JP2010500006A - ＥｐｈＢ３特異的抗体およびその使用 - Google Patents

ＥｐｈＢ３特異的抗体およびその使用 Download PDF

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Abstract

ＥｐｈＢ３特異的抗体が、そのような抗体を含む薬学的組成物、薬学的組成物を備えているキットならびに癌を予防および処置する方法とともに提供される。一実施形態では、本発明は、１０−６Ｍ以下の親和性（ＫＤ）でＥｐｈＢ３の細胞外ドメインと結合し、ＥｐｈＢ３との結合について抗体ＸＰＡ．０４．００１、ＸＰＡ．０４．０１３、ＸＰＡ．０４．０１８、ＸＰＡ．０４．０４８、ＸＨＡ．０５．３３７、ＸＨＡ．０５．２００、ＸＨＡ．０５．１１１、ＸＨＡ．０５．００５、ＸＨＡ．０５．２２８、ＸＨＡ．０５．０３０、ＸＨＡ．０５．９６４またはＸＨＡ．０５．８８５のいずれかと７５％超で競合する、抗体を提供する。

Description

本発明は、ＥｐｈＢ３特異的抗体を投与することによって癌を予防するためおよび処置するための方法に関する。
癌は、米国における主な死因の第２位である。「癌」は、多くの様々な種類の癌、すなわち、乳癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌を記述するために使用されるが、各々の種類の癌は、表現型レベルと遺伝子レベルの両方において異なる。１つ以上の遺伝子の発現が、変異または後成的な変化に起因して調節不全になるとき、制御されていない癌の増殖特性が生じ、細胞増殖を制御することができなくなる。
増殖制御遺伝子は、２つのクラス、すなわち癌遺伝子および癌抑制遺伝子に分類されることが多い。癌遺伝子は、その正常機能が特定の条件下においてのみ細胞増殖を促進する遺伝子である。癌遺伝子が変異を獲得して、その特異的な制御を失うとき、この遺伝子は、一層多様な条件下で増殖を促進する。しかしながら、本当に首尾よく癌となるには、癌細胞が癌抑制遺伝子内に変異を獲得することも必要であることが見出されている。癌抑制遺伝子の正常機能は、細胞の増殖を停止することである。腫瘍抑制因子の例としては、ｐ５３、ｐ１６、ｐ２１およびＡＰＣが挙げられ、これらのすべては、正常に作用するとき、細胞が制御不能に分裂し、成長することを停止する。腫瘍抑制因子が変異しているかまたは腫瘍抑制因子を喪失しているときは、細胞の増殖に対するブレーキも失われ、それにより、細胞は正常に制限なく成長することが可能となる。
ＥｐｈＢ３は、エフリン（ｅｐｈｒｉｎ）レセプターチロシンキナーゼファミリーに属するレセプターである。現在、１４個のＥｐｈレセプターおよび９個のエフリンリガンドが、ヒトにおいて知られている。エフリンレセプター（Ｅｐｈ）およびそのリガンドであるエフリンは、数多くの発生プロセス、特に神経系および脈管系における発生プロセスを媒介する。エフリンは、腫瘍発生、血管新生、転移性増殖および細胞生存に関与することも知られている。エフリンは、その構造と配列の関係性に基づいて、エフリン−Ａ（ＥＦＮＡ）クラス（グリコシルホスファチジルイノシトール結合によって膜に固着している）およびエフリン−Ｂ（ＥＦＮＢ）クラス（膜貫通タンパク質である）に分けられる。レセプターのＥｐｈファミリーは、その細胞外ドメイン配列の類似性ならびにエフリン−Ａリガンドおよびエフリン−Ｂリガンドとの結合に対する親和性に基づいて２つのグループに分けられる。Ｅｐｈレセプターは、レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーのうち最も大きいサブグループを構成している。
Ｅｐｈレセプターは、癌に関係している。ＥｐｈＡ１でトランスフェクトされ、ヌードマウスに移植されたＮＩＨ３Ｔ３細胞は、５〜６週間で１０ｍｍ３の腫瘍をもたらすが、ベクターコントロールは、同じ期間中にいかなる腫瘍ももたらさなかった（非特許文献１）。ＥｐｈＢ２は、正常組織と比べて胃癌（１２／１６）、結腸癌（３／１１）、食道癌（３／６）、卵巣癌（１／７）、腎臓癌（１／２）および肺癌（１／１）において高レベルで発現している（非特許文献２）。ＥｐｈＢ６発現は、低悪性度神経芽細胞腫と相関する。ＥｐｈＢ６のキナーゼドメインは、活性でないがゆえに、このレセプターは、天然に存在するドミナントネガティブとして作用すると提案されている（非特許文献３）。
血管新生におけるＥｐｈおよびエフリンの関与に関する証拠が増えてきている。エフリンＡ１、エフリンＢ１、エフリンＢ２、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３およびＥｐｈＢ４は、血管において発現すると報告されている。エフリンＡ１は、ラット角膜モデルにおいて血管新生を誘導することができ、エフリンＡ１に対する抗体は、この同じモデルにおいてＴＮＦ−α誘導性の血管新生を阻害することができる（非特許文献４）。クラスター化したエフリンＢ１は、奇形癌腫由来のマウス細胞株であるＰ１９およびヒト腎臓微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）において細胞接着および毛細血管様の会合を誘導する（非特許文献５）。クラスター化したエフリンＢ１およびエフリンＢ２は、副腎皮質由来の微小血管内皮細胞（ＡＣＥ）の出芽も誘導することができる（非特許文献６）。Ｘｅｎｏｐｕｓ胚へのドミナントネガティブＥｐｈＢ４レセプターＲＮＡの注入によって、体節間の静脈が、隣接する体節に異常に突き出るようになる（非特許文献７）。ＥｐｈＢ２／ＥｐｈＢ３ダブルノックアウトマウス、ＥｐｈＢ４ノックアウトマウスおよびエフリンＢ２ノックアウトマウスのすべてが、血管リモデリングの欠陥を有する（非特許文献６；非特許文献８；特許文献１）。
Ｅｐｈは、転移にも関与し得る。ＥｐｈＢ３またはＥｐｈＢ２のいずれかでトランスフェクトされた２９３Ｔヒト上皮腎臓細胞は、インビトロにおいてフィブロネクチンまたはコラーゲンでコートされた面への細胞接着の低下を示す。２９３細胞の接着不能は、Ｒ−ｒａｓのＥｐｈＢ２リン酸化後のインテグリン非活性化に媒介された（非特許文献９）。
Ｅｐｈは、活性化時にシグナル伝達することによって機能するとみられる。エフリンの結合は、Ｅｐｈの膜近傍残基のリン酸化をもたらすＥｐｈレセプターのオリゴマー化を誘導する。活性化されたＥｐｈは、シグナル伝達タンパク質（例えば、ＲａｓＧＡＰ、Ｓｒｃ、ＬＭＷ−ＰＴＰ、ＰＬＣｇ、ＰＩ３−キナーゼ、Ｇｒｂ２およびＰＤＺ含有タンパク質）に対するドッキング部位として作用する複数のリン酸化されたチロシンを有する。
Ｅｐｈレセプター（ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＢ２）の過剰発現は、レセプターが過剰リン酸化されていない状況で変換を引き起こす。リン酸化されたＥｐｈＢレセプターは、Ｒａｓ−ＭＡＰ−キナーゼ経路およびＦＡＫシグナル伝達を負に制御することにより、細胞増殖を減じる。
国際公開第００／３０６７３号パンフレット
Ｍａｒｕら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９０ Ｍａｒ；５（３）：４４５−７ Ｋｉｙｏｋａｗａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９４ Ｊｕｌ １５；５４（１４）：３６４５−５０ Ｔａｎｇら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９ａ Ｊｕｎ；５（６）：１４９１−６ Ｐａｎｄｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５ Ａｐｒ ２８；２６８（５２１０）：５６７−９ Ｓｔｅｉｎら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １９９８ Ｍａｒ １；１２（５）：６６７−７８ Ａｄａｍｓら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １９９９ Ｆｅｂ １；１３（３）：２９５−３０６ Ｈｅｌｂｌｉｎｇら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０００ Ｊａｎ；１２７（２）：２６９−７８ Ｗａｎｇら、Ｃｅｌｌ １９９８ Ｍａｙ ２９；９３（５）：７４１−５３ Ｚｏｕら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９９ Ｎｏｖ ２３；９６（２４）：１３８１３−８
ＥｐｈＢ３（Ｈｅｋ２、Ｓｅｋ４、Ｍｄｋ５、Ｔｙｒｏ６、Ｃｅｋ１０およびＱｅｋ１０としても知られる）は、エフリンＢファミリーメンバー（エフリンＢ１、エフリンＢ２およびエフリンＢ３）に対するレセプターであり、正常組織ならびにある特定の腫瘍および癌細胞株において発現することが知られている。しかしながら、現在までに、癌におけるＥｐｈＢ３の役割は、解明されていない。従って、ＥｐｈＢ３を調節する組成物および方法ならびにそのような癌における役割を同定する必要がある。本発明は、これらの必要性ならびに他の重要な必要性に関するものである。
要旨
ＥｐｈＢ３に対するヌクレオチド配列が、配列番号１に示されており、そのアミノ酸配列が、配列番号２に示されている。細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、配列番号２のアミノ酸１〜５５９からなる。あるいは、ＥＣＤは、配列番号２の３４〜５５５からなる（タンパク質配列のＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚデータベースには、ヒトＥｐｈＢ３に対応する遺伝子座番号が２つ存在することに注意されたい）。両方の場合において、（ａ）ＡＴＧ開始コドンから終止コドンまでのコード領域によってコードされるアミノ酸の数；（ｂ）前駆体配列において分泌シグナル配列（この配列は成熟プロセス中に削り取られて成熟タンパク質が作られる）を表すアミノ酸がどれくらい続いているか；および（ｃ）膜貫通領域を表す残基がどれくらい続いているか、に関して上記配列を投稿していると研究者らは予測した。成熟タンパク質の「細胞外」ドメインは、シグナル配列と膜貫通ドメインとの間に位置するものすべてであるので、ＥＣＤの予測の程度は、シグナル領域およびＴＭ領域をどこに置くかに左右される。両方の遺伝子座の投稿（ＮＰ＿００４４３４およびＰ５４７５３）が、その前駆体は、９９８アミノ酸長であり、分泌シグナルは、残基１−３３であると予測している。従って、これら両方が、ＥＣＤの開始は残基３４であることで一致している。しかしながら、それらは、ＴＭ領域の開始については一致していない：ＮＰ＿００４４３４は、開始は残基５５６である（ＥＣＤアミノ酸の末端は５５５番である）と予測しているのに対し、Ｐ５４７５３は、ＴＭは、残基５６０で開始している（ＥＣＤ末端はアミノ酸５５９番である））と予測している。本明細書中の実施例に記載されるように、アミノ酸３７−５５８からなるＥＣＤを抗体作製用の免疫に使用した。
本発明の材料および方法は、上述の必要性および当該分野における他の関連する必要性を満たすものである。
本発明の１つの実施形態において、１０−６Ｍ以下の親和性（ＫＤ）でＥｐｈＢ３の細胞外ドメインと結合し、ＥｐｈＢ３との結合について抗体ＸＰＡ．０４．００１、ＸＰＡ．０４．０１３、ＸＰＡ．０４．０１８、ＸＰＡ．０４．０４８、ＸＨＡ．０５．３３７、ＸＨＡ．０５．２００、ＸＨＡ．０５．１１１、ＸＨＡ．０５．００５、ＸＨＡ．０５．２２８、ＸＨＡ．０５．０３０、ＸＨＡ．０５．９６４またはＸＨＡ．０５．８８５のいずれかと７５％超で競合する抗体が、提供される。用語「１０−６Ｍ以下の親和性（ＫＤ）」は、例えば、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍ（すなわち、１０−６Ｍよりも低い数値）の親和性を意味する。別の実施形態において、上記抗体は、抗体ＸＰＡ．０４．００１、ＸＰＡ．０４．０１３、ＸＰＡ．０４．０１８、ＸＰＡ．０４．０４８、ＸＨＡ．０５．３３７、ＸＨＡ．０５．２００、ＸＨＡ．０５．１１１、ＸＨＡ．０５．００５、ＸＨＡ．０５．２２８、ＸＨＡ．０５．０３０、ＸＨＡ．０５．９６４またはＸＨＡ．０５．８８５のいずれかと同じＥｐｈＢ３のエピトープに結合する。なおも別の実施形態において、抗体ＸＰＡ．０４．００１、ＸＰＡ．０４．０１３、ＸＰＡ．０４．０１８、ＸＰＡ．０４．０４８、ＸＨＡ．０５．３３７、ＸＨＡ．０５．２００、ＸＨＡ．０５．１１１、ＸＨＡ．０５．００５、ＸＨＡ．０５．２２８、ＸＨＡ．０５．０３０、ＸＨＡ．０５．９６４またはＸＨＡ．０５．８８５のいずれかの１、２、３、４、５または６個のＣＤＲを含む抗体が、提供される。さらに別の実施形態において、上述の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト操作（ｈｕｍａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体または抗体フラグメントである。
本発明の別の実施形態において、ＣＤＲ内の少なくとも１つのアミノ酸が、別の抗ＥｐｈＢ３抗体の対応するＣＤＲの対応する残基で置換されている上述の抗体が、提供される。例示的な実施形態において、ＸＰＡ．０４．００１、ＸＰＡ．０４．０１３、ＸＰＡ．０４．０１８、ＸＰＡ．０４．０４８、ＸＨＡ．０５．３３７、ＸＨＡ．０５．２００、ＸＨＡ．０５．１１１、ＸＨＡ．０５．００５、ＸＨＡ．０５．２２８、ＸＨＡ．０５．０３０、ＸＨＡ．０５．９６４およびＸＨＡ．０５．８８５からなる群から選択される抗体由来のＣＤＲ内の少なくとも１つのアミノ酸が、別の抗ＥｐｈＢ３抗体の対応するＣＤＲの対応する残基で置換されている上述の抗体が、提供される。別の例示的な実施形態において、ＸＰＡ．０４．００１、ＸＰＡ．０４．０１３、ＸＰＡ．０４．０１８、ＸＰＡ．０４．０４８、ＸＨＡ．０５．３３７、ＸＨＡ．０５．２００、ＸＨＡ．０５．１１１、ＸＨＡ．０５．００５、ＸＨＡ．０５．２２８、ＸＨＡ．０５．０３０、ＸＨＡ．０５．９６４およびＸＨＡ．０５．８８５からなる群から選択される抗体由来のＣＤＲ内の少なくとも１つのアミノ酸が、ＸＰＡ．０４．００１、ＸＰＡ．０４．０１３、ＸＰＡ．０４．０１８、ＸＰＡ．０４．０４８、ＸＨＡ．０５．３３７、ＸＨＡ．０５．２００、ＸＨＡ．０５．１１１、ＸＨＡ．０５．００５、ＸＨＡ．０５．２２８、ＸＨＡ．０５．０３０、ＸＨＡ．０５．９６４およびＸＨＡ．０５．８８５からなる群から選択される別の抗体の対応するＣＤＲの対応する残基で置換されている上述の抗体が、提供される。別の実施形態において、ＣＤＲ内の１つまたは２つのアミノ酸が改変されている上述の抗体が、提供される。なおも別の実施形態において、上記抗体は、ＸＰＡ．０４．００１、ＸＰＡ．０４．０１３、ＸＰＡ．０４．０１８、ＸＰＡ．０４．０４８、ＸＨＡ．０５．３３７、ＸＨＡ．０５．２００、ＸＨＡ．０５．１１１、ＸＨＡ．０５．００５、ＸＨＡ．０５．２２８、ＸＨＡ．０５．０３０、ＸＨＡ．０５．９６４またはＸＨＡ．０５．８８５の抗体に対して、可変軽鎖領域または可変重鎖領域のいずれかにわたり少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を保持している。さらに別の実施形態において、上述の（ａｆｏｒｅｍｅｍｅｎｔｉｏｎｅｄ）抗体は、ヒト抗体配列の定常領域ならびにヒト抗体配列の１つ以上の重鎖可変フレームワーク領域および軽鎖可変フレームワーク領域を含む。なおも別の実施形態において、ヒト抗体配列が個別のヒト配列、ヒトコンセンサス配列、個別のヒト生殖細胞系列配列またはヒトコンセンサス生殖細胞系列配列である上述の抗体が、提供される。
なおも別の実施形態において、本発明は、重鎖定常領域が、改変されているかまたは改変されていないＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、それらのフラグメントまたはそれらの組み合わせである上述の抗体を提供する。別の実施形態において、上記抗体は、ＥｐｈＢ３に対して１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０または１０−１１Ｍ以下の結合親和性を有する。さらに別の実施形態において、ＣＤＲに保存的置換を含む上述の抗体が、提供される。さらに別の実施形態において、低リスク残基および中程度のリスク残基において保存的変更または非保存的変更を含む上述の抗体が、提供される。別の実施形態において、軽鎖定常領域が、改変されているかまたは改変されていないラムダ軽鎖定常領域、カッパ軽鎖定常領域、それらのフラグメントまたはそれらの組み合わせである上述の抗体が、提供される。
本発明の別の実施形態において、ＥｐｈＢ３のリン酸化を誘導し、ＥｐｈＢ３のオリゴマー化を誘導し、ＥｐｈＢ３の内部移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を誘導し、ＥｐｈＢ３の分解を誘導し、ＥｐｈＢ３のシグナル伝達を誘導し、ＥｐｈＢ３へのエフリンＢの結合を阻害し、そして／または癌細胞の増殖を阻害する上述の抗体が、提供される。さらに別の実施形態において、肺癌細胞、卵巣癌細胞、食道癌細胞、結腸癌細胞または乳癌細胞の増殖を阻害する上述の抗体が、提供される。なおも別の実施形態において、別の診断薬または治療薬に結合体化されている上述の抗体が、提供される。
数多くの方法が、本発明によって企図される。本発明の１つの実施形態において、癌の処置に有用なＥｐｈＢ３タンパク質の細胞外ドメインに対する抗体についてスクリーニングする方法が提供され、その方法は：ＥｐｈＢ３のＥＣＤを含むポリペプチドを、抗体ＸＰＡ．０４．００１、ＸＰＡ．０４．０１３、ＸＰＡ．０４．０１８、ＸＰＡ．０４．０４８、ＸＨＡ．０５．３３７、ＸＨＡ．０５．２００、ＸＨＡ．０５．１１１、ＸＨＡ．０５．００５、ＸＨＡ．０５．２２８、ＸＨＡ．０５．０３０、ＸＨＡ．０５．９６４またはＸＨＡ．０５．８８５の少なくとも１、２、３、４、５または６個のＣＤＲを含む候補抗体と接触させる工程；そのポリペプチドに対する候補抗体の結合親和性を検出する工程、および少なくとも１０−６Ｍの結合親和性が検出される場合に候補抗体を癌の処置に有用な抗体と同定する工程を含む。さらに別の実施形態において、抗体を体系的に変化させ、そして癌の処置に有用なＥｐｈＢ３タンパク質の細胞外ドメインに対する抗体についてスクリーニングする方法が提供され、その方法は：抗体ＸＰＡ．０４．００１、ＸＰＡ．０４．０１３、ＸＰＡ．０４．０１８、ＸＰＡ．０４．０４８、ＸＨＡ．０５．３３７、ＸＨＡ．０５．２００、ＸＨＡ．０５．１１１、ＸＨＡ．０５．００５、ＸＨＡ．０５．２２８、ＸＨＡ．０５．０３０、ＸＨＡ．０５．９６４またはＸＨＡ．０５．８８５のＣＤＲ内の１つまたは２つのアミノ酸に対する改変を含む候補抗体を調製する工程；ＥｐｈＢ３のＥＣＤを含むポリペプチドを候補抗体と接触させる工程；そのポリペプチドに対する候補抗体の結合親和性を検出する工程、および少なくとも１０−６Ｍの結合親和性が検出される場合に、候補抗体を癌の処置に有用な抗体と同定する工程を含む。
さらに別の実施形態において、癌の処置に有用なＥｐｈＢ３タンパク質の細胞外ドメインに対する抗体についてスクリーニングする方法が提供され、その方法は：肺細胞、卵巣細胞、食道細胞、結腸細胞または乳房細胞を、抗体ＸＰＡ．０４．００１、ＸＰＡ．０４．０１３、ＸＰＡ．０４．０１８、ＸＰＡ．０４．０４８、ＸＨＡ．０５．３３７、ＸＨＡ．０５．２００、ＸＨＡ．０５．１１１、ＸＨＡ．０５．００５、ＸＨＡ．０５．２２８、ＸＨＡ．０５．０３０、ＸＨＡ．０５．９６４もしくはＸＨＡ．０５．８８５の少なくとも１、２、３、４、５または６個のＣＤＲを含む候補抗体あるいは１つ以上のＣＤＲ内に１つもしくは２つのアミノ酸の改変を含む抗体と接触させる工程；細胞の増殖または生存を検出する工程；および細胞増殖または細胞生存の減少が検出される場合に、候補抗体を癌の処置に有用な抗体と同定する工程を含む。
さらに別の実施形態において、癌に罹患している被験体を処置する方法が提供され、その方法は、上述の抗体を治療有効量で投与する工程を含む。関連する実施形態において、その癌は、肺癌、卵巣癌、食道癌、結腸癌または乳癌である。なおも別の実施形態において、第２の治療薬が投与される。さらに別の実施形態において、被験体は、放射線治療または手術によってさらに処置される。さらなる実施形態において、本発明は、例えば、上述の方法によって、癌を処置する際に使用する目的をはじめとした医療において使用する目的の本発明の抗体を提供する。他の実施形態において、本発明は、癌を処置するための薬物の製造における本発明の抗体の使用を提供する。その薬物は、第２の治療薬および／または放射線治療とともに患者に投与され得る。
本発明のなおも別の実施形態において、ＥｐｈＢ３を発現している腫瘍細胞を標的化する方法が提供され、その方法は、放射性核種または他のトキシンに結合体化されている上述の抗体を投与する工程を含む。なおも別の実施形態において、被験体が哺乳動物である上述の方法が、提供される。なおも別の実施形態において、被験体は、ヒトである。
本発明の別の実施形態において、上述の抗体の重鎖または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子が提供される。なおも別の実施形態において、制御性調節配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に作動可能に連結された上述の核酸分子を含む発現ベクターが提供される。さらに別の実施形態において、上述のベクターまたは上述の核酸分子を含む宿主細胞が提供される。なおも別の実施形態において、抗体を作製するために上述の宿主細胞を使用する方法が提供され、その方法は、宿主細胞を適当な条件下で培養し、抗体を回収する工程を含む。別の実施形態において、上述の方法によって作製される抗体が提供される。
本発明の別の実施形態において、少なくとも９５重量％の均質性に精製されている上述の抗体が、提供される。なおも別の実施形態において、上述の（ａｆｏｒｅｍｅｎｔｉｏｎｍｅｄ）抗体および薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物が、提供される。さらに別の実施形態において、容器内に包装された治療有効量の本発明の抗体を含む、上述の抗体を含むキットが、提供され、ここで、そのキットは、必要に応じて第２の治療薬を備え、その容器に添付されているかまたはその容器とともに包装されているラベルをさらに備え、そのラベルには、容器の内容物が記載されており、癌を処置するための容器の内容物の使用に関する適用および／または指示を提供する。別の実施形態において、容器がバイアルまたはビンまたは予め充填された注射器である上述のキットが、提供される。
図１は、ｍＡｂに誘導されるＥｐｈＢ３の内部移行／分解を示しているＦＡＣＳ解析の結果を示している。 図２は、抗ＥｐｈＢ３ ｍＡｂが、ＳＷ６２０細胞においてＥｐｈＢ３のリン酸化を引き起こしていることを示している。 図３は、抗ＥｐｈＢ３抗体が、低抗体濃度においてＥｐｈＢ３のリン酸化を誘導していることを示している。 図４は、抗ＥｐｈＢ３ ｍＡｂが、ＥｐｈＢ３の内部移行だけでなく、分解を誘導することを示している。 図５は、ｍＡｂのサブセットが、少なくとも７２時間、ＥｐｈＢ３タンパク質レベルを減少させたことを示している。 図６は、複数の細胞株が、ＥｐｈＢ３をリン酸化することによってアゴニストｍＡｂに応答することを示している。 図７は、ＸＰＡ．０４．００１、ＸＰＡ．０４．０１３、ＸＰＡ．０４．０１８、ＸＰＡ．０４．０４８の軽鎖および重鎖に対するリスクライン（Ｈ＝高リスク、Ｍ＝中程度のリスク、Ｌ＝低リスク）、ＸＰＡ．０４．００１、ＸＰＡ．０４．０１３、ＸＰＡ．０４．０１８ ＸＰＡ．０４．０４８の軽鎖および重鎖の可変領域アミノ酸配列（配列番号３〜１０）ならびにそのアミノ酸配列中のＣＤＲ Ｈ１、Ｈ２およびＨ３の位置を示している。
詳細な説明
本発明は、ＥｐｈＢ３特異的抗体、そのような抗体を含む薬学的処方物、上記抗体および薬学的処方物を調製する方法ならびにその薬学的処方物および化合物で患者を処置する方法を提供する。本発明の抗体は、ＥｐｈＢ３と結合し、ＥｐｈＢ３のリン酸化を誘導し、ＥｐｈＢ３のオリゴマー化を誘導し、ＥｐｈＢ３の内部移行を誘導し、ＥｐｈＢ３の分解を誘導し、ＥｐｈＢ３のシグナル伝達を誘導し、そして／またはＥｐｈＢ３媒介性の細胞−細胞接着を調節する、所望の生物学的活性を有し得る。
１つの実施形態において、本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのアゴニストとして作用する。従って、いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、それが結合する標的抗原の機能を活性化し得るか、または誘導し得る（例えば、リン酸化活性または細胞内シグナル伝達のような標的の機能を増強する）。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、本明細書中で開示されるエピトープまたはその一部に結合する。いくつかの実施形態において、レセプターへの本抗体の結合は、レセプター分解を誘導する。いくつかの実施形態において、レセプターへの本抗体の結合は、レセプターのオリゴマー化を誘導する。いくつかの実施形態において、レセプターへの本抗体の結合は、レセプターのリン酸化を誘導する。いくつかの実施形態において、レセプターへの本抗体の結合は、レセプターの活性化を誘導する。レセプターの活性化（すなわち、シグナル伝達）は、当該分野で公知の手法によって測定され得る。例えば、レセプターの活性化は、免疫沈降後のウエスタンブロット解析によってレセプターまたはその基質のリン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／トレオニン）を検出することによって測定することができる。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるようにリガンド活性またはレセプター活性を、本抗体の非存在下における活性の少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％または少なくとも５０％調節する抗体が、提供される。
いくつかの実施形態において、ＥｐｈＢ３抗体は、細胞内のアダプタータンパク質へのＥｐｈＢ３の結合を刺激する。いくつかの実施形態において、ＥｐｈＢ３抗体は、ＦＡＫ、Ｅｒｋ／ＭＡＰＫ経路、Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ経路を阻害および／または不活性化し、ＲａｓＧＡＰを活性化し、Ａｂｌ／Ａｒｇ、Ｆｙｎ、Ｓｒｃ、ＬＭＷ−ＰＴＰ、インターセクチン、Ｃｄｃ４２経路、ＫａｌｉｒｉｎもしくはＲａｃ経路を阻害および／または不活性化する。いくつかの実施形態において、ＥｐｈＢ３抗体は、Ｒ−ｒａｓを不活性化するか、またはＳｙｎｄｅｃａｎを活性化する。いくつかの実施形態において、ＥｐｈＢ３抗体は、Ｒ−Ｒａｓのリン酸化に導く。
本明細書中で使用されるとき、用語「細胞内のアダプタータンパク質」とは、シグナル伝達複合体の様々なセグメントを接続するタンパク質のことをいう。そのアダプターは、酵素活性を有していてもよいし、有していなくてもよい。アダプタータンパク質の例は、当業者に公知である。例えば、Ｇｒｂ２は、固有の酵素活性を有しないアダプタータンパク質であり、ＲａｓＧＡＰは、酵素活性を有するアダプタータンパク質である。
本発明の抗体は、あるいは（またはさらに）、癌細胞上で発現されるＥｐｈＢ３への結合の所望の生物学的活性を有するので、癌細胞に対して細胞傷害性治療を標的とするために働き得る。
インビトロアッセイで測定するときに高親和性および高力価を有するいくつかの好ましいマウス抗体またはキメラ抗体は、ＳｔｕｄｎｉｃｋａらのＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（商標）法に基づいてヒトにおいて免疫原性がより低くなるように改変される。簡潔には、ヒトの環境に関してその免疫原性を低下させつつ、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の表面に露出したアミノ酸残基を、抗原結合性またはタンパク質フォールディングのいずれかに悪影響を及ぼすことがありそうにないと決定された位置においてヒト残基に改変する。改変された重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする合成遺伝子を構築し、ヒトガンマ重鎖定常領域および／またはカッパ軽鎖定常領域に対するコード配列に連結する。任意のヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域は、Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体可変領域とともに使用され得る。ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子を哺乳動物細胞に導入し、得られる組換え免疫グロブリン産物を得て、特徴付けする。
本発明の例示的な抗体としては、ＸＰＡ．０４．００１、ＸＰＡ．０４．０１３、ＸＰＡ．０４．０１８、ＸＰＡ．０４．０４８、ＸＨＡ．０５．３３７、ＸＨＡ．０５．２００、ＸＨＡ．０５．１１１、ＸＨＡ．０５．００５、ＸＨＡ．０５．２２８、ＸＨＡ．０５．０３０、ＸＨＡ．０５．９６４およびＸＨＡ．０５．８８５が挙げられる。以下の抗体分泌ハイブリドーマは、ブダペスト条約の規定に従って、２００６年８月４日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１１０−２２０９（ＵＳＡ）に寄託された：
本発明をより十分に理解するための助けとして、以下の定義が提供される。
全般的な定義
標的抗原ヒト「ＥｐｈＢ３」とは、本明細書中で使用されるとき、配列番号２およびその天然に存在する対立遺伝子変異体（ａｌｌｅｌｉｃ ｖａｒｉａｎｔ）と実質的に同じアミノ酸配列を有するヒトポリペプチドのことをいう。「ＥｐｈＢ３のＥＣＤ」とは、本明細書中で使用されるとき、配列番号２のアミノ酸３７〜５５８によって表されるＥｐｈＢ３の細胞外部分のことをいう（ＥＣＤの公開されている分類に関して上の記述も参照のこと）。
「腫瘍」とは、本明細書中で使用されるとき、悪性であるか良性であるかに関係なく、また、すべての前癌性細胞および癌性細胞ならびに前癌性組織および癌性組織に関係なく、すべての新生物の細胞の成長および増殖のことをいう。
用語「癌」および「癌性」とは、代表的には調節不全の細胞増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態のことをいうか、または説明する。癌の例としては、扁平上皮および小細胞肺癌腫、食道扁平上皮癌、卵巣明細胞癌、結腸腺癌および浸潤性乳管癌が挙げられるがこれらに限定されない。
「処置」は、障害の発症を予防する意図または障害の病状を変化させる意図で行われる介入である。従って、「処置」とは、治療的な処置と予防的または防止的な措置の両方のことをいう。処置の必要のある者としては、障害をすでに有している者ならびに障害を予防すべき者が挙げられる。腫瘍（例えば、癌）の処置では、治療薬は、腫瘍細胞の病状を直接減少させ得るか、または腫瘍細胞を他の治療薬による処置、例えば、放射線照射および／または化学療法に影響されやすくし得る。疾患の臨床的な症状、生化学的な症状、放射線学的な症状または自覚的な症状に苦しんでいる患者の処置としては、そのような症状の一部または全部を緩和することまたは疾患に対する素因を減少させることが挙げられ得る。癌の「病状」としては、患者の健康を損なうすべての現象が挙げられる。このこととしては、異常な細胞増殖または制御できない細胞増殖、転移、隣接する細胞の正常な機能の妨害、異常なレベルでのサイトカインまたは他の分泌産物の放出、炎症性応答または免疫学的応答の抑制または悪化などが挙げられるが、これらに限定されない。従って、処置後の改善は、腫瘍サイズの減少、腫瘍増殖速度の低下、既存の腫瘍細胞もしくは転移性細胞の破壊および／または転移のサイズもしくは数の減少として表れ得る。
処置の目的での「哺乳動物」とは、ヒト、家庭内の動物および家畜ならびに動物園の動物、スポーツ動物（ｓｐｏｒｔｓ）またはペット動物（例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ）などをはじめとした哺乳動物として分類される任意の動物のことをいう。好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。
本明細書中で使用されるとき、句「治療有効量」は、所望の処置レジメンに従って投与されるときに、疾患のそのような症状の一部もしくは全部を緩和することまたは疾患に対する素因を減少させることを含む所望の治療的または予防的な効果または応答を誘発する、本発明の実施形態に適切である治療的な抗体または予防的な抗体の量のことをいうと意味している。
抗体
用語「免疫特異的（ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）」または「特異的に結合する」は、本抗体が、約１０４Ｍ−１以上、好ましくは、約１０５Ｍ−１以上、より好ましくは、約１０６Ｍ−１以上のＫａでＥｐｈＢ３またはそのＥＣＤに結合することを意味する。本抗体は、標的抗原に対して、他の無関係な分子と比べて実質的に高い親和性を有し得る。本抗体は、標的抗原に対して、オルソログまたはホモログと比べて実質的に高い親和性、例えば、標的抗原に対して少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍またはそれ以上の相対的な親和性も有し得る。あるいは、公知のホモログまたはオルソログと交差反応することが、本抗体にとって有用である場合がある。
本発明の抗体はまた、少なくとも１０−４Ｍ、好ましくは少なくとも約１０−４Ｍ〜約１０−１２Ｍ、より好ましくは少なくとも約１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍまたは１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍまたは１０−１１Ｍの親和性（ＫＤ）によって特徴づけられ得る。本抗体に対する適切な親和性は、治療的な適用に応じて変化し得る。例えば、非常に高い親和性を有する抗体が、血液癌の治療薬として最も望ましい場合があるが、非常に高い親和性を有する抗体は、固形腫瘍への弱い侵入を示す場合がある。従って、約１０−６Ｍ〜１０−１０Ｍの親和性を有する抗体は、固形腫瘍の治療薬として、より適切であり得る。そのような親和性は、従来の手法を使用して（例えば、平衡透析によって；製造者が概要を述べている一般的な手順を用い、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００装置を使用することによって；放射性標識標的抗原を使用するラジオイムノアッセイによって；または、当業者に公知の別の方法によって）容易に測定され得る。親和性データは、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら、Ａｎｎ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，５１：６６０（１９４９）の方法によって解析され得る。
「アゴニスト抗体」とは、それが結合する標的抗原の機能を活性化することができるか、または誘導することができる抗体分子のことを意味する。従って、「アゴニスト」抗標的抗体は、リン酸化活性または細胞内のシグナル伝達のような標的の機能を増加させることができる。
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、完全に組み立てられた抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗原に結合することができる抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、一本鎖抗体、ダイアボディ）および所望の生物学的活性を示す限り前述のもの（ｆｏｒｇｏｉｎｇ）を含む組換えペプチドを包含する。抗体フラグメントは、組換えＤＮＡ手法またはインタクトな抗体の酵素的切断もしくは化学的切断によって作製され得、以下でさらに説明される。モノクローナル抗体の非限定的な例としては、マウスの免疫グロブリン、キメラ免疫グロブリン、ヒト化免疫グロブリン、ヒト免疫グロブリンおよびＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンから得られる配列を有するキメラ融合タンパク質またはムテインもしくはその誘導体が挙げられ、その各々は、以下でさらに説明される。化学的に誘導される抗体を含むインタクトな分子および／またはフラグメントの多量体または集合体が、企図される。本発明によれば、任意のアイソタイプクラスまたはサブクラスの抗体が、企図される。
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書中で使用されるとき、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体のことをいい、すなわち、その集団を含む個別の抗体は、微量存在し得る天然に存在し得る変異または選択的翻訳後修飾を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的である；代表的には、様々な決定基（エピトープ）に対して産生される様々な抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して産生される。モノクローナル抗体は、それらの特異性に加えて、様々な特異性および特性を有する他の免疫グロブリンで汚染されていない均一な培養によって合成されるという点で有利である。
修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られるときの抗体の特性を示すものであり、任意の特定の方法によって抗体を作製する必要があると解釈されるものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５ Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５によって初めて報告されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって作製され得る。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、組換え、キメラ、ヒト化、ヒト、Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）または抗体フラグメントであり得る。
「単離された」抗体は、同定されており、かつ、その天然の環境の成分から分離され、回収されたものである。その天然の環境の夾雑物成分は、抗体にとって診断的または治療的な用途を妨害し得る材料であり、その成分としては、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性溶質または非タンパク質性溶質が挙げられ得る。好ましい実施形態において、本抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって測定されるとき抗体の９５重量％超に、最も好ましくは９９重量％超に、（２）スピニングカップ配列決定装置を使用することによってＮ末端または内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度に、または（３）クマシーブルー染色または好ましくは銀染色を使用して還元条件下または非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一に、精製される。単離された抗体は、その抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、組換え細胞内の原位置における抗体を含む。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製段階によって調製される。
「免疫グロブリン」または「天然抗体」は、４量体糖タンパク質である。天然に存在する免疫グロブリンにおいて、各四量体は、２本の同一のポリペプチド鎖の対から構成され、その各対は、１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端の部分は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の「可変」（「Ｖ」）領域を含む。各鎖のカルボキシ末端の部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域と定義されている。免疫グロブリンは、その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて様々なクラスに割り当てられ得る。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）およびイプシロン（ε）に分類され、抗体のアイソタイプは、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥと定義されている。これらのうちのいくつかは、さらにサブクラスまたはアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分けられ得る。異なるアイソタイプは、異なるエフェクター機能を有する；例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。ヒト軽鎖は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖に分類される。軽鎖および重鎖内において、可変領域および定常領域は、約１２またはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域で連結されており、重鎖は、約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照のこと。
抗体の構造および作製の詳細な説明については、Ｒｏｔｈ，Ｄ．Ｂ．，ａｎｄ Ｃｒａｉｇ，Ｎ．Ｌ．，Ｃｅｌｌ，９４：４１１−４１４（１９９８）（本明細書中でその全体が参考として援用される）を参照のこと。簡潔には、重鎖および軽鎖の免疫グロブリン配列をコードするＤＮＡを作製するためのプロセスは、主に、発生中のＢ細胞において起きる。様々な免疫グロブリン遺伝子セグメントの再編成および連結の前に、Ｖ、Ｄ、Ｊおよび定常（Ｃ）遺伝子セグメントは、一般に、単一染色体上の比較的近い位置に見られる。Ｂ細胞の分化中、Ｖ、Ｄ、Ｊ（または軽鎖遺伝子の場合はＶおよびＪのみ）遺伝子セグメントの適切なファミリーメンバーのうちの各々の１つが、組み換えられることにより、重鎖および軽鎖の免疫グロブリン遺伝子の機能的に再編成された可変領域が形成される。この遺伝子セグメント再編成プロセスは、連続的であるとみられる。まず、重鎖のＤとＪとの連結が行われ、続いて、重鎖のＶとＤＪとの連結、そして軽鎖のＶとＪとの連結が行われる。Ｖ、ＤおよびＪセグメントの再編成に加えて、軽鎖においてＶセグメントとＪセグメントが連結され、重鎖のＤセグメントとＪセグメントが連結される位置における可変的な組換えによって、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の主要なレパートリーにおいて、さらに多様性がもたらされる。軽鎖におけるそのようなバリエーションは、代表的には、Ｖ遺伝子セグメントの最後のコドンおよびＪセグメントの最初のコドンの内側で起きる。連結時の同様の不正確さは、ＤセグメントとＪＨセグメントとの間の重鎖染色体上で起き、１０ヌクレオチド以上延び得る。さらに、いくつかのヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡによってコードされていないＤとＪＨとの間およびＶＨとＤ遺伝子セグメントとの間に挿入され得る。これらのヌクレオチドの付加は、Ｎ領域の多様性として知られている。このような連結中に起き得る可変領域遺伝子セグメントおよび可変的な組換えにおけるそのような再編成の正味の影響が、主要な抗体レパートリーの産生である。
「抗体フラグメント」は、インタクトな完全長抗体（例えば、ヒト抗体を含む）の一部、好ましくは、インタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含み、抗体フラグメントには、抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体も包含される。抗体フラグメントの非限定的な例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体フラグメント、ダイアボディ、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、鎖状抗体（Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））；キレート組換え抗体、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｉｅｓ）またはバイボディ（ｂｉｂｏｄｉｅｓ）、イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ）、小モジュール免疫薬剤（ｓｍａｌｌ ｍｏｄｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（ＳＭＴＰｓ）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）抗体、ＶＨＨ含有抗体もしくはムテインまたはそれらの誘導体、および、抗体が所望の生物学的活性を保持する限り、ＣＤＲ配列のようなそのポリペプチドに対して特異的な抗原結合性を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドが挙げられる。
抗体のパパイン消化によって、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメント（各々が単一の抗原結合部位を有する）およびその残りの「Ｆｃ」フラグメント（容易に３５を結晶化する能力を反映した名称）が生成する。ペプシン処理によって、２つの「Ｆｖ」フラグメントを有するＦ（ａｂ’）２フラグメントが得られる。「Ｆｖ」フラグメントは、完全な抗原認識および結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、堅固な非共有結合での１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとの二量体からなる。この立体配置において、ＶＨＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を定義する各可変ドメインの３つのＣＤＲが、相互作用する。６つのＣＤＲが、集合的に、抗体に対する抗原結合特異性をもたらす。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのみのＣＤＲを含むＦｖの半分）でさえも、抗原を認識し、結合する能力を有する。
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、Ｆｖが抗原に結合するための所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照のこと。
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂフラグメントは、抗体ヒンジ領域から１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端において数残基が付加されるという点で、Ｆａｂ’フラグメントと異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が、遊離チオール基を有するＦａｂ’に対する本明細書中での呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、最初、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として作製された。
用語「超可変」領域とは、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基のことをいう。超可変領域は、「相補性決定領域」すなわちＣＤＲ由来のアミノ酸残基［すなわち、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）に記載されているように、軽鎖可変ドメイン中の残基２４−３４（Ｌ１），５０−５６（Ｌ２）および８９−９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）および９５−１０２（Ｈ３）］および／または超可変ループ由来の残基（すなわち、［Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）］に記載されているように、軽鎖可変ドメイン中の残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）および９１−９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）および９６−１０１（Ｈ３）を含む。
「フレームワーク」またはＦＲ残基は、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
句「定常領域」とは、エフェクター機能を付与する抗体分子の一部のことをいう。
句「キメラ抗体」とは、本明細書中で使用されるとき、代表的には異なる種を起源とする２つの異なる抗体から得られる配列を含む抗体のことをいう（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。最も代表的には、キメラ抗体は、ヒトとマウス（一般にヒト定常領域およびマウス可変領域）の抗体フラグメントを含む。
用語「ムテイン」とは、可変領域または可変領域と等価な部分に少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失または挿入を含む抗体のポリペプチド配列のことをいうが、但し、ムテインは、所望の結合親和性または生物学的活性を保持している。ムテインは、親抗体と実質的に相同かまたは実質的に同一であり得る。
用語「誘導体」とは、本発明の抗体に関連して使用されるとき、ユビキチン化、治療的薬剤または診断用薬剤への結合体化、標識（例えば、放射性核種または様々な酵素を用いた標識）、ペグ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）のような共有結合性のポリマー結合および非天然のアミノ酸の化学合成による挿入または置換のような手法によって共有結合的に改変された抗体のことをいう。本発明の誘導体は、本発明の非誘導化分子の結合特性を保持する。
用語「抗体」は、本明細書中で使用されるとき、ＥｐｈＢ３の細胞外部分に結合する能力を保持する以下のもののうちの任意の１つを特に包含する：
１）親アミノ酸配列と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％相同な可変重鎖アミノ酸配列を含み、そして／または親アミノ酸配列と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％相同な可変軽鎖アミノ酸配列を含む（相同性の決定には類似のアミノ酸を考慮に入れる）ムテインをはじめとした図７に示されるアミノ酸配列を有する親抗体のアミノ酸ムテイン；
２）図７に示されるアミノ酸配列を有する親抗体の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、好ましくは重鎖の少なくともＣＤＲ３を含む、および好ましくは２つ以上または３つ以上または４つ以上または５つ以上または６つすべてのＣＤＲを含む、ＥｐｈＢ３結合ポリペプチド；
３）低リスク残基、中程度のリスク残基および高リスク残基を特定するためにＫａｂａｔナンバリングを使用し、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、米国特許第５，７６６，８８６号および本明細書中の実施例８に示される方法に従って親配列を変化させることによって作製されるＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体；そのような抗体は、以下の重鎖の少なくとも１つおよび以下の軽鎖の少なくとも１つを含む：（ａ）ヒト参照免疫グロブリン配列中の対応する残基と異なる低リスクげっ歯類残基のすべてが、ヒト参照免疫グロブリン配列中のヒト残基と同じになるように改変されている重鎖、または（ｂ）低リスクおよび中程度のリスクげっ歯類残基のすべてが、必要であれば、ヒト参照免疫グロブリン配列中のものと同じ残基になるように改変されている重鎖、（ｃ）低リスク残基のすべてが、必要であれば、ヒト参照免疫グロブリン配列と同じ残基になるように改変されている軽鎖、または（ｂ）低リスクおよび中程度のリスク残基のすべてが、必要であれば、ヒト参照免疫グロブリン配列と同じ残基となるように改変されている軽鎖
４）元のげっ歯類軽鎖と少なくとも６０％、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％および最も好ましくは、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％同一を含む）を有する重鎖もしくは軽鎖または重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域を含む前述のパラグラフ（３）における上述の抗体のムテイン；
５）げっ歯類抗体の１つ以上のＣＤＲの高リスク残基を含む、および好ましくは２つ以上または３つ以上または４つ以上または５つ以上または６つすべてのＣＤＲの高リスク残基を含む、および必要に応じて低リスクまたは中程度のリスク残基において１つ以上の変更を含む、ＥｐｈＢ３結合ポリペプチド；
例えば、低リスク残基における１つ以上の変更および中程度のリスク残基における保存的置換を含むもの、または
例えば、中程度のリスクアミノ酸残基および高リスクアミノ酸残基を保持し、低リスク残基において１つ以上の変更を含むもの。
ここで、変更は、挿入、欠失または置換を含み、保存的置換であり得るか、またはその操作された抗体が、配列において、ヒト軽鎖配列もしくはヒト重鎖配列、ヒト生殖細胞系列軽鎖配列もしくはヒト生殖細胞系列重鎖配列、コンセンサスヒト軽鎖配列もしくはコンセンサスヒト重鎖配列またはコンセンサスヒト生殖細胞系列軽鎖配列もしくはコンセンサスヒト生殖細胞系列重鎖配列に、より近くなり得る。そのような企図される変更はまた、以下のように配列様式で表示され得る。ＡＫＫＬＶＨＴＰＹＳＦＫＥＤＦという仮説配列（Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、米国特許第５，７６６，８８６号に従って各残基に割り当てられるそれぞれのリスクは、ＨＭＬＨＭＬＨＭＬＨＭＬＨＭＬ（Ｈ＝高、Ｍ＝中、Ｌ＝低）である）において、この仮説配列の低リスク残基に対する例示的な変更は：ＡＫＸＬＶＸＴＰＸＳＦＸＥＤＸ（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸であるか、あるいは、Ｘは、その位置における元の残基の保存的置換である）と表示され得、低リスクおよび中程度のリスク残基に対する例示的な変更は、同様に、例えば、ＡＹＸＬＹＸＴＹＸＳＹＸＥＹＸ（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸であり、Ｙは、その位置における元の残基の保存的置換である）と表示され得る。
用語「競合抗体」としては、以下が挙げられる。
１）例えば、Ｘ線結晶構造解析で測定されるとき、マウス抗体ＸＨＡ．０５．４６５、ＸＨＡ．０５．７８３、ＸＨＡ．０５．０３１、ＸＨＡ．０５．９４２、ＸＨＡ．０５．７５１、ＸＨＡ．０５．５９９、ＸＰＡ．０４．０３１、ＸＰＡ．０４．０３０、ＸＰＡ．０４．０４０、ＸＨＡ．０５．１１９、ＸＨＡ．０５．２２８、ＸＨＡ．０５．３３７、ＸＨＡ．０５．４４０、ＸＰＡ．０４．０２２、ＸＨＡ．０５．９６４、ＸＨＡ．０５．６５３、ＸＨＡ．０５．８８５、ＸＰＡ．０４．００１、ＸＰＡ．０４．０１３、ＸＰＡ．０４．０１８、ＸＰＡ．０４．０３６、ＸＰＡ．０４．０４６、ＸＰＡ．０４．０４８、ＸＨＡ．０５．６６０、ＸＨＡ．０５．５５２、ＸＨＡ．０５．９４９、ＸＨＡ．０５．１５１、ＸＰＡ．０４．０１９、ＸＨＡ．０５．６７６、ＸＨＡ．０５．０３０、ＸＨＡ．０５．２００、ＸＨＡ．０５．００５、ＸＨＡ．０５．００１、ＸＨＡ．０５．８８８またはＸＨＡ．０５．１１１と同じＥｐｈＢ３のエピトープに結合する非マウスまたは非げっ歯類のモノクローナル抗体；および
２）マウス抗体ＸＨＡ．０５．４６５、ＸＨＡ．０５．７８３、ＸＨＡ．０５．０３１、ＸＨＡ．０５．９４２、ＸＨＡ．０５．７５１、ＸＨＡ．０５．５９９、ＸＰＡ．０４．０３１、ＸＰＡ．０４．０３０、ＸＰＡ．０４．０４０、ＸＨＡ．０５．１１９、ＸＨＡ．０５．２２８、ＸＨＡ．０５．３３７、ＸＨＡ．０５．４４０、ＸＰＡ．０４．０２２、ＸＨＡ．０５．９６４、ＸＨＡ．０５．６５３、ＸＨＡ．０５．８８５、ＸＰＡ．０４．００１、ＸＰＡ．０４．０１３、ＸＰＡ．０４．０１８ ＸＰＡ．０４．０３６、ＸＰＡ．０４．０４６、ＸＰＡ．０４．０４８、ＸＨＡ．０５．６６０、ＸＨＡ．０５．５５２、ＸＨＡ．０５．９４９、ＸＨＡ．０５．１５１、ＸＰＡ．０４．０１９、ＸＨＡ．０５．６７６、ＸＨＡ．０５．０３０、ＸＨＡ．０５．２００、ＸＨＡ．０５．００５、ＸＨＡ．０５．００１、ＸＨＡ．０５．８８８またはＸＨＡ．０５．１１１と７５％超、８０％超または８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％もしくは９５％競合する非マウスまたは非げっ歯類のモノクローナル抗体。
本発明の抗体は、好ましくは、少なくとも１０−６、１０−７、１０−８，１０−９、１０−１０または１０−１１Ｍ以下の親和性ＫＤでＥｐｈＢ３のＥＣＤに結合し、そして好ましくは、レセプターのリン酸化、オリゴマー化、内部移行、分解、シグナル伝達および／またはＥｐｈＢ３媒介性の細胞−細胞接着を誘導する。
必要に応じて、本明細書の出願日前に公然と開示されているか、または本明細書の出願日前に出願された出願に開示されている、任意のキメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体は、本発明の範囲から除外される。
「非げっ歯類」モノクローナル抗体は、本明細書中で広く定義されるような、げっ歯類ハイブリドーマから産生される完全なインタクトなげっ歯類モノクローナル抗体ではない任意の抗体である。従って、非げっ歯類抗体としては、特に、げっ歯類抗体のムテイン、げっ歯類抗体フラグメント、鎖状抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体およびヒト抗体（トランスジェニック動物から産生されるヒト抗体またはファージディスプレイ技術によるヒト抗体を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。同様に、非マウス抗体としては、マウス抗体のムテイン、マウス抗体フラグメント、鎖状抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体およびヒト抗体が挙げられるがこれらに限定されない。
標的抗原
抗体の作製に使用される標的抗原は、例えば、エピトープがその天然の立体配座でディスプレイされることを可能にする別のポリペプチドに必要に応じて融合されていて、所望のエピトープを保持しているＥｐｈＢ３の細胞外部分またはそのフラグメントであり得る。あるいは、細胞の表面で発現されるインタクトなＥｐｈＢ３が、抗体を作製するために使用され得る。そのような細胞は、ＥｐｈＢ３を発現するように形質転換され得るか、またはＥｐｈＢ３を発現する他の天然に存在する細胞であり得る。抗体を作製するために有用なＥｐｈＢ３ポリペプチドの他の型は、当業者に明らかである。
１つの実施形態において、本発明の抗体は、ＥｐｈＢ３のエピトープに結合し、ここで、そのエピトープは、表１に示される配列番号１１−４２１からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ドメインは、リガンド結合ドメイン（配列番号２のアミノ酸残基３９−２１２）、ＴＮＦＲドメイン（配列番号２のアミノ酸残基２５６−３３１）、第１フィブロネクチンドメイン（配列番号２のアミノ酸残基３４０−４３５）および第２フィブロネクチンドメイン（配列番号２のアミノ酸残基４５３−５３５）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ＥｐｈＢ３のリガンド結合ドメインのエピトープに結合し、そのエピトープは、配列番号１１−１４５からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ＥｐｈＢ３のＴＮＦＲドメインのエピトープに結合し、そのエピトープは、配列番号１６１−２５９からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ＥｐｈＢ３の第１フィブロネクチンドメインのエピトープに結合し、そのエピトープは、配列番号２５９−３０１からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ＥｐｈＢ３の第２フィブロネクチンドメインのエピトープに結合し、そのエピトープは、配列番号３８０−４２１からなる群から選択される。
以下の表１は、抗ＥｐｈＢ３抗体による認識に適した鎖状エピトープと同定されているＥｐｈＢ３（配列番号２）の領域を提供する。
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連抗原およびアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）注射または腹腔内（ｉｐ）注射によって、動物において産生される。抗体応答の改善は、二官能性薬剤または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介した結合体化）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸または当該分野で公知の他の薬剤を使用して、免疫される種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリンまたはダイズトリプシンインヒビターに関連抗原を結合体化することによって得られうる。
例えば、１００μｇまたは５μｇのタンパク質または結合体（それぞれウサギまたはマウスに対して）を３容積のフロイント完全アジュバントと組み合わせ、その溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性の結合体または誘導体に対して動物を免疫する。１ヶ月後に、その動物に、フロイント完全アジュバント中の最初の量の１／５から｛一部（１／１０）｝のペプチドまたは結合体を複数部位に皮下注射することによって追加免疫する。追加免疫注射の７〜１４日後に、その動物から出血させ、抗体価について血清をアッセイする。力価がプラトーに達するまで動物を追加免疫する。好ましくは、その動物を、異なるタンパク質に結合体化されている同じ抗原の結合体および／または異なる架橋試薬を介した同じ抗原の結合体で追加免疫する。結合体は、タンパク質融合物として組換え細胞培養物中でも作製され得る。また、ミョウバンのような凝集剤が、免疫応答を増強するために適切に使用される。
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって初めて報告されたハイブリドーマ法を使用して作製され得るか、または組換えＤＮＡ法によって作製され得る。
ハイブリドーマ法では、本明細書中で記載されるように、マウスまたは他の適切な宿主動物（例えば、ハムスターまたはマカクザル）を免疫することによって、免疫に使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、インビトロにおいてリンパ球を免疫してもよい。次いで、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を使用して、リンパ球をミエローマ細胞と融合することにより、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
このように調製されたハイブリドーマ細胞を播種し、そして、好ましくは、未融合の親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含む適当な培養液中で生育する。例えば、親ミエローマ細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠いている場合、ハイブリドーマ用の培養液は、代表的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を阻止する、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む（ＨＡＴ培地）。
好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合するものであり、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体産生を支援するものであり、培地に感受性のものである。ヒトミエローマ細胞株およびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の作製について報告されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７））。例示的なマウスミエローマ株としては、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡから入手可能な、ＭＯＰ−２１およびＭ．Ｃ．−１１マウス腫瘍由来のもの、ならびに、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞が挙げられる。
ハイブリドーマ細胞を生育している培養液を、抗原に対して産生されたモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着測定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）（ＥＬＩＳＡ））によって測定される。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ解析（Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０））によって決定され得る。
所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、そのクローンは、限界希釈法によりサブクローン化され、そして標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））によって生育され得る。この目的に適した培養液としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞を動物内の腹水腫瘍としてインビボにおいて生育してもよい。サブクローンから分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィ）によって、培養液、腹水または血清から適切に分離される。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、ハイブリドーマ細胞から単離され、配列決定され得る。配列の決定は、一般に、目的の遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部の単離が必要である。通常、これには、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡまたは好ましくはｍＲＮＡ（すなわち、ｃＤＮＡ）をクローニングすることが必要である。クローニングは、標準的な手法を使用して行われる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ １−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。例えば、ｃＤＮＡライブラリーを、ポリＡ＋ｍＲＮＡ、好ましくは、膜関連ｍＲＮＡの逆転写によって構築し、そのライブラリーをヒト免疫グロブリンポリペプチド遺伝子配列に特異的なプローブを使用してスクリーニングする。しかしながら、好ましい実施形態では、目的の免疫グロブリン遺伝子セグメント（例えば、軽鎖可変セグメント）をコードするｃＤＮＡ（または全長ｃＤＮＡの一部）を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する。増幅された配列は、任意の適当なベクター、例えば、発現ベクター、ミニ遺伝子ベクターまたはファージディスプレイベクター内に容易にクローニングされ得る。目的の免疫グロブリンポリペプチドの一部の配列を決定することができる限り、使用されるクローニングの特定の方法は重要ではないことが認識されるだろう。本明細書中で使用されるとき、「単離された」核酸分子または「単離された」核酸配列は、（１）同定されていて、核酸の天然の供給源に通常関連する少なくとも１つの夾雑核酸分子から分離されているか、または（２）目的の核酸の配列を決定することができるように、クローニングされているか、増幅されているか、タグ化されているか、または別途バックグラウンド核酸から区別されている、核酸分子であり、それが、単離されたものと考えられる。単離された核酸分子は、天然において見られる形状または環境におけるもの以外のものである。ゆえに、単離された核酸分子は、天然細胞に存在するときの核酸分子と区別される。しかしながら、単離された核酸分子は、通常、抗体を発現する細胞内に含まれている核酸分子を包含し、例えば、その核酸分子は、天然細胞の染色体位置と異なる染色体位置に存在する。
クローニングおよび配列決定に使用されるＲＮＡに対する１つの供給源は、トランスジェニックマウスからＢ細胞を得て、そのＢ細胞を不死細胞に融合することによって作製されるハイブリドーマである。ハイブリドーマを使用する利点は、ハイブリドーマを容易にスクリーニングすることができる点および目的のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが選択される点である。あるいは、ＲＮＡは、免疫動物のＢ細胞（または脾臓全体）から単離することができる。ハイブリドーマ以外の供給源を使用するとき、特異的な結合特性を有する免疫グロブリンまたは免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列についてスクリーニングすることが望ましい場合がある。そのようなスクリーニングのための１つの方法は、ファージディスプレイ技術の使用である。ファージディスプレイは、例えば、Ｄｏｗｅｒら、ＷＯ９１／１７２７１、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＷＯ９２／０１０４７およびＣａｔｏｎ ａｎｄ Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６４５０−６４５４（１９９０）（これらの各々が、本明細書中で参考として援用される）に記載されている。ファージディスプレイ技術を使用する１つの実施形態において、免疫されたトランスジェニックマウス由来のｃＤＮＡ（例えば、全脾臓ｃＤＮＡ）を単離し、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、免疫グロブリンポリペプチドの一部、例えば、ＣＤＲ領域をコードするｃＤＮＡ配列を増幅し、そしてその増幅された配列をファージベクターに挿入する。所望の結合特性を有する目的のペプチド、例えば、可変領域ペプチドをコードするｃＤＮＡを、パニングのような標準的な手法によって同定する。
次いで、増幅された核酸またはクローニングされた核酸の配列を決定する。代表的には、免疫グロブリンポリペプチドの可変領域全体をコードする配列を決定するが、しかしながら、時折、可変領域の一部のみの配列、例えば、ＣＤＲをコードする部分のみの配列で適切である。代表的には、配列決定される部分は、少なくとも３０塩基長であり、しばしば、可変領域の少なくとも約３分の１または少なくとも約２分の１の長さをコードする部分が、配列決定される。
配列決定は、ｃＤＮＡライブラリーから単離されたクローンにおいてか、または、ＰＣＲを使用するとき、増幅された配列のサブクローニング後に、もしくは増幅されたセグメントの直接的なＰＣＲ配列決定によって、行われ得る。配列決定は、標準的な手法を使用して行われる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ １−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＰｒｅｓｓおよびＳａｎｇｅｒ，Ｆ．ら（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。当業者は、クローニングされた核酸の配列を、ヒト免疫グロブリン遺伝子およびｃＤＮＡの公開されている配列と比較することによって、配列決定された領域に応じて、（ｉ）ハイブリドーマ免疫グロブリンポリペプチドの生殖細胞系列セグメントの用法（重鎖のアイソタイプを含む）および（ｉｉ）Ｎ領域の付加および体細胞変異のプロセスから得られる配列を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列を容易に決定することができる。免疫グロブリン遺伝子配列情報の１つの供給源は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄである。
抗体フラグメント
上で述べたように、抗体フラグメントは、インタクトな完全長抗体の一部、好ましくは、インタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含み、鎖状抗体および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体を包含する。抗体フラグメントの非限定的な例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体フラグメント、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、鎖状抗体、キレート組換え抗体、トリボディまたはバイボディ、イントラボディ、ナノボディ、小モジュール免疫薬剤（ＳＭＩＰｓ）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、ＶＨＨ含有抗体もしくはムテインまたはそれらの誘導体、および、抗体が所望の生物学的活性を保持する限り、ＣＤＲ配列のようなそのポリペプチドに対して特異的な抗原結合性を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドが挙げられる。そのような抗原フラグメントは、抗体全体の改変によって作製され得るか、または組換えＤＮＡ技術もしくはペプチド合成を使用して新規に合成され得る。
用語「ダイアボディ」とは、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体フラグメントのことをいい、そのフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨＶＬ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。短すぎて同じ鎖上の２つのドメイン間で対を形成することができないリンカーを使用することによって、それらのドメインは、別の鎖の相補的なドメインと対を形成せざるを得ず、２つの抗原結合部位が形成される。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；および３０ Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）に十分に説明されている。
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在し、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にＦｖが抗原結合にとって望ましい構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーを必要に応じて含む（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６，１９８８およびＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３，１９８８）。Ｆｄフラグメントは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなる。
さらなる抗体フラグメントとしては、ＶＨドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６，１９８９）が挙げられる。
「鎖状抗体」は、１対の抗原結合領域を形成する１対のタンデム型のＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を包含する。鎖状抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る（Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：１０５７−６２（１９９５））。
ペプチドリンカー（ヒンジなし）を介してまたはＩｇＧヒンジを介してＣＨ３に融合されているｓｃＦｖからなる「ミニボディ」は、Ｏｌａｆｓｅｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２００４ Ａｐｒ；１７（４）：３１５−２３に記載されている。
軽鎖を欠いている機能的な重鎖抗体は、コモリザメ（ｎｕｒｓｅ ｓｈａｒｋ）（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３７４：１６８−７３，１９９５）、テンジクザメ（ｗｏｂｂｅｇｏｎｇ ｓｈａｒｋ）（Ｎｕｔｔａｌｌら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：３１３−２６，２００１）およびＣａｍｅｌｉｄａｅ（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６−８，１９９３；Ｎｇｕｙｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７５：４１３，１９９８）（例えば、ラクダ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびラマ）に天然に存在する。これらの動物において、抗原結合部位は、ＶＨＨドメインである単一ドメインに減少されている。これらの抗体は、重鎖可変領域のみを使用して抗原結合領域を形成する。すなわち、これらの機能的抗体は、構造Ｈ２Ｌ２のみを有する重鎖のホモ二量体である（「重鎖抗体」または「ＨＣＡｂ」と呼ばれる）。ラクダ化ＶＨＨは、報告によれば、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ１ドメインを欠いているＩｇＧ２定常領域およびＩｇＧ３定常領域で組み換えられる（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、前出）。例えば、ラマＩｇＧ１は、ＶＨがヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む定常領域で組み換えられている従来の（Ｈ２Ｌ２）抗体アイソタイプであるのに対し、ラマＩｇＧ２およびＩｇＧ３は、ＣＨ１ドメインを欠いていて、軽鎖を含まない重鎖のみのアイソタイプである。古典的なＶＨのみのフラグメントは、可溶型で作製するのが困難であるが、フレームワーク残基が、よりＶＨＨ様に変更されるとき、溶解性および特異的結合の改善がもたらされ得る（例えば、Ｒｅｉｃｈｍａｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９９，２３１：２５−３８を参照のこと）。ラクダ化ＶＨＨドメインは、高親和性で抗原に結合することが見出されており（Ｄｅｓｍｙｔｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６２８５−９０，２００１）、溶液中での安定性が高い（Ｅｗｅｒｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：３６２８−３６，２００２）。ラクダ化重鎖を有する抗体を作製するための方法は、例えば、米国特許公開番号２００５０１３６０４９および２００５００３７４２１に記載されている。
重鎖抗体の可変ドメインが、たった１５ｋＤａの分子量を有する、完全に機能的な最小の抗原結合フラグメントであるので、この実体は、ナノボディと呼ばれている（Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６４：２８５３−５７，２００４）。ナノボディライブラリーは、Ｃｏｎｒａｔｈら（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４５：２８０７−１２，２００１）に記載されているように、または記載されているような組換え法を使用して、免疫されたヒトコブラクダから作製され得る。
イントラボディは、細胞内発現を示し、細胞内タンパク質機能を操作することができる一本鎖抗体である（Ｂｉｏｃｃａら、ＥＭＢＯ Ｊ．９：１０１−１０８，１９９０；Ｃｏｌｂｙら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０１：１７６１６−２１，２００４）。細胞内領域に抗体構築物を保持するという細胞シグナル配列を含むイントラボディは、Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒら（ＥＭＢＯ Ｊ １４：１５４２−５１，１９９５）およびＷｈｅｅｌｅｒら（ＦＡＳＥＢ Ｊ．１７：１７３３−５．２００３）に記載されているように作製され得る。トランスボディ（Ｔｒａｎｓｂｏｄｉｅｓ）は、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）が一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体と融合されている細胞透過性抗体である。Ｈｅｎｇら（Ｍｅｄ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．６４：１１０５−８，２００５）。
標的タンパク質に特異的なＳＭＩＰまたは結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である抗体がさらに企図される。これらの構築物は、抗体エフェクター機能を発揮するために必要な免疫グロブリンドメインに融合された抗原結合ドメインを含む一本鎖ポリペプチドである。例えば、ＷＯ０３／０４１６００、米国特許公開２００３０１３３９３９および米国特許公開２００３０１１８５９２を参照のこと。
多価抗体
いくつかの実施形態において、多価モノクローナル抗体または多重特異性（例えば、二重特異性、三重特異性など）のモノクローナル抗体を作製することが望ましい場合がある。そのような抗体は、標的抗原の少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有し得るか、あるいは、２つの異なる分子、例えば、標的抗原および細胞表面タンパク質またはレセプターに結合し得る。例えば、二重特異性抗体は、標的発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるために、標的に結合する腕および白血球上のトリガー分子（例えば、Ｔ細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ２またはＣＤ３）またはＩｇＧに対するＦｃレセプター（ＦｃγＲ）（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６））に結合する別の腕を含み得る。別の例として、二重特異性抗体は、標的抗原を発現する細胞に細胞傷害性薬剤を局在化させるために使用され得る。これらの抗体は、標的に結合する腕および細胞傷害性薬剤（例えば、サポリン、抗インターフェロン−６０、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサートまたは放射性同位体ハプテン）に結合する腕を有する。多重特異性抗体は、完全長抗体または抗体フラグメントとして調製され得る。
二重特異性抗体は、架橋された抗体または「ヘテロ結合体」抗体を包含する。例えば、ヘテロ結合体における抗体の一方は、アビジンに結合され得、他方は、ビオチンに結合され得る。ヘテロ結合体抗体は、任意の簡便な架橋法を使用して作製され得る。適当な架橋剤は、当該分野で周知であり、多くの架橋手法とともに米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
二重特異性抗体を作製するための別のアプローチによれば、１対の抗体分子の間の界面を操作することによって、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大にすることができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面由来の１つ以上の小さいアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換する。その大きな側鎖と同一サイズまたは類似サイズの埋め合わせとなる「空洞」を、大きなアミノ酸側鎖をより小さな側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置換することによって第２の抗体分子の界面上に作る。このことにより、ヘテロ二量体の収量をホモ二量体のような他の不必要な最終生成物よりも多くするためのメカニズムがもたらされる。１９９６年９月６日に公開されたＷＯ９６／２７０１１を参照のこと。
抗体フラグメントから二重特異性抗体を作製するための手法はまた、文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を使用して調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５）では、インタクトな抗体がタンパク分解性に切断されることにより、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが作製される手順が記載されている。これらのフラグメントは、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元され、それにより、近接するジチオールを安定化させ、分子間のジスルフィド形成を阻止する。次いで、作製されたＦａｂ’フラグメントを、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つを、メルカプトエチルアミンで還元することによってＦａｂ’−チオールに再度変換し、そして、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を形成する。作製された二重特異性抗体は、酵素の選択的な固定化のための薬剤として使用され得る。Ｂｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）では、細菌由来の機能的抗体フラグメントの分泌が開示されている（例えば、Ｂｅｔｔｅｒら、Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４１（１９８８）を参照のこと）。例えば、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され、そして、化学的に結合することにより、二重特異性抗体が形成され得る（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２）；Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２））。
Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）では、完全なヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の作製が記載されている。各Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから別々に分泌され、インビトロで定方向の化学結合に供され、二重特異性抗体が形成された。このように形成された二重特異性抗体は、ＨＥＲ２レセプターを過剰発現している細胞および正常ヒトＴ細胞に結合することができ、そして、ヒト乳房腫瘍標的に対してヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を引き起こすことができた。
組換え細胞培養物から二重特異性抗体フラグメントを直接作製し、単離するための様々な手法もまた報告されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパー、例えば、ＧＣＮ４を使用して作製される（一般に、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合によって、２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合した。その抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元することにより、モノマーが形成され、次いで、再度酸化することにより、抗体ヘテロ二量体が形成された。この方法は、抗体ホモ二量体の作製にも利用され得る。
用語「ダイアボディ」とは、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体フラグメントのことをいい、そのフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨＶＬ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。短すぎて同じ鎖上の２つのドメイン間で対を形成することができないリンカーを使用することによって、それらのドメインは、別の鎖の相補的なドメインと対を形成せざるを得ず、２つの抗原結合部位が形成される。例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照のこと。
一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用することによる二重特異性抗体フラグメントを作製するための別のストラテジーもまた報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。
あるいは、二重特異性抗体は、Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）に記載されているように作製される「鎖状抗体」であり得る。簡潔には、これらの抗体は、１対の抗原結合領域を形成する、１対のタンデム型のＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。鎖状抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る。
２を超える結合価を有する抗体もまた企図される。例えば、三重特異性抗体が、調製され得る（Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１））。
「キレート組換え抗体」は、標的抗原の隣接する非重複エピトープを認識する二重特異性抗体であり、同時に両方のエピトープに結合するのに十分可撓性である（Ｎｅｒｉら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２４６：３６７−７３，１９９５）。
二重特異性Ｆａｂ−ｓｃＦｖ（「バイボディ」）および三重特異性Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）（２）（「トリボディ」）の作製は、Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓら（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：７０５０−５７，２０００）およびＷｉｌｌｅｍｓら（Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．７８６：１６１−７６，２００３）に記載されている。バイボディまたはトリボディについて、ｓｃＦｖ分子は、ＶＬ−ＣＬ（Ｌ）およびＶＨ−ＣＨ１（Ｆｄ）鎖の一方または両方に融合される。例えば、トリボディを作製するために、２つのｓｃＦｖをＦａｂのＣ末端に融合し、バイボディでは、一方のｓｃＦｖをＦａｂのＣ末端に融合する。
抗体の組換え作製
抗体は、当該分野で周知の抗体発現系の１つを使用して、組換えＤＮＡ法によって作製され得る（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）を参照のこと）。
本発明の抗体をコードするＤＮＡを発現ベクターに入れ、次いで、それを宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、ヒト胎児腎２９３細胞（例えば、２９３Ｅ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または別途免疫グロブリンタンパク質を産生しないミエローマ細胞）にトランスフェクトすることにより、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成がもたらされ得る。抗体の組換え作製は、当該分野で周知である。抗体フラグメントは、インタクトな抗体のタンパク分解性消化を介して得られる（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７−１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５）を参照のこと）。しかしながら、これらのフラグメントは、現在、組換え宿主細胞によって直接産生され得る。ペプチド合成および共有結合をはじめとした、抗体フラグメントを作製するための他の手法は、当業者に明らかである。
発現調節配列とは、特定の宿主生物において、作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列のことをいう。原核生物に適した調節配列は、例えば、プロモーター、必要に応じてオペレーター配列およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが知られている。
核酸が、別の核酸配列と機能的な関係に置かれるとき、その核酸は、作動可能に連結されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーについてのＤＮＡが、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、そのＤＮＡは、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結されている；プロモーターまたはエンハンサーが、配列の転写に影響を及ぼす場合、そのプロモーターまたはエンハンサーは、コード配列に作動可能に連結されている；または、リボソーム結合部位が、翻訳を促進するような位置に置かれている場合、そのリボソーム結合部位は、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されているとは、連結されているＤＮＡ配列が、連続的であり、分泌リーダーの場合は、連続的かつリーディングフェーズで（ｉｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）であることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続的である必要はない。連結は、便利な制限酵素認識部位におけるライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の習慣に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。
細胞、細胞株および細胞培養物は、しばしば交換可能に使用され、本明細書中のこのような呼称すべてが、子孫を包含する。形質転換体および形質転換された細胞は、継代の回数を問わず、主要な被験体細胞およびそれに由来する培養物を包含する。すべての子孫が、意図的な変異または偶然の変異に起因して、ＤＮＡ含有量が正確に同一ではないかもしれないことも理解される。形質転換される元の細胞においてスクリーニングされるときに同じ機能または同じ生物学的活性を有する変異体の子孫が包含される。異なる呼称が意図される場合、それは本文中から明らかである。
別の実施形態において、目的の免疫グロブリンのアミノ酸配列は、直接的なタンパク質配列決定によって決定され得る。適当なコーディングヌクレオチド配列は、一般的なコドン表に従って、設計され得る。
所望の抗体のアミノ酸配列ムテインは、適切なヌクレオチドの変化をコーディングＤＮＡに導入することによって、またはペプチド合成によって、調製され得る。そのようなムテインは、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失および／または抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入および／または抗体のアミノ酸配列内の残基の置換を含む。欠失と挿入と置換との任意の組み合わせが行われることにより、最終的な構築物に達するが、但し、最終的な構築物は、所望の特性を有する。アミノ酸の変更はまた、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体またはムテイン抗体の翻訳後のプロセスも変化させ得る（例えば、グリコシル化部位の数または位置の変化）。
抗体のアミノ酸配列ムテインをコードする核酸分子は、当該分野で公知の種々の方法によって調製される。これらの方法としては、天然の供給源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列ムテインの場合）、あるいは、先に調製されたその抗体のムテインバージョンもしくは非ムテインバージョンのオリゴヌクレオチド媒介性の（または部位特異的な）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発およびカセット突然変異誘発による調製が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明はまた、宿主細胞によって認識される調節配列に必要に応じて作動可能に連結されている本発明の抗体をコードする単離された核酸、それらの核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに、その宿主細胞を培養することによって、その核酸が発現され、必要に応じて宿主細胞培養物または培養液から抗体を回収する工程を含み得る、抗体を作製するための組換え手法を提供する。
抗体の組換え作製にむけて、抗体をコードする核酸が単離され、そして、その核酸は、さらにクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現にむけて、複製可能なベクターに挿入される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離され、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定される。多くのベクターが利用可能である。そのベクター成分としては、一般に、以下：シグナル配列、複製起点、１つ以上の選択マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。
（１）シグナル配列成分
本発明の抗体は、直接、組換え的に作製され得るだけでなく、異種ポリペプチド（好ましくは、シグナル配列または成熟タンパク質もしくは成熟ポリペプチドのＮ末端に特異的な切断部位を有する他のポリペプチドである）との融合ポリペプチドとしても組換え的に作製され得る。選択されるシグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識されるものおよびプロセシングされるもの（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断されるもの）である。原核生物の宿主細胞が、天然抗体のシグナル配列を認識せず、プロセシングしない場合、そのシグナル配列は、例えば、ペクチン酸リアーゼ（例えば、ｐｅｌＢ）アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択されるシグナル配列によって置換され得る。酵母分泌に対しては、天然シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓのα因子リーダーを含む）または酸ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダーまたはＷＯ９０／１３６４６に記載されているシグナルで置換され得る。哺乳動物細胞発現では、哺乳動物のシグナル配列ならびにウイルスの分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。
そのような前駆体領域に対するＤＮＡは、抗体をコードするＤＮＡに読み枠で連結される。
（２）複製起点成分
発現ベクターとクローニングベクターの両方が、選択される１つ以上の宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターでは、この配列は、宿主の染色体ＤＮＡとは無関係にベクターの複製を可能にする配列であり、複製の起点または自律複製配列を含む。種々の細菌、酵母およびウイルスに対するそのような配列は、周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に適しており、２μプラスミド起点は、酵母に適しており、そして、哺乳動物細胞においては、様々なウイルスの起点がクローニングベクターに有用である。一般に、複製起点成分は、哺乳動物の発現ベクターに必要ではない（ＳＶ４０起点は初期プロモーターを含むので、代表的にはこれだけが使用され得る）。
（３）選択マーカー成分
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択的な遺伝子を含み得る。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他のトキシン、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、テトラサイクリン、Ｇ４１８、ジェネテシン、ヒスチジノールまたはミコフェノール酸に対する抵抗性を付与するタンパク質をコードするか、（ｂ）栄養要求性欠損を補完するタンパク質をコードするか、または（ｃ）複合培地から利用できない決定的な栄養分を供給するタンパク質をコードする（例えば、Ｂａｃｉｌｌｉに対するＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。
選択スキームの１つの例は、宿主細胞の増殖を停止する薬物を利用する。異種遺伝子で首尾よく形質転換された細胞は、薬物抵抗性を付与するタンパク質を産生するので、選択レジメンを生き残る。そのような優性選択の例は、薬物メトトレキサート、ネオマイシン、ヒスチジノール、ピューロマイシン、ミコフェノール酸およびハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞に適した選択マーカーの別の例は、抗体をコードする核酸の取り込む能力のある細胞の同定を可能にするものである（例えば、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉおよび−ＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなど）。
例えば、ＤＨＦＲの競合性アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含む培養液中で形質転換体のすべてを培養することによって、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞が同定される。野生型ＤＨＦＲを使用するとき、適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。
あるいは、本発明の抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質およびアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）のような別の選択マーカーをコードするＤＮＡ配列で形質転換されているか、または共形質転換されている宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、選択マーカーに対する選択薬剤（例えば、アミノグリコシド系抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシンまたはＧ４１８）を含む培地中での細胞の増殖によって選択され得る。米国特許第４，９６５，１９９号を参照のこと。
酵母において使用するのに適した選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９））。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で生育する能力を欠いている酵母の変異体株、例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１に対して選択マーカーを提供する。Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７）。次いで、酵母宿主細胞ゲノムにおいてｔｒｐ１が破壊されていることにより、トリプトファンの非存在下における増殖によって形質転換を検出するために有効な環境が提供される。同様に、Ｌｅｕ２遺伝子を有する公知プラスミドによって、Ｌｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２または３８，６２６）が補完される。ｕｒａ３遺伝子を有するプラスミドによって、Ｕｒａ３欠損酵母株が補完される。
さらに、１．６μｍの環状プラスミドｐＫＤ１由来のベクターが、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ酵母の形質転換に使用され得る。あるいは、Ｋ．ｌａｃｔｉｓに対して、組換え子ウシキモシンの大規模生産用の発現系が報告された。Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０）。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓの工業用株による成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌に適した多コピー発現ベクターもまた開示されている。Ｆｌｅｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５（１９９１）。
（４）プロモーター成分
発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主生物に認識され、抗体をコードする核酸に作動可能に連結されているプロモーターを含む。原核生物宿主とともに使用することに適したプロモーターとしては、アラビノース（例えば、ａｒａＢ）プロモーターｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系およびｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかしながら、他の公知の細菌プロモーターが、適当である。細菌系で使用するためのプロモーターはまた、本発明の抗体をコードするＤＮＡに作動可能に連結されているシャイン・ダルガノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。
真核生物に対するプロモーター配列は、公知である。実質的にすべての真核生物遺伝子が、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始から７０〜８０塩基上流に見られる別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域であり、ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドであり得る。コード配列の３’末端にポリＡテールを付加するためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列が、ほとんどの真核生物遺伝子の３’末端に存在する。これらの配列のすべてが、真核生物発現ベクター内に適切に挿入される。
酵母宿主とともに使用するための適当なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼおよびグルコキナーゼ）に対するプロモーターが挙げられる。
増殖条件によって制御される転写のさらなる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素ならびにマルトースおよびガラクトースの利用に関与する酵素に対するプロモーター領域である。酵母の発現における使用に適したベクターおよびプロモーターは、ＥＰ７３，６５７にさらに記載されている。酵母エンハンサーもまた、酵母プロモーターとともに有利に使用される。
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの抗体の転写は、例えば、ウイルス（例えば、Ａｂｅｌｓｏｎ白血病ウイルス、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、最も好ましくは、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サルウイルス４０（ＳＶ４０））のゲノムから得られるプロモーター、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターによって制御される（但し、そのようなプロモーターが、宿主細胞系と適合している場合）。
ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限フラグメントとして便利よく得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限フラグメントとして便利よく得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを使用して哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現するための系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の改変は、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現については、Ｒｅｙｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２９７：５９８−６０１（１９８２）もまた参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列が、プロモーターとして使用され得る。
（５）エンハンサーエレメント成分
高等真核生物による本発明の抗体をコードするＤＮＡの転写は、しばしば、ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増加する。現在、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェトプロテインおよびインスリン）由来の多くのエンハンサー配列が知られている。しかしながら、代表的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用される。例としては、複製開始点（ｂｐ１００−２７０）の後ろ側におけるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後ろ側におけるポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物プロモーターの活性化のための増強エレメントについては、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ ２９７：１７−１８（１９８２）もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体をコードする配列に対して５’位または３’位のベクター内にスプライシングされ得るが、好ましくは、プロモーターから５’の部位に位置する。
（６）転写終結成分
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物由来の有核細胞）において使用される発現ベクターはまた、転写を終結するためおよびｍＲＮＡを安定化するために必要な配列も含む。そのような配列は、通常５’から利用可能であり、時折、真核生物またはウイルスのＤＮＡもしくはｃＤＮＡの３’非翻訳領域から利用可能である。これらの領域は、抗体をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６および本明細書中で開示される発現ベクターを参照のこと。別のものは、マウス免疫グロブリン軽鎖転写ターミネーターである。
（７）宿主細胞の選択および形質転換
本明細書中のベクター内のＤＮＡのクローニングまたは発現に適した宿主細胞は、上に記載された原核生物、酵母または高等真核生物細胞である。この目的に適した原核生物としては、真正細菌（例えば、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓおよびＳｈｉｇｅｌｌａならびにＢａｃｉｌｌｉ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６，７１０に開示されているＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ４１Ｐ））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。１つの好ましいＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、他の株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）およびＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５））が適当である。これらの例は、限定的ではなく、例示的なものである。
原核生物に加えて、真核生物の微生物（例えば、糸状菌または酵母）が、抗体をコードするベクターに適したクローニング宿主または発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅすなわち通常のパン酵母は、下等真核生物宿主微生物のうち最もよく使用される。しかしながら、多くの他の属、種および株（例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属宿主（例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓおよびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｓ（ＥＰ１８３，０７０）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；および糸状菌（例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、ＴｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属宿主（例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＡ．ｎｉｇｅｒ））が、一般に利用可能であり、本明細書中で有用である。
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物から得られる。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルスの株および変種ならびに宿主由来の対応する許容される昆虫宿主細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（毛虫）、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）およびＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）が同定されている。トランスフェクション用の種々のウイルス株（例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＮＰＶのＬ−１変種およびＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＮＰＶのＢｍ−５株）が、公的に利用可能であり、そのようなウイルスは、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために本発明の本明細書中のウイルスとして使用され得る。
ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、タバコ、ウキクサ（ｌｅｍｎａ）および他の植物細胞の植物細胞培養物もまた、宿主として利用され得る。
しかしながら、脊椎動物細胞における関心が最も高く、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の繁殖は、通例の手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４およびチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））を含む）；ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系統（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ヒト胎児腎系統（２９３または懸濁培養物における増殖のためにサブクローン化された２９３細胞［Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）］；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；バッファローラット（ｂｕｆｆａｌｏ ｒａｔ）肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒトヘパトーム系統（ＨｅｐＧ２）である。
宿主細胞は、抗体産生について上に記載された発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換されるか、またはトランスフェクトされ、そして、プロモーターを誘導するためか、形質転換体を選択するためか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に改変された従来の栄養培地中で培養される。さらに、選択マーカーで分断された多コピーの転写単位を有する新規ベクターおよびトランスフェクトされた細胞株が特に有用であり、抗体の発現にとって好ましい。
（８）宿主細胞の培養
本発明の抗体を作製するために使用される宿主細胞は、種々の培地中で培養され得る。市販の培地（例えば、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ），（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ））が、宿主細胞を培養するために適している。さらに、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；もしくは同第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０１０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国特許Ｒｅ．Ｎｏ．３０，９８５に記載されている培地のいずれかが、宿主細胞用の培養液として使用され得る。これらの培地のいずれかは、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸）、緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ（商標）薬物）、微量元素（マイクロモル濃度の範囲で最終濃度に通常存在する無機化合物として定義される）およびグルコースまたは同等のエネルギー源が補充されていてもよい。他の任意の必要な栄養補助剤もまた、当業者に公知の適切な濃度で含まれていてもよい。培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、発現について選択された宿主細胞で以前に使用されていたものであり、当業者には明らかである。
（９）抗体の精製
組換え手法を使用するとき、抗体は、細胞内に産生され得るか、細胞周辺腔内に産生され得るか、または培地中（微生物の培養物を含む）に直接分泌され得る。抗体が、細胞内に産生される場合、第１の工程として、宿主細胞または溶解されたフラグメントのいずれかである粒子状の残骸が、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。Ｂｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）；ＩＣＳＵ Ｓｈｏｒｔ Ｒｅｐｏｒｔｓ １０：１０５（１９９０）；およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：４５７−４６１（１９９３）では、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順が記載されている（［Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２）］もまた参照のこと。
微生物または哺乳動物の細胞から調製される抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ陽イオンまたは陰イオン（ａｖｉａｎ）交換クロマトグラフィおよびアフィニティークロマトグラフィを使用して精製され得るが、ここで、アフィニティークロマトグラフィが、好ましい精製手法である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに左右される。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用され得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプおよびヒトγ３に対して推奨されている（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドを固定するマトリックスは、アガロースであることが最も多いが、他のマトリックスも利用可能である。力学的に安定なマトリックス（例えば、コントロールドポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）またはポリ（スチレンジビニル）ベンゼン）は、アガロースで達成され得るものよりも速い流速および短い処理時間を可能にする。抗体が、ＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が、精製に有用である。タンパク質精製のための他の手法（例えば、イオン交換カラムにおける分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカにおけるクロマトグラフィ、ヘパリンにおけるクロマトグラフィ、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂におけるＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィ（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫安塩析）もまた、回収される抗体に応じて利用可能である。
キメラ抗体
ヒトにおいて単独でか、または結合体として、繰り返しインビボ投与されるときのげっ歯類抗体は、レシピエントにおいてそのげっ歯類抗体に対して免疫応答；いわゆるＨＡＭＡ応答（ヒト抗マウス抗体）を惹起する。反復投薬が必要な場合に、このＨＡＭＡ応答は、その医薬の有効性を制限し得る。抗体の免疫原性は、ポリエチレングリコールのような親水性ポリマーによる抗体の化学修飾によって、または抗体構造をよりヒト様、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体またはＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体にする遺伝子操作法を使用することによって、低減され得る。そのような操作された抗体は、親マウスモノクローナル抗体よりもヒトにおいて免疫原性が低いので、その操作された抗体は、アナフィラキシーのリスクが極めて低い状態でヒトの処置に使用され得る。従って、これらの抗体は、ヒトへのインビボ投与を含む治療的な適用において好ましい場合がある。
マウスモノクローナル抗体の可変Ｉｇドメインがヒト定常Ｉｇドメインに融合されているキメラモノクローナル抗体は、当該分野で公知の標準的な手順を使用して作製され得る（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら（１９８４）Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ；Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｒｅｇｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１，６８４１−６８５５；およびＢｏｕｌｉａｎｎｅ，Ｇ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２，６４３−６４６（１９８４）を参照のこと）。例えば、ＣＥＡに結合するげっ歯類抗体の可変ドメインに対する遺伝子配列を、ヒトミエローマタンパク質の可変ドメインで置換することにより、組換えキメラ抗体を作製することができる。これらの手順は、ＥＰ１９４２７６、ＥＰ０１２０６９４、ＥＰ０１２５０２３、ＥＰ０１７１４９６、ＥＰ０１７３４９４およびＷＯ８６／０１５３３に詳述されている。いくつかのキメラモノクローナル抗体の免疫原性は、ヒトにおいてが低いと証明されているが、マウス可変Ｉｇドメインは、なおも重大なヒト抗マウス応答をもたらし得る。
ヒト化抗体
ヒト化抗体は、例えば：（１）ヒトフレームワークおよび定常領域上に非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を移植すること（当該分野において「ＣＤＲ移植」を介したヒト化と呼ばれるプロセス）、あるいは、（２）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、それらを表面残基の置換によってヒト様表面で「覆い隠す」こと（当該分野において「ベニア化（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」と呼ばれるプロセス）をはじめとした種々の方法によって達成され得る。本発明では、ヒト化抗体は、「ヒト化」抗体と「ベニア化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）」抗体の両方を包含する。これらの方法は、例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２ ５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：６８５１ ６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｏｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５ ９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４ １５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９ ４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９ ２１７（１９９４）；およびＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．４（７）：７７３ ８３（１９９１）（これらの各々が、本明細書中で参考として援用される）に開示されている。
例えば、げっ歯類抗体のＣＤＲの遺伝子配列を、単離するか、または合成し、そして、相同なヒト抗体遺伝子の対応配列領域を置換することにより、元のげっ歯類抗体の特異性を有するヒト抗体が作製され得る。これらの手順は、ＥＰ０２３９４０、ＷＯ９０／０７８６１およびＷＯ９１／０９９６７に記載されている。
ＣＤＲ移植は、マウス重鎖可変Ｉｇドメインおよびマウス軽鎖可変Ｉｇドメイン由来の６つのＣＤＲのうちの１つ以上をヒト可変Ｉｇドメインの適切な４つのフレームワーク領域に導入することを含み、これは、ＣＤＲ移植とも呼ばれる。この手法（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２，３２３（１９８８））は、抗原との主要な接触物であるＣＤＲループを支持する足場として、保存されたフレームワーク領域（ＦＲ１−ＦＲ４）を利用する。しかしながら、フレームワーク領域のアミノ酸が、抗原結合に寄与し得、ＣＤＲループのアミノ酸が、２つの可変Ｉｇドメインの会合に影響し得るので、ＣＤＲ移植の欠点は、ＣＤＲ移植が、元のマウス抗体よりも実質的に低い結合親和性を有するヒト化抗体がもたらされ得る点である。ヒト化モノクローナル抗体の親和性を維持するために、元のマウス抗体のフレームワーク領域に最もよく似たヒトフレームワーク領域を選ぶことによって、そして、抗原結合部位のコンピュータモデリングによって支援されるフレームワーク内またはＣＤＲ内の単一アミノ酸の部位特異的突然変異誘発によって、ＣＤＲ移植の手法を改善することができる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ら（１９９４），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２９６８−２９７６）。
抗体をヒト化する１つの方法は、非ヒト重鎖配列および非ヒト軽鎖配列をヒト重鎖配列およびヒト軽鎖配列とアラインメントする工程、そのようなアラインメントに基づいて非ヒトフレームワークを選択し、それをヒトフレームワークと置換する工程、ヒト化配列の立体配座を予測する分子モデリングを行う工程および親抗体の立体配座と比較する工程を含む。このプロセスは、ヒト化配列モデルの予測される立体配座が、親非ヒト抗体の非ヒトＣＤＲの立体配座に近づくまで、ＣＤＲの構造を妨げるＣＤＲ領域内の残基の復帰突然変異の繰り返しが続く。そのようなヒト化抗体は、さらに、例えばＡｓｈｗｅｌｌレセプターを介する取り込みおよびクリアランスを促進するように誘導体化され得る（例えば、米国特許第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号（これらの特許は本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
合理的な設計による多くのマウスモノクローナル抗体のヒト化が、報告されている（例えば、２００２年７月１１日公開の２００２００９１２４０、ＷＯ９２／１１０１８および米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，７６６，８６６号を参照のこと。
Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体
句「Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体」とは、非ヒト抗体、代表的にはマウスモノクローナル抗体から得られる抗体のことをいう。あるいは、Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体は、非ヒト抗体である親抗体の抗原結合特性を保持しているか、または実質的に保持しているが、ヒトに投与されるときに親抗体と比べて低い免疫原性を示すキメラ抗体から得られうる。
抗体可変ドメインのＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（商標）は、抗体分子の結合活性を維持しながら免疫原性を低下させるための方法として、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａによって報告されている［例えば、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、米国特許第５，７６６，８８６号；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７：８０５−８１４（１９９４）を参照のこと］。その方法によれば、各可変領域アミノ酸には、置換リスクが割り当てられている。アミノ酸置換は、３つのリスクカテゴリーのうちの１つによって区別される：（１）低リスク変更は、抗原結合を破壊する可能性が最も低く、免疫原性を低下させるために最も有望なものであり；（２）中程度のリスク変更は、免疫原性をさらに低下させ得るが、抗原結合またはタンパク質フォールディングに影響する可能性が高いものであり；（３）高リスク残基は、結合するためまたは抗体構造を維持するために重要であり、抗原結合またはタンパク質フォールディングに影響するリスクが最も高いものである。プロリンの３次元構造上の役割に起因して、プロリンにおける改変は、その位置が代表的には低リスクの位置であったとしても、少なくとも中程度のリスク変更であると通常考えられる。
げっ歯類抗体の軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原結合またはタンパク質フォールディングのいずれかに悪影響を及ぼしそうにないがヒトの環境において免疫原性を低下させる可能性があると決定された位置においてヒトアミノ酸で置換することによって、Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）される（ヒト操作される）。「低リスク」の位置に存在し、上記方法の改変の候補であるアミノ酸残基は、げっ歯類可変領域のアミノ酸配列をヒト可変領域配列とアラインメントすることによって同定される。個別のＶＨ配列もしくはＶＬ配列またはヒトコンセンサスＶＨ配列もしくはヒトコンセンサスＶＬ配列または個別のヒト生殖細胞系列配列もしくはコンセンサスヒト生殖細胞系列配列をはじめとした任意のヒト可変領域が、使用され得る。任意の数の低リスク位置におけるアミノ酸残基またはすべての低リスク位置におけるアミノ酸残基が、変更され得る。例えば、低リスク位置の各々において、アラインメントされたマウスとヒトのアミノ酸残基が異なる場合、げっ歯類残基をヒト残基で置換するアミノ酸の改変が導入される。あるいは、すべての低リスク位置におけるアミノ酸残基および任意の数の中程度のリスク位置におけるアミノ酸残基が、変更され得る。理想的には、最低の免疫原性を達成するために、低リスク位置および中程度のリスク位置のすべてが、げっ歯類配列からヒト配列に変更される。
改変された重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む合成遺伝子が、構築され、そしてヒトγ重鎖および／またはカッパ軽鎖定常領域に連結される。任意のヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域が、ＩｇＡ（ＩｇＡ１またはＩｇＡ２のような任意のサブクラスのもの）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のような任意のサブクラスのもの）またはＩｇＭを含むＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体可変領域とともに使用され得る。ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子は、哺乳動物細胞のような宿主細胞に導入され、生じる組換え免疫グロブリン生成物が得られ、特徴付けされる。
トランスジェニック動物由来のヒト抗体
標的抗原に対するヒト抗体はまた、内因性免疫グロブリンの産生がなく、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作されたトランスジェニック動物を使用して作製することもできる。例えば、ＷＯ９８／２４８９３は、ヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック動物を開示しており、ここで、その動物は、内在性の重鎖遺伝子座および軽鎖遺伝子座の不活性化に起因して、機能的な内因性の免疫グロブリンを産生しない。ＷＯ９１／１０７４１はまた、免疫原に対して免疫応答を惹起することができるトランスジェニック非霊長類哺乳動物宿主を開示しており、ここで、抗体は、霊長類の定常領域および／または可変領域を有し、内在性の免疫グロブリンをコードする遺伝子座は、置換されているか、または不活性化されている。ＷＯ９６／３０４９８は、哺乳動物において免疫グロブリン遺伝子座を改変するＣｒｅ／Ｌｏｘ系を使用して、定常領域もしくは可変領域の全部または一部を置換し、改変された抗体分子を形成することを開示している。ＷＯ９４／０２６０２は、不活性化された内在性Ｉｇ遺伝子座および機能的なヒトＩｇ遺伝子座を有する非ヒト哺乳動物宿主を開示している。米国特許第５，９３９，５９８号は、内因性の重鎖を欠いていて１つ以上の異種の定常領域を含む外来性免疫グロブリン遺伝子座を発現するトランスジェニックマウスを作出する方法を開示している。
上に記載されたトランスジェニック動物を使用することにより、選択された抗原性分子に対する免疫応答がもたらされ得、そして抗体産生細胞をその動物から取り出し、ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを産生するために使用され得る。免疫プロトコル、アジュバントなどは、当該分野で公知のものであり、例えば、ＷＯ９６／３３７３５に記載されているようなトランスジェニックマウスの免疫に使用されるものである。この公報は、ＩＬ６、ＩＬ８、ＴＮＦａ、ヒトＣＤ４、Ｌセレクチン、ｇｐ３９および破傷風トキシンをはじめとした種々の抗原性分子に対するモノクローナル抗体を開示している。それらのモノクローナル抗体は、対応タンパク質の生物学的活性または生理学的作用を阻害する能力または中和する能力について試験され得る。ＷＯ９６／３３７３５は、ＩＬ−８に対するモノクローナル抗体が、ＩＬ−８で免疫されたトランスジェニックマウスの免疫細胞から得られ、好中球のＩＬ−８誘導性の機能を抑制したことを開示している。トランスジェニック動物を免疫するために使用される抗原に対して特異性を有するヒトモノクローナル抗体もまた、ＷＯ９６／３４０９６および米国特許出願番号２００３０１９４４０４；および米国特許出願番号２００３００３１６６７）に開示されている。Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；および米国特許第５，５９１，６６９号、米国特許第５，５８９，３６９号、米国特許第５，５４５，８０７号；および米国特許出願番号２００２０１９９２１３、ＷＯ９６／３４０９６および米国特許出願番号２００３０１９４４０４；および米国特許出願番号２００３００３１６６７もまた参照のこと。
モノクローナル抗体を作製するために有用なさらなるトランスジェニック動物としては、米国特許第５，７７０，４２９号およびＦｉｓｈｗｉｌｄら（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１，１９９６）に記載されているＭｅｄａｒｅｘ ＨｕＭＡｂ−ＭＯＵＳＥ（登録商標）が挙げられ、これは、ヒト抗体の重鎖および軽鎖をコードする再編成されていないヒト抗体遺伝子由来の遺伝子配列を含んでいる。ＨｕＭＡｂ−ＭＯＵＳＥ（登録商標）を免疫することにより、標的タンパク質に対するモノクローナル抗体の産生が可能である。
また、Ｉｓｈｉｄａら（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．４：９１−１０２，２００２）は、メガベースのサイズのヒトＤＮＡのセグメントを含み、ヒト免疫グロブリン（ｈＩｇ）遺伝子座全体を組み込んでいるＴｒａｎｓＣｈｒｏｍｏ Ｍｏｕｓｅ（ＴＣＭＯＵＳＥ（商標））を報告している。ＴＣ ＭＯＵＳＥは、ＩｇＧのすべてのサブクラス（ＩｇＧ１−Ｇ４）を含む十分に多様なｈＩｇのレパートリーを有する。ＴＣ ＭＯＵＳＥを様々なヒト抗原で免疫することにより、ヒト抗体を含む抗体応答がもたらされる。
米国特許出願番号２００３００９２１２５は、所望のエピトープに対する動物の免疫応答を片寄らせるための方法を記載している。ヒト抗体はまた、インビトロにおいて活性化されたＢ細胞によっても産生され得る（米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号を参照のこと）。
ファージディスプレイ技術による抗体
組換えヒト抗体遺伝子のレパートリーを作製するための技術および繊維状バクテリオファージの表面上におけるコードされた抗体フラグメントのディスプレイの開発によって、ヒト抗体を直接作製し、選択するための組換え手段が提供され、この手段は、ヒト化抗体、キメラ抗体、マウス抗体またはムテイン抗体にも適用され得る。ファージ技術によって作製された抗体は、細菌において抗原結合フラグメント（通常、ＦｖまたはＦａｂフラグメント）として産生されるので、エフェクター機能を有しない。エフェクター機能は、２つのストラテジーのうちの１つによって導入され得る：フラグメントを、哺乳動物細胞において発現するように完全な抗体に操作し得るか、またはエフェクター機能を引き起こすことができる第２の結合部位を有する二重特異性抗体フラグメントに操作し得る。
代表的には、抗体のＦｄフラグメント（ＶＨ−ＣＨ１）および軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）が、別々にＰＣＲによってクローニングされ、そして、コンビナトリアル・ファージディスプレイ・ライブラリー中にランダムに組み換えられ、次いで、それを特定の抗原に対する結合について選択することができる。Ｆａｂフラグメントは、ファージ表面上で発現する、すなわち、それらをコードする遺伝子に物理的に連結されている。従って、抗原結合によるＦａｂの選択によって、Ｆａｂをコードする配列について同時に選択し、続いてその配列を増幅し得る。抗原結合と再増幅（パニングと呼ばれる手順）を数回繰り返すことによって、抗原に特異的なＦａｂが、濃縮され、最終的に単離される。
１９９４年には、「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる抗体をヒト化するためのアプローチが報告された。誘導選択は、マウスモノクローナル抗体をヒト化するためにファージディスプレイ手法の力を利用する（Ｊｅｓｐｅｒｓ，Ｌ．Ｓ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２，８９９−９０３（１９９４）を参照のこと）。このために、マウスモノクローナル抗体のＦｄフラグメントは、ヒト軽鎖ライブラリーとともにディスプレイされ得、次いで、得られるハイブリッドＦａｂライブラリーは、抗原を用いて選択され得る。それにより、マウスＦｄフラグメントは、選択を誘導する鋳型を提供する。続いて、選択されたヒト軽鎖が、ヒトＦｄフラグメントライブラリーと組み合わされる。得られるライブラリーを選択することにより、完全にヒトＦａｂが得られる。
ファージディスプレイライブラリーからヒト抗体を得るための種々の手順が報告されている（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１−５９７（１９９１）；米国特許第５，５６５，３３２号および同第５，５７３，９０５号；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ． ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．，ＴＩＢＴＥＣＨ １２，１７３−１８４（１９９４）を参照のこと）。特に、ファージディスプレイライブラリーから得られる抗体のインビトロ選択およびインビトロ進化は、強力なツールになっている（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄ Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ，Ｃ．Ｆ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７，１９１−２８０（１９９４）；およびＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２，４３３−４５５（１９９４）；米国特許出願番号２００２０００４２１５およびＷＯ９２／０１０４７；２００３年１０月９日公開の米国特許出願番号２００３０１９０３１７および米国特許第６，０５４，２８７号；米国特許第５，８７７，２９３号を参照のこと。
Ｗａｔｋｉｎｓ，“Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｐｈａｇｅ−Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｂｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｌｉｆｔ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｈａｇｅ−Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １７８：１８７−１９３および２００３年３月６日公開の米国特許出願番号２００１２００３００４４７７２は、ファージによって発現される抗体ライブラリーまたは他の結合分子を捕捉リフト（ｃａｐｔｕｒｅ ｌｉｆｔ）によってスクリーニングするための方法を記載しており、この方法は、固体支持体上に結合分子候補を固定化することを含んでいる。
抗体産物は、本明細書中の「スクリーニング法」と題される項に記載されるようなアッセイまたは当該分野で公知の任意の適当なアッセイを使用して、本発明の処置方法における活性および適合性についてスクリーニングされ得る。
アミノ酸配列ムテイン
本発明の抗体は、親抗体のムテインを包含し、ここで、その親抗体のポリペプチド配列は、可変領域または可変領域と等価な部分（ＣＤＲ内の領域を含む）において少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失または挿入によって変更されているが、但し、そのムテインは、所望の結合親和性または生物学的活性を保持している。ムテインは、親抗体と実質的に相同であり得るか、または実質的に同一であり得、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一または相同であり得る。この配列に関する同一性または相同性は、配列がアラインメントされ、必要であれば、最大配列同一性パーセントを達成するためにギャップが導入された後に親配列と同一であるアミノ酸残基の候補配列中のパーセンテージとして本明細書中で定義され、いかなる保存的置換も配列同一性の一部としてみなされない。抗体配列に対するＮ末端、Ｃ末端または内部の伸長、欠失または挿入は、いずれも配列同一性または配列相同性に影響すると解釈されるべきでない。従って、配列同一性は、２つのポリペプチドのアミノ酸の位置における類似性を比較するために通常使用される標準的な方法によって決定され得る。２つのポリペプチドは、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡのようなコンピュータプログラムを使用して、それぞれのアミノ酸に最適に一致させるためにアラインメントされる（一方または両方の配列の完全長に対して、または、一方または両方の配列の所定の部分に対して）。上記プログラムは、デフォルトのオープニングペナルティ（ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ）およびデフォルトのギャップペナルティを提供し、スコア行列（例えば、ＰＡＭ２５０［標準的なスコア行列；Ｄａｙｈｏｆｆら、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐ．３（１９７８）を参照のこと］）が、このコンピュータプログラムとともに使用され得る。例えば、同一性パーセントは：完全一致の総数に１００を乗じ、そして一致したスパン内の長いほうの配列の長さと２つの配列をアラインメントするために長い方の配列に導入されたギャップの数との合計で除するとして算出され得る。
本発明の抗体はまた、結合親和性に影響を及ぼさないが、エフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）またはクリアランスおよび取り込み（および半減期に対して生じる影響））を変化させ得る、定常領域のポリペプチド配列中の変更も含み得る。
挿入
アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さに及ぶアミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合ならびに単一または複数のアミノ酸残基、例えば、２個、３個またはそれ以上の残基の配列内の挿入を包含する。末端の挿入の例としては、Ｎ末端のメチオニル残基を有する抗体またはエピトープタグもしくはサルベージ・レセプター・エピトープに融合された抗体（抗体フラグメントを含む）が挙げられる。抗体分子の他の挿入性ムテインは、グリコシル化部位の付加、分子内もしくは分子間の結合のためのシステインの付加または抗体の血清半減期を長くするポリペプチドへの、例えばＮ末端もしくはＣ末端における融合を包含する。例えば、システイン結合は、その安定性を改善するために抗体に付加され得る（特に、抗体が、Ｆｖフラグメントのような抗体フラグメントである場合）。
抗体のグリコシル化は、代表的にはＮ結合型またはＯ結合型である。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合のことをいう。アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニンというトリペプチド配列（ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）が、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的な結合に対する認識配列である。ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在することにより、潜在的なグリコシル化部位が形成される。従って、Ｎ結合型グリコシル化部位は、これらのトリペプチド配列の１つ以上を含むようにアミノ酸配列を変化させることによって抗体に付加され得る。Ｏ結合型グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も多いのはセリンまたはトレオニンへの、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン（ａｃｅｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）、ガラクトースまたはキシロースのうちの１つの結合のことをいうが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンもまた、使用され得る。Ｏ結合型グリコシル化部位は、１つ以上のセリン残基またはトレオニン残基を元の抗体の配列に挿入するか、または置換することによって、抗体に付加され得る。
用語「エピトープタグ化」とは、エピトープタグに融合された抗体のことをいう。エピトープタグポリペプチドは、抗体をもたらし得るエピトープを提供するのに十分であるが、その抗体の活性を妨害しないくらい短い残基を有する。エピトープタグは、好ましくは、その抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないくらい十分特有のものである。適当なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６アミノ酸残基を有し、通常、約８〜５０アミノ酸残基（好ましくは、約９〜３０残基）を有する。例としては、ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：２１５９−２１６５（１９８８）］；ｃ−ｍｙｃタグならびにそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体［Ｅｖａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５（１２）：３６１０−３６１６（１９８５）］；ならびに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体［Ｐａｂｏｒｓｋｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３（６）：５４７−５５３（１９９０）］が挙げられる。他の例示的なタグは、ニッケルキレート化を使用して標識される化合物の単離を可能にする、一般におよそ６ヒスチジン残基であるポリヒスチジン配列である。他の標識およびタグ（例えば、当該分野で周知であり、日常的に使用されているＦＬＡＧ（登録商標）タグ（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ））は、本発明によって包含される。
本明細書中で使用されるとき、用語「サルベージレセプター結合エピトープ」とは、ＩｇＧ分子のインビボにおける血清半減期の延長に関与するＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープのことをいう。
欠失
アミノ酸配列欠失は、標的抗原に対する結合親和性を保持しているフラグメントを生じる、１から１００以上の残基の長さに及ぶアミノ末端および／またはカルボキシル末端の欠失ならびに単一または複数のアミノ酸残基、例えば、２個、３個またはそれ以上の配列内の残基の欠失を包含する。例えば、グリコシル化部位は、グリコシル化のためのトリペプチドもしくは他の認識配列の一部または全部を欠失することによって欠失され得るか、または異なる位置に移動され得る。
置換
別のタイプのムテインは、アミノ酸置換ムテインである。これらのムテインでは、抗体分子内において少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その位置に異なる残基が挿入されている。超可変領域もしくはＣＤＲ領域またはフレームワーク領域のいずれかの内部における置換的な突然変異誘発が企図される。保存的置換を表２に示す。最も保存的な置換は、「好ましい置換」の欄に見られる。そのような置換が、生物学的活性を変化させない場合、表１において「例示的な置換」と命名されたより実質的な変化またはアミノ酸クラスに関してさらに下に記載されるようなより実質的な変化が、導入され得、そしてその生成物がスクリーニングされ得る。
抗体の生物学的特性の実質的な改変は、（ａ）例えば、シートまたはヘリックス立体配座のような置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造の維持、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性の維持、または（ｃ）側鎖の嵩の維持に対するそれらの作用が有意に異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて以下のグループに分けられる：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
保存的置換は、そのクラスの別のメンバーによるアミノ酸の置換を含む。非保存的置換は、別のクラスのメンバーによるこれらのクラスのうちの１つのメンバーの置換を含む。
抗体の適正な立体配座の維持に関係しない任意のシステイン残基もまた、分子の酸化安定性を改善するためおよび異常な架橋を防止するために一般にセリンで置換され得る。
親和性成熟は、一般に、親抗体のＣＤＲ内に置換を有する抗体ムテインの調製およびスクリーニングならびに親抗体と比べて結合親和性のような生物学的特性が改善されたムテインの選択を含む。そのような置換ムテインを作製するために便利な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性成熟である。簡潔には、各部位において可能なすべてのアミノ置換を作製するために、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）を変異させる。このようにして作製された抗体ムテインを、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物に対する融合物として繊維状ファージ粒子から一価の様式でディスプレイする。次いで、ファージによってディスプレイされたムテインをそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。例えば、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９３／１１２３６６、ＷＯ９５／１５３８８およびＷＯ９３／１９１７２を参照のこと。
現在の抗体親和性成熟法は、２つの突然変異誘発カテゴリー：確率論的および非確率論的なカテゴリーに属する。エラープローンＰＣＲ、ミューテーター細菌株（Ｌｏｗら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６０，３５９−６８，１９９６）および飽和突然変異誘発（Ｎｉｓｈｉｍｉｙａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１２８１３−２０，２０００；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｐ．Ｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８，２６９−８５，２００２）は、確率論的な突然変異誘発方法の代表的な例である（Ｒａｊｐａｌら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０２：８４６６−７１，２００５）。非確率論的手法では、特定のムテインの限られた集合を作製するためにアラニンスキャニングまたは部位特異的突然変異誘発を使用することが多い。いくつかの方法を、以下でさらに詳細に説明する。
パニング法を介した親和性成熟 組換え抗体の親和性成熟は、通常、徐々に減少させた量の抗原の存在下において、数回の候補抗体のパニングによって行われる。１回あたりの抗原の量を減少させることにより、抗原に対して最も高い親和性を有する抗体が選択され、それによって、出発物質の大きなプールから高親和性の抗体が得られる。パニングを介した親和性成熟は、当該分野で周知であり、例えば、Ｈｕｌｓら（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５０：１６３−７１，２００１）に記載されている。ファージディスプレイ技術を使用した親和性成熟の方法は、本明細書中の別の箇所に記載されており、当該分野で公知である（例えば、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９７：２０２９−３４，２０００を参照のこと）。
ルックスルー（Ｌｏｏｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ）突然変異誘発 ルックスルー突然変異誘発（ＬＴＭ）（Ｒａｊｐａｌら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０２：８４６６−７１，２００５）は、抗体結合部位を迅速にマッピングするための方法を提供する。ＬＴＭでは、２０個の天然のアミノ酸によって提供される主要な側鎖化学の代表である９つのアミノ酸を選択して、抗体の６つすべてのＣＤＲ中のすべての位置における結合に対する機能的な側鎖の寄与を精査する。ＬＴＭによって、ＣＤＲ内で一連の位置的な単一変異が作製され、ここで、各「野生型」残基は、９個の選択されたアミノ酸のうちの１つで体系的に置換される。変異したＣＤＲを組み合わせることにより、すべてのムテインの定量的なディスプレイが抑制されることなく、複雑性およびサイズが増大したコンビナトリアル一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）ライブラリーが得られる。ポジティブ選択の後、結合が改善されたクローンを配列決定し、有益な変異をマッピングする。
エラープローンＰＣＲ エラープローンＰＣＲは、様々な選択回の間における核酸のランダム化を含む。ランダム化は、使用されるポリメラーゼの固有のエラー率によって低い割合で生じるが、転写中の固有の高いエラー率を有するポリメラーゼ（Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−９６，１９９２）を使用するエラープローンＰＣＲ（Ｚａｃｃｏｌｏら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８５：７７５−７８３，１９９９）によって増強され得る。変異のサイクルの後、当該分野で通例の方法（ｍｅｈｏｄｓ）を使用して、抗原に対する親和性が改善されたクローンを選択する。
ＤＮＡシャフリング 核酸シャフリングは、改変体ポリヌクレオチドを作製するためにより短いかまたは小さいポリヌクレオチドのプールをインビトロまたはインビボにおいて相同組換えするための方法である。ＤＮＡシャフリングは、米国特許第６，６０５，４４９号、米国特許第６，４８９，１４５号、ＷＯ０２／０９２７８０およびＳｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１０７４７−５１（１９９４）に記載されている。一般に、ＤＮＡシャフリングは、３工程：ＤＮアーゼＩを用いてシャッフルされる遺伝子の断片化、フラグメントのランダムハイブリダイゼーションおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下でのＰＣＲ（セクシャルＰＣＲ（ｓｅｘｕａｌ ＰＣＲ）による）断片化遺伝子の再構築または充填、ならびに、再構築された産物の従来のＰＣＲによる増幅を含む。
ＤＮＡシャフリングは、逆の連鎖反応であるという点でエラープローンＰＣＲとは異なる。エラープローンＰＣＲでは、ポリメラーゼ開始部位の数および分子の数が、指数関数的に増える。対照的に、ランダムポリヌクレオチドの核酸再構築またはシャフリングでは、開始部位の数およびランダムポリヌクレオチドの数（サイズではない）は、経時的に減少する。
抗体の場合、ＤＮＡシャフリングによって、例えば、すべてのＣＤＲ１と、すべてのＣＤＲ２と、すべてのＣＤＲ３との自由な組み合わせ関係が可能になる。複数の配列ファミリーが、同じ反応においてシャッフルされ得ることが企図される。さらに、シャフリングは、例えば、ＣＤＲ１がＣＤＲ２の位置に見られないように、一般に相対的な順序を保存する。シャッフラント（ｓｈｕｆｆｌａｎｔ）が、多数の最良の（例えば、最高の親和性の）ＣＤＲを含むことは稀にしかなく、これらの稀なシャッフラントは、その優れた親和性に基づいて選択され得る。
ＤＮＡシャフリングにおいて使用され得る鋳型ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。それらは、組み換えられるかもしくは再構築される遺伝子あるいはそれより短いかまたは小さいポリヌクレオチドのサイズに応じて様々な長さであり得る。好ましくは、鋳型ポリヌクレオチドは、５０ｂｐ〜５０ｋｂである。鋳型ポリヌクレオチドは、しばしば、二本鎖であるべきである。
鋳型ポリヌクレオチドと同一の領域および鋳型ポリヌクレオチドに対して異種性の領域を有する一本鎖または二本鎖の核酸ポリヌクレオチドが、遺伝子選択の最初の工程中に、鋳型ポリヌクレオチドに付加され得ることが企図される。異なるが関連する２つのポリヌクレオチド鋳型が、最初の工程中で混合され得ることも企図される。
アラニンスキャニング アラニンスキャニング突然変異誘発は、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定するために行われ得る。Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５，１９８９）。残基または標的残基の群（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕのような帯電した残基）を同定し、中性のアミノ酸または負に帯電したアミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）で置換することにより、そのアミノ酸と抗原との相互作用に影響を及ぼす。次いで、さらなる変異または他の変異を導入することによって、または、置換部位について、置換に対する機能的な感度を示すアミノ酸の位置を正確にする。従って、アミノ酸配列の変更を導入するための部位は、予め決められるが、変異の性質自体は、予め決められる必要はない。例えば、所与の部位において変異の性能を分析するために、標的コドンまたは標的領域においてａｌａスキャニングまたはランダム突然変異誘発を行い、発現される抗体ムテインを所望の活性についてスクリーニングする。
コンピュータ支援による設計 あるいは、またはさらに、抗原抗体複合体の結晶構造を分析することによって、その抗体と抗原との接触点を同定することまたはコンピュータソフトウェアを使用してそのような接触点をモデル化することが、有益であり得る。本明細書中で詳述される手法によれば、そのような接触残基および隣接残基は、置換の候補である。いったんそのようなムテインが作製されると、ムテインのパネルは、本明細書中に記載されるようなスクリーニングに供され、１つ以上の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体が、さらなる開発のために選択され得る。
親和性成熟は、親抗体のＣＤＲ内に置換を有する抗体ムテインの調製およびスクリーニングならびに親抗体と比べて結合親和性のような生物学的特性が改善されたムテインの選択を含む。そのような置換ムテインを作製するために便利な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性成熟である。簡潔には、各部位において可能なすべてのアミノ置換を作製するために、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）を変異させる。このようにして作製された抗体ムテインを、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物に対する融合物として繊維状ファージ粒子から一価の様式でディスプレイする。次いで、ファージによってディスプレイされたムテインをそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
アラニンスキャニング突然変異誘発は、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定するために行われ得る。あるいは、またはさらに、抗原抗体複合体の結晶構造を分析することによって、その抗体と抗原との接触点を同定することが有益であり得る。本明細書中で詳述される手法によれば、そのような接触残基および隣接残基は、置換の候補である。いったんそのようなムテインが作製されると、ムテインのパネルは、本明細書中に記載されるようなスクリーニングに供され、１つ以上の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体は、さらなる開発のために選択され得る。
エフェクター機能の変更
抗体の他の改変が企図される。例えば、癌を処置する際の抗体の有効性を増大させるために、例えば、エフェクター機能に関して本発明の抗体を改変することが望ましい場合がある。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入することによって、この領域において鎖間のジスルフィド結合の形成が可能になり得る。このようにして作製されたホモ二量体抗体は、改善された内部移行能力ならびに／または高い補体媒介性細胞殺傷および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこと。増強された活性を有するホモ二量体抗体はまた、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されているようにヘテロ二官能性架橋剤を使用しても調製され得る。あるいは、二重Ｆｃ領域を有する抗体が操作され得、それによって、増強された補体溶解能力およびＡＤＣＣ能力を有し得る。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ３：２１９−２３０（１９８９）を参照のこと。さらに、ＣＤＲ内の配列が、ＭＨＣクラスＩＩに結合する抗体を引き起こし得、不必要なヘルパーＴ細胞応答を引き起こし得ることが示されている。保存的置換により、抗体が結合活性を保持しながらも不必要なＴ細胞応答を引き起こす能力を無くすことが可能になり得る。マウスの可変領域がヒトガンマ１、ガンマ２、ガンマ３およびガンマ４定常領域と連結されたキメラ抗体について記載されているＳｔｅｐｌｅｗｓｋｉら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９８８；８５（１３）：４８５２−６（その全体が本明細書中で参考として援用される）もまた参照のこと。
本発明のある特定の実施形態において、例えば、腫瘍への透過性を増大させるために、インタクトな抗体ではなく抗体フラグメントを使用することが望ましい場合がある。この場合、血清半減期を長くするために、抗体フラグメントを改変することが望ましい場合があり、例えば、抗体フラグメントに分子（例えば、ＰＥＧまたは多糖ポリマーをはじめとした他の水溶性ポリマー）を付加することによって、半減期を長くする。これは、例えば、抗体フラグメントにサルベージレセプター結合エピトープを組み込むことによって（例えば、抗体フラグメント内の適切な領域の変異によってまたはペプチドタグ中にエピトープを組み込み、そしてそれを末端または中央において抗体フラグメントに融合する（例えば、ＤＮＡ合成またはペプチド合成によって）ことによって）も達成され得る（例えば、ＷＯ９６／３２４７８を参照のこと）。
サルベージレセプター結合エピトープは、好ましくは、Ｆｃドメインの１つまたは２つのループ由来の任意の１つ以上のアミノ酸残基が抗体フラグメントの類似の位置に移行されている領域を構成する。なおもより好ましくは、Ｆｃドメインの１つまたは２つのループ由来の３つ以上の残基が移行されている。なおもより好ましくは、このエピトープは、（例えば、ＩｇＧの）Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから得られ、抗体のＣＨ１、ＣＨ３もしくはＶＨ領域または２つ以上のそのような領域に移行される。あるいは、このエピトープは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから得られ、抗体フラグメントのＣ．ｓｕｂ．Ｌ領域もしくはＶ．ｓｕｂ．Ｌ領域またはその両方に移行される。Ｆｃバリアントおよびサルベージレセプターとのそれらの相互作用について記載している国際出願ＷＯ９７／３４６３１およびＷＯ９６／３２４７８もまた参照のこと。
従って、本発明の抗体は、Ｆｃサルベージレセプターと相互作用する能力を保持している、ヒトＦｃ部、ヒトコンセンサスＦｃ部またはそれらのムテイン（ジスルフィド結合に関与しているシステインが、改変されているか、もしくは除去されており、そして／または、ｍｅｔが、Ｎ末端に付加されており、そして／またはＮ末端の２０アミノ酸の１つ以上が、除去されており、そして／またはＣ１ｑ結合部位のような補体と相互作用する領域が除去されており、そして／またはＡＤＣＣ部位が、除去されているムテインを含む）を含み得る［例えば、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（５）：６３３−９（１９９２）を参照のこと］。ＩｇＧクラスの抗体もまた、異なる定常領域を含み得る。例えば、ＩｇＧ２抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域をディスプレイするように改変され得る。
ＩｇＧ１の場合、定常領域、特にヒンジまたはＣＨ２領域に対する改変によって、ＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣ活性を含むエフェクター機能が増加し得るか、または低下し得る。他の実施形態において、ＩｇＧ２定常領域が改変されることにより、抗体−抗原集合体の形成が減少する。ＩｇＧ４の場合、定常領域、特にヒンジ領域に対する改変によって、半分の抗体の形成が減少し得る。特定の例示的な実施形態において、ＩｇＧ４ヒンジ配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−ＣｙｓをＩｇＧ１ヒンジ配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓに変異することが提供される。
以前の研究では、ＦｃＲに対するヒトおよびマウスのＩｇＧ上の結合部位は、主にＩｇＧ残基２３３−２３９から構成されるヒンジ領域下部にマッピングされた。他の研究では、さらに広いセグメント、例えば、ヒトＦｃレセプターＩに対してＧｌｙ３１６−Ｌｙｓ３３８、ヒトＦｃレセプターＩＩＩに対してＬｙｓ２７４−Ａｒｇ３０１およびＴｙｒ４０７−Ａｒｇ４１６が提案されたか、またはヒンジ下部の外側のいくつかの特異的な残基、例えば、マウスＦｃレセプターＩＩと相互作用するマウスのＩｇＧ２ｂに対してＡｓｎ２９７およびＧｌｕ３１８が見出された。ヒトＦｃレセプターＩＩＩＡを伴うヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントの３．２Å結晶構造の報告では、ＩｇＧ１残基Ｌｅｕ２３４−Ｓｅｒ２３９、Ａｓｐ２６５−Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７−Ｔｈｒ２９９およびＡｌａ３２７−Ｉｌｅ３３２が、ＦｃレセプターＩＩＩＡへの結合に関与していると記載された。ヒンジ下部（Ｌｅｕ２３４−Ｇｌｙ２３７）に加えて、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインループＦＧ（残基３２６−３３０）およびＢＣ（残基２６５−２７１）における残基は、ＦｃレセプターＩＩＡへの結合に関与し得ると結晶構造に基づいて示唆されている。Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（９）：６５９１−６６０４（２００１）（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。Ｆｃレセプター結合部位内の残基の変異によって、エフェクター機能の変更（例えば、ＡＤＣＣ活性もしくはＣＤＣ活性の変更または半減期の変更）がもたらされ得る。上に記載したように、可能な変異としては、１つ以上の残基の挿入、欠失または置換（アラニンによる置換、保存的置換、非保存的置換または異なるＩｇＧサブクラスの同じ位置における対応アミノ酸残基による置換（例えば、その位置における対応ＩｇＧ２残基によるＩｇＧ１残基の置換）を含む）が挙げられる。
Ｓｈｉｅｌｄｓらは、すべてのヒトＦｃレセプターへの結合に関与するＩｇＧ１残基が、ヒンジの近位のＣＨ２ドメインに位置していて、以下のとおり２つのカテゴリーに分類されると報告した：１）すべてのＦｃＲと直接相互作用し得る位置としては、Ｌｅｕ２３４−Ｐｒｏ２３８、Ａｌａ３２７およびＰｒｏ３２９（およびおそらくＡｓｐ２６５）が挙げられる；２）炭水化物の性質または位置に影響を及ぼす位置としては、Ａｓｐ２６５およびＡｓｎ２９７が挙げられる。ＦｃレセプターＩＩへの結合に影響したさらなるＩｇＧ１残基は、以下のとおりである：（最も大きい影響）Ａｒｇ２５５、Ｔｈｒ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｓｅｒ２６７、Ａｓｐ２７０、Ｇｌｕ２７２、Ａｓｐ２８０、Ａｒｇ２９２、Ｓｅｒ２９８ならびに（小さい影響）Ｈｉｓ２６８、Ａｓｎ２７６、Ｈｉｓ２８５、Ａｓｎ２８６、Ｌｙｓ２９０、Ｇｌｎ２９５、Ａｒｇ３０１、Ｔｈｒ３０７、Ｌｅｕ３０９、Ａｓｎ３１５、Ｌｙｓ３２２、Ｌｙｓ３２６、Ｐｒｏ３３１、Ｓｅｒ３３７、Ａｌａ３３９、Ａｌａ３７８およびＬｙｓ４１４。Ａ３２７Ｑ、Ａ３２７Ｓ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２６５ＡおよびＤ２７０Ａは、結合を低減した。すべてのＦｃＲに対して上で同定された残基に加えて、ＦｃレセプターＩＩＩＡへの結合を４０％以上低下させたさらなるＩｇＧ１残基は、以下のとおりである：Ｓｅｒ２３９、Ｓｅｒ２６７（Ｇｌｙのみ）、Ｈｉｓ２６８、Ｇｌｕ２９３、Ｇｌｎ２９５、Ｔｙｒ２９６、Ａｒｇ３０１、Ｖａｌ３０３、Ｌｙｓ３３８およびＡｓｐ３７６。ＦｃＲＩＩＩＡへの結合を改善したムテインとしては、Ｔ２５６Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４ＡおよびＡ３３９Ｔが挙げられる。Ｌｙｓ４１４は、ＦｃＲＩＩＡおよびＦｃＲＩＩＢに対する結合の４０％低下を示し、Ａｒｇ４１６は、ＦｃＲＩＩＡおよびＦｃＲＩＩＩＡに対する結合の３０％低下を示し、Ｇｌｎ４１９は、ＦｃＲＩＩＡに対する結合の３０％低下およびＦｃＲＩＩＢに対する結合の４０％低下を示し、そしてＬｙｓ３６０は、ＦｃＲＩＩＩＡに対する結合の２３％改善を示した。Ｐｒｅｓｔａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．（２００１）３０，４８７−４９０もまた参照のこと。
例えば、米国特許第６，１９４，５５１号（その全体が本明細書中で参考として援用される）では、アミノ酸３２９、３３１または３２２位（Ｋａｂａｔナンバリングを使用）においてヒトＩｇＧ Ｆｃ領域中に変異を含む、エフェクター機能が変更したムテインが記載されており、それらのうちのいくつかは、Ｃ１ｑ結合またはＣＤＣ活性の低下を示す。別の例として、米国特許第６，７３７，０５６号（その全体が本明細書中で参考として援用される）では、アミノ酸２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９位（Ｋａｂａｔナンバリングを使用）においてヒトＩｇＧ Ｆｃ領域中に変異を含む、エフェクター結合またはＦｃガンマレセプター結合が変更されたムテインが記載されており、それらのうちのいくつかは、ＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性の低下に関連するレセプター結合プロファイルを示す。これらのうち、アミノ酸２３８、２６５、２６９、２７０、３２７または３２９位における変異は、ＦｃＲＩへの結合を低下すると述べられており、アミノ酸２３８、２６５、２６９、２７０、２９２、２９４、２９５、２９８、３０３、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３７３、３７６、４１４、４１６、４１９、４３５、４３８または４３９位における変異は、ＦｃＲＩＩへの結合を低下すると述べられており、そして、アミノ酸２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７２、２７８、２８９、２９３、２９４、２９５、２９６、３０１、３０３、３２２、３２７、３２９、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１６、４３４、４３５または４３７位における変異は、ＦｃＲＩＩＩへの結合を低下すると述べられている。
米国特許第５，６２４，８２１号（その全体が本明細書中で参考として援用される）では、マウス抗体のＣ１ｑ結合活性が、重鎖のアミノ酸残基３１８、３２０または３２２を変異させることによって変更され得、そして、残基２９７（Ａｓｎ）を置換することによって、溶解活性が無くなると報告している。
米国出願公開番号２００４０１３２１０１（その全体が本明細書中で参考として援用される）では、アミノ酸２４０、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６６、２９９、３１３、３２５、３２８もしくは３３２位（Ｋａｂａｔナンバリングを使用）または２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２９６、２９７、２９８、２９９、３１３、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０もしくは３３２位（Ｋａｂａｔナンバリングを使用）に変異を有するムテインが記載されており、それらのうち、２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２９６、２９７、２９８、２９９、３１３、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０または３３２位における変異は、ＡＤＣＣ活性を低下させ得るか、またはＦｃガンマレセプターへの結合を低下させ得る。
Ｃｈａｐｐｅｌら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９１；８８（２０）：９０３６−４０（その全体が本明細書中で参考として援用される）は、ＩｇＧ１の細胞親和性活性が、その重鎖ＣＨ２ドメインの固有の特性であると報告している。ＩｇＧ１のアミノ酸残基２３４−２３７のいずれかにおける単一点変異によって、その活性が、有意に低下したか、または消滅した。ＩｇＧ１残基２３４−２３７（ＬＬＧＧ）のすべてをＩｇＧ２およびＩｇＧ４に置換することが、完全な結合活性を回復するために必要であった。ＥＬＬＧＧＰ配列全体（残基２３３−２３８）を含むＩｇＧ２抗体は、野生型ＩｇＧ１よりも活性であることが観察された。
Ｉｓａａｃｓら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１６１（８）：３８６２−９（その全体が本明細書中で参考として援用される）は、ＦｃガンマＲ結合にとって決定的なモチーフ内の変異（グルタミン酸２３３からプロリン、ロイシン／フェニルアラニン２３４からバリンおよびロイシン２３５からアラニン）によって、標的細胞の枯渇が完全に防がれたと報告している。グルタミン酸３１８からアラニンへの変異によって、マウスＩｇＧ２ｂのエフェクター機能が排除され、ヒトＩｇＧ４の効力も低下した。
Ａｒｍｏｕｒら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；４０（９）：５８５−９３（その全体が本明細書中で参考として援用される）では、野生型ＩｇＧ１よりも少なくとも１０倍低い効率で、活性化しているレセプターであるＦｃガンマＲＩＩａと反応するが、阻害性レセプターであるＦｃガンマＲＩＩｂとの結合は、たった４倍低下しただけのＩｇＧ１ムテインが同定された。アミノ酸２３３−２３６の領域ならびに／またはアミノ酸３２７、３３０および３３１位において変異を作製した。ＷＯ９９／５８５７２（その全体が本明細書中で参考として援用される）もまた参照のこと。
Ｘｕら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９４；２６９（５）：３４６９−７４（その全体が本明細書中で参考として援用される）では、ＩｇＧ１ Ｐｒｏ３３１をＳｅｒに変異させることによって、Ｃ１ｑ結合が著しく低下し、実質的に（ｖｉｒｕａｌｌｙ）溶解活性が排除されたと報告している。対照的に、ＩｇＧ４中のＳｅｒ３３１によるＰｒｏの置換によって、ＩｇＧ４ Ｐｒｏ３３１ムテインに対して部分的な溶解活性（４０％）がもたらされた。
Ｓｃｈｕｕｒｍａｎら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；３８（１）：１−８（その全体が本明細書中で参考として援用される）では、重鎖間の結合形成に関与するヒンジシステインのうちの１つであるＣｙｓ２２６をセリンに変異させることにより、より安定な重鎖間の結合がもたらされたと報告している。ＩｇＧ４ヒンジ配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−ＣｙｓをＩｇＧ１ヒンジ配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓに変異させることによってもまた、重鎖間の共有結合性の相互作用が著しく安定化される。
Ａｎｇａｌら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３；３０（１）：１０５−８（その全体が本明細書中で参考として援用される）では、ＩｇＧ４中のアミノ酸２４１位のセリンをプロリン（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ではその位置において見られる）に変異させることによって、均一な抗体の産生ならびに元のキメラＩｇＧ４と比べて血清半減期の延長および組織分布の改善がもたらされたと報告している。
本発明はまた、エフェクター活性の変更をもたらす、炭水化物構造が変更された抗体分子（ＡＤＣＣ活性の改善を示す、フコシル化されていないかまたはフコシル化が少ない抗体分子を含む）の作製を企図する。これを達成する種々の方法が、当該分野で公知である。例えば、ＡＤＣＣエフェクター活性は、ＦｃγＲＩＩＩレセプターへの抗体分子の結合によって媒介され、このことは、ＣＨ２ドメインのＡｓｎ−２９７におけるＮ結合型グリコシル化の炭水化物構造に依存することが示されている。非フコシル化抗体は、このレセプターと高親和性で結合し、ＦｃγＲＩＩＩ媒介性のエフェクター機能を天然のフコシル化抗体よりも効率的に引き起こす。例えば、アルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ酵素がノックアウトされたＣＨＯ細胞における非フコシル化抗体の組換え産生は、１００倍高いＡＤＣＣ活性を有する抗体をもたらす［Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２００４ Ｓｅｐ ５；８７（５）：６１４−２２］。同様の効果は、この酵素またはフコシル化経路中の他の酵素の活性を低下させることによって、例えば、ｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスＲＮＡで処理することによってか、酵素をノックアウトするように細胞株を操作することによってか、または選択的なグリコシル化インヒビターとともに培養することによって、達成され得る［Ｒｏｔｈｍａｎら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８９ Ｄｅｃ；２６（１２）：１１１３−２３］。いくつかの宿主細胞株、例えば、Ｌｅｃ１３またはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞株は、天然に、フコシル化レベルの低い抗体を産生する。Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００２ Ｊｕｌ ２６；２７７（３０）：２６７３３−４０；Ｓｈｉｎｋａｗａら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００３ Ｊａｎ ３１；２７８（５）：３４６６−７３。例えば、ＧｎＴＩＩＩ酵素を過剰発現する細胞において抗体を組換え的に産生することによるバイセクト型（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）炭水化物のレベルの上昇もまた、ＡＤＣＣ活性を増大させると決定されている。Ｕｍａｎａら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９ Ｆｅｂ；１７（２）：１７６−８０。２つのフコース残基のうちの１つが存在しないことだけで、ＡＤＣＣ活性を増加させるのに十分であり得ることが予測されている。［Ｆｅｒｒａｒａら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００５ Ｄｅｃ ５］
他の共有結合性の改変
抗体の共有結合性の改変もまた本発明の範囲内に含まれる。それらは、適用可能である場合、抗体の化学合成または酵素的切断もしくは化学的切断によって作製され得る。他のタイプの抗体の共有結合性の改変は、抗体の標的アミノ酸残基を、選択される側鎖またはＮ末端もしくはＣ末端の残基と反応させることができる有機誘導体化剤と反応させることによって分子に導入されるものである。
システイニル残基は、カルボキシメチル誘導体またはカルボキシアミドメチル誘導体を得るために、α−ハロアセテート（および対応するアミン）（例えば、クロロ酢酸またはクロロアセトアミド）と反応させられることが最も多い。システイニル残基もまた、ブロモトリフルオロアセトン、アルファ−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノールまたはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によって誘導体化される。
ピロ炭酸ジエチルが、ヒスチジル側鎖に対して比較的特異的であるので、この薬剤とｐＨ５．５〜７．０において反応させることによってヒスチジル残基を誘導体化する。パラ−ブロモフェナシルブロミドもまた、有用である；この反応は、好ましくは、ｐＨ６．０の０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で行われる。
リシニル残基およびアミノ末端残基を、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの薬剤を用いた誘導体化は、リシニル残基の電荷を逆転する効果を有する。アルファ−アミノ含有残基を誘導するために適した他の試薬としては、イミドエステル（例えば、ピコリンイミド酸メチル、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオンおよび、グリオキシレートを用いたトランスアミナーゼで触媒される反応が挙げられる。
アルギニル残基は、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンの中の１つまたはいくつかの従来の試薬との反応によって改変される。グアニジン官能基のｐＫａが高いので、アルギニン残基の誘導体化には、アルカリ性条件においてその反応を行うことが必要である。さらに、これらの試薬は、リシンならびにアルギニンイプシロン−アミノ基の群と反応し得る。
チロシル残基の特異的な改変は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によってスペクトル標識をチロシル残基に導入する際に、特定の目的で作製され得る。通常、Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンを使用することによって、それぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体が形成される。チロシル残基は、１２５Ｉまたは１３１Ｉを使用してヨウ素化されることにより、ラジオイムノアッセイにおいて使用するための標識タンパク質が調製される。
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド類（Ｒ−Ｎ．ｄｂｄ．Ｃ．ｄｂｄ．Ｎ−Ｒ’）と反応させることによって選択的に改変され、ここで、ＲおよびＲ’は、様々なアルキル基（例えば、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミド）である。さらに、アスパルチル残基およびグルタミル残基は、アンモニウムイオンと反応させることによって、アスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換される。
グルタミニル残基およびアスパラギニル残基は、それぞれ対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基に脱アミドされることが多い。これらの残基は、中性または塩基性の条件下で脱アミドされる。これらの残基の脱アミド型は、本発明の範囲内に入る。
他の改変としては、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリル残基またはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン側鎖、アルギニン側鎖およびヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
別のタイプの共有結合性の改変は、抗体へのグリコシドの化学的または酵素的な結合を含む。これらの手順は、Ｎ結合型またはＯ結合型のグリコシル化に対してグリコシル化能力を有する宿主細胞における抗体の産生を必要としない点で有利である。使用される結合様式に応じて、糖を、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基（例えば、システインの遊離スルフヒドリル基）、（ｄ）遊離ヒドロキシル基（例えば、セリン、トレオニンまたはヒドロキシプロリンの遊離ヒドロキシル基）、（ｅ）芳香族残基（例えば、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンの芳香族残基）または（ｆ）グルタミンのアミド基に、結合し得る。これらの方法は、１９８７年９月１１日公開のＷＯ８７／０５３３０およびＡｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）に記載されている。
抗体上に存在する任意の炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に達成され得る。化学的な脱グリコシル化には、抗体が化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価な化合物に対して露出していることが必要である。この処理によって、抗体がインタクトなままで、連結糖（ｌｉｎｋｉｎｇ ｓｕｇａｒ）（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外のほとんどまたはすべての糖の切断がもたらされる。化学的な脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２（１９８７）およびＥｄｇｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１（１９８１）に記載されている。抗体上での炭水化物部分の酵素的な切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０（１９８７）に記載されているように、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼを使用することによって達成され得る。
抗体の別のタイプの共有結合性の改変は、種々の非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール、ポリオキシアルキレンまたは多糖ポリマー（例えば、デキストラン）のうちの１つに対する抗体の連結を含む。そのような方法は、当該分野で公知であり、例えば、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号、同第４，１７９，３３７号、同第４，７６６，１０６号、同第４，１７９，３３７号、同第４，４９５，２８５号、同第４，６０９，５４６号またはＥＰ３１５４５６を参照のこと。
各抗体分子は、１つ以上の（すなわち１、２、３、４、５個またはそれ以上の）ポリマー分子に結合され得る。ポリマー分子は、好ましくは、リンカー分子によって抗体に結合される。そのポリマーは、通常、合成ポリマーまたは天然に存在するポリマー、例えば、必要に応じて置換される直鎖もしくは分枝鎖のポリアルケンポリマー、ポリアルケニレンポリマーまたはポリオキシアルキレンポリマーあるいは分枝鎖または非分枝鎖の多糖、例えば、ホモ多糖またはヘテロ多糖であり得る。好ましいポリマーは、ポリオキシエチレンポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、室温の水に可溶性であり、一般式：Ｒ（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎＯ−Ｒを有し、ここで、Ｒは、水素または保護基（例えば、アルキル基またはアルカノール基）であり得る。好ましくは、保護基は、１〜８個の炭素を有し、より好ましくは、メチルである。記号ｎは、正の整数であり、好ましくは、１〜１，０００、より好ましくは、２〜５００である。ＰＥＧは、１０００〜４０，０００、より好ましくは、２０００〜２０，０００、最も好ましくは、３，０００〜１２，０００の好ましい平均分子量を有する。好ましくは、ＰＥＧは、少なくとも１つのヒドロキシ基を有し、より好ましくは、それは、末端のヒドロキシ基である。その末端のヒドロキシ基は、好ましくは、活性化されて、インヒビター上で遊離アミノ基と反応するヒドロキシ基である。しかしながら、反応基のタイプおよび量は、本発明の共有結合的に結合体化されたＰＥＧ／抗体を達成するために変化し得ることが理解される。好ましいポリマーおよびそれらをペプチドに結合する方法は、米国特許第４，７６６，１０６号；同第４，１７９，３３７号；同第４，４９５，２８５号；および同第４，６０９，５４６号（これらのすべての全体が、本明細書によって参考として援用される）に示されている。
遺伝子治療
適切な細胞への治療用抗体の送達は、当該分野で公知の任意の適当なアプローチ（物理的なＤＮＡ移入方法（例えば、リポソームまたは化学処理）の使用またはウイルスベクターを使用することによる（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはレトロウイルス）使用を含む）、エキソビボ、インサイチュまたはインビボにおける遺伝子治療を介して達成され得る。例えば、インビボ治療の場合、所望の抗体をコードする核酸は、単独でか、またはベクター、リポソームもしくは沈殿物とともに、被験体に直接注射され得、そしていくつかの実施形態では、抗体化合物の発現が望まれる部位に注射され得る。エキソビボ処置の場合、被験体の細胞を取り出し、これらの細胞に核酸を導入し、そして改変された細胞を直接被験体に戻すか、または例えば患者に移植される多孔性膜で被包して被験体に戻す。例えば、米国特許第４，８９２，５３８号および同第５，２８３，１８７号を参照のこと。生存可能な細胞への核酸の導入には、種々の手法が利用可能である。その手法は、核酸をインビトロで培養細胞に移入するのか、目的の宿主の細胞においてインビボで移入するのかに応じて、変化する。インビトロにおける哺乳動物細胞への核酸の移入に適した手法としては、リポソームの使用、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストランおよびリン酸カルシウム沈殿が挙げられる。核酸のエキソビボ送達に通常使用されるベクターは、レトロウイルスである。
他のインビボ核酸移入手法としては、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、Ｉ型単純ヘルペスウイルスまたはアデノ随伴ウイルス）を用いるトランスフェクションおよび脂質ベースの系が挙げられる。核酸およびトランスフェクション剤は、必要に応じて、微小粒子と会合される。例示的なトランスフェクション剤としては、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性のトランスフェクション、四級アンモニウム両親媒性物質ＤＯＴＭＡ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬによってリポフェクチンとして商品化されている（ジオレオイルオキシプロピル）トリメチルアンモニウムブロミド））（Ｆｅｌｇｎｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，７４１３−７４１７；Ｍａｌｏｎｅら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６ ６０７７−６０８１）；垂れ下がったトリメチルアンモニウム頭部を有する脂肪親和性グルタミン酸ジエステル（Ｉｔｏら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０２３，１２４−１３２）；代謝可能な親脂質（例えば、陽イオン性脂質ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ，Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミルスペルミン（ＤＰＰＥＳ）（Ｊ．Ｐ．Ｂｅｈｒ（１９８６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２７，５８６１−５８６４；Ｊ．Ｐ．Ｂｅｈｒら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，６９８２−６９８６）；代謝可能な四級アンモニウム塩（ＤＯＴＢ，Ｎ−（１−［２，３−ジオレオイルオキシ］プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサルフェート（ＤＯＴＡＰ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ジオレオイルエステル、ＣｈｏＴＢ、ＣｈｏＳＣ、ＤＯＳＣ）（Ｌｅｖｅｎｔｉｓら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｉｎｔｅｒ．２２，２３５−２４１）；３ベータ［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、１対１混合物中のジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）／３ベータ［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロールＤＣ−Ｃｈｏｌ（Ｇａｏら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６５，８−１４）、スペルミン、スペルミジン、リポポリアミン（Ｂｅｈｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ，１９９４，５：３８２−３８９）、脂肪親和性ポリリシン（ＬＰＬＬ）（Ｚｈｏｕら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９３９，８−１８）、過剰ホスファチジルコリン／コレステロールを伴う水酸化［［（１，１，３，３−テトラメチルブチル）クレ−ソキシ（ｃｒｅ−ｓｏｘｙ）］エトキシ］エチル］ジメチルベンジルアンモニウム（水酸化ＤＥＢＤＡ）（Ｂａｌｌａｓら（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９３９，８−１８）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）／ＤＯＰＥ混合物（Ｐｉｎｎａｄｕｗａｇｅら（１９８９）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９８５，３３−３７）、ホスファチジルエタノールアミンと混合した、ＤＯＰＥ、ＣＴＡＢ、ＤＥＢＤＡ、臭化ジドデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）およびステアリルアミンとのグルタミン酸（ＴＭＡＧ）の脂肪親和性ジエステル（Ｒｏｓｅら（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ １０，５２０−５２５）、ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ（ＴｒａｎｓｆｅｃｔＡＣＥ，ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）およびオリゴガラクトース保持脂質が挙げられる。移入の効率を上げる例示的なトランスフェクション増強剤としては、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレン、リソソーム破壊ペプチド（Ｏｈｍｏｒｉ Ｎ Ｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ Ｊｕｎ．２７，１９９７；２３５（３）：７２６−９）、コンドロイタンベースのプロテオグリカン、硫酸プロテオグリカン、ポリエチレンイミン、ポリリシン（Ｐｏｌｌａｒｄ Ｈら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９８ ２７３（１３）：７５０７−１１）、インテグリン結合ペプチドＣＹＧＧＲＧＤＴＰ、線状デキストランノナサッカリド、グリセロール、オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオシド間結合において繋ぎ止められたコレステリル基（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．１９８９ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：（１７）：６５５３−６）、リゾホスファチド、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミンおよび１−オレオイルリゾホスファチジルコリンが挙げられる。
いくつかの状況において、標的細胞に核酸含有ベクターを向ける薬剤とともに核酸を送達することが望ましい場合がある。そのような「標的化」分子としては、標的細胞上の細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体または標的細胞上のレセプターに対するリガンドが挙げられる。リポソームが使用される場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質が、標的化するためおよび／または取り込みを促進するために使用され得る。そのようなタンパク質の例としては、特定の細胞型に対して向性のキャプシドタンパク質およびそのフラグメント、循環において内部移行するタンパク質に対する抗体、ならびに、細胞内の局在化を標的化し、細胞内の半減期を延長するタンパク質が挙げられる。他の実施形態において、レセプター媒介性のエンドサイトーシスが使用され得る。そのような方法は、例えば、Ｗｕら、１９８７またはＷａｇｎｅｒら、１９９０に記載されている。現在知られている遺伝子マーキングプロトコルおよび遺伝子治療プロトコルの概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ １９９２を参照のこと。ＷＯ９３／２５６７３およびそれに引用されている参考文献もまた参照のこと。遺伝子治療技術のさらなる概説については、Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５−１２８１（１９８９）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３９２，ｎｏ ６６７９に対する補遺，ｐｐ．２５−３０（１９９８）；Ｖｅｒｍａ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ：６８−８４（１９９０）；およびＭｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３５７：４５５４６０（１９９２）を参照のこと。
スクリーニング法
本発明の別の局面は、ＥｐｈＢ３の活性を増大させる抗体を同定する方法に関し、その方法は、ＥｐｈＢ３を抗体と接触させる工程およびその抗体がＥｐｈＢ３の活性を改変するか否かを判定する工程を含む。試験抗体の存在下での活性を、試験抗体の非存在下での活性と比較する。試験抗体を含むサンプルの活性が、試験抗体を有しないサンプル中の活性よりも高い場合、その抗体は、活性化した活性または増加した活性を有する。効果的な治療薬は、有意な毒性を欠いている有効な薬剤の同定に左右される。抗体は、当該分野で公知の方法によって結合親和性についてスクリーニングされ得る。例えば、ゲルシフトアッセイ、ウエスタンブロット、放射性標識競合アッセイ、クロマトグラフィによる共分取（ｃｏ−ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）、共沈、クロスリンキング、ＥＬＩＳＡなどが使用され得、これらは、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。さらに、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用して、抗体競合を評価してもよい（例えば、下記の実施例５を参照のこと）。
はじめに、標的抗原上の所望のエピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されているような通例のクロスブロッキングアッセイ（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｓｓａｙ）が行われ得る。通例の競合結合アッセイもまた使用され得、ここで、未知の抗体が、本発明の標的特異的な抗体への標的の結合を阻害する能力を特徴とする。インタクトな抗原、そのフラグメント（例えば、細胞外ドメイン）または線状エピトープが使用され得る。エピトープマッピングは、Ｃｈａｍｐｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４（１９９５）に記載されている。
インビトロ結合アッセイの１変法において、本発明は、（ａ）固定化されたＥｐｈＢ３を候補抗体と接触させる工程および（ｂ）ＥｐｈＢ３への候補抗体の結合を検出する工程を含む方法を提供する。別の実施形態では、候補抗体が固定化され、ＥｐｈＢ３の結合が検出される。固定化は、当該分野で周知の方法のいずれかを使用して達成され、その方法としては、支持体、ビーズまたはクロマトグラフィ樹脂への共有結合ならびに非共有結合性の高親和性相互作用（例えば、抗体結合）またはストレプトアビジン／ビオチン結合の使用（ここで、固定化される化合物がビオチン部分を含む）が挙げられる。結合の検出は、（ｉ）固定化されていない化合物上の放射性標識を使用して、（ｉｉ）固定化されていない化合物上の蛍光標識を使用して、（ｉｉｉ）固定化されていない化合物に免疫特異的な抗体を使用して、（ｉｖ）固定化されている化合物が結合している蛍光性の支持体を励起させる固定化されていない化合物上の標識を使用して、ならびに、当該分野において周知で日常的に行われている他の手法を使用して、達成され得る。
標的抗原の活性を増加させる抗体は、標的抗原（または標的抗原を発現している細胞）とともに候補抗体をインキュベートし、そして、標的抗原の活性または発現に対する候補抗体の効果を決定することによって同定され得る。試験抗体の存在下での活性を、試験抗体の非存在下での活性と比較する。試験抗体を含むサンプルの活性が、試験抗体を含まないサンプル中の活性よりも高い場合、その抗体は、増加した活性を有する。標的抗原ポリペプチドまたは標的抗原ポリヌクレオチドの活性を調節する抗体の選択力は、標的抗原に対する効果を他の関連化合物に対する効果と比較することによって評価することができる。
特定の例示的な実施形態において、レセプターのリン酸化、オリゴマー化、内部移行、分解、シグナル伝達および／またはＥｐｈＢ３媒介性の細胞−細胞接着を誘導する能力を測定するために、培養された細胞系中での効果について抗体を試験することが企図される。さらに、本明細書中に記載されるような増殖アッセイ、軟寒天アッセイおよび／または細胞傷害アッセイをはじめとした細胞アッセイを使用して、特定のＥｐｈＢ３抗体を評価してもよい。
特定の抗体または抗体の組み合わせの生物学的活性は、適当な動物モデルを使用してインビボにおいて評価され得る。例えば、ヒト癌細胞がヌードマウスまたはＳＣＩＤマウスのような免疫不全動物に導入される異種移植片癌モデルが使用され得る。有効性は、腫瘍形成、腫瘍退縮または転移などの阻害を測定するアッセイを使用して予測され得る。
本発明はまた、標的抗原の生物学的活性と相互作用するか、または標的抗原の生物学的活性を誘導する（すなわち、内部移行または細胞内シグナル伝達などを誘導する）抗体を同定するハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイも包含する。ＨＴＳアッセイによって、効率的な様式で多数の化合物をスクリーニングすることが可能になる。標的抗原とその結合パートナーとの相互作用を調べるために、細胞ベースのＨＴＳシステムが企図される。ＨＴＳアッセイは、所望の特性を有する「ヒット（ｈｉｔｓ）」または「リード化合物」を同定するように設計され、そこから、所望の特性を改善するように改変が設計され得る。
本発明の別の実施形態では、標的抗原ポリペプチドに対して適当な結合親和性を有するＣＤＲ内のアミノ酸に対して１、２、３個またはそれ以上の改変を有する抗体フラグメントまたはＣＤＲに対するハイスループットスクリーニングが使用される。
併用療法
動物モデルにおいて有効な２つ以上の抗体を同定したら、さらに改善された有効性を提供するために、２つ以上のそのような抗体（同じ標的抗原または異なる標的抗原に結合するもの）をともに混合することがさらに有益であり得る。１つ以上の抗体を含む組成物は、癌に罹患しているか、または癌に罹患しやすいヒトまたは哺乳動物に投与され得る。２つの治療薬の一致した投与は、それらの薬剤が、治療的な効果を発揮する期間が重複している限り、それらの薬剤が同じ時点で投与されるかまたは同じ経路によって投与される必要はない。同時投与または異なる日もしくは異なる週における投与であるような連続投与が企図される。
抗体治療は、癌のすべてのステージに有用であり得るが、抗体治療は、進行癌または転移性癌において特に適切であり得る。抗体治療法を化学療法レジメンまたは放射線照射レジメンと併用することが、化学療法的な処置を受けたことがない患者において好ましい場合があるのに対し、抗体治療による処置が、１つ以上の化学療法剤を投薬されたことのある患者に必要とされる場合がある。さらに、抗体治療は、特に化学療法剤の毒性を十分に許容しない患者において、低用量の併用化学療法剤を使用することもできる。
本発明の方法は、単一抗体の投与ならびに様々な抗体の組み合わせ、すなわち「カクテル」としての投与を企図する。そのような抗体カクテルは、様々なエフェクターメカニズムを利用する抗体を含むかまたは免疫エフェクター機能に依存する抗体と細胞傷害性抗体を直接組み合わせる限り、ある特定の利点を有し得る。そのような抗体の併用は、相乗的な治療効果を示し得る。
本発明の方法は、処置される特定の癌（例えば、肺癌、卵巣癌、食道癌、結腸癌または乳癌）に対して医学的に認識されている医療の標準と組み合わせた、単一抗体の投与または抗体カクテルの投与をさらに企図する。
細胞傷害性薬剤とは、細胞の機能を阻害するかまたは妨害し、そして／または細胞の破壊を引き起こす物質のことをいう。この用語は、放射性同位体（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０およびＲｅ１８６）、化学療法剤およびトキシン（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性なトキシンまたは合成トキシンあるいはそれらのフラグメント）を包含すると意図される。非細胞傷害性薬剤とは、細胞の機能を阻害しないか、または妨害しない、そして／または細胞の破壊を引き起こさない物質のことをいう。非細胞傷害性薬剤は、細胞傷害性になるように活性化され得る薬剤を包含し得る。非細胞傷害性薬剤は、ビーズ、リポソーム、マトリックスまたは粒子を包含し得る（例えば、米国特許公報２００３／００２８０７１および２００３／００３２９９５（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。そのような薬剤は、本発明の抗体に結合体化され得るか、結合され得るか、連結され得るか、または会合され得る。
癌化学治療薬としては、アルキル化剤（例えば、カルボプラチンおよびシスプラチン）；ナイトロジェンマスタードアルキル化剤；ニトロソ尿素アルキル化剤（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ））；代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート）；フォリン酸；プリンアナログ代謝拮抗物質、メルカプトプリン；ピリミジンアナログ代謝拮抗物質（例えば、フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）））；抗腫瘍性ホルモン薬（例えば、ゴセレリン、ロイプロリドおよびタモキシフェン）；天然抗腫瘍薬（例えば、アルデスロイキン、インターロイキン−２、ドセタキセル、エトポシド（ＶＰ−１６）、インターフェロンアルファ、パクリタキセル（タキソール（登録商標））およびトレチノイン（ＡＴＲＡ））；抗生物質性の天然抗腫瘍薬（例えば、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ダウノマイシンおよびマイトマイシン（マイトマイシンＣを含む））；およびビンカアルカロイド天然抗腫瘍薬（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン）；ヒドロキシ尿素；アセグラトン、アドリアマイシン、イホスファミド、エノシタビン、エピチオスタノール、アクラルビシン、アンシタビン、ニムスチン、塩酸プロカルバジン、カルボコン、カルボプラチン、カルモフール、クロモマイシンＡ３、抗腫瘍性多糖、抗腫瘍性血小板因子、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘｉｎ（登録商標））、シゾフィラン、シタラビン（シトシンアラビノシド）、ダカルバジン、チオイノシン、チオテパ、テガフール、ドラスタチン、ドラスタチンアナログ（例えば、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｚａｎｔｒｏｎｅ）、ビノレルビン、テニポシド、アミノプテリン、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、エスペラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）（例えば、米国特許第４，６７５，１８７号を参照のこと）、ネオカルチノスタチン、ＯＫ−４３２、ブレオマイシン、フルツロン、ブロクスウリジン、ブスルファン、ホンバン、ペプロマイシン、ベスタチン（Ｕｂｅｎｉｍｅｘ（登録商標））、インターフェロン−β、メピチオスタン、ミトブロニトール、メルファラン、ラミニンペプチド、レンチナン、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ抽出物、テガフール／ウラシル、エストラムスチン（エストロゲン／メクロレタミン）が挙げられるが、これらに限定されない。
さらに、癌患者に対する治療薬として使用されるさらなる薬剤としては、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ガンシクロビル；抗生物質、ロイプロリド；メペリジン；ジドブジン（ＡＺＴ）；インターロイキン１〜１８（変異体およびアナログを含む）；インターフェロンまたはサイトカイン（例えば、インターフェロンα、βおよびγホルモン（例えば、黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）およびアナログならびに性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）））；成長因子（例えば、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子相同因子（ＦＧＦＨＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）およびインスリン成長因子（ＩＧＦ））；腫瘍壊死因子−αおよびβ（ＴＮＦ−αおよびβ）；浸潤抑制因子−２（ＩＩＦ−２）；骨形成タンパク質１−７（ＢＭＰ１−７）；ソマトスタチン；サイモシン−α−１；γ−グロブリン；スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）；補体因子；抗血管新生因子；抗原性物質；およびプロドラッグが挙げられる。
プロドラッグとは、親薬物と比べて腫瘍細胞に対して細胞傷害性が低いかまたは非細胞傷害性であり、酵素的に活性化されるかまたは活性な型もしくはより活性な親型に変換されることが可能な、薬学的に活性な物質の前駆体型または誘導体型のことをいう。例えば、Ｗｉｌｍａｎ“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，１４，ｐｐ．３７５−３８２，６１５ｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｂｅｌｆａｓｔ（１９８６）およびＳｔｅｌｌａら、“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｂｏｒｃｈａｒｄｔら（ｅｄ．），ｐｐ．２４７−２６７，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照のこと。プロドラッグとしては、ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、スルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸改変プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、必要に応じて置換されるフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは必要に応じて置換されるフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよびより活性な細胞傷害性遊離薬物に変換され得る他の５−フルオロウリジンプロドラッグが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中の用途のためにプロドラッグ型に誘導体化され得る細胞傷害性薬物の例としては、上に記載した化学療法剤が挙げられるが、これらに限定されない。
投与および調製
本発明の抗体は、所望の送達方法に適したキャリアを含む薬学的組成物に製剤化され得る。適当なキャリアとしては、抗体と併用されるときに、抗体の所望の活性を保持し、被験体の免疫系に対して反応性でない任意の材料が挙げられる。例としては、多くの標準的な薬学的キャリア（例えば、滅菌リン酸緩衝食塩水溶液、静菌性水など）のうちのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。種々の水性キャリア（例えば、水、緩衝水、０．４％食塩水、０．３％グリシンなど）が使用され得、それらとしては、穏やかな化学修飾などに供された、安定性を増大させるための他のタンパク質（例えば、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなど）が挙げられ得る。
本抗体の治療的な製剤は、所望の程度の純度を有する抗体を任意の生理的に許容可能なキャリア、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することによって、凍結乾燥された製剤または水溶液の形態で貯蔵用に調製される。許容可能なキャリア、賦形剤または安定剤は、使用される投薬量および濃度においてレシピエントに対して無毒性であり、それらとしては、緩衝剤（例えば、リン酸、クエン酸および他の有機酸）；酸化防止剤（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム）；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノールアルコール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン（例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン）；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシン）；単糖類、二糖類および他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））が挙げられる。
本明細書中の製剤はまた、処置される特定の症状に必要なとき、２つ以上の活性な化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない補完的な活性を有する化合物を含み得る。そのような分子は、意図される目的に有効な量で組み合わせ中に適切に存在する。
その活性成分はまた、コロイド性薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョンにおいて、例えば、コアセルベーション手法または界面重合によって調製されるマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンのマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルの中に封入され得る。そのような手法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は、滅菌されていなければならない。これは、滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成される。
本抗体は、非経口、皮下、腹腔内、肺内および鼻腔内投与ならびに局所的処置が所望であれば、病巣内投与をはじめとした任意の適当な手段によって投与される。非経口注入としては、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内または皮下投与が挙げられる。さらに、本抗体は、特に抗体の用量を減少させながらパルス注入によって適切に投与される。好ましくは、投薬は、注射によって行われ、最も好ましくは、静脈内または皮下注射によって行われる。局部的、特に、経皮的、経粘膜的、直腸、経口または局所投与、例えば、所望の部位の近位に配置されたカテーテルを介した投与をはじめとした他の投与方法が企図される。
経鼻投与では、薬学的処方物および薬物は、適切な溶媒および必要に応じて他の化合物（例えば、安定剤、抗菌剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤（ｐＨ ｍｏｄｉｆｉｅｒ）、界面活性剤、バイオアベイラビリティ調整剤およびこれらの組み合わせであるがこれらに限定されない）を含むスプレーまたはエアロゾルであり得る。エアロゾル製剤用の噴霧剤としては、圧縮空気、窒素、二酸化炭素または炭化水素系低沸点溶媒が挙げられ得る。
注射可能な剤形としては、一般に、適当な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して調製され得る水性懸濁液または油性懸濁液が挙げられる。注射可能な形態は、溶液相であり得るか、または溶媒もしくは希釈剤を用いて調製される懸濁液の形態であり得る。許容可能な溶媒またはビヒクルとしては、滅菌水、リンガー溶液または等張性食塩水溶液が挙げられる。
注射に対しては、薬学的処方物および／または薬物は、上に記載したような適切な溶液による再構成に適した粉末であり得る。これらの例としては、フリーズドライ粉末、回転乾燥粉末もしくは噴霧乾燥粉末、非晶質粉末、顆粒、沈殿物または微粒子が挙げられるが、これらに限定されない。注射用に、製剤は、必要に応じて、安定剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、バイオアベイラビリティ調整剤およびこれらの組み合わせを含んでいてもよい。
徐放調製物が、調製され得る。徐放調製物の適当な例としては、本抗体を含んでいる固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、そのマトリックスは、成形された物品の形態、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とｙエチル−Ｌ−グルタメートとの共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸共重合体（例えば、Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロスフェア））およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。ポリマー（例えば、エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸）が、１００日よりも長く分子を放出することができるのに対し、ある特定のヒドロゲルは、それよりも短い期間にわたってタンパク質を放出する。被包性抗体が、長期間体内に残留するとき、それらは、３７℃の水分に曝露される結果として、変性し得るか、または凝集し得、それによって、生物学的活性の喪失および免疫原性の変化の可能性がもたらされる。関与するメカニズムに応じて、合理的なストラテジーが、安定性に対して考案され得る。例えば、凝集メカニズムが、チオ−ジスルフィド交換による分子間のＳ−Ｓ結合形成であると発見される場合、安定性は、スルフヒドリル残基を改変することによって、酸性溶液から凍結乾燥することによって、水分含有量を制御することによって、適切な添加剤を使用することによって、そして特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって、達成され得る。当該分野で公知の他のストラテジーを使用してもよい。
本発明の製剤は、本明細書中に記載されるような短時間作用型、迅速放出型、長時間作用型または徐放型であるように設計され得る。従って、薬学的処方物はまた、制御放出性または緩効性に製剤化され得る。
本組成物はまた、長期間の貯蔵および／または送達効果を提供するために、例えば、ミセルもしくはリポソームまたはいくつかの他の被包性型を含み得るか、または持続放出型で投与され得る。ゆえに、薬学的処方物および薬物は、小丸剤またはボンベ内に圧縮され得、そして蓄積注射としてまたはステントのような埋没物として筋肉内にまたは皮下に埋め込まれ得る。そのような埋没物は、公知の不活性な材料（例えば、シリコーンおよび生分解性ポリマー）を使用し得る。
上に記載した代表的な剤形に加えて、薬学的に許容可能な賦形剤およびキャリアが、一般に当業者に公知であり、ゆえに、本発明に含められる。そのような賦形剤およびキャリアは、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９１）（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
特定の投与量は、疾患の状態、被験体の年齢、体重、全般的な健康状態、遺伝子型、性別および食事、投薬間隔、投与経路、排出速度ならびに薬物の組み合わせに応じて調節され得る。有効量を含む上記剤形のいずれかが、通例の実験の範囲内に十分入っているので、それらは、十分に本発明の範囲内である。
本発明の抗体は、しばしば、他の天然に存在する免疫グロブリンまたは他の生物学的分子を実質的に含まずに調製される。また、好ましい抗体は、癌に苦しんでいるかまたは癌に罹患しやすい哺乳動物に投与されるとき、最小の毒性を示す。
本発明の組成物は、従来の周知の滅菌手法によって滅菌され得る。得られる溶液は、用途に合わせて包装され得るか、または無菌条件下で濾過され、凍結乾燥され得る（その凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌溶液と組み合わされる）。生理学的条件に近い条件が必要とされるとき、本組成物は、薬学的に許容可能な補助剤物質（例えば、ｐＨ調節剤および緩衝剤、張度調節剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムおよび安定剤（例えば、１２０％マルトースなど））を含み得る。
本発明の抗体はまた、薬物（例えば、本明細書中で開示される抗体および必要に応じて化学療法剤）の送達に有用な様々なタイプの脂質および／またはリン脂質および／または界面活性剤から構成される小型ベシクルであるリポソームを介して投与され得る。リポソームとしては、エマルジョン、泡沫、ミセル、不溶性単層、リン脂質分散系、層状の層などが挙げられ、リポソームは、抗体を特定の組織に標的化するビヒクルならびに組成物の半減期を長くするビヒクルとして役立ち得る。例えば、米国特許第４，８３７，０２８号および同第５，０１９，３６９号（これらの特許は、本明細書中で参考として援用される）に記載されているようなリポソームを調製するための種々の方法が、利用可能である。
本抗体を含むリポソームは、当該分野で公知の方法（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０３０（１９８０）；および米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号に記載されている方法）によって調製される。循環時間が増大したリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発法によって作製され得る。リポソームを規定のポアサイズのフィルターから押し出すことによって、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントは、ジスルフィド交換反応を介してＭａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されているようにリポソームに結合体化され得る。化学療法剤（例えば、ドキソルビシン）が、必要に応じてそのリポソーム内に含められる［例えば、Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８１（１９）：１４８４（１９８９）を参照のこと］。
これらの組成物中の抗体の濃度は、広範囲に（すなわち、約１０重量％未満、通常、少なくとも約２５重量％から７５重量％または９０重量％）変化し得、選択された特定の投与様式に従って、主に液量、粘性などによって選択される。経口的、局所的および非経口的に投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知であるかまたは明らかであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９５）（本明細書中で参考として援用される）に詳細に記載されている。
患者において疾患を処置するための本発明の組成物の有効量の決定は、当該分野で周知の標準的な経験的な方法によって達成され得る。これを達成する適切な量は、「治療的に有効な用量」と定義される。抗体の有効量は、疾患の重症度ならびに処置される患者の体重および全般的な状態に応じて変化し、また、それらに左右されるが、一般に、約１．０μｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。例示的な用量は、１適用あたり約１０μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇまたは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇまたは約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。抗体はまた、体表面積によって投薬され得る（例えば、最大４．５ｇ／平方メートル）。抗体の他の例示的な用量は、単回投与において合計最大８ｇを含む（体重が８０ｋｇまたは体表面積が１．８平方メートルであると仮定されるとき）。
投与は、当該分野で公知の任意の手段によるものであり得る。例えば、抗体は、１回以上の別個のボーラス投与によって投与され得るか、あるいは例えば、５、１０、１５、３０、６０、９０、１２０分もしくはそれ以上にわたる短期間または長期間の注入によって、投与され得る。最初の処置期間の後、患者の応答および治療の寛容に応じて、維持用量が患者の応答を維持するために必要であるとき、その維持用量は、例えば、毎週、隔週、３週間毎、４週間毎、毎月、隔月、３ヶ月毎または６ヶ月毎に投与され得る。疾患症状の所望の抑制が生じるまで、より頻繁な投薬が必要である場合があり、必要に応じて用量が調節され得る。この治療の進行は、従来の手法およびアッセイによって容易にモニターされる。この治療は、規定の期間にわたるものであり得るか、または、長期間にわたり、疾患進行もしくは死亡まで数年にわたって継続されるものであり得る。
本組成物の単回投与または反復投与は、処置している医師によって選択される用量レベルおよびパターンを用いて行われ得る。疾患の予防または処置に対して、抗体の適切な投薬量は、上で定義されたような処置される疾患のタイプ、疾患の重症度および経過、その抗体を投与する目的が予防的であるのか治療的であるのか、以前の治療、患者の病歴および抗体に対する応答ならびに主治医の慎重さに左右される。本抗体は、一度に、または一連の処置において、患者に適切に投与される。
任意のイベントにおいて、本製剤は、所望の生物学的活性を発揮するのに十分な、例えば、癌の重症度を予防するかまたは最小にするのに十分な時間にわたって、ある量の治療用抗体を提供するべきである。本発明の組成物は、単独で投与され得るか、またはそのような疾患を処置するために当該分野で公知の他の治療薬とともに補助治療として投与され得る。
本抗体組成物は、優良な医療行為に一致する様式で、製剤化され、調薬され、そして、投与される。この文脈において考慮される因子としては、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個別の患者の臨床上の状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与の日程計画および医師に公知の他の因子が挙げられる。投与される抗体の治療有効量は、そのような考慮によって決定され、その治療有効量は、標的に媒介される疾患、状態または障害を予防するか、寛解するか、または処置するために必要な最小量である。そのような量は、好ましくは、宿主にとって毒性である量よりも少ない量または宿主を有意に感染症にかかりやすくする量よりも少ない量である。
本抗体は、対象の障害を予防するためまたは処置するために現在使用されている１つ以上の薬剤とともに製剤化される必要はないが、必要に応じてそのように製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、疾患、状態もしくは障害のタイプまたは処置のタイプおよび上で述べた他の因子に左右される。これらは、一般に、その前に使用されたものと同じ投与量および同じ投与経路で使用されるか、またはこれまでに使用されてきた投与量の約１〜９９％で使用される。
本発明の別の実施形態において、所望の状態の処置に有用な材料を備えた製品が提供される。その製品は、容器およびラベルを備える。適当な容器としては、例えば、ビン、バイアル、注射器および試験管が挙げられる。その容器は、種々の材料（例えば、ガラスまたはプラスチック）から形成され得る。その容器は、状態を処置するために有効な組成物を保持しており、滅菌された接続口を有し得る（例えば、その容器は、皮下注射針で貫通可能な栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。その組成物中の活性薬剤は、本発明の抗体である。その容器上のラベルまたはその容器に付随するラベルは、その組成物が、最適の状態を処置するために使用されることを示している。その製品は、第２の治療薬（本明細書中で述べられている疾患に対する第２の治療薬または当該分野で公知の第２の治療薬のいずれかを含む）を含んでいる第２の容器をさらに備え得る。その製品は、薬学的に許容可能な緩衝液（例えば、凍結乾燥された抗体製剤を再構成するためのリン酸緩衝食塩水、リンガー溶液またはデキストロース溶液）を含んでいる別の容器をさらに備え得る。その製品は、商業的な観点およびユーザの観点から望ましい他の材料（他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器および使用についての指示を含む添付文書を含む）をさらに備え得る。
免疫療法
癌を有する患者を処置する際に有用な抗体としては、腫瘍に対して強力な免疫応答を開始することができる抗体および細胞傷害性を指示することができる抗体が挙げられる。細胞傷害性薬剤に結合体化された抗体は、ＥｐｈＢ３を発現している腫瘍組織に対して細胞傷害性薬剤を標的化するために使用され得る。あるいは、抗体は、補体媒介性または抗体依存性の細胞傷害（ＡＤＣＣ）メカニズムによって腫瘍細胞溶解を誘発し得、それらの両方が、エフェクター細胞のＦｃレセプター部位または補体タンパク質と相互作用するために、免疫グロブリン分子のインタクトなＦｃ部を必要とする。さらに、腫瘍増殖に対して直接的な生物学的作用を発揮する抗体が、本発明の実施に有用である。そのような直接的な細胞傷害性抗体が作用し得る有望なメカニズムとしては、細胞増殖の阻害、細胞分化の調節、腫瘍血管新生因子プロファイルの調節およびアポトーシスの誘導が挙げられる。特定の抗体が抗腫瘍作用を発揮するメカニズムは、一般に当該分野で公知であるようなＡＤＣＣ、ＡＤＭＭＣ、補体媒介性細胞溶解などを測定するために設計された任意の多くのインビトロアッセイを使用して評価され得る。
抗ＥｐｈＢ３抗体は、「裸の」型もしくは非結合体型で投与され得るか、あるいは他の治療薬もしくは診断用薬剤に直接結合体化され得るか、またはそのような他の治療薬もしくは診断用薬剤を含むキャリアポリマーに間接的に結合体化され得る。
抗体は、放射性同位体、親和性標識（例えば、ビオチン、アビジンなど）、酵素的標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、蛍光または発光または生物発光の標識（例えば、ＦＩＴＣまたはローダミンなど）、常磁性原子などの使用によって検出可能に標識され得る。そのような標識を達成するための手順は、当該分野で周知である；例えば、（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ，Ｌ．Ａ．ら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５（１９７０）；Ｂａｙｅｒ，Ｅ．Ａ．ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８（１９７９）；Ｅｎｇｖａｌ，Ｅ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１２９（１９７２）；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５（１９７６））を参照のこと。
抗体部分の結合体化は、米国特許第６，３０６，３９３号に記載されている。一般的な手法は、Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４１：８３２−８３９（１９８８）；Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４６：１１０１−１１０６（１９９０）；およびＳｈｉｈら、米国特許第５，０５７，３１３号にも記載されている。この一般的な方法は、少なくとも１つの遊離アミン官能基を有し、複数の薬物、トキシン、キレート剤、ホウ素付加物（ｂｏｒｏｎ ａｄｄｅｎｄ）または他の治療薬が負荷されているキャリアポリマーと、酸化型の炭水化物部を有する抗体成分とを反応させる工程を含む。この反応によって、最初のＳｃｈｉｆｆ塩基（イミン）結合がもたらされ、これにより、第二級アミンに還元されることで安定化されて、最終的な結合体が形成され得る。
そのキャリアポリマーは、例えば、アミノデキストランまたは少なくとも５０アミノ酸残基のポリペプチドであり得る。薬物または他の薬剤をキャリアポリマーに結合体化するための様々な手法は、当該分野で公知である。アミノデキストランの代わりに、ポリペプチドキャリアが使用され得るが、そのポリペプチドキャリアは、その鎖において少なくとも５０アミノ酸残基、好ましくは、１００〜５０００アミノ酸残基を有しているべきである。そのアミノ酸のうちの少なくともいくつかは、リシン残基またはグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基であるべきである。リシン残基の垂れ下がったアミンならびにグルタミンおよびアスパラギン酸の垂れ下がったカルボキシレートは、薬物、トキシン、免疫調節剤、キレート剤、ホウ素付加物または他の治療薬を結合するために便利である。適当なポリペプチドキャリアの例としては、ポリリシン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、それらの共重合体およびこれらのアミノ酸の混合ポリマー、ならびに、生じる負荷キャリアおよび結合体に対して望ましい溶解特性を付与するその他のもの、例えば、セリンが挙げられる。
あるいは、結合体化された抗体は、抗体成分を治療薬に直接結合体化することによって調製され得る。一般的な手順は、治療薬が酸化型の抗体成分に直接結合されることを除いて、結合体化の間接的な方法に類似する。例えば、半減期を延長するために、抗体の炭水化物部分をポリエチレングリコールに結合し得る。
あるいは、治療薬は、ジスルフィド結合の形成を介して、またはヘテロ二官能性架橋剤（例えば、Ｎ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）（ＳＰＤＰ））を使用して、還元型の抗体成分のヒンジ領域に結合され得る。Ｙｕら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ５６：２４４（１９９４）。そのような結合体化についての一般的な手法は、当該分野で周知である。例えば、Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９１）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈら（ｅｄｓ．）中のＵｐｅｓｌａｃｉｓら、“Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ”，１８７−２３０頁（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒら（ｅｄｓ．）中のＰｒｉｃｅ，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，６０−８４頁（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）を参照のこと。種々の二官能性タンパク質カップリング剤（例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣＬ）、活性なエステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ））、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６−ジイソシアネート）およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン））が、当該分野で公知である。
最終的には、１つ以上の抗ＥｐｈＢ３抗体部分および別のポリペプチドを含む融合タンパク質が、構築され得る。抗体融合タンパク質を作製する方法は、当該分野で周知である。例えば、米国特許第６，３０６，３９３号を参照のこと。インターロイキン−２部分を含む抗体融合タンパク質は、Ｂｏｌｅｔｉら、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．６：９４５（１９９５），Ｎｉｃｏｌｅｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：１６１（１９９５）、Ｂｅｃｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７８２６（１９９６）、Ｈａｎｋら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２：１９５１（１９９６）およびＨｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：４９９８（１９９６）に記載されている。
本発明の抗体は、「裸の」型もしくは非結合体型で投与され得るか、またはそれらに直接結合体化された治療薬を有し得る。１つの実施形態において、本発明の抗体は、放射線増感剤として使用される。そのような実施形態において、本抗体は、放射線増感薬剤に結合体化される。用語「放射線増感剤」は、本明細書中で使用されるとき、細胞の感度を増加させるために、電磁放射線に対して放射線増感されるために、および／または、電磁放射線で処置可能な疾患の処置を促進するために、治療有効量で動物に投与される分子、好ましくは、低分子量分子と定義される。電磁放射線で処置可能な疾患としては、新生物疾患、良性および悪性の腫瘍ならびに癌性細胞が挙げられる。
本明細書中で使用されるとき、用語「電磁放射線」および「放射線」としては、１０−２０〜１００メートルの波長を有する放射線が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の好ましい実施形態は、ガンマ−放射線（１０−２０〜１０−１３ｍ）、Ｘ線（１０−１２〜１０−９ｍ）、紫外線（１０ｎｍ〜４００ｎｍ）、可視光線（４００ｎｍ〜７００ｎｍ）、赤外線（７００ｎｍ〜１．０ｍｍ）およびマイクロ波（１ｍｍ〜３０ｃｍ）の電磁放射線を使用する。
放射線増感剤は、電磁放射線の有毒作用に対する癌性細胞の感度を増大させることが知られている。多くの癌処置プロトコルは、現在、Ｘ線の電磁放射線によって活性化される放射線増感剤を使用している。Ｘ線で活性化される放射線増感剤の例としては、以下：メトロニダゾール、ミソニダゾール、デスメチルミソニダゾール（ｄｅｓｍｅｔｈｙｌｍｉｓｏｎｉｄａｚｏｌｅ）、ピモニダゾール（ｐｉｍｏｎｉｄａｚｏｌｅ）、エタニダゾール、ニモラゾール、マイトマイシンＣ、ＲＳＵ１０６９、ＳＲ４２３３、ＥＯ９、ＲＢ６１４５、ニコチンアミド、５−ブロモデオキシウリジン（ＢＵｄＲ）、５−ヨードデオキシウリジン（ＩＵｄＲ）、ブロモデオキシシチジン、フルオロデオキシウリジン（ＦＵｄＲ）、ヒドロキシ尿素、シスプラチンならびにそれらの治療的に有効なアナログおよび誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
癌の光線力学的療法（ＰＤＴ）は、感作物質の放射線照射アクチベーターとして可視光線を使用する。光線力学的放射線増感剤の例としては、以下：ヘマトポルフィリン誘導体、Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（ｒ）、ベンゾポルフィリン誘導体、ＮＰｅ６、スズエチオポルフィリン（ｔｉｎ ｅｔｉｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）（ＳｎＥＴ２）、フェオボルビド（ｐｈｅｏｂｏｒｂｉｄｅ）−ａ、バクテリオクロロフィル−ａ、ナフタロシアニン、フタロシアニン、亜鉛フタロシアニンならびにそれらの治療的に有効なアナログおよび誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施形態において、本抗体は、腫瘍の事前標的化において利用するためのレセプター（そのようなストレプトアビジン）に結合体化され得、ここで、その抗体−レセプター結合体は、患者に投与された後、洗浄剤を使用して循環から未結合の結合体が除去され、次いで、細胞傷害性薬剤（例えば、放射性核種）に結合体化されているリガンド（例えば、アビジン）が投与される。
本発明は、上記の抗体を検出可能に標識された形態でさらに提供する。抗体は、放射性同位体、親和性標識（例えば、ビオチン、アビジンなど）、酵素的標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、蛍光または発光または生物発光の標識（例えば、ＦＩＴＣまたはローダミンなど）、常磁性原子などを使用することによって検出可能に標識され得る。そのような標識を達成するための手順は、当該分野で周知である；例えば、（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ，Ｌ．Ａ．ら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５（１９７０）；Ｂａｙｅｒ，Ｅ．Ａ．ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８（１９７９）；Ｅｎｇｖａｌ，Ｅ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１２９（１９７２）；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５（１９７６））を参照のこと。
「標識」とは、直接的または間接的に抗体に結合体化される検出可能な化合物または組成物のことをいう。この標識自体は、それ自体で検出可能であり得る（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）か、または、酵素的標識の場合、検出可能な基質化合物または基質組成物の化学的変化を触媒し得る。あるいは、この標識は、そのままで検出可能でなくてもよいが、検出可能な別の薬剤に結合しているエレメント（例えば、エピトープタグまたは結合パートナー対（例えば、ビオチン−アビジン）など）の一方であり得る。従って、本抗体は、その単離を容易にする標識またはタグを含み得、抗体を同定する本発明の方法は、その標識またはタグとの相互作用によって抗体を単離する工程を含む。
例示的な治療的免疫結合体は、細胞傷害性薬剤（例えば、化学療法剤、トキシン（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性なトキシンまたはそれらのフラグメント）または放射性同位体（すなわち、放射性結合体））に結合体化された本明細書中に記載される抗体を含む。融合タンパク質を、以下でさらに詳細に説明する。
免疫結合体の作製は、米国特許第６，３０６，３９３号に記載されている。免疫結合体は、治療薬を抗体成分に間接的に結合体化することによって調製され得る。一般的な手法は、Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４１：８３２−８３９（１９８８）；Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４６：１１０１−１１０６（１９９０）；およびＳｈｉｈら、米国特許第５，０５７，３１３号に記載されている。その一般的な方法は、少なくとも１つの遊離アミン官能基を有していて、複数の薬物、トキシン、キレート剤、ホウ素付加物または他の治療薬が負荷されたキャリアポリマーと、酸化型の炭水化物部を有する抗体成分とを反応させる工程を含む。この反応によって、最初のＳｃｈｉｆｆ塩基（イミン）結合がもたらされ、これにより、第二級アミンに還元されることで安定化されて、最終的な結合体が形成され得る。
そのキャリアポリマーは、好ましくは、アミノデキストランまたは少なくとも５０アミノ酸残基のポリペプチドであるが、他の実質的に等価なポリマーキャリアも使用することができる。好ましくは、最終的な免疫結合体は、投与を容易にするためおよび治療における用途に向けて効率的に標的化するために、水溶液（例えば、哺乳動物の血清）に可溶性である。従って、キャリアポリマー上の官能基の可溶化は、最終的な免疫結合体の血清溶解性を増大させる。特に、アミノデキストランが、好ましい。
アミノデキストランキャリアとの免疫結合体（ｉｎｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を調製するためのプロセスは、代表的には、デキストランポリマー、有利には、平均分子量が約１０，０００〜１００，０００のデキストランから出発する。そのデキストランを、その炭水化物環の一部の制御性酸化に影響を及ぼす酸化剤と反応させることにより、アルデヒド基が生成される。この酸化は、従来の手順によれば糖分解化学試薬（例えば、ＮａＩＯ４）を用いて便利に影響を受ける。
次いで、酸化デキストランをポリアミン、好ましくはジアミン、より好ましくは、モノ−またはポリヒドロキシジアミンと反応させる。適当なアミンとしては、エチレンジアミン、プロピレンジアミンまたは他の類似のポリメチレンジアミン、ジエチレントリアミンまたは類似のポリアミン、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンまたは他の類似のヒドロキシル化されたジアミンまたはポリアミンなどが挙げられる。デキストランのアルデヒド基に対して過剰のアミンを使用することによって、Ｓｃｈｉｆｆ塩基基へのアルデヒド官能基の実質的に完全な変換が保証される。
還元剤（例えば、ＮａＢＨ４、ＮａＢＨ３ＣＮなど）を使用することによって、生じるＳｃｈｉｆｆ塩基中間体の還元性の安定化が達成される。生じた付加物は、架橋されたデキストランを除去するために従来のサイジングカラムに通すことによって精製され得る。
アミン官能基を導入するためにデキストランを誘導体化する他の従来の方法（例えば、臭化シアンと反応させた後、ジアミンと反応させる方法）もまた使用され得る。
次いで、アミノデキストラン（ａｍｎｉｎｏｄｅｘｔｒａｎ）を、従来の手段によって、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）またはその水溶性改変体を使用して調製された、負荷される特定の薬物、トキシン、キレート剤、免疫調節剤、ホウ素付加物または他の治療薬の誘導体（好ましくは、カルボキシルで活性化される誘導体）と活性型で反応させることにより、中間体付加物が形成される。
あるいは、ポリペプチドトキシン（例えば、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質またはリシンＡ鎖など）は、グルタルアルデヒド縮合によって、または、タンパク質上の活性化カルボキシル基とアミノデキストラン上のアミンとの反応によって、アミノデキストランに結合され得る。
放射性金属に対するキレート剤または磁気共鳴増感剤は、当該分野で周知である。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体が、その代表である。これらのキレート剤は、代表的には、そのキレート剤をキャリアに結合し得る基を側鎖上に有する。そのような基としては、例えば、ベンジルイソチオシアネートが挙げられ、それによって、ＤＴＰＡまたはＥＤＴＡは、キャリアのアミン基に結合され得る。あるいは、キレート剤上のカルボキシル基またはアミン基が、活性化されるか、または事前に誘導体化され、次いで、すべての周知の手段によって結合することによって、キャリアに結合され得る。
ホウ素付加物（例えば、カルボラン）は、従来の方法によって抗体成分に結合され得る。例えば、カルボランは、当該分野で周知であるように垂れ下がっている側鎖上のカルボキシル官能基を用いて調製され得る。キャリア、例えば、アミノデキストランへのそのようなカルボランの結合は、カルボランのカルボキシル基の活性化およびキャリア上のアミンとの縮合によって達成されることにより、中間体結合体が生成され得る。次いで、そのような中間体結合体を抗体成分に結合することにより、以下に記載するような治療的に有用な免疫結合体が生成される。
アミノデキストランの代わりにポリペプチドキャリアが使用され得るが、そのポリペプチドキャリアは、その鎖において少なくとも５０アミノ酸残基、好ましくは、１００〜５０００アミノ酸残基を有しているべきである。そのアミノ酸のうちの少なくともいくつかは、リシン残基またはグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基であるべきである。リシン残基の垂れ下がったアミンならびにグルタミンおよびアスパラギン酸の垂れ下がったカルボキシレートは、薬物、トキシン、免疫調節剤、キレート剤、ホウ素付加物または他の治療薬を結合するために便利である。適当なポリペプチドキャリアの例としては、ポリリシン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、それらの共重合体およびこれらのアミノ酸の混合ポリマー、ならびに、生じる負荷キャリアおよび免疫結合体に対して望ましい溶解特性を付与するその他のもの、例えば、セリンが挙げられる。
中間体結合体と抗体成分との結合体化は、抗体成分の炭水化物部を酸化し、そして、生じたアルデヒド（およびケトン）カルボニルを、薬物、トキシン、キレート剤、免疫調節剤、ホウ素付加物または他の治療薬を負荷された後のキャリア上に残存しているアミン基と反応させることによって達成される。あるいは、中間体結合体は、治療薬を負荷された後の中間体結合体に導入されたアミン基を介して、酸化された抗体成分に結合され得る。酸化は、化学的に、例えば、ＮａＩＯ４もしくは他の糖分解性試薬を用いて、または酵素的に、例えば、ノイラミニダーゼおよびガラクトースオキシダーゼを用いて、都合よく達成される。アミノデキストランキャリアの場合、アミノデキストランのアミンのすべてが、治療薬を負荷するために代表的に使用されるとは限らない。アミノデキストランの残存アミンが、酸化された抗体成分と縮合することにより、Ｓｃｈｉｆｆ塩基付加物が形成され、次いで、通常、ホウ水素化物還元剤を用いて、そのＳｃｈｉｆｆ塩基付加物が還元的に安定化される。
類似の手順を使用することによって、本発明の他の免疫結合体が作製される。負荷されるポリペプチドキャリアは、好ましくは、抗体成分の酸化型の炭水化物部との縮合に対して残存している遊離リシン残基を有する。ポリペプチドキャリア上のカルボキシルは、必要であれば、例えば、ＤＣＣを用いる活性化および過剰ジアミンとの反応によってアミンに変換され得る。
最終的な免疫結合体は、従来の手法（例えば、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００におけるサイジングクロマトグラフィまたは１つ以上のＣＤ８４Ｈｙエピトープを使用するアフィニティークロマトグラフィ）を使用して精製される。
あるいは、免疫結合体は、抗体成分を治療薬に直接結合体化することによって調製され得る。一般的な手順は、治療薬を酸化型抗体成分に直接結合することを除いて、結合体化の間接的な方法に類似したものである。
他の治療薬が本明細書中に記載されるキレート剤と置き換えられ得ることが認識されるだろう。当業者は、過度の実験なしに結合体化スキームを工夫することができる。
さらなる説明として、治療薬を、ジスルフィド結合の形成を介して還元型抗体成分のヒンジ領域に結合することができる。例えば、破傷風トキソイドペプチドは、そのペプチドを抗体成分に結合するために使用される単一のシステイン残基を用いて構築され得る。代替として、そのようなペプチドは、ヘテロ二官能性架橋剤（例えば、Ｎ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ））を使用して抗体成分に結合され得る。Ｙｕら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ５６：２４４（１９９４）。そのような結合体化のための一般的な手法は、当該分野で周知である。例えば、Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９１）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈら（ｅｄｓ．）中のＵｐｅｓｌａｃｉｓら、“Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ”，１８７−２３０頁（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒら（ｅｄｓ．）中のＰｒｉｃｅ，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，６０−８４頁（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）を参照のこと。
本抗体と細胞傷害性薬剤との結合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤（例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ））、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣＬ）、活性なエステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ））、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６−ジイソシアネート）およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製され得る。炭素−１４で標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、本抗体との放射性核種の結合体に対する例示的なキレート剤である（例えば、ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと）。
上に記載したように、抗体のＦｃ領域における炭水化物部分は、治療薬を結合体化するために使用され得る。しかしながら、抗体フラグメントが免疫結合体の抗体成分として使用される場合、Ｆｃ領域は、存在しない場合がある。それにもかかわらず、炭水化物部分を抗体または抗体フラグメントの軽鎖可変領域に導入することが可能である。例えば、Ｌｅｕｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５９１９（１９９５）；Ｈａｎｓｅｎら、米国特許第５，４４３，９５３号を参照のこと。次いで、その操作された炭水化物部分を使用して、治療薬を結合する。
さらに、当業者は、結合体化の方法には数多くの変法があり得ることを認識する。例えば、血液、リンパまたは他の細胞外流体中において、インタクトな抗体またはその抗原結合フラグメントの半減期を延長するために、炭水化物部分を使用して、ポリエチレングリコールを結合することができる。さらに、治療薬を炭水化物部分および遊離スルフヒドリル基に結合することによって「二価の免疫結合体」を構築することが可能である。そのような遊離スルフヒドリル基は、抗体成分のヒンジ領域に配置されている場合がある。
抗体融合タンパク質
本発明は、１つ以上の抗体部分および別のポリペプチド（例えば、免疫調節剤またはトキシン部分）を含む融合タンパク質の使用を企図する。抗体融合タンパク質を作製する方法は、当該分野で周知である。例えば、米国特許第６，３０６，３９３号を参照のこと。インターロイキン−２部分を含んでいる抗体融合タンパク質は、Ｂｏｌｅｔｉら、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．６：９４５（１９９５）、Ｎｉｃｏｌｅｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：１６１（１９９５）、Ｂｅｃｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７８２６（１９９６）、Ｈａｎｋら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２：１９５１（１９９６）およびＨｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：４９９８（１９９６）に記載されている。さらに、Ｙａｎｇら、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ６：１２９（１９９５）では、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよび腫瘍壊死因子アルファ部分を含んでいる融合タンパク質が記載されている。
組換え分子が１つ以上の抗体成分およびトキシンまたは化学療法剤を含んでいる抗体−トキシン融合タンパク質を作製する方法もまた、当業者に公知である。例えば、抗体−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ融合タンパク質が、Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３９４（１９８９）、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８６１６（１９９１）、Ｂａｔｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５８６７（１９９２）、Ｆｒｉｅｄｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：３０５４（１９９３）、Ｗｅｌｓら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ．６０：１３７（１９９５）、Ｆｏｍｉｎａｙａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１０５６０（１９９６）、Ｋｕａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：２８７２（１９９６）およびＳｃｈｍｉｄｔら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ．６５：５３８（１９９６）によって報告されている。ジフテリアトキシン部分を含んでいる抗体−トキシン融合タンパク質が、Ｋｒｅｉｔｍａｎら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ ７：５５３（１９９３）、Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：５３０２（１９９３）、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２８０３７（１９９５）およびＶａｌｌｅｒａら、Ｂｌｏｏｄ ８８：２３４２（１９９６）によって報告されている。Ｄｅｏｎａｒａｉｎら、Ｔｕｍｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ １：１７７（１９９５）では、ＲＮアーゼ部分を有する抗体−トキシン融合タンパク質が報告されたのに対し、Ｌｉｎａｒｄｏｕら、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４−２５：２４３（１９９４）では、ＤＮアーゼＩ成分を含んでいる抗体−トキシン融合タンパク質が作製された。Ｗａｎｇら、Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ２０９ｔｈ ＡＣＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ａｎａｈｅｉｍ，Ｃａｌｉｆ，Ａｐｒ．２−６，１９９５，Ｐａｒｔ １，ＢＩＯＴ００５の抗体−トキシン融合タンパク質では、トキシン部分としてゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）が使用された。さらなる例として、Ｄｏｈｌｓｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８９４５（１９９４）では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌエンテロトキシン−Ａを含んでいる抗体−トキシン融合タンパク質が報告された。
そのような結合体の調製において適切に使用されるトキシンの代表例は、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、ＤＮアーゼＩ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌエンテロトキシン−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリン（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉｎ）トキシン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエンドトキシンである。例えば、Ｐａｓｔａｎら、Ｃｅｌｌ ４７：６４１（１９８６）およびＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＣＡ−Ａ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ ４４：４３（１９９４）を参照のこと。他の適当なトキシンが、当業者に公知である。
本発明の抗体はまた、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤、ＷＯ８１／０１１４５を参照のこと）を活性な抗癌薬物に変換するプロドラッグ活性化酵素に本抗体を結合体化することによってＡＤＥＰＴにおいて使用され得る。例えば、ＷＯ８８／０７３７８および米国特許第４，９７５，２７８号を参照のこと。
ＡＤＥＰＴに有用な免疫結合体の酵素成分としては、プロドラッグをそのより活性な細胞傷害型に変換するような方法で、プロドラッグに対して作用することができる任意の酵素が挙げられる。
本発明の方法において有用な酵素としては、ホスフェート含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ；スルフェート含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；無毒性の５−フルオロシトシンを抗癌薬物である５−フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なプロテアーゼ（例えば、セラチア属プロテアーゼ、サーモリシン、スブチリシン、カルボキシペプチダーゼおよびカテプシン（例えば、カテプシンＢおよびＬ））；Ｄ−アミノ酸置換基を含むプロドラッグを変換するのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用な炭水化物切断酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼ）；β−ラクタムで誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用なβ−ラクタマーゼ；およびそれぞれフェノキシアセチル基またはフェニルアセチル基でアミン窒素において誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用なペニシリンアミダーゼ（例えば、ペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼ）が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、当該分野でアブザイムとしても知られている酵素活性を有する抗体を使用して、本発明のプロドラッグを活性な遊離薬物に変換することができる（例えば、Ｍａｓｓｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ ３２８：４５７−４５８（１９８７）を参照のこと）。抗体−アブザイム結合体は、腫瘍細胞集団にアブザイムを送達するために本明細書中に記載されるように調製され得る。
本発明の酵素は、当該分野で周知の手法（例えば、上で述べたヘテロ二官能性架橋試薬の使用）によって本抗体に共有結合され得る。あるいは、本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に連結された本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質は、当該分野で周知の組換えＤＮＡ手法を使用して構築され得る（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）を参照のこと）。
非治療的な用途
本発明の抗体は、標的抗原に対する親和性精製剤として使用され得るか、または、例えば特定の細胞、組織または血清中のその発現を検出する、標的抗原に対する診断アッセイにおいて使用され得る。本抗体はまた、インビボ診断アッセイに使用され得る。一般に、これらの目的のために、本抗体は、免疫シンチグラフィ（ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｏｇｒａｐｈｙ）を使用して腫瘍を突き止めることができるように放射性核種（例えば、１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐまたは３５Ｓ）で標識される。
本発明の抗体は、任意の公知のアッセイ方法（例えば、競合結合アッセイ、直接的および間接的なサンドイッチアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）ならびに免疫沈降アッセイ）において使用され得る。Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）。また、本抗体を免疫組織化学に使用することによって、当該分野で公知の方法を使用して腫瘍サンプルが標識され得る。
都合上、本発明の抗体は、キット、すなわち、診断アッセイを行うための指示を備え、所定の量の試薬が包装された組み合わせ物として提供され得る。本抗体が、酵素で標識されている場合、そのキットは、その酵素に必要な基質および補因子を備える（例えば、検出可能な発色団またはフルオロフォアを提供する基質前駆体）。さらに、他の添加物（例えば、安定剤、緩衝剤（例えば、ブロッキング緩衝剤または溶解緩衝剤）など）を備えていてもよい。様々な試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬溶液中での濃度を提供するために広く変化し得る。特に、試薬は、溶解時に適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含んだ乾燥粉末、通常、凍結乾燥粉末として提供され得る。
本発明は、以下の実施例によって説明され、これらの実施例は、決して限定する意図ではない。
（実施例１）
ＥＰＨＢ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の調製
ＥｐｈＢ３のＥＣＤの組換え発現に向けて、まず、発現ベクターに組み込むための調製において、タグを組み込むため、およびコード領域の末端を操作するためにネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲアプローチを試みた。使用したプライマーは、以下のとおりである（すべて５’から３’への配列として記載する）：
製造者の推奨に従ってＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、ＰＣＲ増幅を行った。増幅に使用した鋳型は、ｐＤＯＮＯＲ２０１内にクローニングされたＥｐｈＢ３ ＥＣＤフラグメントであった。トポイソメラーゼクローニングストラテジーを使用して、ＥＣＤ ＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅＢａｃ４．５ＧＷにクローニングした。最終的に選択されたクローンを二本鎖配列決定によって確認した。各クローンを代表する１０〜２０μｇのＤＮＡを昆虫トランスフェクションのために調製した。
その組換え構築物を使用して、以下のとおり昆虫細胞においてＥｐｈＢ３ ＥＣＤを発現させた。ＥｐｈＢ３の細胞外ドメインをコードするプラスミドＤＮＡとＳａｐｐｈｉｒｅ（商標）ゲノムＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＤＮＡとの同時トランスフェクションのプラーク精製によって、バキュロウイルスを単離した。組換えウイルスを増幅し、それを使用して、１０Ｌ（ワーキングボリューム）ウェーブバイオリアクター（ｗａｖｅ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）において１〜１．５×１０６細胞／ｍｌの範囲の濃度、２〜１０の感染効率（ｍｏｉ）範囲でＴｎ５昆虫細胞を感染させた。感染の４８時間後、細胞および上清を回収して遠心し、そして、その上清を濃縮用に調製した。上清を０．４５μｍ中空糸カートリッジにおいて浄化した後、タンジェンシャルフロー（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ）１０ｋＤａ ＭＷカットオフ膜を用いて８×濃縮した。タンパク質精製の前に、その上清を、１Ｌの０．２μｍポア真空フラスコを用いてフィルター滅菌した。
ＥｐｈＢ３ ＥＣＤを以下のとおり精製した。ＥｐｈＢ３ ＥＣＤを含んでいる昆虫細胞培養上清を、緩衝液Ａ（ＰＢＳ／０．３５Ｍ ＮａＣｌ／５ｍＭイミダゾール）で平衡化した２５ｍＬのＮｉ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇカラム（Ｇ．Ｅ．ｒｅｓｉｎカタログ番号１７−５３１８−０３）に対して１３ｍｌ／分の流速で通過させた。ＥｐｈＢ３ ＥＣＤを含んでいる結合したタンパク質を、緩衝液Ａから緩衝液Ｂ（ＰＢＳ／０．３５Ｍ ＮａＣｌ／２５０ｍＭイミダゾール）の３０カラム容積勾配を使用して溶出した。分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べ、所望の純度でＥｐｈＢ３ ＥＣＤを含んでいるものを貯蔵した。その貯蔵物を緩衝液Ａに対して透析し、２×５ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ（Ｇ．Ｅ．）カラムに通した。そのＨｉｓＴｒａｐカラムを最初のＮｉ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇカラムと同じ様式で溶出した。分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べ、所望の純度でＥｐｈＢ３ ＥＣＤタンパク質を含んでいるものを貯蔵した。最終的な貯蔵物をＰＢＳ／０．１Ｍアルギニンに対して透析した。その最終的な材料を、Ｎ末端配列決定ならびに還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色およびＷｅｓｔｅｒｎ解析）によって同定および純度について解析した。
（実施例２）
マウスハイブリドーマによって分泌される標的特異的抗体の同定
ハイブリドーマ作製に使用した免疫原は、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系を使用して作製されたヒトＥｐｈＢ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（配列番号２のアミノ酸３７〜５５８に対応する）の組換え型であった。免疫のために、ＥＣＤを等体積のアジュバントと混合し、その混合物を後肢の足蹠の腹側表面に皮下注射した。様々な免疫スケジュールに従って、３〜１４日ごとにマウスに免疫原を注射することによって、強力な免疫応答をもたらした。次いで、良好な免疫応答を示すマウスを屠殺し、リンパ節を回収し、そのリンパ節中のＢ細胞を回収した。次いで、当該分野で周知の手法に従って、そのＢ細胞をミエローマ細胞と融合することによって、ハイブリドーマを作製し、そのハイブリドーマをＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳアッセイにおいてＥｐｈＢ３タンパク質を認識する抗体の産生についてスクリーニングした。
（実施例３）
ファージディスプレイによる標的特異的抗体の同定
抗体のスクリーニング
アゴニスト活性を有する抗ＥｐｈＢ３抗体のパネルを単離するために、ＥｐｈＢ３の細胞外（ｅｃｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）ドメイン（ＥＣＤ）で過免疫されたマウスから作製されたＯｍｎｉｃｌｏｎａｌファージディスプレイライブラリー（Ｂｕｅｃｈｌｅｒら、特許番号６０５７０９８）をスクリーニングした。
米国特許第６，０５７，０９８号におけるプロトコルに従ってそのＯｍｎｉｃｌｏｎａｌライブラリーから得られたシングルコロニーをＥＬＩＳＡアッセイにおいて結合活性についてスクリーニングした。簡潔には、ミクロ培養物をＯＤ６００＝０．６まで生育し、その時点で、０．２％ｗ／ｖのアラビノースを加え、その後、３０℃の振盪恒温器において一晩培養することによって可溶性抗体フラグメントの発現を誘導した。細菌を遠沈し、ペリプラズム抽出物を調製し、それを使用して、マイクロプレートの製造者によって提供される標準的なＥＬＩＳＡプロトコルに従って、Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）マイクロプレート上に固定化されたＥｐｈＢ３−ＥＣＤに対する抗体結合活性を検出した。蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）解析を使用して、ＣＨＯ−Ｋ１−ＥｐｈＢ３発現細胞への結合を測定することによって抗体結合も評価した。
ファージディスプレイによって同定された候補抗体の完全ＩｇＧへの変換
最初のスクリーニング由来のリード候補結合物を、抗体重鎖および軽鎖定常領域を含む抗体に変換するために、結合物の重鎖と軽鎖の両方の可変領域に対するコード配列を、カッパ（κ）およびガンマ−１（γ１）定常領域遺伝子をコードする専売哺乳動物発現ベクター（ＷＯ２００４／０３３６９３）内にクローニングした。
Ｈａｎｄａら（２００４ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｐｏｓｔｅｒ ＃１９３７）に記載されているように、抗体を２９３Ｅ細胞において一過性に発現させた。培養の６日目に、トランスフェクトされた細胞の上清を回収し、製造者のプロトコルに従ってプロテインＡセファロース（ＧＥ ＨＥａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＩｇＧを精製した。
（実施例４）
選択された抗ＥＰＨＢ３抗体の親和性決定
プロトコル１：
プロテインＡを、アミン結合を介してＣＭ５バイオセンサーチップ上に固定化した。０．７５μｇ／ｍｌの抗ＥｐｈＢ３抗体を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）中で１：１００希釈し、その改変されたバイオセンサー表面上に１．５分間捕捉した。組換え可溶性ＥｐｈＢ３ ＥＣＤ（細胞外ドメイン）を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中の様々な濃度で上記バイオセンサー表面に対して流した。１：１相互作用モデル／グローバルフィットを用いた、ＳｃｒｕｂｂｅｒとＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアとの組み合わせを使用して速度定数および親和定数を決定した。
プロトコル２：
ラット抗マウスＦｃ（ＲａｍＦｃ）を、アミン結合を介してＣＭ５バイオセンサーチップ上に固定化した。０．７５μｇ／ｍｌの抗ＥｐｈＢ３抗体を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で１：２００希釈し、その改変されたバイオセンサー表面上に１．５分間捕捉した。組換え可溶性ＥｐｈＢ３ ＥＣＤを、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中の様々な濃度で上記バイオセンサー表面に対して流した。１：１相互作用モデル／グローバルフィットを用いた、ＳｃｒｕｂｂｅｒとＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアとの組み合わせを使用して速度定数および親和定数を決定した。
親和性実験の結果を下記の表３に示す。
＊ＸＨＡ．０５．１１１およびＸＨＡ．０５．８８５は、ＲａｍＦｃ形式で解析した。
（実施例５）
ＥＰＨＢ３抗体のエピトープのビンニング（ＢＩＮＮＩＮＧ）
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用した一連の競合アッセイストラテジーによって、抗ＥｐｈＢ３抗体をエピトープビン（ｅｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎ）に割り当てた。このアプローチでは、１つの抗体を、直接または捕捉剤を介してセンサーチップ上に固定化し、固定化された抗体の上にリガンド（ＥｐｈＢ３ ＥＣＤ）を注入して、そのリガンドを結合させた。続いて第２試験抗体を注入し、第１抗体によって捕捉されたリガンドと結合する能力を測定した。それらの抗体が、リガンド上の空間的に分断されたエピトープに結合する場合、第２抗体は、リガンド／第１抗体複合体にも結合することができるはずである。２つの異なる抗体が同じリガンド分子に同時に結合する能力は、対形成と呼ばれる。
１．第１の一連の実験では、すべてのフローセル上の高密度のウサギ抗マウスＦｃ特異的抗体（ＲＡＭ−Ｆｃ）でコーティングされたＣＭ５センサーチップを利用した。
ａ．流動緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標），Ｉｎｃ．）であり、温度は、２５℃に設定し、流速は、１０μＬ／分であった。
ｂ．１〜３分間、２００〜１０００ＲＵの捕捉レベルをもたらす１〜１０μｇ／ｍＬの希釈物を注入することによって、異なる抗体を各フローセル上に捕捉した。
ｃ．次いで、ＨＢＳ−ＥＰ中の１００μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧを３０分間注入することによって、その表面をブロッキングした。
ｄ．対形成について試験される抗体を１μｇ／ｍＬで注入することによって、そのチップが効率的にブロッキングされていることを確認し、その抗体のバックグラウンド結合レベルを測定した。
ｅ．リガンドを２〜４分間、２〜１０μｇ／ｍＬで注入した。
ｆ．上の工程１ｄと同様に、対形成される抗体を再度注入した。その抗体がこの注入中に結合した場合、これらの２抗体は、対を形成し、ゆえに、別個のエピトープビンに入れられる。第２抗体が結合しなかった場合、その第２抗体は、結合について第１抗体と競合し、それらは、同じエピトープビンまたは重複したエピトープビンに入れられる。
ｇ．自己対形成（ｓｅｌｆ−ｐａｉｒｉｎｇ）についてのコントロールとして、捕捉される抗体の各々を、それ自体での対形成について試験した。
２．いったん、いくつかのエピトープビンまたは非対形成抗体の特有のセットが明らかになると、それらの抗体を使用して、それらの抗体をさらに調べた。一度に４つの抗体を使用して、一連の様式で抗体を調べた。４つのフローセルの各々の上に、異なるエピトープビン由来のハイブリドーマ抗体を捕捉した後、一度に４つすべてに対して上記の対形成プロトコルを行うことによって、より多くのサンプルセットを調べた。
３．ＲＡＭ−Ｆｃ表面はヒトＦａｂを捕捉しないので、１００μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧを使用するブロッキング工程を使用しないという変法を用いて同様にこのプロセスを使用してヒト抗体Ｆａｂフラグメントを評価した。
競合実験の結果として、表４に示されるエピトープビンが定義された。最も高い結合親和性（上の実施例４を参照のこと）を有する抗体のすべてが、ＢＩＮ３に入っている。
（実施例６）
フローサイトメトリーベースのアッセイを使用するアゴニストＥＰＨＢ３抗体の選択ならびにＥＰＨＢ３のリン酸化および分解の検出
ＥｐｈＢ３に対して標的化されたアゴニスト抗体を同定するために、レセプター活性化の下流の効果をモニターする２つのフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）ベースのアッセイを開発した：（１）シグナル伝達経路の活性化の基準としての全細胞ホスホ−チロシン（ｐＹ）；および（２）活性化されたレセプターのダウンレギュレーションを測定するためのレセプター内部移行。
全細胞チロシンリン酸化
全細胞ｐＹアッセイでは、懸濁液適合型で、安定的にトランスフェクトされ、高レベルのレセプターを発現するＣＨＯ細胞株を使用した。このアッセイを使用して、ハイブリドーマ上清、精製されたハイブリドーマ由来抗体および精製された完全ＩｇＧの再編成されたファージディスプレイ由来抗体をスクリーニングした。
ＥｐｈＢ３を過剰発現する懸濁液適合型ＣＨＯ−Ｋ１細胞を２×１０５細胞／ウェルで丸底９６ウェルプレートに播種した。次いで、ＥｐｈＢ３に対する抗体を各サンプルウェル中で直接１：１０希釈した。サンプルを３７℃で４０〜４５分間インキュベートした。インキュベートした後、２％ホルムアルデヒドを用い、室温において２０分間、細胞を固定した。次いで、細胞を透過処理緩衝液で２回洗浄し、そしてＰＥ結合体化マウス抗ホスホチロシン抗体（ＰＹ２０）を含む透過処理緩衝液に再懸濁した。細胞を４℃で１時間インキュベートし、透過処理緩衝液で２回洗浄し、そしてフローサイトメトリーで解析した。
試験された抗体の約２４％が、このｐＹアッセイにおいてアゴニスト活性を示した。次いで、免疫沈降に続いてＷｅｓｔｅｒｎ解析（以下を参照のこと）を、抗体で処理した細胞（ＥｐｈＢ３を過剰発現するＣＨＯ細胞株および腫瘍細胞株）由来の溶解産物において行い、そのデータから、ｐＹを誘導する抗体が、ＥｐｈＢ３のリン酸化を引き起こしたことを確認した。
細胞表面上のＥｐｈＢ３の定常状態レベルを測定するためのアッセイ
全細胞ｐＹアッセイを使用して同定された上位候補を、細胞表面ＥｐｈＢ３のダウンレギュレーションおよび分解についてさらに特徴付けした。まず、ＦＡＣＳおよびＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用してエピトープ競合研究を行うことにより、その上位ｐＹ誘導抗体に対して最小の競合性を示した強力なＦＡＣＳ陽性「検出」抗体を同定した。これらの抗体を使用して、ｐＹ誘導抗体添加の２〜７２時間後の細胞表面のＥｐｈＢ３レベルをモニターするＦＡＣＳベースのアッセイを開発した。
懸濁液適合型ＳＷ６２０細胞を１０μｇ／ｍＬの抗ＥｐｈＢ３抗体または組換えリガンドタンパク質とともに２〜７２時間培養した。各時点において、ハイブリドーマ由来マウス抗標的検出抗体（キメラヒト抗体で処理された細胞用）またはキメラヒト抗標的検出抗体（ハイブリドーマ由来抗体で処理された細胞用）のいずれかを使用するフローサイトメトリー解析によって、ＥｐｈＢ３の細胞表面レベルを測定した。ＥｐｈＢ３結合について処理抗体と最小の競合性を示す検出抗体を選択するためにスクリーニングを行ったが、ほとんどの場合において、干渉は低レベルであった（１０〜２０％）。検出抗体で染色する前に新しいＳＷ６２０細胞を処理抗体で少しの間プレインキュベートするという条件を使用して、各処理抗体について最大検出抗体結合を決定した。
ある抗体のサブセットは、２時間で細胞表面レセプターの劇的なダウンレギュレーションを示し、それは、７２時間を通じて維持された（例えば、図１を参照のこと）。
標的のリン酸化を検出するためのＩＰ−ウエスタン：
ＥｐｈＢ３を発現しているヒト細胞株をコンフルエント近くまで（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）生育し、無血清培地中で３０分間インキュベートし、次いで、３７℃において３０分間、様々な濃度（０．２〜１０μｇ／ｍｌ）のリガンドまたはアゴニスト抗体で処理した。細胞をＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ，製造者の指示に従って使用した無ＥＤＴＡプロテアーゼインヒビターカクテル錠剤）およびホスファターゼインヒビター（Ｓｉｇｍａホスファターゼインヒビターカクテル１および２，製造者の推奨に従って使用した）の存在下において１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および０．１％ＳＤＳを含むＴｒｉｓ緩衝食塩水に溶解した。抗ＥｐｈＢ３特異的抗体を使用して、約８００μｇの浄化された溶解産物から標的を免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースに転写し、そして抗ホスホチロシン抗体（４Ｇ１０，Ｕｐｓｔａｔｅ）を用いるウエスタンブロット解析に供した。そのブロットをはぎ取り（ｓｔｒｉｐｐｅｄ）、抗ＥｐｈＢ３特異的抗体で再度探索することにより、タンパク質ローディング（ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏａｄｉｎｇ）を決定した。図２に示されるように、抗ＥｐｈＢ３ ｍＡｂは、ＳＷ６２０細胞においてＥｐｈＢ３のリン酸化を引き起こす。図３に示されるように、抗ＥｐｈＢ３抗体は、低（０．２μｇ／ｍｌ）抗体濃度においてＥｐｈＢ３のリン酸化を誘導する。
標的の分解を確認するウエスタンブロット：
ＥｐｈＢ３を発現しているヒト細胞株を未処理のままにしておくか、または様々な時間（２〜７２時間）にわたって完全培地中で１０μｇ／ｍｌのリガンドもしくはアゴニストＡｂで処理した。実験の開始時にそのリガンドまたは抗体を１回投与した。選択された時点において、細胞をＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ，製造者の指示に従って使用した無ＥＤＴＡプロテアーゼインヒビターカクテル錠剤）およびホスファターゼインヒビター（Ｓｉｇｍａホスファターゼインヒビターカクテル１および２，製造者の指示に従って使用した）の存在下において１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および０．１％ＳＤＳを含むＴｒｉｓ緩衝食塩水に溶解した。４℃において１０分間、１４，０００ｒｐｍで遠心分離することによって浄化した後、４０μｇの溶解産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分画し、ニトロセルロースに転写し、そして抗ＥｐｈＢ３特異的抗体を用いるウエスタンブロット解析に供した。β−チューブリンをローディングコントロールとして可視化した。増強された化学発光およびオートラジオグラフィによって標的を検出した。図４に示されるように、抗ＥｐｈＢ３ ｍＡｂは、ＥｐｈＢ３の内部移行だけでなく、分解を誘導する。図５に示されるように、ｍＡｂのサブセットは、少なくとも７２時間、ＥｐｈＢ３を減少した。最終的に、図６に示されるように、複数の細胞株が、ＥｐｈＢ３をリン酸化することによってアゴニストｍＡｂに応答する。
上述のアッセイに関する選択された抗体の概要を下記の表５に示す：
（実施例７）
マウス抗体のヒト化
この実施例では、マウス抗ＥｐｈＢ３抗体のヒト化についての手順を示す。
ヒト化されたＸＰＡ．０４．００１、ＸＰＡ．０４．０１３、ＸＰＡ．０４．０１８、ＸＰＡ．０４．０４８の軽鎖および重鎖に対する遺伝子の設計
マウス抗体ＸＰＡ．０４．００１、ＸＰＡ．０４．０１３、ＸＰＡ．０４．０１８およびＸＰＡ．０４．０４８に対する軽鎖および重鎖の可変領域アミノ酸配列を図７に示す。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅまたは類似のデータベースを使用して同定されたヒト抗体の配列を使用して、ヒト化抗体のフレームワークが提供される。ヒト化される重鎖の配列を選択するために、マウス重鎖配列をヒト抗体重鎖の配列とアラインメントする。その位置が、以下に定義される４つのカテゴリーのいずれか１つに入らない限り、その各位置においてヒト抗体アミノ酸がヒト化配列のために選択され、入る場合は、マウスアミノ酸が選択される：
（１）その位置が、Ｋａｂａｔ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２５，９６１−９６９（１９８０）によって定義されるような相補性決定領域（ＣＤＲ）に入る；
（２）ヒト抗体のアミノ酸が、その位置においてヒト重鎖にとって稀なアミノ酸であるのに対し、マウスのアミノ酸が、その位置においてヒト重鎖にとって通常のアミノ酸である；
（３）その位置が、マウス重鎖のアミノ酸配列においてＣＤＲに直接隣接している；または
（４）そのアミノ酸が抗原結合領域に物理的に近いとマウス抗体の３次元モデリングが示唆している。
ヒト化軽鎖の配列を選択するために、マウスの軽鎖配列をヒト抗体軽鎖の配列とアラインメントする。その位置が、上に記載され、以下にもう一度記載されるカテゴリーのうちの１つに再び入らない限り、ヒト化配列に対する各位置においてヒト抗体アミノ酸が選択される：
（１）ＣＤＲ；
（２）ヒト抗体よりもマウスアミノ酸のほうが代表的である；
（３）ＣＤＲに隣接している；または
（４）結合領域に３次元的に近接している可能性がある。
重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の実際のヌクレオチド配列は、以下のとおり選択される：
（１）それらのヌクレオチド配列は、上に記載したように選択されるアミノ酸配列をコードする；
（２）これらのコード配列の５’であるヌクレオチド配列は、リーダー（シグナル）配列をコードする。これらのリーダー配列は、抗体の代表として選択した；
（３）それらのコード配列の３’であるヌクレオチド配列は、マウス配列の一部であるマウス軽鎖Ｊ５セグメントおよびマウス重鎖Ｊ２セグメントに続く配列である。これらの配列は、スプライスドナーシグナルを含むので、含められる；および
（４）ＸｂａＩ部位での切断およびベクターのＸｂａＩ部位へのクローニングを可能にするＸｂａＩ部位が、この配列の各末端に存在する。
ヒト化軽鎖遺伝子およびヒト化重鎖遺伝子の構築
重鎖を合成するために、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３８０Ｂ ＤＮＡ合成装置を使用して４つのオリゴヌクレオチドを合成する。これらのオリゴヌクレオチドのうちの２つは、重鎖の各鎖の一部であり、各オリゴヌクレオチドは、アニーリングを可能にするために次のオリゴヌクレオチドと約２０ヌクレオチド重複している。それらのオリゴヌクレオチドは、併せると、ヒト化重鎖可変領域全体に及び、各末端にＸｂａＩ部位での切断を可能にする余分な数ヌクレオチドを有する。それらのオリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲルから精製する。
標準的な手順（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））によってＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して、各オリゴヌクレオチドをリン酸化する。そのリン酸化されたオリゴヌクレオチドをアニーリングするために、それらを各々約３．７５μＭの濃度で４０μｌのＴＡ（３３ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸塩，ｐＨ７．９、６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム）中に共に懸濁し、４分間９５℃に加熱し、４℃までゆっくり冷却する。各オリゴヌクレオチドの逆鎖を合成することによって、これらのオリゴヌクレオチドから完全な遺伝子を合成するために、以下の成分を最終体積１００μｌに加える：
１０μｌ アニーリングしたオリゴヌクレオチド
０．１６ｍＭ 各デオキシリボヌクレオチド
０．５ｍＭ ＡＴＰ
０．５ｍＭ ＤＴＴ
１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ
３．５μｇ／ｍｌ Ｔ４ ｇ４３タンパク質（ＤＮＡポリメラーゼ）
２５μｇ／ｍｌ Ｔ４ ｇ４４／６２タンパク質（ポリメラーゼアクセサリータンパク質）
２５μｇ／ｍｌ ４５タンパク質（ポリメラーゼアクセサリータンパク質）
この混合物を３７℃で３０分間インキュベートする。次いで、１０ｕのＴ４ ＤＮＡリガーゼを加え、３７℃でのインキュベートを３０分間再開する。その反応物を７０℃で１５分間インキュベートすることによって、上記のポリメラーゼおよびリガーゼを不活性化する。その遺伝子をＸｂａＩで消化するために、２００μｇ／ｍｌのＢＳＡおよび１ｍＭのＤＴＴを含む５０μｌの２×ＴＡ、４３μｌの水および５μｌ中の５０ｕのＸｂａＩをその反応物に加える。その反応物を３７℃で３時間インキュベートし、次いで、ゲルにおいて精製する。そのＸｂａＩフラグメントをゲルから精製し、そして標準的な方法によってプラスミドｐＵＣ１９のＸｂａＩ部位にクローニングする。標準的な手法を使用してプラスミドを精製し、ジデオキシ法を使用して配列決定する。
ヒト化軽鎖およびヒト化重鎖を発現するプラスミドの構築は、軽鎖および重鎖のＸｂａＩフラグメントを、それが挿入されていたｐＵＣ１９プラスミドから単離し、次いで、それを、適切な宿主細胞にトランスフェクトされたときに高レベルの完全な重鎖を発現する適切な発現ベクターのＸｂａＩ部位に挿入することによって達成される。
ヒト化抗体の合成および親和性
上記発現ベクターをマウスＳｐ２／０細胞にトランスフェクトし、標準的な方法によって、発現ベクターによって付与された選択可能なマーカーに基づいて、そのプラスミドを組み込んでいる細胞を選択する。これらの細胞が、ＥｐｈＢ３に結合する抗体を分泌したことを確認するために、それらの細胞からの上清を、ＥｐｈＢ３を発現することが知られている細胞とともにインキュベートする。洗浄後、それらの細胞をフルオレセイン結合体化ヤギ抗ヒト抗体とともにインキュベートし、そして洗浄し、ＦＡＣＳＣＡＮサイトフルオロメーターにおいて蛍光について解析する。
次の実験に向けて、上記ヒト化抗体を産生する細胞をマウスに注射し、得られる腹水を回収する。標準的な手法に従ってＡｆｆｉｇｅｌ−１０支持体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆ．）上に調製されたヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗体のアフィニティーカラムに通すことによって、その腹水からヒト化抗体を実質的に均一になるまで精製する。元のマウス抗体に対する上記ヒト化抗体の親和性は、当該分野で公知の手法に従って決定される。
（実施例８）
マウス抗体のヒト操作（ＨＵＭＡＮ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ）
この実施例では、Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体のクローニングおよび発現ならびにそのような抗体の精製および結合活性についての試験について記載する。
Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）配列の設計
抗体可変ドメインのＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（商標）は、抗体分子の結合活性を維持しつつ免疫原性を低下させるための方法としてＳｔｕｄｎｉｃｋａによって報告された［例えば、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、米国特許第５，７６６，８８６号；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７：８０５−８１４（１９９４）を参照のこと］。この方法によれば、各可変領域アミノ酸を、置換のリスクについて割り当てる。アミノ酸置換は、３つのリスクカテゴリーのうちの１つに区別される：（１）低リスクの変更は、免疫原性を低下させる可能性が最も高く、抗原結合を妨害する可能性が最も低いものである；（２）中程度のリスクの変更は、免疫原性をさらに低下させ得るが、抗原結合またはタンパク質フォールディングに影響を及ぼす可能性がより高いものである；（３）高リスク残基は、結合または抗体構造の維持に重要であり、抗原結合またはタンパク質フォールディングが影響を受けるリスクが最も高いものである。プロリンの３次元構造上の役割に起因して、一般に、その位置が代表的には低リスクの位置であったとしても、そのプロリンにおける改変は少なくとも中程度のリスクの変更であると考えられる。置換的な（Ｓｕｂｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ）変更が好ましいが、挿入および欠失も可能である。図７は、ＸＰＡ．０４．００１、ＸＰＡ．０４．０１３、ＸＰＡ．０４．０１８、ＸＰＡ．０４．０４８の軽鎖および重鎖の各アミノ酸残基に対するリスクの割り当てを示しており、高リスク、中程度のリスクまたは低リスクの変更として分類されている。
マウス抗体の軽鎖および重鎖の可変領域は、この方法を使用してＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）（ヒト操作）される。低リスク位置における上記方法に従う改変の候補であるアミノ酸残基を、マウス可変領域のアミノ酸配列とヒト可変領域配列とをアラインメントすることによって同定する。個別のＶＨ配列もしくはＶＬ配列またはヒトコンセンサスＶＨ配列もしくはＶＬ配列をはじめとした任意のヒト可変領域を使用することができる。任意の数の低リスク位置またはすべての低リスク位置におけるアミノ酸残基を変更することができる。
同様に、低リスク位置および中程度のリスク位置のすべてにおいて上記方法に従う改変の候補であるアミノ酸残基を、マウス可変領域のアミノ酸配列とヒト可変領域配列とをアラインメントすることによって同定する。任意の数の低リスク位置もしくは中程度のリスク位置または低リスク位置および中程度のリスク位置のすべてにおけるアミノ酸残基を変更することができる。
永久細胞株開発用の発現ベクターの調製
合成ヌクレオチド合成法を使用して、抗体由来シグナル配列とともに上記の重鎖および軽鎖Ｖ領域配列の各々をコードするＤＮＡフラグメントを構築する。上に記載された軽鎖Ｖ領域アミノ酸配列の各々をコードするＤＮＡを、ヒトカッパ軽鎖定常領域を含んでいるベクターｐＭＸＰ１０に挿入する。上に記載された重鎖Ｖ領域アミノ酸配列の各々をコードするＤＮＡを、ヒトガンマ−１、２、３または４重鎖定常領域を含んでいるベクターｐＭＸＰ６に挿入する。これらのベクターのすべてが、ｈＣＭＶプロモーターおよびマウスカッパ軽鎖３’非翻訳領域ならびに選択可能マーカー遺伝子（例えば、それぞれＧ４１８耐性またはヒスチジノール耐性トランスフェクタントの選択用のｎｅｏまたはまたはｈｉｓ）を含んでいる。
一過性発現用の発現ベクターの調製
上にも記載された軽鎖遺伝子または重鎖遺伝子のいずれかを含むベクターを一過性トランスフェクション用に構築する。これらのベクターは、ｎｅｏ遺伝子またはｈｉｓ遺伝子の代わりに、エプスタイン・バーウイルス核抗原を発現するＨＥＫ２９３細胞における複製のためのエプスタイン・バーウイルスｏｒｉＰを含むことを除いて、持続性トランスフェクションについて上で記載されたものと類似である。
ＨＥＫ２９３Ｅ細胞におけるヒト操作抗ＥｐｈＢ３抗体の一過性発現
それぞれエプスタイン・バーウイルス由来のｏｒｉＰおよび上に記載された軽鎖遺伝子または重鎖遺伝子を含む別個のベクターを、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞に一過性にトランスフェクトする。一過性にトランスフェクトされた細胞を、最大１０日間インキュベートした後、その上清を回収し、プロテインＡクロマトグラフィを使用して抗体を精製する。
持続性にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞の開発
各々１コピーの軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子を共に含む上に記載されたベクターをＥｘ−Ｃｅｌｌ３０２適合型ＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトする。代表的には、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ３０２培地中での懸濁液増殖に適合しているＣＨＯ−Ｋ１細胞を、４０μｇの線形ベクターを用いて電気穿孔する。あるいは、線形ＤＮＡを線状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と複合体形成して、トランスフェクションに使用することができる。その細胞を、１％ＦＢＳおよびＧ４１８が補充されたＥｘ−Ｃｅｌｌ３０２培地を含んでいる９６ウェルプレートにプレーティングする。クローンを９６ウェルプレート中でスクリーニングし、そして各トランスフェクションから上位約１０％のクローンを、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ３０２培地を含んでいる２４ウェルプレートに移す。
７日間および１４日間生育した培養物に対して、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ３０２培地中の２４ウェルプレートにおいて、産生性試験を行い、その時点で、ＩｇＧに対する免疫グロブリンＥＬＩＳＡアッセイによって、分泌された抗体のレベルについて培養上清物を試験する。
上位のクローンを、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ３０２培地を含んでいる振盪フラスコに移す。その細胞が、懸濁液増殖に適合したらすぐに、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ３０２培地中のこれらのクローンを用いて振盪フラスコ試験を行う。これらの細胞を、２５ｍｌの培地を含んでいる１２５ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ内で最大１０日間生育する。ガス交換するためにインキュベーション期間の少なくとも１日おきにそのフラスコを開け、そしてインキュベーション期間の終わりに、その培養液中の免疫グロブリンポリペプチドのレベルをＩｇＧ ＥＬＩＳＡによって測定する。２つまたは３つのマルチユニット（ｍｕｌｔｉ−ｕｎｉｔ）転写ベクターを用いて同じ細胞株を複数回連続してトランスフェクションすることにより、免疫グロブリン産生のレベルのさらなる上昇、好ましくは、３００μｇ／ｍｌまたはそれ以上を示すクローンおよび細胞株がもたらされる。
精製
本発明のベクターおよびすべての系統から免疫グロブリンポリペプチドを精製するためのプロセスが、設計され得る。例えば、当該分野で周知の方法によれば、終了後に、細胞を濾過によって除去する。その濾液をプロテインＡカラムに充填する（必要であれば複数回）。そのカラムを洗浄し、次いで、発現されて分泌された免疫グロブリンポリペプチドをそのカラムから溶出する。抗体生成物の調製のために、そのプロテインＡ貯蔵をウイルス不活性化工程として低ｐＨ（最短で３０分間、最長で１時間、ｐＨ３）において行う。次に、吸着性陽イオン交換工程を使用して、さらにその生成物を精製する。吸着性分離カラムからの溶出液をウイルス担持フィルターに通すことによって、存在し得るウイルス粒子のさらなる除去がもたらされる。その生成物が結合しない陰イオン交換カラムに通すことによって、その濾液をさらに精製する。最終的には、膜分離法を介してその生成物を製剤緩衝液に移すことによって精製プロセスが終わる。その貯留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を少なくとも１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度に調整し、安定剤を加える。
結合活性
組換えＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体のＥｐｈＢ３結合活性を評価する。プロテインＡカラムに通過させることによって振盪フラスコ培養上清からタンパク質を精製した後、Ａ２８０によって濃度決定を行う。他の実施例に記載したように結合アッセイを行う。
（実施例９）
インビボにおけるＥＰＨＢ３特異的抗体の効果
インビボにおいて腫瘍増殖に対する抗ＥｐｈＢ３抗体の効果を試験するために、同所性異種移植片モデルを使用し、このモデルは、乳癌細胞株（例えば、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＭＤＡ−ＭＢ−４３５）を雌のＳＣＩＤ−ベージュマウスの乳房脂肪パッドに、または乳房脂肪パッド付近に移植する。その癌細胞（１匹のマウスあたり：５０〜１００μｌ中の５×１０６細胞）を等体積のマトリゲルと混合し、外科的に露出された乳房脂肪パッドに直接注射するか、または乳房脂肪パッドの上の皮下に注射する。そのマウスをケージに戻し、体積が約１００〜１５０ｍｍ３に達するまで腫瘍増殖をモニターする。次いで、そのマウスを処置群にランダム化する。
処置は、抗体またはアイソタイプコントロール抗体を１週間に２回投与する腹腔内注射からなる。有効性研究において使用される用量は、０．２〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲である。腫瘍体積を１週間に２〜３回測定し、コントロール処置マウスに対するアゴニスト処置マウスの腫瘍体積の減少パーセントとして有効性を判定する。
本明細書中で参照され、そして／または出願データシート（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａ Ｓｈｅｅｔ）に列挙されている、上記の米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国の特許、外国の特許出願および非特許刊行物のすべての全体が、本明細書中で参考として援用される。
前述から、本発明の特定の実施形態が、例示目的で本明細書中において記載されてきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な改変が行われ得ることが認識されるだろう。

Claims (42)

  1. １０−６Ｍ以下の親和性（ＫＤ）でＥｐｈＢ３の細胞外ドメインと結合し、ＥｐｈＢ３との結合について抗体ＸＰＡ．０４．００１、ＸＰＡ．０４．０１３、ＸＰＡ．０４．０１８、ＸＰＡ．０４．０４８、ＸＨＡ．０５．３３７、ＸＨＡ．０５．２００、ＸＨＡ．０５．１１１、ＸＨＡ．０５．００５、ＸＨＡ．０５．２２８、ＸＨＡ．０５．０３０、ＸＨＡ．０５．９６４またはＸＨＡ．０５．８８５のいずれかと７５％超で競合する、抗体。
  2. 抗体ＸＰＡ．０４．００１、ＸＰＡ．０４．０１３、ＸＰＡ．０４．０１８、ＸＰＡ．０４．０４８、ＸＨＡ．０５．３３７、ＸＨＡ．０５．２００、ＸＨＡ．０５．１１１、ＸＨＡ．０５．００５、ＸＨＡ．０５．２２８、ＸＨＡ．０５．０３０、ＸＨＡ．０５．９６４またはＸＨＡ．０５．８８５のいずれかと同じＥｐｈＢ３のエピトープに結合する、請求項２に記載の抗体。
  3. 抗体ＸＰＡ．０４．００１、ＸＰＡ．０４．０１３、ＸＰＡ．０４．０１８、ＸＰＡ．０４．０４８、ＸＨＡ．０５．３３７、ＸＨＡ．０５．２００、ＸＨＡ．０５．１１１、ＸＨＡ．０５．００５、ＸＨＡ．０５．２２８、ＸＨＡ．０５．０３０、ＸＨＡ．０５．９６４またはＸＨＡ．０５．８８５のいずれかの１、２、３、４、５または６個のＣＤＲを含む、抗体。
  4. 前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト操作抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体または抗体フラグメントである、請求項１〜３のいずかに記載の抗体。
  5. ＣＤＲ内の少なくとも１つのアミノ酸が、別の抗ＥｐｈＢ３抗体の対応するＣＤＲの対応する残基で置換されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
  6. ＣＤＲ内の１つまたは２つのアミノ酸が改変されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
  7. ＸＰＡ．０４．００１、ＸＰＡ．０４．０１３、ＸＰＡ．０４．０１８、ＸＰＡ．０４．０４８、ＸＨＡ．０５．３３７、ＸＨＡ．０５．２００、ＸＨＡ．０５．１１１、ＸＨＡ．０５．００５、ＸＨＡ．０５．２２８、ＸＨＡ．０５．０３０、ＸＨＡ．０５．９６４またはＸＨＡ．０５．８８５の抗体に対して、可変軽鎖領域または可変重鎖領域のいずれかにわたり少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を保持している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
  8. ヒト抗体配列の定常領域ならびにヒト抗体配列の１つ以上の重鎖可変フレームワーク領域および軽鎖可変フレームワーク領域を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体。
  9. 前記ヒト抗体配列が、個別のヒト配列、ヒトコンセンサス配列、個別のヒト生殖細胞系列配列またはヒトコンセンサス生殖細胞系列配列である、請求項８に記載の抗体。
  10. 前記重鎖定常領域が、改変されているかまたは改変されていない、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、それらのフラグメントまたはそれらの組み合わせである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体。
  11. ＥｐｈＢ３に対して１０−７、１０−８または１０−９Ｍ以下の結合親和性を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体。
  12. 前記ＣＤＲにおいて保存的置換を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体。
  13. 低リスク残基および中程度のリスク残基において保存的変更または非保存的変更を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体。
  14. 前記軽鎖定常領域が、改変されているかもしくは改変されていないラムダ軽鎖定常領域、カッパ軽鎖定常領域、それらのフラグメントまたはそれらの組み合わせである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体。
  15. ＥｐｈＢ３のリン酸化を誘導する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体。
  16. ＥｐｈＢ３のオリゴマー化を誘導する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体。
  17. ＥｐｈＢ３の内部移行を誘導する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体。
  18. ＥｐｈＢ３の分解を誘導する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体。
  19. ＥｐｈＢ３のシグナル伝達を誘導する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体。
  20. ＥｐｈＢ３へのエフリンＢの結合を阻害する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の抗体。
  21. 癌細胞の増殖を阻害する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体。
  22. 肺癌細胞、卵巣癌細胞、食道癌細胞、結腸癌細胞または乳癌細胞の増殖を阻害する、請求項２１に記載の抗体。
  23. 別の診断薬または治療薬に結合体化されている、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の抗体。
  24. 癌の処置に有用なＥｐｈＢ３タンパク質の細胞外ドメインに対する抗体についてスクリーニングする方法であって、該方法は：
    ＥｐｈＢ３のＥＣＤを含むポリペプチドを、抗体ＸＰＡ．０４．００１、ＸＰＡ．０４．０１３、ＸＰＡ．０４．０１８またはＸＰＡ．０４．０４８の少なくとも１、２、３、４、５または６個のＣＤＲを含む候補抗体と接触させる工程；
    該ポリペプチドに対する該候補抗体の結合親和性を検出する工程、および
    少なくとも１０−６Ｍの結合親和性が検出される場合に該候補抗体を癌の処置に有用な抗体と同定する工程、
    を含む、方法。
  25. 抗体を体系的に変化させ、そして癌の処置に有用なＥｐｈＢ３タンパク質の細胞外ドメインに対する抗体についてスクリーニングする方法であって、該方法は：
    抗体ＸＰＡ．０４．００１、ＸＰＡ．０４．０１３、ＸＰＡ．０４．０１８、ＸＰＡ．０４．０４８、ＸＨＡ．０５．３３７、ＸＨＡ．０５．２００、ＸＨＡ．０５．１１１、ＸＨＡ．０５．００５、ＸＨＡ．０５．２２８、ＸＨＡ．０５．０３０、ＸＨＡ．０５．９６４またはＸＨＡ．０５．８８５のＣＤＲ内の１つまたは２つのアミノ酸に対する改変を含む候補抗体を調製する工程、
    ＥｐｈＢ３のＥＣＤを含むポリペプチドを該候補抗体と接触させる工程
    該ポリペプチドに対する該候補抗体の結合親和性を検出する工程、および
    少なくとも１０−６Ｍの結合親和性が検出される場合に、該候補抗体を癌の処置に有用な抗体と同定する工程
    を含む、方法。
  26. 癌の処置に有用なＥｐｈＢ３タンパク質の細胞外ドメインに対する抗体についてスクリーニングする方法であって、該方法は：
    肺細胞、卵巣細胞、食道細胞、結腸細胞または乳房細胞を、抗体ＸＰＡ．０４．００１、ＸＰＡ．０４．０１３、ＸＰＡ．０４．０１８、ＸＰＡ．０４．０４８、ＸＨＡ．０５．３３７、ＸＨＡ．０５．２００、ＸＨＡ．０５．１１１、ＸＨＡ．０５．００５、ＸＨＡ．０５．２２８、ＸＨＡ．０５．０３０、ＸＨＡ．０５．９６４もしくはＸＨＡ．０５．８８５の少なくとも１、２、３、４、５または６個のＣＤＲを含む候補抗体あるいは１つ以上のＣＤＲ内に１つもしくは２つのアミノ酸の改変を含む抗体と接触させる工程；
    該細胞の増殖または生存を検出する工程；および
    細胞増殖または細胞生存の減少が検出される場合に、該候補抗体を癌の処置に有用な抗体と同定する工程
    を含む、方法。
  27. 癌に罹患している被験体を処置する方法であって、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の抗体を治療有効量において投与する工程を含む、方法。
  28. 前記癌が、肺癌、卵巣癌、食道癌、結腸癌または乳癌である、請求項２７に記載の方法。
  29. 第２の治療薬が投与される、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記被験体が、放射線治療または手術によってさらに処置される、請求項２８に記載の方法。
  31. ＥｐｈＢ３を発現している腫瘍細胞を標的化する方法であって、放射性核種または他のトキシンに結合体化されている請求項１〜３０のいずれか一項に記載の抗体を投与する工程を含む、方法。
  32. 前記被験体が、哺乳動物である、請求項２７〜３１に記載の方法。
  33. 前記被験体が、ヒトである、請求項３２に記載の方法。
  34. 請求項１〜２３のいずれか一項に記載の抗体の重鎖または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
  35. 制御性調節配列に作動可能に連結された請求項３４に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
  36. 請求項３５に記載のベクターまたは請求項４８に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
  37. 抗体を作製するために請求項３６に記載の宿主細胞を使用する方法であって、適当な条件下で請求項３６に記載の宿主細胞を培養する工程および該抗体を回収する工程を含む、方法。
  38. 請求項３７に記載の方法によって作製される抗体。
  39. 少なくとも９５重量％の均質性で精製されている、請求項１〜２３または３８のいずれか一項に記載の抗体。
  40. 請求項３９に記載の抗体および薬学的に許容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
  41. 容器内に包装されており、治療有効量の本発明の抗体を含む請求項１〜４０のいずれか一項に記載の抗体を含むキットであって、該キットは、必要に応じて第２の治療薬を備え、該容器に添付されているかまたは該容器とともに包装されているラベルをさらに備え、該ラベルには、該容器の内容物が記載されており、癌を処置するための該容器の該内容物の使用に関する適用および／または指示が提供される、キット。
  42. 前記容器が、バイアルまたはビンまたは予め充填された注射器である、請求項４１に記載のキット。
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