ES2452067T3

ES2452067T3 - Anticuerpo específico para EPHB3 y usos del mismo

Info

Publication number: ES2452067T3
Application number: ES07840695.6T
Authority: ES
Inventors: Jeff Hsu; Linda Masat; Judy Abraham; Masahisa Handa; Siew Scheyer
Original assignee: Novartis AG; Xoma Technology Ltd USA
Current assignee: Novartis AG; Xoma Technology Ltd USA
Priority date: 2006-08-04
Filing date: 2007-08-03
Publication date: 2014-03-31
Anticipated expiration: 2027-08-03
Also published as: EP2420252A1; BRPI0715332A2; JP2013153769A; KR20090039799A; KR20140033236A; US9006398B2; WO2008019326A2; EP2057193B1; EP2057193A2; JP5406027B2; US8586716B2; US20140148584A1; CN101626783A; MX2009001341A; CA2659820A1; RU2009107707A; WO2008019326A3; US20090142261A1; AU2007281717A1; KR101437188B1

Abstract

Un anticuerpo monoclonal que (a) se une al dominio extracelular de EphB3 con una afinidad (KD) de 10-6 M omenos, (b) (i) compite con el anticuerpo XPA.04.001, que comprende una región variable de la cadena ligera de SEC IDNº: 3 y una región variable de la cadena pesada de SEC ID Nº: 4 para unirse a EphB3 más del 75 %, (ii) compite con el anticuerpo XPA.04.013, que comprende una región variable de la cadena ligera de SEC IDNº: 5 y una región variable de la cadena pesada de SEC ID Nº: 6 para unirse a EphB3 más del 75 %, (iii) compite con el anticuerpo XPA.04.018, que comprende una región variable de la cadena ligera de SEC IDNº: 7 y una región variable de la cadena pesada de SEC ID Nº: 8 para unirse a EphB3 más del 75 %, (iv) compite con el anticuerpo XPA.04.048, que comprende una región variable de la cadena ligera de SEC IDNº: 9 y una región variable de la cadena pesada de SEC ID Nº: 10 para unirse a EphB3 más del 75 %, (v) comprende las 6 CDR de anticuerpo XPA.04.001 (residuos 24-39 (CDR1), 55-61 (CDR2) y 94-102 (CDR3)de SEC ID Nº: 3 y los residuos 26-35 (CDR1), 50-66 (CDR2) y 99-102 (CDR3) de SEC ID Nº: 4), (vi) comprende las 6 CDR de anticuerpo XPA.04.013 (residuos 24-39 (CDR1), 55-61 (CDR2) y 94-102(CDR3) de SEC ID Nº: 5 y los residuos 26-35 (CDR1), 50-66 (CDR2) y 99-103 (CDR3) de SEC ID Nº: 6), (vii) comprende las 6 CDR de anticuerpo XPA.04.018 (residuos 24-39 (CDR1), 55-61 (CDR2) y 94-102(CDR3) de SEC ID Nº: 7 y los residuos 26-35 (CDR1), 50-66 (CDR2) y 99-102 (CDR3) de SEC ID Nº: 8), o (viii) comprende las 6 CDR de anticuerpo XPA.04.048 (residuos 24-39 (CDR1), 55-61 (CDR2) y 94-102(CDR3) de SEC ID Nº: 9 y los residuos 26-35 (CDR1), 50-66 (CDR2) y 99-102 (CDR3) de SEC ID Nº: 10), y (c) induce la fosforilación de EphB3 y/o degradación de EphB3.

Description

La presente invención se refiere a procedimientos para prevenir y tratar cáncer administrando anticuerpos específicos para EphB3.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El cáncer es la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos. Aunque “cáncer” se usa para describir muchos tipos diferentes de cáncer, es decir, mama, próstata, pulmón, colon, páncreas, cada tipo de cáncer se diferencia tanto al nivel fenotípico como al nivel genético. La característica de crecimiento no regulada del cáncer se produce cuando la expresión de uno o más genes se desregula debido a mutaciones o cambios epigenéticos, y ya no puede controlarse el crecimiento celular.

Los genes de control del crecimiento se clasifican frecuentemente en dos clases, oncogenes y genes supresores de tumores. Los oncogenes son genes cuya función normal es promover el crecimiento celular, pero solo bajo condiciones específicas. Cuando un oncogén adquiere una mutación y pierde ese control de la especificidad, promueve el crecimiento bajo una variedad mucho más amplia de condiciones. Sin embargo, se ha encontrado que para el cáncer es realmente satisfactorio que la célula cancerosa deba también adquirir mutaciones en genes supresores de tumor. La función normal de genes supresores de tumor es detener el crecimiento celular. Ejemplos de supresores de tumores incluyen p53, p16, p21 y APC, todos los cuales, cuando actúan normalmente, detienen que una célula se divida y crezca incontroladamente. Cuando un supresor de tumor se muta o pierde, ese freno del crecimiento celular también se pierde, permitiendo ahora que las células crezcan sin las restricciones normales.

EphB3 es un receptor en la familia de tirosina cinasa de receptores de efrina. Actualmente hay 14 receptores de Eph y 9 ligandos de efrina conocidos en seres humanos. Los receptores de efrina (Eph) y sus ligandos, las efrinas, median en numerosos procesos de desarrollo, particularmente en el sistema nervioso y sistemas vasculares. Las efrinas también son conocidas por desempeñar una función en el desarrollo tumoral, angiogénesis, crecimiento metastásico y supervivencia celular. Basándose en sus estructuras y relaciones de secuencia, las efrinas se dividen en la clase de efrina-A (EFNA), que están ancladas a la membrana por un enlace glucosilfosfatidilinositol, y la clase de efrina-B (EFNB), que son proteínas transmembrana. La familia de Eph de receptores se divide en 2 grupos basándose en la similitud de sus secuencias de dominio extracelular y sus afinidades para unirse a ligando de efrina-A y efrina-B. Los receptores de Eph constituyen el mayor subgrupo de la familia de tirosina cinasa de receptor (RTK).

VAN HEVMEN y col., 2000, Binchi y col. y el documento WO 03/087841 desvelan todos anticuerpos que se unen a efrina B3.

Los receptores de Eph participan en cáncer. Las células NIH3T3 transfectadas con EphA1 y trasplantadas en ratones sin pelo producen tumores de 10 mm3 en 5-6 semanas, mientras que los controles de vector no produjeron ningún tumor durante el mismo periodo de tiempo (Maru y col., Oncogene. 1990 Mar; 5(3):445-7). EphB2 se expresa a mayores niveles en cánceres de estómago (12/16), colon (3/11), esófago (3/6), ovario (1/7), riñón (1/2) y pulmón (1/1) cuando se compara con tejidos normales (Kiyokawa y col., Cancer Res 1994 Jul 15; 54(14):3645-50). La expresión de EphB6 se correlaciona con neuroblastomas de bajo grado. El dominio de cinasa de EphB6 no es activo, por tanto, se ha propuesto que este receptor actúa de negativo dominante que se produce naturalmente (Tang y col., Clin Cancer Res 1999a Jun;5(6):1491-6).

Hay un volumen creciente de pruebas que implican la participación de Eph y efrinas en angiogénesis. Se ha informado que la efrina A1, efrina B1, efrina B2, EphB2, EphB3 y EphB4 se expresan en vasos sanguíneos. La efrina A1 puede inducir angiogénesis en el modelo de córnea de rata y los anticuerpos para efrina A1 pueden inhibir angiogénesis inducida por TNF-α en este mismo modelo (Pandey y col., Science 1995 Apr 28; 268(5210):567-9). La efrina B1 agrupada induce la unión a célula y el ensamblaje similar a capilar en P 19, una línea celular murina derivada de teratocarcinoma, y en células endoteliales microvasculares renales humanas (HRMEC) (Stein y col., Genes Dev 1998 Mar 1; 12(5):667-78). La efrina B1 agrupada y la efrina B2 también pueden inducir la germinación de células endoteliales microvasculares derivadas de la corteza suprarrenal (ACE) (Adams y col., Genes Dev 1999 Feb 1; 13(3):295-306). La inyección de un ARN de receptor EphB4 negativo dominante en embriones de Xenopus produce venas intersomáticas que se proyectan anormalmente en somitas adyacentes (Helbling y col., Development 2000 Jan;127(2):269-78). Ratones inactivados doblemente en EphB2/EphB3, inactivados en EphB4 y efrina B2 tienen todos defectos de remodelación vascular (Adams y col., 1999; Wang y col., Cell 1998 May 29; 93(5):741-53;PCT documento WO 00/30673).

Batlle y col., 2005, desvelan modelos inactivados en Eph

Las Eph también pueden desempeñar una función en metástasis. Células de riñón epiteliales humanas 293T transfectadas con tanto EphB3 como EphB2 presentan adhesión de células reducida a superficies recubiertas de fibronectina o colágeno in vitro. El fracaso de células 293 a adherirse se medió por la fosforilación de EphB2 de R

ras, seguido de desactivación de integrinas (Zou y col., Proc Natl Acad Sci U S A 1999 Nov 23; 96(24):13813-8).

Las Eph parecen funcionar por señalización tras la activación. La unión de efrina induce la oligomerización de receptores de Eph causando la fosforilación de residuos de yuxtamembrana de Eph. Las Eph activadas tienen múltiples tirosinas fosforiladas que actúan de sitios de unión para las proteínas de señalización (por ejemplo, proteínas que contienen RasGAP, Src, LMW-PTP, PLCg, PI3-cinasa, Grb2 y PDZ).

La expresión en exceso de receptores de Eph (EphA1, EphA2, EphB2) produce la transformación en ausencia de hiperfosforilación de receptores. Los receptores EphB fosforilados regulan negativamente la ruta de Ras-MAP-cinasa y la señalización de FAK, alterando el crecimiento celular.

EphB3 (también conocido como Hek2, Sek4, Mdk5, Tyro6, Cek10 y Qek10) es un receptor para los miembros de la familia de efrina B (efrina B1, efrina B2 y efrina B3), y se sabe que se expresa en tejido normal y en ciertos tumores y líneas de células cancerosas. Hasta la fecha, sin embargo, la función de EphB3 en cáncer no se había elucidado. Así, hay una necesidad de identificar composiciones y procedimientos que modulen EphB3 y su función en tales cánceres.

Bohme y col., 1996, documentos EP 1400807, WO2004/005457 y WO2006/047639, desvelan anticuerpos que se unen a receptores de Eph. La presente invención se refiere a estas, además de a otras, necesidades importantes.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona un anticuerpo monoclonal que (a) se une al dominio extracelular de EphB3 con una afinidad (KD) de 10-6 M o menos, (b)

(i): compite con el anticuerpo XPA.04.001, que comprende una región variable de la cadena ligera de SEC ID Nº: 3 y una región variable de la cadena pesada de SEC ID Nº: 4 para unirse a EphB3 más del 75 %,

(ii): compite con el anticuerpo XPA.04.013, que comprende una región variable de la cadena ligera de SEC ID Nº: 5 y una región variable de la cadena pesada de SEC ID Nº: 6 para unirse a EphB3 más del 75 %,

(iii) compite con el anticuerpo XPA.04.018, que comprende una región variable de la cadena ligera de SEC ID Nº: 7 y una región variable de la cadena pesada de SEC ID Nº: 8 para unirse a EphB3 más del 75 %,

(iv): compite con el anticuerpo XPA.04.048, que comprende una región variable de la cadena ligera de SEC ID Nº: 9 y una región variable de la cadena pesada de SEC ID Nº: 10 para unirse a EphB3 más del 75 %,

(v): comprende las 6 CDR de anticuerpo XPA.04.001 (residuos 24-39 (CDR1), 55-61 (CDR2) y 94-102 (CDR3) de SEC ID Nº: 3 y los residuos 26-35 (CDR1), 50-66 (CDR2) y 99-102 (CDR3) de SEC ID Nº: 4),

(vi): comprende las 6 CDR de anticuerpo XPA.04.013 (residuos 24-39 (CDR1), 55-61 (CDR2) y 94-102 (CDR3) de SEC ID Nº: 5 y los residuos 26-35 (CDR1), 50-66 (CDR2) y 99-103 (CDR3) de SEC ID Nº: 6),

(vii) comprende las 6 CDR de anticuerpo XPA.04.018 (residuos 24-39 (CDR1), 55-61 (CDR2) y 94-102 (CDR3) de SEC ID Nº: 7 y los residuos 26-35 (CDR1), 50-66 (CDR2) y 99-102 (CDR3) de SEC ID Nº: 8), o

(viii) comprende las 6 CDR de anticuerpo XPA.04.048 (residuos 24-39 (CDR1), 55-61 (CDR2) y 94-102 (CDR3) de SEC ID Nº: 9 y los residuos 26-35 (CDR1), 50-66 (CDR2) y 99-102 (CDR3) de SEC ID Nº: 10),

y (c) induce la fosforilación de EphB3 y/o degradación de EphB3.

En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención se une al mismo epítope de EphB3 que cualquiera de los anticuerpos XPA.04.001, XPA.04.013, XPA.04.018 o XPA.04.048. En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo Human Engineered, un anticuerpo humano, un anticuerpo monocatenario o un fragmento de anticuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención comprende una región constante de una secuencia de anticuerpo humano y una o más regiones estructurales variables de la cadena pesada y ligera de una secuencia de anticuerpo humano. En algunas realizaciones, la secuencia de anticuerpo humano es una secuencia humana individual, una secuencia consenso humana, una secuencia humana individual de la línea germinal o una secuencia consenso humana de la línea germinal. En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención la región constante de la cadena pesada es una IgG, IgM, IgA, IgD, IgE modificada o sin modificar, un fragmento de la misma, o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención tiene una afinidad de unión de 10-7, 10-8 ó 10-9 M o menos por EphB3. En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención inhibe (i) la unión de una efrina B a EphB3; y/o (ii) la proliferación de una célula cancerosa, tal como una célula de cáncer de pulmón, ovario, esofágico, colon o mama. En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención está conjugado con otro agente de diagnóstico o terapéutico.

La invención también proporciona un procedimiento de selección de un anticuerpo para el dominio extracelular de una proteína EphB3 útil para el tratamiento de cáncer que comprende las etapas de:

poner en contacto un polipéptido que comprende el DEC de EphB3 con un anticuerpo candidato que contiene 6 CDR de los anticuerpos XPA.04.001, XPA.04.013, XPA.04.018 o XPA.04.048; detectar la afinidad de unión del anticuerpo candidato al polipéptido, e identificar dicho anticuerpo candidato como un anticuerpo útil para el tratamiento de cáncer si se detecta una

afinidad de unión de al menos 10-6 M.

La invención también proporciona un procedimiento de alterar sistemáticamente anticuerpos y seleccionar un anticuerpo para el dominio extracelular de una proteína EphB3 útil para el tratamiento de cáncer que comprende las etapas de:

preparar un anticuerpo candidato que contiene modificaciones a uno o dos aminoácidos dentro de las CDR de los anticuerpos XPA.04.001, XPA.04.013, XPA.04.018 o XPA.04.048, poner en contacto un polipéptido que comprende el DEC de EphB3 con dicho anticuerpo candidato detectar la afinidad de unión del anticuerpo candidato al polipéptido, e identificar dicho anticuerpo candidato como un anticuerpo útil para el tratamiento de cáncer si se detecta una afinidad de unión de al menos 10-6 M.

poner en contacto una célula de pulmón, ovario, esófago, colon o mama con un anticuerpo candidato que contiene 6 CDR de los anticuerpos XPA.04.001, XPA.04.013, XPA.04.018 o XPA.04.048 o un anticuerpo que contiene una modificación de uno o dos aminoácidos dentro de una o más CDR; detectar la proliferación o supervivencia de dicha célula; e identificar dicho anticuerpo candidato como un anticuerpo útil para el tratamiento de cáncer si se detecta una disminución en la proliferación o supervivencia celular.

La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo de la invención.

La invención también proporciona un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la invención operativamente ligado a una secuencia de control reguladora.

La invención también proporciona una célula huésped que expresa un anticuerpo de la invención y comprende el vector de la invención o una molécula de ácido nucleico de la invención.

La invención también proporciona un procedimiento de uso de la célula huésped de la invención para producir un anticuerpo de la invención, que comprende cultivar la célula huésped bajo condiciones adecuadas y recuperar dicho anticuerpo.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La invención también proporciona un kit que comprende un anticuerpo cualquiera de la invención que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho anticuerpo, envasado en un recipiente, conteniendo dicho kit opcionalmente un segundo agente terapéutico, y que comprende además una etiqueta unida a o envasada con el recipiente, etiqueta que describe el contenido del recipiente y proporciona indicaciones y/o instrucciones referentes al uso del contenido del recipiente para tratar cáncer, por ejemplo, en el que el recipiente es un vial o frasco o jeringuilla precargada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra los resultados de un análisis de FACS que demuestra internalización/degradación de EphB3 inducida por mAb.

La Figura 2 muestra que los mAb anti-EphB3 desencadenan la fosforilación de EphB3 en células SW620.

La Figura 3 muestra que los anticuerpos anti-EphB3 inducen la fosforilación de EphB3 a una baja concentración de anticuerpo.

La Figura 4 muestra que los mAb anti-EphB3 inducen la degradación, no solo la internalización de EphB3.

La Figura 5 muestra que un subconjunto de mAb redujo el nivel de proteína EphB3 durante al menos 72 horas.

La Figura 6 muestra que múltiples líneas celulares responden a un mAb agonista fosforilando EphB3.

La Figura 7 muestra la línea de riesgo para la cadena ligera y cadena pesada de XPA.04.001, XPA.04.013, XPA.04.018, XPA.04.048 (H=riesgo alto, M=riesgo moderado, L=riesgo bajo), la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera y cadena pesada de XPA.04.001, XPA.04.013, XPA.04.018, XPA.04.048 (SEC ID Nº: 3-10) y la localización de CDR H1, H2 y H3 dentro de la secuencia de aminoácidos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente invención proporciona anticuerpos específicos para EphB3, formulaciones farmacéuticas que contienen tales anticuerpos, procedimientos de preparación de los anticuerpos y formulaciones farmacéuticas. Los anticuerpos según la presente invención pueden tener una actividad biológica deseada de unión a EphB3, inducción de la fosforilación de EphB3, inducción de la oligomerización de EphB3, inducción de la internalización de EphB3, inducción de la degradación de EphB3, inducción de la señalización EphB3 y/o modulación de la adhesión célulacélula mediada por EphB3.

En una realización, los anticuerpos de la presente invención actúan de agonistas de los polipéptidos de la presente invención. Por consiguiente, en algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención pueden activar o inducir una función de un antígeno diana con el que se une (por ejemplo, aumentando una función de la diana, tal como actividad de fosforilación o señalización intracelular).

En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención se unen a un epítope desvelado en el presente documento, o una porción del mismo. En algunas realizaciones, la unión del anticuerpo al receptor induce la degradación del receptor. En algunas realizaciones, la unión del anticuerpo al receptor induce la oligomerización del receptor. En algunas realizaciones, la unión del anticuerpo al receptor induce la fosforilación del receptor. En algunas realizaciones, la unión del anticuerpo al receptor induce la activación del receptor. La activación del receptor (es decir, señalización) puede determinarse por técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, la activación del receptor puede determinarse detectando la fosforilación (por ejemplo, tirosina o serina/treonina) del receptor o su sustrato por inmunoprecipitación, seguido de análisis de transferencia Western. En algunas realizaciones se proporcionan anticuerpos que modulan la actividad del ligando o actividad del receptor como se describe en el presente documento por al menos el 95 %, al menos el 90 %, al menos el 85 %, al menos el 80 %, al menos el 75 %, al menos el 70 %, al menos el 60 %, o al menos el 50 % de la actividad en ausencia del anticuerpo.

En algunas realizaciones, los anticuerpos para EphB3 estimulan la unión de EphB3 a proteínas adaptadoras intracelulares. En algunas realizaciones, los anticuerpos para EphB3 inhiben y/o inactivan FAK, la ruta de Erk/MAPK, la ruta de Cdc42/Rac, activan RasGAP, inhiben y/o inactivan Abl/Arg, Fyn, Src, LMW-PTP, intersectina, la ruta de Cdc42, kalirina o la ruta de Rac. En algunas realizaciones, los anticuerpos para EphB3 inactivan R-ras o activan sindecano. En algunas realizaciones, los anticuerpos para EphB3 conducen a la fosforilación de R-Ras.

Como se usa en el presente documento, el término “proteínas adaptadoras intracelulares” se refiere a una proteína que conecta diferentes segmentos de un complejo de señalización. El adaptador puede o puede no tener actividad enzimática. Ejemplos de proteínas adaptadoras son conocidos para aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, Grb2 es una proteína adaptadora que no tiene actividad enzimática intrínseca, mientras que RasGAP es una proteína adaptadora que tiene actividad enzimática.

Los anticuerpos según la presente invención pueden tener alternativamente (o además) una actividad biológica deseada de unión a EphB3 expresada sobre células cancerosas, sirviendo así para elegir como diana terapias citotóxicas para las células cancerosas.

Varios anticuerpos murinos o quiméricos preferidos con alta afinidad y potencia como se mide por ensayos in vitro se modifican para ser menos inmunogénicos en seres humanos basándose en el procedimiento Human Engineering ™ de Studnicka y col. Brevemente, residuos de aminoácidos expuestos en la superficie de regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera se modifican dando residuos humanos en posiciones que se determina que es poco probable que efectúen adversamente tanto la unión a antígeno como el plegamiento de proteínas, a la vez que reducen su inmunogenicidad con respecto a un entorno humano. Se construyen genes sintéticos que codifican regiones variables de cadena pesada y/o ligera modificadas y se ligan a secuencias codificantes para las regiones constantes de la cadena pesada gamma y/o de la cadena ligera kappa humanas. Cualquier región constante de la cadena pesada y de la cadena ligera humana puede usarse en combinación con las regiones variables de anticuerpo Human Engineered ™. Los genes de la cadena pesada y ligera humana se introducen en células de mamífero y los productos de inmunoglobulina recombinantes resultantes se obtienen y se caracterizan.

Anticuerpos a modo de ejemplo según la invención incluyen XPA.04.001, XPA.04.013, XPA.04.018 y XPA.04.048.

Las siguientes definiciones se proporcionan como una ayuda para entender la invención más completamente.

Definiciones generales

El antígeno diana “EphB3” humano como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido humano que tiene sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que SEC ID Nº: 2 y variantes alélicas que se producen naturalmente del mismo. “DEC de EphB3” como se usa en el presente documento se refiere a la porción extracelular de EphB3 representada por los aminoácidos 37 - 558 de SEC ID Nº: 2 (véase también la discusión anterior con respecto a la clasificación publicada del DEC).

“Tumor” como se usa en el presente documento se refiere a todo crecimiento y proliferación celular neoplásico, tanto si es maligno como benigno, y a todas las células y tejidos pre-cancerosos y cancerosos.

Los términos “cáncer” y “canceroso” se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza normalmente por crecimiento celular desregulado. Ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinomas de pulmón de células escamosas y pequeñas, carcinoma de células escamosas esofágicas, carcinoma de células claras del ovario, adenocarcinomas de colon y carcinoma de mama ductal infiltrante.

“Tratamiento” es una intervención realizada con la intención de prevenir el desarrollo o alterar la patología de un trastorno. Por consiguiente, “tratamiento” se refiere a tanto tratamiento terapéutico y profiláctico como a medidas preventivas. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos ya con el trastorno, además de aquellos en los que el trastorno va a prevenirse. En el tratamiento de tumores (por ejemplo, cáncer), un agente terapéutico puede disminuir directamente la patología de células tumorales, o hacer las células tumorales más susceptibles a tratamiento por otros agentes terapéuticos, por ejemplo, radiación y/o quimioterapia. El tratamiento de pacientes que padecen síntomas clínicos, bioquímicos, radiológicos o subjetivos de la enfermedad puede incluir aliviar algunos o todos de aquellos síntomas o reducir la predisposición a la enfermedad. La “patología” del cáncer incluye todos los fenómenos que comprometen el bienestar del paciente. Esto incluye, sin limitación, crecimiento celular anormal o incontrolable, metástasis, interferencia con el funcionamiento normal de células vecinas, liberación de citocinas u otros productos secretores a niveles anormales, supresión o agravación de respuesta inflamatoria o inmunológica, etc. Así, la mejora después del tratamiento puede manifestarse como disminución del tamaño del tumor, descenso en la tasa de crecimiento tumoral, destrucción de células tumorales existentes o células metastásicas, y/o una reducción en el tamaño o número de metástasis.

“Mamífero” para los fines de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, que incluye seres humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, para deportes o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferentemente, el mamífero es humano.

Como se usa en el presente documento, el término “cantidad terapéuticamente eficaz” pretende referirse a una cantidad de anticuerpo terapéutico o profiláctico que sería apropiada para una realización de la presente invención, que provocará el efecto o respuesta terapéutico o profiláctico deseado, que incluye aliviar algunos o todos de aquellos síntomas de enfermedad o reducir la predisposición a la enfermedad, cuando se administran según la pauta de tratamiento deseada.

Anticuerpos

El término “inmunoespecífico” o “que se une específicamente” significa que el anticuerpo se une a EphB3 o su DEC con una Ka superior a o igual a aproximadamente 104 M-1, preferentemente superior a o igual a aproximadamente 105 M-1, más preferentemente superior a o igual a aproximadamente 106 M-1. El anticuerpo puede tener afinidad sustancialmente mayor por el antígeno diana en comparación con otras moléculas sin relacionar. El anticuerpo también puede tener afinidad sustancialmente mayor por el antígeno diana en comparación con ortólogos u homólogos, por ejemplo, al menos 1,5 veces, 2 veces, 5 veces 10 veces, 100 veces, 103 veces, 104 veces, 105 veces, 106 veces o mayor afinidad relativa por el antígeno diana. Alternativamente, podría ser útil que el anticuerpo reaccionara de forma cruzada con un homólogo u ortólogo conocido.

Los anticuerpos de la invención también pueden caracterizarse por una afinidad (KD) de al menos 10-6 M, 10-7 M o 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M o 10-11 M. La afinidad apropiada por los anticuerpos puede variar dependiendo de la aplicación terapéutica. Por ejemplo, aunque anticuerpos con muy alta afinidad pueden ser los más deseables como terapéutico para cáncer de sangre, un anticuerpo con muy alta afinidad puede mostrar escasa penetración de tumores sólidos. Por consiguiente, un anticuerpo con una afinidad de aproximadamente 10-6 M a 10-10 M puede ser más apropiado como terapéutico para tumor sólido. Tales afinidades pueden determinarse fácilmente usando técnicas convencionales, tales como por diálisis en equilibrio; usando el instrumento BIAcore 2000, usando procedimientos generales brevemente explicados por el fabricante; por radioinmunoensayo usando antígeno diana radiomarcado; o por otro procedimiento conocido para el experto. Los datos de afinidad pueden analizarse, por ejemplo, mediante el procedimiento de Scatchard y col., Ann N.Y. Acad. Sci., 51:660 (1949).

Por “anticuerpo agonista” se indica una molécula de anticuerpo que puede activar o inducir una función de un antígeno diana con el que se une. Por consiguiente, un anticuerpo anti-diana “agonista” puede aumentar una función de la diana, tal como actividad de fosforilación o señalización intracelular.

El término “anticuerpo” se usa en el sentido más amplio e incluye anticuerpos completamente ensamblados, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), fragmentos de anticuerpos que pueden unirse a antígeno (por ejemplo, Fab', F'(ab)2, Fv, anticuerpos monocatenarios, diacuerpos) y péptidos recombinantes que comprenden los anteriores en tanto que presenten la actividad biológica deseada. Los fragmentos de anticuerpos pueden producirse por técnicas de ADN recombinante o por escisión enzimática o química de anticuerpos intactos y se describen adicionalmente más adelante. Ejemplos no limitantes de anticuerpos monoclonales incluyen inmunoglobulinas murinas, quiméricas, humanizadas, humanas y

Human Engineered™, anticuerpos, proteínas de fusión quiméricas que tienen secuencias derivadas de inmunoglobulinas, o muteínas o derivados de las mismas, cada uno descrito adicionalmente más adelante. Se contemplan multímeros o agregados de moléculas intactas y/o fragmentos, que incluyen anticuerpos químicamente derivatizados. Según la presente invención se contemplan anticuerpos de cualquier clase o subclase de isotipo.

El término “anticuerpo monoclonal” como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones que se producen naturalmente o modificaciones postraduccionales alternativas que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos; a diferencia de preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes), estando cada anticuerpo monoclonal dirigido contra un único determinante sobre el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque se sintetizan por el cultivo homogéneo, sin contaminar por otras inmunoglobulinas, con diferentes especificidades y características.

El adjetivo “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo como que se ha obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse como que requiera la producción del anticuerpo por cualquier procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que van a usarse según la presente invención pueden prepararse mediante el procedimiento de hibridoma descrito por primera vez por Kohler y col., 1975 Nature, 256:495, o pueden prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.816.567). Los “anticuerpos monoclonales” también pueden ser, por ejemplo, recombinantes, quiméricos, humanizados, humanos, Human Engineered™, o fragmentos de anticuerpos.

Un anticuerpo “aislado” es uno que se ha identificado y separado y recuperado de un componente de su entorno natural. Componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con usos de diagnóstico

o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) a más del 95 % en peso de anticuerpo como se ha determinado por el procedimiento de Lowry, y lo más preferentemente más del 99 % en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos del extremo N o secuencia de aminoácidos interna por el uso de un secuenciador de taza giratoria, o (3) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Generalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará por al menos una etapa de purificación.

Una “inmunoglobulina” o “anticuerpo nativo” es una glucoproteína tetramérica. En una inmunoglobulina que se produce naturalmente, cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, teniendo cada par una cadena “ligera” (aproximadamente 25 kDa) y una “pesada” (aproximadamente 50-70 kDa). La porción del extremo amino de cada cadena incluye una región “variable” (“V”) de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsable del reconocimiento de antígeno. La porción del extremo carboxi de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora. Las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas. Las cadenas pesadas se clasifican como mu (μ), delta (Δ), gamma (γ), alfa (α) y épsilon (ε) y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Varias de estas pueden dividirse adicionalmente en subclases o isotipos, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Diferentes isotipos tienen diferentes funciones efectoras; por ejemplo, los isotipos IgG1 e IgG3 tienen actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa (κ) y lambda (λ). Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes se unen por una región “J” de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región “D” de aproximadamente 10 aminoácidos más. Véase generalmente Fundamental Immunology, Cap. 7 (Paul, W., ed., 2ª ed. Raven Press, N.Y. (1989)).

Para una descripción detallada de la estructura y generación de anticuerpos véase Roth, D.B., y Craig, N.L., Cell, 94:411-414 (1998). Brevemente, el procedimiento para generar ADN que codifica las secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera se produce principalmente en linfocitos B en desarrollo. Antes del reordenamiento y unión de diversos segmentos de genes de inmunoglobulina, los segmentos de genes V, D, J y constantes (C) se encuentran generalmente a relativa proximidad sobre un único cromosoma. Durante la diferenciación de linfocitos B, uno de cada uno de los miembros de la familia apropiada de los segmentos de genes V, D, J (o solo V y J en el caso de genes de la cadena ligera) se recombinan para formar regiones variables funcionalmente reordenadas de los genes de inmunoglobulina pesada y ligera. Este proceso de reordenamiento de segmentos de genes parece ser secuencial. Primero se hacen las uniones D a J de la cadena pesada, seguido de las uniones V a DJ de la cadena pesada y las uniones V a J de la cadena ligera. Además del reordenamiento de segmentos V, D y J, adicionalmente se genera diversidad en el repertorio primario de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina a modo de recombinación variable en las localizaciones en las que los segmentos V y J en la cadena ligera se unen y en las que los segmentos D y J de la cadena pesada se unen. Tal variación en la cadena ligera normalmente se produce dentro del último codón del segmento del gen V y el primer codón del segmento J. Imprecisión similar en la unión se produce en el cromosoma de la cadena pesada entre los segmentos D y JH y puede extenderse durante hasta 10

nucleótidos. Además, pueden insertarse varios nucleótidos entre los segmentos de genes D y JH y entre VH y D que no están codificados por ADN genómico. La adición de estos nucleótidos se conoce como diversidad de la región N. El efecto neto de tales reordenamientos en los segmentos de genes de la región variable y la recombinación variable que puede producirse durante tal unión es la producción de un repertorio de anticuerpos primarios.

Los “fragmentos de anticuerpos” comprenden una parte de un anticuerpo de longitud completa intacto (que incluyen, por ejemplo, anticuerpos humanos), preferentemente la región de unión a antígeno o variable del anticuerpo intacto, e incluyen anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Ejemplos no limitantes de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticuerpo de dominio (dAb), fragmentos de la región determinante de la complementariedad (CDR), anticuerpos monocatenarios (scFv), fragmentos de anticuerpos monocatenarios, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, anticuerpos lineales (Zapata y col., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995)); anticuerpos recombinantes quelantes, tricuerpos o bicuerpos, intracuerpos, nanocuerpos, productos inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP), una proteína de fusión de dominio de unión a antígeno-inmunoglobulina, un anticuerpo camelizado, un anticuerpo que contiene VHH, o muteínas o derivados de las mismas, y polipéptidos que contienen al menos una parte de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión de antígeno específica al polipéptido, tal como una secuencia de CDR, en tanto que el anticuerpo retenga la actividad biológica deseada.

La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos llamados fragmentos “Fab”, cada uno con un único sitio de unión a antígeno, y un fragmento “Fc” residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina da un fragmento F(ab')2 que tiene dos fragmentos “Fv”. Un fragmento “Fv” es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento y de unión a antígeno completo. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de la cadena pesada y ligera en estrecha asociación no covalente. Es en esta configuración en la que las tres CDR de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión a antígeno sobre la superficie del dímero VH VL. Conjuntamente, las seis CDR confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad para reconocer y unirse a antígeno.

Fragmentos de “Fv monocatenario” o “sFv” o “scFv” de anticuerpos comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo, en los que estos dominios están presentes en una única cadena de polipéptidos. Preferentemente, el polipéptido de Fv comprende además un polipéptido ligador entre los dominios VH y VL que permite que Fv forme la estructura deseada para unión a antígeno. Para una revisión de scFv véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pág. 269-315 (1994).

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab se diferencian de fragmentos Fab' mediante la adición de algunos residuos en el extremo carboxi del dominio CH1 de la cadena pesada que incluyen una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en el presente documento para Fab' en el que el (los) residuo(s) de cisteína de los dominios constantes poseen un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos.

El término región “hipervariable” se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión a antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de una “región determinante de la complementariedad” o CDR [es decir, residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada como se describe por Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] y/o aquellos residuos de un bucle hipervariable (es decir, los residuos 26-32 (L1), 5052 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada como se describe por [Chothia y col., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)].

Residuos de la “región estructural” o FR son aquellos residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable.

El término “región constante” se refiere a la porción de la molécula de anticuerpo que confiere funciones efectoras.

El término “anticuerpo quimérico”, como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que contiene secuencia derivada de dos anticuerpos diferentes (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.816.567) que normalmente se originan a partir de diferentes especies. Lo más normalmente, los anticuerpos quiméricos comprenden fragmentos de anticuerpos humanos y murinos, generalmente regiones constantes humanas y variables de ratón.

El término “muteína” se refiere a la secuencia de polipéptidos de un anticuerpo que contiene al menos una sustitución, deleción o inserción de aminoácidos en la región variable o la porción equivalente a la región variable, a condición de que la muteína retenga la afinidad de unión deseada o actividad biológica. Las muteínas pueden ser sustancialmente homólogas o sustancialmente idénticas al anticuerpo parental.

El término “derivado” cuando se usa a propósito de los anticuerpos de la invención se refiere a anticuerpos covalentemente modificados por técnicas tales como ubiquitinación, conjugación con agentes terapéuticos o de diagnóstico, marcado (por ejemplo, con radionúclidos o diversas enzimas), unión covalente de polímeros tal como PEGilación (derivatización con polietilenglicol) e inserción o sustitución por síntesis química de aminoácidos no naturales. Los derivados de la invención retendrán las propiedades de unión de moléculas sin derivatizar de la invención.

Cuando se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” incluye específicamente uno cualquiera de los siguientes que retienen la capacidad para unirse a la porción extracelular de EphB3:

1) una muteína de aminoácido de un anticuerpo parental que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 7, que incluye muteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable que es al menos el 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o el 99 % homóloga a la secuencia de aminoácidos parental, y/o que comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable que es al menos el 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o el 99 % homóloga a la secuencia de aminoácidos parental, teniendo en cuenta aminoácidos similares para la determinación de la homología;

2) polipéptidos de unión a EphB3 que comprenden una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo parental que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 7, que comprenden preferentemente al menos CDR3 de la cadena pesada, y que comprenden preferentemente dos o más, o tres o más,

o cuatro o más, o cinco o más, o las seis CDR;

3) anticuerpos Human Engineered ™ generados alterando la secuencia parental según los procedimientos expuestos en Studnicka y col., patente de EE.UU. nº 5.766.886 y el Ejemplo 8 en el presente documento, usando la numeración de Kabat para identificar residuos de riesgo bajo, moderado y alto; comprendiendo tales anticuerpos al menos una de las siguientes cadenas pesadas y al menos una de las siguientes cadenas ligeras: (a) una cadena pesada en la que todos los residuos de roedor de riesgo bajo que se diferencian de residuos correspondientes en una secuencia de inmunoglobulina de referencia humana se han modificado para ser los mismos que los residuos humanos en la secuencia de inmunoglobulina de referencia humana o (b) una cadena pesada en la que todos los residuos de roedor de riesgo bajo y moderado se han modificado, si fuera necesario, para ser los mismos residuos que en la secuencia de inmunoglobulina de referencia humana, (c) una cadena ligera en la que todos los residuos de riesgo bajo se han modificado, si fuera necesario, para ser los mismos residuos que una secuencia de inmunoglobulina de referencia humana o (b) una cadena ligera en la que todos los residuos de riesgo bajo y moderado se han modificado, si fuera necesario, para ser los mismos residuos que una secuencia de inmunoglobulina de referencia humana;

4) muteínas de los anticuerpos anteriormente mencionados en el párrafo (3) precedente que comprenden una cadena pesada o ligera o regiones variables de cadena pesada o ligera que tienen al menos el 60 % de identidad de secuencias de aminoácidos con la cadena ligera de roedor original, más preferentemente al menos el 80 %, más preferentemente al menos el 85 %, más preferentemente al menos el 90 %, y lo más preferentemente al menos el 95 %, que incluyen, por ejemplo, el 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y el 100 % de identidad;

5) polipéptidos de unión a EphB3 que comprenden los residuos de riesgo alto de una o más CDR del anticuerpo de roedor, y que comprenden preferentemente residuos de riesgo alto de dos o más, o tres o más, o cuatro o más, o cinco o más, o las seis CDR, y que opcionalmente comprenden uno o más cambios en los residuos de riesgo bajo o moderado;

por ejemplo, que comprende uno o más cambios en un residuo de riesgo bajo y sustituciones conservativas en un residuo de riesgo moderado, o

por ejemplo, que retiene los residuos de aminoácidos de riesgo moderado y alto y que comprende uno o más cambios en un residuo de riesgo bajo,

en el que los cambios incluyen inserciones, deleciones o sustituciones y pueden ser sustituciones conservativas o pueden hacer que el anticuerpo manipulado esté más próximo en secuencia a una secuencia de cadena ligera o cadena pesada humana, una secuencia de la cadena ligera o cadena pesada de la línea germinal humana, una secuencia de la cadena ligera o cadena pesada humana consenso o una secuencia de la cadena ligera o cadena pesada de la línea germinal humana consenso. Tales cambios contemplados también pueden mostrarse en formato de secuencia del siguiente modo. En una secuencia hipotética de AKKLVHTPYSFKEDF, en la que el riesgo respectivo asignado a cada residuo según Studnicka y col., patente de EE.UU. nº 5.766.886, es HMLHMLHMLHMLHML (H= alto, M= medio, L= bajo), cambios a modo de ejemplo a los residuos de riesgo bajo de la secuencia hipotética pueden expresarse como: AKXLVXTPXSFXEDX en la que X es cualquier aminoácido, o alternativamente en la que X es una sustitución conservativa del residuo original en esa posición, y cambios a modo de ejemplo para los residuos de riesgo bajo y moderado pueden expresarse similarmente, por ejemplo, AYXLYXTYXSYXEYX, en la que X es cualquier aminoácido e Y es una sustitución conservativa del residuo original en esa posición.

El término “anticuerpo de competición” incluye

5 1) un anticuerpo monoclonal no murino o de no roedor que se une al mismo epítope de EphB3 que el anticuerpo murino XHA.05.465, XHA.05.783, XHA.05.031, XHA.05.942, XHA.05.751, XHA.05.599, XPA.04.031, XPA.04.030, XPA.04.040, XHA.05.119, XHA.05.228, XHA.05.337, XHA.05.440, XPA.04.022, XHA.05.964, XHA.05.653, XHA.05.885, XPA.04.001, XPA.04.013, XPA.04.018, XPA.04.036, XPA.04.046, XPA.04.048, XHA.05.660, XHA.05.552, XHA.05.949, XHA.05.151, XPA.04.019, XHA.05.676, XHA.05.030, XHA.05.200, XHA.05.005,

10 XHA.05.001, XHA.05.888 o XHA.05.111, por ejemplo, como se ha determinado mediante cristalografía de rayos X; y

2) un anticuerpo monoclonal no murino o de no roedor que compite con anticuerpo murino XHA.05.465, XHA.05.783, XHA.05.031, XHA.05.942, XHA.05.751, XHA.05.599, XPA.04.031, XPA.04.030, XPA.04.040, XHA.05.119, XHA.05.228, XHA.05.337, XHA.05.440, XPA.04.022, XHA.05.964, XHA.05.653, XHA.05.885, XPA.04.001,

15 XPA.04.013, XPA.04.018, XPA.04.036, XPA.04.046, XPA.04.048, XHA.05.660, XHA.05.552, XHA.05.949, XHA.05.151, XPA.04.019, XHA.05.676, XHA.05.030, XHA.05.200, XHA.05.005, XHA.05.001, XHA.05.888 o XHA.05.111 más del 75 %, más del 80 % o más del 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % o el 95 %.

20 Los anticuerpos de la invención se unen preferentemente al DEC de EphB3 con una afinidad KD de al menos 10-6, 10-7, 10-8,10-9, 10-10 ó 10-11 M o menos, y preferentemente inducen la fosforilación, oligomerización, internalización, degradación, señalización y/o adhesión célula-célula mediada por EphB3 del receptor.

Opcionalmente, cualquier anticuerpo humanizado quimérico, humano o públicamente desvelado antes de la fecha de

25 presentación del presente documento, o desvelado en una solicitud presentada antes de la fecha de presentación del presente documento, se excluye del alcance de la invención.

Anticuerpo monoclonal de “no roedor” es cualquier anticuerpo, como se ha definido ampliamente en el presente documento, que no es un anticuerpo monoclonal de roedor intacto completo generado por un hibridoma de roedor. 30 Así, anticuerpos de no roedor incluyen específicamente, pero no se limitan a, muteínas de anticuerpos de roedor, fragmentos de anticuerpos de roedor, anticuerpos lineales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos Human Engineered™ y anticuerpos humanos, que incluyen anticuerpos humanos producidos a partir de animales transgénicos o mediante tecnología de expresión en fago. Similarmente, los anticuerpos no murinos incluyen, pero no se limitan a, muteínas de anticuerpos de roedor, fragmentos de anticuerpos de roedor, anticuerpos

35 lineales, anticuerpos quiméricos, humanizados, Human Engineered ™ y humanos.

Antígeno diana

El antígeno diana que va a usarse para la producción de anticuerpos pueden ser, por ejemplo, la porción extracelular

40 de EphB3, o un fragmento de la misma que retiene el epítope deseado, opcionalmente fusionado con otro polipéptido que permite que el epítope se exprese en su conformación nativa. Alternativamente, EphB3 intacto expresado en la superficie de células puede usarse para generar anticuerpos. Tales células pueden transformarse para expresar EphB3 o pueden ser otras células que se producen naturalmente que expresan EphB3. Otras formas de polipéptidos de EphB3 útiles para generar anticuerpos serán evidentes para aquellos expertos en la materia.

45 En una realización, los anticuerpos se unen a un epítope de EphB3, en el que el epítope está seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 11-421 expuesta en la Tabla 1. En algunas realizaciones, el dominio está seleccionado del grupo que consiste en el dominio de unión a ligando (residuos de aminoácidos 39-212 de SEC ID Nº: 2), el dominio TNFR (residuos de aminoácidos 256-331 de SEC ID Nº: 2), el 1º dominio de fibronectina (residuos de

50 aminoácidos 340-435 de SEC ID Nº: 2) y el 2º dominio de fibronectina (residuos de aminoácidos 453-535 de SEC ID Nº: 2). En algunas realizaciones, los anticuerpos se unen a un epítope del dominio de unión a ligando de EphB3, el epítope seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 11-145. En algunas realizaciones, los anticuerpos se unen a un epítope del dominio de TNFR de EphB3, el epítope seleccionado del grupo que consiste en SEC ID NºS:161-259. En algunas realizaciones, los anticuerpos se unen a un epítope del 1º dominio de fibronectina de

55 EphB3, el epítope seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 259-301. En algunas realizaciones, los anticuerpos se unen a un epítope del 2º dominio de fibronectina de EphB3, el epítope seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 380-421.

La siguiente Tabla 1 proporciona regiones de EphB3 (SEC ID Nº: 2) que se han identificado como epítopes lineales 60 adecuados para el reconocimiento por anticuerpos anti-EphB3.

Tabla 1

Región Mapeada (aa): Longitud del epítopo epítopo Ubicación aa seq epítopo # SEQ ID NO:

98-115: 8-mer WRRDVQRV 98-105 1 11

98-115: 8-mer RRDVQRVY 99-106 2 12

98-115: 8-mer RDVQRVYV 100-107 3 13

98-115: 8-mer DVQRVYVE 101-108 4 14

98-115: 8-mer VQRVYVEL 102-109 15

98-115: 8-mer QRVYVELK 103-110 6 16

98-115: 8-mer RVYVELKF 104-111 7 17

98-115: 8-mer VYVELKFT 105-112 8 18

98-115: 8-mer YVELKFTV 106-113 9 19

98-115: 8-mer VELKFTVR 107-114 20

98-115: 8-mer ELKFTVRD 108-115 11 21

98-115: 9-mer WRRDVQRVY 98-106 12 22

98-115: 9-mer RRDVQRVYV 99-107 13 23

98-115: 9-mer RDVQRVYVE 100-108 14 24

98-115: 9-mer DVQRVYVEL 101-109 25

98-115: 9-mer VQRVYVELK 102-110 16 26

98-115: 9-mer QRVYVELKF 103-111 17 27

98-115: 9-mer RVYVELKFT 104-112 18 28

98-115: 9-mer VYVELKFTV 105-113 19 29

98-115: 9-mer YVELKFTVR 106-114 30

98-115: 9-mer VELKFTVRD 107-115 21 31

98-115: 10-mer WRRDVQRVYV 98-107 22 32

98-115: 10-mer RRDVQRVYVE 99-108 23 33

98-115: 10-mer RDVQRVYVEL 100-109 24 34

98-115: 10-mer DVQRVYVELK 101-110 35

98-115: 10-mer VQRVYVELKF 102-111 26 36

98-115: 10-mer QRVYVELKFT 103-112 27 37

98-115: 10-mer RVYVELKFTV 104-113 28 38

98-115: 10-mer VYVELKFTVR 105-114 29 39

98-115: 10-mer YVELKFTVRD 106-115 40

152-194: 8-mer NPYVKVDT 152-159 1 41

152-194: 8-mer PYVKVDTI 153-160 2 42

152-194: 8-mer YVKVDTIA 154-161 3 43

152-194: 8-mer VKVDTIAP 155-162 4 44

(continuada) (continuada) (continuada) (continuada) (continuada) (continuada) (continuada) (continuada) (continuada) (continuada)

152-194: 8-mer KVDTIAPD 156-163 45

152-194: 8-mer VDTIAPDE 157-164 6 46

152-194: 8-mer DTIAPDES 158-165 7 47

152-194: 8-mer TIAPDESF 159-166 8 48

152-194: 8-mer IAPDESFS 160-167 9 49

152-194: 8-mer APDESFSR 161-168 50

152-194: 8-mer PDESFSRL 162-169 11 51

152-194: 8-mer DESFSRLD 163-170 12 52

152-194: 8-mer ESFSRLDA 164-171 13 53

152-194: 8-mer SFSRLDAG 165-172 14 54

152-194: 8-mer FSRLDAGR 166-173 55

152-194: 8-mer SRLDAGRV 167-174 16 56

152-194: 8-mer RLDAGRVN 168-175 17 57

152-194: 8-mer LDAGRVNT 169-176 18 58

152-194: 8-mer DAGRVNTK 170-177 19 59

152-194: 8-mer AGRVNTKV 171-178 60

152-194: 8-mer GRVNTKVR 172-179 21 61

152-194: 8-mer RVNTKVRS 173-180 22 62

152-194: 8-mer VNTKVRSF 174-181 23 63

152-194: 8-mer NTKVRSFG 175-182 24 64

152-194: 8-mer TKVRSFGP 176-183 65

152-194: 8-mer KVRSFGPL 177-184 26 66

152-194: 8-mer VRSFGPLS 178-185 27 67

152-194: 8-mer RSFGPLSK 179-186 28 68

152-194: 8-mer SFGPLSKA 180-187 29 69

152-194: 8-mer FGPLSKAG 181-188 70

152-194: 8-mer GPLSKAGF 182-189 31 71

152-194: 8-mer PLSKAGFY 183-190 32 72

152-194: 8-mer LSKAGFYL 184-191 33 73

152-194: 8-mer SKAGFYLA 185-192 34 74

152-194: 8-mer KAGFYLAF 186-193 75

152-194: 8-mer AGFYLAFQ 187-194 36 76

152-194: 9-mer NPYVKVDTI 152-160 37 77

152-194: 9-mer PYVKVDTIA 153-161 38 78

152-194: 9-mer YVKVDTIAP 154-162 39 79

152-194: 9-mer VKVDTIAPD 155-163 80

152-194: 9-mer KVDTIAPDE 156-164 41 81

152-194: 9-mer VDTIAPDES 157-165 42 82

152-194: 9-mer DTIAPDESF 158-166 43 83

152-194: 9-mer TIAPDESFS 159-167 44 84

152-194: 9-mer IAPDESFSR 160-168 45 85

152-194: 9-mer APDESFSRL 161-169 46 86

152-194: 9-mer PDESFSRLD 162-170 47 87

152-194: 9-mer DESFSRLDA 163-171 48 88

152-194: 9-mer ESFSRLDAG 164-172 49 89

152-194: 9-mer SFSRLDAGR 165-173 50 90

152-194: 9-mer FSRLDAGRV 166-174 51 91

152-194: 9-mer SRLDAGRVN 167-175 52 92

152-194: 9-mer RLDAGRVNT 168-176 53 93

152-194: 9-mer LDAGRVNTK 169-177 54 94

152-194: 9-mer DAGRVNTKV 170-178 55 95

152-194: 9-mer AGRVNTKVR 171-179 56 96

152-194: 9-mer GRVNTKVRS 172-180 57 97

152-194: 9-mer RVNTKVRSF 173-181 58 98

152-194: 9-mer VNTKVRSFG 174-182 59 99

152-194: 9-mer NTKVRSFGP 175-183 60 100

152-194: 9-mer TKVRSFGPL 176-184 61 101

152-194: 9-mer KVRSFGPLS 177-185 62 102

152-194: 9-mer VRSFGPLSK 178-186 63 103

152-194: 9-mer RSFGPLSKA 179-187 64 104

152-194: 9-mer SFGPLSKAG 180-188 65 105

152-194: 9-mer FGPLSKAGF 181-189 66 106

152-194: 9-mer GPLSKAGFY 182-190 67 107

152-194: 9-mer PLSKAGFYL 183-191 68 108

152-194: 9-mer LSKAGFYLA 184-192 69 109

152-194: 9-mer SKAGFYLAF 185-193 70 110

152-194: 9-mer KAGFYLAFQ 186-194 71 111

152-194: 10-mer NPYVKVDTIA 152-161 72 112

152-194: 10-mer PYVKVDTIAP 153-162 73 113

152-194: 10-mer YVKVDTIAPD 154-163 74 114

152-194: 10-mer VKVDTIAPDE 155-164 75 115

152-194: 10-mer KVDTIAPDES 156-165 76 116

152-194: 10-mer VDTIAPDESF 157-166 77 117

152-194: 10-mer DTIAPDESFS 158-167 78 118

152-194: 10-mer TIAPDESFSR 159-168 79 119

152-194: 10-mer IAPDESFSRL 160-169 80 120

152-194: 10-mer APDESFSRLD 161-170 81 121

152-194: 10-mer PDESFSRLDA 162-171 82 122

152-194: 10-mer DESFSRLDAG 163-172 83 123

152-194: 10-mer ESFSRLDAGR 164-173 84 124

152-194: 10-mer SFSRLDAGRV 165-174 85 125

152-194: 10-mer FSRLDAGRVN 166-175 86 126

152-194: 10-mer SRLDAGRVNT 167-176 87 127

152-194: 10-mer RLDAGRVNTK 168-177 88 128

152-194: 10-mer LDAGRVNTKV 169-178 89 129

152-194: 10-mer DAGRVNTKVR 170-179 90 130

152-194: 10-mer AGRVNTKVRS 171-180 91 131

152-194: 10-mer GRVNTKVRSF 172-181 92 132

152-194: 10-mer RVNTKVRSFG 173-182 93 133

152-194: 10-mer VNTKVRSFGP 174-183 94 134

152-194: 10-mer NTKVRSFGPL 175-184 95 135

152-194: 10-mer TKVRSFGPLS 176-185 96 136

152-194: 10-mer KVRSFGPLSK 177-186 97 137

152-194: 10-mer VRSFGPLSKA 178-187 98 138

152-194: 10-mer RSFGPLSKAG 179-188 99 139

152-194: 10-mer SFGPLSKAGF 180-189 100 140

152-194: 10-mer FGPLSKAGFY 181-190 101 141

152-194: 10-mer GPLSKAGFYL 182-191 102 142

152-194: 10-mer PLSKAGFYLA 183-192 103 143

152-194: 10-mer LSKAGFYLAF 184-193 104 144

152-194: 10-mer SKAGFYLAFQ 185-194 105 145

244-256: 8-mer NAVEVSVP 244-251 1 146

244-256: 8-mer AVEVSVPL 245-252 2 147

244-256: 8-mer VEVSVPLK 246-253 3 148

244-256: 8-mer EVSVPLKL 247-254 4 149

244-256: 8-mer VSVPLKLY 248-255 5 150

244-256: 8-mer SVPLKLYC 249-256 6 151

244-256: 9-mer NAVEVSVPL 244-252 7 152

244-256: 9-mer AVEVSVPLK 245-253 8 153

244-256: 9-mer VEVSVPLKL 246-254 9 154

244-256: 9-mer EVSVPLKLY 247-255 10 155

244-256: 9-mer VSVPLKLYC 248-256 11 156

244-256: 10-mer NAVEVSVPLK 244-253 12 157

244-256: 10-mer AVEVSVPLKL 245-254 13 158

Región Mapeada (aa): Longitud del epítope epítope Ubicación aa seq epítope # SEQ ID NO:

244-256: 10-mer VEVSVPLKLY 246-255 14 159

244-256: 10-mer EVSVPLKLYC 247-256 15 160

274-298: 8-mer GHEPAAKE 274-281 1 161

274-298: 8-mer HEPAAKES 275-282 2 162

274-298: 8-mer EPAAKESQ 276-283 3 163

274-298: 8-mer PAAKESQC 277-284 4 164

274-298: 8-mer AAKESQCR 278-285 5 165

274-298: 8-mer AKESQCRP 279-286 6 166

274-298: 8-mer KESQCRPC 280-287 7 167

274-298: 8-mer ESQCRPCP 281-288 8 168

274-298: 8-mer SQCRPCPP 282-289 9 169

274-298: 8-mer QCRPCPPG 283-290 10 170

274-298: 8-mer CRPCPPGS 284-291 11 171

274-298: 8-mer RPCPPGSY 285-292 12 172

274-298: 8-mer PCPPGSYK 286-293 13 173

274-298: 8-mer CPPGSYKA 287-294 14 174

274-298: 8-mer PPGSYKAK 288-295 15 175

274-298: 8-mer PGSYKAKQ 289-296 16 176

274-298: 8-mer GSYKAKQG 290-297 17 177

274-298: 8-mer SYKAKQGE 291-298 18 178

274-298: 9-mer GHEPAAKES 274-282 19 179

274-298: 9-mer HEPAAKESQ 275-283 20 180

274-298: 9-mer EPAAKESQC 276-284 21 181

274-298: 9-mer PAAKESQCR 277-285 22 182

274-298: 9-mer AAKESQCRP 278-286 23 183

274-298: 9-mer AKESQCRPC 279-287 24 184

274-298: 9-mer KESQCRPCP 280-288 25 185

274-298: 9-mer ESQCRPCPP 281-289 26 186

274-298: 9-mer SOCRPCPPG 282-290 27 187

274-298: 9-mer QCRPCPPGS 283-291 28 188

274-298: 9-mer CRPCPPGSY 284-292 29 189

274-298: 9-mer RPCPPGSYK 285-293 30 190

274-298: 9-mer PCPPGSYKA 286-294 31 191

274-298: 9-mer CPPGSYKAK 287-295 32 192

274-298: 9-mer PPGSYKAKQ 288-296 33 193

274-298: 9-mer PGSYKAKQG 289-297 34 194

274-298: 9-mer GSYKAKQGE 290-298 35 195

274-298: 10-mer GHEPAAKESQ 274-283 36 196

274-298: 10-mer HEPAAKESQC 275-284 37 197

274-298: 10-mer EPAAKESQCR 276-285 38 198

274-298: 10-mer PAAKESQCRP 277-286 39 199

274-298: 10-mer AAKESQCRPC 278-287 40 200

274-298: 10-mer AKESQCRPCP 279-288 41 201

274-298: 10-mer KESQCRPCPP 280-289 42 202

274-298: 10-mer ESQCRPCPPG 281-290 43 203

274-298: 10-mer SQCRPCPPGS 282-291 44 204

274-298: 10-mer QCRPCPPGSY 283-292 45 205

274-298: 10-mer CRPCPPGSYK 284-293 46 206

274-298: 10-mer RPCPPGSYKA 285-294 47 207

274-298: 10-mer PCPPGSYKAK 286-295 48 208

274-298: 10-mer CPPGSYKAKQ 287-296 49 209

274-298: 10-mer PPGSYKAKQG 288-297 50 210

274-298: 10-mer PGSYKAKQGE 289-298 51 211

313-336: 8-mer PAASICTC 313-320 1 212

313-336: 8-mer AASICTCH 314-321 2 213

313-336: 8-mer ASICTCHN 315-322 3 214

313-336: 8-mer SICTCHNN 316-323 4 215

313-336: 8-mer ICTCHNNF 317-324 5 216

313-336: 8-mer CTCHNNFY 318-325 6 217

313-336: 8-mer TCHNNFYR 319-326 7 218

313-336: 8-mer CHNNFYRA 320-327 8 219

313-336: 8-mer HNNFYRAD 321-328 9 220

313-336: 8-mer NNFYRADS 322-329 10 221

313-336: 8-mer NFYRADSD 323-330 11 222

313-336: 8-mer FYRADSDS 324-331 12 223

313-336: 8-mer YRADSDSA 325-332 13 224

313-336: 8-mer RADSDSAD 326-333 14 225

313-336: 8-mer ADSDSADS 327-334 15 226

313-336: 8-mer DSDSADSA 328-335 16 227

313-336: 8-mer SDSADSAC 329-336 17 228

313-336: 9-mer PAASICTCH 313-321 18 229

313-336: 9-mer AASICTCHN 314-322 19 230

313-336: 9-mer ASICTCHNN 315-323 20 231

313-336: 9-mer SICTCHNNF 316-324 21 232

313-336: 9-mer ICTCHNNFY 317-325 22 233

313-336: 9-mer CTCHNNFYR 318-326 23 234

313-336: 9-mer TCHNNFYRA 319-327 24 235

313-336: 9-mer CHNNFYRAD 320-328 25 236

313-336: 9-mer HNNFYRADS 321-329 26 237

313-336: 9-mer NNFYRADSD 322-330 27 238

313-336: 9-mer NFYRADSDS 323-331 28 239

313-336: 9-mer FYRADSDSA 324-332 29 240

313-336: 9-mer YRADSDSAD 325-333 30 241

313-336: 9-mer RADSDSADS 326-334 31 242

313-336: 9-mer ADSDSADSA 327-335 32 243

313-336: 9-mer DSDSADSAC 328-336 33 244

313-336: 10-mer PAASICTCHN 313-322 34 245

313-336: 10-mer AASICTCHNN 314-323 35 246

313-336: 10-mer ASICTCHNNF 315-324 36 247

313-336: 10-mer SICTCHNNFY 316-325 37 248

313-336: 10-mer ICTCHNNFYR 317-326 38 249

313-336: 10-mer CTCHNNFYRA 318-327 39 250

313-336: 10-mer TCHNNFYRAD 319-328 40 251

313-336: 10-mer CHNNFYRADS 320-329 41 252

313-336: 10-mer HNNFYRADSD 321-330 42 253

313-336: 10-mer NNFYRADSDS 322-331 43 254

313-336: 10-mer NFYRADSDSA 323-332 44 255

313-336: 10-mer FYRADSDSAD 324-333 45 256

313-336: 10-mer YRADSDSADS 325-334 46 257

313-336: 10-mer RADSDSADSA 326-335 47 258

313-336: 10-mer ADSDSADSAC 327-336 48 259

362-383: 8-mer PRDLGGRD 362-369 1 260

362-383: 8-mer RDLGGRDD 363-370 2 261

362-383: 8-mer DLGGRDDL 364-371 3 262

362-383: 8-mer LGGRDDLL 365-372 4 263

362-383: 8-mer GGRDDLLY 366-373 5 264

362-383: 8-mer GRDDLLYN 367-374 6 265

362-383: 8-mer RDDLLYNV 368-375 7 266

362-383: 8-mer DDLLYNVI 369-376 8 267

362-383: 8-mer DLLYNVIC 370-377 9 268

362-383: 8-mer LLYNVICK 371-378 10 269

362-383: 8-mer LYNVICKK 372-379 11 270

362-383: 8-mer YNVICKKC 373-380 12 271

362-383: 8-mer NVICKKCH 374-381 13 272

362-383: 8-mer VICKKCHG 375-382 14 273

362-383: 8-mer ICKKCHGA 376-383 15 274

362-383: 9-mer PRDLGGRDD 362-370 16 275

362-383: 9-mer RDLGGRDDL 363-371 17 276

362-383: 9-mer DLGGRDDLL 364-372 18 277

362-383: 9-mer LGGRDDLLY 365-373 19 278

362-383: 9-mer GGRDDLLYN 366-374 20 279

362-383: 9-mer GRDDLLYNV 367-375 21 280

362-383: 9-mer RDDLLYNVI 368-376 22 281

362-383: 9-mer DDLLYNVIC 369-377 23 282

362-383: 9-mer DLLYNVICK 370-378 24 283

362-383: 9-mer LLYNVICKK 371-379 25 284

362-383: 9-mer LYNVICKKC 372-380 26 285

362-383: 9-mer YNVICKKCH 373-381 27 286

362-383: 9-mer NVICKKCHG 374-382 28 287

362-383: 9-mer VICKKCHGA 375-383 29 288

362-383: 10-mer PRDLGGRDDL 362-371 30 289

362-383: 10-mer RDLGGRDDLL 363-372 31 290

362-383: 10-mer DLGGRDDLLY 364-373 32 291

362-383: 10-mer LGGRDDLLYN 365-374 33 292

362-383: 10-mer GGRDDLLYNV 366-375 34 293

362-383: 10-mer GRDDLLYNVI 367-376 35 294

362-383: 10-mer RDDLLYNVIC 368-377 36 295

362-383: 10-mer DDLLYNVICK 369-378 37 296

362-383: 10-mer DLLYNVICKK 370-379 38 297

362-383: 10-mer LLYNVICKKC 371-380 39 298

362-383: 10-mer LYNVICKKCH 372-381 40 299

362-383: 10-mer YNVICKKCHG 373-382 41 300

362-383: 10-mer NVICKKCHGA 374-383 42 301

436-469: 8-mer PLPPRYAA 436-443 1 302

436-469: 8-mer LPPRYAAV 437-444 2 303

436-469: 8-mer PPRYAAVN 438-445 3 304

436-469: 8-mer PRYAAVNI 439-446 4 305

436-469: 8-mer RYAAVNIT 440-447 5 306

436-469: 8-mer YAAVNITT 441-448 6 307

436-469: 8-mer AAVNITTN 442-449 7 308

436-469: 8-mer AVNITTNQ 443-450 8 309

436-469: 8-mer VNITTNQA 444-451 9 310

436-469: 8-mer NITTNQAA 445-452 10 311

436-469: 8-mer ITTNQAAP 446-453 11 312

436-469: 8-mer TTNQAAPS 447-454 12 313

436-469: 8-mer TNQAAPSE 448-455 13 314

436-469: 8-mer NQAAPSEV 449-456 14 315

436-469: 8-mer QAAPSEVP 450-457 15 316

436-469: 8-mer AAPSEVPT 451-458 16 317

436-469: 8-mer APSEVPTL 452-459 17 318

436-469: 8-mer PSEVPTLR 453-460 18 319

436-469: 8-mer SEVPTLRL 454-461 19 320

436-469: 8-mer EVPTLRLH 455-462 20 321

436-469: 8-mer VPTLRLHS 456-463 21 322

436-469: 8-mer PTLRLHSS 457-464 22 323

436-469: 8-mer TLRLHSSS 458-465 23 324

436-469: 8-mer LRLHSSSG 459-466 24 325

436-469: 8-mer RLHSSSGS 460-467 25 326

436-469: 8-mer LHSSSGSS 461-468 26 327

436-469: 8-mer HSSSGSSL 462-469 27 328

436-469: 9-mer PLPPRYAAV 436-444 28 329

436-469: 9-mer LPPRYAAVN 437-445 29 330

436-469: 9-mer PPRYAAVNI 438-446 30 331

436-469: 9-mer PRYAAVNIT 439-447 31 332

436-469: 9-mer RYAAVNITT 440-448 32 333

436-469: 9-mer YAAVNITTN 441-449 33 334

436-469: 9-mer AAVNITTNQ 442-450 34 335

436-469: 9-mer AVNITTNQA 443-451 35 336

436-469: 9-mer VNITTNQAA 444-452 36 337

436-469: 9-mer NITTNQAAP 445-453 37 338

436-469: 9-mer ITTNQAAPS 446-454 38 339

436-469: 9-mer TTNQAAPSE 447-455 39 340

436-469: 9-mer TNQAAPSEV 448-456 40 341

436-469: 9-mer NQAAPSEVP 449-457 41 342

436-469: 9-mer QAAPSEVPT 450-458 42 343

436-469: 9-mer AAPSEVPTL 451-459 43 344

436-469: 9-mer APSEVPTLR 452-460 44 345

436-469: 9-mer PSEVPTLRL 453-461 45 346

436-469: 9-mer SEVPTLRLH 454-462 46 347

436-469: 9-mer EVPTLRLHS 455-463 47 348

436-469: 9-mer VPTLRLHSS 456-464 48 349

436-469: 9-mer PTLRLHSSS 457-465 49 350

436-469: 9-mer TLRLHSSSG 458-466 50 351

436-469: 9-mer LRLHSSSGS 459-467 51 352

436-469: 9-mer RLHSSSGSS 460-468 52 353

436-469: 9-mer LHSSSGSSL 461-469 53 354

436-469: 10-mer PLPPRYAAVN 436-445 54 355

436-469: 10-mer LPPRYAAVNI 437-446 55 356

436-469: 10-mer PPRYAAVNIT 438-447 56 357

436-469: 10-mer PRYAAVNITT 439-448 57 358

436-469: 10-mer RYAAVNITTN 440-449 58 359

436-469: 10-mer YAAVNITTNO 441-450 59 360

436-469: 10-mer AAVNITTNQA 442-451 60 361

436-469: 10-mer AVNITTNQAA 443-452 61 362

436-469: 10-mer VNITTNQAAP 444-453 62 363

436-469: 10-mer NITTNQAAPS 445-454 63 364

436-469: 10-mer ITTNQAAPSE 446-455 64 365

436-469: 10-mer TTNQAAPSEV 447-456 65 366

436-469: 10-mer TNQAAPSEVP 448-457 66 367

436-469: 10-mer NQAAPSEVPT 449-458 67 368

436-469: 10-mer QAAPSEVPTL 450-459 68 369

436-469: 10-mer AAPSEVPTLR 451-460 69 370

436-469: 10-mer APSEVPTLRL 452-461 70 371

436-469: 10-mer PSEVPTLRLH 453-462 71 372

436-469: 10-mer SEVPTLRLHS 454-463 72 373

436-469: 10-mer EVPTLRLHSS 455-464 73 374

436-469: 10-mer VPTLRLHSSS 456-465 74 375

436-469: 10-mer PTLRLHSSSG 457-466 75 376

436-469: 10-mer TLRLHSSSGS 458-467 76 377

436-469: 10-mer LRLHSSSGSS 459-468 77 378

436-469: 10-mer RLHSSSGSSL 460-469 78 379

509-530: 8-mer QLDGLRPD 509-516 1 380

509-530: 8-mer LDGLRPDA 510-517 2 381

509-530: 8-mer DGLRPDAR 511-518 3 382

509-530: 8-mer GLRPDARY 512-519 4 383

509-530: 8-mer LRPDARYV 513-520 5 384

509-530: 8-mer RPDARYVV 514-521 6 385

509-530: 8-mer PDARYVVQ 515-522 7 386

509-530: 8-mer DARYVVQV 516-523 8 387

509-530: 8-mer ARYVVQVR 517-524 9 388

509-530: 8-mer RYVVQVRA 518-525 10 389

509-530: 8-mer YVVQVRAR 519-526 11 390

509-530: 8-mer VVQVRART 520-527 12 391

509-530: 8-mer VQVRARTV 521-528 13 392

509-530: 8-mer QVRARTVA 522-529 14 393

509-530: 8-mer VRARTVAG 523-530 15 394

509-530: 9-mer QLDGLRPDA 509-517 16 395

509-530: 9-mer LDGLRPDAR 510-518 17 396

509-530: 9-mer DGLRPDARY 511-519 18 397

509-530: 9-mer GLRPDARYV 512-520 19 398

509-530: 9-mer LRPDARYVV 513-521 20 399

509-530: 9-mer RPDARYVVQ 514-522 21 400

509-530: 9-mer PDARYVVQV 515-523 22 401

509-530: 9-mer DARYVVQVR 516-524 23 402

509-530: 9-mer ARYVVQVRA 517-525 24 403

509-530: 9-mer RYVVQVRAR 518-526 25 404

509-530: 9-mer YVVQVRART 519-527 26 405

509-530: 9-mer VVQVRARTV 520-528 27 406

509-530: 9-mer VQVRARTVA 521-529 28 407

509-530: 9-mer QVRARTVAG 522-530 29 408

509-530: 10-mer QLDGLRPDAR 509-518 30 409

509-530: 10-mer LDGLRPDARY 510-519 31 410

509-530: 10-mer DGLRPDARYV 511-520 32 411

509-530: 10-mer GLRPDARYVV 512-521 33 412

509-530: 10-mer LRPDARYVVQ 513-522 34 413

509-530: 10-mer RPDARYVVQV 514-523 35 414

509-530: 10-mer PDARYVVQVR 515-524 36 415

509-530: 10-mer DARYVVQVRA 516-525 37 416

509-530: 10-mer ARYVVQVRAR 517-526 38 417

509-530: 10-mer RYVVQVRART 518-527 39 418

509-530: 10-mer YVVQVRARTV 519-528 40 419

509-530: 10-mer VVQVRARTVA 520-529 41 420

509-530: 10-mer VQVRARTVAG 521-530 42 421

Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos policlonales se producen preferentemente en animales por múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Una respuesta de anticuerpos mejorada puede obtenerse conjugando el antígeno relevante con una proteína que es inmunogénica en las especies a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoilsulfosuccinimida (conjugación a residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico u otros agentes conocidos en la técnica.

Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados combinando, por ejemplo, 100 μg o 5 μg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la disolución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes después, los animales se refuerzan con 1/5 a {fracción (1/10)} de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en múltiples sitios. A los 7-14 días después de la inyección de refuerzo, los animales se sangran y el suero se ensaya para título de anticuerpos. Los animales se refuerzan hasta la meseta del título. Preferentemente, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antígeno, pero se conjuga con una proteína diferente y/o mediante un reactivo de reticulación diferente. Los conjugados también pueden prepararse en cultivo celular recombinante como fusiones de proteínas. Por tanto, agentes de agregación tales como alumbre se usan adecuadamente para potenciar la respuesta inmunitaria.

Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando el procedimiento de hibridoma descrito por primera vez por Kohler y col., Nature, 256:495 (1975), o pueden prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante.

En el procedimiento de hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster o mono macaco, se inmuniza como se ha descrito en el presente documento para provocar linfocitos que producen o pueden producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Los linfocitos se fusionan entonces con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado tal como polietilenglicol para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pág. 59-103 (Academic Press, 1986)).

Las células de hibridoma así preparadas se siembran y se cultivan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales sin fusionar. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas normalmente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que previenen el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficazmente, soportan la producción de alto nivel estable de anticuerpo por las células productoras de anticuerpo seleccionadas y son sensibles a un medio. También se han descrito líneas de células de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pág. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)). Líneas de mieloma murino a modo de ejemplo incluyen aquellas derivadas de los tumores de ratón MOP-21 y M.C.-11 disponibles del Centro de distribución de células del Instituto Salk, San Diego, Calif. EE.UU., y células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de la Colección americana de cultivos tipo, Rockville, Md. EE.UU.

El medio de cultivo en el que las células de hibridoma se cultivan se ensaya para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, por análisis de Scatchard (Munson y col., Anal. Biochem.,

107:220 (1980)).

Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseada, los clones pueden subclonarse por procedimientos de dilución limitante y cultivarse mediante procedimientos convencionales (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pág. 59-103 (Academic Press, 1986)). Medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores ascíticos en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, fluido ascítico o suero por procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tal como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales puede aislarse y secuenciarse a partir de células de hibridoma usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que pueden unirse

específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos monoclonales). La determinación de secuencias generalmente requerirá el aislamiento de al menos una parte del gen o ADNc de interés. Normalmente, esto requiere clonar el ADN o, preferentemente, ARNm (es decir, ADNc) que codifica los anticuerpos monoclonales. La clonación se lleva a cabo usando técnicas convencionales (véase, por ejemplo, Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, vol. 1-3, Cold Spring Harbor Press). Por ejemplo, puede construirse una biblioteca de ADNc por transcripción inversa de ARNm poliA+, preferentemente ARNm asociado a la membrana, y seleccionarse la biblioteca usando sondas específicas para secuencias de genes de polipéptidos de inmunoglobulina humana. Sin embargo, en una realización preferida, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se usa para amplificar ADNc (o porciones de ADNc de longitud completa) que codifican un segmento del gen de inmunoglobulina de interés (por ejemplo, un segmento variable de la cadena ligera). Las secuencias amplificadas pueden clonarse fácilmente en cualquier vector adecuado, por ejemplo, vectores de expresión, vectores de minigen o vectores de expresión en fago. Se apreciará que el procedimiento particular de clonación usado no es crítico, mientras que sea posible determinar la secuencia de alguna porción del polipéptido de inmunoglobulina de interés. Como se usa en el presente documento, una molécula de ácido nucleico “aislada” o secuencia de ácidos nucleicos “aislada” es una molécula de ácido nucleico que o bien (1) se identifica o se separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que está generalmente asociada en la fuente natural del ácido nucleico o bien (2) se clona, amplifica, marca o distingue de otro modo de ácidos nucleicos de referencia de forma que la secuencia del ácido nucleico de interés pueda determinarse, se considera aislada. Una molécula de ácido nucleico aislada es distinta en la forma o ámbito en el que se encuentra en la naturaleza. Por tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico ya que existe en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que generalmente expresan el anticuerpo en las que, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de la de células naturales.

Una fuente para ARN usada para la clonación y secuenciación es un hibridoma producido obteniendo un linfocito B del ratón transgénico y fusionando el linfocito B con una célula inmortal. Una ventaja del uso de hibridomas es que pueden cribarse fácilmente, y seleccionarse un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal humano de interés. Alternativamente, el ARN puede aislarse de linfocitos B (o bazo completo) del animal inmunizado. Si se usan fuentes distintas de hibridomas, puede desearse seleccionar secuencias que codifican inmunoglobulinas o polipéptidos de inmunoglobulina con características de unión específica. Un procedimiento para tal selección es el uso de tecnología de expresión en fago. La expresión en fago se describe en, por ejemplo, Dower y col., documento WO 91/17271, McCafferty y col., documento WO 92/01047, y Caton y Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6450-6454 (1990). En una realización usando tecnología de expresión en fago, ADNc de un ratón transgénico inmunizado (por ejemplo, ADNc de bazo total) se aísla, se usa la reacción en cadena de la polimerasa para amplificar secuencias de ADNc que codifican una parte de un polipéptido de inmunoglobulina, por ejemplo, regiones CDR, y las secuencias amplificadas se insertan en un vector de fago. ADNc que codifican péptidos de interés, por ejemplo, péptidos de la región variable con características de unión deseadas, se identifican por técnicas convencionales tales como inmunopurificación.

Entonces se determina la secuencia del ácido nucleico amplificado o clonado. Normalmente se determina la secuencia que codifica una región variable entera del polipéptido de inmunoglobulina; sin embargo, algunas veces será adecuado secuenciar solo una parte de una región variable, por ejemplo, la parte codificante de CDR. Normalmente, la porción secuenciada tendrá al menos 30 bases de longitud, más frecuentemente se secuenciarán bases que codifican al menos aproximadamente un tercio o al menos aproximadamente la mitad de la longitud de la región variable.

La secuenciación puede llevarse a cabo en clones aislados de una biblioteca de ADNc o, si se usa PCR, después de subclonar la secuencia amplificada o por secuenciación de PCR directa del segmento amplificado. La secuenciación se lleva a cabo usando técnicas convencionales (véase, por ejemplo, Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, vol 1-3, Cold Spring Harbor Press, y Sanger, F. y col. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 54635467). Comparando la secuencia del ácido nucleico clonado con secuencias publicadas de genes de inmunoglobulina humana y ADNc, un experto podrá determinar fácilmente, dependiendo de la región secuenciada,

(i) el uso del segmento de la línea germinal del polipéptido de inmunoglobulina de hibridoma (incluyendo el isotipo de la cadena pesada) y (ii) la secuencia de las regiones variables de cadena pesada y ligera, que incluyen secuencias resultantes de la adición de la región N y el procedimiento de mutación somática. Una fuente de información de secuencias del gen de inmunoglobulina es el Centro nacional para información biotecnológica, Biblioteca Nacional de Medicina, National Institutes of Health, Bethesda, Md.

Fragmentos de anticuerpos

Como se observa anteriormente, los fragmentos de anticuerpos comprenden una parte de un anticuerpo de longitud completa intacto, preferentemente una región de unión a antígeno o variable del anticuerpo intacto, e incluyen anticuerpos lineales y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Ejemplos no limitantes de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, anticuerpo de dominio (dAb), fragmentos de la región determinante de la complementariedad (CDR), anticuerpos monocatenarios (scFv), fragmentos de anticuerpos monocatenarios, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, anticuerpos lineales, anticuerpos

recombinantes quelantes, tricuerpos o bicuerpos, intracuerpos, nanocuerpos, productos inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP), una proteína de fusión de dominio de unión a antígeno-inmunoglobulina, un anticuerpo camelizado, un anticuerpo que contiene VHH, o muteínas o derivados de las mismas, y polipéptidos que contienen al menos una parte de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión a antígeno específica al polipéptido, tal como una secuencia de CDR, en tanto que el anticuerpo retenga la actividad biológica deseada. Tales fragmentos de antígeno pueden producirse por la modificación de anticuerpos completos o sintetizarse de novo usando tecnologías de ADN recombinante o síntesis de péptidos.

El término “diacuerpos” se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable (VH) de las cadenas pesadas conectado a un dominio variable (VL) de las cadenas ligeras en la misma cadena de polipéptidos (VH - VL). Usando un ligador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son obligados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, los documentos EP 404.097; WO 93/11161; y 30 Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

Los fragmentos de anticuerpos “Fv monocatenario” o “scFv” comprenden los dominios de anticuerpo VH y VL, estando estos dominios presentes en una única cadena de polipéptidos, y comprendiendo opcionalmente un ligador de polipéptidos entre los dominios VH y VL que permite que Fv forme la estructura deseada para la unión a antígeno (Bird y col., Science 242:423-426, 1988, y Huston y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988). Un fragmento Fd consiste en los dominios VH y CH1.

Fragmentos de anticuerpos adicionales incluyen un fragmento de anticuerpo de dominio (dAb) (Ward y col., Nature 341:544-546, 1989) que consiste en un dominio VH.

Los “anticuerpos lineales” comprenden un par de segmentos de Fd en tándem (VH -CH1-VH -CH1) que forman un par de regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos (Zapata y col. Protein Eng. 8:1057-62 (1995)).

Un “minicuerpo” que consiste en scFv fusionado con CH3 mediante un péptido ligador (sin bisagra) o mediante una bisagra de IgG se ha descrito en Olafsen, y col., Protein Eng Des Sel. 2004 Apr; 17(4):315-23.

Anticuerpos de la cadena pesada funcionales que carecen de cadenas ligeras se producen naturalmente en tiburones gata (Greenberg y col., Nature 374:168-73, 1995), tiburones alfombra (Nuttall y col., Mol Immunol. 38:31326, 2001) y Camelidae (Hamers-Casterman y col., Nature 363: 446-8, 1993; Nguyen y col., J. Mol. Biol. 275: 413, 1998), tales como camellos, dromedarios, alpacas y llamas. El sitio de unión a antígeno se reduce a un único dominio, el dominio VHH, en estos animales. Estos anticuerpos forman regiones de unión a antígeno usando solo la región variable de la cadena pesada, es decir, estos anticuerpos funcionales son homodímeros de cadenas pesadas que solo tienen la estructura H2L2 (denominados “anticuerpos de cadena pesada” o “HCAbs”). VHH camelizado se recombina supuestamente con regiones constantes de IgG2 y IgG3 que contienen dominios bisagra, CH2 y CH3 y carecen de un dominio CH1 (Hamers-Casterman y col., arriba). Por ejemplo, IgG1 de llama es un isotipo de anticuerpo convencional (H2L2) en el que VH se recombina con una región constante que contiene dominios bisagra, CH1, CH2 y CH3, mientras que las IgG2 y IgG3 de llama son solo isotipos de cadena pesada que carecen de dominios CH1 y que no contienen cadenas ligeras. Solo los fragmentos VH clásicos son difíciles de producir en forma soluble, pero pueden obtenerse mejoras en la solubilidad y la unión específica cuando los residuos de la región estructural se alteran para ser más similares a VHH (véase, por ejemplo, Reichman y col., J Immunol Methods 1999, 231:25-38.) Se ha encontrado que los dominios VHH camelizados se unen a antígeno con alta afinidad (Desmyter y col., J. Biol. Chem. 276:26285-90, 2001) y poseen alta estabilidad en disolución (Ewert y col., Biochemistry 41:362836, 2002). Los procedimientos para generar anticuerpos que tienen cadenas pesadas camelizadas se describen en, por ejemplo, las publicaciones de patente de EE.UU. nº 20050136049 y 20050037421.

Debido a que el dominio variable de los anticuerpos de cadena pesada es el fragmento de unión a antígeno completamente funcional más pequeño con una masa molecular de solo 15 kDa, esta entidad se denomina un nanocuerpo (Cortez-Retamozo y col., Cancer Research 64:2853-57, 2004). Puede generarse una biblioteca de nanocuerpos a partir de un dromedario inmunizado como se describe en Conrath y col., (Antimicrob Agents Chemother 45: 2807-12, 2001) o usando procedimientos recombinantes como se describen en

Los intracuerpos son anticuerpos monocatenarios que demuestran expresión intracelular y pueden manipular la función de proteínas intracelulares (Biocca, y col., EMBO J. 9:101-108, 1990; Colby y col., Proc Natl Acad Sci U S A. 101:17616-21, 2004). Los intracuerpos, que comprenden secuencias señal de células que retienen la construcción de anticuerpo en regiones intracelulares, pueden producirse como se describe en Mhashilkar y col. (EMBO J 14:1542-51, 1995) y Wheeler y col. (FASEB J. 17:1733-5. 2003). Los transcuerpos son anticuerpos permeables a células en los que un dominio de transducción de proteínas (PTD) está fusionado con anticuerpos de fragmentos variables monocatenarios (scFv) Heng y col., (Med Hypotheses. 64:1105-8, 2005).

Adicionalmente se contemplan anticuerpos que son SMIP o proteínas de fusión de dominio de unión

inmunoglobulina específicas para proteína diana. Estas construcciones son polipéptidos monocatenarios que comprenden dominios de unión a antígeno fusionados con dominios de inmunoglobulina necesarios para llevar a cabo las funciones efectoras de anticuerpos. Véanse, por ejemplo, el documento WO03/041600, la publicación de patente de EE.UU. 20030133939 y la publicación de patente de EE.UU. 20030118592.

Anticuerpos multivalentes

En algunas realizaciones puede desearse generar anticuerpo monoclonal multivalente o incluso uno multiespecífico (por ejemplo, biespecífico, triespecífico, etc.). Tal anticuerpo puede tener especificidades de unión por al menos dos epítopes diferentes del antígeno diana, o alternativamente puede unirse a dos moléculas diferentes, por ejemplo, al antígeno diana y a una proteína de la superficie celular o receptor. Por ejemplo, un anticuerpo biespecífico puede incluir un brazo que se une a la diana y otro brazo que se une a una molécula desencadenante sobre un leucocito tal como una molécula receptora de linfocitos T (por ejemplo, CD2 o CD3), o receptores de Fc para IgG (FcγR), tales como FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) y FcγRIII (CD16), de manera que se centren los mecanismos de defensa celular en la célula que expresa diana. Como otro ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden usarse para localizar agentes citotóxicos en células que expresan antígeno diana. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a diana y un brazo que se une a agente citotóxico (por ejemplo, saporina, anti-interferón-60, alcaloide de la vinca, cadena A de ricina, metotrexato o hapteno de isótopo radiactivo). Los anticuerpos multiespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos.

Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o “heteroconjugados”. Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina, el otro a biotina. Los anticuerpos heteroconjugados pueden prepararse usando cualquier procedimiento de reticulación conveniente. Agentes de reticulación adecuados son muy conocidos en la técnica y se desvelan en la patente de EE.UU. nº 4.676.980, junto con varias técnicas de reticulación.

Según otro enfoque para preparar anticuerpos biespecíficos, la superficie de separación entre un par de moléculas de anticuerpos puede manipularse para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo celular recombinante. La superficie de separación preferida comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeños de la superficie de separación de la primera molécula de anticuerpo están sustituidas con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Las “cavidades” de compensación de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena(s) lateral(es) grande(s) se crean sobre la superficie de separación de la segunda molécula de anticuerpo sustituyendo las cadenas laterales de aminoácidos grandes por más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero con respecto a otros productos finales no deseados tales como homodímeros. Véase el documento WO96/27011 publicado el 6 de septiembre de 1996.

Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descrito en la bibliografía. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse usando enlace químico. Brennan y col., Science 229:81 (1985), describen un procedimiento en el que anticuerpos intactos se escinden proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol arsenito de sodio para estabilizar ditioles vecinos y prevenir la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados se convierten entonces en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab'-TNB se reconvierte entonces en el Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden usarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. Better y col., Science 240: 1041-1043 (1988) desvelan la secreción de fragmentos de anticuerpos funcionales de bacterias (véanse, por ejemplo, Better y col., Skerra y col. Science 240: 1038-1041 (1988)). Por ejemplo, fragmentos de Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos (Carter y col., Bio/Technology 10:163-167 (1992); Shalaby y col., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)).

Shalaby y col., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico completamente humanizado F(ab')2. Cada fragmento Fab' se secretó por separado de E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado podía unirse a células que expresaban en exceso el receptor HER2 y linfocitos T humanos normales, además de provocar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumor de mama humano.

También se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente a partir de cultivo celular recombinante. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se han producido usando cremalleras de leucina, por ejemplo, GCN4 (véase generalmente Kostelny y col., J. Immunol., 148(5):15471553 (1992)). Los péptidos de cremalleras de leucina de las proteínas Fos y Jun se ligaron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión de genes. Los homodímeros de anticuerpos se redujeron en la región de bisagra para formar monómeros y luego se reoxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpos. Este procedimiento también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpos.

El término “diacuerpos” se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptidos (VH VL). Usando un ligador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son obligados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Véase, por ejemplo, Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

También se ha notificado otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante el uso de dímeros Fv monocatenarios (sFv). Véase, Gruber y col., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Alternativamente, el anticuerpo biespecífico puede ser un “anticuerpo lineal” producido como se describe en Zapata y col. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995). Brevemente, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos de Fd en tándem (VH -CH1-VH -CH1) que forman un par de regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.

También se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos (Tutt y col., J. Immunol. 147:60 (1991)).

Un “anticuerpo recombinante quelante” es un anticuerpo biespecífico que reconoce epítopes adyacentes y no solapantes del antígeno diana, y es suficientemente flexible para unirse a ambos epítopes simultáneamente (Neri y col., J Mol Biol. 246:367-73, 1995).

La producción de Fab-scFv biespecífico (“bicuerpo”) y Fab-(scFv)(2) triespecífico (“tricuerpo”) se describe en Schoonjans y col. (J Immunol. 165:7050-57, 2000) y Willems y col. (J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 786:161-76, 2003). Para bicuerpos o tricuerpos, una molécula de scFv se fusiona con una o ambas de las cadenas de VL-CL (L) y VH-CH1 (Fd), por ejemplo, para producir un tricuerpo dos scFv se fusionan con el extremo C de Fab mientras que en un bicuerpo un scFv se fusiona con el extremo C de Fab.

Producción recombinante de anticuerpos

Los anticuerpos pueden producirse por metodología de ADN recombinante usando uno de los sistemas de expresión de anticuerpos muy conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)).

Los anticuerpos que codifican ADN de la invención pueden colocarse en vectores de expresión, que luego se transfectan en células huésped tales como células de E. coli, células COS de simio, células 293 de riñón embrionario humano (por ejemplo, células 293E), células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. La producción recombinante de anticuerpos es muy conocida en la técnica. Se han derivado fragmentos de anticuerpos mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto y col., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan y col., Science

229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden ahora producirse directamente por células huésped recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos, que incluyen síntesis de péptidos y enlace covalente, serán evidentes para el médico habitual.

Secuencias de control de la expresión se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante operativamente ligada en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión a ribosoma. Las células eucariotas son conocidas por utilizar promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

El ácido nucleico está operativamente ligado cuando se pone en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder secretor está operativamente ligado a ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente ligado a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está operativamente ligado a una secuencia codificante si está posicionado de forma que facilite la traducción. Generalmente, operativamente ligado significa que las secuencias de ADN que están ligadas son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La ligación se lleva a cabo por ligación en sitios de restricción convenientes. Si no existen tales sitios, los adaptadores o ligadores de oligonucleótidos sintéticos se usan según la práctica convencional.

Célula, línea celular y cultivo celular se usan frecuentemente indistintamente y todas aquellas designaciones en el presente documento incluyen progenie. Los transformantes y células transformadas incluyen la célula objeto primaria y cultivos derivados de la misma sin considerar el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Está incluida la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que se ha

seleccionado en la célula originalmente transformada. Si se prevén distintas designaciones, será evidente del contexto.

En una realización alternativa, la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina de interés puede determinarse por secuenciación directa de proteínas. Pueden diseñarse secuencias de nucleótidos codificantes adecuadas según una tabla de codones universal.

Las muteínas de secuencias de aminoácidos del anticuerpo deseado pueden prepararse introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN codificante, o por síntesis de péptidos. Tales muteínas incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos. Se hace cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, a condición de que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar procedimientos postraduccionales del anticuerpo monoclonal, humano, humanizado, Human Engineered ™ o de muteína, tal como cambiando el número o posición de sitios de glucosilación.

Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican muteínas de secuencias de aminoácidos del anticuerpo se preparan mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de muteínas de secuencias de aminoácidos que se producen naturalmente) o preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida a sitio), mutagénesis por PCR y mutagénesis en casete de una muteína preparada antes o una versión de no muteína del anticuerpo.

La invención también proporciona ácido nucleico aislado que codifica anticuerpos de la invención, opcionalmente operativamente ligado a secuencias de control reconocidas por una célula huésped, vectores y células huésped que comprenden los ácidos nucleicos, y técnicas recombinantes para la producción de los anticuerpos, que pueden comprender cultivar la célula huésped de manera que el ácido nucleico se exprese y, opcionalmente, recuperar el anticuerpo del cultivo de células huésped o medio de cultivo.

Para la producción recombinante del anticuerpo, el ácido nucleico codificante se aísla y se inserta en un vector replicable para la posterior clonación (amplificación del ADN) o para la expresión. El ADN que codifica el anticuerpo monoclonal se aísla fácilmente y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que pueden unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo). Están disponibles muchos vectores. Los componentes de vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores selectivos, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción.

(1) Componente de la secuencia señal

El anticuerpo de la presente invención puede producirse recombinantemente no solo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es preferentemente una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N de la proteína madura o polipéptido. La secuencia señal seleccionada es preferentemente una que es reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa señal) por la célula huésped. Si las células huésped procariotas no reconocen y procesan la secuencia señal del anticuerpo nativo, la secuencia señal puede sustituirse con una secuencia señal seleccionada, por ejemplo, del grupo de los líderes de pectato liasa (por ejemplo, pelB) fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp, o enterotoxina estable al calor II. Para la secreción de levadura, la secuencia señal nativa puede sustituirse por, por ejemplo, el líder de levadura invertasa, líder de factor α (incluyendo líderes de factor α de Saccharomyces y Kluyveromyces), o líder de fosfatasa ácida, el líder de glucoamilasa de C. albicans, o la señal descrita en el documento WO90/13646. En la expresión de células de mamífero están disponibles secuencias señal de mamífero, además de líderes secretores virales, por ejemplo, la señal gD del herpes simple.

El ADN para tal región precursora se liga en marco de lectura al ADN que codifica el anticuerpo.

(2): Componente de origen de replicación

Tanto los vectores de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Generalmente, en vectores de clonación esta secuencia es una que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias autónomamente replicantes. Tales secuencias son muy conocidas para una variedad de bacterias, levadura y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen de plásmido 2 μ es adecuado para levadura, y son útiles diversos orígenes virales para vectores de clonación en células de mamífero. Generalmente, el componente de origen de replicación no se necesita para vectores de expresión de mamífero (el origen de SV40 puede usarse normalmente solo debido a que contiene el promotor temprano).

(3): Componente de marcador selectivo

Los vectores de expresión y de clonación pueden contener un gen selectivo, también llamado un marcador de selección. Genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, tetraciclina, G418, geneticina, histidinol o ácido micofenólico (b) complementan deficiencias auxotróficas o (c) aportan nutrientes críticos no disponibles de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa para bacilos.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que son satisfactoriamente transformadas con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia a fármaco y así sobrevive la pauta de selección. Ejemplos de tal selección dominante usan los fármacos metotrexato, neomicina, histidinol, puromicina, ácido micofenólico e higromicina.

Otro ejemplo de marcadores de selección adecuados para células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para capturar el ácido nucleico que codifica anticuerpo, tal como DHFR, timidina cinasa, metalotioneína-I y -II, preferentemente genes metalotioneína de primate, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc.

Por ejemplo, células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican primero cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se emplea DHFR natural es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad de DHFR.

Alternativamente, las células huésped (particularmente huéspedes naturales que contienen DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican anticuerpo de la invención, proteína DHFR natural y otro marcador de selección tal como aminoglucósido 3'-fosfotransferasa (APH) pueden seleccionarse por crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador de selección tal como un antibiótico aminoglucosídico, por ejemplo, kanamicina, neomicina o G418. Véase la patente de EE.UU. nº 4.965.199.

Un gen de selección adecuado para su uso en levadura es el gen trp1 presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb y col., Nature, 282: 39 (1979)). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC nº 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics, 85: 12 (1977). La presencia de la lesión trp1 en el genoma de la célula huésped de levadura proporciona entonces un entorno eficaz para detectar la transformación por el crecimiento en ausencia de triptófano. Similarmente, cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20.622 ó 38.626) se complementan por plásmidos conocidos que llevan el gen Leu2. Cepas de levadura deficientes en Ura3 se complementan por plásmidos que llevan el gen ura3.

Además, pueden usarse vectores derivados del plásmido circular de 1,6 μm pKD1 para transformación de levaduras de Kluyveromyces. Alternativamente se informó de un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimosina bovina recombinante para K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8: 135 (1990). También se han desvelado vectores de expresión de múltiples copias estables para la secreción de albúmina de suero humano recombinante madura por cepas industriales de Kluyveromyces. Fleer y col., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991).

(4) Componente de promotor

Los vectores de expresión y de clonación normalmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está operativamente ligado al ácido nucleico que codifica el anticuerpo. Promotores adecuados para su uso con huéspedes procariotas incluyen el promotor de arabinosa (por ejemplo, araB) promotor phoA, sistemas promotores de β-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac. Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Promotores para su uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) operativamente ligada al ADN que codifica el anticuerpo de la invención.

Se conocen secuencias promotoras para eucariotas. Prácticamente todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases en la dirección 5' del sitio en el que se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada 70 a 80 bases en la dirección 5' del inicio de transcripción de muchos genes es una región CNCAAT en la que N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucariotas está una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola de poli A al extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan adecuadamente en vectores de expresión eucariotas.

Ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glicolíticas tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato decarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa.

Otros promotores de levadura que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de la transcripción

controlada por condiciones de crecimiento son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradantes asociadas al metabolismo de nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Vectores y promotores adecuados para uso en la expresión de levadura se describen adicionalmente en el documento EP 73.657. También se usan ventajosamente potenciadores de levadura con promotores de levadura.

La transcripción de anticuerpos a partir de vectores en células huésped de mamífero está controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos a partir de los genomas de virus tales como virus de la leucemia de Abelson, virus del polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, lo más preferentemente citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y virus simio 40 (SV40), de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque térmico, siempre que tales promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.

Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación viral de SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción de HindIII E. Un sistema para expresar ADN en huéspedes de mamífero usando el virus del papiloma bovino como vector se desvela en la patente de EE.UU. nº 4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en la patente de EE.UU. nº

4.601.978. Véase también Reyes y col., Nature 297:598-601 (1982) que describe la expresión de ADNc de βinterferón humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina cinasa del virus del herpes simple. Alternativamente, como promotor puede usarse la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous.

(5): Componente de elemento potenciador

La transcripción de un ADN que codifica el anticuerpo de esta invención por eucariotas superiores aumenta frecuentemente insertando una secuencia potenciadora en el vector. Muchas secuencias potenciadoras se conocen ahora de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, alfa-fetoproteína e insulina). Normalmente, sin embargo, se usará un potenciador de un virus de células eucariotas. Ejemplos incluyen el potenciador del SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma en el lado tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) que describe elementos potenciadores para la activación de promotores eucariotas. El potenciador puede cortarse y empalmarse en el vector en una posición 5' o 3' con respecto a la secuencia codificante del anticuerpo, pero preferiblemente está localizado en un sitio 5' desde el promotor.

(6): Componente de terminación de la transcripción

Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas (células de levadura, hongo, insecto, planta, animal, humana o nucleada de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias están comúnmente disponibles de las regiones sin traducir de 5' y, ocasionalmente 3', de ADN eucariotas o virales o ADNc. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción sin traducir del ARNm que codifica un anticuerpo. Un componente de terminación de la transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Véase el documento WO94/11026 y el vector de expresión desvelado en su interior. Otro es el terminador de la transcripción de la cadena ligera de la inmunoglobulina de ratón.

(7): Selección y transformación de células huésped

Células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores en este documento son las células procariotas, de levadura o eucariotas superiores descritas anteriormente. Procariotas adecuados para este fin incluyen eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescens, y Shigella, además de Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, 41 P de B. licheniformis desvelado en el documento DD 266.710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Un huésped de clonación de E. coli preferido es 294 de E. coli (ATCC 31.446), aunque son adecuadas otras cepas tales como B de E. coli, X1776 de E. coli (ATCC 31.537) y W3110 de E. coli (ATCC 27.325). Estos ejemplos son ilustrativos en vez de limitantes.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levadura son huéspedes de clonación o expresión adecuados para los vectores que codifican anticuerpos. Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panadero común, es el más comúnmente usado entre los microorganismos huésped eucariotas inferiores. Sin embargo, varios otros géneros, especies y cepas están comúnmente disponibles y son útiles en el presente documento, tales como Schizosaccharomyces pombe; huéspedes de Kluyveromyces tales como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (documento EP 402.226); Pichia pastoris (documento EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (documento EP 244.234);

Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y huéspedes de Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.

Células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo glucosilado se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de planta y de insecto. Se han identificado numerosas cepas baculovirales y variantes y células huésped de insecto permisivas correspondientes de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori. Una variedad de cepas virales para transfección está públicamente disponible, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y tales virus pueden usarse como virus en el presente documento según la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

También pueden utilizarse cultivos de células de planta de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate, tabaco, lemna y otras células de planta como huéspedes.

Sin embargo, el mayor interés ha sido en células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejido) se ha convertido en un procedimiento rutinario. Ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero útiles son células de ovario de hámster chino, que incluyen células CHOK1 (ATCC CCL61), DXB-11, DG44, y células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón de embrión humano (293 o células 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, [Graham y col., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]; células de riñón de bebé de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-11587); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather y col., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

Las células huésped se transforman o transfectan con los vectores de expresión o de clonación anteriormente descritos para la producción de anticuerpos y se cultivan en medio nutriente convencional modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Además, vectores novedosos y líneas celulares transfectadas con múltiples copias de unidades de transcripción separadas por un marcador selectivo son particularmente útiles y se prefieren para la expresión de anticuerpos.

(8): Cultivo de células huésped

Las células huésped usadas para producir el anticuerpo de la presente invención pueden cultivarse en una variedad de medios. Medios comercialmente disponibles tales como Ham F10 (Sigma), medio mínimo esencial ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y medio Eagle modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y col., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes y col., Anal. Biochem, 102:255 (1980), las patentes de EE.UU. nº 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; documentos WO90103430; WO 87/00195; o la patente de EE.UU. Re. nº 30.985 puede usarse como medio de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede complementarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco Gentamycin™), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos normalmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. También puede incluirse cualquier otro complemento a concentraciones apropiadas que serían conocidas para aquellos expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son aquellas previamente usadas con la célula huésped seleccionada para expresión, y serán evidentes para el experto habitual en la técnica.

(9): Purificación de anticuerpos

Si se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o secretarse directamente en el medio, que incluye de cultivos microbianos. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como una primera etapa, el residuo particulado, tanto células huésped como fragmentos lisados, se elimina, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Better y col. Science 240: 1041-1043 (1988); ICSU Short Reports 10: 105 (1990); y Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 457-461 (1993) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que son secretados al espacio periplásmico de E. coli. (véase también [Carter y col., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)].

La composición de anticuerpo preparada a partir de células microbianas o de mamífero puede purificarse usando, por ejemplo, cromatografía con hidroxilapatita, cromatografía de intercambio catiónico o aniónico y cromatografía de

afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y el isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. La proteína A puede usarse para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas γ1, γ2 o γ4 humanas (Lindmark y col., J. Immunol. Methods 62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para γ3 humana (Guss y col., EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la que está unida el ligando de afinidad es más frecuentemente agarosa, pero están disponibles otras matrices. Matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que pueden lograrse con agarosa. Si el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas tales como fraccionamiento sobre una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía sobre sílice, cromatografía sobre heparina SEPHAROSE™, cromatografía sobre una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo que vaya a recuperarse.

Anticuerpos quiméricos

Un anticuerpo de roedor con administración in vivo repetida en el hombre bien solo o bien como un conjugado provocará una respuesta inmunitaria en el receptor contra el anticuerpo de roedor; la llamada respuesta de HAMA (anticuerpo humano anti-ratón). La respuesta de HAMA puede limitar la eficacia del producto farmacéutico si se requiere dosificación repetida. La inmunogenicidad del anticuerpo puede reducirse por modificación química del anticuerpo con un polímero hidrófilo tal como polietilenglicol o usando procedimientos de ingeniería genética para hacer la estructura del anticuerpo más similar a la humana, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, humanizados, humanos o Human Engineered ™. Debido a que tales anticuerpos manipulados son menos inmunogénicos en seres humanos que los anticuerpos monoclonales de ratón parentales, pueden usarse para el tratamiento de seres humanos con mucho menos riesgo de anafilaxia. Así, estos anticuerpos pueden preferirse en aplicaciones terapéuticas que implican administración in vivo a un ser humano.

Los anticuerpos monoclonales quiméricos, en los que los dominios Ig variables de un anticuerpo monoclonal de ratón están fusionados con dominios Ig constantes humanos, pueden generarse usando procedimientos convencionales conocidos en la técnica (véanse Morrison, S. L., y col. (1984) Chimeric Human Antibody Molecules; Mouse Antigen Binding Domains with Human Constant Region Domains, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6841-6855; y, Boulianne, G. L., y col., Nature 312, 643-646. (1984)). Por ejemplo, las secuencias de gen para los dominios variables del anticuerpo de roedor que se unen a CEA pueden sustituirse por los dominios variables de una proteína de mieloma humana, produciendo así un anticuerpo quimérico recombinante. Estos procedimientos se detallan en los documentos EP 194276, EP 0120694, EP 0125023, EP 0171496, EP 0173494 y WO 86/01533. Aunque algunos anticuerpos monoclonales quiméricos han demostrado ser menos inmunogénicos en seres humanos, los dominios Ig variables de ratón pueden todavía conducir a una respuesta humana anti-ratón significativa.

Anticuerpos humanizados

Los anticuerpos humanizados pueden lograrse mediante una variedad de procedimientos que incluyen, por ejemplo:

(1) injertar las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) no humanas en una región estructural humana y región constante (un procedimiento denominado en la materia humanizar mediante “injerto de CDR”), o, alternativamente, (2) trasplantar los dominios variables no humanos enteros, pero “encubriéndolos” con una superficie similar a humana mediante sustitución de residuos superficiales (un procedimiento denominado en la materia “inactivación”). En la presente invención, los anticuerpos humanizados incluirán tanto anticuerpos “humanizados” como “inactivados”. Estos procedimientos se desvelan en, por ejemplo, Jones y col., Nature 321:522 525 (1986); Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 81:6851 6855 (1984); Morrison y Oi, Adv. Immunol., 44:65 92 (1988); Verhoeyer y col., Science 239:1534 1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489 498 (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31(3):169 217 (1994); y Kettleborough, C.A. y col., Protein Eng. 4(7):773 83 (1991).

Por ejemplo, las secuencias de genes de las CDR del anticuerpo de roedor pueden aislarse o sintetizarse y sustituirse con las regiones de secuencia correspondientes de un gen de anticuerpo humano homólogo, produciendo un anticuerpo humano con la especificidad del anticuerpo de roedor original. Estos procedimientos se describen en los documentos EP 023940, WO 90/07861 y WO91/09967.

El injerto de CDR implica introducir una o más de las seis CDR de los dominios de Ig variables de la cadena pesada y ligera de ratón en las cuatro regiones estructurales apropiadas de dominios de Ig variables humanos también se llama injerto de CDR . Esta técnica (Riechmann, L., y col., Nature 332, 323 (1988)), utiliza las regiones estructurales conservadas (FR1-FR4) como un esqueleto para soportar los bucles de CDR que son los contactos primarios con el antígeno. Sin embargo, una desventaja del injerto de CDR es que puede producir un anticuerpo humanizado que tiene una afinidad de unión sustancialmente inferior a la del anticuerpo de ratón original, debido a que los aminoácidos de las regiones estructurales pueden contribuir a la unión a antígeno, y debido a que los aminoácidos de los bucles de CDR pueden influir en la asociación de los dos dominios de Ig variables. Para mantener la afinidad del anticuerpo monoclonal humanizado, la técnica de injerto de CDR puede mejorarse eligiendo regiones

estructurales humanas que se parecen mucho a las regiones estructurales del anticuerpo de ratón original, y por mutagénesis dirigida a sitio de aminoácidos individuales dentro de la región estructural o CDR ayudadas por modelado informático del sitio de unión a antígeno (por ejemplo, Co, M. S., y col. (1994), J. Immunol. 152, 29682976).

Un procedimiento de humanización de anticuerpos comprende alinear las secuencias de cadenas pesadas y ligeras no humanas con secuencias de cadenas pesadas y ligeras humanas, seleccionar y sustituir la región estructural no humana con una región estructural humana basándose en tal alineamiento, modelar molecularmente para predecir la conformación de la secuencia humanizada y comparar con la conformación del anticuerpo parental. Este procedimiento va seguido de retromutación repetida de residuos en la región CDR que alteran la estructura de las CDR hasta que la conformación predicha del modelo de secuencia humanizado se aproxime mucho a la conformación de las regiones no humanas del anticuerpo parental no humano. Tales anticuerpos humanizados pueden derivatizarse adicionalmente para facilitar la captación y eliminación, por ejemplo, mediante receptores Ashwell (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 5.530.101 y 5.585.089).

Se ha informado de varias humanizaciones de anticuerpos monoclonales de ratón por diseño racional (véase, por ejemplo, el documento 20020091240 publicado el 11 de julio de 2002, documento WO 92/11018 y la patente de EE.UU. nº 5.693.762, la patente de EE.UU. nº 5.766.866).

Anticuerpos Human Engineered™

El término “anticuerpo Human Engineered™” se refiere a un anticuerpo derivado de un anticuerpo no humano, normalmente un anticuerpo monoclonal de ratón. Alternativamente, un anticuerpo Human Engineered™ puede derivarse de un anticuerpo quimérico que retiene o retiene sustancialmente las propiedades de unión a antígeno del anticuerpo no humano parental, pero que presenta inmunogenicidad disminuida con respecto al anticuerpo parental cuando se administra a seres humanos.

Se han descrito Human Engineering™ de dominios variables de anticuerpos por Studnicka [véanse, por ejemplo, Studnicka y col., patente de EE.UU. nº 5.766.886; Studnicka y col. Protein Engineering 7: 805-814 (1994)] como un procedimiento para reducir la inmunogenicidad mientras que se mantiene la actividad de unión de moléculas de anticuerpo. Según el procedimiento, a cada aminoácido de la región variable se le ha asignado un riesgo de sustitución. Las sustituciones de aminoácidos se distinguen por una de las tres categorías de riesgo: (1) cambios de riesgo bajo son aquellos que tienen la mayor probabilidad de reducir la inmunogenicidad con la mínima posibilidad de alterar la unión a antígeno; (2) cambios de riesgo moderado son aquellos que reducirían adicionalmente la inmunogenicidad, pero tienen una mayor posibilidad de afectar la unión a antígeno o el plegamiento de proteínas; (3) residuos de riesgo alto son aquellos que son importantes para la unión o para mantener la estructura del anticuerpo y llevan el mayor riesgo de que se afecte la unión a antígeno o plegamiento de proteínas. Debido a la función estructural tridimensional de prolinas, las modificaciones en prolinas se consideran generalmente que son al menos cambios de riesgo moderado, aunque la posición sea normalmente una posición de riesgo bajo.

Regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo de roedor son Human Engineered™ del siguiente modo para sustituir aminoácidos humanos en posiciones que se determina que es poco probable que efectúen adversamente tanto la unión a antígeno como el plegamiento de proteínas, pero que probablemente reducen la inmunogenicidad en un entorno humano. Se identifican residuos de aminoácidos que están en posiciones “de riesgo bajo” y que son candidatos para modificación según el procedimiento alineando las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de roedor con una secuencia de la región variable humana. Puede usarse cualquier región variable humana, que incluye una secuencia de VH o VL individual o una secuencia de VH o VL consenso humana o una secuencia de la línea germinal humana individual o consenso. Pueden cambiarse residuos de aminoácidos en cualquier número de las posiciones de riesgo bajo, o en todas las posiciones de riesgo bajo. Por ejemplo, en cada posición de riesgo bajo en la que los residuos de aminoácidos murinos y humanos alineados se diferencian se introduce una modificación de aminoácidos que sustituye el residuo de roedor con el residuo humano. Alternativamente pueden cambiarse los residuos de aminoácidos en todas las posiciones de riesgo bajo y en cualquier número de las posiciones de riesgo moderado. Idealmente, para lograr la menor inmunogenicidad, todas las posiciones de riesgo bajo y moderado se cambian de secuencia de roedor a humana.

Se construyen genes sintéticos que contienen regiones variables de cadena pesada y/o ligera modificadas y se ligan a regiones constantes de la cadena pesada γ y/o de la cadena ligera kappa humanas. Cualquier región constante de la cadena pesada y de la cadena ligera humana puede usarse en combinación con las regiones variables del anticuerpo Human Engineered™, que incluyen IgA (de cualquier subclase, tal como IgA1 o IgA2), IgD, IgE, IgG (de cualquier subclase, tal como IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), o IgM. Los genes de la cadena pesada y ligera humana se introducen en células huésped, tales como células de mamífero, y se obtienen y caracterizan productos de inmunoglobulina recombinantes resultantes.

Anticuerpos humanos de animales transgénicos

Los anticuerpos humanos para antígeno diana también pueden producirse usando animales transgénicos que no

tienen producción de inmunoglobulina endógena y se manipulan para contener sitios de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, el documento WO 98/24893 desvela animales transgénicos que tienen un sitio de Ig humana en el que los animales no producen inmunoglobulinas endógenas funcionales debido a la inactivación de sitios endógenos de la cadena pesada y ligera. El documento WO 91/10741 también desvela huéspedes mamíferos no primates transgénicos que pueden organizar una respuesta inmunitaria a un inmunogén, en los que los anticuerpos tienen regiones constantes y/o variables de primate, y en los que los sitios que codifican inmunoglobulina endógena están sustituidos o inactivados. El documento WO 96/30498 desvela el uso del sistema Cre/Lox para modificar el sitio de inmunoglobulina en un mamífero, tal como para sustituir toda o una parte de la región constante o variable para formar una molécula de anticuerpo modificada. El documento WO 94/02602 desvela huéspedes mamíferos no humanos que tienen sitios de Ig endógenos inactivados y sitios de Ig humanos funcionales. La patente de EE.UU. nº

5.939.598 desvela procedimientos de preparación de ratones transgénicos en los que los ratones carecen de cadenas pesadas endógenas, y expresan un sitio de inmunoglobulina exógeno que comprende una o más regiones constantes xenogeneicas.

Usando un animal transgénico descrito anteriormente, una respuesta inmunitaria puede producirse para una molécula antigénica seleccionada, y pueden extraerse células productoras de anticuerpo del animal y usarse para producir hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales humanos. Los protocolos de inmunización, adyuvantes y similares se conocen en la técnica, y se usan en la inmunización de, por ejemplo, un ratón transgénico como se describe en el documento WO 96/33735. Esta publicación desvela anticuerpos monoclonales contra una variedad de moléculas antigénicas que incluyen IL-6, IL-8, TNFa, CD4 humano, L-selectina, gp39 y toxina tetánica. Los anticuerpos monoclonales pueden probarse para la capacidad para inhibir o neutralizar la actividad biológica o efecto fisiológico de la proteína correspondiente. El documento WO 96/33735 desvela que los anticuerpos monoclonales contra IL-8, derivada de células inmunitarias de ratones transgénicos inmunizados con IL-8, bloquearon las funciones inducidas por IL-8 de neutrófilos. Anticuerpos monoclonales humanos con especificidad por el antígeno usado para inmunizar animales transgénicos también se desvelan en el documento WO 96/34096 y la solicitud de patente de EE.UU. nº 20030194404; y la solicitud de patente de EE.UU. nº 20030031667). Véanse también Jakobovits y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits y col., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann y col., Year in Immuno., 7:33 (1993); y la patente de EE.UU. nº 5.591.669, la patente de EE.UU. nº 5.589.369, la patente de EE.UU. nº 5.545.807; y la solicitud de patente de EE.UU. nº 20020199213, documento WO 96/34096 y la solicitud de patente de EE.UU. nº 20030194404; y la solicitud de patente de EE.UU. nº 20030031667.

Animales transgénicos adicionales útiles para preparar anticuerpos monoclonales incluyen Medarex HuMAb-MOUSE®, descrito en la patente de EE.UU. nº 5.770.429, y Fishwild y col. (Nat. Biotechnol. 14:845-851, 1996), que contiene secuencias de genes de genes de anticuerpos humanos sin reordenar que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos humanos. La inmunización de un HuMAb-MOUSE® permite la producción de anticuerpos monoclonales para la proteína diana.

Por tanto, Ishida y col. (Cloning Stem Cells. 4:91-102, 2002) describen el ratón TransChromo (TCMOUSE™) que comprende segmentos de megabases de tamaño de ADN humano y que incorpora el sitio de la inmunoglobulina humana (hIg) entera. El TCMOUSE tiene un repertorio completamente diverso de hIg, que incluye todas las subclases de IgG (IgG1-G4). La inmunización del ratón TC con diversos antígenos humanos produce respuestas de anticuerpos que comprenden anticuerpos humanos.

La solicitud de patente de EE.UU. nº 20030092125 describe procedimientos para sesgar la respuesta inmunitaria de un animal al epítope deseado. También pueden generarse anticuerpos humanos por linfocitos B activados in vitro (véanse las patentes de EE.UU. nº 5.567.610 y 5.229.275).

Anticuerpos de tecnología de expresión en fago

El desarrollo de tecnologías para preparar repertorios de genes de anticuerpos humanos recombinantes, y la expresión de los fragmentos de anticuerpos codificados sobre la superficie de bacteriófago filamentoso, ha proporcionado un medio recombinante para preparar y seleccionar directamente anticuerpos humanos, que también puede aplicarse a anticuerpos humanizados, quiméricos, murinos o de muteína. Los anticuerpos producidos por la tecnología de fagos se producen como fragmentos de unión a antígeno - normalmente fragmentos Fv o Fab - en bacterias y así carecen de funciones efectoras. Las funciones efectoras pueden introducirse por una de las dos estrategias: los fragmentos pueden manipularse tanto en anticuerpos completos para la expresión en células de mamífero como en fragmentos de anticuerpos biespecíficos con un segundo sitio de unión que puede provocar una función efectora.

Normalmente, el fragmento Fd (VH-CH1) y la cadena ligera (VL-CL) de anticuerpos se clonan por separado por PCR y se recombinan aleatoriamente en bibliotecas combinatorias de expresión en fago, que pueden entonces seleccionarse para unirse a un antígeno particular. Los fragmentos Fab se expresan sobre la superficie del fago, es decir, se ligan físicamente a los genes que los codifican. Así, la selección de Fab por unión a antígeno co-selecciona las secuencias codificantes de Fab, que pueden amplificarse posteriormente. Por varias rondas de unión a antígeno y re-amplificación, un procedimiento llamado inmunopurificación, Fab específico para el antígeno se enriquece y finalmente se aísla.

En 1994 se describió un enfoque para la humanización de anticuerpos, llamado “selección guiada”. La selección guiada utiliza la potencia de la expresión en la técnica en fagos para la humanización de anticuerpo monoclonal de ratón (véase Jespers, L. S., y col., Bio/Technology 12, 899-903 (1994)). Para esto, el fragmento Fd del anticuerpo monoclonal de ratón puede expresarse en combinación con una biblioteca de cadenas ligeras humanas, y la biblioteca de Fab híbrida resultante puede entonces seleccionarse con antígeno. El fragmento Fd de ratón proporciona así un molde para guiar la selección. Posteriormente, las cadenas ligeras humanas seleccionadas se combinan con una biblioteca de fragmentos Fd humanos. La selección de la biblioteca resultante proporciona Fab completamente humano.

Se ha descrito una variedad de procedimientos para derivar anticuerpos humanos de bibliotecas de expresión en fago (véanse, por ejemplo, Hoogenboom y col., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991); las patentes de EE.UU. nº 5.565.332 y 5.573.905; Clackson, T., y Wells, J. A., TIBTECH 12, 173-184 (1994)). En particular, la selección y evolución in vitro de anticuerpos derivados de bibliotecas de expresión en fago se ha convertido en una poderosa herramienta (véanse Burton, D. R., y Barbas III, C. F., Adv. Immunol. 57, 191-280 (1994); y, Winter, G., y col., Annu. Rev. Immunol. 12,433-455 (1994); solicitud de patente de EE.UU. nº 20020004215 y el documento WO92/01047; solicitud de patente de EE.UU. nº 20030190317 publicada el 9 de octubre de 2003 y la patente de EE.UU. nº 6.054,287; la patente de EE.UU. nº 5.877.293.

Watkins, “Screening of Phage-Expressed Antibody Libraries por Capture Lift”, Methods in Molecular Biology, Antibody Phage Display: Methods and Protocols 178: 187-193, y la solicitud de patente de EE.UU. nº 200120030044772 publicada el 6 de marzo de 2003, describen procedimientos para seleccionar bibliotecas de anticuerpos expresadas en fago u otras moléculas de unión por levantamiento por captura, un procedimiento que implica la inmovilización de las moléculas de unión candidatas sobre un soporte sólido.

Los productos de anticuerpo pueden cribarse para actividad y para idoneidad en los procedimientos de tratamiento de la invención usando ensayos como se describen en la sección titulada “Procedimientos de selección” en el presente documento o usando cualquier ensayo adecuado conocido en la técnica.

Muteínas de secuencias de aminoácidos

Los anticuerpos de la invención incluyen muteínas de un anticuerpo parental en el que la secuencia de polipéptidos del anticuerpo parental ha sido alterada por al menos una sustitución, deleción o inserción de aminoácidos en la región variable o la porción equivalente a la región variable, que incluye dentro de las CDR, a condición de que la muteína retenga la afinidad de unión deseada o actividad biológica. Las muteínas pueden ser sustancialmente homólogas o sustancialmente idénticas al anticuerpo parental, por ejemplo, al menos el 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %

o el 100 % idénticas u homólogas. La identidad u homología con respecto a esta secuencia se define en el presente documento como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos a la secuencia parental, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencias, y sin considerar sustituciones conservativas como parte de la identidad de secuencias. Ninguna de las extensiones, deleciones o inserciones del extremo N, extremo C o internas en la secuencia de anticuerpos debe interpretarse como que afecta la identidad de secuencias u homología. Así, la identidad de secuencias puede determinarse mediante procedimientos convencionales que se usan comúnmente para comparar la similitud en la posición de los aminoácidos de dos polipéptidos. Usando un programa informático tal como BLAST o FASTA, dos polipéptidos se alinean para correspondencia óptima de sus aminoácidos respectivos (tanto a lo largo de la longitud completa de una o ambas secuencias como a lo largo de una porción predeterminada de una o ambas secuencias). Los programas proporcionan una penalización por abertura por defecto y una penalización por hueco por defecto, y puede usarse una matriz de puntuación tal como PAM 250 [una matriz de puntuación estándar; véase Dayhoff y col., en Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, sup. 3 (1978)] conjuntamente con el programa informático. Por ejemplo, la identidad en porcentaje puede entonces calcularse como: el número total de coincidencias idénticas multiplicado por 100 y luego dividirse entre la suma de la longitud de la secuencia más larga dentro de la amplitud de coincidencia y el número de huecos introducidos en las secuencias más largas con el fin de alinear las dos secuencias.

Los anticuerpos de la invención también pueden incluir alteraciones en la secuencia de polipéptidos de la región constante, que no afectarán la afinidad de unión, pero pueden alterar la función efectora, tal como toxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o eliminación y captación (y efecto resultante sobre la semivida).

Inserciones

Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones del extremo amino y/o carboxilo que oscilan en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cientos o más residuos, además de inserciones intra-secuencia de residuos de aminoácidos individuales o múltiples, por ejemplo 2, 3 o más. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo del extremo N o el anticuerpo (incluyendo fragmento de anticuerpo) fusionado con una marca de epítope o un epítope de receptor salvaje. Otras muteínas de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la adición de sitios de glucosilación, adición de cisteínas para enlace intramolecular

o intermolecular, o fusión con un polipéptido que aumenta la semivida en suero del anticuerpo, por ejemplo, en el

extremo N o extremo C. Por ejemplo, el (los) enlace(s) de cisteína puede(n) añadirse al anticuerpo para mejorar su 5 estabilidad (particularmente si el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv).

La glucosilación de anticuerpos está normalmente tanto ligada en N como ligada en O. Ligada en N se refiere a la unión del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina en las que X es cualquier aminoácido, excepto prolina, son las 10 secuencias de reconocimiento para unión enzimática del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de asparagina. La presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un posible sitio de glucosilación. Así, los sitios de glucosilación ligados en N pueden añadirse a un anticuerpo alterando la secuencia de aminoácidos de forma que contenga una o más de estas secuencias de tripéptidos. La glucosilación ligada en O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, el más 15 comúnmente serina o treonina, aunque también puede usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. Los sitios de glucosilación ligados en O pueden añadirse a un anticuerpo insertando o sustituyendo uno o más residuos de serina

o treonina en la secuencia del anticuerpo original.

El término “marcado con epítope” se refiere al anticuerpo fusionado con una marca de epítope. El polipéptido de la

20 marca de epítope tiene suficientes residuos para proporcionar un epítope contra el que puede prepararse un anticuerpo, aunque es suficientemente corto de forma que no interfiera con la actividad del anticuerpo. La marca de epítope es preferentemente suficientemente única de manera que el anticuerpo contra el mismo no reaccione sustancialmente de forma cruzada con otros epítopes. Polipéptidos de marca adecuados generalmente tienen al menos 6 residuos de aminoácidos y normalmente entre aproximadamente 8-50 residuos de aminoácidos

25 (preferentemente entre aproximadamente 9-30 residuos). Ejemplos incluyen el polipéptido de marca HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 [Field y col., Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165 (1988)]; la marca c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 para la misma [Evan y col., Mol. Cell. Biol. 5(12): 3610-3616 (1985)]; y la marca de glucoproteína D del virus del herpes simple D (gD) y su anticuerpo [Paborsky y col., Protein Engineering 3(6): 547553 (1990)]. Otras marcas a modo de ejemplo son una secuencia de poli-histidina, generalmente de

30 aproximadamente seis residuos de histidina, que permite el aislamiento de un compuesto así marcado usando quelación con níquel. Otras marcas y etiquetas, tales como la marca FLAG® (Eastman Kodak, Rochester, NY), muy conocidas y rutinariamente usadas en la materia, están englobadas por la invención.

Como se usa en el presente documento, el término “epítope de unión a receptor salvaje” se refiere a un epítope de la

35 región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable de aumentar la semivida en suero in vivo de la molécula de IgG.

Deleciones

40 Las deleciones de secuencias de aminoácidos incluyen deleciones del extremo amino y/o carboxilo que oscilan en longitud de uno a cientos o más residuos, produciendo fragmentos que retienen la afinidad de unión por antígeno diana, además de deleciones intra-secuencia de residuos de aminoácidos individuales o múltiples, por ejemplo, 2, 3

o más. Por ejemplo, los sitios de glucosilación pueden delecionarse o moverse a una posición diferente

delecionando parte o todo el tripéptido u otras secuencias de reconocimiento para la glucosilación. 45

Sustituciones

Otro tipo de muteína es una muteína de sustitución de aminoácidos. Estas muteínas tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo eliminada y un residuo diferente insertado en su lugar. Se contempla 50 mutagénesis de sustitución dentro de cualquiera de las regiones hipervariables o CDR o regiones estructurales. Se muestran sustituciones conservativas en la Tabla 2. La sustitución más conservativa se encuentra bajo el encabezado de “sustituciones preferidas”. Si tales sustituciones no producen cambio en la actividad biológica, entonces pueden introducirse más cambios sustanciales, denominados “sustituciones a modo de ejemplo” en la Tabla 1, o como se describe adicionalmente más adelante en referencia a clases de aminoácidos, y seleccionarse

55 los productos.

TABLA 2

Original: Ejemplar Sustituciones de Residuos Preferidas

Ala (A): val; leu; ile val

Arg (R): lys; gln; asn lys

Asn (N): gln; his; asp, lys; gln arg

Asp (D): glu; asn glu

Cys (C): ser; ala ser

Gln (Q): asn; glu asn

Glu (E): asp; gln asp

Gly (G): ala

His (H): asn; gln; lys; arg

Ile (I): leu; val; met; ala; phe; leu norleucine

Leu (L): norleucine; ile; val; met; ala; phe ile

Lys (K): arg; gln; asn arg

Met (M): leu; phe; ile leu

Phe (F): leu; val; ile; ala; tyr

Pro (P): ala

Ser (S): thr

Thr (T): ser ser

Trp (W): tyr; phe tyr

Tyr (Y): trp; phe; thr; ser phe

Val (V): ile; leu; met; phe; ala; norleucine leu

Modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se llevan a cabo seleccionando sustituciones que se diferencian significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto de polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobia de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Residuos que se producen naturalmente se dividen en grupos basándose en propiedades comunes de la cadena lateral:

(1): hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2): hidrófilos neutros: cys, ser, thr;

(3): ácidos: asp, glu;

(4): básicos: asn, gln, his, lys, arg;

(5): residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6): aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones conservativas implican sustituir un aminoácido con otro miembro de su clase. Sustituciones no conservativas implican sustituir un miembro de una de estas clases con un miembro de otra clase.

Cualquier residuo de cisteína que no participe en el mantenimiento de la conformación apropiada del anticuerpo también puede estar sustituido, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir la reticulación anómala.

La maduración por afinidad generalmente implica preparar y seleccionar muteínas de anticuerpo que tienen sustituciones dentro de las CDR de un anticuerpo parental y seleccionar muteínas que tienen propiedades biológicas mejoradas tales como afinidad de unión con respecto al anticuerpo parental. Una forma conveniente para generar tales muteínas de sustitución es la maduración por afinidad usando expresión en fago. Brevemente, varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo 6-7 sitios) se mutan para generar todas las posibles sustituciones de amino en cada sitio. Las muteínas de anticuerpo así generadas se expresan de un modo monovalente a partir de partículas de fago filamentoso como fusiones con el producto del gen III de M13 encapsidado dentro de cada partícula. Las muteínas expresadas en fago se criban entonces para su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión). Véanse, por ejemplo, los documentos WO 92/01047, WO 93/112366, WO 95/15388 y WO 93/19172.

Los actuales procedimientos de maduración por afinidad de anticuerpo pertenecen a dos categorías de mutagénesis: estocástica y no estocástica. La PCR propensa a error, cepas bacterianas de mutadas (Low y col., J. Mol. Biol. 260, 359-68, 1996) y mutagénesis de saturación (Nishimiya y col., J. Biol. Chem. 275:12813-20, 2000; Chowdhury, P. S. Methods Mol. Biol. 178, 269-85, 2002) son ejemplos típicos de procedimientos de mutagénesis estocástica (Rajpal y col., Proc Natl. Acad Sci U S A. 102:8466-71, 2005). Las técnicas no estocásticas frecuentemente usan mutagénesis

de barrido con alanina o dirigida a sitio para generar colecciones limitadas de muteínas específicas. Algunos procedimientos se describen en más detalle a continuación.

Maduración por afinidad mediante procedimientos de inmunopurificación – La maduración por afinidad de anticuerpos recombinantes se realiza comúnmente mediante varias rondas de inmunopurificación de anticuerpos candidatos en presencia de cantidades decrecientes de antígeno. El decrecer la cantidad de antígeno por ronda selecciona los anticuerpos con la mayor afinidad por el antígeno, dando así anticuerpos de alta afinidad a partir de un gran conjunto de material de partida. La maduración por afinidad mediante inmunopurificación es muy conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en Huls y col. (Cancer Immunol Immunother. 50:163-71, 2001). Los procedimientos de maduración por afinidad usando tecnologías de expresión en fago se describen en cualquier parte en el presente documento y se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Daugherty y col., Proc Natl Acad Sci U S

A. 97:2029-34, 2000).

Mutagénesis Look-through – La mutagénesis Look-through (LTM) (Rajpal y col., Proc Natl Acad Sci U S A. 102:8466-71, 2005) proporciona un procedimiento para mapear rápidamente el sitio de unión a anticuerpo. Para LTM, nueve aminoácidos, representativos de las principales químicas de cadenas laterales proporcionadas por los 20 aminoácidos naturales, se seleccionan para diseccionar las contribuciones funcionales de las cadenas laterales a la unión en cada posición en las seis CDR de un anticuerpo. LTM genera una serie de posiciones de mutaciones únicas dentro de una CDR en la que cada residuo “natural” se sustituye sistemáticamente con uno de nueve aminoácidos seleccionados. Las CDR mutadas se combinan para generar bibliotecas combinatorias de fragmentos variables monocatenarios (scFv) de complejidad y tamaño crecimiento sin llegar a ser prohibitivas para la expresión cuantitativa de todas las muteínas. Después de la selección positiva, los clones con unión mejorada se secuencian, y se mapean mutaciones beneficiosas.

PCR propensa a error – La PCR propensa a error implica la aleatorización de ácidos nucleicos entre diferentes rondas de selección. La aleatorización se produce a una baja tasa por la tasa de error intrínseco de la polimerasa usada, pero puede potenciarse por PCR propensa a error (Zaccolo y col.,. J. Mol. Biol. 285:775-783, 1999) usando una polimerasa que tiene una alta tasa de error intrínseco durante la transcripción (Hawkins y col., J Mol Biol. 226:889-96, 1992). Después de los ciclos de mutación, los clones con afinidad mejorada por el antígeno se seleccionan usando procedimientos rutinarios en la materia.

Barajado de ADN – El barajado de ácido nucleico es un procedimiento para recombinación homóloga in vitro o in vivo de conjuntos de polinucleótidos más cortos o más pequeños para producir polinucleótidos de variante. El barajado de ADN se ha descrito en la patente de EE.UU. nº 6.605.449, la patente de EE.UU. 6.489.145, el documento WO 02/092780 y Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:10747-51 (1994). Generalmente, el barajado de ADN comprende 3 etapas: fragmentación de los genes que van a barajarse con ADNsa I, hibridación al azar de fragmentos y reensamblaje o llenado en el gen fragmentado por PCR en presencia de ADN polimerasa (PCR sexual), y amplificación de producto reensamblado por PCR convencional.

El barajado de ADN se diferencia de la PCR propensa a error en que es una reacción en cadena inversa. En PCR propensa a error, el número de sitios de iniciación de polimerasa y el número de moléculas crece exponencialmente. A diferencia, en el reensamblaje o barajado de ácidos nucleicos de polinucleótidos al azar, el número de sitios de iniciación y el número (pero no el tamaño) de los polinucleótidos al azar disminuye con el tiempo.

En el caso de un anticuerpo, el barajado de ADN permite la libre asociación combinatoria de, por ejemplo, todas las CDR1 con todas las CDR2 con todas las CDR3. Se contempla que múltiples familias de secuencias puedan barajarse en la misma reacción. Además, el barajado generalmente conserva el orden relativo, de forma que, por ejemplo, CDR1 no se encontrará en la posición de CDR2. Barajados raros contendrán un gran número de las mejores CDR (por ejemplo, mayor afinidad) y estos barajados raros pueden seleccionarse basándose en su afinidad superior.

El polinucleótido molde que puede usarse en el barajado de ADN puede ser ADN o ARN. Puede ser de diversas longitudes dependiendo del tamaño del gen o polinucleótido más corto o más pequeño que vaya a reensamblarse. Preferentemente, el polinucleótido molde tiene de 50 pb a 50 kb. El polinucleótido molde debe ser frecuentemente bicatenario.

Se contempla que polinucleótidos de ácido nucleico monocatenario o bicatenario que tienen regiones de identidad con el polinucleótido molde y regiones de heterología con el polinucleótido molde puedan añadirse al polinucleótido molde, durante la etapa inicial de la selección de genes. También se contempla que dos moldes de polinucleótido diferentes, pero relacionados, puedan mezclarse durante la etapa inicial.

Barrido con alanina – La mutagénesis por barrido con alanina puede realizarse para identificar residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión a antígeno. Cunningham y Wells (Science 244:10811085, 1989). Se identifican un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y se sustituyen por un aminoácido neutro o negativamente cargado (lo más preferentemente alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con antígeno. Aquellas localizaciones de

aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan entonces introduciendo más mutaciones u otras o mutaciones en, o para, los sitios de sustitución. Así, mientras que el sitio para introducir un cambio de secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación por sí misma no necesita predeterminarse. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado se realiza barrido con ala o mutagénesis al azar en el codón o región diana y las muteínas de anticuerpo expresadas se seleccionan para la actividad deseada.

Diseño asistido por ordenador – Alternativamente, o además, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y antígeno, o para usar software informático para modelar tales puntos de contacto. Tales residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para sustitución según las técnicas elaboradas en el presente documento. Una vez se generan tales muteínas, el panel de muteínas se somete a selección como se describe en el presente documento y anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes pueden seleccionarse para el posterior desarrollo.

La maduración por afinidad implica preparar y seleccionar muteínas de anticuerpo que tienen sustituciones dentro de las CDR de un anticuerpo parental y seleccionar muteínas que tienen propiedades biológicas mejoradas tales como afinidad de unión con respecto al anticuerpo parental. Una forma conveniente para generar tales muteínas de sustitución es la maduración por afinidad usando expresión en fago. Brevemente, se mutan varios sitios de región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) para generar todas las posibles sustituciones de amino en cada sitio. Las muteínas de anticuerpo así generadas se expresan de un modo monovalente a partir de partículas de fago filamentoso como fusiones con el producto del gen III de M13 encapsidado dentro de cada partícula. Las muteínas expresadas en fago se seleccionan entonces para su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión).

La mutagénesis por barrido con alanina puede realizarse para identificar residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión a antígeno. Alternativamente, o además, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Tales residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para sustitución según las técnicas elaboradas en el presente documento. Una vez se generan tales muteínas, el panel de muteínas se somete a selección como se describe en el presente documento y pueden seleccionarse anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para el posterior desarrollo.

Función efectora alterada

Se contemplan otras modificaciones del anticuerpo. Por ejemplo, puede desearse modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, de manera que se potencie la eficacia del anticuerpo, por ejemplo, en el tratamiento de cáncer. Por ejemplo, puede(n) introducirse residuo(s) de cisteína en la región Fc, permitiendo así la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado pueden tener capacidad de internalización mejorada y/o elevada destrucción de células mediada por complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). Véanse Caron y col., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). También pueden prepararse anticuerpos homodiméricos con actividad potenciada usando reticuladores heterobifuncionales como se describe en Wolff y col., Cancer Research

53: 2560-2565 (1993). Alternativamente puede manipularse un anticuerpo que tiene regiones Fc duales y así puede tener lisis del complemento potenciada y capacidades de ADCC. Véase Stevenson y col., Anti-Cancer Drug Design

3: 219-230 (1989). Además, se ha mostrado que secuencias dentro de la CDR pueden hacer que un anticuerpo se una a un MHC clase II y provoque una respuesta de linfocitos T auxiliares no deseada. Una sustitución conservativa puede permitir que el anticuerpo retenga la actividad de unión, aunque pierda su capacidad para provocar una respuesta de linfocitos T no deseada. Véase también Steplewski y col., Proc Natl Acad Sci U S A. 1988;85(13):48526, que describió anticuerpos quiméricos en los que una región variable murina se unió a regiones constantes gamma 1, gamma 2, gamma 3 y gamma 4 humanas.

En ciertas realizaciones de la invención puede desearse usar un fragmento de anticuerpo, en vez de un anticuerpo intacto, para aumentar, por ejemplo, la penetración tumoral. En este caso, puede desearse modificar el fragmento de anticuerpo con el fin de aumentar su semivida en suero, por ejemplo, añadiendo moléculas tales como PEG u otros polímeros solubles en agua, que incluyen polímeros de polisacáridos, a fragmentos de anticuerpos para aumentar la semivida. Esto también pueden lograrse, por ejemplo, por incorporación de un epítope de unión a receptor salvaje en el fragmento de anticuerpo (por ejemplo, por mutación de la región apropiada en el fragmento de anticuerpo o incorporando el epítope en una marca de péptido que luego se fusiona con el fragmento de anticuerpo en cualquier extremo o en el centro, por ejemplo, por ADN o síntesis de péptidos) (véase, por ejemplo, el documento WO96/32478).

El epítope de unión a receptor salvaje constituye preferentemente una región en la que uno cualquiera o más residuos de aminoácidos de uno o dos bucles de un dominio Fc se transfieren a una posición análoga del fragmento de anticuerpo. Incluso más preferentemente, tres o más residuos de uno o dos bucles del dominio Fc se transfieren. Todavía más preferido, el epítope se toma del dominio CH2 de la región Fc (por ejemplo, de una IgG) y se transfiere a la región CH1, CH3 o VH, o más de una región tal, del anticuerpo. Alternativamente, el epítope se toma del dominio CH2 de la región Fc y se transfiere a la región CL o región VL, o ambas, del fragmento de anticuerpo.

Véanse también las solicitudes internacionales WO 97/34631 y WO 96/32478 que describen variantes de Fc y su interacción con el receptor salvaje.

Así, los anticuerpos de la invención pueden comprender una porción Fc humana, una porción Fc consenso humana

o una muteína de la misma que retiene la capacidad para interaccionar con el receptor salvaje de Fc, que incluye muteínas en las que las cisteínas que participan en el enlace disulfuro se modifican o eliminan, y/o en las que una met se añade al extremo N y/o se eliminan uno o más de los 20 aminoácidos del extremo N, y/o se eliminan regiones que interaccionan con el complemento, tales como el sitio de unión a C1q, y/o se elimina el sitio de ADCC [véase, por ejemplo, Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992)]. Los anticuerpos de la clase IgG también pueden incluir una región constante diferente, por ejemplo, puede modificarse un anticuerpo IgG2 para mostrar una región constante de IgG1 o IgG4.

En el caso de IgG1, las modificaciones a la región constante, particularmente la región bisagra o CH2, pueden aumentar o disminuir la función efectora, que incluye actividad de ADCC y/o de CDC. En otras realizaciones, una región constante de IgG2 se modifica para reducir la formación de agregados de anticuerpo-antígeno. En el caso de IgG4, las modificaciones a la región constante, particularmente la región bisagra, pueden reducir la formación de semianticuerpos. En realizaciones específicas a modo de ejemplo se proporciona mutar la secuencia bisagra de IgG4 Cys-Pro-Ser-Cys a la secuencia bisagra de IgG1 Cys-Pro-Pro-Cys.

Estudios previos mapearon el sitio de unión sobre IgG humanas y murinas para FcR principalmente a la región bisagra inferior compuesta de los residuos de IgG 233-239. Otros estudios propusieron segmentos anchos adicionales, por ejemplo, Gly316-Lys338 para receptor I de Fc humana, Lys274-Arg301 y Tyr407-Arg416 para receptor III de Fc humano, o se encontraron algunos residuos específicos fuera de la bisagra inferior, por ejemplo, Asn297 y Glu318 para IgG2b murina que interacciona con receptor II de Fc murino. El informe de la estructura cristalina de 3,2 Å del fragmento Fc de IgG1 humana con receptor IIIA de Fc humano delineó los residuos de IgG1 Leu234-Ser239, Asp265-Glu269, Asn297-Thr299 y Ala327-Ile332 como implicados en la unión a receptor IIIA de Fc. Se ha sugerido basándose en la estructura cristalina que además de la bisagra inferior (Leu234-Gly237), los residuos en los bucles del dominio CH2 de IgG FG (residuos 326-330) y BC (residuos 265-271) podrían desempeñar una función en la unión a receptor IIA de Fc. Véase Shields y col., J. Biol. Chem., 276(9):6591-6604 (2001). La mutación de residuos dentro de sitios de unión a receptor de Fc puede producir función efectora alterada, tal como actividad de ADCC o CDC alterada, o semivida alterada. Como se ha descrito anteriormente, posibles mutaciones incluyen inserción, deleción o sustitución de uno o más residuos, que incluyen sustitución con alanina, una sustitución conservativa, una sustitución no conservativa, o sustitución con un residuo correspondiente de aminoácido en la misma posición de una subclase de IgG diferente (por ejemplo, sustitución de un residuo de IgG1 con un residuo de IgG2 correspondiente en esa posición).

Shields y col. informaron que los residuos de IgG1 que participan en la unión a todos los receptores de Fc humanos están localizados en el dominio CH2 proximal a la bisagra y se clasifican en dos categorías del siguiente modo: 1) posiciones que pueden interaccionar directamente con todos los FcR incluyen Leu234-Pro238, Ala327 y Pro329 (y posiblemente Asp265); 2) posiciones que influyen en la naturaleza o posición de los hidratos de carbono incluyen Asp265 y Asn297. Los residuos de IgG1 adicionales que afectaron la unión al receptor II de Fc son del siguiente modo: (mayor efecto) Arg255, Thr256, Glu258, Ser267, Asp270, Glu272, Asp280, Arg292, Ser298 y (menor efecto) His268, Asn276, His285, Asn286, Lys290, Gln295, Arg301, Thr307, Leu309, Asn315, Lys322, Lys326, Pro331, Ser337, Ala339, Ala378 y Lys414. A327Q, A327S, P329A, D265A y D270A redujeron la unión. Además, de los residuos identificados anteriormente para todos los FcR, residuos de IgG1 adicionales que redujeron la unión al receptor IIIA de Fc el 40 % o más son del siguiente modo: Ser239, Ser267 (Gly sola), His268, Glu293, Gln295, Tyr296, Arg301, Val303, Lys338 y Asp376. Muteínas que mejoraron la unión a FcRIIIA incluyen T256A, K290A, S298A, E333A, K334A y A339T. Lys414 mostró una reducción del 40 % en la unión a FcRIIA y FcRIIB, Arg416 una reducción del 30 % a FcRIIA y FcRIIIA, Gln419 una reducción del 30 % a FcRIIA y una reducción del 40 % a FcRIIB, y Lys360 una mejora del 23 % a FcRIIIA. Véase también Presta y col., Biochem. Soc. Trans. (2001) 30, 487-490.

Por ejemplo, la patente de Estados Unidos nº 6.194.551 describe muteínas con función efectora alterada que contienen mutaciones en la región de IgG humana Fc, en la posición de aminoácidos 329, 331 ó 322 (usando numeración de Kabat), algunas de los cuales muestran unión a C1q o actividad de CDC reducida. Como otro ejemplo, la patente de Estados Unidos nº 6.737.056 describe muteínas con unión a efector o a receptor de Fcgamma alterada que contienen mutaciones en la región de IgG humana Fc, en la posición de aminoácido 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ó 439 (usando numeración de Kabat), algunas de los cuales muestran perfiles de unión a receptor asociados a actividad de ADCC o CDC reducida. De estas, se establece que una mutación en la posición de aminoácido 238, 265, 269, 270, 327 ó 329 reduce la unión a FcRI, se establece que una mutación en la posición de aminoácido 238, 265, 269, 270, 292, 294, 295, 298, 303, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 373, 376, 414, 416, 419, 435, 438 ó 439 reduce la unión a FcRII y se establece que una mutación en la posición de aminoácido 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 293, 294, 295, 296, 301, 303, 322, 327, 329, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 416, 434, 435 ó 437 reduce la unión a FcRIII.

La patente de Estados Unidos nº 5.624.821 informa que la actividad de unión a Clq de un anticuerpo murino puede alterarse mutando el residuo de aminoácido 318, 320 ó 322 de la cadena pesada y que el residuo de sustitución 297 (Asn) produce la eliminación de actividad lítica.

La publicación de solicitud de patente de Estados Unidos nº 20040132101 describe muteínas con mutaciones en las posiciones de aminoácidos 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 299, 313, 325, 328 ó 332 (usando numeración de Kabat) o posiciones 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330 ó 332 (usando numeración de Kabat), de las cuales las mutaciones en las posiciones 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330 ó 332 pueden reducir la actividad de ADCC o reducir la unión a una receptor gamma de Fc.

Chappel y col., Proc Natl Acad Sci U S A. 1991;88(20):9036-40 informan que la actividad citofílica de IgG1 es una propiedad intrínseca de su dominio CH2 de la cadena pesada. Mutaciones puntuales individuales en cualquiera de los residuos de aminoácidos 234-237 de IgG1 redujeron o abolieron significativamente su actividad. Se requirió la sustitución de todos los residuos de IgG1 234-237 (LLGG) en IgG2 e IgG4 para restaurar la actividad de unión completa. Se observó que un anticuerpo IgG2 que contenía la secuencia entera de ELLGGP (residuos 233-238) era más activo que la IgG1 natural.

Isaacs y col., J Immunol. 1998;161(8):3862-9 informan que las mutaciones dentro de un motivo crítico para la unión de Fc gammaR (glutamato 233 a prolina, leucina/fenilalanina 234 a valina y leucina 235 a alanina) previno completamente la disminución de células diana. La mutación glutamato 318 a alanina eliminó la función efectora de IgG2b de ratón y también redujo la potencia de IgG4 humana.

Armour y col., Mol Immunol. 2003;40(9):585-93 identificaron muteínas de IgG1 que reaccionaban con el receptor activante, FcgammaRIIa, al menos 10 veces menos eficazmente que la IgG1 natural, pero cuya unión al receptor inhibidor, FcgammaRIIb, era solo cuatro veces reducida. Se hicieron mutaciones en la región de aminoácidos 233236 y/o en las posiciones de aminoácidos 327, 330 y 331. Véase también el documento WO 99/58572.

Xu y col., J Biol Chem. 1994;269(5):3469-74 informan que mutar Pro331 de IgG1 a Ser disminuyó significativamente la unión a C1q y casi eliminó la actividad lítica. A diferencia, la sustitución de Pro por Ser331 en IgG4 confirió actividad lítica parcial (40 %) a la muteína de Pro331 de IgG4.

Schuurman y col.,. Mol Immunol. 2001;38(1):1-8 informan que la mutación de una de las cisteínas de bisagra implicadas en la formación de enlaces entre cadenas pesadas, Cys226, a serina produjo un enlace entre cadenas pesadas más estable. La mutación de la secuencia bisagra de IgG4 Cys-Pro-Ser-Cys a la secuencia bisagra de IgG1 Cys-Pro-Pro-Cys también estabiliza significativamente la interacción covalente entre las cadenas pesadas.

Angal y col., Mol Immunol. 1993;30(1):105-8 informan que la mutación de la serina en la posición de aminoácido 241 en IgG4 a prolina (encontrada en esa posición en IgG1 y IgG2) condujo a la producción de un anticuerpo homogéneo, además de prolongar la semivida en suero y mejorar la distribución en tejido en comparación con la IgG4 quimérica original.

La invención también contempla la producción de moléculas de anticuerpo con estructura de hidratos de carbono alterada que produce actividad efectora alterada, que incluye moléculas de anticuerpo con fucosilación ausente o reducida que presentan actividad de ADCC mejorada. Se conocen una variedad de formas en la técnica para realizar esto. Por ejemplo, la actividad efectora de ADCC se media uniendo la molécula de anticuerpo al receptor FcγRIII, que se ha mostrado que depende de la estructura de hidratos de carbono de la glucosilación ligada en N en Asn-297 del dominio CH2. Anticuerpos no fucosilados se unen a este receptor con afinidad elevada y provocan funciones efectoras mediadas por FcγRIII más eficazmente que anticuerpos fucosilados nativos. Por ejemplo, la producción recombinante de anticuerpo no fucosilado en células CHO en las que la enzima alfa-1,6-fucosil transferasa se ha inactivado produce anticuerpo con actividad de ADCC 100 veces elevada [Yamane-Ohnuki y col., Biotechnol Bioeng. 2004 Sep 5;87(5):614-22]. Pueden llevarse a cabo efectos similares para disminuir la actividad de esta u otras enzimas en la ruta de fucosilación, por ejemplo, un tratamiento con ARNip o ARN antisentido, manipulando líneas celulares para inactivar la(s) enzima(s) o cultivando con inhibidores selectivos de la glucosilación [Rothman y col., Mol Immunol. 1989 Dec;26(12):1113-23]. Algunas cepas de células huésped, por ejemplo, línea celular Lec13 o YB2/0 de hibridoma de rata producen naturalmente anticuerpos con menores niveles de fucosilación. Shields y col., J Biol Chem. 2002 Jul 26;277(30):26733-40; Shinkawa y col., J Biol Chem. 2003 Jan 31;278(5):3466

73. También se ha determinado que un aumento en el nivel de hidrato de carbono bifurcado, por ejemplo, un anticuerpo que se produce recombinantemente en células que expresan en exceso la enzima GnTIII, aumenta la actividad de ADCC. Umana y col., Nat Biotechnol. 1999 Feb;17(2):176-80. Se ha predicho que la ausencia de solo uno de los dos residuos de fucosa puede ser suficiente para aumentar la actividad de ADCC. [Ferrara y col., J Biol Chem. 2005 Dec 5]

Otras modificaciones covalentes

Dentro del alcance de la presente invención también están incluidas modificaciones covalentes del anticuerpo. Pueden prepararse por síntesis química o por escisión enzimática o química del anticuerpo, si es aplicable. Otros tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo se introducen en la molécula haciendo reaccionar residuos de aminoácidos elegidos como diana del anticuerpo con un agente derivatizante orgánico que puede reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos del extremo N o C.

Los residuos de cisteinilo reaccionan muy comúnmente con α-haloacetatos (y aminas correspondientes), tales como ácido cloroacético o cloroacetamida, para dar derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo. Los residuos de cisteinilo también se derivatizan mediante reacción con bromotrifluoroacetona, ácido .alfa.-bromo-β-(5imidozoil)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, 2-piridildisulfuro de metilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Los residuos de histidilo se derivatizan mediante reacción con pirocarbonato de dietilo a pH 5,5-7,0 debido a que este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidilo. El bromuro de para-bromofenacilo también es útil; la reacción se realiza preferentemente en cacodilato de sodio 0,1 M a pH 6,0.

Los residuos de lisinilo y del extremo amino se hacen reaccionar con anhídrido succínico u otros anhídridos de ácido carboxílico. La derivatización con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatizar los residuos que contiene alfa.-amino incluyen imidoésteres tales como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitrobencenosulfónico, Ometilisourea, 2,4-pentanodiona y reacción catalizada por transaminasa con glioxilato.

Los residuos de arginilo se modifican mediante reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona y ninhidrina. La derivatización de residuos de arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo funcional guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina, además del grupo épsilon-amino de arginina.

La modificación específica de residuos de tirosilo puede hacerse, con interés particular en introducir marcas espectrales en residuos de tirosilo, mediante reacción con compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometano. Lo más comúnmente, N-acetilimidizol y tetranitrometano se usan para formar especies de O-acetiltirosilo y derivados de 3-nitro, respectivamente. Los residuos de tirosilo se yodan usando 125I o 131I para preparar proteínas marcadas para su uso en radioinmunoensayo.

Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican selectivamente mediante reacción con carbodiimidas (R-N.dbd.C.dbd.N-R') en las que R y R' son grupos alquilo diferentes, tales como 1-ciclohexil-3-(2morfolinil-4-etil)carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Además, los residuos de aspartilo y glutamilo se convierten en residuos de asparaginilo y glutaminilo mediante reacción con iones amonio.

Los residuos de glutaminilo y asparaginilo se desamidan frecuentemente a los residuos de glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente. Estos residuos se desamidan bajo condiciones neutras o básicas. La forma desamidada de estos residuos se encuentra dentro del alcance de la presente invención.

Otras modificaciones incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo

o treonilo, metilación de los grupos .alfa.-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pág. 79-86 (1983)), acetilación de la amina del extremo N y amidación de cualquier grupo carboxilo del extremo C.

Otro tipo de modificación covalente implica acoplar químicamente o enzimáticamente glucósidos al anticuerpo. Estos procedimientos son ventajosos porque no requieren la producción del anticuerpo en una célula huésped que tiene capacidades de glucosilación para glucosilación ligada en N u O. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, el (los) azúcar(es) puede(n) unirse a (a) arginina y histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como aquellos de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como aquellos de serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como aquellos de fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de glutamina. Estos procedimientos se describen en el documento W087/05330 publicado el 11 de septiembre 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pág. 259-306 (1981).

La eliminación de cualquier resto de hidrato de carbono presente sobre el anticuerpo puede llevarse a cabo químicamente o enzimáticamente. La desglucosilación química requiere la exposición del anticuerpo al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento produce la escisión de la mayoría o todos los azúcares, excepto el azúcar de enlace (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras que queda el anticuerpo intacto. La desglucosilación química se describe por Hakimuddin y col. Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987) y por Edge y col., Anal. Biochem., 118: 131 (1981). La escisión enzimática de restos de hidrato de carbono sobre anticuerpos puede lograrse por el uso de una variedad de endo- y exo-glucosidasas como se describe por Thotakura y col., Meth. Enzymol. 138: 350 (1987).

Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo comprende ligar el anticuerpo a uno de una variedad de polímeros

no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, polioles polioxietilados, sorbitol polioxietilado, glucosa polioxietilada, glicerol polioxietilado, polioxialquilenos, o polímeros de polisacárido tales como dextrano. Tales procedimientos se conocen en la técnica, véanse, por ejemplo las patentes de EE.UU. nº 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192, 4.179.337, 4.766.106, 4.179.337, 4.495.285, 4.609.546 o EP 315 456.

Cada molécula de anticuerpo puede unirse a una o más moléculas de polímero (es decir, 1, 2, 3, 4, 5 o más). Las moléculas de polímero se unen preferentemente a anticuerpos por moléculas ligadoras. El polímero puede ser, en general, un polímero sintético o que se produce naturalmente, por ejemplo, un polímero de polialqueno, polialquenileno o polioxialquileno opcionalmente sustituido de cadena lineal o ramificada o un polisacárido ramificado

o sin ramificar, por ejemplo, homo- o heteropolisacárido. Polímeros preferidos son polioxietilenpolioles y polietilenglicol (PEG). El PEG es soluble en agua a temperatura ambiente y tiene la fórmula general: R(O--CH2-CH2)nO--R en la que R puede ser hidrógeno, o un grupo protector tal como un grupo alquilo o alcanol. Preferentemente, el grupo protector tiene entre 1 y 8 carbonos, más preferentemente es metilo. El símbolo n es un número entero positivo, preferentemente entre 1 y 1.000, más preferentemente entre 2 y 500. El PEG tiene un peso molecular promedio preferido entre 1000 y 40.000, más preferentemente entre 2000 y 20.000, lo más preferentemente entre 3.000 y 12.000. Preferentemente, el PEG tiene al menos un grupo hidroxi, más preferentemente es un grupo hidroxi terminal. Es este grupo hidroxi el que se activa preferentemente para reaccionar con un grupo amino libre sobre el inhibidor. Sin embargo, se entenderá que pueden variarse el tipo y la cantidad de grupos reactivos para lograr un PEG/anticuerpo covalentemente conjugado de la presente invención. Polímeros preferidos, y procedimientos para unirlos a péptidos se muestran en la patente de EE.UU. nº 4.766.106; 4.179.337;

4.495. 285; y 4.609.546.

Terapia génica

La administración de un anticuerpo terapéutico a células apropiadas puede efectuarse mediante terapia génica ex vivo, in situ o in vivo usando cualquier enfoque adecuado conocido en la técnica, que incluye usar procedimientos físicos de transferencia de ADN (por ejemplo, liposomas o tratamientos químicos) o usar vectores virales (por ejemplo, adenovirus, virus adenoasociados, o un retrovirus). Por ejemplo, para terapia in vivo, un ácido nucleico que codifica el anticuerpo deseado, tanto solo como conjuntamente con un vector, liposoma o precipitado, puede inyectarse directamente en el sujeto, y en algunas realizaciones, puede inyectarse en el sitio en el que se desea la expresión del compuesto de anticuerpo. Para tratamiento ex vivo, las células del sujeto se extraen, el ácido nucleico se introduce en estas células y las células modificadas se devuelven al sujeto bien directamente o bien, por ejemplo, encapsuladas dentro de membranas porosas que se implantan en el paciente. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 4.892.538 y 5.283.187. Hay una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere o no en células cultivadas in vitro, o in vivo en las células del huésped previsto. Técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico en células de mamífero in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión de células, DEAEdextrano y precipitación con fosfato de calcio. Un vector comúnmente usado para la administración ex vivo de un ácido nucleico es un retrovirus.

Otras técnicas de transferencia de ácidos nucleicos in vivo incluyen transfección con vectores virales (tales como adenovirus, virus de herpes simple I o virus adenoasociados) y sistemas basados en lípidos. El ácido nucleico y el agente de transfección se asocian opcionalmente a una micropartícula. Agentes de transfección a modo de ejemplo incluyen co-precipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, el anfífilo de amonio cuaternario DOTMA (bromuro de (dioleoiloxipropil)trimetilamonio, comercializado como Lipofectin por GIBCO-BRL)) (Felgner y col., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417; Malone y col. (1989) Proc. Natl Acad. Sci. USA 86 6077-6081); diésteres de glutamato lipófilos con cabezas laterales de trimetilamonio (Ito y col. (1990) Biochem. Biophys. Acta 1023, 124-132); los lípidos parentales metabolizables tales como el lípido catiónico dioctadecilamido glicilespermina (DOGS, Transfectam, Promega) y dipalmitoilfosfatidil etanolamilespermina (DPPES)

(J. P. Behr (1986) Tetrahedron Lett. 27, 5861-5864; J. P. Behr y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 69826986); sales de amonio cuaternario metabolizables (DOTB, metilsulfato de N-(1-[2,3-dioleoiloxi]propil)-N,N,Ntrimetilamonio (DOTAP) (Boehringer, Mannheim), polietilenimina (PEI), ésteres de dioleoílo, ChoTB, ChoSC, DOSC) (Leventis y col. (1990) Biochim. Inter. 22, 235-241); 3beta[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol (DC-Chol), dioleoilfosfatidil etanolamina (DOPE)/3beta[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol-DC-Chol en mezclas uno a uno (Gao y col., (1991) Biochim. Biophys. Acta 1065, 8-14), espermina, espermidina, lipopoliaminas (Behr y col., Bioconjugate Chem, 1994, 5: 382-389), polilisinas lipófilas (LPLL) (Zhou y col., (1991) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18), hidróxido de [[(1,1,3,3-tetrametilbutil)cresoxi]etoxi]etil]dimetilbencilamonio (hidróxido de DEBDA) con exceso de fosfatidilcolina/colesterol (Ballas y col., (1988) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18), mezclas de bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB)/DOPE (Pinnaduwage y col., (1989) Biochim. Biophys. Acta 985, 33-37), diéster lipófilo de ácido glutámico (TMAG) con DOPE, CTAB, DEBDA, bromuro de didodecilamonio (DDAB) y estearilamina en mezcla con fosfatidiletanolamina (Rose y col., (1991) Biotechnique 10, 520-525), DDAB/DOPE (TransfectACE, GIBCO BRL), y lípidos que llevan oligogalactosa. Agentes potenciadores de la transfección a modo de ejemplo que aumentan la eficiencia de transferencia incluyen, por ejemplo, DEAE-dextrano, polibreno, péptido disruptor de lisosomas (Ohmori N I y col., Biochem Biophys Res Commun Jun. 27, 1997;235(3):726-9), proteoglicanos basados en condroitano, proteoglicanos sulfatados, polietilenimina, polilisina (Pollard H y col. J Biol Chem, 1998 273 (13):7507-11), péptido de unión a integrina CYGGRGDTP, nonasacárido de dextrano lineal, glicerol, grupos colesterilo unidos en el enlace

internucleosídico del extremo 3' de un oligonucleótido (Letsinger, R. L. 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86: (17):65536), lisofosfatida, lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina y 1-oleoil-lisofosfatidilcolina.

En algunas situaciones puede desearse administrar el ácido nucleico con un agente que dirige el vector que contiene ácido nucleico a células diana. Tales moléculas “que eligen diana” incluyen anticuerpos específicos para una proteína de la membrana superficial de la célula sobre la célula diana, o un ligando para un receptor sobre la célula diana. Si se emplean liposomas pueden usarse las proteínas que se unen a una proteína de la membrana superficial de la célula asociada a endocitosis para elegir diana y/o para facilitar la captación. Ejemplos de tales proteínas incluyen proteínas de la cápside y fragmentos de las mismas trópicos para un tipo de célula particular, anticuerpos para proteínas que experimentan internalización en el ciclo y proteínas que eligen como diana la localización intracelular y potencian la semivida intracelular. En otras realizaciones puede usarse endocitosis mediada por receptor. Tales procedimientos se describen, por ejemplo, en Wu y col., 1987 o Wagner y col., 1990. Para una revisión de los protocolos de marcado de genes y de terapia génica actualmente conocidos véase Anderson 1992. Véase también el documento WO 93/25673 y las referencias citadas en su interior. Para revisiones adicionales de tecnología de terapia génica véase Friedmann, Science, 244: 1275-1281 (1989); Anderson, Nature, suplemento al vol. 392, nº 6679, pág. 25-30 (1998); Verma, Scientific American: 68-84 (1990); y Miller, Nature, 357: 455460 (1992).

Procedimientos de selección

Otro aspecto de la presente invención se refiere a procedimientos de identificación de anticuerpos que aumentan la actividad de un EphB3 que comprenden poner en contacto un EphB3 con un anticuerpo y determinar si el anticuerpo modifica o no la actividad del EphB3. La actividad en presencia del anticuerpo de prueba se compara con la actividad en ausencia del anticuerpo de prueba. Si la actividad de la muestra que contiene el anticuerpo de prueba es mayor a la actividad en la muestra que carece del anticuerpo de prueba, el anticuerpo habrá activado o elevado la actividad. Agentes terapéuticos eficaces dependen de identificar agentes eficaces que carecen de toxicidad significativa. Los anticuerpos pueden seleccionarse para afinidad de unión mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse ensayos de desplazamiento del gel, transferencias Western, ensayo de competición radiomarcada, co-fraccionamiento por cromatografía, co-precipitación, reticulación, ELISA y similares, que se describen en, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (1999) John Wiley & Sons, NY. Además, puede emplearse Biacore® para evaluar la competición de anticuerpos (véase, por ejemplo, el Ejemplo 5 más adelante).

Para seleccionar inicialmente anticuerpos que se unen al epítope deseado sobre el antígeno diana puede realizarse un ensayo de bloqueo cruzado rutinario tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988). También pueden usarse ensayos competitivos de unión rutinarios en los que el anticuerpo desconocido se caracteriza por su capacidad para inhibir la unión de diana a un anticuerpo específico para diana de la invención. Puede usarse antígeno intacto, fragmentos del mismo tales como el dominio extracelular, o epítopes lineales. El mapeo de epítopes se describe en Champe y col., J. Biol. Chem. 270: 1388-1394 (1995).

En una variación de un ensayo de unión in vitro, la invención proporciona un procedimiento que comprende las etapas de (a) poner en contacto un EphB3 inmovilizado con un anticuerpo candidato y (b) detectar la unión del anticuerpo candidato al EphB3. En una realización alternativa, el anticuerpo candidato se inmoviliza y la unión de EphB3 se detecta. La inmovilización se lleva a cabo usando cualquiera de los procedimientos muy conocidos en la técnica, que incluyen enlace covalente a un soporte, una perla o una resina cromatográfica, además de interacción de alta afinidad no covalente tal como unión a anticuerpo, o uso de unión a estreptavidina/biotina en la que el compuesto inmovilizado incluye un resto de biotina. La detección de la unión puede llevarse a cabo (i) usando una marca radiactiva sobre el compuesto que no está inmovilizado, (ii) usando una marca fluorescente sobre el compuesto no inmovilizado, (iii) usando un anticuerpo inmunoespecífico para el compuesto no inmovilizado, (iv) usando una marca sobre el compuesto no inmovilizado que excite un soporte fluorescente con el que está unido el compuesto inmovilizado, además de otras técnicas muy conocidas y rutinariamente practicadas en la materia.

Los anticuerpos que aumentan la actividad del antígeno diana pueden identificarse incubando un anticuerpo candidato con antígeno diana (o una célula que expresa antígeno diana) y determinando el efecto del anticuerpo candidato sobre la actividad o expresión del antígeno diana. La actividad en presencia del anticuerpo de prueba se compara con la actividad en ausencia del anticuerpo de prueba. Si la actividad de la muestra que contiene el anticuerpo de prueba es mayor a la actividad en la muestra que carece del anticuerpo de prueba, el anticuerpo habrá aumentado la actividad. La selectividad de un anticuerpo que modula la actividad de un polipéptido o polinucleótido de antígeno diana puede evaluarse comparando sus efectos sobre el antígeno diana con su efecto sobre otros compuestos relacionados.

En realizaciones particulares a modo de ejemplo se contempla que los anticuerpos sean probados para su efecto en un sistema de células cultivadas para determinar su capacidad para inducir la fosforilación, oligomerización, internalización, degradación, señalización y/o adhesión célula-célula mediada por EphB3 del receptor. Adicionalmente pueden usarse ensayos celulares que incluyen ensayos de proliferación, ensayos en agar blando y/o ensayos de citotoxicidad como se describen en el presente documento para evaluar un anticuerpo para EphB3

particular.

La actividad biológica de un anticuerpo particular, o combinación de anticuerpos, puede evaluarse in vivo usando un modelo animal adecuado. Por ejemplo, pueden usarse modelos de cáncer de xenoinjerto en los que las células cancerosas humanas se introducen en animales inmunodeprimidos, tales como ratones desnudos o SCID. La eficacia puede predecirse usando ensayos que miden la inhibición de la formación tumoral, regresión tumoral o metástasis, y similares.

La invención también comprende ensayos de selección de alto rendimiento (HTS) para identificar anticuerpos que interaccionan con o inducen la actividad biológica (es decir, inducen internalización o señalización intracelular, etc.) de antígeno diana. Los ensayos de HTS permiten la selección de grandes números de compuestos de una manera eficiente. Se contemplan sistemas de HTS basados en células para investigar la interacción entre el antígeno diana y sus componentes de unión. Los ensayos de HTS se diseñan para identificar “líderes” o “compuestos cabeza de serie” que tienen la propiedad deseada, a partir de los cuales pueden diseñarse modificaciones para mejorar la propiedad deseada.

En otra realización de la invención se emplea selección de alto rendimiento para fragmentos de anticuerpos o CDR con 1, 2, 3 o más modificaciones a aminoácidos dentro de las CDR que tienen afinidad de unión adecuada por un polipéptido de antígeno diana.

Terapia de combinación

Habiendo identificado más de un anticuerpo que es eficaz en un modelo animal, puede ser adicionalmente ventajoso mezclar juntos dos o más de tales anticuerpos (que se unen a los mismos antígenos diana o diferentes) para proporcionar eficacia todavía mejorada. Las composiciones que comprenden uno o más anticuerpos pueden administrarse a personas o mamíferos que padecen, o predispuestas a sufrir, cáncer. La administración concurrente de dos agentes terapéuticos no requiere que los agentes se administren al mismo tiempo o por la misma vía, en tanto que haya un solapamiento en el periodo de tiempo durante el cual los agentes estén ejerciendo su efecto terapéutico. Se contempla administración simultánea o secuencial, ya que es administración en diferentes días o semanas.

Aunque la terapia con anticuerpos puede ser útil para todas las etapas de los cánceres, la terapia con anticuerpos puede ser particularmente apropiada en cánceres avanzados o metastásicos. Combinar el procedimiento de terapia con anticuerpos con una pauta quimioterapéutica o de radiación puede preferirse en pacientes que no han recibido tratamiento quimioterapéutico, mientras que el tratamiento con la terapia con anticuerpos puede indicarse para pacientes que han recibido una o más quimioterapias. Adicionalmente, la terapia con anticuerpos también puede permitir el uso de dosificaciones reducidas de quimioterapia concomitante, particularmente en pacientes que no toleran muy bien la toxicidad del agente quimioterapéutico.

Los procedimientos de la invención contemplan la administración de anticuerpos individuales, además de combinaciones, o “mezclas”, de diferentes anticuerpos. Tales mezclas de anticuerpos pueden tener ciertas ventajas en tanto que contengan anticuerpos que explotan diferentes mecanismos efectores o combinan directamente anticuerpos citotóxicos con anticuerpos que se basan en funcionalidad efectora inmune. Tales anticuerpos en combinación pueden presentar efectos terapéuticos sinérgicos.

Los procedimientos de la invención contemplan adicionalmente la administración de anticuerpos individuales o mezclas de anticuerpos en combinación con el tratamiento de referencia médicamente reconocido para el cáncer particular que está tratándose (por ejemplo, cáncer de pulmón, ovario, esofágico, colon o mama).

Un agente citotóxico se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de células y/o produce destrucción de células. El término está previsto que incluya isótopos radiactivos (por ejemplo, I131, I125, Y90 y Re186), agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o toxinas sintéticas, o fragmentos de las mismas. Un agente no citotóxico se refiere a una sustancia que no inhibe o previene la función de células y/o no produce destrucción de células. Un agente no citotóxico puede incluir un agente que puede activarse para ser citotóxico. Un agente no citotóxico puede incluir una perla, liposoma, matriz

o partícula (véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de EE.UU. 2003/0028071 y 2003/0032995). Tales agentes pueden conjugarse, acoplarse, ligarse o asociarse a un anticuerpo según la invención.

Los agentes quimioterapéuticos contra el cáncer incluyen, sin limitación, agentes alquilantes tales como carboplatino y cisplatino; agentes alquilantes de mostazas de nitrógeno; agentes alquilantes de nitrosourea tales como carmustina (BCNU); antimetabolitos tales como metotrexato; ácido folínico; antimetabolitos de análogos de purina, mercaptopurina; antimetabolitos de análogos de pirimidina tales como fluorouracilo (5-FU) y gemcitabina (Gemzar®); antineoplásicos hormonales tales como goserelina, leuprolida y tamoxifeno; antineoplásicos naturales tales como aldesleucina, interleucina-2, docetaxel, etopósido (VP-16), interferón alfa, paclitaxel (Taxol®) y tretinoína (ATRA); antineoplásicos naturales de antibióticos tales como bleomicina, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, daunomicina y mitomicinas que incluyen mitomicina C; y antineoplásicos naturales de alcaloides de la vinca tales

como vinblastina, vincristina, vindesina; hidroxiurea; aceglatona, adriamicina, ifosfamida, enocitabina, epitiostanol, aclarubicina, ancitabina, nimustina, clorhidrato de procarbazina, carbocuona, carboplatino, carmofur, cromomicina A3, polisacáridos antitumorales, factores plaquetarios antitumorales, ciclofosfamida (Cytoxin®), esquizofilan, citarabina (citosina arabinósido), dacarbazina, tioinosina, tiotepa, tegafur, dolastatinas, análogos de dolastatina tales como auristatina, CPT-11 (irinotecan), mitoxantrona, vinorelbina, tenipósido, aminopterina, carminomicina, esperamicinas (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.675.187), neocarzinostatina, OK-432, bleomicina, furtulon, broxuridina, busulfano, honvan, peplomicina, bestatina (Ubenimex®), interferón-�, mepitiostano, mitobronitol, melfalan, péptidos de laminina, lentinan, extracto de Coriolus versicolor, tegafur/uracilo, estramustina (estrógeno/mecloretamina).

Además, agentes adicionales usados como terapia para pacientes con cáncer incluyen EPO, G-CSF, ganciclovir; antibióticos, leuprolida; meperidina; zidovudina (AZT); interleucinas 1 a 18, que incluyen mutantes y análogos; interferones o citocinas, tales como interferones α, β y γ; hormonas, tales como hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH) y análogos y, hormona liberadora de gonadotropina (GnRH); factores de crecimiento tales como factores de crecimiento transformantes β (TGF-β), factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor liberador de hormona de crecimiento (GHRF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor homólogo a factor de crecimiento de fibroblastos (FGFHF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y factor de crecimiento de insulina (IGF); factor de necrosis tumoral α y β (TNF-α y β; factor inhibidor de la invasión 2 (IIF-2); proteínas morfogenéticas óseas 1-7 (BMP 1-7); somatostatina; timosina α-1; γ-globulina; superóxido dismutasa (SOD); factores antiangiogénesis; materiales antigénicos; y profármacos.

Profármaco se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica o no citotóxica para células tumorales en comparación con el fármaco parental y puede activarse enzimáticamente o convertirse en un forma parental activa o la más activa. Véanse, por ejemplo, Wilman, “Prodrugs in Cancer Chemotherapy” Biochemical Society Transactions, 14, pág. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) y Stella y col., “Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery”, Directed Drug Delivery, Borchardt y col., (ed.), pág. 247-267, Humana Press (1985). Los profármacos incluyen, pero no se limitan a, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos que contienen D-aminoácido, profármacos glucosilados, profármacos que contienen βlactama, opcionalmente profármacos que contienen fenoxiacetamida sustituida u opcionalmente profármacos que contienen fenilacetamida sustituida, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que pueden convertirse en el fármaco libre citotóxico más activo. Ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden derivatizarse en una forma de profármaco para su uso en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, aquellos agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente.

Administración y preparación

Los anticuerpos de la invención pueden formularse en composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo adecuado para el procedimiento de administración deseado. Vehículos adecuados incluyen cualquier material que, cuando se combina con anticuerpos, retiene la actividad deseada del anticuerpo y no es reactivo con los sistemas inmunitarios del sujeto. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, distintos vehículos farmacéuticos convencionales tales como soluciones salinas tamponadas con fosfato estériles, agua bacteriostática y similares. Puede usarse una variedad de vehículos acuosos, por ejemplo, agua, agua tamponada, solución salina al 0,4 %, glicina al 0,3 % y similares, y pueden incluir otras proteínas para estabilidad potenciada, tales como albúmina, lipoproteína, globulina, etc., sometidas a modificaciones químicas suaves o similares.

Las formulaciones terapéuticas del anticuerpo se preparan para almacenamiento mezclando el anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas. Vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros hidratos de carbono que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).

La formulación en el presente documento también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que está tratándose, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Tales moléculas están adecuadamente presentes en combinación en cantidades

que son eficaces para el fin previsto.

Los principios activos también pueden atraparse en microcápsula preparada, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsula de gelatina y microcápsula de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se desvelan en Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª edición, Osol, A. Ed. (1980).

Las formulaciones que van a usarse para administración in vivo deben ser estériles. Esto se realiza fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles.

El anticuerpo se administra por cualquier medio adecuado que incluye administración parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para tratamiento local, intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intradérmica o subcutánea. Además, el anticuerpo se administra adecuadamente por infusión pulsada, particularmente con dosis decrecientes del anticuerpo. Preferentemente, la dosificación se administra mediante inyecciones, lo más preferentemente inyecciones intravenosas o subcutáneas. Se contemplan otros procedimientos de administración, que incluyen administración tópica, particularmente transdérmica, transmucosa, rectal, oral o local, por ejemplo, mediante un catéter colocado próximo al sitio deseado.

Para administración nasal, las formulaciones farmacéuticas y medicamentos pueden ser un espray o aerosol que contiene un disolvente(s) apropiado(s) y opcionalmente otros compuestos tales como, pero no se limitan a, estabilizadores, agentes antimicrobianos, antioxidantes, modificadores del pH, tensioactivos, modificadores de la biodisponibilidad y combinaciones de estos. Un propulsor para una formulación de aerosol puede incluir aire comprimido, nitrógeno, dióxido de carbono, o un hidrocarburo basado en un disolvente de bajo punto de ebullición.

Las formas de dosificación inyectables generalmente incluyen suspensiones acuosas o suspensiones en aceite que pueden prepararse usando un agente dispersante o humectante adecuado y un agente de suspensión. Las formas inyectables pueden estar en fase de disolución o en forma de una suspensión, que se prepara con un disolvente o diluyente. Disolventes o vehículos aceptables incluyen agua esterilizada, disolución de Ringer, o una solución salina acuosa isotónica.

Para inyección, la formulación farmacéutica y/o medicamento puede ser un polvo adecuado para reconstitución con una disolución apropiada como se ha descrito anteriormente. Ejemplos de éstos incluyen, pero no se limitan a, polvos liofilizados, secados giratoriamente o secados por pulverización, polvos amorfos, gránulos, precipitados o partículas. Para inyección, las formulaciones pueden contener opcionalmente estabilizadores, modificadores del pH, tensioactivos, modificadores de la biodisponibilidad y combinaciones de estos.

Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que están en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas, o microcápsula. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (patente de EE.UU. nº 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de γ-etilo, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como Lupron Depot™ (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Aunque los polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Si los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un largo tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de exposición a humedad a 37 ºC, produciendo una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Pueden idearse estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S--S intermoleculares mediante intercambio de tio-disulfuro, puede lograrse la estabilización modificando residuos sulfhidrilo, liofilizando a partir de disoluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matriz de polímero específicas. Pueden usarse otras estrategias conocidas en la técnica.

Las formulaciones de la invención pueden diseñarse para ser de acción corta, de liberación rápida, de acción prolongada o de liberación sostenida como se describe en el presente documento. Así, las formulaciones farmacéuticas también pueden formularse para liberación controlada o para liberación lenta.

Las presentes composiciones también pueden comprender, por ejemplo, micelas o liposomas, o alguna otra forma encapsulada, o pueden administrarse en una forma de liberación prolongada para proporcionar un almacenamiento y/o efecto de administración prolongado. Por tanto, las formulaciones farmacéuticas y medicamentos pueden comprimirse en pellas o cilindros e implantarse intramuscularmente o subcutáneamente como inyecciones de liberación prolongada o como implantes tales como prótesis endovasculares. Tales implantes pueden emplear

materiales inertes conocidos tales como siliconas y polímeros biodegradables.

Además de aquellas formas de dosificación representativas descritas anteriormente, excipientes y vehículos farmacéuticamente aceptables son generalmente conocidos para aquellos expertos en la materia y así se incluyen en la presente invención. Tales excipientes y vehículos se describen, por ejemplo, en “Remington's Pharmaceutical Sciences” Mack Pub. Co., New Jersey (1991).

Pueden ajustarse dosificaciones específicas dependiendo de las condiciones de enfermedad, la edad, peso corporal, condiciones de salud general, genotipo, sexo y dieta del sujeto, intervalos de dosis, vías de administración, tasa de eliminación y combinaciones de fármacos. Cualquiera de las formas de dosificación anteriores que contienen cantidades eficaces están perfectamente dentro de los límites de la experimentación rutinaria y, por tanto, bien dentro del alcance de la presente invención.

Los anticuerpos de la invención se prepararán frecuentemente sustancialmente libres de otras inmunoglobulinas que se producen naturalmente u otras moléculas biológicas. Anticuerpos preferidos también presentarán toxicidad mínima cuando se administran a un mamífero aquejado de, o predispuesto a sufrir, cáncer.

Las composiciones de la invención pueden esterilizarse por técnicas de esterilización convencionales muy conocidas. Las disoluciones resultantes pueden envasarse para su uso o filtrarse bajo condiciones asépticas y liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con una disolución estéril antes de la administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste del pH y de tamponamiento, agentes de ajuste de la tonicidad y similares, por ejemplo, acetato sódico, lactato de sodio, cloruro sódico, cloruro de potasio, cloruro de calcio y estabilizadores (por ejemplo, 1 20 % de maltosa, etc.).

Los anticuerpos de la presente invención también pueden administrarse mediante liposomas, que son pequeñas vesículas compuestas de diversos tipos de lípidos y/o fosfolípidos y/o tensioactivo que son útiles para la administración de un fármaco (tales como los anticuerpos desvelados en el presente documento y, opcionalmente, un agente quimioterapéutico). Los liposomas incluyen emulsiones, espumas, micelas, monocapas insolubles, dispersiones de fosfolípidos, capas laminares y similares, y pueden servir de vehículos para dirigir los anticuerpos a un tejido particular, además de para aumentar la semivida de la composición. Están disponibles una variedad de procedimientos para preparar liposomas, como se describe en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 4.837.028 y

5.019.369.

Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos en la técnica, tal como se describen en Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688 (1985); Hwang y col., Proc. Natl Acad. Sci. USA

77: 4030 (1980); y las patentes de EE.UU. nº 4.485.045 y 4.544.545. Los liposomas con tiempo de circulación potenciado se desvelan en la patente de EE.UU. nº 5.013.556. Pueden generarse liposomas particularmente útiles por el procedimiento de evaporación en fase inversa con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para dar liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse con los liposomas como se describe en Martin y col., J. Biol. Chem. 257: 286288 (1982) mediante una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico (tal como doxorubicina) está opcionalmente contenido dentro del liposoma [véase, por ejemplo, Gabizon y col., J. National Cancer Inst. 81(19): 1484 (1989)].

La concentración de anticuerpo en estas composiciones puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente el 10 %, normalmente al menos aproximadamente el 25 % a hasta el 75 % o el 90 % en peso, y se seleccionará principalmente por volúmenes de fluido, viscosidades, etc., según el modo de administración particular seleccionado. Procedimientos actuales para preparar composiciones administrables por vía oral, tópicamente y parenteralmente serán conocidos o evidentes para aquellos expertos en la materia y se describen en detalle en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 19ª ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995).

La determinación de una cantidad eficaz de una composición de la invención para tratar enfermedad en un paciente puede llevarse a cabo mediante procedimientos empíricos convencionales que son muy conocidos en la técnica. Una cantidad adecuada para realizar esto se define como una “dosis terapéuticamente eficaz”. Cantidades eficaces de un anticuerpo variarán y dependerán de la gravedad de la enfermedad y el peso y estado general del paciente que está tratándose, pero generalmente oscilan de aproximadamente 1,0 μg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Dosis a modo de ejemplo pueden oscilar de aproximadamente 10 μg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, o de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, o de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg por administración. El anticuerpo también puede dosificarse por área superficial corporal (por ejemplo, hasta 4,5 g/metro cuadrado). Otras dosis a modo de ejemplo de anticuerpo incluyen hasta 8 g totales en una única administración (suponiendo un peso corporal de 80 kg o área superficial corporal de 1,8 metros cuadrados).

La administración puede ser mediante cualquier medio conocido en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo puede

administrarse por una o más administraciones en bolo separadas, o por infusión a corto o a largo plazo durante un periodo de, por ejemplo, 5, 10, 15, 30, 60, 90, 120 minutos o más. Tras un periodo de tratamiento inicial, y dependiendo de la respuesta del paciente y la tolerancia de la terapia, pueden administrarse dosis de mantenimiento, por ejemplo, semanalmente, bisemanalmente, cada 3 semanas, cada 4 semanas, mensualmente, bimensualmente, cada 3 meses, o cada 6 meses, según se necesite para mantener la respuesta del paciente. Pueden necesitarse dosificaciones más frecuentes hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de enfermedad, y pueden ajustarse dosificaciones según sea necesario. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente por técnicas y ensayos convencionales. La terapia puede ser durante un periodo definido o puede ser crónica y continuar durante un periodo de años hasta la progresión de la enfermedad o muerte.

Pueden llevarse a cabo administraciones únicas o múltiples de las composiciones con los niveles de dosis y patrón que se seleccionan por el médico práctico. Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación apropiada del anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad que va a tratarse, como se ha definido anteriormente, la gravedad y evolución de la enfermedad, si el anticuerpo se administra o no para fines preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y respuesta al anticuerpo, y el criterio del médico adjunto. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos.

En cualquier caso, las formulaciones deben proporcionar una cantidad de anticuerpo terapéutico con el tiempo que sea suficiente para ejercer la actividad biológica deseada, por ejemplo, prevenir o minimizar la gravedad del cáncer. Las composiciones de la presente invención pueden administrarse solas o como una terapia auxiliar conjuntamente con otros terapéuticos conocidos en la técnica para el tratamiento de tales enfermedades.

La composición de anticuerpo se formulará, dosificará y administrará en un modo de acuerdo con la buena práctica médica. Factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno particular que está tratándose, el mamífero particular que está tratándose, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, la programación de la administración, y otros factores conocidos para los médicos. La cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo que va a administrarse estará gobernada por tales consideraciones, y es la cantidad mínima necesaria para prevenir, mejorar o tratar la enfermedad, afección o trastorno mediado por diana. Tal cantidad es preferentemente inferior a la cantidad que es tóxica para el huésped o hace que el huésped sea significativamente más susceptible a infecciones.

El anticuerpo no necesita formularse, pero opcionalmente se formula, con uno o más agentes actualmente usados para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de tales otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de enfermedad, afección o trastorno o tratamiento, y otros factores tratados anteriormente. Éstos se usan generalmente en las mismas dosificaciones y con las vías de administración que se usan anteriormente en este documento o aproximadamente del 1 al 99 % de las dosificaciones empleadas hasta ahora.

En otra realización de la invención se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento de la afección deseada. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta. Recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringuillas y tubos de ensayo. Los recipientes pueden formarse a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es eficaz para tratar la afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de disolución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). El agente activo en la composición es el anticuerpo de la invención. La etiqueta sobre o asociada al recipiente indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. El artículo de fabricación puede comprender además un segundo recipiente que contiene un segundo agente terapéutico (incluyendo cualquiera de los segundos agentes terapéuticos para enfermedades tratadas en el presente documento o conocidas en la técnica). El artículo de fabricación puede comprender además otro recipiente que contiene un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato, disolución de Ringer o disolución de dextrosa para reconstituir una formulación de anticuerpo liofilizada. Adicionalmente puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, que incluyen otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas y prospectos con instrucciones para su uso.

Inmunoterapia

Anticuerpos útiles en el tratamiento de pacientes que tienen cánceres incluyen aquellos que son capaces de iniciar una potente respuesta inmunitaria contra el tumor y aquellos que son capaces de dirigir la citotoxicidad. Los anticuerpos conjugados con agentes citotóxicos pueden usarse para elegir como diana los agentes citotóxicos para tejidos tumorales que expresan EphB3. Alternativamente, los anticuerpos pueden provocar lisis de células por o bien mecanismos de citotoxicidad celular mediada por complemento o bien dependientes de anticuerpos (ADCC), ambos de los cuales requieren una porción Fc intacta de la molécula de inmunoglobulina para interacción con sitios de receptor de Fc de células efectoras o proteínas de complemento. Además, los anticuerpos que ejercen un efecto biológico directo sobre el crecimiento tumoral son útiles en la práctica de la invención. Los posibles mecanismos por los que tales anticuerpos directamente citotóxicos pueden actuar incluyen inhibición del crecimiento celular, modulación de la diferenciación celular, modulación de los perfiles del factor de angiogénesis tumoral e inducción de

apoptosis. El mecanismo por el que un anticuerpo particular ejerce un efecto antitumoral puede evaluarse usando cualquier número de ensayos in vitro diseñados para determinar ADCC, ADMMC, lisis de células mediada por el complemento, etc., como se conoce generalmente en la técnica.

Los anticuerpos anti-EphB3 pueden administrarse en su forma “desnuda” o sin conjugar, o pueden conjugarse directamente con otros agentes terapéuticos o de diagnóstico, o pueden conjugarse indirectamente con polímeros de vehículo que comprenden tales otros agentes terapéuticos o de diagnóstico.

Los anticuerpos pueden marcarse detectablemente mediante el uso de radioisótopos, marcas de afinidad (tales como biotina, avidina, etc.), marcas enzimáticas (tales como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, etc.) marcas fluorescentes o luminiscentes o bioluminiscentes (tales como FITC o rodamina, etc.), átomos paramagnéticos, y similares. Los procedimientos para llevar a cabo tal marcado son muy conocidos en la técnica; por ejemplo, véase (Sternberger, L.A. y col., J. Histochem. Cytochem. 18:315 (1970); Bayer, E.A. y col., Meth. Enzym. 62:308 (1979); Engval, E. y col., Immunol. 109:129 (1972); Goding, J.W. J. Immunol. Meth. 13:215 (1976)).

La conjugación de restos de anticuerpos se describe en la patente de EE.UU. nº 6.306.393. También se describen técnicas generales en Shih y col., Int. J. Cancer 41:832-839 (1988); Shih y col., Int. J. Cancer 46:1101-1106 (1990); y Shih y col., patente de EE.UU. nº 5.057.313. Este procedimiento general implica hacer reaccionar un componente de anticuerpo que tiene una porción de hidrato de carbono oxidada con un polímero portador que tiene al menos una función amina libre y que se carga con una pluralidad de fármaco, toxina, quelante, aditivos de boro u otro agente terapéutico. Esta reacción produce un enlace de base de Schiff inicial (imina) que puede estabilizarse mediante reducción a una amina secundaria para formar el conjugado final.

El polímero portador puede ser, por ejemplo, un aminodextrano o polipéptido de al menos 50 residuos de aminoácidos. En la técnica se conocen diversas técnicas para conjugar un fármaco u otro agente con el polímero portador. Puede usarse un portador de polipéptido en lugar de aminodextrano, pero el portador de polipéptido debe tener al menos 50 residuos de aminoácido en la cadena, preferentemente 100-5000 residuos de aminoácido. Al menos algunos de los aminoácidos deben ser residuos de lisina o residuos de glutamato o aspartato. Las aminas colgantes de residuos de lisina y carboxilatos colgantes de glutamina y aspartato son convenientes para unir un fármaco, toxina, inmunomodulador, quelante, aditivo de boro u otro agente terapéutico. Ejemplos de soportes de polipéptido adecuados incluyen polilisina, ácido poliglutámico, ácido poliaspártico, co-polímeros de los mismos, y polímeros mixtos de estos aminoácidos y otros, por ejemplo, serinas, para conferir propiedades de solubilidad deseable sobre el soporte cargado resultante y conjugado.

Alternativamente pueden prepararse anticuerpos conjugados conjugando directamente un componente de anticuerpo con un agente terapéutico. El procedimiento general es análogo al procedimiento indirecto de conjugación, excepto que un agente terapéutico se une directamente a un componente de anticuerpo oxidado. Por ejemplo, un resto de hidrato de carbono de un anticuerpo puede unirse a polietilenglicol para prolongar la semivida.

Alternativamente, un agente terapéutico puede unirse en la región bisagra de un componente de anticuerpo reducido mediante formación de enlaces disulfuro, o usando un reticulador heterobifuncional tal como 3-(2piridilditio)proprionato de N-succinilo (SPDP). Yu y col., Int. J. Cancer 56:244 (1994). Técnicas generales para tal conjugación son muy conocidas en la técnica. Véanse, por ejemplo, Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Reticulation (CRC Press 1991); Upeslacis y col., “Modification of Antibodies by Chemical Methods” en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch y col. (eds.), páginas 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, “Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies” en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter y col. (eds.), páginas 60-84 (Cambridge University Press 1995). En la técnica se conocen una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCl de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como toluilen-2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno).

Finalmente, pueden construirse proteínas de fusión que comprenden uno o más restos de anticuerpos anti-EphB3 y otro polipéptido. Los procedimientos de preparación de proteínas de fusión de anticuerpos son muy conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 6.306.393. Proteínas de fusión de anticuerpos que comprenden un resto de interleucina-2 se describen por Boleti y col., Ann. Oncol. 6:945 (1995), Nicolet y col., Cancer Gene Ther. 2:161 (1995), Becker y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 93:7826 (1996), Hank y col., Clin. Cancer Res. 2:1951 (1996), y Hu y col., Cancer Res. 56:4998 (1996).

Los anticuerpos de la invención pueden administrarse en su forma “desnuda” o sin conjugar, o pueden tener agentes terapéuticos conjugados con ellos. En una realización, los anticuerpos de la invención se usan como radiosensibilizador. En tales realizaciones, los anticuerpos están conjugados con un agente radiosensibilizante. El término “radiosensibilizador”, como se usa en el presente documento, se define como una molécula, preferentemente una molécula de bajo peso molecular, administrada a animales en cantidades terapéuticamente

eficaces para aumentar la sensibilidad de las células a ser radiosensibilizadas a radiación electromagnética y/o para promover el tratamiento de enfermedades que son tratables con radiación electromagnética. Enfermedades que son tratables con radiación electromagnética incluyen enfermedades neoplásicas, tumores benignos y malignos, y células cancerosas.

Los términos “radiación electromagnética” y “radiación” como se usan en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, radiación que tiene la longitud de onda de 10-20 a 100 metros. Realización preferidas de la presente invención emplean la radiación electromagnética de: radiación gamma (10-20 a 10-13 m), radiación de rayos X (10-12 a 10-9 m), luz ultravioleta (10 nm a 400 nm), luz visible (400 nm a 700 nm), radiación infrarroja (700 nm a 1,0 mm) y radiación microondas (1 mm a 30 cm).

Los radiosensibilizadores son conocidos por aumentar la sensibilidad de células cancerosas a los efectos tóxicos de la radiación electromagnética. Muchos protocolos de tratamiento del cáncer actualmente emplean radiosensibilizadores activados por la radiación electromagnética de rayos X. Ejemplos de radiosensibilizadores activados por rayos X incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: metronidazol, misonidazol, desmetilmisonidazol, pimonidazol, etanidazol, nimorazol, mitomicina C, RSU 1069, SR 4233, EO9, RB 6145, nicotinamida, 5bromodesoxiuridina (BUdR), 5-yododesoxiuridina (IUdR), bromodesoxicitidina, fluorodesoxiuridina (FUdR), hidroxiurea, cisplatino, y análogos terapéuticamente eficaces y derivados de los mismos.

La terapia fotodinámica (PDT) de cánceres emplea luz visible como activador de la radiación del agente sensibilizante. Ejemplos de radiosensibilizantes fotodinámicos incluyen los siguientes, pero no se limitan a: derivados de hematoporfirina, Photofrin(R), derivados de benzoporfirina, NPe6, etioporfirina de estaño (SnET2), feoborbida-a, bacterioclorofila-a, naftalocianinas, ftalocianinas, ftalocianina de cinc, y análogos terapéuticamente eficaces y derivados de los mismos.

En otra realización, el anticuerpo puede conjugarse con un receptor (como estreptavidina) para la utilización en la elección previa de dianas para tumores en el que el conjugado anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido de eliminación del conjugado sin unir de la circulación usando un agente de aclaramiento y luego administración de un ligando (por ejemplo, avidina) que está conjugado con un agente citotóxico (por ejemplo, un radionúclido).

La presente invención proporciona además los anticuerpos anteriormente descritos en forma detectablemente marcada. Los anticuerpos pueden marcarse detectablemente mediante el uso de radioisótopos, marcas de afinidad (tales como biotina, avidina, etc.), marcas enzimáticas (tales como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, etc.), marcas fluorescentes o luminiscentes o bioluminiscentes (tales como FITC o rodamina, etc.), átomos paramagnéticos y similares. Procedimientos para llevar a cabo tal marcado son muy conocidos en la técnica; por ejemplo, véanse (Sternberger, L.A. y col., J. Histochem. Cytochem. 18:315 (1970); Bayer, E.A. y col., Meth. Enzym.

62:308 (1979); Engval, E. y col., Immunol. 109:129 (1972); Goding, J.W. J. Immunol. Meth. 13:215 (1976)).

“Marca” se refiere a un compuesto o composición detectable que está conjugado directamente o indirectamente con el anticuerpo. La propia marca puede ser detectable por sí misma (por ejemplo, marcas de radioisótopo o marcas fluorescentes) o, en el caso de una marca enzimática, puede catalizar la alteración química de un compuesto de sustrato o composición que sea detectable. Alternativamente, la marca puede no ser detectable por sí misma, pero puede ser un elemento que está unido por otro agente que es detectable (por ejemplo, una marca de epítope o una de un par de componentes de unión tal como biotina-avidina, etc.). Así, el anticuerpo puede comprender una marca

o etiqueta que facilita su aislamiento, y procedimientos de la invención para identificar anticuerpos incluyen una etapa de aislar el anticuerpo mediante interacción con la marca o etiqueta.

Inmunoconjugados terapéuticos a modo de ejemplo comprenden el anticuerpo descrito en el presente documento conjugado con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, de planta o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado). Las proteínas de fusión se describen en más detalle más adelante.

La producción de inmunoconjugados se describe en la patente de EE.UU. nº 6.306.393. Los inmunoconjugados pueden prepararse conjugando indirectamente un agente terapéutico con un componente de anticuerpo. Técnicas generales se describen en Shih y col., Int. J. Cancer 41:832-839 (1988); Shih y col., Int. J. Cancer 46:1101-1106 (1990); y Shih y col., patente de EE.UU. nº 5.057.313. El procedimiento general implica hacer reaccionar un componente de anticuerpo que tiene una porción de hidrato de carbono oxidada con un polímero portador que tiene al menos una función amina libre y que se carga con una pluralidad de fármaco, toxina, quelante, aditivos de boro u otro agente terapéutico. Esta reacción produce un enlace de base de Schiff (imina) inicial, que puede estabilizarse mediante reducción a una amina secundaria para formar el conjugado final.

El polímero portador es preferentemente un aminodextrano o polipéptido de al menos 50 residuos de aminoácidos, aunque también pueden usarse otros portadores de polímero sustancialmente equivalentes. Preferentemente, el inmunoconjugado final es soluble en una disolución acuosa, tal como suero de mamífero, para facilitar la administración y elección eficaz de diana para su uso en terapia. Así, funciones solubilizantes sobre el polímero

portador potenciarán la solubilidad en suero del inmunoconjugado final. En particular se preferirá un aminodextrano.

El procedimiento para preparar un inmunoconjugado con un soporte de aminodextrano normalmente empieza con un polímero de dextrano, ventajosamente un dextrano de peso molecular promedio de aproximadamente 10.000

100.000. El dextrano se hace reaccionar con un agente de oxidación para afectar una oxidación controlada de una parte de sus anillos de hidrato de carbono para generar grupos aldehído. La oxidación se efectúa convenientemente con reactivos químicos glicolíticos tales como NaIO4, según procedimientos convencionales.

El dextrano oxidado se hace reaccionar entonces con una poliamina, preferentemente una diamina, y más preferentemente una mono- o polihidroxidiamina. Aminas adecuadas incluyen etilendiamina, propilendiamina u otras como polimetilendiaminas, dietilentriamina o como poliaminas, 1,3-diamino-2-hidroxipropano u otras como diaminas hidroxiladas o poliaminas, y similares. Se usa un exceso de la amina con respecto a los grupos aldehído del dextrano para garantizar conversión sustancialmente completa de las funciones aldehído en grupos de base de Schiff.

Un agente reductor, tal como NaBH4, NaBH3 CN o similares, se usa para efectuar la estabilización reductora del producto intermedio de base de Schiff resultante. El aducto resultante puede purificarse por pase a través de una columna de tamizado convencional para eliminar dextranos reticulados.

También pueden usarse otros procedimientos convencionales de derivatización de un dextrano para introducir funciones amina, por ejemplo, reacción con bromuro de cianógeno, seguido de reacción con una diamina.

El aminodextrano se hace reaccionar entonces con un derivado del fármaco particular, toxina, quelante, inmunomodulador, aditivo de boro u otro agente terapéutico que vaya a cargarse, en una forma activada, preferentemente, un derivado activado con carboxilo, preparado mediante medios convencionales, por ejemplo, usando diciclohexilcarbodiimida (DCC) o una variante soluble en agua de la misma, para formar un aducto intermedio.

Alternativamente, toxinas de polipéptido tales como proteína antiviral de hierba carmín o cadena A de ricina, y similares, pueden acoplarse a aminodextrano por condensación de glutaraldehído o haciendo reaccionar grupos carboxilo activados sobre la proteína con aminas sobre el aminodextrano.

Quelantes para radiometales o potenciadores de la resonancia magnética son muy conocidos en la técnica. Típicos son los derivados de ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) y ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA). Estos quelantes normalmente tienen grupos sobre la cadena lateral, por lo que el quelante puede unirse a un soporte. Tales grupos incluyen, por ejemplo, bencilisotiocianato, por lo que el DTPA o EDTA puede acoplarse al grupo amina de un soporte. Alternativamente, los grupos carboxilo o grupos amina sobre un quelante pueden acoplarse a un soporte por activación o antes de la derivatización y luego acoplarse, todo por medios muy conocidos.

Los aditivos de boro, tales como carboranos, puede unirse a componentes de anticuerpo mediante procedimientos convencionales. Por ejemplo, pueden prepararse carboranos con funciones carboxilo sobre cadenas laterales colgantes, como es muy conocido en la técnica. La unión de tales carboranos a un soporte, por ejemplo, aminodextrano, puede lograrse por activación de los grupos carboxilo de los carboranos y condensación con aminas sobre el soporte para producir un conjugado intermedio. Tales conjugados intermedios se unen entonces a componentes de anticuerpo para producir inmunoconjugados terapéuticamente útiles, como se describe más adelante.

Puede usarse un soporte de polipéptido en lugar de aminodextrano, pero el soporte de polipéptido debe tener al menos 50 residuos de aminoácidos en la cadena, preferentemente 100-5000 residuos de aminoácidos. Al menos algunos de los aminoácidos deben ser residuos de lisina o residuos de glutamato o aspartato. Las aminas colgantes de residuos de lisina y los carboxilatos colgantes de glutamina y aspartato son convenientes para unir un fármaco, toxina, inmunomodulador, quelante, aditivo de boro u otro agente terapéutico. Ejemplos de soportes de polipéptidos adecuados incluyen polilisina, ácido poliglutámico, ácido poliaspártico, co-polímeros de los mismos, y polímeros mixtos de estos aminoácidos y otros, por ejemplo, serinas, para conferir propiedades de solubilidad deseables sobre el soporte cargado resultante e inmunoconjugado.

La conjugación del conjugado intermedio con el componente de anticuerpo se efectúa oxidando la porción de hidrato de carbono del componente de anticuerpo y haciendo reaccionar los carbonilos del aldehído (y cetona) resultantes con grupos amina que quedan sobre el soporte después de cargarlo con un fármaco, toxina, quelante, inmunomodulador, aditivo de boro u otro agente terapéutico. Alternativamente, un conjugado intermedio puede unirse a un componente de anticuerpo oxidado mediante grupos amina que han sido introducidos en el conjugado intermedio después de cargar con el agente terapéutico. La oxidación se efectúa convenientemente tanto químicamente, por ejemplo, con NaIO4 u otro reactivo glicolítico, como enzimáticamente, por ejemplo, con neuraminidasa y galactosa oxidasa. En el caso de un soporte de aminodextrano, no todas las aminas del aminodextrano se usan normalmente para cargar un agente terapéutico. Las aminas restantes del aminodextrano condensan con el componente de anticuerpo oxidado para formar aductos de bases de Schiff, que luego se

estabilizan reductoramente, normalmente con un agente reductor de borohidruro.

Se usan procedimientos análogos para producir otros inmunoconjugados según la invención. Los soportes de polipéptidos cargados tienen preferentemente residuos de lisina libres que quedan para la condensación con la porción de hidrato de carbono oxidada de un componente de anticuerpo. Los carboxilos sobre el soporte de polipéptido pueden convertirse, si fuera necesario, en aminas por, por ejemplo, activación con DCC y reacción con un exceso de una diamina.

El inmunoconjugado final se purifica usando técnicas convencionales, tales como cromatografía de tamizado sobre Sephacryl S-300 o cromatografía de afinidad usando uno o más epítopes de CD84Hy.

Alternativamente, los inmunoconjugados pueden prepararse conjugando directamente un componente de anticuerpo con un agente terapéutico. El procedimiento general es análogo al procedimiento indirecto de conjugación, excepto que un agente terapéutico se une directamente a un componente de anticuerpo oxidado.

Se apreciará que otros agentes terapéuticos pueden sustituirse por los quelantes descritos en el presente documento. Aquellos expertos en la materia podrán idear esquemas de conjugación sin excesiva experimentación.

Como otra ilustración, un agente terapéutico puede unirse en la región bisagra de un componente de anticuerpo reducido mediante formación de enlaces disulfuro. Por ejemplo, pueden construirse péptidos de toxoide tetánico con un único residuo de cisteína que se usa para unir el péptido a un componente de anticuerpo. Como alternativa, tales péptidos pueden unirse al componente de anticuerpo usando un reticulante heterobifuncional, tal como 3-(2piridilditio)proprionato de N-succinilo (SPDP). Yu y col., Int. J. Cancer, 56:244 (1994). Técnicas generales para tal conjugación son muy conocidas en la técnica. Véanse, por ejemplo, Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Reticulation (CRC Press 1991); Upeslacis y col., “Modification of Antibodies by Chemical Methods” en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch y col. (eds.), páginas 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, “Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies” en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter y col. (eds.), páginas 60-84 (Cambridge University Press 1995).

Los conjugados del anticuerpo y agente citotóxico se preparan usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCl de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis(pazidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como toluilen-2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse como se describe en Vitetta y col., Science 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminapentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante para conjugación del radionúclido al anticuerpo (véase, por ejemplo, el documento WO94/11026).

Como se ha descrito anteriormente, pueden usarse restos de hidrato de carbono en la región Fc de un anticuerpo para conjugar un agente terapéutico. Sin embargo, la región Fc puede estar ausente si un fragmento de anticuerpo se usa como componente de anticuerpo del inmunoconjugado. Sin embargo, es posible introducir un resto de hidrato de carbono en la región variable de la cadena ligera de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Véase, por ejemplo, Leung y col., J. Immunol. 154:5919 (1995); Hansen y col., patente de EE.UU. nº 5.443.953. El resto de hidrato de carbono manipulado se usa entonces para unir un agente terapéutico.

Además, aquellos expertos en la materia reconocerán numerosas variaciones posibles de los procedimientos de conjugación. Por ejemplo, el resto de hidrato de carbono puede usarse para unir polietilenglicol con el fin de prolongar la semivida de un anticuerpo intacto, o fragmento de unión a antígeno del mismo, en sangre, linfa u otros fluidos extracelulares. Además, es posible construir un “inmunoconjugado divalente” uniendo agentes terapéuticos a un resto de hidrato de carbono y a un grupo sulfhidrilo libre. Un grupo sulfhidrilo libre tal puede localizarse en la región bisagra del componente de anticuerpo.

Proteínas de fusión de anticuerpos

La presente invención contempla el uso de proteínas de fusión que comprenden uno o más restos de anticuerpo y otro polipéptido, tal como un inmunomodulador o resto de toxina. Los procedimientos de preparación de proteínas de fusión de anticuerpos son muy conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 6.306.393. Las proteínas de fusión de anticuerpos que comprenden un resto de interleucina-2 se describen por Boleti y col., Ann. Oncol. 6:945 (1995), Nicolet y col., Cancer Gene Ther. 2:161 (1995), Becker y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 93:7826 (1996), Hank y col., Clin. Cancer Res. 2:1951 (1996) y Hu y col., Cancer Res. 56:4998 (1996). Además, Yang y col., Hum. Antibodies Hybridomas 6:129 (1995), describen una proteína de fusión que incluye un fragmento F(ab')2 y un resto de factor de necrosis tumoral alfa.

Los procedimientos de preparación de proteínas de fusión de anticuerpo-toxina en los que una molécula

recombinante comprende uno o más componentes de anticuerpo y una toxina o agente quimioterapéutico también son conocidos para aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, se han descrito proteínas de fusión de anticuerpoexotoxina A de Pseudomonas por Chaudhary y col., Nature 339:394 (1989), Brinkmann y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:8616 (1991), Batra y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:5867 (1992), Friedman y col., J. Immunol. 150:3054 (1993),Wels y col., Int. J. Can. 60:137 (1995), Fominaya y col., J. Biol. Chem. 271:10560 (1996), Kuan y col., Biochemistry 35:2872 (1996) y Schmidt y col., Int. J. Can. 65:538 (1996). Se han descrito proteínas de fusión de anticuerpo-toxina que contienen un resto de toxina diftérica por Kreitman y col., Leukemia 7:553 (1993), Nicholls y col., J. Biol. Chem. 268:5302 (1993), Thompson y col., J. Biol. Chem. 270:28037 (1995) y Vallera y col., Blood 88:2342 (1996). Deonarain y col., Tumor Targeting 1:177 (1995), han descrito una proteína de fusión de anticuerpotoxina que tiene un resto de RNasa, mientras que Linardou y col., Cell Biophys. 24-25:243 (1994), produjeron una proteína de fusión de anticuerpo-toxina que comprendía un componente de DNasa I. La gelonina se usó como resto de toxina en la proteína de fusión de anticuerpo-toxina de Wang y col., Abstracts of the 209th ACS National Meeting, Anaheim, Calif., 2-6 de abril de 1995, Parte 1, BIOT005. Como otro ejemplo, Dohlsten y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91:8945 (1994), informaron de una proteína de fusión de anticuerpo-toxina que comprendía enterotoxina-A estafilocócica.

Toxinas ilustrativas que se emplean adecuadamente en la preparación de tales conjugados son ricina, abrina, ribonucleasa, DNasa I, enterotoxina-A estafilocócica, proteína antiviral de hierba carmín, gelonina, toxina diftérica, exotoxina de Pseudomonas y endotoxina de Pseudomonas. Véase, por ejemplo, Pastan y col., Cell 47:641 (1986), y Goldenberg, CA--A Cancer Journal for Clinicians 44:43 (1994). Otras toxinas adecuadas son conocidas para aquellos expertos en la materia.

Los anticuerpos de la presente invención también pueden usarse en ADEPT conjugando el anticuerpo con una enzima activadora de profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico de peptidilo, véase el documento WO81/01145) en un fármaco anticancerígeno activo. Véanse, por ejemplo, el documento WO88/07378 y la patente de EE.UU. nº 4.975.278.

El componente de enzima del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un profármaco de tal forma que se convierta en su forma citotóxica más activa.

Enzimas que son útiles en el procedimiento de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina útil para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina desaminasa útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco anticancerígeno, 5-fluorouracilo; proteasas tales como proteasa de serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L), que son útiles para convertir profármacos que contienen péptido en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes de D-aminoácido; enzimas que escinden hidratos de carbono tales como β-galactosidasa y neuraminidasa útiles para convertir profármacos glucosilados en fármacos libres; β-lactamasa útil para convertir fármacos derivatizados con β-lactamas en fármacos libres; y penicilina amidasas, tales como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útiles para convertir fármacos derivatizados en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, pueden usarse anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como abzimas, para convertir los profármacos de la invención en fármacos activos libres (véase, por ejemplo, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Los conjugados de anticuerpo-abzima pueden prepararse como se describe en el presente documento para la administración de la abzima a una población de células tumorales.

Las enzimas de la presente invención pueden unirse covalentemente a los anticuerpos por técnicas muy conocidas en la técnica tales como el uso de los reactivos de reticulación heterobifuncionales tratados anteriormente. Alternativamente, pueden construirse proteínas de fusión que comprenden al menos la región de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención ligada a al menos una porción funcionalmente activa de una enzima de la invención usando técnicas de ADN recombinante muy conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Neuberger y col., Nature

312: 604-608 (1984)).

Usos no terapéuticos

Los anticuerpos de la invención pueden usarse como agentes de purificación por afinidad para antígeno diana o en ensayos de diagnóstico para antígeno diana, por ejemplo, detectando su expresión en células específicas, tejidos o suero. Los anticuerpos también pueden usarse para ensayos de diagnóstico in vivo. Generalmente, para estos fines el anticuerpo se marca con un radionúclido (tal como 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P o 35S) de manera que el tumor pueda localizarse usando inmunoescintografía.

Los anticuerpos de la presente invención pueden emplearse en cualquier procedimiento de ensayo conocido, tal como ensayos de unión competitiva, ensayos de sándwich directos e indirectos tales como ELISA, y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pág. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987). Los anticuerpos también pueden usarse para inmunohistoquímica, para marcar muestras de tumor usando procedimientos conocidos en la técnica.

Por razones de conveniencia, el anticuerpo de la presente invención puede proporcionarse en un kit, es decir, una combinación envasada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar el ensayo de diagnóstico. Si el anticuerpo se marca con una enzima, el kit incluirá sustratos y cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un sustrato precursor que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable). Además, pueden incluirse otros aditivos tales como estabilizadores, tampones (por ejemplo, un tampón de bloqueo o tampón de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variarse ampliamente para proporcionar concentraciones en disolución de los reactivos que optimicen sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos pueden proporcionarse como polvos secos, normalmente liofilizados, que incluyen excipientes que tras la disolución proporcionarán una disolución de reactivo que tiene la concentración apropiada.

EJEMPLOS

La invención se ilustra por los siguientes ejemplos, que no pretenden ser de ningún modo limitantes.

EJEMPLO 1

PREPARACIÓN DE DOMINIO EXTRACELULAR (DEC) DE EPHB3

Para la expresión recombinante del DEC de EphB3, un enfoque de PCR anidada se realizó primero para incorporar marcas y para manipular los extremos de la región codificante en preparación para la incorporación en un vector de expresión. Los cebadores usados fueron del siguiente modo (todos se escriben como secuencias de 5' a 3'):

Directo nº 1:

TCGTATACATTTCTTACATCTATGCGCTGGAAGAGACCCTCATGGACACAAA (SEQ ID NO: 422)

Directo nº 2:

Inverso nº 1:

CGGGTCGTCGAGGTCCTCGTCGAAGGGCCTCGTGTAGTGGTAGTGGTAGTGCCT (SEQ ID NO: 424) Inverso nº 2:

La amplificación por PCR se llevó a cabo usando PfuUltra ™ Hotstart PCR Master Mix (Stratagene) según recomendación del fabricante. El molde usado para la amplificación fue un fragmento de DEC de EphB3 clonado en pDONOR201. El producto de PCR del DEC se clonó en pBlueBac4.5GW usando la estrategia de clonación de topoisomerasa. Los clones seleccionados finales se confirmaron por secuenciación bicatenaria. Se prepararon 10-20 μg de ADN que representan cada clon para la transfección de insectos.

Las construcciones recombinantes se usaron para expresar el DEC de EphB3 en células de insecto del siguiente modo. Se aisló baculovirus por purificación en placa de una co-transfección de ADN de plásmido que codifica el dominio extracelular de EphB3 con ADN genómico de Autographa californica Sapphire™. El virus recombinante se amplificó y se usó para infectar células de insecto Tn5 a densidades que oscilan de 1 - 1,5 x 106 células por ml, intervalo de multiplicidad de infección (moi) de 2-10 en un biorreactor de ondas de 10 l (volumen de trabajo). Tras 48 horas de infección, las células y el sobrenadante se recogieron y se centrifugaron, y el sobrenadante se preparó para concentración. El sobrenadante se clarificó sobre un cartucho de fibra hueca de 0,45 μm antes de 8x concentración con una membrana de corte de 10 kDa de MW de flujo tangencial. Antes de la purificación de proteína, el sobrenadante se esterilizó por filtración con un matraz a vacío de 0,2 um de poro de 1 l.

El DEC de EphB3 se purificó del siguiente modo. El sobrenadante de cultivo de células de insecto que contenía DEC de EphB3 se pasó a una velocidad de flujo de 13 ml/min sobre una columna quelante de Ni de 25 ml (número de catálogo de G.E. resin 17-5318-03) equilibrada en tampón A (PBS / NaCl 0,35 M / imidazol 5 mM). La proteína unida

que contenía DEC de EphB3 se eluyó usando un gradiente de 30 volúmenes de columna de tampón A a tampón B (PBS / NaCl 0,35 M / imidazol 250 mM). Las fracciones se examinaron por SDS-PAGE, y se reunieron aquellas que contenían DEC de EphB3 a la pureza deseada. El conjunto se dializó frente a tampón A y se pasó sobre columnas HisTrap (G.E.) de 2 x 5 ml. Las columnas HisTrap se eluyeron del mismo modo que la primera columna quelante de Ni. Las fracciones se examinaron por SDS-PAGE, y se reunieron aquellas que contenían proteína de DEC de EphB3 a la pureza deseada. El conjunto final se dializó frente a PBS / arginina 0,1 M. El material final se analizó para identidad y pureza por secuenciación del extremo N, además de SDS-PAGE reducida y no reducida (tinción con Coomassie y análisis Western).

EJEMPLO 2

IDENTIFICACIÓN DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS PARA DIANA SECRETADOS POR HIBRIDOMAS MURINOS

El inmunogén usado para la generación de hibridomas fue una forma recombinante del dominio extracelular (DEC) (correspondiente a los aminoácidos 37 - 558 de SEC ID Nº: 2) de EphB3 humano, que se generó usando el sistema de expresión en baculovirus / célula de insecto. Para las inmunizaciones, el DEC se mezcló con un volumen igual de adyuvante, y la mezcla se inyectó subcutáneamente sobre la superficie ventral de las almohadillas de las extremidades traseras. Los ratones se inyectaron con el inmunogén cada 3 - 14 días según diversos programas de inmunización, para producir una fuerte respuesta inmunitaria. Entonces se sacrificaron los ratones que mostraban una buena respuesta inmunitaria, se recogieron los ganglios linfáticos y se recogieron los linfocitos B en los ganglios linfáticos. Entonces, los linfocitos B se fusionaron con células de mieloma para producir hibridomas según técnicas muy conocidas en la técnica, y los hibridomas se seleccionaron para aquellos anticuerpos productores que reconocen proteína EphB3 en ensayos de ELISA y FACS.

EJEMPLO 3

IDENTIFICACIÓN DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS PARA DIANA POR EXPRESIÓN EN FAGO

Selección de anticuerpos

Para aislar un panel de anticuerpos anti-EphB3 con actividad agonista se seleccionó una biblioteca de expresión en fago Omniclonal (Buechler y col., número de patente 6057098) que se había generado a partir de ratones hiperinmunizados con el dominio extracelular (DEC) de EphB3.

Colonias individuales, obtenidas de la biblioteca Omniclonal según el protocolo en la patente de EE.UU. nº 6.057.098, se seleccionaron para actividad de unión en un ensayo de ELISA. Brevemente, los microcultivos se cultivaron a una DO600=0,6 en cuyo momento se indujo la expresión de fragmento de anticuerpo soluble mediante la adición de 0,2 % en peso/volumen de arabinosa, seguido de cultivo durante la noche en una estufa de incubación con agitación a 30 ºC. Las bacterias se centrifugaron y se preparó extracto periplásmico y se usó para detectar actividad de unión de anticuerpo a DEC de EphB3 inmovilizado sobre microplacas Nunc MaxiSorp™ siguiendo el protocolo de ELISA convencional proporcionado por el fabricante de las microplacas. La unión a anticuerpo también se evaluó midiendo la unión a células que expresan CHO-K1-EphB3 usando análisis de citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS).

Conversión de candidatos a anticuerpo identificados por expresión en fago en IgG completa

Para convertir los ligandos candidatos cabeza de serie de la selección inicial en anticuerpos que comprenden regiones constantes de la cadena pesada y ligera de anticuerpo, las secuencias codificantes para las regiones variables de tanto las cadenas pesadas como ligeras de ligandos se clonaron en un vector de expresión de mamífero del propietario (documento WO 2004/033693) que codificaba los genes de la región constate kappa (κ) y gamma-1 (γ1).

Los anticuerpos se expresaron transitoriamente en células 293E como se describe en Handa y col. (2004, póster nº 1937 de la American Society of Cancer Biology). El sobrenadante de células transfectadas se recogió en el día 6 de cultivo y la IgG se purificó usando proteína A-Sepharose (GE Healthcare) siguiendo el protocolo del fabricante.

EJEMPLO 4

DETERMINACIÓN DE LA AFINIDAD DE ANTICUERPOS ANTI-EPHB3 SELECCIONADOS

Protocolo 1:

Se inmovilizó proteína A sobre chips biosensores CM5 mediante acoplamiento de amina. Anticuerpos anti-EphB3, a 0,75 μg/ml, se diluyeron 1:100 en tampón HBS-EP (HEPES 0,1 M pH7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, 0,005 % tensioactivo P20) y se capturaron sobre la superficie del biosensor modificada durante 1,5 minutos. El DEC (dominio

extracelular) de EphB3 soluble recombinante circuló sobre el superficie del biosensor a concentraciones variables en tampón HBS-EP. Las constantes cinéticas y de afinidad se determinaron usando una combinación del software Scrubber y BiaEvaluation con un ajuste 1:1 de modelo de interacción/global.

Protocolo 2:

Se inmovilizó anti-Fc de ratón de rata (RamFc) sobre chips biosensores CM5 mediante acoplamiento de amina. Anticuerpos anti-EphB3, a 0,75 μg/ml, se diluyeron 1:200 en tampón HBS-EP y se capturaron sobre la superficie del biosensor modificada durante 1,5 minutos. El DEC de EphB3 soluble recombinante circuló sobre el superficie del biosensor a concentraciones variables en tampón HBS-EP. Las constantes cinéticas y de afinidad se determinaron usando una combinación del software Scrubber y BiaEvaluation con un ajuste 1:1 de modelo de interacción/global.

Los resultados de los experimentos de afinidad se explican a continuación en la Tabla 3.

Tabla 3.

Anticuerpo: Ka (M-1 sec-1) Kd (sec-1) KD (nM)

XHA.05.337: 3.53e4 2.79e-3 79

XHA.05.228: 2.15e4 4.52e-3 210

XHA.05.200: 4.86e4 1.39e-3 28.6

XHA.05.111*: 2.14e5 1.21e-2 57

XHA.05.885*: 1.39e5 1.19e-3 8.5

XPA.04.001: 2.15e5 3.19e-4 1.5

XPA.04.019: 1.18e5 7.20e-4 6.1

XPA.04.013: 1.16e5 3.88e-4 3.4

XPA.04.018: 1.49e5 2.34e-4 1.6

XPA.04.048: 2.66e5 1.60e-4 0.6

* XHA.05.111 y XHA.05.885 se analizaron con el format RamFc

EJEMPLO 5

AGRUPAMIENTO DE EPÍTOPES DE ANTICUERPOS PARA EPHB3

Los anticuerpos anti-EphB3 se asignaron a agrupaciones de epítopes por una estrategia de ensayo de competición en serie usando tecnologías de resonancia de plasmones superficiales (SPR). En este enfoque, un anticuerpo se inmovilizó sobre un chip sensor, tanto directamente como mediante un agente de captura, y se dejó que se uniera al ligando (DEC de EphB3) a medida que se inyectaba sobre el anticuerpo inmovilizado. Posteriormente se inyectó un segundo anticuerpo de prueba, y se determinó su capacidad para unirse al ligando capturado por el primer anticuerpo. Si los anticuerpos se unen a epítopes espacialmente separados sobre el ligando, el segundo anticuerpo también debe poder unirse al complejo de ligando/primer anticuerpo. La capacidad de dos anticuerpos diferentes para unirse simultáneamente a la misma molécula de ligando se denomina apareamiento.

1. La primera serie de experimentos utilizó un chip sensor CM5 recubierto con una alta densidad de anticuerpo específico de conejo anti-Fc de ratón (RAM-Fc) sobre todas las celdas de flujo.

a.: El tampón de electroforesis fue HBS-EP (Biacore®, Inc.), la temperatura se fijó a 25 ºC y la velocidad de flujo fue 10 μl/min.

b.: Se capturó un anticuerpo diferente sobre cada celda de flujo inyectando una dilución de 1-10 μg/ml durante 1-3 minutos produciendo un nivel de captura de 200-1000 UR.

c.: La superficie se bloqueó entonces inyectando 100 μg/ml de IgG de ratón en HBS-EP durante 30 minutos.

d.: El anticuerpo que iba a probarse para apareamiento se inyectó a 1 μg/ml para verificar que el chip se había bloqueado eficazmente y para determinar el nivel de unión de referencia del anticuerpo.

e.: El ligando se inyectó a 2-10 μg/ml durante 2-4 minutos.

f.: El anticuerpo que iba a aparearse se inyectó de nuevo como en la etapa 1d anterior. Si el anticuerpo se unió durante esta inyección, los dos anticuerpos forman un par, y por tanto se colocan en agrupaciones de epítopes separadas. Si el segundo anticuerpo no se unió, compite con el primer anticuerpo por la unión, y se colocan en los mismos conjuntos de epítopes, o solapantes.

g.: Como control para el autoapareamiento, cada uno de los anticuerpos capturados se probó para apareamiento consigo mismo.

2. Una vez se habían elucidado varias agrupaciones de epítopes, o conjuntos únicos de anticuerpos que no se

5 aparearon, aquellos anticuerpos se usaron para investigar posteriormente más los anticuerpos. Se usaron cuatro anticuerpos de uno en uno para interrogar anticuerpos de una manera en serie. Se interrogó un mayor conjunto de muestras capturando un anticuerpo de hibridoma de una agrupación de epítopes diferente sobre cada una de las cuatro celdas de flujo, seguido de realizar el protocolo de apareamiento anteriormente descrito a través de las cuatro a la vez.

3. Este procedimiento también se usó para evaluar los fragmentos Fab de anticuerpo humano, con la modificación de que no se usó la etapa de bloqueo usando los 100 μg/ml de IgG de ratón, ya que la superficie de RAM-Fc no captura los Fab humanos.

15 Como resultado de los experimentos de competición se definieron los agrupamientos de epítopes mostrados en la Tabla 4. Todos los anticuerpos con la mayor afinidad de unión (véase el Ejemplo 4 anteriormente) están en AGRUPAMIENTO 3.

Tabla 4. Agrupamientos de epítopes de datos de emparejamiento de Biacore® 2000.

AGRUPAM IENTO 1: AGRUPAM IENTO 2 AGRUPAMI ENTO 3 AGRUPAMI ENTO 4 AGRUPAMI ENTO 5 AGRUPAMI ENTO 6 AGRUPAMI ENTO 7 AGRUPAMI ENTO 8

XHA. 05.465: XHA. 05.119 XHA. 05.964 XHA. 05.660 XHA. 05.676 XHA. 05.030 XHA. 05.200 XHA. 05.111

XHA. 05.783: XHA. 05.228 XHA. 05.653 XHA. 05.552 XHA. 05.005

XHA. 05.031: XHA. 05.337 XHA. 05.885 XHA. 05.949 XHA. 05.001

XHA. 05.942: XHA. 05.440 XPA. 04.001 XHA. 05.151 XHA. 05.888

XHA. 05.751: XPA. 04.022 XPA. 04.013 XPA. 04.019

XHA. 05.599: XPA. 04.018

XPA. 04.031: XPA. 04.036

XPA. 04.030: XPA. 04.046

XPA. 04.040: XPA. 04.048

EJEMPLO 6

SELECCIÓN DE ANTICUERPOS PARA EPHB3 AGONISTAS USANDO ENSAYOS BASADOS EN CITOMETRÍA DE FLUJO Y DETECCIÓN DE FOSFORILACIÓN Y DEGRADACIÓN DE EPHB3

Para identificar anticuerpos agonistas elegidos como diana por EphB3 se desarrollaron dos ensayos basados en

55 citometría de flujo (FACS) para monitorizar efectos aguas abajo de la activación del receptor: (1) fosfotirosina celular total (pY) como medida de activación de rutas de señalización; y (2) internalización de receptores, para medir la regulación por disminución de receptor activado.

Fosforilación de tirosina celular total

El ensayo de pY celular total empleó una línea de células CHO establemente transfectadas adaptadas a la suspensión que expresa altos niveles del receptor. Este ensayo se usó para seleccionar sobrenadantes de hibridoma, anticuerpos derivados de hibridomas purificados y anticuerpos derivados de expresión en fago reformateados por IgG completa purificada.

65 Células CHO-K1 adaptadas a la suspensión que expresan en exceso EphB3 se sembraron en una placa de 96

pocillos de fondo redondo a 2 x 105 células/pocillo. El anticuerpo contra EphB3 se diluyó entonces a 1:10 directamente en cada pocillo de muestra. Las muestras se incubaron durante 40-45 minutos a 37 ºC. Después de la incubación, las células se fijaron con 2 % de formaldehído durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron entonces 2X con tampón de permeabilización y se resuspendieron en tampón de permeabilización que contenía anticuerpo de ratón anti-fosfotirosina conjugada con PE (PY20). Las células se incubaron durante 1 hora a 4 ºC, se lavaron 2X con tampón de permeabilización y se analizaron por citometría de flujo.

Aproximadamente el 24 % de los anticuerpos probados mostraron actividad agonista en el ensayo de pY. Entonces se realizó inmunoprecipitación seguida de análisis de Western (véase más adelante) sobre lisados de células tratadas con anticuerpo (líneas de células CHO y tumorales que expresan en exceso EphB3), y los datos confirmaron que los anticuerpos inductores de pY desencadenaron la fosforilación de EphB3.

Ensayo para determinar niveles en estado estacionario de EphB3 sobre la superficie celular

Los principales candidatos identificados usando el ensayo de pY celular total se caracterizaron adicionalmente para regulación por disminución y degradación de EphB3 de la superficie celular. Los estudios de competición por epítope se realizaron primero usando FACS y Biacore® para identificar anticuerpos de “detección” positiva para FACS fuerte que mostraron competición mínima con los principales anticuerpos inductores de pY. Estos anticuerpos se emplearon para desarrollar un ensayo basado en FACS que monitoriza los niveles de EphB3 de la superficie celular 2 a 72 horas después de la adición de anticuerpos inductores de pY.

Células SW620 adaptadas a la suspensión se cultivaron durante 2-72 horas con anticuerpos anti-EphB3 o proteína de ligando recombinante a 10 μg/ml. En cada momento de tiempo, los niveles de la superficie celular de EphB3 se determinaron por análisis de citometría de flujo, usando tanto un anticuerpo de detección anti-diana de ratón derivado de hibridoma (para células tratadas con anticuerpos humanos quiméricos) como un anticuerpo de detección anti-diana humana quimérico (para células tratadas con anticuerpos derivados de hibridomas). Aunque la selección se hizo para seleccionar anticuerpos de detección que mostraban competición mínima con los anticuerpos de tratamiento para la unión a EphB3, en la mayoría de los casos hubo bajos niveles de interferencia (10-20 %). La máxima unión del anticuerpo de detección se determinó para cada anticuerpo de tratamiento usando condiciones en las que células SW620 frescas se pre-incubaron brevemente con anticuerpo de tratamiento antes de la tinción con anticuerpo de detección.

Un subconjunto de los anticuerpos mostró una espectacular regulación por disminución de receptor de la superficie celular durante 2 horas que se mantuvo hasta 72 horas (véase, por ejemplo, la Figura 1).

IP-Western para la detección de fosforilación de la diana:

Se cultivaron líneas celulares humanas que expresan EphB3 a subconfluencia, se incubaron en medio libre de suero durante 30 minutos y luego se trataron con ligando o anticuerpo agonista a diversas concentraciones (0,2 - 10 ug/ml) durante 30 minutos a 37 ºC. Las células se lavaron con PBS y se lisaron en solución salina tamponada con Tris que contenía 1 % de Triton X-100 y 0,1 % de SDS en presencia de inhibidores de proteasa (Roche Complete Mini, comprimidos de mezcla de inhibidores de proteasa sin EDTA usados según instrucciones del fabricante) e inhibidores de fosfatasa (mezclas de inhibidores de fosfatasa Sigma 1 y 2, usadas según recomendaciones del fabricante). La diana se inmunoprecipitó a partir de � 800 μg de lisado clarificado usando un anticuerpo específico anti-EphB3, se resolvió por SDS-PAGE, se transfirió a nitrocelulosa y se sometió a análisis de transferencia Western con un anticuerpo anti-fosfotirosina (4G10, Upstate). La transferencia se quitó y se volvió a sondar con un anticuerpo específico anti-EphB3 para determinar la carga de proteína. Como se muestra en la Figura 2, los mAb anti-EphB3 desencadenan la fosforilación de EphB3 en células SW620. Como se muestra en la Figura 3, los anticuerpos anti-EphB3 inducen la fosforilación de EphB3 a una baja (0,2 μg/ml) concentración de anticuerpo.

Transferencia Western para confirmar la degradación de la diana:

Se dejaron sin tratar líneas celulares humanas que expresan EphB3 o se trataron con 10 μg/ml de ligando o Ab agonistas durante diversos periodos de tiempo (2 - 72 h) en medio completo. El ligando o anticuerpo se administró una vez al inicio del experimento. En los momentos de tiempo elegidos, las células se lavaron con PBS y se lisaron en solución salina tamponada con Tris que contenía 1 % de Triton X-100 y 0,1 % de SDS en presencia de inhibidores de proteasa (Roche Complete Mini, comprimidos de mezcla de inhibidores de proteasa sin EDTA usados según instrucciones del fabricante) e inhibidores de fosfatasa (mezclas de inhibidores de fosfatasa Sigma 1 y 2, usadas según recomendaciones del fabricante). Después de la clarificación por centrifugación a 14.000 rpm durante 10 minutos a 4 ºC, 40 μg de lisado se fraccionaron con SDS-PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa y se sometieron a análisis de transferencia Western con un anticuerpo específico anti-EphB3. Se visualizó -tubulina como control de carga. Las dianas se detectaron por quimioluminiscencia potenciada y autorradiografía. Como se muestra en la Figura 4, los mAb anti-EphB3 inducen degradación, no solo internalización, de EphB3. Como se muestra en la Figura 5, un subconjunto de mAb redujo EphB3 durante al menos 72 horas. Finalmente, como se muestra en la Figura 6, múltiples líneas celulares responden a un agonista mAb fosforilando Eph3.

Un resumen de anticuerpos seleccionados con respecto a los ensayos anteriormente mencionados se expone en la siguiente Tabla 5:

Tabla 5

Anticuerpo:: MFI: pY total (veces de aumento): EphB3 Estado de equilibrio (% de reducción): Agrupamiento:

XPA.04.048: 611 1.7 47.2 3

XPA.04.018: 1610 1.7 46.4 3

XPA.04.01: 1171 1.6 46.9 3

XPA.04.013: 1283 1.6 49.8 3

XHA.05.337: 559 2.8 71.7 2

XHA.05.200: 942 1.5 70.4 7

XHA.05.111: 1110 1.5 69.4 8

XHA.05.005: 1280 1.6 67.1 7

XHA.05.228: 666 3.3 66.8 2

XHA.05.030: 500 2 52 6

XHA.05.964: 800 1.5 48.6 3

XHA.05.885: 1200 1.8 56.4 3

EJEMPLO 7

HUMANIZACIÓN DE ANTICUERPOS MURINOS

Este ejemplo expone un procedimiento para la humanización de un anticuerpo anti-EphB3 murino.

Diseño de genes para cadenas ligeras y pesadas de XPA.04.001, XPA.04.013, XPA.04.018, XPA.04.048 humanizadas

Las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera y de la cadena pesada para anticuerpos XPA.04.001, XPA.04.013, XPA.04.018 y XPA.04.048 murinos se exponen en la Figura 7. La secuencia de un anticuerpo humano identificado usando la National Biomedical Foundation Protein Identification Resource o base de datos similar se usa para proporcionar la región estructural del anticuerpo humanizado. Para seleccionar la secuencia de la cadena pesada humanizada, la secuencia de la cadena pesada murina se alinea con la secuencia de la cadena pesada del anticuerpo humano. En cada posición, el aminoácido del anticuerpo humano se selecciona para la secuencia humanizada, a menos que esa posición se clasifique en una cualquiera de las cuatro categorías definidas a continuación, en cuyo caso se selecciona el aminoácido murino:

(1): La posición cae dentro de una región determinante de la complementariedad (CDR), como se define por Kabat, J. Immunol., 125, 961-969 (1980);

(2): El aminoácido del anticuerpo humano es raro para cadenas pesadas humanas en esa posición, mientras que el aminoácido murino es común para cadenas pesadas humanas en esa posición;

(3): La posición es inmediatamente adyacente a una CDR en la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada murina; o

(4): El modelado tridimensional del anticuerpo murino sugiere que el aminoácido está físicamente próximo a la región de unión a antígeno.

Para seleccionar la secuencia de la cadena ligera humanizada, la secuencia de la cadena ligera murina se alinea con la secuencia de la cadena ligera del anticuerpo humano. El aminoácido del anticuerpo humano se selecciona en cada posición para la secuencia humanizada, a menos que la posición se clasifique de nuevo en una de las categorías que se han descrito anteriormente y se repiten a continuación:

(1): CDR;

(2): Aminoácido murino más típico que el anticuerpo humano;

(3): Adyacente a CDR; o

(4): Posible proximidad tridimensional a la región de unión.

La secuencia de nucleótidos real de los genes de la cadena pesada y ligera se selecciona del siguiente modo:

(1): Las secuencias de nucleótidos codifican las secuencias de aminoácidos elegidas como se ha descrito anteriormente;

(2): 5' de estas secuencias codificantes, las secuencias de nucleótidos codifican una secuencia (señal) conductora. 5 Estas secuencias conductoras se eligieron como típicas de anticuerpos;

(3) 3' de las secuencias codificantes, las secuencias de nucleótidos son las secuencias que siguen el segmento J5 de la cadena ligera de ratón y el segmento J2 de la cadena pesada de ratón, que son parte de la secuencia murina. Estas secuencias están incluidas debido a que contienen señales de donantes de corte y empalme; y

(4): En cada extremo de la secuencia está un sitio Xba I para permitir el corte en los sitios Xba I y la clonación en el 10 sitio Xba I de un vector.

Construcción de genes de la cadena ligera y pesada humanizados

Para sintetizar la cadena pesada, cuatro oligonucleótidos se sintetizan usando un sintetizador de ADN 380B de

15 Applied Biosystems. Dos de los oligonucleótidos son parte de cada hebra de la cadena pesada, y cada oligonucleótido solapa el siguiente aproximadamente 20 nucleótidos para permitir la hibridación. Juntos, los oligonucleótidos cubren la región variable de la cadena pesada humanizada entera con algunos nucleótidos adicionales en cada extremo para permitir cortar en los sitios Xba I. Los oligonucleótidos se purifican a partir de geles de poliacrilamida.

20 Cada oligonucleótido se fosforila usando cinasa del polinucleótido ATP y T4 mediante procedimientos convencionales (Maniatis y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Para hibridar los oligonucleótidos fosforilados se suspenden juntos en 40 ul de TA (Tris-acetato 33 mM, pH 7,9, acetato de potasio 66 mM, acetato de magnesio 10 mM) a una concentración de

25 aproximadamente 3,75 μM cada uno, se calientan a 95 ºC durante 4 min y se enfrían lentamente a 4 ºC. Para sintetizar el gen completo a partir de los oligonucleótidos sintetizando la hebra opuesta de cada oligonucleótido se añaden los siguientes componentes en un volumen final de 100 ul:

10 ul oligonucleótidos hibridados

30 0,16 mM cada desoxirribonucleótido 0,5 mM ATP 0,5 mM DTT 100 ug/ml BSA 3,5 ug/ml proteína T4 g43 (ADN polimerasa)

35 25 ug/ml proteína T4 g44/62 (proteína accesoria de polimerasa) 25 ug/ml proteína 45 (proteína accesoria de polimerasa)

La mezcla se incuba a 37 ºC durante 30 min. Luego se añaden 10 u de T4 ADN ligasa y la incubación a 37 ºC se reanuda durante 30 min. La polimerasa y la ligasa se inactivan por incubación de la reacción a 70 ºC durante 15 min.

40 Para digerir el gen con Xba I, a la reacción se añaden 50 ul de 2 X BSA que contiene TA a 200 ug/ml y DTT a 1 mM, 43 ul de agua y 50 u de Xba I en 5 ul. La reacción se incuba durante 3 h a 37 ºC, y luego se purifica sobre un gel. El fragmento Xba I se purifica a partir de un gel y se clona en el sitio Xba I del plásmido pUC19 mediante procedimientos convencionales. Los plásmidos se purifican usando técnicas convencionales y se secuencian usando el procedimiento de didesoxi.

45 La construcción de plásmidos para expresar cadenas ligeras y pesadas humanizadas se lleva a cabo aislando los fragmentos Xba I de la cadena ligera y pesada del plásmido pUC 19 en el que se había insertado y luego insertándolo en el sitio Xba I de un vector de expresión apropiado que expresará altos niveles de una cadena pesada completa cuando se transfecta en una célula huésped apropiada.

50 Síntesis y afinidad de anticuerpo humanizado

Los vectores de expresión se transfectan en células Sp2/0 de ratón, y las células que integran los plásmidos se seleccionan basándose en el (los) marcador(es) de selección conferido(s) por los vectores de expresión mediante

55 procedimientos convencionales. Para verificar que estas células secretaron anticuerpo que se une a EphB3, el sobrenadante de las células se incuba con células que se sabe que expresan EphB3. Después de lavar, las células se incuban con anticuerpo de cabra anti-humano conjugado con fluoresceína, se lavan y se analizan para fluorescencia sobre un citofluorímetro FACSCAN.

60 Para los siguientes experimentos, las células que producen el anticuerpo humanizado se inyectan en ratones y se recoge el ascitis resultante. El anticuerpo humanizado se purifica a homogeneidad sustancial del ascitis por pase a través de una columna de afinidad de anticuerpo de cabra anti-inmunoglobulina humana, preparada sobre un soporte Affigel-10 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Richmond, Calif.) según técnicas convencionales. La afinidad del anticuerpo humanizado con respecto al anticuerpo murino original se determina según técnicas conocidas en la

65 técnica.

EJEMPLO 8

MANIPULACIÓN HUMANA DE ANTICUERPOS MURINOS

Este ejemplo describe la clonación y expresión de anticuerpos Human Engineered ™, además de la purificación de tales anticuerpos y la prueba para actividad de unión.

Diseño de secuencias de Human Engineered ™

Se ha descrito Human Engineering ™ de dominios variables de anticuerpos por Studnicka [véase, por ejemplo, Studnicka y col., patente de EE.UU. nº 5.766.886; Studnicka y col. Protein Engineering 7: 805-814 (1994)] como un procedimiento para reducir la inmunogenicidad a la vez que se mantiene la actividad de unión de moléculas de anticuerpo. Según el procedimiento, a cada aminoácido de la región variable se le ha asignado un riesgo de sustitución. Las sustituciones de aminoácidos se distinguen por una de las tres categorías de riesgo: (1) cambios de riesgo bajo son aquellos que tienen la mayor probabilidad de reducir la inmunogenicidad con la mínima posibilidad de alterar la unión a antígeno; (2) cambios de riesgo moderado son aquellos que reducirían adicionalmente la inmunogenicidad, pero tienen una mayor posibilidad de afectar la unión a antígeno o el plegamiento de proteínas; (3) residuos de riesgo alto son aquellos que son importantes para la unión o para mantener la estructura del anticuerpo y llevan el mayor riesgo de que se afecte la unión a antígeno o plegamiento de proteínas. Debido a la función estructural tridimensional de prolinas, las modificaciones en prolinas se consideran generalmente que son al menos cambios de riesgo moderado, aunque la posición sea normalmente una posición de riesgo bajo. Se prefieren cambios sustitucionales, pero también son posibles inserciones y deleciones. La Figura 7 muestran la asignación de riesgo para cada residuo de aminoácido de cadenas ligeras y pesadas de XPA.04.001, XPA.04.013, XPA.04.018, XPA.04.048, clasificado como cambio de riesgo alto, moderado o bajo.

Regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo murino son Human Engineered ™ usando este procedimiento. Los residuos de aminoácidos que son candidatos para modificación según el procedimiento en posiciones de riesgo bajo se identifican alineando las secuencias de aminoácidos de las regiones variables murinas con una secuencia de la región variable humana. Puede usarse cualquier región variable humana, que incluye una secuencia de VH o VL individual o una secuencia de VH o VL consenso humana. Pueden cambiarse los residuos de aminoácidos en cualquier número de las posiciones de riesgo bajo, o en todas las posiciones de riesgo bajo.

Similarmente, residuos de aminoácidos que son candidatos para modificación según el procedimiento en todas las posiciones de riesgo bajo y moderado se identifican alineando las secuencias de aminoácidos de las regiones variables murinas con una secuencia de la región variable humana. Pueden cambiarse los residuos de aminoácidos en cualquier número de las posiciones de riesgo bajo o moderado, o en todas las posiciones de riesgo bajo y moderado.

Preparación de vectores de expresión para el desarrollo de líneas celulares permanentes

Se construyen fragmentos de ADN que codifican cada una de las secuencias de la región V de la cadena pesada y ligera anteriormente descritas, junto con secuencias señal derivadas de anticuerpos, usando síntesis de nucleótidos sintéticos. El ADN que codifica cada una de las secuencias de aminoácidos de la región V de la cadena ligera descritas anteriormente se insertan en el vector pMXP10 que contiene la región constante de la cadena ligera kappa humana. El ADN que codifica cada una de las secuencias de aminoácidos de la región V de la cadena pesada descritas anteriormente se insertan en el vector pMXP6 que contiene la región constante de la cadena pesada gamma-1, 2, 3 ó 4 humana. Todos estos vectores contienen un promotor del hCMV y una región sin traducir de 3' de la cadena ligera kappa de ratón, además de genes de marcadores de selección tales como neo o his para la selección de transfectantes resistentes a G418 - o histidinol -, respectivamente.

Preparación de vectores de expresión para expresión transitoria

Los vectores que contienen tanto genes de la cadena ligera como pesada descritos anteriormente también se construyen para transfección transitoria. Estos vectores son similares a aquellos descritos anteriormente para transfecciones permanentes, excepto que en lugar de los genes neo o his contienen oriP del virus de Epstein-Barr para replicación en células HEK293 que expresan el antígeno nuclear del virus de Epstein-Barr.

Expresión transitoria de anticuerpo anti-EphB3 Human-Engineered en células HEK293E

Vectores separados que contiene cada uno oriP del virus de Epstein-Barr y genes de la cadena ligera o cadena pesada descritos anteriormente se transfectan transitoriamente en células HEK293E. Células transitoriamente transfectadas se dejan incubar durante hasta 10 días después de que el sobrenadante se recupere y el anticuerpo se purifica usando cromatografía en proteína A.

Desarrollo de células CHO-K1 permanentemente transfectadas Los vectores descritos anteriormente que contiene una copia cada uno de los genes ligeros y pesados juntos se transfectan en células CHO-K1 adaptadas a Ex-Cell 302. Las células CHO-K1 adaptadas a crecimiento en suspensión en medio Ex-Cell 302 se electroporan normalmente con 40 ug de vector linealizado. Alternativamente, ADN linealizado puede complejarse con polietilenimina lineal (PEI) y usarse para transfección. Las células se siembran en placas de 96 pocillos que contienen medio Ex-Cell 302 complementado con 1 % de SBF y G418. Los clones se seleccionan en placas de 96 pocillos y ~10 % de los clones superiores de cada transfección se transfieren a placas de 24 pocillos que contienen medio Ex-Cell 302.

Se realiza una prueba de productividad en placas de 24 pocillos en medio Ex-Cell 302 para cultivos cultivados durante 7 y 14 días en el momento en el que los sobrenadantes de cultivo se prueban para niveles de anticuerpo secretado por un ensayo de ELISA de inmunoglobulina para IgG.

Los clones superiores se transfieren a matraces con agitación que contienen medio Ex-Cell 302. Tan pronto como las células se adaptan al crecimiento en suspensión se realiza una prueba en matraz con agitación con estos clones en medio Ex-Cell 302. Las células se cultivan durante hasta 10 días en matraces Erlenmeyer de 125 ml que contienen 25 ml de medio. Los matraces se abren al menos cada dos días del periodo de incubación para permitir el intercambio de gases y los niveles de polipéptido de inmunoglobulina en el medio de cultivo se determinan por ELISA de IgG al final del periodo de incubación. Múltiples transfecciones secuenciales de la misma línea celular con dos o tres vectores de transcripción de multi-unidad producen clones y líneas celulares que presentan más aumentos en los niveles de producción de inmunoglobulina, preferentemente a 300 μg/ml o más.

Purificación

Puede diseñarse un procedimiento para la purificación de polipéptidos de inmunoglobulina a partir de vectores y todas las líneas según la invención. Por ejemplo, según procedimientos muy conocidos en la técnica, las células se extraen por filtración después de la terminación. El filtrado se carga sobre una columna de proteína A (en múltiples pases, si se necesita). La columna se lava y luego los polipéptidos de inmunoglobulina expresados y secretados se eluyen de la columna. Para la preparación del producto de anticuerpo, el conjunto de proteína A se mantiene a un pH bajo (pH 3 durante un mínimo de 30 minutos y un máximo de una hora) como etapa de inactivación viral. A continuación se usa una etapa de intercambio catiónico adsortivo para purificar adicionalmente el producto. El eluato de la columna de separación adsortiva se pasa a un filtro de retención de virus para proporcionar eliminación adicional de posibles partículas virales. El filtrado se purifica adicionalmente pasando a través de una columna de intercambio aniónico en la que el producto no se une. Finalmente, el procedimiento de purificación finaliza transfiriendo el producto al tampón de formulación mediante diafiltración. El concentrado se ajusta a una concentración de proteína de al menos 1 mg/ml y se añade un estabilizador.

Actividad de unión

Se evalúa la actividad de unión de EphB3 de los anticuerpos Human Engineered ™ recombinantes. Se purifica proteína de los sobrenadantes de cultivo de los matraces con agitación por pase sobre una columna de proteína A, seguido de determinación de la concentración por A280. Se realizan ensayos de unión como se ha descrito en otros ejemplos.

EJEMPLO 9

EFECTO DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS PARA EPHB3 IN VIVO

Para probar los efectos de los anticuerpos anti-EphB3 sobre el crecimiento tumoral in vivo se usa un modelo de xenoinjerto de ortotópico en el que una línea celular de cáncer de mama tal como MDA-MB-231 o MDA-MB-435 se implanta en o próxima a los panículos adiposos mamarios de ratones beis SCID hembra. Las células cancerosas (por ratón: 5 x 106 células en 50 - 100 μl) se mezclan con un volumen igual de Matrigel y tanto se inyectan directamente en un panículo adiposo mamario quirúrgicamente expuesto como se inyectan subcutáneamente por encima del panículo adiposo mamario. Los ratones se devuelven a sus jaulas y se monitoriza el crecimiento tumoral hasta que se alcanza un volumen de aproximadamente 100 - 150 mm3. Entonces, los ratones se aleatorizan a grupos de tratamiento.

Los tratamientos consisten en inyecciones intraperitoneales administradas dos veces por semana de anticuerpo o anticuerpo de control de isotipo. Las dosis usadas en los estudios de eficacia oscilan de 0,2 - 20 mg/kg. Los volúmenes de tumor se miden 2 - 3 veces por semana, y la eficacia se juzga como el porcentaje de reducción en el volumen del tumor en los ratones tratados con agonista frente a los ratones tratados con control.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Hsu, et al.

<120> Anticuerpo Específico para EPHB3 y Usos del Mismo

<130> PP028230.0002(27527/41965A)

<150> US 60/835,777

<151> 2006-08-04

<160> 425

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 4234

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 998

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3 <210> 4

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5 <210> 6

<211> 114

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6 <210> 7

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8 <210> 9

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10 <210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

<210> 18

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

<210> 20

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20 <210> 21

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

<210> 25

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

<210> 27

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

<210> 28

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28

<210> 29

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 29

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 30

<210> 31

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 31

<210> 32

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

<210> 33

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 33 <210> 34

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 34

<210> 35

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 35

<210> 36

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 36

<210> 37

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 37

<210> 38

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 38

<210> 39

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 39

<210> 40

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 40

<210> 41

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 41

<210> 42

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 42

<210> 43

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 43

<210> 44

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 44

<210> 45

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 45

<210> 46

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 46 <210> 47

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 47

<210> 48

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 48

<210> 49

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 49

<210> 50

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 50

<210> 51

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 51

<210> 52

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 52

<210> 53

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 53

<210> 54

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 54

<210> 55

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 55

<210> 56

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 56

<210> 57

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 57

<210> 58

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 58

<210> 59

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 59 <210> 60

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 60

<210> 61

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 61

<210> 62

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 62

<210> 63

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 63

<210> 64

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 64

<210> 65

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 65

<210> 66

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 66

<210> 67

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 67

<210> 68

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 68

<210> 69

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 69

<210> 70

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 70

<210> 71

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 71

<210> 72

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 72 <210> 73

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 73

<210> 74

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 74

<210> 75

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 75

<210> 76

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 76

<210> 77

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 77

<210> 78

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 78 <210> 79

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 79

<210> 80

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 80

<210> 81

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 81

<210> 82

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 82

<210> 83

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 83

<210> 84

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 84

<210> 85

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 85 <210> 86

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 86

<210> 87

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 87

<210> 88

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 88

<210> 89

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 89

<210> 90

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 90

<210> 91

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 91

<210> 92

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 92

<210> 93

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 93

<210> 94

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 94

<210> 95

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 95

<210> 96

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 96

<210> 97

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 97

<210> 98

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 98 <210> 99

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 99

<210> 100

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 100

<210> 101

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 101

<210> 102

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 102

<210> 103

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 103

<210> 104

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 104 <210> 105

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 105

<210> 106

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 106

<210> 107

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 107

<210> 108

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 108

<210> 109

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 109

<210> 110

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 110

<210> 111

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 111 <230> 112

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 112

<210> 113

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 113

<210> 114

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 114

<210> 115

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 115

<210> 116

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 116

<210> 117

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 117

<210> 118

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 118

<210> 119

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 119

<210> 120

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 120

<210> 121

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 121

<210> 122

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 122

<210> 123

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 123

<210> 124

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 124 <210> 125

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 125

<210> 126

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 126

<210> 127

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 127

<210> 128

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 128

<210> 129

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 129

<210> 130

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 130

<210> 131

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 131

<210> 132

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 132

<210> 133

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 133

<210> 134

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 134

<210> 135

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 135

<210> 136

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 136

<210> 137

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 137 <210> 138

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 138

<210> 139

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 139

<210> 140

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 140

<210> 141

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 141

<210> 142

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 142

<210> 143

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 143

<210> 144

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 144 <210> 145

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 145

<210> 146

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 146

<210> 147

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 147

<210> 148

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 148

<210> 149

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 149

<210> 150

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 150 <210> 151

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 151

<210> 152

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 152

<210> 153

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 153

<210> 154

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 154

<210> 155

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 155

<210> 156

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 156

<210> 157

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 157 <210> 158

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 158

<210> 159

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 159

<210> 160

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 160

<210> 161

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 161

<210> 162

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 162

<210> 163

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 163

<210> 164

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 164

<210> 165

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 165

<210> 166

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 166

<210> 167

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 167

<210> 168

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 168

<210> 169

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 169

<210> 170

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 170 <210> 171

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 171

<210> 172

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 172

<210> 173

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 173

<210> 174

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 174

<210> 175

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 175

<210> 176

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 176

<210> 177

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 177

<210> 178

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 178

<210> 179

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 179

<210> 180

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 180

<210> 181

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 181

<210> 182

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 182

<210> 183

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 183 <210> 184

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 184

<210> 185

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 185

<210> 186

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 186

<210> 187

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 187

<210> 188

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 188

<210> 189

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 189

<210> 190

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 190

<210> 191

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 191

<210> 192

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 192

<210> 193

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 193

<210> 194

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 194

<210> 195

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 195

<210> 196

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 196 <210> 197

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 197

<210> 198

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 198

<210> 199

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 199

<210> 200

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 200

<210> 201

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 201

<210> 202

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 202

<210> 203

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 203

<210> 204

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 204

<210> 205

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 205

<210> 206

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 206

<210> 207

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 207

<210> 208

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 208

<210> 209

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 209 <210> 210

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 210

<210> 211

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 211

<210> 212

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 212

<210> 213

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 213

<210> 214

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 214

<210> 215

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 215

<210> 216

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 216

<210> 217

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 217

<210> 218

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 218

<210> 219

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 219

<210> 220

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 220

<210> 221

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 221

<210> 222

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 222 <210> 223

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 223

<210> 224

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 224

<210> 225

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 225

<210> 226

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 226

<210> 227

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 227

<210> 228

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 228

<210> 229

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 229

<210> 230

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 230

<210> 231

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 231

<210> 232

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 232

<210> 233

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 233

<210> 234

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 234

<210> 235

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 235 <210> 236

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 236

<210> 237

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 237

<210> 238

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 238

<210> 239

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 239

<210> 240

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 240

<210> 241

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 241

<210> 242

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 242

<210> 243

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 243

<210> 244

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 244

<210> 245

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 245

<210> 246

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 246

<210> 247

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 247

<210> 248

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 248 <210> 249

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 249

<210> 250

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 250

<210> 251

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 251

<210> 252

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 252

<210> 253

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 253

<210> 254

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 254

<210> 255

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 255

<210> 256

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 256

<210> 257

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 257

<210> 258

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 258

<210> 259

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 259

<210> 260

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 260

<210> 261

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 261 <210> 262

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 262

<210> 263

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 263

<210> 264

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 264

<210> 265

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 265

<210> 266

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 266

<210> 267

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 267

<210> 268

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 268

<210> 269

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 269

<210> 270

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 270

<210> 271

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 271

<210> 272

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 272

<210> 273

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 273

<210> 274

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 274 <210> 275

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 275

<210> 276

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 276

<210> 277

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 277

<210> 278

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 278

<210> 279

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 279

<210> 280

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 280

<210> 281

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 281

<210> 282

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 282

<210> 283

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 283

<210> 284

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 284

<210> 285

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 285

<210> 286

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 286

<210> 287

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 287 <210> 288

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 288

<210> 289

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 289

<210> 290

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 290

<210> 291

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 291

<210> 292

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 292

<210> 293

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 293

<210> 294

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 294

<210> 295

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 295

<210> 296

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 296

<210> 297

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 297

<210> 298

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 298

<210> 299

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 299

<210> 300

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 300 <210> 301

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 301

<210> 302

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 302

<210> 303

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 303

<210> 304

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 304

<210> 305

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 305

<210> 306

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 306 <210> 307

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 307

<210> 308

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 308

<210> 309

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 309

<210> 310

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 310

<210> 311

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 311

<210> 312

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 312

<210> 313

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 313

<210> 314

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 314

<210> 315

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 315

<210> 316

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 316

<210> 317

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 317

<210> 318

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 318

<210> 319

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 319 <210> 320

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 320

<210> 321

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 321

<210> 322

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 322

<210> 323

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 323

<210> 324

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 324

<210> 325

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 325

<210> 326

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 326 <210> 327

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 327

<210> 328

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 328

<210> 329

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 329

<210> 330

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 330

<210> 331

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 331

<210> 332

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 332

<210> 333

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 333

<210> 334

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 334

<210> 335

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 335

<210> 336

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 336

<210> 337

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 337

<210> 338

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 338

<210> 339

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 339 <210> 340

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 340

<210> 341

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 341

<210> 342

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 342

<210> 343

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 343

<210> 344

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 344

<210> 345

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 345

<210> 346

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 346 <210> 347

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 347

<210> 348

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 348

<210> 349

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 349

<210> 350

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 350

<210> 351

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 351

<210> 352

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 352

<210> 353

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 353

<210> 354

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 354

<210> 355

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 355

<210> 356

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 356

<210> 357

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 357

<210> 358

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 358

<210> 359

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 359 <210> 360

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 360

<210> 361

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 361

<210> 362

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 362

<210> 363

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 363

<210> 364

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 364

<210> 365

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 365

<210> 366

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 366

<210> 367

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 367

<210> 368

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 368

<210> 369

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 369

<210> 370

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 370

<210> 371

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 371

<210> 372

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 372 <210> 373

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 373

<210> 374

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 374

<210> 375

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 375

<210> 376

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 376

<210> 377

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 377

<210> 378

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 378

<210> 379

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 379

<210> 380

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 380

<210> 381

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 381

<210> 382

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 382

<210> 383

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 383

<210> 384

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 384

<210> 385

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 385 <210> 386

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 386

<210> 387

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 387

<210> 388

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 388

<210> 389

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 389

<210> 390

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 390

<210> 391

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 391

<210> 392

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 392

<210> 393

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 393

<210> 394

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 394

<210> 395

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 395

<210> 396

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 396

<210> 397

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 397

<210> 398

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 398 <210> 399

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 399

<210> 400

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 400

<210> 401

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 401

<210> 402

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 402

<210> 403

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 403

<210> 404

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 404 <210> 405

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 405

<210> 406

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 406

<210> 407

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 407

<210> 408

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 408

<210> 409

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 409

<210> 410

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 410

<210> 411

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 411

<210> 412

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 412

<210> 413

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 413

<210> 414

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 414

<210> 415

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 415

<210> 416

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 416

<210> 417

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 417 <210> 418

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 418

<210> 419

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 419

<210> 420

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 420

<210> 421

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 421

<210> 422

<211> 52

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 422 tcgtatacat ttcttacatc tatgcgctgg aagagaccct catggacaca aa 52

<210> 423

<211> 108

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 423

<210> 424

<211> 54

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 424 cgggtcgtcg aggtcctcgt cgaagggcct cgtgtagtgg tagtggtagt gcct 54

<210> 425

<211> 61

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 425

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal que (a) se une al dominio extracelular de EphB3 con una afinidad (KD) de 10-6 M o menos, (b)

(i)

compite con el anticuerpo XPA.04.001, que comprende una región variable de la cadena ligera de SEC ID Nº: 3 y una región variable de la cadena pesada de SEC ID Nº: 4 para unirse a EphB3 más del 75 %,

(ii)

compite con el anticuerpo XPA.04.013, que comprende una región variable de la cadena ligera de SEC ID Nº: 5 y una región variable de la cadena pesada de SEC ID Nº: 6 para unirse a EphB3 más del 75 %,

(iii) compite con el anticuerpo XPA.04.018, que comprende una región variable de la cadena ligera de SEC ID Nº: 7 y una región variable de la cadena pesada de SEC ID Nº: 8 para unirse a EphB3 más del 75 %,

(iv)

compite con el anticuerpo XPA.04.048, que comprende una región variable de la cadena ligera de SEC ID Nº: 9 y una región variable de la cadena pesada de SEC ID Nº: 10 para unirse a EphB3 más del 75 %,

(v)

comprende las 6 CDR de anticuerpo XPA.04.001 (residuos 24-39 (CDR1), 55-61 (CDR2) y 94-102 (CDR3) de SEC ID Nº: 3 y los residuos 26-35 (CDR1), 50-66 (CDR2) y 99-102 (CDR3) de SEC ID Nº: 4),

(vi)

comprende las 6 CDR de anticuerpo XPA.04.013 (residuos 24-39 (CDR1), 55-61 (CDR2) y 94-102 (CDR3) de SEC ID Nº: 5 y los residuos 26-35 (CDR1), 50-66 (CDR2) y 99-103 (CDR3) de SEC ID Nº: 6),

(vii) comprende las 6 CDR de anticuerpo XPA.04.018 (residuos 24-39 (CDR1), 55-61 (CDR2) y 94-102 (CDR3) de SEC ID Nº: 7 y los residuos 26-35 (CDR1), 50-66 (CDR2) y 99-102 (CDR3) de SEC ID Nº: 8), o

(viii) comprende las 6 CDR de anticuerpo XPA.04.048 (residuos 24-39 (CDR1), 55-61 (CDR2) y 94-102 (CDR3) de SEC ID Nº: 9 y los residuos 26-35 (CDR1), 50-66 (CDR2) y 99-102 (CDR3) de SEC ID Nº: 10),

y (c) induce la fosforilación de EphB3 y/o degradación de EphB3.
2.

El anticuerpo de la reivindicación 1 que se une al mismo epítope de EphB3 que cualquiera de los anticuerpos XPA.04.001, XPA.04.013, XPA.04.018 o XPA.04.048.
3.

El anticuerpo de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo Human Engineered, un anticuerpo humano, un anticuerpo monocatenario o un fragmento de anticuerpo.
4.

El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende una región constante de una secuencia de anticuerpo humano y una o más regiones estructurales variables de la cadena pesada y ligera de una secuencia de anticuerpo humano.
5.

El anticuerpo de la reivindicación 4, en el que la secuencia de anticuerpo humano es una secuencia humana individual, una secuencia consenso humana, un secuencia humana individual de la línea germinal, o una secuencia consenso humana de la línea germinal.
6.

El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la región constante de la cadena pesada es una IgG, IgM, IgA, IgD, IgE modificada o sin modificar, un fragmento de la misma, o combinaciones de las mismas.
7.

El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que tiene una afinidad de unión de 10-7, 10-8 ó 10 9 M o menos por EphB3.
8.

El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que inhibe (i) la unión de una efrina B a EphB3; y/o (ii) la proliferación de una célula cancerosa, tal como una célula de cáncer de pulmón, ovario, esófago, colon o mama.
9.

El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que está conjugado con otro agente de diagnóstico o terapéutico.
10.

Un procedimiento de seleccionar un anticuerpo para el dominio extracelular de una proteína EphB3 útil para el tratamiento de cáncer que comprende las etapas de:

poner en contacto un polipéptido que comprende el DEC de EphB3 con un anticuerpo candidato que contiene 6 CDR de los anticuerpos XPA.04.001, XPA.04.013, XPA.04.018 o XPA.04.048; detectar la afinidad de unión del anticuerpo candidato al polipéptido, e identificar dicho anticuerpo candidato como un anticuerpo útil para el tratamiento de cáncer si se detecta una afinidad de unión de al menos 10-6 M.
11.

Un procedimiento de alterar sistemáticamente anticuerpos y seleccionar un anticuerpo para el dominio extracelular de una proteína EphB3 útil para el tratamiento de cáncer que comprende las etapas de:

preparar un anticuerpo candidato que contiene modificaciones a uno o dos aminoácidos dentro de las CDR de los anticuerpos XPA.04.001, XPA.04.013, XPA.04.018 o XPA.04.048, poner en contacto un polipéptido que comprende el DEC de EphB3 con dicho anticuerpo candidato detectar la afinidad de unión del anticuerpo candidato al polipéptido, e identificar dicho anticuerpo candidato como un anticuerpo útil para el tratamiento de cáncer si se detecta una afinidad de unión de al menos 10-6 M.
12.

Un procedimiento de selección de un anticuerpo para el dominio extracelular de una proteína EphB3 útil para el tratamiento de cáncer que comprende las etapas de:

poner en contacto una célula de pulmón, ovario, esófago, colon o mama con un anticuerpo candidato que contiene 6 CDR de los anticuerpos XPA.04.001, XPA.04.013, XPA.04.018 o XPA.04.048 o un anticuerpo que contiene una modificación de uno o dos aminoácidos dentro de una o más CDR; detectar la proliferación o supervivencia de dicha célula; e identificar dicho anticuerpo candidato como un anticuerpo útil para el tratamiento de cáncer si se detecta una disminución en la proliferación o supervivencia celular.
13.

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1- 9.
14.

Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 13 operativamente ligada a una secuencia de control reguladora.
15.

Una célula huésped que expresa un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y comprende el vector de la reivindicación 14 o una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 13.
16.

Un procedimiento de uso de la célula huésped de la reivindicación 15 para producir un anticuerpo, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 15 bajo condiciones adecuadas y recuperar dicho anticuerpo.
17.

El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 que se purifica a al menos el 95 % de homogeneidad en peso.
18.

Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la reivindicación 17 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
19.

Un kit que comprende un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho anticuerpo, envasada en un recipiente, conteniendo dicho kit opcionalmente un segundo agente terapéutico, y que comprende además una etiqueta unida a o envasada con el recipiente, etiqueta que describe el contenido del recipiente y que proporciona indicaciones y/o instrucciones referentes al uso del contenido del recipiente para tratar cáncer, por ejemplo, en el que el recipiente es un vial o frasco o jeringuilla precargada.