ES2242437T3

ES2242437T3 - Utilizaciones de agonistas y antagonistas del receptor eph para el tratamiento de trastornos vasculares.

Info

Publication number: ES2242437T3
Application number: ES99960524T
Authority: ES
Inventors: Michel Aguet
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1998-11-20
Filing date: 1999-11-18
Publication date: 2005-11-01
Anticipated expiration: 2019-11-18
Also published as: EP1135153A1; DK1135153T3; AU766077B2; AU1739700A; CA2351311A1; JP2002530350A; AU766077C; US20040234520A1; US20070031434A1; ATE293989T1; IL142921A0; EP1135153B1; JP2006016404A; DE69925024T2; WO2000030673A1; US20040136983A1; DE69925024D1; PT1135153E

Abstract

Utilización de un antagonista del receptor Eph, como un ingrediente activo, para la fabricación de una composición destinada al tratamiento del cáncer en un mamífero.

Description

Utilizaciones de agonistas y antagonistas del receptor Eph para el tratamiento de trastornos vasculares.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

Esta invención se refiere de forma general a usos de los antagonistas o agonistas del receptor Eph. En concreto, la presente invención proporciona procedimientos para inhibir o estimular la angiogénesis en un mamífero, incluyendo la administración al mamífero de una cantidad efectiva, respectivamente, de un antagonista o agonista.

Descripción de la técnica relacionada

La formación de nuevos vasos sanguíneos, bien a partir de la diferenciación de células endoteliales durante el desarrollo embrionario (vasculogénesis) o a partir de vasos preexistentes durante la vida adulta (angiogénesis) es una característica esencial del desarrollo de órganos, de la reproducción, y de la cicatrización de heridas en los organismos superiores. Folkman y Shing, J. Biol. Chem., 267:10931-10934 (1992); Reynolds et al., FASEB J., 6:886-892 (1992); Risau et al., Development, 102:471-478 (1988).

La angiogénesis está implicada en la patogénesis de una variedad de desórdenes. Estos incluyen los tumores sólidos, los síndromes de neovasculatura intraocular, tales como las retinopatías proliferantes o la degeneración macular asociada con la edad (AMD), la artritis reumatoide, y la psoriasis (Folkman et al., J. Biol. Chem., 267:10931-10934 (1992); Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol., 53:217-239 (1991); y Garner A, "Vascular diseases", en: Pathobiology of ocular disease. A dynamic approach. Eds. Garner A, Klintworth G K, 2ª edición, Marcel Dekker, NY, pp 1625-1710 (1994)). En el caso de los tumores sólidos, la vascularización permite a las células tumorales adquirir una ventaja en crecimiento y una autonomía proliferante en comparación con las células normales. En consecuencia, se ha observado una correlación entre la densidad de microvasos en secciones de tumor y la supervivencia del paciente en el cáncer de mama así como en varios otros tumores (Weidner et al., N. Engl. J. Med., 324:1-6 (1991); Horak et al., Lancet, 340:1120-1124 (1992); y Macchiarini et al., Lancet, 340:145-146 (1992)).

La búsqueda de reguladores positivos de la angiogénesis ha proporcionado muchos candidatos, incluyendo los aFGF, bFGF, TGF-alpha, TGF-beta, HGF, TNF-alfa, angiogenina, IL-8, etc. (Folkman et al. y Klagsbrun et al.). Los reguladores negativos identificados hasta la fecha incluyen la trombosises (Good et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87:6624-6628 (1990)), el fragmento N-terminal de 16-kilodalton de la prolactina (Clapp et al., Endocrinology, 133:1292-1299 (1993)), la angiostatina (O'Reilly et al., Cell, 79:315-328 (1994)) y la endostatina (O'Reilly et al., Cell, 88:277-285 (1996)).

Se han descrito un cierto número de quinasas de tirosina de receptor que gobiernan etapas discretas del desarrollo vascular (Folkman et al., Cell, 87:1153-1155 (1996); Hanahan, D., Science, 277:48-50 (1997); Risau, W., Nature, 386:671-674 (1997); Yancopoulos et al., Cell, 93:661-664 (1998)).

El Flk-1 (VEGF-R2), un receptor para el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), media la diferenciación celular precursora endotelial y hematopoyética (Shalaby et al., Nature, 376:62-66 (1995); Carmeliet et al., Nature, 380:435-439 (1996); Ferrara et al., Nature, 380:439-442 (1996)]. El VEGF también gobierna las etapas tardías de la angiogénesis a través de la ligación del Flt-1 (VEGF-R2) (Fong et al., Nature, 376:66-70 (1995)). Los ratones que carecen del Flt-1 tienen un endotelio vascular desorganizado a través de la presencia ectópica de células endoteliales a partir de las etapas más tempranas del desarrollo vascular, sugiriendo que la señalización del Flt-1 es esencial para el ensamblado correcto de las capas endoteliales (Fong et al., ver más arriba).

Otro receptor quinasa de tirosinas, el Tie-2 (Dumont et al., Genes Dev., 8:1897-1909 (1994); Sato et al., Nature, 376:70-74 (1995)), y sus ligandos Ang-1 (Davis et al., Cell, 87:1161-1169 (1996); Suri et al., Cell, 87:1171-1180 (1996)) y Ang-2 (Maisonpierre et al., Science, 277:55-60 (1997)) están implicados en el ensamblado de los componentes de la pared vascular no endotelial. El Tie-1 está implicado en el mantenimiento de la integridad y su inactivación resulta en mortalidad perinatal debido a edema y hemorragia (Sato, et al., Nature, 376:70-74 (1995)). La vía del Tie-2 parece estar implicada en los pasos de maduración a través de promover las interacciones entre el endotelio y los componentes de la pared del vaso que lo rodean (Suri et al., supra; y Vikkula et al., Cell, 87:1181-1190 (1996)).

La subfamilia de la quinasa de tirosina Eph parece ser la subfamilia más extensa de quinasas de tirosina de receptor transmembrana (Pasquale, E. Curr. Opin. Cell Biol., 9:608-615 (1997); y Orioli y Klein, Trends in Genetics, 13:354-359 (1997)). Debido a que se han identificado tantos genes del receptor Eph en diferentes especies en un plazo breve de tiempo, a cada gen se le han asignado múltiples nombres. En consecuencia, se ha desarrollado una nomenclatura unificada en la cual los receptores Eph se dividen en dos grupos en base a las homologías de secuencia. Los miembros del grupo EphA se unen preferentemente a los ligandos Eph con una ancla glicosilfosfatidilinositol (GPI) para el anclaje a membrana. Tales ligandos unidos a GPI se agrupan en la subclase Efrina-A. Los miembros del grupo EphB preferentemente se unen a ligandos que poseen una región transmembrana polipeptídica para su anclaje a membrana. Tales ligandos transmembrana se agrupan en la subclase Efrina-B.

Las efrinas y sus receptores gobiernan la correcta migración y ubicación de las células durante el desarrollo neural, presumiblemente modulando la repulsión intercelular (Pasquale, ver más arriba; Orioli y Klein, ver más arriba). Se ha observado una señalización bidireccional en algunos pares Efrina-B/ligando EphB/receptor (Holland et al., Nature, 383:722-725 (1996); y Bruckner et al., Science, 275:1640-1643 (1997)).

El receptor Htk descubierto en Bennett et al., J. Biol. Chem., 269:14211-14218 (1994) es un miembro de la familia Eph. Este receptor, denominado "EphB4", se expresa en una variedad de tejidos, incluyendo las células mioepiteliales y las epiteliales. Bennett et al., ver más arriba; Ciossek et al., Oncogene, 11:2085-2095 (1995); Inada et al., Blood, 89: 2757-2765 (1997); Nikolova et al., J. Cell Sci., 111:2741-2751 (1998). Recientemente se ha descrito que la expresión del receptor EphB4 está relacionada con el estrógeno (Nikolova et al., ver más arriba).

Se ha propuesto que Efrina-A1 y Efrina-B1 tienen propiedades angiogénicas (Pandey et al., Science, 268:567-569 (1995); y Stein et al., Genes Dev., 12:667-678 (1998)). Se ha descrito recientemente que Efrina-B2, un ligando para el receptor EphB4, marca el compartimento arterial durante la angiogénesis temprana, y los ratones que carecían de Efrina-B2 mostraron anomalías graves en la formación del lecho capilar (Wang et al., Cell, 93:741-753 (1998)).

En relación a las reivindicaciones en la presente invención que están facultadas a partir de su fecha de prioridad reivindicada, WO99/52.541 es técnica previa sólo para los propósitos de novedad, y sólo hasta el punto en que está facultada a partir de una de sus propias fechas de prioridad reivindicadas. WO99/52.541 descubre que los antagonistas del EphB4 inhibirán la angiogénesis; un párrafo distinto indica que la invención se refiere a procedimientos para potenciar o inhibir la angiogénesis (incluyendo la angiogénesis en tumores). Mientras que cada uno de los tres documentos prioritarios se refieren a ambas, (1) la inhibición de la angiogénesis y (2) la inhibición de tumores, ninguno contiene un párrafo que directamente y de forma no ambigua una la inhibición de la angiogénesis usando antagonistas de un receptor Eph con el tratamiento de tumores.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a medios para inhibir la angiogénesis o tratar una anomalía vascular en un mamífero, comprendiendo la administración al mamífero de una cantidad de un antagonista del receptor Eph que es efectiva para inhibir la angiogénesis o para tratar la anomalía vascular en el mamífero. Por tanto, la presente invención proporciona medios para tratar enfermedades o alteraciones caracterizadas por una vascularización indeseable o excesiva, tal como se define en las reivindicaciones, incluyendo, a modo de ejemplo, los tumores, y especialmente los tumores malignos sólidos, la artritis reumatoide, la psoriasis, la ateroesclerosis, las retinopatías diabética y otras, la fibroplasia retrolental, la degeneración macular asociada a la edad, el glaucoma neovascular, los hemangiomas, las hiperplasias de la tiroides (incluyendo la enfermedad de Grave), los transplantes de córnea y otros tejidos, y la inflamación crónica, mediante la administración de una cantidad efectiva de un antagonista del receptor Eph a un paciente que necesita el mismo. La invención proporciona además un procedimiento para tratar enfermedades o alteraciones caracterizados por una permeabilidad vascular indeseable o excesiva, tales como el edema asociados con los tumores cerebrales, los ascites asociados con los tumores malignos, el síndrome de Meig, la inflamación pulmonar, el síndrome nefrítico, la efusión pericárdica (tal como la asociada con la pericarditis) y la efusión
pleural.

En una realización, se pretende que el antagonista del receptor Eph trate una anomalía vascular (por ejemplo, las anomalías de los vasos pequeños) que resultan de la terapia con estrógenos. La administración del antagonista del receptor Eph podría preceder o seguir la administración de estrógeno al paciente. También se contempla la terapia concomitante, por ejemplo, cuando el antagonista del receptor Eph y el estrógeno se proporcionan en la misma composición.

En otro aspecto, la invención proporciona medios para tratar el cáncer, tal como un tumor maligno sólido, en un mamífero, que comprenden administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de receptor Eph.

En una realización adicional, la invención se refiere a medios para tratar el tejido vascular o para estimular la angiogénesis en un mamífero, que comprenden administrar al mamífero una cantidad de un agonista del receptor Eph que es efectiva para tratar el tejido vascular o para estimular la angiogénesis. En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para tratar un trauma causado a la red vascular en un mamífero, que comprende administrar al mamífero que padece el trauma una cantidad terapéuticamente efectiva de un agonista del receptor Eph. El trauma es, por ejemplo, úlceras diabéticas o una herida de los vasos sanguíneos o del corazón.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 ilustra esquemáticamente el EphB4 de ratón, el cual comprende 987 aminoácidos y contiene un péptido de señal, un dominio parecido a globulina, una región rica en cisteína (aa 184-373), dos repeticiones de fibronectina III (FNIII, aa 324-408, 434-509), y un dominio citoplasmático quinasa de tirosina (TK, aa 615-878), los cuales están todos conservados dentro de la família Eph. La organización genómica del gen del receptor EphB4 de ratón se determinó sólo en parte. Recuadros negros: exones conocidos; recuadros vacíos, sin mapear.

La Figura 2 ilustra el análisis mediante transferencia Southern del ADN genómico derivado de embriones E9.5 y digerido con EcoRI. Sonda: fragmento XbaI-EcoRI de 1,5 kb (sonda flanqueante) derivada de las secuencias genómicas cadena abajo respecto el vector apuntado (ver Figura 1).

La Figura 3A muestra una hibridación in situ de un montaje completo de E9.5. La Figura 3B es una representación de campo oscuro de los embriones E9.5 EphB4+/-(izquierda) y EphB4-/-(derecha).

Las Figuras 4A-E muestran el análisis histológico y de montaje completo de embriones E9.5 inmunoteñidos con anti-PECAM. La Figura 4A muestra una sección coronal de la cabeza de embriones E9.5 (\times240). La Figura 4B muestra una sección de las yemas de las extremidades anteriores de embriones E9.5 (\times960). La Figura 4C muestra una sección coronal del tronco de embriones E9.5 (\times240) (da, aorta dorsal; cv, vena cardinal). La Figura 4D muestra un montaje completo de embriones E9.5 teñido con anti-PECAM (da, aorta dorsal; aa, arco aórtico). La Figura 4E muestra una ampliación de las venas colectoras anteriores de la cabeza (acv) corriente arriba respecto la vena cardinal.

La Figura 5A muestra secciones del saco de la yema de E10.0 teñidas con anti-PECAM (\times120). La Figura 5B muestra secciones de saco de la yema de E9.5 teñidas con anti-PECAM (\times480).

La Figura 6 muestra una sección coronal de la cabeza de embriones de E9.5: crecimiento del neuroepitelio (\times960).

Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. Definiciones

El término "receptor Eph" se refiere a un receptor quinasa de tirosinas que pertenece a la familia de receptores Eph. La familia de receptor Eph está revisada, por ejemplo, en Pasquale, E., Curr. Opin. Cell Biol., 9:608-615 (1997); y Orioli y Klein, Trends in Genetics, 13:354-359 (1997). La familia Eph comprende catorce receptores quinasa de tirosina transmembrana estructuralmente relacionados, teniendo cada uno una región extracelular que comprende una serie de módulos; un dominio inmunoglobulina (Ig) putativo en el extremo amino terminal, seguido por una región rica en cisteína y dos repeticiones de fibronectina del tipo III cerca del segmento único que abarca la membrana, una región citoplasmática que comprende un dominio quinasa de tirosina altamente conservado flanqueado por una región yuxtamembrana y una cola carboxi-terminal, las cuales están menos conservadas. Las diversas formas variantes con supresiones, truncaciones, sustituciones, o inserciones están incluidas en la presente definición. Más aún, el receptor Eph, Mep, que carece de actividad quinasa de tirosina, y otras moléculas del receptor a descubrirse, están incluidos en la presente definición. Los receptores Eph pueden dividirse en dos grupos en base a las homologías de secuencias.

Los receptores Eph del grupo EphA, denominados "receptores EphA" en ésta, interaccionan preferentemente con ligandos unidos a glicosilfosfatidilinositol (GPI) (de la subclase Efrina-A, la cual comprende actualmente cinco ligandos). Los receptores específicos EphA incluyen: el EphA1 (también denominado Eph y Esk); el EphA2 (también denominado Eck, mEck, Myk2, Sek2); el EphA3 (también denominado Hek, Mek4, Tyro4 y Cek4); el EphA4 (también denominado como Hek8, Sek1, Tyro1, y Cek8); el EphA5 (también denominado Hek7, Bsk, Ehk1, Rek7 y Cek7); el EphA6 (también denominado mEhk2 y Ehk2); el EphA7 (de otro modo llamado Hek11, Mdk1, Ebk, Ehk3); y el Eph8 (también denominado Eek y mEek), y las variantes de los mismos que ocurren de forma natural.

Los receptores Eph del grupo EphB, denominados "receptores EphB" en ésta, interaccionan preferentemente con ligandos transmembrana (de la subclase Efrina-B, la cual comprende actualmente tres ligandos). Los receptores EphB específicos incluyen el EphB 1 (de otro modo llamado Net, Elk y Cek6); el EphB2 (otros nombres incluyen: Erk, Hek5, Drt, Nuk, Sek3, Tyro5, Cek5 y Qek5); el EphB3 (también denominado Hek2, Sek4, Mdk5, Tyro6, Cek10 y Qek10); el EphB4 (también designado Htk, HpTK5, Myk1, Mdk2 y Tyro 11); el EphB5 (también llamado Cek9); y el EphB6 (Hep y Mep son otros nombres para este receptor), y variantes de los mismos que ocurren de forma natural.

El receptor Eph preferido es un receptor Eph de "secuencia nativa" (ver la definición más abajo). Preferiblemente, el receptor Eph es un "receptor Eph humano", es decir, que tiene la secuencia de aminoácidos de un receptor Eph procedente de una fuente humana.

Un polipéptido de "secuencia nativa" es uno que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido (por ejemplo el receptor Eph o ligando Eph) derivado de la naturaleza. Tales polipéptidos de secuencia nativa pueden ser endógenos (es decir, están presentes in vivo en una mamífero), aislados a partir de la naturaleza, o pueden producirse mediante medios recombinantes o sintéticos. Por tanto, un polipéptido de secuencia nativa puede tener la secuencia de aminoácidos de un polipéptido humano, de un polipéptido de ratón, o de un polipéptido procedente de cualquier otra especie de mamífero, que ocurran de forma natural.

Un receptor Eph preferido en ésta es un "receptor EphB4" (es decir, el receptor Htk), tal como un receptor Eph humano que comprenda una secuencia de aminoácidos como en Bennett et al., J. Biol. Chem., 269(19):14211-14218 (1994), incorporada expresamente en ésta por referencia.

El término "ligando Eph" en ésta se refiere a un polipéptido que se une a, y opcionalmente activa (por ejemplo, estimula la fosforilación de tirosinas de) un receptor Eph.

El ligando Eph podría ser un "ligando Eph unido a GPI", es decir, un ligando que comprende un ancla glicosilfosfatidilinositol o GPI. Los ejemplos de ligandos de Eph unidos a GPI incluyen, la Efrina-A1 (también denominada Lerk1 y B61); la Efrina-A2 (por otra parte conocida como Elf1 y Cek7-L); la Efrina-A3 (también denominada Lerk3 y Ehk1-L); Efrina-A4 (también llamada Lerk4); y la Efrina-A5 (otros nombres son Lerk7, Al1 y Rags), y las variantes de los mismos que ocurren de forma natural.

Alternativamente, el ligando Eph podría ser un "ligando Eph transmembrana", es decir, comprender un dominio polipeptídico transmembrana y, preferiblemente, comprender además un dominio polipeptídico citoplasmático. Los ejemplos de ligandos de Eph transmembrana incluyen la Efrina-B1 (también llamada Lerk2, Elk-L y Cek5-L); la Efrina-B2 (conocida de otro modo como Lerk5, Htk-L y Elf-2); y la Efrina-B3 (también denominada Nlerk2 y Elk-L3), y las variantes de los mismos que ocurren de forma natural.

El ligando Eph preferido es un ligando Eph transmembrana, y el más preferido es la Efrina-B2 (es decir, el ligando Htk) que comprende, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos como en los números de acceso al GenBank nº L38847 (ligando Htk de ratón) ó L38734 (ligando HTK humano) (ver, también, Bennett et al., PNAS (USA), 92:1866-1870 (1995), incorporada expresamente en ésta por referencia).

El término "variante de la secuencia de aminoácidos" se refiere a polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que difieren hasta cierto punto del polipéptido de secuencia nativa. Ordinariamente, las variantes de secuencia de aminoácidos poseerán al menos un 70% de homología con al menos un dominio unidor de receptor de un ligando Eph de secuencia nativa, o con al menos un dominio unidor de ligando de un receptor Eph de secuencia nativa, y preferiblemente, serán al menos un 80%, más preferiblemente un 90% homólogos con tales dominios unidores de receptor o ligando. Las variantes de secuencia de aminoácidos poseen sustituciones, supresiones, y/o inserciones en ciertas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos nativa.

La "homología" se define como el porcentaje de residuos en la variante de secuencia de aminoácidos que son idénticos después de alinear las secuencias e introducir, si es necesario, discontinuidades para conseguir el porcentaje máximo de homología. Los procedimientos y programas de ordenador para el alineamiento son bien conocidos en la técnica. Uno de tales programas de ordenador es "Align 2", escrito por Genentech, Inc., el cual se registró con su documentación para el usuario en la United States Copyright Office, Washington, D.C. 20559, el 10 de diciembre de 1991.

El término "dominio unidor del receptor", tal como se usa en ésta, designa cualquier región de un ligando Eph que retiene al menos una capacidad cualitativa de unión al receptor de un correspondiente ligando Eph de secuencia nativa. Las variantes de la secuencia de aminoácidos y/o los derivados de un dominio de unión de receptor de secuencia nativa están incluidos en esta definición.

El término "dominio unidos de ligando", tal como se usa en ésta, se refiere a cualquier región de un receptor Eph que retiene al menos una capacidad cualitativa de unión de ligando de un correspondiente receptor Eph de secuencia nativa. Las variantes de la secuencia de aminoácidos y/o los derivados de un dominio de unión de ligando de secuencia nativa están incluidos en esta definición.

El término "receptor Eph soluble" o "ligando Eph soluble" se refiere en ésta una forma del receptor Eph o del ligando Eph que está esencialmente libre de un región de anclaje a membrana de la molécula nativa, o a una forma que tiene una región de anclaje a membrana desactivada. Por "región de anclaje a membrana" se quiere indicar un dominio transmembrana (y, opcionalmente un dominio citoplasmático) de un receptor Eph o ligando Eph, o un ancla GPI de un ligando Eph. Por "esencialmente libre" se quiere significar que la molécula tiene menos del 1% de tal región de anclaje a membrana, preferiblemente del 0,5 al 1% de tal región, y más preferiblemente del 0,1 al 0% de tal región.

El término "antagonista" cuando se usa en ésta se refiere a una molécula que es capaz de inhibir una o más de las actividades biológicas de una molécula diana, tal como un receptor Eph. Los antagonistas podrían actuar interfiriendo con la unión de un receptor a un ligando y viceversa, incapacitando o matando células que han sido activadas por un ligando, y/o interfiriendo con la activación del receptor o ligando (por ejemplo, la activación de la quinasa de tirosina), o con la transducción de la señal después de la unión del ligando a un receptor celular. El antagonista podría bloquear completamente las interacciones receptor-ligando o podría reducir sustancialmente tales interacciones. La totalidad de tales puntos de intervención por parte de un antagonista deberán considerarse equivalentes para los propósitos de esta invención. Por tanto, dentro del ámbito de la invención se incluyen los antagonistas (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes) que se unen a un receptor Eph, ligando Eph, o a un complejo de un receptor Eph y ligando Eph; variantes o derivados de la secuencia de aminoácidos de un receptor Eph o ligando Eph que antagoniza la interacción entre un receptor Eph y un ligando Eph; receptor Eph soluble o ligando Eph soluble, opcionalmente fusionado a una molécula heteróloga tal como una región de inmunoglobulina (por ejemplo, una inmunoadhesina); un complejo que comprende un receptor Eph en asociación con un ligando Eph; secuencias peptídicas sintéticas o nativas que se unen al receptor Eph o ligando Eph; pequeñas moléculas antagonistas; y ácidos nucleicos antagonistas (por ejemplo, antisentido).

Un "agonista" en ésta es una molécula que es capaz de activar una o más de las actividades biológicas de una molécula diana, tal como un receptor Eph. Los agonistas podrían, por ejemplo, actuar activando una molécula diana y/o mediando la transducción de la señal. Están incluidos dentro del ámbito de la invención los propios receptor Eph y ligando Eph; los agonistas (por ejemplo, anticuerpos agonistas) que se unen al receptor Eph, ligando Eph, o a un complejo de un receptor Eph y ligando Eph; las variantes o derivados de secuencia de aminoácidos de un receptor Eph o ligando Eph que activan el receptor Eph o ligando Eph (por ejemplo, una molécula bivalente tal como una inmunoadhesina que activa el receptor o ligando Eph); péptidos con secuencias nativas o sintéticas que se unen y activan el receptor Eph o ligando Eph; pequeñas moléculas agonistas; y un gen que codifica el receptor Eph o ligando Eph (por ejemplo, para terapia génica).

"Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como al profiláctico o a las medidas preventivas. Entre aquéllos en necesidad de tratamiento se incluyen aquéllos que ya padecen el trastorno así como aquéllos en los que debe prevenirse el trastorno.

"Mamífero" para los propósitos de tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo los humanos, los domésticos y los animales de granja, y los animales de zoo, deportes o de compañía, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferiblemente, el mamífero es humano. El humano a tratarse en éste incluye un embrión o feto (por ejemplo, cuando el mamífero se trata en el útero), un bebé, un niño, un adulte pubescente, o un adulto.

"Cantidad efectiva" o "Cantidad efectiva terapéuticamente" del agonista o antagonista es una cantidad que es efectiva para prevenir, atenuar el empeoramiento de, aliviar, o curar la condición tratada.

Una "cantidad efectiva terapéuticamente", en referencia al tratamiento del cáncer se refiere a una cantidad capaz de invocar uno o más de los siguientes efectos: (1) inhibición, hasta cierto punto, del crecimiento del tumor, incluyendo, ralentizar y detener completamente el crecimiento; (2) reducción en el número de células tumorales; (3) reducción en el tamaño del tumor; (4) inhibición (es decir, reducción, ralentización, o detención completa) de la infiltración de células tumorales en órganos periféricos; (5) inhibición (es decir, reducción, ralentización, o detención completa) de la metástasis; (6) potenciación de la respuesta inmune anti-tumor, la cual podrían, pero no tiene porqué, resultar en la regresión o rechazo del tumor; y/o (7) alivio, hasta cierto punto, de uno o más síntomas asociados con el trastorno.

El término "inhibiendo la angiogénesis" se refiere al acto de prevenir o reducir sustancialmente el desarrollo de vasos sanguíneos en un mamífero tratado.

Las expresiones "estimulando la angiogénesis" o "promoviendo la angiogénesis" se refieren al acto de incrementar sustancialmente el desarrollo de los vasos sanguíneos en un mamífero tratado.

"Enfermedades o trastornos caracterizados por una vascularización excesiva o indeseable" incluye, a modo de ejemplo, los tumores, especialmente los tumores malignos sólidos, la artritis reumatoide, la psoriasis, la ateroesclerosis, las retinopatías diabética y otras, la fibroplasia retrolental, la degeneración macular asociada con la edad, el glaucoma neovascular, los hemangiomas, las hiperplasias de la tiroides (incluyendo la enfermedad de Grave), los transplantes de córnea y otros tejidos, y la inflamación crónica.

Los ejemplos de "enfermedades o alteraciones caracterizadas por una permeabilidad vascular indeseable o excesiva" incluyen el edema asociado con los tumores cerebrales, los ascites asociados con los cánceres, el síndrome de Meig, la inflamación pulmonar, el síndrome nefrítico, la efusión pericárdica (tal como la asociada con la pericarditis), y la efusión pleural.

La expresión "trauma a la red vascular" se refiere a traumas, tales como las lesiones, de los vasos sanguíneos o del corazón, incluyendo la red vascular de órganos, a los cuales está sometido el mamífero. Los ejemplos de tales traumas incluyen las heridas, las incisions, y las úlceras, por ejemplo, las úlceras diabéticas y las heridas o laceraciones de los vasos sanguíneos o del corazón. El trauma incluye las condiciones causadas por sucesos internos, así como aquéllas impuestas por un agente extrínseco tal como un patógeno, las cuales pueden mejorarse mediante la promoción de la angiogénesis. Se refiere también al tratamiento de heridas en los cuales se requiere la vascularización o reendotelización para la cicatrización.

El término "anticuerpo" se usa en ésta en el sentido más amplio y abarca específicamente los anticuerpos monoclonales (incluyendo los anticuerpos monoclonales de longitud completa), los anticuerpos policlonales, los anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos), y los fragmentos de anticuerpos. "Fragmentos de anticuerpos" comprende una porción de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la región unidora de antígeno o los dominios variables de la misma. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen los Fab, Fab', F(ab')_{2}, y los fragmentos Fv; los diacuerpos; los anticuerpos lineales; las moléculas de anticuerpo de cadena sencilla; y los anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

El término "anticuerpo monoclonal" tal como se usa en ésta se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que conforman la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que ocurren de forma natural que podrían estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un único sitio antigénico. Más aún, en contraste con las preparaciones de anticuerpo (policlonal) tradicional que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante sobre el antígeno. El modificados "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se ha obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe limitarse como que requiera la producción del anticuerpo mediante cualquier procedimiento concreto. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a usarse de acuerdo con la presente invención podrían prepararse mediante el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o podrían prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, la patente estadounidense nº 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" podrían aislarse también a partir de bibliotecas de anticuerpos en fagos usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales en ésta específicamente incluyen los anticuerpos (inmunoglobulinas) "quiméricos", en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a, u homóloga de, las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie concreta o pertenecientes a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es(son) idénticas a, u homólogas de, las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase particular de anticuerpo, así como de fragmentos de tales anticuerpos (patente estadounidense nº 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)).

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de ratón) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de la región hipervariable del receptor son remplazados con residuos de la región hipervariable procedentes de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como el ratón, rata, conejo o primate no humano, que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, los residuos de la región estructural (FR) de la inmunoglobulina humana son sustituidos por los correspondientes residuos no humanos. Más aún, los anticuerpos humanizados podrían comprender residuos que no se hallan en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente las prestaciones del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de un, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones hipervariables corresponden a las de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente comprenderá también al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, consultar Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992).

El término "región hipervariable" cuando se usa en ésta se refiere a los residuos aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión del antígeno. La región hipervariable comprende los residuos aminoácidos de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (es decir, los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera, y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos procedentes de un "bucle hipervariable" (es decir, los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)). La "Región Estructural" o residuos "FR" son aquellos residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable tal como se han definido en ésta.

Los fragmentos de anticuerpos "Fv de cadena sencilla" o "sFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido Fv comprende además un eslabón polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite a los sFv formar la estructura deseada para la unión de antígeno. Para una revisión de los sFv consultar Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Eds. Rosenburg y Moore, Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994).

El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión de antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Mediante el uso de un eslabón que es demasiado corto como para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión de antígeno. Los diacuerpos se describen más detalladamente en, por ejemplo, EP-404.097; WO-93/11.161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

La expresión "anticuerpos lineales" cuando se usa a lo largo de está solicitud, se refiere a los anticuerpos L-F(ab')_{2} descritos en la patente estadounidense nº 5.641.870, concedida el 24 de junio de 1997. En resumen, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) los cuales, cuando se combinan con dos cadenas ligeras, forman un par de regiones unidoras de antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.

Tal como se usa en ésta, el término "inmunoadhesina" designa moléculas similares a anticuerpos, las cuales combinan el "dominio unidor" de una proteína "adhesina" heteróloga (por ejemplo, una receptor Eph o ligando Eph) con una secuencia de aminoácidos del dominio constante de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de la secuencia de aminoácidos de adhesina con la especificidad de unión deseada, la cual es distinta del sitio de reconocimiento y unión (sitio de combinación del antígeno) de un anticuerpo (es decir, es "heteróloga") y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina.

Una "quimera anticuerpo-inmunoadhesina" comprende una molécula que combina al menos un dominio de unión de un anticuerpo (tal como se ha definido en ésta) con al menos una inmunoadhesina (tal como se ha definido en esta solicitud). Son ejemplos de quimeras anticuerpo-inmunoadhesina las quimeras biespecíficas CD4-IgG descritas en Berg et al., PNAS (USA), 88:4723-4727 (1991) y Chamow et al., J. Immunol., 153:4268 (1994).

Una molécula "aislada" es una que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos terapéuticos de la molécula, y podrían incluir los enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos y no proteicos.

El término "citotóxico" o "agente citostático" tal como se usa en ésta se refiere a una sustancia que reduce o previene la función, o crecimiento, de células y/o causa la destrucción de células. El término se pretende que incluya los isótopos radiactivos (por ejemplo, ^{131}I, ^{125}I, ^{90}Y y ^{186}Re), los agentes quimioterapéuticos, y las toxinas tales como las toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas.

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen la adriamicina, doxorubicina, epirubicina, 5-fluorouracilo, arabinósido de citosina ("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa, busulfan, citoxina, taxoides, por ejemplo el paclitaxel (TAXOL™, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), y doxetaxel (TAXOTERE™., Rôhne-Poulenc Rorer, Antony, France), taxotero, metotrexato, cisplatino, melfalan, vinblastina, bleomicina, etoposida, ifosfamida, mitomicina C, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, carboplatino, teniposido, daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomicinas, esperamicinas (ver la patente estadounidense nº 4.675.187), melfalan y otras mostazas de nitrógeno relacionas. También se incluyen en esta definición los agentes hormonales que actúan para regular o inhibir la acción de hormonas sobre los tumores, tales como el tamoxifeno y la onapristona.

El término "estrógeno" se refiere a cualquier sustancia (natural o sintética) que ejerce efectos biológicos característicos de hormonas estrogénicas (tales como el estradiol).

El término "prodroga" tal como se usa en esta solicitud se refiere a una forma precursora o derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos tóxica para las células tumorales en comparación con la droga progenitora, y que es capaz de ser enzimáticamente activada o convertida en la forma progenitora más activa. Ver, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615ª Reunión, Belfast (1986) y Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Ed. Borchardt et al., pp. 247-267, Humana Press (1985). Las prodrogas de esta invención incluyen, pero no se limitan a, prodrogas que contienen fosfato, prodrogas que contienen fosfato, prodrogas que contienen tiofosfato, prodrogas que contienen sulfato, prodrogas que contienen péptidos, prodrogas modificadas con D-aminoácidos, prodrogas glicosiladas, prodrogas que contienen beta-lactama, prodrogas que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o prodrogas que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, prodrogas de 5-fluorocitosina y otras prodrogas de 5-fluorouridina, las cuales pueden convertirse en la droga libre citotóxica o citostática más activa. Los ejemplos de drogas citotóxicas o citostáticas que pueden derivatizarse en una forma prodroga para su uso en esta invención incluyen, pero no se limitan a, aquellos agentes quimioterapéuticos descritos más arriba.

Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta por varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivos, la cual es útil para suministrar una droga (tal como los antagonistes descubiertos en ésta, y, opcionalmente, un agente quimioterapéutico) a un mamífero. Los componentes del liposoma están comúnmente dispuestos en una formación en bicapa, similar a la disposición lipídica de las membranas biológicas.

Los términos "oligodesoxinucleótido antisentido" y "oligo antisentido" se refieren a un polinucleótido que se hibrida con un área del ARNm o ADN del receptor Eph o ligando Eph y de ese modo impide o reduce la producción de polipéptido receptor Eph o ligando Eph in vitro o in vivo. Este término abarca los polinucleótidos "modificados", de los cuales se describen ejemplos en ésta.

II. Modos para llevar a cabo la invención

La presente invención se refiere al uso de agonistas y/o antagonistas del receptor EphB2. Más abajo se elaborarán procedimientos para preparar tales moléculas. Preferiblemente, el agonista o antagonista se une a, o interacciona con, un receptor Eph (en lugar de un ligando Eph) puesto que, tal como se muestra en el ejemplo siguiente, se anticipa que el receptor Eph tendrá un efecto más pronunciado sobre la angiogénesis debido al solapamiento y redundancia potenciales en la vía del ligando Eph. Más preferiblemente, el agonista o antagonista comprende, se une a, o interacciona con, el receptor EphB4, y lo más preferiblemente, con un receptor EphB4 humano.

Cuando la molécula es un agonista, se podría usar un receptor Eph o ligando Eph de secuencia nativa (o variantes o derivados de las mismas) que retienen una o más propiedades agonísticas del receptor o ligando nativos. En la patente estadounidense nº 5.635.177, concedida el 3 de junio de 1997, se descubren moléculas del receptor EphB4 (moléculas del receptor HpTK5) apropiadas, y en la patente estadounidense nº 5.624.899 se descubren moléculas Efrina-B2 (ligandos HTK), expresamente incorporadas en ésta por referencia. En una realización, se podría usar receptor o ligando Eph soluble. por ejemplo, una forma truncada del receptor o ligando que careciera de una región funcional de anclaje a membrana, a condición de que la molécula soluble retenga una o más propiedades agonísticas de la molécula nativa. Alternativamente, se podría administrar el gen que codifica el receptor Eph, ligando Eph, o ácido nucleico que codifica variantes agonísticas de los mismos mediante terapia génica. Más adelante, se descubren en ésta otras moléculas agonistas.

Con objeto de buscar moléculas agonísticas, se podría verificar la capacidad de una molécula candidata para estimular la fosforilación de la tirosina del receptor y/o ligando Eph utilizando cualquiera de los varios ensayos disponibles para determinar la fosforilación de tirosina. Por ejemplo, se podría exponer una célula que comprendiera el receptor o ligando (bien endógenamente o introducido de forma recombinante) al agonista candidato y determinar la fosforilación de la tirosina del receptor o ligando usando un anticuerpo anti-fosfotirosina (ver la patente estadounidense nº 5.635.177, concedida el 3 de junio de 1997, y la patente estadounidense nº 5.766.863, concedida el 16 de junio de 1998; la última patente describe el "Ensayo de Activación del Receptor Quinasa", el cual puede usarse convenientemente para identificar agonistas).

Alternativa, o adicionalmente, se podrían examinar otras propiedades agonísticas de un agonista candidato, por ejemplo, la capacidad para activar los sucesos de señalización cadena abajo, por ejemplo, la interacción del receptor Eph o ligando Eph con moléculas intracelulares.

Más aún, se podrían examinar por la capacidad de un agonista candidato para estimular la angiogénesis in vitro o in vivo. Por ejemplo, podría verificarse la actividad angiogénica en la córnea avascular de ojos de ratas hembras F344 (ver, por ejemplo, Streiter et al., Am. J. Pathol., 141:1279 (1992)).

En una realización alternativa, la molécula de interés es un antagonista del receptor Eph. Más abajo se describen varias moléculas antagonísticas. El antagonista preferido es un anticuerpo neutralizante que se une al receptor Eph y bloquea la unión de un ligando Eph al mismo. Para buscar una molécula que bloquea la interacción entre un ligando Eph y un receptor Eph, el ligando o receptor (o un dominio unidor de los mismos) podría inmovilizarse sobre una fase sólida, y podría analizarse, mediante técnicas estándares, tales como un ELISA de competición, la inhibición competitiva de la unión del receptor o ligando, respectivamente, por parte de un antagonista candidato. Alternativa, o adicionalmente, se podría buscar un antagonista que impida o reduzca la fosforilación de tirosina del receptor o ligando usando ensayos de fosforilación de tirosina tales como, por ejemplo, los descritos en la patente estadounidense nº 5.635.177, concedida el 3 de junio de 1997, o la patente estadounidense nº 5.766.863, concedida el 16 de junio de 1998. Otros ensayos incluyen aquéllos que verifican la capacidad de un antagonista candidato para prevenir o reducir los sucesos de señalización cadena abajo en un ensayo de angiogénesis (ver más arriba). Alternativa, o adicionalmente, podría verificarse la capacidad de un antagonista para erradicar o reducir el tamaño tumoral en ratones inmunodeprimidos (nude mice) inyectados con células tumorales (ver, por ejemplo, Presta et al., Cancer Research, 57:4593-4599 (1997)).

A. Anticuerpos

La presente invención contempla el uso de anticuerpos como antagonistas (anticuerpos "neutralizantes" o "bloqueadores") o agonistas ("anticuerpos agonistas"). Las técnicas para generar anticuerpos se describirán aquí. Las propiedades antagonísticas o agonísticas pueden examinarse tal como se ha descrito en la sección previa.

(i) Preparación del antígeno

El antígeno a usarse para la producción de anticuerpos podría ser, por ejemplo, receptor Eph intacto aislado, o ligando Eph aislado, o uno o más fragmentos de los mismos. Alternativamente, podrían usarse células expresando el receptor Eph o ligando Eph nativos o recombinantes como inmunogenes para generar anticuerpos. EL antígeno podría comprender opcionalmente de forma adicional una molécula heteróloga, por ejemplo, un péptido inmunogénico. Otras formas de receptor Eph o ligando Eph útiles para generar anticuerpos serán evidentes para los especialistas en la técnica.

(ii) Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos policlonales se generan preferiblemente en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Podría ser útil conjugar el antígeno relevante a una proteína que sea inmunogénica en las especies a inmunizar, por ejemplo, la hemocianina de lapa con forma de ojo de herradura, la albúmina de suero, la tiroglobulina bovina, o el inhibidor de tripsina de soja, usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, el éster maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl_{2}, o R1N=C=NR, en donde R y R1 son grupos alquilos diferentes.

Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos, o derivados, combinando, por ejemplo, 100 \mug o 5 \mug de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes del adyuvante completo de Freund, e inyectando la solución de forma intradérmica en múltiples sitios. Un mes más tarde, los animales se impulsan con de 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund, mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a 14 días más tarde, se sangran los animales y se ensaya el título de anticuerpo en el suero. Los animales se impulsan hasta que el título se estabiliza. Preferiblemente, el animal es impulsado con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado con una proteína diferente y/o a través de un reactivo de entrecruzamiento diferente. Los conjugados pueden prepararse también en cultivos de células recombinantes como fusiones de proteínas. También, los agentes agregantes tales como el alum se usan convenientemente para potenciar la respuesta inmune.

(iii) Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales podrían prepararse usando el procedimiento del hibridoma descrito en primer lugar por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o podrían prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante (patente estadounidense nº 4.816.567).

En el procedimiento del hibridoma, un ratón, u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster o un mono macaco, se inmuniza como se ha descrito en ésta más arriba, para elicitar linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos podrían inmunizarse in vitro. Los linfocitos se fusionan a continuación con células de mieloma usando un agente de fusión apropiado, tal como el polietilenglicol, para formar una célula hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles y Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).

Las células hibridoma preparadas de este modo se siembran y hacen crecer en un medio de cultivo apropiado que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma progenitoras no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma progenitoras carecen del enzima hipoxantina guanina fosforibosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT), sustancias que impiden el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Las células de mieloma preferidas son aquéllas que se fusionan eficientemente, soportan una producción estable con nivel elevado, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre éstas, las líneas celulares de mieloma preferidas son las líneas de mieloma de ratón, tales como las derivadas de los tumores de ratón MOP-21 y M.C.-11, disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EE.UU., y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles del American Type Culture Collection, Rockville, Md., EE.UU. También se han descrito células de mieloma humanas y de heteromieloma de ratón-humanas, para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques y Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).

El medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma se ensaya por la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos mediante células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo inmunosorbente unido a enzima (ELISA).

La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse mediante el análisis Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Una vez se han identificado células de hibridoma que producen anticuerpos con la especificidad, afinidad y/o actividad deseada, los clones podrían subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y cultivarse mediante procedimientos estándares (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles y Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo apropiados para este propósito incluyen, por ejemplo, el D-MEM o el medio RPMI-1640. Además, las células de hibridoma podrían cultivarse in vivo en tumores ascíticos en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan convenientemente del medio de cultivo, fluido ascítico, o suero, mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas, como, por ejemplo, la cromatografía con proteína A-Sepharose, hidroxilapatito, la electroforesis en gel, la diálisis, o la cromatografía de afinidad.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven como fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN podría colocarse en vectores de expresión, los cuales se transfectan a continuación en células huéspedes, tales como células de E. coli, células COS de simio, células ováricas de hámster chino (CHO), o células de mieloma que por otra parte no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huéspedes recombinantes.

(iv) Anticuerpos humanizados

Un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoácidos introducidos en él y procedentes de una fuente que no es humana. Estos residuos aminoácidos no humanos a menudo se denominan residuos "importados", y típicamente se toman de un dominio variable "importado". La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo con CDR o secuencias de CDR de roedor las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente estadounidense nº 4.816.567) en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la correspondiente secuencia procedente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de la región hipervariable y, posiblemente, algunos residuos FR se sustituyen con residuos procedentes de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

La elección de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, a usarse en la preparación de anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el procedimiento denominado de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor es examina respecto la biblioteca entera de secuencias de dominios variables humanos conocidos. La secuencia humana que es la más cercana a la del roedor se acepta a continuación como la FR humana para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)). Otro procedimiento usa una FR concreta derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo concreto de cadenas ligeras y pesadas. La misma FR podría usarse para varios anticuerpos humanizados diferentes.(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immnol., 151:2623
(1993)).

Es adicionalmente importante que los anticuerpos se humanicen con retención de la afinidad elevada por el antígeno y de otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, de acuerdo con un procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de la secuencia progenitora y de varios productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de secuencias progenitoras y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina están comúnmente disponibles y son familiares a aquéllos especialistas en la técnica. Hay programas de ordenador que ilustran y muestran probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas muestras permite el análisis del probable papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina para unir su antígeno. De esta forma, los residuos FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias receptora e importadora de forma que se consiga la característica del anticuerpo deseada, tal como una afinidad incrementada por los antígenos diana. En general, los residuos de la región hipervariable están directa y de la forma más sustancial implicados en influenciar la unión de antígeno.

(v) Anticuerpos humanos

Como una alternativa a la humanización, pueden generarse anticuerpos humanos. Por ejemplo, es ahora posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, a partir de su inmunización, de producir un completo repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulinas. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homocigótica del gen de la región de unión de la cadena pesada (JH) de anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes de la línea germinal resulta en la completa inhibición de la producción endógena de anticuerpos. La transferencia del conjunto de genes de inmunoglobulina una línea germinal humana en tales ratones mutantes de la línea germinal resulta en la producción de anticuerpos humanos a partir del desafío con antígeno. Ver, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993);

y las patentes estadounidenses nº 5.591.669, 5.589.369 y 5.545.807. Los anticuerpos humanos pueden derivarse también a partir de bibliotecas de exhibición en fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); y las patentes estadounidenses nº 5.565.332 y 5.573.905). Los anticuerpos humanos pueden generarse también mediante células B activadas in vitro (ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses nº 5.567.610 y 5.229.275).

(vi) Fragmentos de anticuerpos

Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaban vía digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical y Biophysical Methods, 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, ahora, estos fragmentos pueden producirse directamente mediante células huésped recombinantes. Por ejemplo, pueden recuperarse fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')_{2} (Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992)). En otra realización, el F(ab')_{2} se forma usando la cremallera de leucina GCN4 para promover el ensamblaje de la molécula de F(ab')_{2}. De acuerdo con otra estrategia, los fragmentos Fv, Fab o F(ab')_{2} pueden aislarse directamente a partir del cultivo de células huéspedes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes a los profesionales cualificados.

(vii) Anticuerpos multiespecíficos

En algunas realizaciones, podría ser deseable generar anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos) que tengan especificidades de unión por al menos dos epítopos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos de ejemplo podrían unirse a dos epítopos diferentes sobre el antígeno diana. Alternativamente, un brazo anti-ligando Eph o anti-receptor Eph podría combinarse con un brazo que se une a una molécula disparadora sobre un leucocito, tal como una molécula del receptor de la célula T (por ejemplo, CD2 o CD3), o receptores Fc IgG (Fc\gammaR), tales como Fc\gammaRI (CD64), Fc\gammaRII (CD32) y Fc\gammaRIII (CD16), para concentrar los mecanismos de defensa celular contra el receptor Eph o la célula que expresa el ligando Eph. Los anticuerpos biespecíficos podrían usarse también para localizar agentes citotóxicos contra células que expresan el receptor Eph o ligando Eph. Estos anticuerpos poseen brazo unidor de receptor Eph o ligando Eph, y un brazo que une el agente citotóxico (por ejemplo, la saporina, el alcaloide vinca, la cadena A de ricina, el metotrexato, o hapteno de isótopo radiactivo).

En otra realización, el anticuerpo biespecífico tiene un brazo que une un ligando Eph y un brazo que une un receptor Eph (por ejemplo, el receptor afín al cual se une el ligando endógeno). También se contemplan los anticuerpos biespecíficos que son capaces de entrecruzar diferentes ligandos Eph o diferentes receptores Eph. Tales anticuerpos biespecíficos podrían emplearse como agonistas o antagonistas, dependiendo de sus actividades biológicas.

Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')_{2}).

De acuerdo con una estrategia para preparar preferiblemente anticuerpos biespecíficos de longitud completa, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo puede diseñarse para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. La interfaz preferida comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos procedentes de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo se sustituyen con cadenas laterales mayores (por ejemplo, tirosina o triptófano). En la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo se crean "cavidades" idénticas o de tamaño similar al de la(s) cadena(s) lateral(es) grande(s) mediante la sustitución de cadenas laterales grandes de aminoácidos con unas más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento de los heterodímeros respecto otros productos finales no deseados, tales como los homodímeros. Ver la patente estadounidense nº 5.731.168, publicada el 24 de marzo de 1998.

Los anticuerpos biespecíficos incluyen los anticuerpos entrecruzados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina, el otro a biotina. Los anticuerpos heteroconjugados podrían prepararse usando cualquier procedimiento de entrecruzado apropiado. Los agentes de entrecruzado son bien conocidos en la técnica, y se descubren en la patente estadounidense nº 4.676.980, junto con un cierto número de técnicas de entrecruzado.

Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo han sido descritas también en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse usando enlaces químicos. Ver, por ejemplo, Brennan et al., Science, 229:81 (1985) y Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992).

También se han descrito varias técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpo biespecífico directamente a partir del cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucinas procedentes de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión de genes. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región gozne para formar monómeros y a continuación se oxidaron de nuevo para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este procedimiento también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología del "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) mediante un eslabón que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. En consecuencia, los dominios VH y VL de un fragmento están forzados a emparejarse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando de ese modo dos sitios de unión a antígeno. También se ha descrito otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico mediante el uso de dímeros de Fv de cadena sencilla (scFv). Ver Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994). Alternativamente, el anticuerpo biespecífico podría ser un "anticuerpo lineal" producido, por ejemplo, tal como se describe en la patente estadounidense nº 5.641.870, concedida el 24 de junio de 1997.

Los anticuerpos con más de dos valencias se contemplan. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol., 147:60 (1991).

(viii) Otras modificaciones

Se contemplan otras modificaciones de los anticuerpos. Por ejemplo, podría ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, para mejorar la efectividad del anticuerpo para tratar, por ejemplo, el cáncer. Por ejemplo, podrían introducirse residuos cisteína en la región Fc, permitiendo de ese modo la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de este modo podría tener una capacidad de internalización mejorada y/o una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), o una capacidad de matar células mediada por complemento, incrementadas. Ver Caron et al., J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol., 148:2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con actividad anti-tumor mejorada también podrían prepararse usando entrecruzadores heterobifuncionales tal como se describen en Wolff et al., Cancer Research, 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, puede diseñarse un anticuerpo que tiene regiones Fc duales y de ese modo podría tener capacidades potenciadas de lisis por complemento y ADCC. Ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989).

En ciertas realizaciones de la invención, podría ser deseable usar un fragmento de anticuerpo, en vez de un anticuerpo intacto, para, por ejemplo, incrementar la penetración en el tumor. En este caso, podría ser deseable modificar el fragmento de anticuerpo con objeto de incrementar su vida media en suero. Esto podría conseguirse, por ejemplo, mediante la incorporación de un epítopo de unión del receptor salvaje en el fragmento de anticuerpo (por ejemplo, mediante mutación de la región apropiada en el fragmento de anticuerpo, o incorporando el epítopo en una etiqueta peptídica que se fusiona a continuación al fragmento de anticuerpo en uno de los extremos o en medio, por ejemplo, mediante síntesis de ADN o peptídica). Ver la patente estadounidense nº 5.739.277.

B. Derivados o variantes del polipéptido

Otros antagonistas o agonistas útiles incluyen las variantes de secuencia y/o derivados del receptor Eph o ligando Eph nativos que se unen al receptor o ligando endógenos e inhibien competitivamente la interacción entre el ligando nativo y el receptor (antagonistas) o activan el receptor o ligando (agonistas).

Por ejemplo, tales antagonistas incluyen fragmentos y variantes de la secuencia de aminoácidos que comprenden un dominio unidor de receptor de un ligando Eph, o un dominio unidor de ligando de un receptor Eph, pero que carecen de un dominio que confiere la actividad biológica, o que son defectuosos de otra forma para activar los receptores o ligandos Eph celulares.

Los dominios unidores de receptor en el ligando Eph, y los dominios unidores de ligando en el receptor Eph, se determinan mediante procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo los estudios de rayos X, los análisis mutacionales, y los estudios de unión al anticuerpo. Las estrategias mutacionales incluyen las técnicas de mutagénesis de saturación aleatoria acoplada con la selección de mutantes de escape, y la mutagénesis por inserción. Otra estrategia apropiada para identificar los dominios unidores se conoce como mutagénesis de barrido con alanina. Cunningham, et al., Science, 244:1081-1985 (1989). Este procedimiento implica la identificación de regiones que contienen cadenas laterales de aminoácidos cargadas. Los residuos cargados en cada región identificada (es decir, Arg, Asp, His, Lys, y Glu) se remplazan (una región por molécula mutante) con Ala y se ensaya la unión de las variantes obtenidas para verificar la importancia de la región concreta en la unión. Un potente procedimiento adicional para la localización de dominios unidores es a través del uso de anticuerpos neutralizantes. Usualmente, se usa una combinación de estos y similares procedimientos para localizar los dominios implicados en la unión del receptor o ligando.

Las variantes por sustitución son aquellas que tienen al menos un residuo aminoácido en una secuencia nativa suprimido y un aminoácido diferente insertado en su lugar en la misma posición. Las sustituciones podrían ser únicas, en donde sólo se ha sustituido un aminoácido en la molécula, o podrían ser múltiples, en donde se han sustituido dos o más aminoácidos en la misma molécula.

Las variantes por inserción son aquellas con uno o más aminoácidos insertados inmediatamente adyacentes a un aminoácido en una posición particular en una secuencia nativa. Inmediatamente adyacente a un aminoácido significa conectado, bien al grupo funcional \alpha-carboxilo o \alpha-amino del aminoácido.

Las variantes por supresión son aquéllas con uno o más residuos aminoácidos en una secuencia nativa suprimidos. Ordinariamente, las variantes por supresión tendrán uno o dos residuos aminoácidos suprimidos en una región particular de la molécula. Una variante de supresión preferida es un receptor Eph o ligando Eph soluble, fusionado opcionalmente a una molécula heteróloga, tal como una región de inmunoglobulina (ver más abajo sección sobre "Inmunoadhesinas") u otra molécula, por ejemplo, polietilenglicol.

Los fragmentos y variantes de la secuencia de aminoácidos se preparan fácilmente mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como mediante mutagénesis dirigida a un sitio del ADN que codifica el factor nativo. El ADN mutado se inserta en un vector de expresión apropiado, y a continuación se transfectan las células huéspedes con el vector recombinante. Las células huéspedes recombinantes se cultivan en medio de cultivo apropiado, y el fragmento o variante de la secuencia de aminoácidos deseados y expresados en las células huésped se recuperan del cultivo de células recombinantes mediante procedimientos cromatográficos u otros procedimientos de purificación.

Alternativamente, los fragmentos y variantes de aminoácido se preparan in vitro, por ejemplo, mediante la proteolisis del receptor Eph o ligando Eph nativos, o mediante síntesis usando procedimientos estándares de síntesis de péptidos en fase sólida, tal como se describen en Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149 (1963), aunque podrían usarse otras síntesis químicas en fase sólida equivalentes y conocidas en la técnica. La síntesis en fase sólida se inicia a partir del extremo C-terminal del péptido acoplando un aminoácido \alpha-protegido a una resina apropiada. Los aminoácidos se acoplan a la cadena peptídica usando técnicas bien conocidas en la técnica para la formación de enlaces peptídicos.

C. Inmunoadhesinas

Un derivado preferido del receptor Eph o ligando Eph es una inmunoadhesina. La inmunoadhesina podría ser un agonista o antagonista. El antagonista de inmunoadhesina podría comprender una porción del receptor Eph que une el ligando Eph (o viceversa) y, por tanto, sirve para inhibir competitivamente la interacción entre el receptor y el ligando endógenos. Cuando la oligomerización o transfosforilación están implicadas en la activación del receptor o ligando, una inmunoadhesina comprendiendo dos o más dominios unidores de receptor o ligando en la configuración apropiada podría actuar, por ejemplo, como un agonista del receptor o ligando.

El diseño más sencillo y directo de inmunoadhesina combina el(los) dominio(s) unidor(es) de la adhesina (por ejemplo, el dominio extracelular (ECD) de un receptor Eph o un ligando Eph) con las regiones gozne y Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina. Ordinariamente, cuando se preparan las inmunoadhesinas de las presente invención, el ácido nucleico que codifica el dominio unidor de la adhesina se fusionará C-terminalmente al ácido nucleico que codifica el extremo N-terminal de un secuencia del dominio constante de inmunoglobulina, no obstante, son también posibles las fusiones N-terminales.

Típicamente, en tales fusiones el polipéptido quimérico retendrá al menos los dominios gozne, CH2 y CH3 funcionalmente activos de la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina. También se hacen fusiones al extremo C-terminal de la porción Fc de un dominio constante, o de forma inmediatamente N-terminal respecto el CH1 de la cadena pesada o de la región correspondiente en la cadena ligera. El sitio preciso en el cual se realiza la fusión no es crítico; son bien conocidos sitios particulares, y podrían seleccionarse con objeto de optimizar la actividad biológica, secreción o características de unión de la inmunoadhesina.

En una realización preferida, la secuencia de adhesina se fusiona al extremo N-terminal del dominio Fc de la inmunoglobulina G1 (IgG1). Es posible fusionar la región constante de la cadena pesada a la secuencia de adhesina. Sin embargo, más preferiblemente, se usa en la fusión una secuencia que empieza en la región gozne, justo cadena del sitio de corte con papaína que define químicamente el Fc de IgG (es decir, el residuo 216, tomando como 114 el primer residuo de la región constante de la cadena pesada), o sitios análogos de otras inmunoglobulinas. En una realización particularmente preferida, la secuencia de aminoácidos de adhesina se fusiona a (a) la región gozne y a CH2 y CH3, o (b) los dominios CH1, gozne, CH2 y CH3 de una cadena pesada de IgG.

Para las inmunoadhesinas biespecíficas, las inmunoadhesinas se ensamblan como multímeros, y particularmente como heterodímeros o heterotetrámeros. Generalmente, estas inmunoglobulinas ensambladas tendrán unidades estructurales conocidas. Una unidad estructural básica de cuatro cadenas es la forma en la que existen IgG, IgD, e IgE. En las inmunoglobulinas de peso molecular más elevado se repite una unidad de cuatro cadenas; IgM existe generalmente como un pentámero de cuatro unidades básicas mantenidas juntas mediante enlaces disulfuro. La globulina IgA, y ocasionalmente la globulina IgG, podrían existir también en forma multimérica en el suero. En el caso del multímero, cada una de las cuatro unidades podría ser la misma o diferente.

Más abajo se ilustran esquemáticamente varias inmunoadhesinas ensambladas de ejemplo dentro del ámbito de ésta:

(a): AC_{L}-AC_{L};

(b): AC_{H}-(AC_{H}, AC_{L}-AC_{H}, AC_{L}-V_{H}C_{H}, o V_{L}C_{L}-AC_{H});

(c): AC_{L}-AC_{H}-(AC_{L}-AC_{H}, AC_{L}-V_{H}C_{H}, V_{L}C_{L}-AC_{H}, o V_{L}C_{L}-V_{H}C_{H});

(d): AC_{L}-V_{H}C_{H}-(AC_{H}, or AC_{L}-V_{H}C_{H}, o V_{L}C_{L}-AC_{H});

(e): V_{L}C_{L}-AC_{H}-(AC_{L}-V_{H}C_{H}, or V_{L}C_{L}-AC_{H}); y

(f): (A-Y)_{n}-(V_{L}C_{L}-V_{H}C_{H})_{2},

en donde cada A representa secuencias de aminoácidos de adhesina idénticas o diferentes;

: V_{L} es un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina;

: V_{H} es un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina;

: C_{L} es un dominio constante de cadena ligera de inmunoglobulina;

: C_{H} es un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina;

: n es un entero mayor de 1;

: Y designa el residuo de un agente entrecruzador covalente.

Para mayor brevedad, las estructuras anteriores sólo muestran características claves; no indican el dominio unidor (J) u otros dominios de las inmunoglobulinas, ni se muestran enlaces disulfuro. Sin embargo, cuando tales dominios son requeridos para la actividad unidora, deberían ser forzados a estar presentes en las ubicaciones ordinarias que ocupan en las moléculas de inmunoglobulina.

Alternativamente, las secuencias de adhesina pueden insertarse entre las secuencias de la cadena pesada y cadena ligera de la inmunoglobulina, de tal forma que se obtenga una inmunoglobulina que comprenda una cadena pesada quimérica. En esta realización, las secuencias de adhesina se fusionan al extremo 3' de una cadena pesada de inmunoglobulina en cada brazo de una inmunoglobulina, bien entre el gozne y el dominio C_{H2}, o entre los dominios C_{H2} y C_{H3}. Se han descrito construcciones similares por Hoogenboom, et al., Mol. Immunol., 28:1027-1037 (1991).

Aunque la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina no es necesaria en las inmunoadhesinas de la presente invención, una cadena ligera de inmunoglobulina podría estar presente, bien unida covalentmente a un polipéptido de fusión de cadena pesada de inmunoglobulina-adhesina, o directamente fusionada a la adhesina. En el primer caso, típicamente se coexpresa un ADN que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina con el ADN que codifica la proteína de fusión adhesina-cadena pesada de inmunoglobulina. A partir de su secreción, la cadena pesada híbrida y la cadena ligera se asociarán covalentemente para proporcionar una estructura similar a inmunoglobulina que comprende dos pares cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina unidos por disulfuro. Los procedimientos apropiados para la preparación de tales estructuras se descubren, por ejemplo, en la patente estadounidensenº 4.816.567, concedida el 28 de marzo de 1989.

Las inmunoadhesinas se construyen de la forma más conveniente fusionando la secuencia de ADNc que codifica la porción adhesina en pauta de lectura con una secuencia de cADN de la inmunoglobulina. Sin embargo, también puede usarse la fusión a fragmentos de inmunoglobulina genómicos (ver, or ejemplo, Aruffo et al., Cell, 61:1303-1313 (1990); y Stamenkovic et al., Cell, 66:1133-1144 (1991)). El último tipo de fusión requiere la presencia de secuencias reguladora de Ig para la expresión. Los ADNc que codifican las regiones constantes de la cadena pesada de IgG pueden aislarse en base a secuencias publicadas procedentes de bibliotecas de ADNc derivadas del bazo o de linfocitos de la sangre periférica, mediante técnicas de hibridación o mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los ADNc que codifican las partes "adhesina" e inmunoglobulina de la inmunoadhesina se insertan en tándem en un plásmido vector que dirige la expresión eficiente en las células huésped escogidas.

D. Otras moléculas agonistas o antagonistas

La presente invención contempla antagonistas o agonistas adicionales.

Por ejemplo, el antagonista o agonista podrían ser una molécula pequeña sintética. Por ejemplo, la molécula pequeña podría imitar el sitio de unión del receptor Eph o ligando Eph, y de ese modo actuar como un agonista o antagonista. Alternativamente, la molécula pequeña podría interaccionar con el dominio quinasa de tirosina del receptor o ligando, y de ese modo activar o impedir la activación del dominio quinasa de tirosina. Ver, por ejemplo, la patente estadounidense nº 5.795.910.

El antagonista o agonista podría ser también un péptido generado, por ejemplo, mediante diseño racional o mediante exhibición en fago (WO98/35036, publicada el 13 de agosto de 1998). Por tanto, la molécula de elección podría ser una "imitación del CDR" o un análogo de anticuerpo diseñado, por ejemplo, en base a los CDR de un anticuerpo.

Alternativamente, el agonista o antagonista podrían interaccionar con el promotor u otra región reguladora de un gen Eph, siguiendo, por ejemplo, esencialmente la estrategia en WO95/28485, publicada el 26 de octubre de 1995.

Otro agonista de interés es una molécula tal como un dímero que comprende dos o más sitios de unión de un receptor Eph o ligando Eph. Tales moléculas podrían formarse fusionando el dominio de unión a una región de dimerización, la cual promueve la interacción estable de los dominios del dímero. Tales moléculas podrían ser agonistas útiles para promover la "comunicación cruzada del receptor" o la transfosforilación de receptores Eph o ligando Eph.

Otro tipo de antagonista es un ácido nucleico antisentido. La inhibición antisentido de la expresión de un gen puede ocurrir a múltiples niveles. No obstante, la estrategia preferida es una que implica interferir con la traducción del ARNm en proteína. Para conseguir esto, se podría usar un oligodesoxinucleótido (oligo) complementario del ARNm del receptor Eph o ligando Eph. Este oligo antisentido se une mediante emparejamiento de bases complementarias Watson-Crick al mARN con sentido nativo. Sin embargo, también se contempla el ARN antisentido derivado de plásmido (es decir, en donde el ADN antisentido se proporciona en un plásmido). Mercola y Cohen, Cancer Gene Therapy, 2(l):47-59 (1995). De acuerdo con otra realización, la denominada "estrategia antigén", la molécula antisentido es una que se une para formar una triple hélice o tríplex con el ADN del receptor Eph o ligando Eph a través de puentes de hidrógeno Hoogsteen (o anti-Hoogsteen) de la tercera base en la molécula antisentido con el par ya formado. Mercola y Cohen, ver más arriba. Mientras que los oligos antisentido pueden ser dirigidos a cualquier lugar a lo largo del transcrito de ARNm, la secuencia diana preferida es el extremo 5' del mismo, abarcando el codón de inicio. Los oligos de interés normalmente comprenden al menos 15-17 bases. Para identificar la secuencia antisentido más activa, podría realizarse el análisis de supresión.

Los oligos antisentido pueden sintetizarse fácilmente mediante procedimientos automatizados. Ver la patente estadounidense nº 5.489.677, concedida el 6 de febrero de 1996. Normalmente, el oligo antisentido destinado a un uso in vivo estará modificado para hacerlo menos susceptible a la degradación por nucleasa y/o para mejorar la eficiencia con al que es captado por la célula. Se han desarrollado varias modificaciones del esqueleto para contrarrestar la degradación por la nucleasa. Una modificación de ejemplo resulta en un oligo "metil-fosfonato" (MO). De acuerdo con esta estrategia, uno de los átomos de oxígeno no enlazante en el enlace internucleótido es sustituido por un grupo metilo que tiene el efecto neto de eliminar la carga negativa del oligo. Tonkinson et al., Cancer Investigation, 14(1):54-65 (1996). Otra modificación descrita en Tonkinson et al. para reducir la degradación por nuclease es la modificación del fosforotioato (PS) que implica remplazar uno de los oxígenos no enlazantes del fósforo con un azufre. Otras formas de modificar el oligo básico se revisan en Cohen, J. Adv. Pharmacol., 25:319-339 (1993). Por ejemplo, se ha descrito un nuevo análogo en donde la totalidad del esqueleto desoxiribosa-fosfato es remplazado por un esqueleto parecido a un péptido. Ver Mercola y Cohen, más arriba. Para mejorar la captación celular, los oligos antisentido pueden encapsularse en liposomas, formularse en complejos con lípidos catiónicos como el DOTMA, acoplarse a polilisina o lipofectina, y/o unirse covalentemente a un grupo colesteril. Ver Tonkinson et al., más arriba.

Aparte de los ácidos nucleicos antisentido, tal como se ha mencionado más arriba, la presente invención también contempla la administración de ácido nucleico que codifique cualquier agonista o antagonista tal como se ha descrito en ésta. Por ejemplo, la presente invención contempla los "anticuerpos intracelulares" introducidos dentro de la célula mediante terapia génica.

Hay dos estrategias principales para conseguir el ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) dentro de las células del paciente; in vivo y ex vivo. Para el suministro in vivo el ácido nucleico se inyecta directamente en el paciente, usualmente en el sitio en donde se requiere el agonista o antagonista. Para el tratamiento ex vivo, se extraen las células del paciente, el ácido nucleico se introduce en estas células aisladas, bien directa o, por ejemplo, encapsulado dentro de membranas porosas que se implantan en el paciente (ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses nº 4.892.538 y 5.283.187). Hay una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere en células cultivadas in vitro, o in vivo en las células del huésped destinatario. Las técnicas apropiadas para la transferencia de ácido nucleico dentro de células de mamífero in vitro incluyen el uso de liposomas, la electroporación, la microinyección, la fusión de células, el DEAE-dextrano, el procedimiento de la precipitation con fosfato cálcico, etc. Un vector comúnmente usado para el suministro ex vivo del gen es un retrovirus.

Las técnicas actualmente preferidas para la transferencia in vivo de ácido nucleico incluyen la transfección con vectores virales (tales como adenovirus, el virus Herpes simplex I, o los virus adeno-asociados) y los sistemas basados en lípidos (son lípidos útiles para la transferencia de los genes mediada por lípidos el DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo). En algunas situaciones es deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que apunte a las células diana, tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de la superficie celular o para la célula diana, un ligando para un receptor sobre la célula diana, etc. Cuando se emplean liposomas, las proteínas que se unen a una proteína de membrana de la superficie celular asociada con la endocitosis podrían usarse para apuntar y/o facilitar la captación, por ejemplo, las proteínas de la cápside o fragmentos de las mismas trópicos para un tipo de célula determinado, anticuerpos contra proteínas que experimentan internalización al ciclarse, y proteínas que apuntan a localizaciones intracelulares y mejoran la vida media intracelular. La técnica de la endocitosis mediada por receptor es descrita, por ejemplo, por Wu et al., J. Biol. Chem., 262:4429-4432 (1987); y Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3410-3414 (1990). Para una revisión de los protocolos de marcaje de genes y terapia génica actualmente conocidos consultar Anderson et al., Science, 256:808-813 (1992). Consultar también WO 93/25673 y las referencias citadas en la misma.

E. Moléculas conjugadas

Los procedimientos que contienen "conjugados" de los antagonistas o agonistas descritos más arriba y de las moléculas heterólogas también se contemplan. El antagonista o agonista y la(s) molécula(s) heteróloga(s) están unidos mediante una variedad de formas diferentes, incluyendo el entrecruzamiento químico, la producción de proteínas de fusión, etc.

Un conjugado preferido en ésta comprende un agonista o antagonista conjugado con una molécula que incrementa su vida media en suero. Por ejemplo, se podría unir el agonista o antagonista a una cualquiera de una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, o polioxialquilenos, en la forma establecida en las patentes estadounidenses nº 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 or 4.179.337.

Otro conjugado preferido comprende un antagonista conjugado con un agente citotóxico o citostático. Los ejemplos de agentes citotóxicos o citostáticos útiles para la generación de tales construcciones incluyen, sin limitación, los agentes quimioterapéuticos, las toxinas (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o isótopos radiactivos (es decir, un radioconjugado).

Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de tales conjugados han sido descritos más arriba. Las toxinas activas enzimáticamente y los fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen la cadena A de la difteria, los fragmentos activos no unidores de la toxina de la difteria, la cadena de la endotoxina A (procedente de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de ricina, la cadena A de abrina, la cadena A de modeccina, la alpha-sarcina, las proteínas de Aleurites fordii, las proteínas de diantina, las proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), el inhibidor de Momordica charantia , la curcina, la crotina, el inhibidor de la Saponaria officinalis, la gelonina, la mitogellina, la restrictocina, la fenomicina, la enomicina, y la tricotecenes. Una variedad de radionúcleos están disponibles para la producción de antagonistas radioconjugados. Los ejemplos incluyen el ^{212}Bi, ^{131}I, ^{131}In, ^{90}Y y ^{186}Re.

Los conjugados del antagonista y del agente citotóxico o citostático se preparan usando una variedad de agentes bifuncionales acopladores de proteínas, tales como el N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como el dimetil-adipimidato HCl), ésteres activos (tales como el disuccinimidilsuberato), aldehídos (tales como el glutareldehído), compuestos bis-azido (tales como el bis (p-azidobenzoil)hexanediamina), derivados bis-diazonio (tales como el bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenediamina), diisocianatos (tales como el toliene-2,6-diisocianato), y compuestos bis-activos de fluor (tales como el 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse como se describe en Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen-triaminopentaacetico (MX-DTPA) marcado con carbono-14 es un agente quelante ilustrativo para la conjugación de radionucleótido al anticuerpo. Ver WO94/11026. Alternativamente, pueden prepararse proteínas de fusión que comprenden un polipéptido antagonista y un polipéptido citotóxico o citostático. Tales moléculas pueden generarse también mediante, por ejemplo, síntesis peptídica.

En otra realización, el antagonista podría conjugarse a un "receptor" (tal como la estreptoavidina) para su utilización en el pre-apuntamiento de tumores, en donde el conjugado antagonista-receptor se administra al paciente, seguido por la retirada del conjugado no unido de la circulación usando un agente de aclaramiento, y a continuación la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que está conjugado a un agente citotóxico o citostático (por ejemplo, un radionúcleo).

Los antagonistas de la presente invención podrían usarse también en ADEPT conjugando el antagonista a un enzima activador de pro-droga que convierte una pro-droga (por ejemplo, un agente quimioterapéutico peptidilo, ver WO81/01145) en un fármaco anticáncer activo. Consultar, por ejemplo, WO 88/07378 y la patente estadounidense nº 4.975.278.

El componente enzimático del conjugado de antagonista útil para el ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre una prodroga de tal forma que la convierte en us más activa, forma citotóxica.

Los enzimas que son útiles en el procedimiento de esta invención incluyen, pero no se limitan a, la fosfatasa alcalina, útil para convertir prodrogas que contienen fosfato en drogas libres; la arilsulfatasa, útil para convertir prodrogas que contienen sulfato en drogas libres; la desaminasa de citosina, útil para convertir la 5-fluorocitosina no tóxina en la droga anticáncer 5-fluorulacilo; las proteasas, tales como la proteasa de Serratia, la termolisina, la subtilisina, las carboxipeptidasas y catepsinas (tales como la catepsinas B y L), que son útiles para convertir las prodrogas que contienen péptidos en drogas libres; las D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir prodrogas que contienen sustituyentes D-aminoácidos; los enzimas cortadores de carbohidratos, tales como la beta-galactosidasa y la neuraminidasa, útiles para convertir prodrogas glicosiladas en drogas libres; y la penicilina, tal como la amidasa de penicilina V o la amidasa de penicilina G, útiles para convertir las drogas derivadatizadas en sus nitrógenos de amina respectivamente con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo en drogas libres. Alternativamente, pueden usarse anticuerpos con actividad enzimática, conocidos también en la técnica como "abzimas", para convertir las prodrogas de la invención en drogas activas libres (consultar, por ejemplo, Massey, Nature, 328:457-458 (1987)). Los conjugados anticuerpo-enzima pueden prepararse tal como se describe en ésta para suministrar el abzima a la población de células tumorales.

Los enzimas de esta invención pueden unirse covalentemente al antagonista mediante técnicas bien conocidas en la técnica, tales como el uso de los reactivos entrecruzadores heterobifuncionales discutidos más arriba. Alternativamente, las proteínas de fusión que comprenden al menos el dominio unidor del receptor Eph o ligando Eph de un antagonista de la invención unido a al menos una porción funcionalmente activa de un enzima de la invención, pueden construirse usando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Neuberger et al., Nature, 312:604-608 (1984)).

F. Composiciones farmacéuticas

Las formulaciones terapéuticas del agonista o antagonista se preparan para su almacenamiento mezclando el agonista o antagonista, que tienen el grado de pureza deseado, con portadores fisiológicamente aceptables, excipientes o estabilizadores opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Ed. Osol, A. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como el fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo el ácido ascórbico y la metionina; conservantes (tales como el cloruro de octadecildimetilbencilamonio; el cloruro de hexametonio; en cloruro de benzalconio; el cloruro de bencetonio; el fenol, butil- o bencil-alcohol; los alquilparabens tales como el metil- o propilparaben; catechol; el resorcinol; el ciclohexanol; el 3-pentanol; y el m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como la albúmina de suero, la gelatina, o las inmunoglobulinas; los polímeros hidrofílicos tales como la polivinilpirrolidona; los aminoácidos tales como la glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; los monosacáridos, los disacáridos, y otros carbohidratos, incluyendo la glucosa, manosa, o dextrinas; los agentes quelantes tales como el EDTA; los azúcares tales como la sacarosa, el manitol, la trehalosa o sorbitol; los contraiones formadores de sales, tales como el sodio; complejos de metales (por ejemplo, los complejos de Zn-proteína); y/o los tensioactivos no iónicos, tales como el TWEEN™, PLURONICS™, o el polietilenglicol (PEG).

Los agonistas o antagonistas podrían formularse también en liposomas. Los liposomas que contienen la molécula de interés se preparan mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); y las patentes estadounidenses nº 4.485.045 y 4.544.545. En la patente estadounidense nº 5.013.556 se descubren liposomas con un tiempo de circulación mejorado.

Pueden generarse inmunoliposomas particularmente útiles mediante el procedimiento de evaporación en fase inversa con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para rendir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' de un anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse con los liposomas tal como se describe en Martin et al., J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982) a través de una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico (tal como la Doxorubicin) está opcionalmente contenido dentro del liposoma. Ver, Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19):1484 (1989).

La formulación en ésta también podría contener más de un compuesto activo, según sea necesario para la indicación particular que está siendo tratada, preferiblemente, aquéllos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre ellos. Tales moléculas se presentan convenientemente en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito pretendido. Por ejemplo, un antagonista del receptor Eph podría combinarse con un agente quimioterapéutico o estrógeno.

Los ingredientes activos también podrían atraparse en una microcápsula preparada, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, respectivamente, microcápsula de hidroximetilcelulosa o gelatina, y microcápsulas de poli(metilmetacilato), en sistemas de suministro de drogas coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Ed. Osol, A. (1980).

Las formulaciones a usarse para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

Podrían prepararse preparaciones de suministro continuado. Los ejemplos apropiados de preparaciones de suministro continuado incluyen las matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos conteniendo el antagonista, matrices que están en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de suministro continuado incluyen los poliésteres, los hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli(vinilalcohol)), los poliláctidos (patente estadounidense nº 3.773.919), los copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, etilenvinil acetato no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico, tales como el Lupron Depot™ (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como el etilenvinilacetato y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanece en el cuerpo durante un período largo, podrían desnaturalizarse o agregarse a resultas de la exposición a humedad a 37ºC, resultando en un pérdida de actividad biológica y en posibles cambios en la inmunogenicidad. Pueden diseñarse estrategias para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación intermolecular de enlaces S--S a través del intercambio tio-disulfuro, podría conseguirse la estabilización modificando los residuos sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido en humedad, usando aditivos apropiados, y desarrollando composiciones específicas de matriz de polímeros.

G. Terapia con antagonistas del receptor Eph

Para las aplicaciones terapéuticas, los antagonistas de la invención se administran a un mamífero, preferiblemente a un humano, en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable, tal como las descritas más arriba, incluyendo aquéllas que podrían administrarse a un humano intravenosamente como un bolo o mediante infusión continuada a lo largo de un período de tiempo, mediante rutas intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o de inhalación. Los antagonistas se administran también de forma apropiada mediante rutas intratumoral, peritumoral, intralesional, o perilesional para ejercer efectos locales así como sistémicos. Se espera que la ruta intraperitoneal sea particularmente útil, por ejemplo, en el tratamiento de los tumores ováricos.

Para la prevención o tratamiento de una enfermedad, la dosificación apropiada de antagonista dependerá del tipo de enfermedad a tratar, tal como se ha definido más arriba, de la gravedad y curso de la enfermedad, de si el antagonista se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, de la terapia previa, de la historia clínica del paciente, y de la respuesta al antagonista, y de la discreción del médico que lo atienda. El antagonista se administra convenientemente al paciente de una vez o a lo largo de una serie de tratamientos.

Los antagonistas son útiles en el tratamiento de varias enfermedades y trastornos neoplásicos y no neoplásicos. Los cánceres y condiciones relacionadas que son susceptibles de tratamiento incluyen los carcinoma de mama, carcinomas de pulmón, carcinomas gástricos, carcinomas esofágicos, carcinomas colorectales, carcinomas de hígado, carcinomas de ovarios, tecomas, arrenoblastomas, carcinomas cervicales, carcinoma endometrial, hiperplasia endometrial, endometriosis, fibrosarcomas, coriocarcinoma, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma nasofaríngeo, carcinomas laríngeos, hepatoblastoma, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinomas de la piel, hemangioma, hemangioma cavernoso, hemangioblastoma, carcinomas del páncreas, retinoblastoma, astrocitoma, glioblastoma, schwannoma, oligodendroglioma, meduloblastoma, neuroblastoma, radbomioscarcoma, sarcoma osteogénico, leiomiosarcomas, carcinomas del tracto urinario, carcinomas de tiroides, tumor de Wilm, carcinoma de célula renal, carcinoma de próstata, proliferación vascular anormal asociada con facomatosas, edema (tal como el asociado con tumores cerebrales), o el síndrome de Meig.

Los condiciones no neoplásicas que son susceptibles de tratamiento incluyen la artritis reumatoide, la psoriasis, la aterosclerosis, las retinopatías diabética y otras retinopatías proliferantes, incluyendo la retinopatía de prematuros, la fibroplasia retrolental, el glaucoma neovascular, la degeneración macular asociada con la edad, la hiperplasia de la tiroides (incluyendo la enfermedad de Grave), los transplantes de córnea y otros tejidos, la inflamación crónica, la inflamación pulmonar, el síndrome nefrítico, la preeclampsia, los ascites, la efusión pericardíaca (tal como la asociada con la pericarditis), y la efusión pleural.

Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente de 1 \mug/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg (por ejemplo, 0,1-20 mg/kg) de antagonista es una dosis candidata inicial para la administración al paciente, sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante infusión continuada. Una dosis típica diaria o semanal podría oscilar desde aproximadamente 1 \mug/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados más arriba. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o más, dependiendo de la condición, se repite el tratamiento hasta que ocurre una supresión deseada de síntomas de la enfermedad. Sin embargo, podrían ser útiles otros regímenes de dosis. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales, incluyendo, por ejemplo, la imagen radiográfica del tumor.

De acuerdo con otra realización de la invención, la efectividad del antagonista para prevenir o tratar la enfermedad podrían mejorarse administrando el antagonista en serie o en combinación con otro agentes que es efectivo para esos propósitos, tal como el factor de la necrosis del tumor (TNF), un antagonista capaz de inhibir o neutralizar la actividad angiogénica del factor de crecimiento de fibroblastos ácido o básico, o el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un antagonista capaz de inhibir o neutralizar las actividades coagulantes del factor del tejido, proteína C, o proteína S (ver Esmon et al., publicación de patente PCT nº WO*91/01.753, publicada el 21 de febrero de 1991), un antagonista capaz de unirse al receptor HER2 (ver la patente estadounidense nº 5.772.997), o uno o más agentes terapéuticos convencionales, tales como, por ejemplo, los agentes alquilantes, los antagonistas del ácido fólico, los anti-metabolitos del metabolismo del ácido nucleico, los antibióticos, los análogos de pirimidina, el 5-fluorouracilo, el cisplatino, los nucleósidos de purina, las aminas, los aminoácidos, los nucleósidos de triazol, o los corticosteroides. Tales otros agentes podrían estar presentes en la composición que se está administrando o podrían administrarse por separado. También, el antagonista se administra convenientemente en serie o en combinación con tratamientos radiológicos, sea implicando irradiación o administración de sustancias radiactivas.

En una realización, la vascularización de tumores se ataca mediante terapia de combinación. El antagonista y uno o más de otros antagonistas se administran a los pacientes portadores de tumor en dosis terapéuticamente efectivas, tal como se determina, por ejemplo, observando la necrosis del tumor o sus focos metastásicos, si existe alguno. Esta terapia se continua hasta el momento en que no se observa ningún efecto beneficioso adicional o hasta que el examen clínico no muestra traza del tumor o de ningún foco metastásico. A continuación se administra el TNF, solo o en combinación con un agente auxiliar tal como el interferón alfa, beta o gamma, el anticuerpo anti-HER2, la heregulina, el anticuerpo anti-heregulina, el factor D, la interleukina-1 (IL-1), la interleukina-2 (IL-2), el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), o agentes que promueven la coagulación microvascular en tumores, tales como el anticuerpo anti-proteína C, el anticuerpo anti-proteína S, o la proteína unidora de C4b (ver Esmon et al., Publicación de Patente PCT nº WO 91/01753, publicada el 21 de febrero de 1991), o calor o radiación.

Puesto que los agentes auxiliares variarán en su efectividad, es deseable comparar su impacto sobre el tumor mediante examen en matriz de la forma convencional. La administración de antagonista y TNF se repite hasta que se consigue el efecto clínico deseado. Alternativamente, el antagonista se administra junto con el TNF y, opcionalmente, con agente(s) auxiliar(es). En los casos en los que los tumores sólidos se hallan en las extremidades o en otras ubicaciones susceptibles de ser aisladas de la circulación general, los agentes terapéuticos descritos en ésta se administran al tumor u órgano aislado. En otras realizaciones, un antagonista del FGF o del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), tal como un anticuerpo neutralizante anti-FGF o un anti-PDGF, se administra al paciente en conjunción con el antagonista. El tratamiento con antagonista óptimamente podría suspenderse durante períodos de cicatrización de la herida o de vascularización deseable.

En una realización, el antagonista del receptor Eph se usa para tratar una anomalía vascular (por ejemplo, las anomalías de los vasos pequeños) que resultan de la terapia con estrógeno. La administración del antagonista del receptor del Eph podría preceder o seguir la administración de estrógeno al paciente. También se contempla la terapia concomitante, por ejemplo, cuando el antagonista del receptor Eph y el estrógeno se proporcionan en la misma composición. Las dosis de estrógeno podrían corresponder a las previamente conocidas.

H. Terapia con agonistas del receptor Eph

La presente invención proporciona un procedimiento para estimular la angiogénesis que comprende administrar un agonista del receptor Eph a un mamífero. Por ejemplo, el agonista podría usarse para tratar condiciones asociadas con el endotelio vascular, tales como el tratamiento de traumas de la red vascular. Los ejemplos de tales traumas que podrían tratarse de este modo incluyen, pero no se limitan a, las incisiones quirúrgicas, particularmente las que implican el corazón, las heridas, incluyendo las laceraciones, incisiones, y penetraciones de vasos sanguíneos, y las úlceras de superficie que implican el endotelio vascular, tales como las úlceras diabéticas, hemofílicas, y varicosas.

Para las indicaciones traumáticas mencionadas más arriba, el agonista del receptor Eph se formulará y dosificará de forma consistente con la buena práctica médica, tomando en consideración el trastorno específico a tratarse, la condición del paciente individual, el sitio de suministro del agonista del receptor Eph, el procedimiento de administración, y otros factores conocidos por los facultativos.

Las indicaciones adicionales para el agonista del receptor Eph son el tratamiento de heridas profundas, tales como las úlceras dérmicas, incluyendo la categoría de llagas por presión, las úlceras venosas, las úlceras diabéticas, así como las quemaduras profundas, y las lesiones en las que se requiere la angiogénesis para preparar la quemadura o sitio lesionado para un trasplante o colgajo de piel. En este caso, el agonista del receptor Eph se aplica bien directamente al sitio o se usa para mojar la piel o colgajo que se está trasplantando antes del injerto. De forma similar, el agonista del receptor Eph podría usarse en la cirugía plástica cuando se require la reconstrucción a continuación de una quemadura u otro trauma, o con propósitos cosméticos.

La angiogénesis es también importante para mantener las heridas limpias y no infectadas. Por tanto, el agonista del receptor Eph puede usarse en asociación con la cirugía general y siguiendo la reparación de cortes y laceraciones. Es particularmente útil en el tratamiento de heridas abdominales con un elevado riesgo de infección. La vascularización es también clave para la reparación de fracturas, puesto que los vasos sanguíneos se desarrollan en el sitio de lesión del hueso. La administración del agonista del receptor Eph en el sitio de una fractura es por tanto otra utilidad.

En los casos en los que el agonista del receptor se está usando para la cicatrización de heridas tópicas, tal como se describe más arriba, éste podría suministrarse mediante cualquiera de las rutas descritas más abajo para la re-endotelización del tejido vascular, o más preferiblemente mediante medios tópicos. En estos casos, se administrará como una solución, aerosol, gel, cream, ungüento, o polvo seco, directamente en el sitio de la lesión. También se usarán los dispositivos de liberación lenta que dirigen el agonista del receptor Eph al sitio lesionado. En las aplicaciones tópicas, el agonista del receptor Eph se aplicará en una concentración que oscilará desde aproximadamente 50 hasta 10.000 \mug/ml, bien en una única aplicación, o en regímenes de dosis que son diarios o cada pocos días durante un período de una semana a varias semanas. Generalmente, la cantidad de formulación tópica administrada es la que es suficiente para aplicar desde aproximadamente 0,1 hasta 100 \mug/cm^{2} del agonista del receptor Eph, en base al área de la superficie de la herida.

El agonista del receptor Eph puede usarse como agente cicatrizante post-quirúrgico en la angioplastia con globo, un procedimiento en el cual se suprimen o lesionan células endoteliales vasculares, junto con la compresión de las placas ateroescleróticas. El agonista del receptor Eph puede aplicarse a las superficies vasculares internas mediante aplicación intravenosa sistémica o local, bien como inyección de bolo intravenoso o como infusión. Si se desea, el agonista del receptor Eph puede administrarse a lo largo del tiempo usando una bomba micrométrica. Las composiciones apropiadas para la administración intravenosa comprenden el agonista del receptor Eph en una cantidad efectiva para promover el crecimiento de células endoteliales y un material portador parenteral. El agonista del receptor Eph puede estar en presente en la composición a lo largo de un ampli rango de concentraciones, por ejemplo, desde aproximadamente 50 \mug/ml hasta aproximadamente 1000 \mug/ml, usando inyecciones de 3 a 10 ml por paciente, administrado una vez o en regímenes de dosificación que permiten múltiples aplicaciones. Cualquiera de los vehículos portadores parenterales conocidos puede usarse, tales como la solución salina normal o la dextrosa al 5-10%.

El agonista del receptor Eph puede usarse también para promover la endotelización en la cirugía de injertos vasculares. En el caso de los injertos vasculares usando, por ejemplo, vasos trasplantados o material sintético el agonista del receptor Eph puede aplicarse a las superficies del injerto y/o en las uniones del injerto y la vasculatura existente, para promover el crecimiento de las células endoteliales vasculares. Para tales aplicaciones, el agonista del receptor Eph puede aplicarse intravenosamente tal como se ha descrito más arriba para la angioplastia con globo, o puede aplicarse directamente a las superficies del injerto y/o la vasculatura existente, bien antes o durante la cirugía. En tales casos, podría ser deseable aplicar el agonista de receptor Eph en un material portador espesante, de forma que se adhiera a la superficie afectada. Los materiales portadores apropiados incluyen, por ejemplo, el carbopol al 1-5%. El agonista del receptor Eph puede estar presente en el portador a lo largo de un amplio rango de concentraciones, por ejemplo, desde aproximadamente 50 \mug/mg hasta aproximadamente 1000 \mug/ml. Alternativamente, el agonista del receptor Eph puede suministrarse al sitio mediante una bomba micrométrica como una solución parenteral.

El agonista del receptor Eph puede emplearse también para reparar la lesión vascular posterior al infarto de miocardio, y para salvar la necesidad de cirugía de bypass coronario mediante la estimulación del crecimiento de una circulación colateral. El agonista del receptor Eph se administra intravenosamente para este propósito, bien en inyecciones individuales o mediante una bomba micrométrica a lo largo de un período de tiempo, tal como se describe más arriba, o mediante infusión o inyección directa en el sitio del músculo cardíaco lesionado.

La ruta de administración del agonista del receptor Eph está de acuerdo con procedimientos conocidos, por ejemplo, aquellas rutas detalladas más arriba para indicaciones específicas, así como las rutas generales de inyección o infusión mediante medios intravenosos, intraperitoneales, intracerebrales, intramusculares, intraoculares, intraarteriales, o intralesionales, o mediante sistemas de liberación continuada, tal como se ha mencionado más arriba. El agonista del receptor Eph se administra continuamente mediante infusión o mediante inyección de bolo. Generalmente, cuando el trastorno lo permite, se debería formular y dosificar el agonista del receptor Eph para su suministro específico en un sitio. Esto es conveniente en el caso de heridas y úlceras.

Una cantidad efectiva de agonista del receptor Eph a emplearse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la ruta de administración, y la condición del paciente. En consecuencia, será necesario para el médico valorar la dosis y modificar la ruta de administración según se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Típicamente, el clínico administrará el agonista del receptor Eph hasta alcanzar una dosis que consiga el efecto deseado. Una dosis diaria típica para el tratamiento sistémico podría oscilar desde aproximadamente 1 \mug/kg hasta 10 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados más arriba. Como una proposición alternativa general, el agonista del receptor Eph se formula y suministra al sitio o tejido diana en una dosis capaz de establecer en el tejido un nivel de agonista del receptor Eph superior a aproximadament 0,1 ng/cc, hata una dosis máxima que es eficaz pero no innecesariamente tóxica. Esta concentración intra-tejido debería mantenerse si es posible mediante infusión continua, liberación continuada, aplicación tópica, o inyección con frecuencias determinadas empíricamente. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante ensayos convencionales.

Se halla dentro del ámbito de ésta combinar la terapia con el agonista del receptor Eph con otras terapias convencionales o novedosas (por ejemplo, factores de crecimiento tales como el VEGF, el factor de crecimiento de fibroblastos ácido o básico (respectivamente aFGF o bFGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento parecido a insulina (IGF-I o IGF-II), el factor de crecimiento nervioso (NGF), los esteroides anabólicos, el EGF o el TGF-\beta) para potenciar la actividad de cualquiera de los factores de crecimiento, incluyendo el agonista del receptor Eph, en la promoción de la proliferación celular y reparación. No es necesario que tales drogas de co-tratamiento se incluyan per se en las composiciones de esta invención, aunque esto será conveniente cuando tales drogas sean proteicas. Tales mezclas se administran convenientemente de la misma manera y para los mismos propósitos que el agonista del receptor Eph usado solo. El proporción molar útil de agonista de receptor Eph respecto tales factores de crecimiento secundarios es típicament 1:0,1-10, siendo la preferida con cantidades equimolares.

Ejemplo 1

Este ejemplo muestra que el receptor EphB4 es esencial para promover el remodelado angiogénico de las redes capilares primarias. Los ratones que carecían de EphB4 tenían un fenotipo más precoz y morían alrededor de E9.5-E10. El corazón estaba dilatado y las arterias y venas principales eran gravemente dismórficas. Lo más sorprendente, el remodelado angiogénico de las redes capilares primarias extra- e intra-embrionarias estaba completamente suprimido, y grandes láminas endoteliales se ensamblaban en sinusoides extensos y pobremente estructurados. Por tanto, la vía EphB4 gobierna la angiogénesis en un etapa temprana, cuando el sistema vascular primario empieza a reorganizarse a través de la germinación e intususcepción.

El gen de EphB4 se desactivó transfectando células madres embrionarias (ES) de ratón con un vector de remplazo mostrado en la Figura 1. La integración homóloga ocurrió con una frecuencia de aproximadamente 1 en 200 colonias de células ES resistentes a G-418 y ganciclovir, y resultó en el remplazo, con el gen de la resistencia a la neomicina, de una región del gen de EphB4 que codifica los primeros 382 residuos aminoácidos de la proteína, incluyendo el péptido señal. La estructura del gen de EphB4 mutado en las células ES apuntadas y en la progenie de las quimeras de la línea germinal se identificó mediante análisis de transferencia Southern (Figura 2). Los ratones heterocigotos para la mutación no tenían anomalías fenotípicas aparentes y eran fértiles. Sin embargo, no se halló ningún raton EphB4-/- entre las 114 camadas procedentes de entrecruzamientos de heterocigotos. Para determinar el instante en el que la mutación de EphB4 era letal, se examinaron embriones procedentes de entrecruzamientos F1 en diferentes etapas. Hasta E9.5-E10, había presentes embriones EphB4-/-embryos viables en la proporción mendeliana esperada. En E10.5 todos los embriones mutantes homocigotos estaban muertos como se evidenciaba por una amplia apoptosis y/o necrosis.

La hibridación in situ de montajes completos de embriones E9.5 reveló la expresión específica de EphB4 predominantemente en el sistema ventricular, incluyendo las vesículas óticas (Figura 3A). La expresión específica se observó también en el corazón en desarrollo. Por otra parte, la expresión era difusa, y presumiblemente ampliamente mesenquimal, con cierta preponderancia en las yemas de las extremidades. Los embriones mutantes tenían un crecimiento retardado y consistentemente tenían un corazón dilatado (Figura 3B). El análisis histológico reveló un sorprendente defecto vascular al nivel de los vasos pequeños. Por tanto, los capilares que rodean el tubo neural (futura pia madre y plexo coroidal) estaban fuertemente dilatados (Figura 4A). La inmunotinción de la molécula de adhesión celular endotelial de plaquetas (PECAM) como un marcador celular endotelial reveló vastas dilataciones capilares a través del cuerpo, tal como se ilustra mediante los vasos de las yemas de las extremidades en crecimiento (Figura 4B). Incluso, aunque los grandes vasos estaban presentes de forma normal y no mostraban anomalías aparentes en las secciones de tejido (Figura 4C), la tinción de los montajes completos con anticuerpos anti-PECAM reveló también graves anomalías de ambos, las grandes arterias y venas (Figura 4D y 4E). Estos vasos tenían generalmente un tamaño normal, pero eran dismórficos y estaban irregularmente conformados. Sorprendentemente, la ramificación y fusión de vasos colectores estaba desorganizada, tal como se ilustra mediante las venas cardinales de la cabeza (Figura 4E).

El defecto vascular fue más dramático en el saco vitelino, el cual consistía en extensos sinusoides endoteliales en vez de la red capilar primaria que normalmente se compartimenta en islas de sangre (Figura 5A). Los grandes vasos eran indetectables, con excepción de la arteria y vena vitelina. La capa endotelial que alinea estos sinusoides y que cubre el saco vitelino no mostraba anomalías aparentes cuando se examinó tanto histológicamente como mediante microscopia electrónica, y las células endoteliales estaban presentes con la densidad normal (Figura 5B). El desarrollo de las glóbulos rojos era normal, tal como se evidenció mediante la tinción de la hemoglobina con benzidina, y los embriones E9.5 mutantes tenían un sistema cardiovascular funcional, puesto que se observaron células sanguíneas a través del sistema vascular. Sin embargo, la presumiblemente baja resistencia vascular periférica podría haber causado una insuficiencia hemodinámica letal.

Por tanto, las etapas tempranas del desarrollo vascular, incluyendo la diferenciación de células madre hematopoyéticas y de los precursores de angioblastos y hemangioblastos, la migración de los angioblastos a lugares remotos, tales como el plexo vascular perineural, y la formación de las redes capilares primarias, permaneció no afectada por la inactivación del gen de EphB4. Los sinusoides endoteliales patológicos que se formaron a través del cuerpo de los embriones E9.5 mutantes, cuando los lechos capilares normalmente empiezan a vascularizar los tejidos periféricos, reflejan, por tanto, un defecto grave en el proceso de remodelado angiogénico que subyace la formación de redes capilares maduras. Se cree que estas se forman a través de la interacción de nuevos vasos que brotan, y el desdoblamiento o intususcepción de vasos preexistentes. El defecto observado lo más sorprendentemente en el saco vitelino de embriones E9.5 EphB4-/- podría reflejar una detención en una etapa en la que los vasos principales se juntan antes de que se inicie la reorganización vascular a través del reparto transluminal. La angiogénesis de los brotes, que ocurre por ejemplo, en respuesta al VEGF producido en la capa perivascular del tubo neural, también podría verse afectada en los embriones EphB4-/-, puesto que el neuroepitelio de los embriones mutantes no consiguió pasar a estar vascularizado (Figura 6). Más aún, las células endoteliales diferenciadas normalmente parecen detenerse en la interfaz entre el mesénquima y el neuroepitelio y formar una lámina endotelial continua en vez de invadir la capa endotelial en donde, en esta etapa, la expresión de EphB4 es la más pronunciada (Figura 3A).

Procedimientos

Alteración dirigida del gen de EphB4: Se aisló un fragmento de gen de 18 kb que codificaba el dominio extracelular entero y una porción del dominio intracelular del EphB4 de ratón a partir de una biblioteca de 129Sv de la cepa lambda DashIII (Stratagene) usando una sonda de ADNc del EphB4 de ratón (Andres et al., Oncogene, 9: 1461-1467 (1994)), y se subclonó en un vector Bluescript como fragmentos XbaI. Se construyó un vector de remplazo insertando un fragmento BspMII-ApaI de 1,1 Kb que contenía secuencias cadena arriba respecto el codón de inicio de la traducción, en el sitio NotI de pTK.neo.ums (Reis et al., EMBO J., 13: 4798-4806 (1994)), y un fragmento XhoI-XbaI de 4,0 kb que contiene los exones que codifican los aminoácidos 383-563 de la proteína inmadura en el ClaI de pTK.neo.ums, adyacente respecto el gen quinasa de timidina del virus herpes simplex dirigido por el promotor y potenciador del polioma. La construcción dirigida sustituyó 11 kB del gen de EphB4 con el gen de la resistencia a la neomicina colocado bajo el contron del promotor de PGK, suprimiendo por tanto la porción de gen que codifica los primeros 382 aminoácidos de la prooteína EphB4. Las células ES (Reis et al., EMBO J., 13: 4798-4806 (1994)) se electroporaron y se seleccionaron las colonias como se había descrito (Spencer et al., J. Exp. Med., 187: 571-578 (1998)). La recombinación homóloga se detectó mediante PCR usando un cebador con sentido específico para el EphB4, correspondiente a una secuencia genómica inmediatamente cadena arriba respecto el extremo 5' del vector apuntado (pHTKc1, ACTTAACGTGCACGCACTGAT, SEC. Nº ID.: 1) y un cebador antisentido específico para el gen de la resistencia a la neomicina (pHTKc2, ACTGAAGCGGGAAGGGACTGG, SEC. Nº ID.: 2). La integración homóloga se confirmó mediante análisis de transferencia Southern de ADN genómico digerido con EcoRI, usando una sonda XbaI-EcoRI de 1,5 kB, marcada con 32-P, y derivada de secuencias genómicas cadena abajo respecto el vector apuntado. Los clones positivos se identificaron mediante la presencia de un fragmento EcoRI de 6 kb, además del fragmento EcoRI de 9 kb típico del alelo de tipo salvaje del EphB4.

Análisis embrionario: Los genotipos se determinaron a partir del saco vitelino o a partir de ADN embrionario usando pares de cebadores específicos para el gen de la resistencia a la neomicina (pNeo 474+, GCCGCGCTGTTCTCCTC
TTCC, SEC. Nº ID.: 3, y pNeo 1513-, TCCCAATCCTCCCCCTTGCTGT, SEC. Nº ID.: 4), o abarcando la supresión dentro del gen del EphB4 (pHtkV7-2 152+, CTTTATGTGAGGYTGGGGACA, SEC. Nº ID.: 5 y pHtk p469-wt, CCGTATCACGTTCGCTCTCGT, SEC. Nº ID.: 6).

Los embriones retirados entre E8.5 y E11.5 se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 2 h a temperatura ambiente. Para su análisis histológico, los embriones y los sacos vitelinos se deshidrataron, se impregnaron en parafina, y se cortaron en secciones (generalmente de 8 \mum) y se contratiñeron con hematoxilina de Gill de acuerdo con protocolos estándares.

Hibridación in situ de montajes completos: La hibridación in situ de montajes completos se realizó tal como se ha descrito (Wilkinson, D. G., "Whole mount in situ hybridization of vertebrate embryos", en In Situ Hybridization: A Pratical Approach, Editorial IRL Press, O., (1992), pp. 75-83). Se sintetizó una sonda antisentido a partir de un fragmento de ADNc de SstI EphB4 (nucleótidos 2-644 de la pauta de lectura abierta del EphB4) que se subclonó en pB1KSII+ (Stratagene).

Inmunohistoquímica: La inmunohistoquímica de los montajes enteros se realizó esencialmente tal como se ha descrito (Schlaeger et al., Development, 121: 1089-1098 (1995)). En resumen, embriones y sacos vitelinos fijados con paraformaldehído, se aclararon en PBS, se deshidrataron en metanol, se blanquearon en peróxido de hidrógeno al 5% en metanol durante 4-5 horas a temperatura ambiente, y se aclararon con metanol. Se rehidrataron las muestras, se incubaron durante 1 hora a 4ºC en PBS que contenía 0,1% de Triton-X-100 (PBST) y 10% de FCS, y se dejaron toda la noche a 4ºC con un Mab anti-PECAM (Pharmingen, clon MEC13.3, dilución 1/250). A continuación, se lavaron las muestras cinco veces durante 1 hora a 4ºC en PBST, se incubaron durante la noche a 4ºC con IgG anti-rata de cabra, conjugada con peroxidasa de rábano silvestre (TACO Immunologicals #6470, dilución 1/100), se lavaron cinco veces durante 1 hora a 4ºC en PBST, y una vez durante 20 minutos a temperatura ambiente en PBST suplementado con 0,2% de BSA (PBT). La tinción con peroxidasa se realizó mediante incubación durante 20 minutos en DAB 0,3 mg/ml (Sigma) en PBT, seguida por la adición de peroxidasa de hidrógeno hasta una concentración final del 0,03%. Transcurridos 10 minutos, se detuvo la reacción mediante lavado en PBT y PBST. Los embriones teñidos se post-fijaron en paraformaldehído al 4%.

Claims

1. Utilización de un antagonista del receptor Eph, como un ingrediente activo, para la fabricación de una composición destinada al tratamiento del cáncer en un mamífero.

2. Utilización según la reivindicación 1, en donde el mamífero tiene un tumor maligno sólido.

3. Utilización de un antagonista del receptor Eph, como un ingrediente activo, para la fabricación de una composición destinada al tratamiento del cáncer o una condición relacionada en un mamífero, en donde el cáncer o condición relacionada es un carcinoma de mama, carcinoma de pulmón, carcinoma gástrico, carcinoma esofágico, carcinoma colorectal, carcinoma de hígado, carcinoma de ovarios, tecoma, arrenoblastoma, carcinoma cervical, carcinoma endometrial, hiperplasia endometrial, endometriosis, fibrosarcoma, coriocarcinoma, cáncer de cabeza o cuello, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma laríngeo, hepatoblastoma, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinoma de piel, hemagioma, carcinoma cavernoso, hemangioblastoma, carcinoma de páncreas, retinoblastoma, astrocitoma, glioblastoma, Schwannoma, oligodendroglioma, meduloblastoma, neuroblastoma, radbomiosarcoma, carcinoma osteogénico, leiomiosarcoma, carcinoma del tracto urinario, carcinoma de tiroides, tumor de Wilm, carcinoma de célula renal, carcinoma de próstata, proliferación vascular anormal asociada con facomatosas, edema o el síndrome de Meig.

4. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que además comprende el uso de un agente terapéutico adicional en la fabricación de la misma o de una diferente composición.

5. Utilización según la reivindicación 4, en donde el agente terapéutico adicional es un factor tumoral de necrosis (TNF); o un antagonista de un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) ácido o básico, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de tejido (TF), proteína C, proteína S, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), o el receptror HER 2.

6. Utilización de un antagonista del receptor Eph para la fabricación de una composición destinado al tratamiento de una condición no neoplásica en un mamífero, en donde dicha condición no neoplásica es la artritis reumatoide, la psoriasis, la ateroesclerosis, la retinopatía diabética u otra retinopatía proliferante, la fibroplasia retrolental, el glaucoma neovascular, la degeneración macular asociada con la edad, la hiperplasia de la tiroides, los transplantes de córnea u otros tejidos, la inflamación crónica, la inflamación de pulmón, el síndrome nefrítico, la preeclampsia, los ascites, la efusión pericardíaca, la efusión pleural, o una anomalía vascular resultante de la terapia con estrógenos.

7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el antagonista se une a un receptor Eph.

8. Utilización según la reivindicación 7, en donde el receptor Eph es EphB4.

9. Utilización según la reivindicación 7, en donde el receptor Eph es EphB2.

10. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el antagonista une un ligando efrina.

11. Utilización según la reivindicación 10, en donde el ligando efrina es Efrina-B2.

12. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el antagonista comprende un anticuerpo.

13. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el antagonista comprende una inmunoadhesina.

14. Utilización según la reivindicación 10 o reivindicación 11, en donde el antagonista comprende una porción del receptor Eph, la cual une el ligando Eph pero carece de un dominio que confiere actividad biológica.

15. Utilización de un agonista del receptor Eph para la fabricación de una composición destinada al tratamiento de un trauma de la red vascular de un mamífero.

16. Utilización según la reivindicación 15, en donde el trauma es una incisión quirúrgica; una herida; una laceración, incisión o penetración de vasos sanguíneos; o una úlcera de superficie que implique el endotelio vascular.

17. Utilización según la reivindicación 16, en donde la úlcera de superficie es diabética, hemofílica, o una úlcera varicosa.

18. Utilización según la reivindicación 15, en donde el trauma es cirugía de injerto vascular, angioplastia con globo, o infarto de miocardio.

19. Utilización de un agonista de receptor Eph para la fabricación de una composición destinada al tratamiento de una herida profunda en un mamífero.

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20. Utilización según la reivindicación 19, en donde la herida profunda es una úlcera dérmica, una quemadura o lesión profunda.

21. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en donde el agonista une un receptor Eph.

22. Utilización según la reivindicación 21, en donde el receptor Eph es EphB4.

23. Utilización según la reivindicación 21, en donde el receptor Eph es EphB2.

24. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en donde el antagonista une un ligando efrina.

25. Utilización según la reivindicación 24, en donde el ligando efrina es Efrina-B2.

26. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 25, en donde el antagonista comprende un anticuerpo.

27. Utilización según las reivindicaciones 12 ó 26, en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.

28. Utilización según la reivindicación 27, en donde el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab, Fab', F(ab')_{2} ó Fv.

29. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde el mamífero es un humano.