al menos una de una CDR de la cadena ligera variable de ST2146 y/o una CDR de la cadena pesada variable de ST2146. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo o quimera de anticuerpos o molécula de inmunoglobulina de la presente invención puede ser un anticuerpo, un fragmento Fv, un fragmento Fab, un fragmento (Fab)2, una cadena individual de anticuerpo, o un anticuerpo multimérico. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo o quimera de anticuerpos o molécula de inmunoglobulina de la presente invención puede ser una molécula IgM, IgD, IgG, IgA, o IgE. La presente invención proporciona un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo o una quimera de anticuerpos o una molécula de inmunoglobulina que comprende al menos una de las SEC ID N.ºs: 1, 2, 9, 11, 13, 15, 17, o 19. La presente invención proporciona adicionalmente las secuencias de ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos de la presente invención, tales como las secuencias de SEQ ID N.ºs: 1, 2, 9, 11, 13, 15, 17, o 19. La presente invención proporciona por lo tanto una secuencia de DNA que codifica un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo o una quimera de anticuerpos o una molécula de inmunoglobulina de la presente invención. Tales secuencias de DNA incluyen al menos una secuencia o subsecuencia de DNA seleccionada de SEQ ID N.ºs: 3, 4, 10, 21, 14, 16, 18 ó 20. Otra realización se refiere a una molécula de ácido nucleico purificada que codifica el producto de anticuerpo o de fragmento de anticuerpo o de quimera de anticuerpos o de molécula de inmunoglobulina de la invención. Una molécula de ácido nucleico que codifica un producto de inmunoglobulinas de la invención puede elaborarse usando técnicas convencionales. Por ejemplo, los oligonucleótidos se pueden sintetizar usando los sintetizadores de oligonucleótidos y pueden estar unidos conjuntamente para formar un marco de lectura abierto funcional que codifica un producto de inmunoglobulinas de la invención. La molécula de ácido nucleico, una vez sintetizada, se puede clonar dentro de un vector de ácido nucleico. Un vector de ácido nucleico tal como un plásmido, cósmido, fagémido, plásmido de levadura, vectores bacteriófagos, plásmido de TI y similares se conoce en la técnica. El vector puede ser un vector de expresión. Los vectores de expresión y los sistemas de expresión están disponibles comercialmente de fuentes tales como Stratagene (La Jolla, California). Otra realización de la invención se refiere a una célula que comprende un ácido nucleico de la invención. Una célula se puede elaborar mediante transfección. Los procedimientos de transfección se conocen y los kits para transfección de células procariotas y eucariotas se pueden adquirir de fuentes comerciales (por ejemplo, Stratagene, La Jolla, California). Otra realización de la invención se refiere al uso del producto de anticuerpos, de fragmentos de anticuerpos, de quimeras de anticuerpos o de inmunoglobulinas de la invención para los medios útiles para detectar o diagnosticar un trastorno que comprende las etapas de poner en contacto una muestra de tejido de un sujeto con la condición de que permita la formación de un complejo entre dicho producto de anticuerpos, de fragmentos de anticuerpos, de quimeras de anticuerpos o de inmunoglobulinas y un antígeno de tenascina, y determinar la formación de dicho complejo. Otra realización de la invención se refiere al uso de un producto de anticuerpos, de fragmentos de anticuerpos, de quimeras de anticuerpos o de inmunoglobulinas de la invención o un ácido nucleico de la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades que expresan tenascina, en particular tumores. Se conocen los procedimientos para inmunoterapia para el cáncer. Véase por ejemplo en Old, L.J. Immunotherapy para el cáncer, Scientific American, septiembre de 1996. Otra realización se refiere a una composición terapéutica que comprende un producto de anticuerpos, de fragmentos de anticuerpos, de quimeras de anticuerpos o de inmunoglobulinas de la invención. Los productos de inmunoglobulinas de la invención se pueden proporcionar en forma de una composición que comprende el producto de anticuerpos, de fragmentos de anticuerpos, de quimeras de anticuerpos o de inmunoglobulinas y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición terapéutica se puede usar para el tratamiento de trastornos en un mamífero tal como un ser humano. El medicamento se administrará a un mamífero en una cantidad terapéuticamente efectiva de producto de anticuerpos, de fragmentos de anticuerpos, de quimeras de anticuerpos o de inmunoglobulinas de la invención para el mamífero. En su uso como un agente terapéutico, el producto de anticuerpos, de fragmentos de anticuerpos, de quimeras de anticuerpos o de inmunoglobulinas de la invención puede unirse a un agente. La unión puede ser por enlaces covalentes o por el enlace de anticuerpo–epitopo. Por ejemplo, un producto de anticuerpos, de fragmentos de anticuerpo, de quimeras de anticuerpos o de inmunoglobulinas puede estar formando retícula con un segundo anticuerpo en el que el segundo anticuerpo puede tener una afinidad por el agente. El agente puede ser un agente citotóxico. El término “agente citotóxico” como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o evita la función de las células y/o causa la destrucción de las células. El término se desea para incluir isótopos radiactivos (por ejemplo I, Y, Pr), agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, de plantas o animales, o fragmentos de los mismos. El agente puede ser un agente quimioterapéutico. Un agente quimioterapéutico es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen Adriamicina, Doxorrubicina, 5– Fluorouracilo, Arabinósido de citosina (“Ara–C”), Ciclofosfamida, Tiotepa, Busulfán, Citoxina, Taxol, Metotrexato, Cisplatina, Melfalán, Vinblastina, Bleomicina, Etopósido, Ifosfamida, Mitomicina C, Mitoxantrona, Vincristina, Vinorelbina, Carboplatina, Tenipósido, Daunomicina, Carminomicina, Aminopterina, Dactinomicina, Mitomicinas, Esperamicinas (véase el documento de patente de los Estados Unidos N.º: 4,675,187), Melfalán y otras mostazas de nitrógeno relacionadas. El agente puede ser una citoquina. El término citoquina es un término genérico para las proteínas liberadas por una población celular que actúan en otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de tales citoquinas son linfoquinas, monoquinas y hormonas polipeptídicas tradicionales. La hormona del crecimiento está incluida entre las citoquinas tal como la hormona del crecimiento humana, N–metionilo de hormona del crecimiento humana y hormona del crecimiento bovina; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas de glucoproteínas tales como hormona estimuladora del folículo (FSH), hormona estimuladora del tiroides (TSH) y hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; factor de necrosis tumoral; sustancia inhibidora de Müllerian; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso tales como NGF; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento de transformación (TGF); factores I y II de crecimiento similares a insulina; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductores; interferones tales como interferón–alfa, –beta y –gamma, factores estimuladores de colonias (CSF); CFS de granulocitos–macrófagos (GM–CSF); y CSF de granulocitos (G–CSF); interleucinas (IL) tales como IL–1, IL 1–alfa, IL–2, IL–3, IL–4, IL–5, IL–6, IL–7, IL–8, IL9, IL–11, IL–12; un factor de necrosis tumoral; y otros factores polipeptídicos incluyendo LIF y ligando de kit (KL). Como se usa en el presente documento, el término citoquina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de citoquinas de secuencias nativas. Para el diagnóstico, el producto de anticuerpos, de fragmentos de anticuerpos, de quimeras de anticuerpos o de producto de inmunoglobulinas de la invención pueden unirse a una marca, tal como a un compuesto o a una composición detectable que está conjugado directa o indirectamente al anticuerpo. La etiqueta puede ser detectable por sí misma (por ejemplo las etiquetas de radioisótopos o las etiquetas fluorescentes) o, en el caso de una etiqueta enzimática, puede catalizar la alteración química de un compuesto sustrato o de una composición sustrato que sea detectable. La invención también contemplaba la generación de mutantes de las CDR reveladas por la realización de mutaciones, de uno o más aminoácidos en la secuencia de las CDR. Se sabe que una única sustitución de aminoácidos situada apropiadamente en una CDR puede ser suficiente para aumentar la afinidad. El investigador ha usado la mutagénesis dirigida a sitio para incrementar la afinidad de algunos productos de inmunoglobulina en aproximadamente 10 veces. Este procedimiento de incrementar o disminuir la afinidad de anticuerpos mutando CDR es conocimiento común (véase, por ejemplo., el capítulo 23, Paul, W.E., Fundamental Immunology, Raven Press, NY, N.Y. 1993). Así, la sustitución, deleción, o adición de aminoácidos a las CDR de la invención para incrementar o disminuir afinidad de unión o especificidad de unión está también dentro de la contemplación de esta invención. Un aspecto adicional de la presente invención está proporcionando un medicamento para tratar a un individuo con un tumor, tal como tumores cerebrales quísticos, gliomas, tumores mamarios, carcinomas de pulmón, fibrosarcomas o carcinomas de células escamosas, que implican administrar a un sujeto humano afectado con el tumor como tumor cerebral quístico (p. ej., uno que expresa tenascina) un producto de anticuerpos, de fragmentos de anticuerpos, de quimeras de anticuerpos o de inmunoglobulinas de la presente invención que se une a tenascina en una cantidad terapéuticamente efectiva. La etapa de administración puede lograrse depositando el anticuerpo en la cavidad del tumor. También se revela en el presente documento un procedimiento de tratar un tumor sólido que comprende, primero, eliminar un tumor sólido (p. ej., uno que expresa tenascina) de un órgano de tejidos sólidos (p. ej., el cerebro) de un sujeto humano afectado; después formar una cavidad de resección quirúrgica cerrada en el órgano del sujeto en la localización de la que se eliminó el tumor sólido; y después administrar al sujeto un agente antineoplásico tal como un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una quimera de anticuerpo o un producto de inmunoglobulinas de la presente invención (por ejemplo, un anticuerpo que se une a tenascina) que es selectivamente tóxico para las células del tumor sólido en una cantidad terapéuticamente efectiva. En una realización de la invención, la etapa de administración se lleva a cabo depositando el agente antineoplásico en la cavidad de resección quirúrgica. Otro objeto de la presente invención son fragmentos proteolíticos de dicho anticuerpo, que se unen a un epitopo antigénico dentro de la repetición similar a EGF de la tenascina C humana. En el curso de la descripción de la presente invención, para fragmentos de anticuerpo se desean aquellos fragmentos que se unen a un epitopo antigénico dentro de la repetición similar a EGF de la tenascina C humana. En otra realización de la presente invención, el anticuerpo y los fragmentos del mismo pueden contener adicionalmente marcadores adicionales y/o agentes de diagnóstico adicionales. Dichos marcadores y/o agentes de diagnóstico se conocen bien por la persona experta en la técnica a la que se dirige la presente invención. De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, dicho anticuerpo o los fragmentos proteolíticos de los mismos están biotinilados. Otro objeto de la presente invención es la línea celular de hibridoma, llamada en el presente documento cST2146, que produce dicho anticuerpo. La línea celular de hibridoma se ha registrado en el Advanced Biotechnology Center, L.go

Rosanna Benzi, 10 16132 GÉNOVA–Italia, el 29 de enero de 2002 sometida a las disposiciones del Tratado de Budapest, y se le ha asignado N.º de Acceso PD02003. La presente invención también comprende DNA que codifica el anticuerpo o fragmentos del mismo, CDR específicas y las proteínas que comprenden o que contienen las CDR, vectores que contienen dicho DNA y células huésped que contienen dichos vectores. Otro objeto de la presente invención son los derivados recombinantes de dicho anticuerpo. En particular, los derivados recombinantes preferidos son aquellos donde la región constante murina está sustituida por la contrapartida humana (Ferrer C. y col. J. Biotechnol. 52: 51–60, 1996) o aquellos donde la región constante murina está reemplazada por un resto biológicamente activo, tal como, por ejemplo, un miembro de la familia de avidina (Manuel L y col., J. Immunol., 163: 4421–4426, 1999), un factor de crecimiento útil para estimular determinantes inmunológicos dirigidos a tumores (tales como por ejemplo G–CSF, GM–CSF), o aquellos en los que la región constante murina está reemplazada por un resto farmacológicamente activo, tal como por ejemplo una toxina, un superantígeno, una citoquina o cualquier otra proteína útil en potenciar la eficacia terapéutica antitumoral (Di Máximo A.M., y col., Britishs J. Cancer 75 (6): 822–828, 1997; Parente D. y col., Anticancer Research 17 (6A): 4073–4074, 1997). Los procedimientos para obtener dichos derivados recombinantes se conocen bien en la técnica. Otro objeto de la presente invención son los derivados conjugados de dicho anticuerpo. En particular, los derivados de conjugado preferidos son aquellos donde el resto biológicamente activo está ligado al anticuerpo por medio de procedimientos convencionales. Ejemplos de restos biológicamente activos son miembro de la familia de avidina, un factor de crecimiento útil para estimular efectores inmunológicos dirigidos a tumores (tal como por ejemplo G–CSF, GM–CSF), un resto farmacológicamente activo, tal como por ejemplo una toxina, un superantígeno, una citoquina o cualquier otra proteína útil en incrementar la eficacia terapéutica antitumoral, fármacos antitumorales, radioisótopos. De acuerdo con la presente invención, los derivados o conjugados recombinantes de la tenascina anti–humano monoclonal o fragmentos de la misma también se indican como “derivados”. En una realización más particularmente preferida de la invención, distinta del anticuerpo y de los fragmentos, también los derivados de los mismos están biotinilados. Otro objeto de la presente invención es la línea celular de hibridoma que produce el anticuerpo según se define anteriormente. Dicho hibridoma se ha registrado en el Advanced Biotechnology Center el 29 de enero de 2002 sometido a las disposiciones del Tratado de Budapest, con el número PD02003. Como un objeto adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento para la preparación de anticuerpo monoclonal, comprendiendo dicho procedimiento cultivar la línea celular anterior de hibridoma y aislar el anticuerpo. Otro objeto de la presente invención es el uso del anticuerpo monoclonal anti–tenascina anti– humana para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad que expresa tenascina, en particular un tumor. Una lista no limitante, ejemplificadora de tumores que expresan tenascina son gliomas, tumores mamarios, carcinomas de pulmón, fibrosarcomas y carcinomas de células escamosas. Otro aspecto más de la presente invención es un medicamento para la radioinmunoterapia de tumores, que se administra a un sujeto que sufre de un tumor que expresa tenascina, y comprende dicho anticuerpo monoclonal o fragmentos proteolíticos, o derivados de los mismos. En una realización preferida, dicho anticuerpo monoclonal o fragmentos o derivados proteolíticos de los mismos están biotinilados, en una realización más particularmente preferida, el medicamento es adecuado para la radioinmunoterapia, en particular para llevar a cabo el procedimiento de pre–marcaje como objetivo de tres etapas, como se describe en la técnica, por ejemplo en los documentos EP 0 496 074, European Journal of Nuclear Medicine Viol. 26, N.º: 4; abril de 1999; 348–357 y US 5,968,405. En este último aspecto, el medicamento de acuerdo con la presente invención estará en forma de un kit, estando dicho kit compuesto de 5 viales, cuyo primer vial contiene el anticuerpo biotinilalado o el fragmento o derivado biotinilado del mismo; el segundo vial contiene una avidina, el tercer vial contiene albúmina biotinilada, el cuarto vial contiene una estreptavidina, el quinto vial contiene biotina marcada radiactivamente o derivado de biotina marcado radiactivamente. Esta clase de kit se proporciona en European Journal of Nuclear Medicine Vol. 26, N.º: 4; abril de 1999; 348–357. Una secuencia comprende avidina, estreptavidina, PEG–avidina o PEG–estreptavidina, di– o poliavidina o di– o poliestreptavidina. Una biotina radiomarcada contiene un radionúclido, tal como se describe en el documento EP 0 496 074, preferentemente 90Y. Los derivados de biotina se describen, por ejemplo en el documento WO 02/066075. Un kit de esta clase se describe en European Journal of Nuclear Medicine Vol. 26, N.º: 4; abril de 1999; 348–357. Preferentemente, los viales son adecuados para inyección a seres humanos. Los derivados recombinantes del anticuerpo de la presente invención, así como sus conjugados se usan también convenientemente en terapia del tumor. Aunque el anticuerpo de la presente invención así como los fragmentos, derivados y conjugados del mismo se usan adecuadamente en el tratamiento de tumores relacionados con tenascina, en particular por medio de inmunoterapia, la radioinmunoterapia es una realización preferida de la invención.

El recipiente específico, preferentemente en forma de un vial adecuado para inyección, que comprende el anticuerpo o fragmentos del mismo, en la forma biotinilada, es otro objeto de la presente invención. En otra realización de la presente invención, en el kit terapéutico, el anticuerpo biotinilado se combina con otros anticuerpos específicos de tenascina dirigidos preferentemente hacia el fragmento de A–D. Alternativamente, el anticuerpo biotinilado se combina con otros anticuerpos específicos del tumor. Una enseñanza general de dicha clase de kit se proporciona en los documentos EP 0 496 074, European Journal of Nuclear Medicine Viol. 26, N.º: 4; abril de 1999; 348–357 y US 5,968,405. En particular, la presente invención también comprende un contenedor, que contiene opcionalmente compartimentos múltiples, que comprende el anticuerpo biotinilado o fragmentos

o derivados del mismo, tampones y reactivos adecuados para usar en un kit terapéutico para un procedimiento de pre–marcaje como objetivo de tres etapas. Otro objeto de la presente invención es el uso de dicho anticuerpo monoclonal o de dichos fragmentos, o derivados recombinantes o conjugados del mismo o el derivado biotinilado del mismo, para la preparación de medios de diagnóstico, para la detección de enfermedades que expresan tenascina, en particular para formación de imagen de tumor in vivo. En una realización particular de la presente invención, dicho anticuerpo monoclonal o fragmentos o derivados de los mismos se usa en combinación con un segundo anticuerpo específico de tenascina en un ensayo en sandwich para la producción de un kit diagnóstico para la determinación del nivel de tenascina circulante. El ensayo en sandwich es, por ejemplo, un ELISA in vitro en condiciones donde dicho segundo anticuerpo se une a un segundo epitopo antigénico de tenascina, dicho ensayo de ELISA in vitro es útil para determinar el nivel de tenascina circulante. Los kits de diagnóstico o terapéuticos que comprenden el anticuerpo o fragmentos o derivados del mismo son un objeto adicional de la presente invención. Estos y otros objetos de la presente invención serán descritos en detalle en la siguiente descripción también por medio de ejemplos y figuras.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1: muestra la representación esquemática de tenascina–C humana, los fragmentos y reactivos antigénicos recombinantes relacionados, así como la estrategia usada para generar un anticuerpo similar a BC–4. Figura 2: muestra la confirmación de la naturaleza glucosídica de la variabilidad de la cadena pesada de ST2146 digiriendo el anticuerpo con un sialidasa.

Figura 3 muestra homogeneidad total de ST2146 opuesta a BC4. Figura 4 muestra la prueba de bandas de Western de unión de ST2146 a epitopo de tenascina humana comparado con el epitopo antigénico de BC4 (el carril D está vacío). Figura 5 muestra un ELISA competitivo donde ST2146 compite fuertemente con BC4 en la unión a tenascina humana mientras que ST2077 muestra sólo competición parcial. ST2077 es un anticuerpo monoclonal específico de tenascina obtenido en el procedimiento para generar ST2146. ST2077 muestra especificidad similar a ST2146 (región de repetición similar a EGF de tenascina humana) pero se refiere a un epitopo antigénico que solo interfiere parcialmente con el epitopo BC4/ST2146. Figura 6 muestra la inmunorreactividad de ST2146 por ELISA en comparación con el pico totalmente activo de BC4. Figura 7 muestra el protocolo para el estudio de biodistribución de ST2146. Figura 8 muestra la biodistribución para ST2146 en comparación con BC4 (biot = biotinilado; IR = inmunorreactividad expresada como la cantidad de anticuerpo para obtener D.O. 1,0 en ELISA). Figura 9 muestra la proporción de tumor/no–tumor para ST2146 en comparación con BC4. Figura 10 muestra la secuencia de la cadena ligera variable ST2146 (VL) (SEQ ID N.ºs: 1 (aminoácido de longitud completa), 3 (DNA que codifica aminoácido), 9 (aminoácidos de la cadena ligera de CDR1), 10 (DNA de la cadena ligera de CDR1), 11 (aminoácidos de la cadena ligera de CDR2), 12 (DNA de la cadena ligera de CDR2), 13 (aminoácidos de la cadena ligera de CDR3), 14 (DNA de la cadena ligera de CDR3) y 21 (DNA de longitud total)). Figura 11 muestra la secuencia de la cadena pesada variable de ST2146 (VH) (SEQ ID N.ºs: 2 (aminoácido de longitud completa), 4 (DNA que codifica aminoácido), 15 (aminoácidos de la cadena pesada de CDR1), 16 (DNA de la cadena pesada de CDR1), 17 (aminoácidos de la cadena pesada de CDR2), 18 (DNA de la cadena pesada de CDR2), 19 (aminoácidos de la cadena pesada de CDR3), y 20 (DNA de la cadena pesada de CDR3) y 22 (DNA de longitud total)).

Descripción detallada de la invención ST2146 se obtiene del clon celular de hibridoma correspondiente cST2146 como se da en detalle en el siguiente ejemplo. Por lo que se refiere a los aspectos industriales de la presente invención, el anticuerpo desvelado en el presente documento se formulará adecuadamente en composiciones farmacéuticas o kits de diagnóstico como se hizo normalmente en este campo técnico. Las composiciones farmacéuticas son convencionales en este campo y pueden fabricarse por la persona experta en la técnica justo en base al conocimiento general común. Ejemplos de composiciones farmacéuticas se dan en las referencias mencionadas en la presente invención. Lo mismo se aplica a los kits de diagnóstico. Se prefieren particularmente en el kit para la radioinmunoterapia de tumores como se revela en los artículos mencionados anteriormente por Paganelli y otros y por el documento EP 0 496 074. Las composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo y/o un fragmento y/o un derivado recombinante y/o un conjugado del mismo en mezcla con al menos un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptables están incluidas en el alcance de la presente invención. El siguiente ejemplo adicionalmente ilustra la presente invención. Ejemplo 1 Para generar un nuevo clon celular de hibridoma con la especificidad de BC4 pero careciendo de expresión de la cadena ligera no funcional, los ratones Balb/c se inmunizaron con el lisado de fago de Escherichia coli pTn28. pTn28 es un clon recombinante de λgt11 que codifica un fragmento de la repetición similar a EGF de tenascina humana que muestra previamente que contiene el epitopo BC4 (Balza E y col., 1993). La representación esquemática de tenascina–C humana, los fragmentos y reactivos antigénicos recombinantes relacionados, así como la estrategia usada generando un anticuerpo similar a BC–4 se dan en la figura 1. Los esplenocitos inmunizados pTn28 se condensronan a células de mieloma no productoras Sp2/0Ag14 por el procedimiento estándar (Cianfriglia M. y col., Methods Enzymol. 121:193210, 1986) y la población de hibridoma se revisó por ELISA sobre tenascina purificada de SK–MEL– 28 (línea celular humana de melanoma). Los hibridomas específicos de tenascina se clonaron limitando dilución dos veces en FCS que contiene medio y tres veces en medio libre de proteínas (Medio Libre de Componente Derivado de Animales HyClone, HyQR Perbio). El subclón cST2146/D3d/F6e finalmente se seleccionó para la producción del cST2146 Master Cell Bank (MCB) y Working Cell Bank (WCB). La producción del material de referencia de ST2146 se hizo por cultivo de células de hibridoma cST2146 en Biorreactor 2L y la estabilidad del cST2146 Post Production Cell Bank (PPCB) se confirmó por análisis de FACS y por Dilución Limitante. ST2146 es una inmunoglobulina de ratón del isotipo IgG2b/k. ST2146 demostró ser homogéneo para la composición de cadena ligera como se muestra por análisis de SDS–PAGE reductor que también mostró un cierto grado de heterogeneidad de la cadena pesada. Esta observación fue consistente con una variabilidad en la glucosilación O– ligada como se comunica previamente para el isotipo IgG2b murino (Kim H y col., J. Biol. Chem. 269 (16): 12345–12350, 1994). La consistencia en el modelo de las bandas de la cadena pesada ST2146 se observó en tres lotes diferentes obtenidos de FCS que contienen medio de cultivo o medio libre de proteínas. La confirmación de la naturaleza glucosídica de la variabilidad de la cadena pesada ST2146 se produjo digiriendo el anticuerpo con una sialidasa. El ST 2146 se sometió a intercambio de tampón con una columna de desalación de HiTrap (Amersham–Pharmacia), a tampón de fosfato de sodio 10 mM conteniendo NaCl 150 mm, pH 6,4. El Mab se concentró en centricons 100.000 MWCO (Millipore) a una concentración final de aproximadamente 1 mg/ml y se digirió con 1,5 U/ml de sialidasa (Sigma) durante 24 horas a 37°C. Las muestras se sometieron a electroforesis en gel de bloque de poliacrilamida al 12%. La tinción del gel se hizo por Azul Brillante de Coomassie. Como se esperaba, esta digestión dio como resultado la eliminación de la banda de peso molecular más alto (Figura 2). La homogeneidad total de ST2146 también se confirmó por cromatografía de la hidroxilapatita que mostró un pico individual para ST2146 opuesto a los tres picos observados para BC4 (Figura 3, en la que, para BC4 lo totalmente funcional corresponde al pico 3). ST2146 une tenascina humana a un epitopo relacionado estrictamente, si no idéntico, al epitopo antigénico de BC4 como se muestra por prueba de bandas de Western (Figura 4) y ELISA competitivo (Figura 5). En la Figura 5, BC4 biotinilado se mezcló con concentraciones crecientes de BC4, de ST2077 o de ST2146 como competidores y se plaqueó en placas revestidas de tenascina. La unión se midió después de la adición de HRP–estreptavidina y de sustrato cromogénico relacionado. ST2077 es un anticuerpo que reconoce un epitopo de tenascina dentro de la repetición similar a EGF, parcialmente compartido con el epitopo de BC4. La inmunorreactividad del ST2146 se evaluó por ELISA en comparación con el pico totalmente activo de BC4 (pico 3). Figura 6 muestra que la cantidad de ST2146 obteniendo D.O. 1,0 en ELISA de concentración antigénica óptima (panel A) es aproximadamente 20 veces menos que la cantidad del pico 3 totalmente reactivo de BC4 y aproximadamente 100 veces menos que BC4. Esta diferencia se amplifica de forma impresionante en condiciones de limitación de antígenos como en el panel B donde sólo ST2146 mantiene una buena inmunorreactividad. La afinidad de ST2146 se evaluó por BIAcore. La KD de ST2146 resultó de 1,4 x 10–9 (Ka 3,0 x 105; kd 4,1 x 10–4). Los datos de afinidad de ST2146 se compararon con BC4 que muestra una KD de 4,9 x 10–9 (Ka 1,9 x 105; kd 9,3 x 10–4). El mantenimiento de inmunorreactividad tras biotinilación es una característica fundamental de un anticuerpo monoclonal que se usa pre– marcando. Para evaluar el comportamiento de ST2146 biotinilado se investigaron proporciones anticuerpo:biotina diferentes y se midió la inmunoreactividad de anticuerpo biotinilado por ELISA en comparación con BC4 y ST1897, siendo el último un anticuerpo monoclonal específico de tenascina con afinidad más baja. Los resultados en la tabla 1 muestran que la biotinilación baja (2–3 biotinas/mol) afecta ligeramente a inmunorreactividad de anticuerpos monoclonales independientemente de sus afinidades. Una biotinilación más alta, hasta 20 biotinas/mol está asociada a una reducción en inmunorreactividad. Esta reducción es más alta cuanto más baja es la afinidad del anticuerpo.

Tabla 1 Estudio de Biotinilación en ST2146

% de Inmunorreactividad Moles de biotina/anticuerpo Mab Afinidad (nm) 2–3 3,5–5 7–10 15–20 ST1897 10 84,8 +/–1,3 62,3 +/–12,4 26,65 +/–13,8 9,45 +/–9,26 BC4 4,9 82,4 +/–11,5 74,4 +/–9,3 67,2 +/–12,3 12,6 ST2146 1,4 100 89,6 +/–4,39 77,63 +/–8,59 52,37 +/–3,95

% de inmunorreactividad es la media de 2–3 experimentos independientes +/– desviación estándar.

imagen1

La afinidad de ST2146 biotinilado se midió mediante BIAcore y resultó mantenida sustancialmente no importa el número de biotinas ligadas. La inmunohistoquímica en tumores diferentes (de mama, glioma, de colon) mostró para BC4 y

10 ST2146 selectividad similar. El comportamiento de la farmacología del ST2146 biotinilado se dirigió estableciendo la capacidad para localizar a las masas tumorales. Los estudios de biodistribución de ST2146 marcado con 125I y de anticuerpos biotinilados de BC4 se hicieron en ratones inmunodeficientes injertados con tenascina que expresa tumores humanos de acuerdo con el protocolo en la

15 Figura 7. Los ratones recibieron subcutáneamente 4 x 106 células de carcinoma de colon humanas HT29 en 0,1 ml de solución estéril. Después de 15 días, cuando la masa tumoral era aproximadamente de 100 mg, los grupos de 5 ratones recibieron intravenosamente BC4 marcado con 125I, ST2146 o inmunoglobulinas de ratones normales (nMIg) a 10, 2, 0,5 ó 0,1 µg/ratón en 0,1 ml de PBS estériles. Todos los anticuerpos se biotinilaron (7–10 biotinas/mol) y

20 ST2146 y Mabs biotinilados BC4 mostraron un inmunorreactividad de aproximadamente el 80%. Cada animal recibió la cantidad de CPM siguiente:

Dosis BC4 ST2146 NMIg

10 µg 632,000 570,000 577,00 2 µg 555,000 639,000 624,00 0,5 µg 310,000 401,000 382,00 0,1 µg 186,000 211,000 174,00

Los resultados en la figura 8 muestran que BC4 y ST2146 localizan específicamente masa 25 tumoral. La cantidad de ambos anticuerpos en el sitio de tumor (expresado como el % de la dosis/gramo inyectada de tejido) es dependiente de dosis con una tendencia en acumulación

más alta para ST2146. Además, ST2146 muestra una mejor proporción de tumor/no tumor comparada con BC4 tal como se muestra en la Figura 9. La región variable de la cadena ligera de tipo Kappa se amplificó de cDNA circularizado usando un par de cebadores (5'–TGTCAA–GAGCTTCAACAGGA (SEC ID N.º: 5), 5'– AAGATGGATACAGTTGGTGC (SEC ID N.º: 6) que se fusionan a la región constante del anticuerpo como se describe en M. Sassano y col, Nucl. Ac. Res. (1994) 22, 1768–1769. La región variable de cadena pesada gamma se amplificó a partir de cDNA circularizado usando los cebadores siguientes: oligo de ratón γ2bCH1 GTCACTGACTCAGGGAAGTAGCC (SEC ID N.º: 7); oligo de ratón γ2bCH3 GCAACGTGAGACACGAG–GGTCTG (SEC ID N.º: 8) que se fusionan a la región constante del anticuerpo como se describe en M. Sassano y col. Nucl. Ac. Res. (1994) 22, 1768–1769. La PCR se llevó a cabo usando las siguientes condiciones: 1 min a 94°C, 1,5 minutos a 60°C, 2 minutos a 72°C durante 30 ciclos. Los fragmentos amplificados se clonaron directamente en el plásmido pUC18 cortado por SmaI. Se secuenciaron dos clones que contenían la cadena ligera kappa y 4 clones que contenían las regiones variables de la cadena pesada gamma. La secuenciación se llevó a cabo en MWG Biotech, Alemania. Ambas hebras se secuenciaron. No se encontraron ambigüedades. Figura 10 muestra la secuencia de la cadena ligera variable (VL) de ST2146. La Figura 11 muestra la secuencia de la cadena pesada variable (VH) de ST2146. La caracterización comparativa total de ST2146 hacia BC4 muestra que ST2146 tiene las características siguientes: -anticuerpo monoclonal similar a BC4 con respecto a especificidad de epitopos; -homogéneo con respecto a la composición de cadena pesada y ligera; -heterogéneo con respecto a glucosilación de la cadena pesada; -superior a BC4 con respecto a inmunorreactividad como se espera en base a la heterogeneidad de BC4; -aproximadamente 3 veces superior a BC4 con respecto a afinidad; -superior a BC4 con respecto al mantenimiento de inmunorreactividad tras biotinilación; -similar a BC4 para selectividad en inmunohistoquímica; -superior a BC4 con respecto a señalar como objetivo al tumor.

LISTA DE REFERENCIAS

Balza E., Siri A., Ponassi M., Caocci F., Linnala A., Virtanen I., Zardi L. Production and

characterization of monoclonal antibodies specific for different epitopes of human tenascin. FEBS 332:39–43, 1993. Chinol M., Casalini P., Maggiolo M., Canevari S., Omodeo E.S., Caliceti P., Veronese F.M., Cremonesi M.,Chiolerio F., Nardone E., Siccardi A.G., Paganelli G. Biochemical modifications of avidin improve pharmacokinetics and biodistribution, and reduce immunogenicity. British Journal of Cancer 78(2): 189–197, 1998. Cianfriglia M., Mariani M., Armellini D., Massone A., Lafata M., Presentini L. and Antoni G. Methods for high frequency production of soluble antigen–specific hybridomas; specificities and affinities of monoclonal antibodies obtained. Methods Enzymol 121:193210, 1986. Cremonesi M., Ferrari M., Chinol M., Stabin M. G., Grana C., Prisco G., Robertson C., Tosi G., Paganelli G. Three–step radioimmunotherapy with yttrium–90 biotin: dosimetry and pharmacokinetics in cancer patients. Eur J Nucl Med 26(2):110–120, 1999. Di Massimo AM., Di Loreto M., Pacilli A., Raucci G., D’Alatri L., Mele A., Bolognesi A., Polito L., Stirpe F. and De Santis R. Immunoconjugates made of an anti EGF–receptor Monoclonal Antibody and Type 1 RIPs from Saponaria ocymoides or Vaccaria pyramidata. British J. Cancer 75(6):822–828, 1997 Parente D., D’Alatri L., Di Massimo AM., Saccinto MP., Novelli S., Pacilli A., Mele A. and De Santis R. Production and in vitro characterization of a recombinant immunotoxin made of a single chain anti–EGF receptor antibody and a type ribosome–inactivating protein (RIP) from filamentous fungus Aspergillus clavatus. Anticancer Research 17 (6A):4073–4074, 1997 Kim H, Yamaguchi Y, Masuda K, Matsunage C, Yamamoto K, Irimura T, Takahashi N, Kato K, Arata Y. O–glycosylation in hinge region of mouse immunoglobulin G2b. J Biol Chem 269(16):12345–12350, 1994. Ferrer C., Anastasi A.M., Di Massimo A.M., Bullo A., Di Loreto M., Raucci G., Pacilli A., Rotondaro L., Mauro S., Mele A. and De Santis R. Expression and characterization of a mouse/human chimeric antibody specific for EGF receptor. J. Biotechnol. 52: 51–60, 1996 Manuel L. Penichet,* Young–Sook Kang, t William M. Pardridge, ‡ Sherie L. Morrison,* and Seung–Uon Shin. An Antibody–Avidin Fusion Protein Specific for the Transferrin Receptor serves as a Delivery Vehicle for Effective Brain Targeting: Initial Applications in Anti–HIV Antisense Drug Delivery to the Brain 1. J Immunol 163: 4421–4426, 1999. Paganelli G., Grana C., Chinol M., Cremonesi M., De Cicco C., De Braud F., Robertson C., Zurrida S., Casadio C., Zoboli S., Siccardi A. G., Veronesi U. Antibody–guided three step therapy for high grade glioma with yttrium–90 biotin. Eur J Nucl Med 26(4):348–357, 1999. Paganelli G., Bartolomei M., Ferrari M., Cremonesi M., Broggi G., Maira G., Sturiale C., Grana C., Prisco G., Gatti M., Caliceti P., Chinol M. Pre–targeted locoregional radioimmunotherapy with 90Y–biotin in glioma patients: Phase I study and preliminary therapeutic results. Cancer Biother & Radiopharm 16(3):227–235, 2001. Parente D., D’Alatri L., Di Massimo AM., Saccinto MP., Novelli S., Pacilli A., Mele A. and De Santis R. Production and in vitro characterization of a recombinant immunotoxin made of a single chain anti–EGF receptor antibody and a type ribosome–inactivating protein (RIP) from filamentous fungus Aspergillus clavatus. Anticancer Research 17 (6A):4073–4074, 1997 Ramos D.M. Chen B, Regezi J, Zardi L, Pytela R Tenascin–C matrix assembly in oral squamous cell carcinoma. Int J Cancer 75:680–687, 1998. Siri A., Carnemolla B., Saginati M., Leprini A., Casari G., Baralle F. and Zardi L. Human tenascin: primary structure, pre–mRNA splicing patterns and localization of the epitope recognized by two monoclonal antibodies. Nucl Acid Res 19(3):525–531, 1991.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> DE SANTIS, RITA ANASTASI, ANNA MARIA

<120> ANTICUERPO MONOCLONAL DE ANTI–TENASCINA HUMANA

<130> 2818–141

<140>

<141>

<150> 60/359.299

<151> 26–2–2002

<160> 22

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1

<211> 142

<212> Proteína

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de proteínas de la región variable de la cadena ligera de ST2146 sintética

<400> 1

imagen2

<210> 2

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de proteínas de la región variable de la

cadena pesada de ST2146 sintética 10

<400> 2 <210> 3

imagen3

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de cDNA de la región variable de la

cadena pesada de ST2146 sintética 10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(426)

15 <400> 3 <210> 4

imagen1

imagen4

<213> Secuencia Artificial

<220>

cadena pesada de ST2146 sintética 10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(360)

15 <400> 4

imagen1

5 10: <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador <400> 5

tgtcaagagc ttcaacggga: 20

15: <210> 6 <211> 20 <212> DNA

<213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

<400> 6

aagatggata cagttggtgc: 20

<210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

<400> 7

gtcactgact cagggaagta gcc: 23

<210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

<400> 8

gcaacgtgag acacgagggt ctg: 23

<210> 9 <211> 16 <212> Proteína <213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia peptídica CDR1 de la región variable de cadena ligera de ST2146 sintética

<400> 9

imagen1

<210> 10

<211> 48

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia nucleotídica de CDR1 de la región variable de cadena ligera de ST2146 sintética

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(48)

<400> 10

imagen1

<210> 11

<211> 7

<212> Proteína

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia peptídica CDR2 de la región variable de cadena ligera de ST2146 sintética

<400> 11

Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser 15

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia nucleotídica de CDR2 de la región variable de cadena ligera de ST2146 sintética

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(21)

<400> 12

imagen1

<210> 13

<211> 9

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia peptídica CDR3 de la región variable de cadena ligera de ST2146 sintética

<400> 13

Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Leu Thr 15

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia nucleotídica de CDR3 de la región variable de cadena ligera de ST2146 sintética

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(27)

<400> 14

imagen1

<210> 15

<211> 5

<212> Proteína

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia peptídica CDR1 de la región variable de cadena pesada de ST2146 sintética

<400> 15

Ser Tyr Asn Met Tyr 15

<210> 16

<211> 15

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia nucleotídica de CDR1 de la región

variable de cadena pesada de ST2146 sintética

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(15)

<400> 16

imagen1

<210> 17

<211> 17

<212> Proteína

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia peptídica CDR2 de la región variable de cadena pesada de ST2146 sintética

<400> 17

imagen1

<210> 18

<211> 51

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia nucleotídica de CDR2 de la región variable de cadena pesada de ST2146 sintética

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(51)

<400> 18

imagen5

<210> 19

<211> 11

<212> Proteína 10 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia peptídica CDR3 de la región variable de cadena pesada de ST2146 sintética

15 <400> 19

Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 15 10

20 <210> 20

<211> 33

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

25 <223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia nucleotídica de CDR3 de la región variable de cadena pesada de ST2146 sintética

<220>

<221> CDS 30 <222> (1)..(33)

<400> 20

imagen1

<210> 21 5 <211> 773

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia nucleotídica de la región variable de la 10 cadena ligera de ST2146 sintética

<220>

<221> CDS

<222> (292)..(717) 15

<400> 21

imagen1

<210> 22

<211> 360

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia nucleotídica de la región variable de la cadena pesada de ST2146 sintética

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(360)

<400> 22

imagen6

Claims

REIVINDICACIONES

1.

El anticuerpo monoclonal anti–tenascina humana cuyas secuencias de la región variable de la cadena pesada y de la región variable de la cadena ligera son SEC ID N.º: 1 y SEC ID N.º: 2, respectivamente, y los fragmentos proteolíticos de los mismos que se unen a un epitopo antigénico dentro de la repetición similar a EGF de tenascina humana C.
2.

Un anticuerpo monoclonal contra tenascina C humana, cuya región variable de la cadena ligera comprende secuencias de aminoácidos de SEC ID N.º: 9, SEC ID N.º: 11 y SEC ID N.º: 13 y la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de aminoácidos: SEC ID N.º: 15, SEC ID N.º: 17 y SEC ID N.º: 19, o un fragmento de dicho anticuerpo monoclonal, en el que dicho anticuerpo o fragmento se une a un epitopo antigénico dentro de la repetición similar a EGF de la tenascina C humana.
3.

El anticuerpo y los fragmentos del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 contienen adicionalmente marcadores adicionales y/o agentes de diagnóstico.
4.

Un anticuerpo biotinilado o fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1–3 que se une a un epitopo antigénico dentro de la repetición similar a EGF de tenascina C humana.
5.

La línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal anti– tenascina humana que se une a un epitopo antigénico dentro de la repetición similar a EGF de tenascina C humana, registrada en el Advanced Biotechnology Center en el 29 de enero de 2002 sometida a las disposiciones del Tratado de Budapest, con el número PD02003.
6.

Un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma de la reivindicación 5.
7.

El procedimiento para la preparación del anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2, que comprende cultivar el hibridoma de la reivindicación 5 y aislar dicho anticuerpo.
8.

Uso del anticuerpo o de fragmentos del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1–3 o el anticuerpo o fragmento biotinilado de la reivindicación 4 para la preparación de medios de diagnóstico para la detección de enfermedades que expresan tenascina.
9.

Uso de la reivindicación 8, en el que dicha enfermedad es un tumor.
10.

Uso de la reivindicación 9, en el que dicho tumor se selecciona del grupo constituido por gliomas, tumores mamarios, carcinomas de pulmón, fibrosarcomas y carcinomas de células escamosas.
11.

Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8–10, en el que dicho medios de diagnóstico se usan en técnicas de formación de imagen in vivo.
12.

Uso del anticuerpo o de fragmentos del mismo de cualquiera de las

reivindicaciones 1–3 o el anticuerpo o fragmento biotinilado de la reivindicación 4 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de tumores que expresan tenascina.
13.

Uso de la reivindicación 12, en el que dicho tumor está seleccionado del grupo constituido por tumores cerebrales quísticos, gliomas, tumores mamarios, carcinomas de pulmón, fibrosarcomas y carcinomas de células escamosas.
14.

Uso de cualquiera de las reivindicaciones 12–13, en el que dicho medicamento está en forma de un kit adecuado para llevar a cabo el procedimiento de pre–marcaje como objetivo de tres etapas.
15.

El kit terapéutico compuesto de 5 viales, cuyo primer vial contiene el anticuerpo

o fragmento biotinilado de la reivindicación 4, el segundo vial contiene una avidina, el tercer vial contiene albúmina biotinilada, el cuarto vial contiene una estreptavidina, el quinto vial contiene biotina radiomarcada o derivado de biotina radiomarcado.
16.

El kit terapéutico de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dichos viales son adecuados para inyección a humanos.
17.

DNA que codifica el anticuerpo o los fragmentos del mismo de la reivindicación 1 ó 2.
18.

Proteínas que comprenden o que contienen CDR que se unen a un epitopo antigénico dentro de la repetición similar a EGF de tenascina C humana que tiene las secuencias de aminoácidos: SEQ ID N.º: 9, SEC ID N.º: 11 y SEC ID N.º: 13 y las secuencias de aminoácidos: SEQ ID N.º: 15, SEC ID N.º: 17 y SEC ID N.º: 19.
19.

Vector que contiene DNA de la reivindicación 17.
20.

Células huésped que contienen vectores de la reivindicación 19.
21.

Uso de anticuerpo o fragmentos del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1–3 en combinación con un segundo anticuerpo específico de tenascina en un ensayo de sandwich para la producción de un kit diagnóstico para la determinación del nivel de tenascina circulante.
22.

Kit diagnóstico que comprende el anticuerpo o los fragmentos de cualquiera de las reivindicaciones 1–3.
23.

Un envase que comprende el anticuerpo biotinilado o fragmentos biotinilados del mismo de la reivindicación 4, tampones y reactivos adecuados para usar en un kit terapéutico para un procedimiento de pre–marcaje como objetivo de tres etapas.
24.

El recipiente de acuerdo con la reivindicación 23, que contiene compartimentos múltiples.
25.

El recipiente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23–24, que comprende adicionalmente un anticuerpo específico de tenascina separado dirigido

preferencialmente hacia el fragmento de A–D.
26.

El recipiente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23–24, que comprende adicionalmente un anticuerpo específico de tumores separado.
27.

El anticuerpo de las reivindicaciones 1–3 en combinación con un segundo

5 anticuerpo específico de tenascina en un ensayo in vitro de ELISA en sandwich en condiciones donde dicho segundo anticuerpo se une a un segundo epitopo antigénico de tenascina, siendo dicho ensayo de ELISA in vitro útil para determinar el nivel de tenascina circulante.
28. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo y/o un fragmento del

mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1–3, en mezcla con al menos un excipiente y/o 10 vehículo farmacéuticamente aceptable.