CN104995207B - β整联蛋白-G蛋白α亚基结合相互作用的抑制剂 - Google Patents

Abstract

本文提供了抑制β整联蛋白和G蛋白亚基之间的结合相互作用的化合物，以及包含所述化合物的组合物如药物组合物，及相关试剂盒。在一些实施方案中，所述化合物是抗体或抗体类似物，并且在其它实施方案中，所述化合物是肽或肽类似物。还提供了使用所述化合物的方法，包括治疗或预防医学病况，诸如中风、心脏病发作、癌症或炎症的方法。

Description

β整联蛋白-G蛋白α亚基结合相互作用的抑制剂

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年9月15日提交的美国申请No.13/621,064的优先权，其进而要求2011年3月15日提交的国际专利申请No.PCT/US2011/028567的优先权，所述国际专利申请No.PCT/US2011/028567要求2010年3月15日提交的美国临时专利申请No.61/314,027和2011年1月14日提交的美国临时专利申请No.61/433,037的优先权；其每个申请通过引用以其整体并入。

资助基金

本发明是在由美国国家心肺血研究所资助的批准号HL080264、HL062350、HL068819和HL109439下由政府支持进行的。政府具有本发明的某些权利。

通过引用并入以电子方式提交的材料

通过引用将同时提交的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表以其整体并入本文，并且其被鉴定为如下：2013年9月13日创建的名为“45326B_PCT_SeqListing.txt”的195千字节ACII(文本)文件。

背景

整联蛋白是细胞外基质的异源二聚体跨膜受体，并且由α和β亚基组成。天然存在的整联蛋白配体包括层粘连蛋白、纤连蛋白和玻连蛋白，并且还包括纤维蛋白原和纤维蛋白、血小板反应蛋白和冯威勒布兰德因子(von Willebrand factor)，及成纤维细胞生长因子2。整联蛋白通过识别暴露环上的短氨基酸延伸部分特别是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)或类似序列而结合配体。在连接后，整联蛋白单独或与其它类型的受体(诸如生长因子受体)一起介导细胞粘附，并启动复杂的信号转导事件，以及调控细胞铺展、收缩、粘附、增殖、存活和迁移。整联蛋白信号转导是双向的。胞内信号介导所谓的“由内向外”信号转导，这诱导了整联蛋白的配体结合功能的激活。整联蛋白连接激活“由外向内”信号转导通路，包括例如Src家族激酶(SFK)、磷酸肌醇3-激酶、蛋白激酶B(PKB/Akt)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)及Rac。参见，如Li Z,Delaney MK,O'Brien KA,Du X.,Arterioscler ThrombVasc Biol.30(12):2341-2349,2010。

整联蛋白在血小板(在血栓形成和止血中重要的血细胞类型)表面上表达并用作为主要粘附受体。在血小板表面表达的重要的整联蛋白是整联蛋白α_IIbβ₃，也被称为糖蛋白IIb-IIIa(GPIIa-IIIa)。在暴露于血管损伤位点之后，血小板粘附至损伤或刺激的血管内皮细胞或细胞外基质上，并在其上铺展，激活并聚集形成原发血栓。整联蛋白α_IIbβ₃介导稳定的血小板粘附、铺展和聚集。这一过程通常起到停止出血并防止血液流失的作用(这被称为止血)。在某些情况下，诸如在动脉粥样硬化的位点，血小板形成阻塞血管的闭塞性血栓，从而导致器官和组织局部缺血，进而引起诸如心脏病发作和血栓性中风等(Li Z,DelaneyMK,O'Brien KA,Du X.,Arterioscler Thromb Vasc Biol.30(12):2341-2349,2010)。因此，整联蛋白功能的抑制剂在临床上被用于预防和治疗血栓性疾病。整联蛋白在其它生理和病理过程中也很重要，诸如免疫、炎症、血管生成及肿瘤发展和转移。

当前在临床上使用或开发的整联蛋白抑制剂有三类：靶向异源二聚体胞外配体结合结构域的单克隆抗体(如，Reopro,Eli Lilly,Indiapolis,Vitaxin；MedImmune,Gaithersburg,MD)，含有RGD或KGD序列的合成肽(如，Integrillin,MillenniumPharmaceuticals；西仑吉肽；Merck KGaA,Darmstadt,Germany)及肽模拟物(如，aggrestat(替罗非班),Merck,White House Station,NJ；S247；Pfizer,St Louis,MO)。

第一种整联蛋白特异性药物靶向整联蛋白α_IIbβ₃，其对于止血极为重要，并且在血小板粘附和血栓形成中起到重要作用。α_IIbβ₃还在炎症应答中起作用。第一种FDA批准的α_IIbβ₃拮抗剂已被证明对于包括急性冠状动脉综合征的适应症和预防心肌梗死有利。然而，这些药物中一些由于它们的药代动力学特征而使用受限--一些药物显示出快速血浆清除、快速代谢、口服生物利用率差和/或血浆水平变化较大。此外，一些α_IIbβ₃整联蛋白拮抗剂诱导血小板减少症。参见，如,Advances in Immunology,第91卷,Elsevier Academic Press(San Diego,CA),2006。整联蛋白抑制剂的常见和潜在的威胁生命的不良影响是出血(这是因为整联蛋白在止血中是重要的)。

概述

本发明提供抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间结合相互作用的化合物。如本文中进一步讨论，在示例性实施方案中，所述化合物采用抗体或抗体类似物、肽或肽类似物的形式。因此，本发明提供抗体、抗体类似物、肽和肽类似物。

本发明还提供了包含抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间结合相互作用的化合物的组合物，如药物组合物。本文也提供了包括一种或多种本发明化合物的试剂盒。

还提供了使用本发明的化合物和组合物的方法。例如，本发明提供了抑制细胞中整联蛋白与G蛋白亚基之间结合相互作用的方法。所述方法包括使细胞与有效抑制结合相互作用的量的本发明的化合物或组合物接触的步骤。

本发明还提供了在细胞中抑制整联蛋白依赖性Src激活的方法。所述方法包括了使细胞与有效抑制Src激活的量的本发明的化合物或组合物接触的步骤。

本发明还提供了激活GTP酶的方法。所述方法包括使G蛋白亚基与有效激活GTP酶的量的化合物或组合物接触的步骤。

本发明还提供了抑制细胞铺展或迁移的方法。所述方法包括使细胞与有效抑制铺展和迁移的量的本发明的化合物或组合物接触的步骤。

本发明还提供了抑制血小板粘附的方法。所述方法包括使血小板与有效抑制血小板粘附的量的本发明的化合物或组合物接触的步骤。本发明还提供了抑制血小板颗粒分泌和血小板聚集的方法。所述方法包括使血小板与有效抑制颗粒分泌和聚集的量的本发明的化合物或组合物接触的步骤。

此外涵盖了本发明的化合物和组合物以用于治疗目的。例如，本发明的化合物和组合物可用于在有需要的个体中增强血块凝缩或抑制血栓形成。因此，本发明提供在在有需要的个体中增强血块凝缩的方法。所述方法包括向个体给予有效增强血块凝缩的量的本发明的化合物或组合物的步骤。还提供了在有需要的个体中抑制血栓形成的方法。所述方法包括向个体给予有效抑制血栓形成的量的本发明的化合物或组合物的步骤。

由于血栓形成在中风和心脏病发作中起作用，本发明提供了在有需要的个体中治疗或预防中风或心脏病发作的方法。所述方法包括向个体给予有效治疗或预防中风或心脏病发作的量的本发明的化合物或组合物的步骤。

由于本文提供的化合物和组合物涉及协同的细胞铺展-收缩过程，其进而在细胞迁移中是重要的，本发明还提供了抑制肿瘤细胞转移的方法。所述方法包括使肿瘤细胞与有效抑制转移的量的本发明的化合物或组合物接触的步骤。还涵盖了用于抑制血管生成的化合物和组合物。因此，本发明提供在有需要的个体中抑制血管生成的方法。所述方法包括向个体给予有效抑制血管生成的量的本发明的化合物或组合物的步骤。

由于转移和血管生成是癌症重要的方面，所以本发明还提供了在有需要的个体中治疗或预防癌症的方法。所述方法包括向个体给予有效治疗或预防癌症的量的本发明的化合物或组合物的步骤。

本文提供的化合物和组合物还可用于影响白细胞功能。本发明因此提供了抑制白细胞粘附、铺展、迁移或趋化性的方法。所述方法包括使白细胞与有效抑制白细胞粘附、铺展、迁移或趋化性的量的本发明的化合物或组合物接触的步骤。由于这些白细胞功能与炎症相关，所以本发明另外提供了在有需要的个体中抑制或治疗炎症的方法。所述方法包括向个体给予有效抑制或治疗炎症的量的本发明的化合物或组合物的步骤。

附图简述

图1表明了Gα₁₃在整联蛋白由外向内信号转导中的作用。(A)在纤维蛋白原上铺展乱序siRNA对照血小板，或在Y27632存在或不存在的情况下去Gα₁₃血小板(Gα₁₃-siRNA)的共焦显微图像。合并的EGFP(绿色)荧光和Alex Fluor 546-缀合的鬼笔环肽(红色)荧光。(B)来自用对照siRNA-或Gα₁₃-siRNA-转染的骨髓干细胞接种的小鼠的血小板中的Gα₁₃丰度的蛋白质印迹比较。(C,D,E)使来自乱序siRNA-或Gα₁₃ siRNA-转染的干细胞的小鼠血小板粘附至固定纤维蛋白原，溶解及分析c-Src Tyr⁴¹⁶磷酸化和RhoA激活。

图2表明了Gα₁₃与β₃的结合和mSRI肽的抑制作用。(A)在1μM GDP、1μM GTP或30μMAlF₄ ^-存在或不存在的情况下，使来自血小板裂解物的蛋白与对照IgG或Gα₁₃的抗体免疫沉淀。使免疫沉淀物与抗-Gα₁₃或抗-β₃(MAb15)免疫印迹。参见图S4定量。(B)使来自血小板裂解物的蛋白质与对照小鼠IgG、抗-α_IIbβ₃(D57(24))或糖蛋白Ib的抗体(GPIb)免疫沉淀。使免疫沉淀物与抗-Gα₁₃、抗-β₃或抗-GPIb抗体免疫印迹。(C，D)在存在或不存在1μM GDP、1μMGTPγS或30μM AlF₄ ^-的情况下，将结合至谷胱甘肽珠的经纯化的GST-β₃CD(C)或GST-b1CD(D)与经纯化的Gα₁₃混合。将结合的蛋白用抗-Gα₁₃进行免疫印迹。定量数据显示为平均值±SD和p值(t-检验)。(E)将对照血小板或在0.025U/ml凝血酶的不存在或存在下粘附至纤维蛋白原的血小板的裂解物用抗-Gα₁₃进行免疫沉淀，然后用MAb15进行免疫印迹。定量数据显示为平均值±SD和值(t-检验)。(F)将转染有Flag-标记的野生型Gα₁₃或指定的截短突变型的293FT细胞的裂解物(参见图S5)用GST-β₃CD-或GST-结合的谷胱甘肽珠沉淀。将珠-结合蛋白用抗-Flag(结合的)进行免疫印迹。裂解物中Flag-标记的蛋白的量通过抗-Flag免疫印迹(输入)显示。(G)将来自用0.1％DMSO、250μM乱序对照肽(Ctrl)或mSRI处理的血小板裂解物的蛋白，用抗-Gα₁₃进行免疫沉淀。将免疫沉淀物用抗-Gα₁₃或抗-β₃进行免疫印迹。参见图S4定量。

图3表明了mSRI对整联蛋白-诱导的c-Src磷酸化、RhoA活性和血小板铺展的影响。(A)使用DMSO、mSRI或乱序对照肽预处理的经洗涤的人血小板粘附至纤维蛋白原，然后在指定时间点溶解。将来自裂解物的蛋白质用在Tyr⁴¹⁶处被磷酸化的c-Src、c-Src或RhoA的抗体进行免疫印迹。通过与GST-RBD珠缔合测量GTP-结合的RhoA(25)。参见图S4的定量数据。(B)在不存在或存在C3毒素、Y27632或0.01U/ml凝血酶下，用0.1％DMSO、乱序对照肽或mSRI处理的血小板的铺展。将血小板用Alexa Fluor 546-缀合的鬼笔环肽染色。

图4表明了Gα₁₃在血块凝缩和动态RhoA调控中的作用。(A)与DMSO和乱序肽相比，250μM mSRI肽对人富含血小板的血浆的血块凝缩的影响。使用Image J对血块尺寸进行定量(平均值±SD，n＝3，t检验)。(B)由对照siRNA血小板和去Gα₁₃的血小板介导的血块凝缩的比较(平均值±SD，n＝3，t检验)。(C、D、E、F)将血小板用具有或不具有2mM RGDS的凝血酶刺激，并监测由形状变化和聚集所导致的血小板悬浮液的浊度变化(C)。然后将血小板在指定的时间点溶解，并通过免疫印迹分析与Gα₁₃共免疫沉淀的β₃的量(D)和结合至GST-RBD珠的GTP-RhoA的量(E)。(F)3次实验的定量数据(平均值±SD)。(G)说明Gα₁₃依赖性动态RhoA调控，以及GPCR与整联蛋白信号转导之间的串扰的示意图。

图5表明了由慢病毒感染的骨髓干细胞的辐射和移植进行的血小板替换的效率。高剂量辐射和移植感染有乱序siRNA-或Gα₁₃-特异性siRNA#1-编码慢病毒的骨髓干细胞之后五周，从接受者小鼠分离血小板并使其粘附至固定纤维蛋白原。使用Zeiss LSM 510META共聚焦显微镜对血小板成像。绿色：EGFP荧光，表明血小板来源于移植干细胞。红色：Alexa Fluor 546-缀合的鬼笔环肽染色，表明总血小板。

图6表明了两种不同的Gα₁₃ siRNA对血小板铺展、c-Src激活和RhoA活性的类似影响，及阿司匹林对血小板铺展的影响。(A)转染有乱序siRNA、Gα₁₃ siRNA#1-和Gα₁₃ siRNA#2的在固定纤维蛋白原上铺展的小鼠血小板的共焦显微图像。合并的EGFP绿色荧光和AlexaFluor 546-缀合的鬼笔环肽红色荧光。(B)使乱序siRNA、Gα₁₃ siRNA#1-和Gα₁₃ siRNA#2-转染的血小板粘附至固定纤维蛋白原持续指定的时间，并分析c-Src激活和RhoA活性。注意两种不同的siRNA类似地抑制了血小板铺展和c-Src激活，并加速了RhoA的激活。(C)将小鼠血小板在室温下在存在或不存在1mM阿司匹林的情况下预孵育30分钟，并使其在固定纤维蛋白原上铺展。

图7表明了Gα₁₃ siRNA对表达整联蛋白α_IIbβ₃的CHO细胞中的细胞铺展和c-Src磷酸化的抑制作用，及其由Gα₁₃的siRNA-抗性突变型拯救。将表达整联蛋白α_IIbβ₃的稳定CHO细胞系(123细胞)用编码EGFP的cDNA构建体和乱序对照siRNA或Gα₁₃ siRNA(在存在或不存在共转染Gα₁₃ cDNA构建体的Flag-标记的siRNA-抗性突变型(Flag-G13-Mut1)的情况下)转染。(A)将细胞溶解并用抗-Gα₁₃抗体、抗-Flag(用于检测Flag-标记的Gα₁₃)和微管蛋白的抗体(上样对照)进行免疫印迹。(B)将细胞涂铺在纤维蛋白原-涂覆的表面上持续各种时长，溶解，并且对裂解物进行免疫印迹以得到Y416处的c-Src磷酸化来指示c-Src激活，或者得到c-Src的总量。(C)将粘附至纤维蛋白原的细胞用Alexa Fluor 633-标记的鬼笔环肽(人工蓝色)和Alexa Fluor 546-缀合的抗-Flag抗体(红色)染色，并使用Zeiss LSM 510 META共聚焦显微镜成像。成功转染有siRNA构建体的细胞表达EGFP并因此显示出绿色荧光。注意Gα₁₃ siRNA抑制了整联蛋白依赖性c-Src激活和细胞在纤维蛋白原上的铺展，这可通过表达Flag-G13-Mut1拯救。

图8提供了图2和3所示实验的定量数据。(A)图2A的定量数据，显示β₃与Gα₁₃的免疫共沉淀被GTP和AlF4^-增强。(B)图2G的定量数据，显示mSRI抑制β₃与Gα₁₃的免疫共沉淀。(C和D)图3A的定量数据，显示mSRI抑制了c-Src激活(C)和加速了RhoA激活(D)。所有数据表达为来自3个实验的平均值±SD。使用学生t检验来确定统计显著性。

图9代表了具有指定转换区的Gα₁₃的示意图。开发两种Gα₁₃截短突变型以对β₃结合位点作图(参见图2F)：(1)编码缺乏转换区I的含残基1-196的Gα₁₃片段的突变型，和(2)编码含转换区I的Gα₁₃片段(残基1-212)的突变型。

图10提供了血块凝缩典型图，其显示了mSRI和Gα₁₃-敲低对血小板-介导的血块凝缩的影响。(A)与DMSO和乱序肽相比，250μM mSRI肽对人富含血小板的血浆的血块凝缩的影响。定量数据示于图4A中。(B)由对照siRNA血小板和Gα₁₃-敲低血小板介导的血块凝缩的比较。定量数据示于图4B中。

图11表明了整联蛋白β₃细胞质结构域中的Gα₁₃结合位点。(A)各种人整联蛋白β亚基的细胞质结构域的氨基酸序列比对。Gα₁₃结合中重要的关键序列被标记为红色。合成对应于β₃的Gα₁₃结合区的合成肽。(B)将来自表达类似水平的野生型和截短整联蛋白β₃的CHO细胞的裂解物用抗-Gα₁₃抗体或等量的对照兔IgG进行免疫沉淀。将裂解物和免疫沉淀物用抗-Gα₁₃或抗-β₃(MAb15)抗体进行免疫印迹。(C)将来自表达野生型或突变型β₃的CHO细胞的裂解物用抗-Gα₁₃抗体或等量的对照兔IgG进行免疫沉淀。将免疫沉淀物用抗-Gα₁₃或抗-β₃(MAb15)单克隆抗体进行免疫印迹。(D)β₃ ^-/-血小板和在纤维蛋白原上铺展的表达野生型或AAA-突变型整联蛋白β₃的β₃ ^-/-血小板的共焦显微图像。(E)转染有与野生型α_IIb复合的野生型和AAA(E^731-733至丙氨酸)突变型整联蛋白β₃的β₃ ^-/-小鼠血小板中的β₃表达水平的流式细胞术分析。β₃ ^-/-血小板用作阴性对照。(b)

在图12中，(A)使表达野生型或AAA突变型α_IIbβ₃的CHO细胞铺展在纤维蛋白原表面上。(B)使野生型或AAA-突变型α_IIbβ₃-表达CHO-1b9细胞粘附至固定纤维蛋白原，溶解并分析RhoA激活和c-Src Tyr⁴¹⁶磷酸化。(C)如(d)所示的RhoA活性和c-Src Tyr⁴¹⁶磷酸化的定量(平均值±SD，3个实验)。(D)PAR4AP-诱导的俄勒冈绿-标记的纤维蛋白原结合至来自骨髓-移植的β₃ ^-/-小鼠的野生型或AAA-突变型α_IIbβ₃-表达血小板的流式细胞术分析。β₃ ^-/-血小板用作阴性对照。

图13表明了对整联蛋白中的Gα₁₃结合基序的鉴定。(A)用500μM对照肽、mP₁₃、mP₇或mP₅肽处理血小板，然后用抗-Gα₁₃抗体或等量的对照兔IgG进行免疫沉淀。将裂解物和免疫沉淀物用抗-Gα₁₃或抗-β₃(MAb15)抗体进行免疫印迹。(B)用DMSO、Myr-乱序肽或mP₅肽处理的人血小板粘附至固定纤维蛋白原，溶解并分析RhoA激活和c-Src Tyr⁴¹⁶磷酸化。(C)用DMSO、肉豆蔻酰化乱序肽处理的血小板，和在不存在或存在Rho激酶抑制剂Y27632的情况下用mP₅肽处理30分钟的粘附至纤维蛋白原的血小板的共焦显微图像。合并的整联蛋白β₃(绿色)荧光和Alexa Fluor 546-缀合的鬼笔环肽(红色)荧光。(D)PAR4AP(50μM)-诱导的俄勒冈绿标记的纤维蛋白原结合至用DMSO、250μM Myr-乱序肽或250μM mP₅肽预处理的人血小板的流式细胞术分析。(E)将血小板与mP5或乱序对照预孵育，然后在血小板凝集计中在37℃下用凝血酶刺激。记录血小板聚集迹线。

图14表明了整联蛋白由外向内和由内向外信号转导被mP₁₃肽抑制。(A)粘附在纤维蛋白原上的用250μM肉豆蔻酰化乱序对照肽、250μM mP₁₃肽预处理的人血小板的荧光显微图像。(B)PAR4AP(50μM)-诱导的俄勒冈绿标记的纤维蛋白原结合至用DMSO、150μM Myr-乱序肽或150μM mP₁₃肽预处理的人血小板的流式细胞术分析。

图15表明了整联蛋白β₃-CD的EEE基序对于Gα₁₃结合和细胞铺展很重要。(A)人工比对人整联蛋白细胞质结构域序列。将保守的ExE基序以红色突出显示。将保守的NxxY和HDR[R/K]基序以粗体突出显示。根据美国国家生物技术信息中心(NCBI)序列对残基编号。在该研究中开发的肽抑制剂的序列显示在相应的β₃细胞质结构域序列的下方。(B)将来自截短的整联蛋白β₃-稳定表达123细胞的裂解物用抗-Gα₁₃抗体或等量的正常兔IgG(作为对照)沉淀。将免疫沉淀物用抗-Gα₁₃或抗-β₃(M15)抗体进行免疫印迹。(C)将E至A突变型整联蛋白β₃-稳定表达123细胞的裂解物用抗-Gα₁₃抗体或等量的正常兔IgG(作为对照)沉淀。将免疫沉淀物用抗-Gα₁₃或抗-β₃(M15)抗体进行免疫印迹。(D)在纤维蛋白原铺展的β₃ ^-/-对照血小板或表达野生型或AAA-突变型整联蛋白β₃的血小板的共焦显微图像。合并的整联蛋白β₃(绿色)荧光和Alex Fluor 546-缀合的鬼笔环肽(红色)荧光。(E)野生型和AAA-突变型整联蛋白β₃表达水平的流式细胞术分析。人血小板和β₃ ^-/-血小板用作阳性和阴性对照。

图16表明了AAA突变造成增加的RhoA活性和降低的c-Src活性而不影响整联蛋白由内向外信号转导。(A)使野生型或AAA-突变型123细胞粘附至固定纤维蛋白原，溶解并分析RhoA激活和c-Src Tyr⁴¹⁶磷酸化。(B)用于A的RhoA活性的定量。(C)用于A的c-Src Tyr⁴¹⁶磷酸化的定量。(D)将来自野生型或AAA-突变型整联蛋白β₃-稳定表达123细胞的裂解物用抗-c-Src抗体或等量的正常兔IgG(作为对照)沉淀。将免疫沉淀物用抗-v-Src或抗-p190RhoGAP抗体进行免疫印迹。(E)用于D的c-Src结合的pl90RhoGAP的定量。(F)将来自野生型或AAA-突变型整联蛋白β₃-稳定表达123细胞的裂解物用抗-pl15RhoGEF抗体或等量的正常小鼠IgG(作为对照)沉淀。将免疫沉淀物用抗-Gα₁₃或抗-p115RhoGEF抗体进行免疫印迹。(G)用于F的p115RhoGEF结合的Gα₁₃的定量。(H)由Par₄-诱导的野生型和AAA-突变型整联蛋白β₃-表达血小板纤维蛋白原结合能力的流式细胞术分析。人血小板和β₃ ^-/-血小板用作阳性和阴性对照。

图17表明了由于RhoA活性增加和c-Src活性降低而不影响整联蛋白由内向外信号转导，Myr-P₅肽抑制了血小板聚集和铺展。(A)用DMSO、Myr-乱序或Myr-P₅肽处理的人血小板粘附至固定纤维蛋白原，溶解并分析RhoA激活和c-Src Tyr⁴¹⁶磷酸化。(B)用于A的RhoA活性的定量。(C)用于A的c-Src Tyr⁴¹⁶磷酸化的定量。(D)将来自DMSO、Myr-乱序或Myr-P₅肽处理的血小板的裂解物用抗-Gα₁₃抗体或等量的正常兔IgG(作为对照)沉淀。将免疫沉淀物用抗-Gα₁₃或抗-β₃(M15)抗体进行免疫印迹。(E)用于D的Gα₁₃-结合的整联蛋白β₃的定量。(F)用DMSO、Myr-乱序或在不存在或存在Y27632的情况下Myr-P₅肽处理的在纤维蛋白原上铺展30分钟的血小板的共聚焦显微术图像。合并的整联蛋白β₃(绿色)荧光和Alex Fluor 546-缀合的鬼笔环肽(红色)荧光。(G，H)由Par₄诱导的DMSO、Myr-乱序或Myr-P₅肽处理的血小板纤维蛋白原结合能力的流式细胞术分析。肽浓度为150μM(对于G)、250μM(对于H)。(I)200μMMyr-P₅肽抑制了由凝血酶诱导的血小板聚集。

图18表明了踝蛋白头不能拯救在纤维蛋白原上的AAA-突变型123细胞铺展-缺陷。(A，C)将结合至谷胱甘肽珠的经纯化的GST-β₃-CD与经纯化的Gα₁₃在纯化的踝蛋白的存在或不存在下混合。将结合的蛋白用抗-Gα₁₃或抗-踝蛋白抗体进行免疫印迹。定量数据显示为平均值±SD和p值(t检验)。(B，D)用于A和C的GST-β₃-CD结合的Gα₁₃或踝蛋白的定量。(E)将来自转染有踝蛋白头的123或AAA细胞的裂解物用抗-β₃兔血清(8053)或等量的预免疫血清沉淀。将免疫沉淀物用抗-Gα₁₃或抗-β₃抗体进行免疫印迹。(F)用于E的整联蛋白β₃-结合的踝蛋白的定量。

图19表明了整联蛋白β₃的EEE基序对介导细胞在固定纤维蛋白原上铺展很重要。(A)用媒介物(PBS)、乱序肽或P13肽预处理的经洗涤的人血小板在固定纤维蛋白原上铺展1小时。将血小板用Alexa Fluor 546-缀合的鬼笔环肽染色。(B)123细胞或E至A-突变型细胞在纤维蛋白原铺展1小时的显微图像。合并的整联蛋白β₃(绿色)荧光和踝蛋白头(红色)荧光。

图20表明了P₅肽对血小板铺展和聚集的影响。(A)在纤维蛋白原上铺展60分钟的经DMSO、Myr-乱序或Myr-P₅处理的血小板的共焦显微图像。合并的整联蛋白β₃(绿色)荧光和Alex Fluor 546-缀合的鬼笔环肽(红色)荧光。(B，C)30μM Myr-P₅肽抑制了由凝血酶诱导的人(B)和小鼠(C)血小板聚集。

图21A代表了一组使用β₃、踝蛋白或Gα₁₃特异性抗体的蛋白质印迹。将用DMSO、500μM mP13、mP5或相应的对照肽处理的血小板用0.025U/ml凝血酶在22℃下刺激，溶解并用抗-β₃或预免疫兔血清进行免疫沉淀。将裂解物和免疫沉淀物用抗-Gα₁₃、抗-踝蛋白或抗-β₃抗体进行免疫印迹。

图21B代表了PAR4AP(50μM)-诱导的俄勒冈绿标记的纤维蛋白原结合至用DMSO、250μM Myr-乱序肽或250μM mP5(上图)预处理或者用DMSO、150μM Myr-乱序肽或150μMmP13(下图)预处理的人血小板的流式细胞术(flow cytometrical)分析的一组图。

图21C代表了一组在纤维蛋白原铺展1小时的鬼笔环肽-染色的人血小板的荧光显微图像。将血小板用0.05％DMSO、250μM肉豆蔻酰化mP5、mP13或相应的对照肽在室温下预处理5分钟。

图21D代表了用mP₅或mP₁₃(250μM)或它们各自的乱序肽处理的血小板的粘附至固定纤维蛋白原的静息血小板％的图(平均值±SD，n＝3，*p<0.001)。

图22是描绘用当前整联蛋白拮抗剂对比由外向内信号抑制剂处理的血管损伤时由内向外和由外向内信号转导差异的图示。

图23是描绘整联蛋白的信号转导通路的图示。

图24代表一组描绘当用mP5肽或其乱序对照肽处理时血小板ATP分泌(顶部)和％血小板聚集(底部)差异的图。

图25是胶束的图示。

图26代表了用Integrillin或盐水对照处理的小鼠中的尾出血时间的图。指出了中位值。

图27代表了用0.1U凝血酶刺激并与溶解于DMSO的FEEERA(SEQ ID NO:87)肽或其对照乱序肽的血小板进行的ATP分泌的图。

图28代表了用EXE基序肽或乱序肽对照处理的小鼠的阻塞时间的图。

图29代表了血小板聚集的比浊测量的图，显示在胶束形式的肽对比溶解于DMSO中的肽中抑制血小板聚集所需的EXE基序肽FEEERA(SEQ ID NO:87)的剂量。

图30A代表了包括各种剂量的mP5或SEQ ID NO:87的肽的抑制血小板聚集能力得分的表。

图30B代表了一组描绘mP5肽、mP5的乱序对照、SEQ ID NO:87的肽或其乱序对照的血小板聚集迹线的图。

图31表明了踝蛋白和Gα₁₃与β₃的相互排斥结合性质。(a)人β₃细胞质结构域的序列及其与其它β亚基的比对，显示踝蛋白、kindlin和c-Src的保守ExE基序和结合位点。(b)使用抗-β₃或对照预免疫兔血清进行的Wt和截短突变型β₃与Gα₁₃和踝蛋白的免疫共沉淀。将免疫沉淀物和CHO细胞裂解物(免疫沉淀中所用的10％)用指定的抗体进行免疫印迹(IB)。(c)经纯化的重组Gα₁₃与谷胱甘肽珠-结合的谷胱甘肽S-转移酶(GST)、GST-β₁细胞质结构域融合蛋白(GST-β₁CD)、GST-β₂CD、GST-β₃CD或GST-β₈CD的结合。(d)使用抗-β₃或预免疫兔血清进行的CHO细胞-表达的Wt或ExE基序突变的β₃与Gα₁₃和踝蛋白的免疫共沉淀。(e)用编码THD的cDNA转染之后CHO细胞-表达的整联蛋白α_IIbβ₃与Gα₁₃和THD的免疫共沉淀。(f，g)通过增加Gα₁₃(f)或THD(g)的浓度抑制THD(20nM)(f)或Gα₁₃(40nM)(g)结合至固定的GST-β₃CD蛋白(Wt和阴性对照突变型)。使用抗-Gα₁₃或抗-踝蛋白检测结合的Gα₁₃或THD。

图32表明了踝蛋白和Gα₁₃结合至β₃的动力学，及踝蛋白在整联蛋白信号转导中的作用。(a，b和c)在存在或不存在2mM整联蛋白抑制剂RGDS的情况下，用0.025U/mlα-凝血酶(在凝集计中)刺激人血小板，在各时间点溶解，用抗-β₃或预免疫兔血清进行免疫沉淀，及进行Gα₁₃、踝蛋白和β₃(在E.D.图3d中的额外对照)的免疫印迹。(a)典型的免疫印迹。(b)免疫印迹的定量(平均值±SD，3个实验)。(c)表明整联蛋白依赖性血小板聚集的浊度变化。(d)Wt和踝蛋白-1^-/-小鼠血小板中的踝蛋白-1的免疫印迹。(e)在存在或不存在1mM MnCl₂或0.3μg/ml LIBS6的情况下，在20μg/ml纤维蛋白原的存在下用5μM ADP刺激的Wt和踝蛋白-1^-/-血小板的聚集。(f)在存在或不存在1mM MnCl₂或0.18μg/ml LIBS6的情况下，未刺激的小鼠血小板粘附至固定纤维蛋白原1小时(定量为负载的血小板的百分比，平均值±SD，n＝4，*p<0.001)。(g)在存在或不存在1mM MnCl₂或0.18μg/ml LIBS6的情况下，鬼笔环肽-染色的小鼠血小板在纤维蛋白原上铺展1小时的图像(在E.D.图4e中定量)。

图33表明了Gα₁₃-ExE结合在整联蛋白由外向内信号转导中的选择作用。(a)在来自移植有Wt或AAA-突变型β₃-转染的骨髓干细胞的β₃ ^-/-小鼠的血小板中的β₃表达的流式细胞术分析。β₃ ^-/-血小板用作阴性对照。(b)用0.025U/mlα-凝血酶刺激表达Wt或AAA突变型β₃的小鼠血小板，在各个时间点溶解、用抗-β₃或预免疫兔血清进行免疫沉淀，及进行Gα₁₃、踝蛋白和β₃的免疫印迹。(c)俄勒冈绿-标记的纤维蛋白原与Wt或AAA-突变型α_IIbβ₃-表达血小板的PAR4AP-诱导的结合，而β₃ ^-/-血小板作为阴性对照。(d)在纤维蛋白原上铺展的β₃ ^-/-血小板和表达Wt或AAA-突变型β₃的β₃ ^-/-血小板的共聚焦图像，及表面积定量(平均值±SE)。合并的抗-β₃(绿色)和Alexa Fluor 546-缀合的鬼笔环肽(红色)荧光。(e)在CHO-1b9细胞中表达的Wt或β₃E731-733A(AAA)突变型α_IIbβ₃的流式细胞术分析。(f)在纤维蛋白原上铺展的(45分钟)鬼笔环肽(红色)/抗-β₃(绿色)-双染色的Wt和AAA-突变型α_IIbβ₃-表达CHO细胞的共聚焦图像。(g)粘附至纤维蛋白原的Wt或AAA-突变型α_IIbβ₃-表达CHO-1b9细胞中的RhoA激活和c-Src Tyr416磷酸化(平均值±SD，n＝3)。

图34表明了不引起出血的新型抗-血栓药。(a)与乱序相比，在凝血酶-刺激的血小板中，500μM mP₁₃、mP₆或mP₅对β₃与Gα₁₃或踝蛋白的免疫共沉淀的影响(也可参见E.D.图7)。(b)铺展在固定纤维蛋白原(1小时)上的用100μM mP₆或mP₆Scr处理的鬼笔环肽(红色)/抗-β₃(绿色)-双染色的人血小板的共聚焦图像。(c)PAR4AP-诱导的俄勒冈绿-标记的纤维蛋白原结合至用DMSO或100μM mP₆Scr或mP₆预处理的人血小板。(d)如与乱序肽相比，mP₆和mP₁₃(250μM)对静息血小板粘附至固定纤维蛋白原的影响(平均值±SD，n＝4)。(e)在存在或不存在1mM锰的情况下，mP₆或mP₁₃(250μM)对富含人血小板的血浆的血块凝缩的影响(平均值±SD，n＝3)。(f)10μM mP₆或mP₆Scr胶束对由0.03U/ml凝血酶所诱导的血小板聚集的影响。(g)mP₆胶束(5μmol/kg)与Integrilin(12μmol/kg)及它们各自对照在小鼠中抑制激光-诱导的小动脉血栓形成方面的比较。显示了损伤后60秒处的代表性图像。血小板血栓由DyLight 649-标记的非封闭性大鼠抗-小鼠GPIbβ(红色)显示。(h)(g)的定量。血栓形成期间3只小鼠的30个损伤位点处的中位整体血小板荧光(integrated plateletflurorescence)(F_血小板)。(i)mP₆(5μmol/kg)与Integrilin(5μmol/kg)及它们各自对照在小鼠中抑制FeCl₃-诱导的颈动脉血栓形成方面的比较。(j)mP₆(5μmol/kg)与Integrilin(5μmol/kg)及对照的小鼠尾出血时间分析的比较。

图35代表了显示整联蛋白由外向内信号转导的选择性抑制剂如何作为抗-血栓药的示意图。蓝色箭头指示了受到抑制的步骤。

图36表明了保守的ExE基序在整联蛋白与Gα₁₃相互作用中的重要性。(a和b)将来自表达类似水平的野生型(Wt)α_IIbβ₃、与Wtα_IIb复合的β₃C-末端截短突变型(D759、D741、D728和D715)(a)及与Wtα_IIb复合的β₃ExE基序突变型(E731A、E732A、E733A和EEE至AAA)(b)的CHO细胞的裂解物用抗-Gα₁₃抗体或等量的对照兔IgG进行免疫沉淀。将免疫沉淀物和裂解物(用于免疫沉淀的10％当量)用抗-Gα₁₃和抗-β₃抗体进行免疫印迹。(c和d)将固定在谷胱甘肽-涂覆的微量滴定孔中的GST-β₃CD(Wt)或GST-β₃AAACD(AAA突变型)蛋白与增加浓度的Gα₁₃(c)或增加浓度的踝蛋白头结构域(THD)(d)孵育。洗涤后，将结合的Gα₁₃和THD分别使用抗-Gα₁₃或抗-踝蛋白(小鼠IgG用作特异性对照)检测，然后用二级HRP-标记的抗-IgG抗体检测。(e)除了AAA突变之外，将EEE至DED和EEE至QSE的保守突变(如在β₅中存在的那样)引入β₃细胞质结构域。将这些突变型与Wtα_IIb共转染至CHO细胞中，其被分选以获得与Wtα_IIbβ₃-表达细胞相当的表达水平(如E.D.图4e中所示)。将来自这些细胞的裂解物用抗-β₃或等量的预免疫兔血清进行免疫沉淀。将裂解物(10％)和免疫沉淀物用抗-Gα₁₃或抗-β₃进行免疫印迹。(f)将来自人血小板(用或不用0.025u/ml凝血酶刺激)的裂解物用抗-Gα₁₃抗体或等量的对照兔IgG进行免疫沉淀。将免疫沉淀物用抗-Gα₁₃和抗-β₁抗体进行免疫印迹。Gα₁₃与β₁缔合，这在凝血酶刺激之后显著增加。

图37表明了配体占位诱导整联蛋白α_IIbβ₃从踝蛋白-结合状态转换到Gα₁₃-结合状态。(a)为了确定整联蛋白激活和配体占位对Gα₁₃-β₃缔合的影响，将人血小板在存在或不存在1mM MnCl₂的情况下，与30μg/ml纤维蛋白原在22℃下孵育5分钟。然后将血小板裂解物用抗-β₃或预免疫兔血清进行免疫沉淀。将裂解物(10％)和免疫沉淀物用抗-β₃或抗-Gα₁₃进行免疫印迹。(b，c)将经洗涤的人血小板在添加或不添加2mM EDTA(整联蛋白配体结合功能的抑制剂)的情况下用0.025U/mlα-凝血酶刺激，在37℃下搅拌(1000rpm)，在各个时间点溶解，并用抗-β₃或等量的预免疫兔血清进行免疫沉淀。将裂解物(10％)和免疫沉淀物用抗-Gα₁₃、抗-踝蛋白或抗-β₃抗体进行免疫印迹。(b)蛋白质印迹结果。(c)血小板混悬液的浊度变化，表明整联蛋白依赖性血小板聚集。注意EDTA对踝蛋白解离和Gα₁₃结合至β₃的抑制作用。(d)作为图2a的另外对照以排除血小板裂解物中的踝蛋白和β₃显著损失是由于在整联蛋白信号转导期间的不溶级分所导致的可能性，将经洗涤的人血小板用0.025U/mlα-凝血酶在不存在或存在2mM整联蛋白抑制剂RGDS的情况下刺激，在37℃下搅拌(1000rpm)，然后在各个时间点溶解，如在图2a中那样。将溶解的血小板以14,000g离心10分钟以将裂解物从不溶沉淀中分离。将沉淀溶解于SDS样品缓冲液中至与用2倍SDS样品缓冲液以1：1稀释后的裂解物相同的体积，然后用抗-β₃和抗-踝蛋白抗体进行免疫印迹。注意踝蛋白和β₃在血小板裂解物中的水平在血小板聚集期间基本保持恒定，并且在用于刺激血小板的低浓度的凝血酶的存在下，极少的不溶β₃和踝蛋白存在于沉淀中，其仅可在延长的暴露(与10秒正常暴露时间相比，5分钟暴露)之后检测到并且在血小板聚集期间没有显著变化。

图38表明了shRNA-诱导的踝蛋白敲低和踝蛋白敲除对整联蛋白信号转导的影响。(a)在源自对照shRNA-或踝蛋白-shRNA-转染的骨髓干细胞的小鼠血小板中踝蛋白-1表达水平的蛋白质印迹比较。还显示了Gα₁₃和整联蛋白β₁及β₃的蛋白质印迹。(b)未刺激的小鼠血小板粘附至固定纤维蛋白原1小时。将粘附血小板定量为负载的总血小板的百分比(平均值±SD，n＝4)。(c)用5μM ADP在存在或不存在1mM MnCl₂的情况下在20μg/ml纤维蛋白原的存在下刺激的小鼠血小板混悬液的浊度变化，如使用凝集计测试。(d)在存在或不存在1mMMnCl₂的情况下，在纤维蛋白原上铺展1小时的鬼笔环肽-染色的小鼠血小板的荧光显微镜图像。(e)如图2g所述的各个粘附的血小板的表面积的定量(平均值±SE)。

图39表明了在血小板中AAA突变对整联蛋白由外向内信号转导的影响。(a)与C57BL/6小鼠血小板相比，使用骨髓干细胞移植技术转染有Wt或AAA突变型β₃的β₃ ^-/-小鼠血小板中整联蛋白α_IIb/β₃表达水平的流式细胞术分析。β₃ ^-/-血小板用作阴性对照。使用抗-小鼠α_IIb抗体检测α_IIbβ₃复合物。(b)将如在(a)中的表达重组Wt或AAA突变型β₃的小鼠血小板裂解并用抗-β₃或等量的预免疫兔血清进行免疫沉淀。将裂解物(10％)和免疫沉淀物用抗-Src或抗-β₃抗体进行免疫印迹。(c和d)鬼笔环肽-染色的Wt血小板(EEE)、AAA突变型血小板和与mP₆Scr或mP₆孵育的AAA突变型血小板在固定纤维蛋白原上铺展1小时。(c)典型的荧光显微镜图像。(d)各个血小板的表面积的定量(平均值±SE)。

图40表明了ExE基序的突变破坏对整联蛋白由外向内信号转导的影响。(a)与Wtα_IIb在CHO细胞中复合的Wt或ExE基序(QSE、DED或AAA)突变型β₃的表达水平，如通过流式细胞术所测定。小鼠IgG用作阴性对照。(b，c)表达Wtα_IIbβ₃及QSE、DED或AAA突变型α_IIbβ₃的CHO-1b9细胞在纤维蛋白原上铺展1小时。(b)各个细胞(平均值±SE)的表面积的定量。(c)典型的显微镜图像。(d)CHO细胞中表达的Wt α_IIbβ₃、AAA或Y747A突变型α_IIbβ₃的流式细胞术分析。小鼠IgG用作对照。(e)将在不存在(上图)或存在(下图)重组THD的共表达的情况下表达Wt、AAA或Y747A β₃的CHO细胞溶解，并用抗-β₃或预免疫血清进行免疫沉淀。将10％裂解物和免疫沉淀物用抗-踝蛋白、抗-Gα₁₃或抗-β₃抗体进行免疫印迹。(f)图3g的典型蛋白质印迹。使Wt或AAA-突变型α_IIbβ₃-表达CHO-1b9细胞粘附至固定纤维蛋白原，在各时间点溶解，并分析RhoA激活和c-Src Tyr416磷酸化。

图41表明了mP₆选择性抑制整联蛋白由外向内信号转导而不影响由内向外信号转导。(a，b，c和d)将经洗涤的人血小板用0.025U/mlα-凝血酶在不存在或存在250μM肉豆蔻酰化肽、mP₁₃(a，b)和mP₆(c，d)的情况下在搅拌(1000rpm)下在37℃下刺激，然后在各时间点溶解。将裂解物用抗-β₃兔血清或等量的预免疫血清进行免疫沉淀。将裂解物(10％)和免疫沉淀物用抗-Gα₁₃、抗-踝蛋白或抗-β₃抗体进行免疫印迹。(a，c)典型的蛋白质印迹结果。(b，d)血小板混悬液中典型的浊度变化，表明了整联蛋白依赖性血小板聚集。(e)在不存在或存在DMSO、mP₆Scr或mP₆处理的情况下，在固定纤维蛋白原上铺展1小时的人血小板的定量，如图4b所示(平均值表面积±SE)。(f)PAR4AP-诱导的俄勒冈绿标记的可溶纤维蛋白原结合至用增加浓度的PAR4激动剂肽(PAR4AP)刺激、用100μM mP₆Scr或100μM mP₆预处理的人血小板的流式细胞术分析。Integrilin-处理的血小板用作阴性对照。(g)100μM PAR4AP-诱导的PAC1结合至用100μM mP₆Scr或mP₆预处理的人血小板的流式细胞术分析。Integrilin-处理的血小板用作阴性对照。(h)PAR4AP-诱导的俄勒冈绿标记的可溶纤维蛋白原结合至用溶剂DMSO、mP₁₃Scr或mP₁₃预处理的人血小板的流式细胞术分析。静息血小板用作阴性对照。

图42表明了mP₆的体内作用：选择性抑制血栓形成但不抑制止血。(a)在亮场微血管组织学的情形下，通过输注缀合至DyLight 649的非封闭性大鼠抗-小鼠GPIbβ抗体呈现的激光-诱导的小鼠提睾肌小动脉血栓形成(红色)的代表性图像。在激光-诱导的小动脉壁损伤之前3分钟，向C57BL/6小鼠注射5μmol/kg胶束配制的mP₆或mP₆Src(阴性对照)、12μmol/kg Integrillin或缓冲液。白色箭头表明血流的方向。(b)在选定的时间点每次处理的30个血栓(在3只小鼠中呈现的)的平均血小板荧光强度(平均值±SE，n＝30，t检验)。mP₆-和Integrilin-处理的小鼠中的荧光是最小的。(c)mP₆(5μmol/kg)与相同剂量的Integrilin及它们各自对照在小鼠中FeCl₃-诱导的颈动脉血栓形成的阻塞时间方面的比较。显示了FeCl₃-诱导的阻塞性血栓形成的典型动脉血流图。(d)mP₆(5μmol/kg)与相同剂量的Integrilin和对照在小鼠尾部出血分析方面的比较。释放的血红蛋白水平用作评估失血的参数(平均值±SD，n＝10)。

图43表明了mP₆和mP₆Scr的血小板摄取，并且mP6对血像没有影响。(a)在与血小板孵育5分钟后，PDAM-缀合的mP₆和mP₆Scr的胞内水平的评估。通过离心沉淀血小板，并评估血小板裂解物中PDAM-缀合的肽的量(平均值±SD，n＝3)。(b)注射mP₆或mP₆Scr(5μmol/kg)之前或注射后1小时的小鼠全血的血像，显示没有显著差异。

图44是说明纤维蛋白原结合至血小板上整联蛋白的图的集合。将血小板在用PAR4刺激之前与肉豆蔻酰化肽mP5(P5)、mP6(P6)、mP7(P7)或mP13(P13)，或它们的乱序对应物(mP5Scr(P5Scr)、mP6Scr(P6Scr)、mP7Scr(P7Scr)或mP13Scr(P13Scr))或Integrilin预孵育。显示结合至静息血小板的纤维蛋白原(被标记为静息的线)，并将其用作基线对照。

图45是说明与肉豆蔻酰化肽mP6(P6)、mP7(P7)或mP13(P13)或它们的乱序对应物(mP6Scr(P6Scr)、mP7Scr(P7Scr)或mP13Scr(P13Scr))预孵育的血小板的凝血酶-刺激的血小板聚集的图的集合。

图46是说明血小板粘附至与肉豆蔻酰化肽mP6(P6)、mP7(P7)或mP13(P13)或它们的乱序对应物(mP6Scr(P6Scr)、mP7Scr(P7Scr)或mP13Scr(P13Scr))或HEPES缓冲液或Integrilin预孵育的血小板的固定纤维蛋白原的图。

详述

β整联蛋白与G蛋白α亚基之间结合相互作用的抑制剂

本文提供了抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间的蛋白质-蛋白质结合相互作用的化合物。本发明的化合物可被认为是β整联蛋白结合G蛋白α亚基的抑制剂和/或G蛋白α亚基结合β整联蛋白的抑制剂。在一些实施方案中，所述化合物是竞争性结合抑制剂。在某些方面，所述化合物结合至β整联蛋白中G蛋白α亚基结合的位点。在某些方面，所述化合物结合至G蛋白α亚基中的β整联蛋白结合的位点。在可选的实施方案中，所述化合物是非竞争性结合抑制剂。在某些方面，所述化合物抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间的结合相互作用，然而所述化合物结合至β整联蛋白中非G蛋白α亚基结合位点的位点，或者所述化合物结合至G蛋白α亚基非β整联蛋白结合位点的位点。

由本发明的化合物提供的抑制可能不是100％或完全抑制或终止β整联蛋白与G蛋白α亚基之间的结合相互作用。相反，存在各种程度的抑制被本领域的普通技术人员认为具有潜在的益处或治疗效果。在这一方面，本发明的化合物可抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间的结合相互作用至任何量或水平。在示例性实施方案中，所述化合物提供β整联蛋白与G蛋白α亚基之间的结合的至少或约10％的抑制(如，至少或约20％的抑制、至少或约30％的抑制、至少或约40％的抑制、至少或约50％的抑制、至少或约60％的抑制、至少或约70％的抑制、至少或约80％的抑制、至少或约90％的抑制、至少或约95％的抑制、至少或约98％的抑制)。在一些实施方案中，所述化合物完全终止β整联蛋白与G蛋白α亚基之间的结合相互作用，使得在从个体获得的样品中没有如通过例如免疫沉淀、蛋白质印迹、免疫组织化学等，检测到β整联蛋白-G蛋白α亚基结合复合物。

在本发明的一些实施方案中，所述化合物抑制野生型人β整联蛋白和野生型人G蛋白α亚基之间的结合相互作用。在示例性方面，野生型人G蛋白α亚基是野生型人Gα₁₂或野生型人Gα₁₃。在示例性方面，野生型人β整联蛋白是野生型人β_1A整联蛋白、野生型人β_1D整联蛋白、野生型人β₂整联蛋白、野生型人β₃整联蛋白、野生型人β₅整联蛋白、野生型人β₆整联蛋白或野生型人β₇整联蛋白。这些野生型人蛋白的氨基酸序列是本领域中已知的并且可从美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)网站的蛋白数据库中作为NCBI参考序列No.NP_006563.2(Gα₁₃)、NP_031379.2(Gα₁₂)、NP_002202(β_1A整联蛋白)、NP_391988(β_1D整联蛋白)、NP_000202(β₂整联蛋白)、NP_000203(β₃整联蛋白)、NP_002204.2(β₅整联蛋白)、NP_000879.2(β₆整联蛋白)和NP_000770.1(β₇整联蛋白)获得。所述氨基酸序列在本文中也作为SEQ ID NO:1-4和10-18提供。

在其它示例性实施方案中，所述化合物抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间的结合相互作用，其中β整联蛋白与G蛋白α亚基的一者或两者是非野生型，如突变型。例如，突变型β整联蛋白的氨基酸序列在一个或多个(如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或更多个)位置处不同于本领域公认的野生型人β整联蛋白(如，β_1A整联蛋白、β_1D整联蛋白、β₂整联蛋白、β₃整联蛋白、β₅整联蛋白、β₆整联蛋白、β₇整联蛋白)的氨基酸序列。在示例性方面，突变型β整联蛋白的氨基酸序列与野生型β整联蛋白的氨基酸序列约98％或更小(如，约95％或更小、约90％或更小、约85％或更小、约80％或更小、约75％或更小、约70％或更小、约65％或更小、约60％或更小、约55％或更小、约50％或更小)相同。此外，例如，突变型G蛋白α亚基的氨基酸序列在一个或多个(如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或更多个)位置处不同于本领域公认的野生型人G蛋白α亚基(如，Gα₁₂、Gα₁₃)的氨基酸序列。在示例性方面，突变型G蛋白α亚基的氨基酸序列与野生型G蛋白α亚基的氨基酸序列约98％或更小(如，约95％或更小、约90％或更小、约85％或更小、约80％或更小、约75％或更小、约70％或更小、约65％或更小、约60％或更小、约55％或更小、约50％或更小)相同。

在示例性方面，所述化合物是抗体、抗体类似物、肽、肽类似物(如，类肽、肽模拟物)、编码任一种抗体或肽的核酸分子或其类似物、或小分子化合物(如，基于本文所述的任何一种抗体或肽合理设计的小分子化合物)。

抗体及其类似物

在本发明的一些实施方案中，抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间结合相互作用的化合物包括抗体或其抗原结合片段。在本发明的一些实施方案中，抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间结合相互作用的化合物是抗体或其抗原结合片段。所述抗体可为本领域已知的任何类型的免疫球蛋白。在示例性实施方案中，所述抗体是同种型IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的抗体。此外，在一些实施方案中的抗体是单克隆抗体。在其它实施方案中，所述抗体是多克隆抗体。

在一些实施方案中，所述抗体是天然存在的抗体，如从如小鼠、兔、山羊、马、鸡、仓鼠、人等的哺乳动物分离和/或纯化的抗体。就此而言，所述抗体可被认为是哺乳动物抗体，如小鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、马抗体、鸡抗体、仓鼠抗体、人抗体等。产生天然存在的抗体的方法是本领域已知的，其中的一些方法在本文中于标题为“产生抗体的方法”一章中进一步描述。

在一些实施方案中，所述抗体是基因工程化抗体，如单链抗体、人源化抗体、嵌合抗体、CDR-接枝抗体、包括CDR序列中对β整联蛋白或G蛋白α亚基有特异性的部分的抗体、人工程化抗体、双特异性抗体、三特异性抗体等。基因工程技术还提供了在非人来源中制备完全人抗体的能力。

在一些方面，基因工程化抗体是对β整联蛋白或G蛋白α亚基有特异性的单链抗体(SCA)。在特定的方面，SCA结合至β整联蛋白中G蛋白α亚基结合的位点，或者SCA结合至G蛋白α亚基中β整联蛋白结合的位点。在示例性方面，SCA结合至如本文在题为“表位”一章中进一步描述的表位。制备SCA的方法是本领域中已知的。参见，例如，Davis等,NatureBiotechnology 9:165-169(1991)。

在一些方面，所述抗体是嵌合抗体。术语"嵌合抗体"在本文中用来指含有来自一个物种的恒定结构域和来自第二物种的可变结构域，或更通常含有来自至少两个物种的氨基酸序列的延伸部分的抗体。在特定的方面，嵌合抗体结合至β整联蛋白中G蛋白α亚基结合的位点，或者嵌合抗体结合至G蛋白α亚基中β整联蛋白结合的位点。在示例性方面，嵌合抗体结合至如在本文中于题为“表位”一章中进一步描述的表位。

在一些方面，所述抗体是人源化抗体。术语"人源化"当结合抗体使用时是指至少具有来自非人来源的CDR区的抗体，其被工程化以具有与真正的人抗体而非原始源抗体更类似的结构和免疫功能。例如，人源化可涉及将来自非人抗体诸如小鼠抗体的CDR接枝到人抗体中。人源化还可涉及选择氨基酸取代以制备看起来更像人序列的非人序列。在特定的方面，人源化抗体结合至β整联蛋白中G蛋白α亚基结合的位点，或者人源化抗体结合至G蛋白α亚基中β整联蛋白结合的位点。在示例性方面，人源化抗体结合至如在本文中于题为“表位”一章中进一步描述的表位。

在本文中使用术语"嵌合或人源化的"并非意在相互排斥，相反，意在涵盖嵌合抗体、人源化抗体及已被进一步人源化的嵌合抗体。除非上下文另有指示，否则关于本发明嵌合抗体的陈述(其性质、用途、测试等)适用于本发明的人源化抗体，并且关于本发明的人源化抗体的陈述也适于嵌合抗体。类似地，除非上下文中规定，否则此类陈述还应被理解为适用于抗体和本发明的此类抗体的抗原结合片段。

在一些方面，所述抗体是对β整联蛋白或G蛋白α亚基具有特异性的CDR-接枝抗体。在特定的方面，CDR-接枝抗体结合至β整联蛋白中G蛋白α亚基结合的位点，或者CDR-接枝抗体结合至G蛋白α亚基中β整联蛋白结合的位点。在示例性方面，CDR-接枝抗体结合至如在本文中于题为“表位”一章中进一步描述的表位。制备CDR-接枝抗体的方法是本领域中已知的。参见，例如，Lo,Benny,Antibody Engineering:Methods and Protocols,第248卷(2004)，其通过引用以其整体并入。

在一些方面，所述抗体是对β整联蛋白或G蛋白α亚基具有特异性的双特异性或三特异性抗体。在特定的方面，双特异性或三特异性抗体结合至β整联蛋白中G蛋白α亚基结合的位点，或者双特异性或三特异性抗体结合至G蛋白α亚基中β整联蛋白结合的位点。在示例性方面，双特异性或三特异性抗体结合至如在本文中于题为“表位”一章中进一步描述的表位。制备双特异性或三特异性抗体的方法是本领域中已知的。参见，例如，Marvin和Zhu,Acta Pharmacologica Sinica 26:649-658(2005)和美国专利6,551,592。

在一些方面，所述抗体是Humaneered^TM抗体。人工程化技术是KaloBiosPharmaceuticals,Inc.(San Francisco,California)用于将非人抗体转化为工程化人抗体的专利方法。Humaneered^TM抗体亲和力高，并且与人种系抗体序列高度类似。

在一些实施方案中，所述抗体对β整联蛋白具有一定水平的亲和力或亲合力，足以防止G蛋白α亚基结合β整联蛋白。在一些实施方案中，所述抗体对G蛋白α亚基具有一定水平的亲和力或亲合力，足以防止β整联蛋白结合G蛋白α亚基。因此，在一些实施方案中，本发明的抗体对于β整联蛋白的亲和力常数K_a(其是解离常数K_d的倒数)大于G蛋白α亚基对于β整联蛋白的K_a。可选地，在一些实施方案中，本发明抗体对G蛋白α亚基的K_a大于β整联蛋白对G蛋白α亚基的K_a。结合常数，包括解离常数，可通过本领域已知的方法测定，所述方法包括例如利用表面等离子体共振原理的方法，如利用Biacore^TM系统的方法。

在一些实施方案中，所述抗体呈单体形式，而在其它实施方案中，所述抗体缀合至一个或多个抗体(如，其每一个识别第一抗体相同的表位)。因此，在一些方面，所述抗体呈聚合物、寡聚体或多聚体形式。在其中抗体包含两个或多个不同的抗原结合区片段的某些实施方案中，所述抗体被认为是双特异性、三特异性或多特异性的，或者二价、三价或多价的，这取决于抗体识别和结合的不同表位的数目。

抗原结合片段

在本发明的某些方面，抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间的结合相互作用的化合物是抗体的抗原结合片段。抗原结合片段(在本文中也被称为“抗原结合部分”)可为本文所述的任何抗体的抗原结合片段。抗原结合片段可为具有至少一个抗原结合位点的抗体的任何部分，包括但不限于Fab、F(ab')₂、dsFv、sFv、双抗体、三抗体、双-scFv、由Fab表达文库表达的片段、结构域抗体、VhH结构域、V-NAR结构域、VH结构域、VL结构域等。然而，本发明的抗体片段并不限于这些示例性类型的抗体片段。

结构域抗体包含抗体的功能性结合单元，并且可对应于抗体的重(V_H)或轻(V_L)链的可变区。结构域抗体可具有大约13kDa的分子量，或大约完全抗体的十分之一。结构域抗体可来源于完全抗体，诸如本文中描述的那些。在一些实施方案中，抗原结合片段是单体或聚合物，双特异性或三特异性、双价或三价的。

所述抗体分子的含有抗原结合的抗体片段或独特型可通过本领域已知的技术产生。例如，此类片段包括但不限于可通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab')₂片段；可通过还原F(ab')₂片段的二硫桥产生的Fab'片段以及可通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的两个Fab'片段。

单链可变区片段(sFv)抗体片段，其由包含经由合成肽连接至轻抗体链V结构域的抗体重链可变(V)结构域的截短Fab片段组成，可使用常规重组DNA技术技艺产生(参见，如Janeway等，同上)。类似地，二硫稳定化的可变区片段(dsFv)可通过重组DNA技术制备(参见，如Reiter等,蛋白Engineering,7,697-704(1994))。

重组抗体片段，如scFv，还可被工程化以组装成针对不同靶抗原具有高结合亲合力和特异性的稳定多聚寡聚物。此类双抗体(二聚体)、三抗体(三聚体)或四抗体(四聚体)是本领域所熟知的，参加，如Kortt等,Biomol Eng.2001 18:95-108,(2001)和Todorovska等,J Immunol Methods.248:47-66,(2001)。

双特异性抗体(bscAb)是包含使用重组方法经由甘氨酸-丝氨酸接头连接的两个单链Fv片段的分子。在示例性实施方案中，使用标准PCR方法分离两种目标抗体的V轻链(V_L)和V重链(V_H)结构域。然后将从每个杂交瘤获得的V_L和V_H cDNA在两步融合PCR中合起来形成单链片段。以类似的方式制备双特异性融合蛋白。双特异性单链抗体和双特异性融合蛋白是本发明范围内包括的抗体物质。示例性双特异性抗体在美国专利申请公布No.2005-0282233A1和国际专利申请公布No.WO 2005/087812中教导，这两个的申请内容通过引用以其整体并入本文。

抗体或抗原结合片段产生的方法

适合的制备抗体的方法是本领域中已知的。例如，标准杂交瘤方法描述于如Harlow和Lane(编辑),Antibodies:A Laboratory Manual,CSH Press(1988)和CA.Janeway等(编辑),Immunobiology,第5版，Garland Publishing,New York,NY(2001))中。

简而言之，通过用包括本发明的多肽的免疫原免疫动物和从免疫的动物收集抗血清制备多克隆抗体。广泛的动物物种可用于产生抗血清。在一些方面，用于产生抗-抗血清的动物是非人动物，包括兔、小鼠、大鼠、仓鼠、山羊、绵羊、猪或马。由于兔的血液体积相对较大，兔是用于产生多克隆抗体的优选选项。在产生与选择的β整联蛋白表位具有免疫反应性的多克隆抗血清的示例性方法中，将50μg的β整联蛋白抗原在弗氏完全佐剂(Freund'sComplete Adjuvant)中乳化以用于免疫兔。以例如21天的间隔，将50μg表位在弗氏不完全佐剂(Freund's Incomplete Adjuvant)中乳化以用于加强。可在允许抗体产生的时间之后，仅通过将动物放血和从全血制备血清样品获得多克隆抗血清。

可使用任何由培养中的连续细胞系提供抗体分子产生的技术制备用于本发明的单克隆抗体。这些技术包括但不限于由Koehler和Milstein首先描述的杂交瘤技术(Nature256:495-497,1975)，人B-细胞杂交瘤技术(Kosbor等,Immunol Today 4:72,1983；Cote等,Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030,1983)和EBV-杂交瘤技术(Cole等,Mono克隆Antibodies and Cancer Therapy,Alan R Liss Inc,New York N.Y.,第77-96页,(1985)。

简而言之，在示例性实施方案中，为了产生单克隆抗体，将小鼠用待产生的抗体所针对的重组β整联蛋白(如，在弗氏完全佐剂中乳化的10-20μg)周期性注射。向小鼠施以在PBS中β整联蛋白多肽的最后融合前加强，并且四后天处死小鼠并取出其脾。将脾置于10ml不含血清的RPMI 1640中，并通过在浸没在补充有2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素(RPMI)(Gibco,Canada)的不含血清的RPMI 1640的两个玻璃显微镜载物片的磨砂端之间，研磨脾形成单细胞混悬液。将细胞混悬液通过无菌70-目Nitex细胞过滤器(Becton Dickinson,Parsippany,N.J.)过滤，并通过200g离心5分钟而洗涤两次，并将沉淀重悬浮于20ml不含血清的RPMI中。从三只原生Balb/c小鼠取出的脾细胞以类似方式制备，并用作对照。将在具有11％胎牛血清(FBS)的RPMI(Hyclone Laboratories,Inc.,Logan,Utah)中保持在对数期三天的NS-1骨髓瘤细胞在融合前以200g离心5分钟，并将沉淀洗涤两次。

将脾细胞(1×10⁸)与2.0×10⁷个NS-1细胞合并并离心，并吸出上清液。通过轻叩管来移动细胞沉淀，并在搅拌下在1分钟的时间内添加1ml 37℃ PEG 1500(50％于75mMHepes，pH 8.0)(Boehringer Mannheim)，然后在7分钟内添加7ml不含血清的RPMI。另外添加8ml RPMI，并将细胞200g离心10分钟。在弃去上清液之后，将沉淀重悬浮于含有15％FBS、100μM次黄嘌呤钠、0.4μM氨基蝶呤、16μM胸苷(HAT)(Gibco)、25单位/ml IL-6(BoehringerMannheim)和1.5×10⁶个脾细胞/ml的200ml RPMI中，并涂布于10个Corning平底96孔组织培养平板(Corning,Corning N.Y.)。

在融合后第2、4和6天，从融合板的各孔移除100μl培养基，并用新鲜培养基替代。在第8天，如下通过ELISA测试小鼠IgG结合至β整联蛋白存在而筛选融合体。将Immulon 4平板(Dynatech,Cambridge,Mass.)用于25mM Tris,pH 7.5中稀释的100ng/孔的β整联蛋白在37℃下涂覆2小时。吸出涂覆溶液并在37℃下添加200μl/孔的封闭溶液(于CMF-PBS中稀释的0.5％鱼皮明胶(Sigma))并孵育30分钟。将平板用含0.05％Tween 20的PBS(PBST)洗涤三次，并添加50μl培养上清液。在37℃下孵育30分钟并如上洗涤之后，添加50μl于PBST中1:3500稀释的辣根过氧化物酶缀合的山羊抗-小鼠IgG(fc)(Jackson ImmunoResearch,WestGrove,Pa.)。如上孵育平板，用PBST洗涤四次，及添加100μl由于100mM柠檬酸盐(pH 4.5)中的1mg/ml邻苯二胺(Sigma)和0.1μl/ml 30％H₂O₂组成的底物。5分钟之后通过添加50μl15％H₂SO₄停止颜色反应。在读板仪(Dynatech)上读取A₄₉₀。

将所选择的融合孔通过稀释至96-孔板中和5天后对菌落数目/孔目测评分来克隆两次。将由杂交瘤产生的单克隆抗体使用Isostrip系统(Boehringer Mannheim,Indianapolis,Ind.)同种型化(isotyped)。

当采用杂交瘤技术时，可使用骨髓瘤细胞系。此类适用于产杂交瘤的融合程序的细胞系优选为不产生抗体的，具有高融合效率和使其不能在支持仅所需的融合细胞(杂交瘤)生长的某些选择性培养基中生长的酶缺陷。例如，当经免疫的动物是小鼠时，人们可使用P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/15XX0Bul；对于大鼠，人们可使用R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210；并且U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6就细胞融合而言都是可用的。应该注意由此类技术产生的用于产生单克隆抗体的杂交瘤和细胞系被作为本发明的新型组合物所涵盖。

根据宿主的物种，各种佐剂可用于增强免疫应答。此类佐剂包括但不限于弗氏佐剂、矿物凝胶诸如氢氧化铝，及表面活性物质诸如溶血卵磷脂、普洛尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔戚血蓝蛋白和二硝基苯酚。BCG(卡介苗，bacilli Calmette-Guerin)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)是潜在有用的人佐剂。

可选地，其它方法，诸如EBV-杂交瘤方法(Haskard和Archer,J.Immunol.Methods,74(2),361-67(1984)和Roder等₅Methods Enzymol.,121,140-67(1986))和噬菌体载体表达系统(参见，如Huse等,Science,246,1275-81(1989))是本领域中已知的。此外，在非人动物中产生抗体的方法描述于如美国专利5,545,806、5,569,825和5,714,352及美国专利申请公布No.2002/0197266Al)中。

还可通过在淋巴细胞群体中诱导体内产生或筛选高特异性结合试剂的重组免疫球蛋白文库或小组而产生抗体(如在Orlandi等(Proc Natl Acad Sci 86:3833-3837；1989)和Winter G和Milstein C(Nature 349:293-299,1991)中所公开)。

此外，噬菌体展示可用于产生本发明的抗体。就此而言，可使用标准分子生物学和重组DNA技术产生编码抗体的抗原结合可变(V)结构域的噬菌体文库(参见，如Sambrook等(编辑),Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York(2001))，选择特异性结合至所需抗原的编码具有所需特异性的可变区的噬菌体，并且重新构建包含所选的可变结构域的完全或部分抗体。将编码重新构建的抗体的核酸序列引入至适合的细胞系中，诸如用于杂交瘤产生的骨髓瘤细胞，使得具有单克隆抗体特征的抗体被所述细胞分泌(参见，如Janeway等，同上，Huse等，同上及美国专利6,265,150)。相关方法还描述于美国专利No.5,403,484；美国专利No.5,571,698；美国专利No.5,837,500；美国专利No.5,702,892中。所述技术描述于美国专利No.5,780,279；美国专利No.5,821,047；美国专利No.5,824,520；美国专利No.5,855,885；美国专利No.5,858,657；美国专利No.5,871,907；美国专利No.5,969,108；美国专利No.6,057,098；美国专利No.6,225,447中。

可由针对特异性重链和轻链免疫球蛋白基因转基因的转基因小鼠产生抗体。此类方法是本领域中已知的并且描述于例如美国专利5,545,806和5,569,825及Janeway等，同上中。

用于产生人源化抗体的方法是本领域所熟知的，并且详细描述于例如Janeway等，同上、美国专利5,225,539、5,585,089和5,693,761、欧洲专利No.0239400 Bl和英国专利No.2188638中。人源化抗体还可使用美国专利5,639,641和Pedersen等,J.MoI.Biol,235,959-973(1994)中所述的抗体表面重塑技术产生。

可使用为产生"嵌合抗体"、将小鼠抗体至人抗体基因获得具有适当的抗原特异性和生物活性的分子而开发的技术(Morrison等,Proc Natl Acad Sci 81:6851-6855,1984；Neuberger等,Nature 312:604-608,1984；Takeda等,Nature 314:452-454；1985)。可选地，可采用所述的用于产生单链抗体的技术(美国专利No.4,946,778)以产生β整联蛋白-或G蛋白α亚基-特异性单链抗体。

优选的嵌合或人源化抗体具有人恒定区，而所述抗体的可变区或至少CDR来源于非人物种。用于人源化非人抗体的方法是本领域中所熟知的。(参见美国专利No.5,585,089和5,693,762)。通常，人源化抗体具有一个或多个氨基酸残基被引入至来自非人来源的框架区。可使用例如Jones等(Nature 321:522-525,1986)、Riechmann等(Nature,332:323-327,1988)及Verhoeyen等(Science 239:1534-1536,1988)中所述的方法通过将啮齿类动物互补决定区(CDR)的一部分替换为人抗体的相应部分进行人源化。多种用于制备工程化抗体的技术描述于如Owens和Young,J.Immunol.Meth.,168:149-165(1994)中。然后将额外的改变引入抗体框架中以调控亲和力和免疫原性。

同样，通过使用本领域已知的技术分离CDR，产生包含CDR的组合物。互补决定区的特征在于六个多肽环，可重链或轻链可变区各三个环。CDR中氨基酸的位置由Kabat等,"Sequences of Proteins of Immunological Interest,"U.S.Department of Health andHuman Services,(1983)定义，其通过引用并入本文。例如，人抗体的高可变区被粗略定义为存在于重链和轻链可变区的残基28至35、49-59及残基92-103处(Janeway和Travers,Immunobiology,第2版,Garland Publishing,New York,(1996))。鼠科动物CDR也大概存在于这些氨基酸残基处。应理解在本领域中CDR区可位于以上示出的这些近似残基的数个氨基酸范围内。免疫球蛋白可变区也由围绕CDR的四个"框架"区(FR1-4)组成。不同轻链或重链的框架区的序列在一个物种中是高度保守的，并且在人和鼠科动物序列之间也是保守的。

可产生包含单克隆抗体的重链可变区或轻链可变区的一个、两个和/或三个CDR的组合物。用于克隆和表达核苷酸和多肽序列的技术在本领域中已被确立(参见如Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor,New York(1989))。将扩增的CDR序列链接至适当的质粒中。包含一个、两个、三个、四个、五个和/或六个克隆的CDR的质粒任选地含有链接至CDR的编码额外多肽的区域。

鼠科动物抗体的框架区(FR)通过取代从人抗体可变序列的大数据库(包括超过1,200条人V_H序列和超过1,000条V_L序列)选择的相容的人框架区而人源化。用于比较的抗体序列的数据库可从Andrew C.R.Martin's KabatMan网页(http://www.rubic.rdg.ac.uk/ abs/)下载。用于鉴别CDR的Kabat法提供从任何人抗体描绘大概的CDR和框架区并比较鼠科动物抗体序列的相似性以确定CDR和FR的方式。基于高的总体框架匹配、类似的CDR长度及规范和V_H/V_L接触残基的最小错配，选择最佳匹配的人V_H和V_L序列。将最类似鼠科动物序列的人框架区插入鼠科动物CDR之间。可选地，鼠科动物框架区可通过对更密切相似于人抗体框架区的所有或部分天然框架区进行氨基酸取代来修饰。

此外，另一种产生本发明所用抗体的有用技术可以是使用合理设计类型方法的技术。合理设计的目标是产生生物活性多肽或化合物的结构类似物，其可与所述生物活性多肽或化合物相互作用(激动剂、拮抗剂、抑制剂、肽模拟物、结合伴侣等)。在一种方法中，人们将产生抗体或其表位结合片段的三维结构。这可通过X射线结晶学、计算机建模或通过这两种方法结合而实现。另外一种方法，"丙氨酸扫描"涉及用丙氨酸随机替换整个分子的残基，和测定所导致的对功能的影响。

还可能解析特定抗体的晶体结构。原则上，该方法产生了药核(pharmacore)，随后的药物设计可基于此。可能通过一同产生功能性药理活性抗体的抗-独特型抗体而绕过蛋白结晶学。作为镜像的镜像，抗-独特型的结合位点将被期望是原始抗原的类似物。然后抗-独特型可用于从化学产生或生物产生的肽库中鉴别和分离另外的抗体。

化学构建的双特异性抗体可借由化学品诸如异型双功能试剂琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二巯基)-丙酸酯(SPDP,Pierce Chemicals,Rockford,Ill.)通过化学交联异源Fab或F(ab')₂片段来制备。Fab和F(ab')₂片段可从完整抗体通过分别用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化它来获得(Karpovsky等,J.Exp.Med.160:1686-701,1984；Titus等,J.Immunol.,138:4018-22,1987)。

无论抗体是如何产生的，测试抗体结合β整联蛋白表位的能力的方法是本领域中已知的，并且包括任何抗体-抗原结合测定，诸如例如放射免疫测定(RIA)、ELISA、蛋白质印迹、免疫沉淀和竞争性抑制测定(参见，如Janeway等，如下和美国专利申请公布No.2002/0197266 Al)。

适体

在一些实施方案中，抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间结合相互作用的化合物是抗体的类似物。在一些方面，所述化合物是适体。最近在组合科学领域的进展鉴定了对给定靶具有高亲和力和特异性的短聚合物序列(如，寡核酸或肽分子)。例如，SELEX技术已被用于鉴别具有竞争哺乳动物抗体的结合性质的DNA和RNA适体，免疫学领域已经产生并分离了结合至许多化合物的抗体或抗体片段，以及已使用噬菌体展示发现具有非常有利的结合性质的新型肽序列。基于这些分子进化技术的成功，很确定可产生结合任何靶分子的分子。通常涉及环结构以提供所需的结合属性，如在以下情况中：常使用从短区产生而无互补碱基配对的发夹环的适体，利用环化高可变区的组合排列的天然来源的抗体以及当与线性肽噬菌体展示结果相比已显示出结果改善的利用环肽的新噬菌体展示文库。因此，已产生了充足的证据表明可通过组合分子进化技术产生和鉴别高亲和力配体。对于本发明，分子进化技术可用于分离对本文所述的β整联蛋白或G蛋白α亚基具有特异性的化合物，所述化合物可抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间的结合相互作用。更多关于适体的内容通常参见Gold,L.,Singer,B.,He,Y.Y.,Brody.E.,"Aptamers As Therapeutic And DiagnosticAgents,"J.Biotechnol.74:5-13(2000)。用于产生适体的相关技术可参见美国专利No.6,699,843中，其通过引用以其整体并入。

表位

如本文所用借由“表位”意指由所述化合物如抗体、抗原结合片段、适体结合的β整联蛋白或G蛋白α亚基的区域或其内的区域。在一些实施方案中，所述表位是线性表位。如本文所用，借由“线性表位”指由所述化合物结合的β整联蛋白或G蛋白α亚基的区域或其内的区域，所述区域由β整联蛋白或G蛋白α亚基氨基酸序列的连续氨基酸组成。线性表位的氨基酸在抗原的一级结构及抗原的二级和/或三级结构中的位置彼此紧密相邻。例如，当抗原，如β整联蛋白或G蛋白α亚基，处于其适当折叠的状态(如，其天然构象)时，线性表位的连续的氨基酸的位置彼此紧密相邻。

在其它方面，结合构建体的表位是构象表位。借由“构象表位”意指由仅当β整联蛋白或G蛋白α亚基处于其适当折叠的状态时位置彼此紧密相邻的氨基酸组成的表位，并非β整联蛋白或G蛋白α亚基氨基酸序列的连续的氨基酸。

在本发明的示例性实施方案中，抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间结合相互作用的化合物结合至β整联蛋白的表位。在一些方面，所述化合物结合的表位在β整联蛋白的细胞质结构域内。在示例性方面，所述化合物结合的表位在β_1A整联蛋白、β_1D整联蛋白、β₂整联蛋白、β₃整联蛋白、β₅整联蛋白、β₆整联蛋白或β₇整联蛋白的细胞质结构域内。在示例性方面，所述化合物结合的表位在β_1A整联蛋白(SEQ ID NO:12)的氨基酸738-777或β_1A整联蛋白(SEQ ID NO:12)的氨基酸732-778内。在示例性方面，所述化合物结合的表位在β_1D整联蛋白(SEQ ID NO:13)的氨基酸738-776或β_1D整联蛋白(SEQ ID NO:13)的氨基酸732-781内。在示例性方面，所述化合物结合的表位在β₂整联蛋白(SEQ ID NO:14)的氨基酸702-746或β₂整联蛋白(SEQ ID NO:14)的氨基酸702-747内。在示例性方面，所述化合物结合的表位在β₃整联蛋白(SEQ ID NO:15)的氨基酸722-761或β₃整联蛋白(SEQ ID NO:15)的氨基酸716-762内。在示例性方面，所述化合物结合的表位在β₅整联蛋白(SEQ ID NO:16)的氨基酸720-765或β₅整联蛋白(SEQ ID NO:16)的氨基酸720-776内。在示例性方面，所述化合物结合的表位在β₆整联蛋白(SEQ ID NO:17)的氨基酸710-755或β₆整联蛋白(SEQ ID NO:17)的氨基酸710-767内。在示例性方面，所述化合物结合的表位在β₇整联蛋白(SEQ ID NO:18)的氨基酸728-773或β₇整联蛋白(SEQ ID NO:18)的氨基酸728-779内。

在本发明的示例性实施方案中，抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间结合相互作用的化合物结合至G蛋白α亚基的表位。在一些方面，所述化合物结合的表位在G蛋白α亚基的转换区I内。在示例性方面，所述化合物结合的表位在G蛋白α亚基Gα₁₂或Gα₁₃的转换区I内。在示例性方面，所述化合物结合至Gα₁₂(SEQ ID NO:11)的氨基酸201-216或Gα₁₃(SEQ IDNO:10)的氨基酸197-212内的表位。在示例性方面，所述化合物结合至Gα₁₃(SEQ ID NO:10)的氨基酸197-209或Gα₁₃(SEQ ID NO:10)的氨基酸198-206内的表位。在示例性方面，所述化合物结合至Gα₁₂(SEQ ID NO:11)的氨基酸203-211内的表位。

在又一些其它实施方案中，抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间的结合相互作用的化合物结合至包含任何一种本文所述肽或肽类似物的氨基酸序列的表位。参见，如题为“β整联蛋白或G蛋白α亚基及其衍生物的片段”的章节。在示例性方面，抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间的结合相互作用的化合物结合至包含SEQ ID NO:19-40的任一个的氨基酸序列的表位。

肽

在本发明的一些实施方案中，抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间结合相互作用的化合物是包含至少四个经由肽键连接的氨基酸的肽。因此，本发明提供肽。在一些方面，所述肽的长度为约4至约50个氨基酸。在一些方面，所述化合物的长度为约5至约25个氨基酸。在一些方面，所述化合物的长度为约5至20个氨基酸。在一些方面，所述肽的长度为5-15个氨基酸。在一些方面，所述肽的长度为5-9或5-8或5-7个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽为5-聚体、6-聚体、7-聚体、8-聚体、9-聚体-10-聚体、11-聚体、12-聚体、13-聚体、14-聚体、15-聚体、16-聚体、17-聚体、18-聚体、19-聚体或20-聚体。

β整联蛋白或G蛋白α亚基的片段及其衍生物

在一些实施方案中，抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间结合相互作用的肽包含片段或为人野生型β整联蛋白的片段，如本文所公开的那些片段的任何一种。如本文所用，术语“片段”不涵盖全长β整联蛋白或全长G蛋白α亚基。在一些方面，所述化合物包含或是β_1A整联蛋白、β_1D整联蛋白、β₂整联蛋白、β₃整联蛋白、β₅整联蛋白、β₆整联蛋白或β₇整联蛋白的片段。在特定方面，所述化合物包含β整联蛋白的细胞质结构域的4至50个(如，5至25个)连续氨基酸。

在本发明的示例性实施方案中，抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间结合相互作用的化合物包含β_1A整联蛋白、β_1D整联蛋白、β₂整联蛋白、β₃整联蛋白、β₅整联蛋白、β₆整联蛋白或β₇整联蛋白的细胞质结构域的4至50个(如，5至25个)连续氨基酸。在示例性方面，所述化合物包含β_1A整联蛋白(SEQ ID NO:12)的氨基酸738-777或β_1A整联蛋白(SEQ ID NO:12)的氨基酸732-778的4至50个(如，5至25个)连续氨基酸。在示例性方面，所述化合物包含β_1D整联蛋白(SEQ ID NO:13)的氨基酸738-776或β_1D整联蛋白(SEQ ID NO:13)的氨基酸732-781的4至50个(如，5至25个)连续氨基酸。在示例性方面，所述化合物包含β₂整联蛋白(SEQ IDNO:14)的氨基酸702-746或β₂整联蛋白(SEQ ID NO:14)的氨基酸702-747的4至50个(如，5至25个)连续氨基酸。在示例性方面，所述化合物包含β₃整联蛋白(SEQ ID NO:15)的氨基酸722-761或β₃整联蛋白(SEQ ID NO:15)的氨基酸716-762的4至50个(如，5至25个)连续氨基酸。在示例性方面，所述化合物包含β₅整联蛋白(SEQ ID NO:16)的氨基酸720-765或β₅整联蛋白(SEQ ID NO:16)的氨基酸720-776的4至50个(如，5至25个)连续氨基酸。在示例性方面，所述化合物包含β₆整联蛋白(SEQ ID NO:17)的氨基酸710-755或β₆整联蛋白(SEQ IDNO:17)的氨基酸710-767的4至50个(如，5至25个)连续氨基酸。在示例性方面，所述化合物包含β₇整联蛋白(SEQ ID NO:18)的氨基酸728-773或β₇整联蛋白(SEQ ID NO:18)的氨基酸728-779的4至50个(如，5至25个)连续氨基酸。

在本发明的示例性实施方案中，抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间结合相互作用的化合物包含G蛋白α亚基的4至50个(如，5至25个)连续氨基酸。在一些方面，所述化合物包含G蛋白α亚基的转换区I的4至50个(如，5至25个)连续氨基酸。在示例性方面，所述化合物包含G蛋白α亚基Gα₁₂或Gα₁₃的转换区I的4至50个(如，5至25个)连续氨基酸。在示例性方面，所述化合物包含Gα₁₂(SEQ ID NO:11)的氨基酸201-216或Gα₁₃(SEQ ID NO:10)的氨基酸197-212的4至50个(如，5至25个)连续氨基酸。在示例性方面，所述化合物包含Gα₁₃(SEQ IDNO:10)的氨基酸197-209或Gα₁₃(SEQ ID NO:10)的氨基酸198-206的4至50个(如，5至25个)连续氨基酸。在示例性方面，所述化合物包含Gα₁₂(SEQ ID NO:11)的氨基酸203-211的4至50个(如，5至25个)连续氨基酸。

在示例性方面，所述化合物包含为β整联蛋白的细胞质结构域的一部分或片段的三个氨基酸的核心序列。例如，所述化合物包含与β₃整联蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO:15)的氨基酸731至733相同的核心序列，其为EEE。在示例性方面，所述化合物包含与β_1A整联蛋白(SEQ ID NO:12)或β_1D整联蛋白(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列的氨基酸747-749，β₂整联蛋白(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列的氨基酸717-719或β₇整联蛋白(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列的氨基酸743-745相同的核心序列，其各自为EKE。在示例性方面，所述化合物包含与β₆整联蛋白(SEQ ID NO:17)的氨基酸725-727相同的核心序列，其为EAE。在示例性方面，所述化合物包含与β₅整联蛋白(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列的氨基酸735-737相同的核心序列，其为QSE。

在示例性实施方案中，所述化合物包含核心序列N-末端和/或C-末端的额外氨基酸。额外的氨基酸，如非核心序列，可代表为β整联蛋白氨基酸序列的核心序列的N-末端和/或C-末端的氨基酸。例如，所述化合物可包含核心序列EEE(β₃整联蛋白(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列的氨基酸731至733)并且可额外地包含N-末端非核心序列(包括KF(Lys-Phe))和/或C-末端非核心序列(包括RA(Arg-Ala))。因此，在示例性方面，所述化合物包含氨基酸序列KFEEE(SEQ ID NO:19)、KFEEERA(SEQ ID NO:20)、EEERA(SEQ ID NO:21)。在示例性方面，所述化合物包含氨基酸序列KFEEERARAKWDT(SEQ ID NO:22)。

在示例性方面，所述化合物包含核心序列EKE并包含N-末端非核心序列(包括KF(Lys-Phe)或RF(Arg-Phe))和/或C-末端非核心序列(包括KM(Lys-Met)、KL(Lys-Leu)或QQ(Gln-Gln))。因此，在示例性方面，所述化合物包含氨基酸序列KFEKE(SEQ ID NO:23)、RFEKE(SEQ ID NO:24)、KFEKEKM(SEQ ID NO:25)、KFEKEKL(SEQ ID NO:26)、KFEKEQQ(SEQID NO:27)、RFEKEKM(SEQ ID NO:28)、RKFEKEKL(SEQ ID NO:29)、RFEKEQQ(SEQ ID NO:30)、EKEKM(SEQ ID NO:31)、EKEKL(SEQ ID NO:32)或EKEQQ(SEQ ID NO:33)。

在示例性方面，所述化合物包含核心序列EAE并包含N-末端非核心序列(包括KF(Lys-Phe))和/或C-末端非核心序列(包括RS(Arg-Ser))。因此，在示例性方面，所述化合物包含氨基酸序列KFEAE(SEQ ID NO:34)、KFEAERS(SEQ ID NO:35)或EAERS(SEQ ID NO:36)。

在示例性方面，所述化合物包含核心序列QSE并包含N-末端非核心序列(包括KF(Lys-Phe))和/或C-末端非核心序列(包括RS(Arg-Ser))。因此，在示例性方面，所述化合物包含氨基酸序列KFQSE(SEQ ID NO:37)、KFQSERS(SEQ ID NO:38)或QSERS(SEQ ID NO:39)。

在可选或另外的实施方案中，所述化合物包含并非基于β整联蛋白的野生型序列的非核心序列。在示例性方面，所述化合物可包含核心序列EEE(β₃整联蛋白(SEQ ID NO:15)的基酸序列的氨基酸731至733)并可额外地包含除KF(Lys-Phe)之外的N-末端非核心序列和/或除RA(Arg-Ala)之外的C-末端非核心序列。

在示例性实施方案中，抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间结合相互作用的肽包含片段或是人野生型G蛋白α亚基(如Gα₁₂、Gα₁₃)的片段。在一些方面，所述化合物包含或是Gα₁₂或Gα₁₃的片段。在特定方面，所述化合物包含G蛋白α亚基转换区I的4至50个(如，5至25个)连续氨基酸。

在示例性方面，所述化合物包含G蛋白α亚基Gα₁₂或Gα₁₃转换区I的4至50个(如，5至25个)连续氨基酸。在示例性方面，所述化合物包含Gα₁₂(SEQ ID NO:11)的氨基酸201-216或Gα₁₃(SEQ ID NO:10)的氨基酸197-212的4至50个(如，5至25个)连续氨基酸。在示例性方面，所述化合物包含Gα₁₃(SEQ ID NO:10)的氨基酸197-209或Gα₁₃(SEQ ID NO:10)的氨基酸198-206的4至50个(如，5至25个)连续氨基酸。在示例性方面，所述化合物包含Gα₁₂(SEQ IDNO:11)的氨基酸203-211的4至50个(如，5至25个)连续氨基酸。在一些方面，所述化合物包含氨基酸序列LLARRPTKGIHEY(SEQ ID NO:40)。

在一些实施方案中，抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间结合相互作用的肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列基于人野生型β整联蛋白或其片段的氨基酸序列但当与人野生型β整联蛋白序列或其片段比对时在一个或多个(如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)氨基酸位置处不同。

在一些实施方案中，抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间的结合相互作用的肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与人野生型β整联蛋白如SEQ ID NO:15或其片段(如，SEQ IDNO:15的约4至约50个连续的氨基酸的片段)的氨基酸序列具有至少25％的序列同一性。在一些实施方案中，所述化合物包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:15或其片段(如，SEQ ID NO:15的约4至约25个连续的氨基酸的片段)具有至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或具有大于95％的序列同一性。在一些实施方案中，所述化合物包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:12-18中的任一个或其片段(如，SEQ ID NO:12-18中任一个的约4至约25个连续的氨基酸的片段)有至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或具有大于95％的序列同一性。在一些实施方案中，所述化合物包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:19-39的任一个具有至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或具有大于95％的序列同一性。

在一些实施方案中，抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间结合相互作用的肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列基于人野生型G蛋白α亚基或其片段的氨基酸序列但当与人野生型G蛋白α亚基序列或其片段比对时在一个或多个(如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)氨基酸位置处不同。在一些实施方案中，抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间的结合相互作用的肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与人野生型G蛋白α亚基如SEQ ID NO:10或11或其片段(如，SEQ ID NO:10或11的约4至约15个连续氨基酸的片段)的氨基酸序列具有至少25％的序列同一性。在一些实施方案中，所述化合物包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:10或11或其片段(如，SEQ ID NO:10或11的约4至约10个连续氨基酸的片段)具有至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或具有大于95％的序列同一性。在一些实施方案中，所述化合物包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与Gα₁₂(SEQ ID NO:11)的氨基酸201-216或Gα₁₃(SEQ ID NO:10)的氨基酸197-212、Gα₁₃(SEQ ID NO:10)的氨基酸197-209或Gα₁₃(SEQ IDNO:10)的氨基酸198-206、Gα₁₂(SEQ ID NO:11)的氨基酸203-211具有至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，所述化合物包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:40具有至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或具有大于95％的序列同一性。

在示例性实施方案中，所述化合物包含氨基酸序列：

Xaa₁ Xaa₂ Glu，

其中Xaa₁是Glu或Gln且Xaa₂是Glu、Lys、Ser或Ala。在示例性方面，(i)Xaa₁是Glu且Xaa₂是Glu、Lys或Ala或者(ii)Xaa₁是Gln且Xaa₂是Ser。在示例性方面，Xaa₁和Xaa₂的每一个都是Glu。在示例性方面，所述肽包含Xaa₁ Xaa₂ Glu的N-末端的Phe。在示例性方面，所述肽包含Xaa₁ Xaa₂ Glu的C-末端的Arg。在示例性方面，所述肽包含Xaa₁ Xaa₂ Glu的N-末端的Phe和Xaa₁ Xaa₂ Glu的C-末端的Arg。在示例性方面，所述化合物包含两个氨基酸的延伸，Xaa₁ Xaa₂ Glu的N-末端的Xaa_-1 Xaa₀。在示例性方面，N-末端延伸的Xaa_-1是Lys或Arg。在示例性方面，N-末端延伸的Xaa₀是Phe。在示例性方面，所述化合物包含两个氨基酸的延伸，Xaa₁ Xaa₂ Glu的C末端的Xaa₃ Xaa₄。在示例性方面，C-末端延伸的Xaa₃是Lys、Arg或Gln。在示例性方面，C-末端延伸的Xaa₄是Met、Leu、Ala、Ser或Gln。在示例性方面，Xaa₃是Arg且Xaa₄是Ala。因此，在本发明的示例性方面，所述化合物包含选自以下的序列：HDRKEFAKFEEERARAKWDT(SEQ ID NO:83)KFEEERARAKWDT(SEQ ID NO:22)；KFEEERA(SEQ IDNO:20)；和EEERA(SEQ ID NO:21)。在示例性方面，所述肽包含FEEERA(SEQ ID NO:87)、基本上由FEEERA(SEQ ID NO:87)组成或由FEEERA(SEQ ID NO:87)组成。在示例性方面，所述肽包含序列KFEEE(SEQ ID NO:19)、FEEER(SEQ ID NO:84)、AKFEEE(SEQ ID NO:85)、KFEEER(SEQ ID NO:86)、FEEERA(SEQ ID NO:87)、EEERAR(SEQ ID NO:88)、EEERARA(SEQ ID NO:89)或EEERARAK(SEQ ID NO:90)。

在示例性方面，所述肽包含核心EXE(SEQ ID NO:93)，其中X是任何氨基酸。在示例性方面，X是Glu、Lys、Ser或Ala。在示例性方面，X是Ala、Gly、Val、Leu或Ile。在示例性方面，X是Glu或Asp。在示例性方面，X是Ser或Thr。在示例性方面，X是Lys或鸟氨酸或Arg。在示例性方面，X是Pro、Phe、Tyr、Trp、Asn、Gln、His、Cys或Met。

在示例性方面，所述肽包含FEXE(SEQ ID NO:94，其中X是任何氨基酸。在示例性方面，X是Glu或Asp。在示例性方面，X是Ala、Gly、Val、Leu或Ile。在示例性方面，X是Glu或Asp。在示例性方面，X是Ser或Thr。在示例性方面，X是Lys或鸟氨酸或Arg。在示例性方面，X是Pro、Phe、Tyr、Trp、Asn、Gln、His、Cys或Met。

在示例性方面，所述肽包含FEX₁EX₂，其中X1和X2的每一个独立地为任何氨基酸。在示例性方面，所述肽包含FEX₁EX₂(SEQ ID NO:95)，其中X1是任何氨基酸且X2是Lys、Arg或Gln。在示例性方面，X1是Glu或Asp。在示例性方面，X1是Ala、Gly、Val、Leu或Ile。在示例性方面，X1是Glu或Asp。在示例性方面，X1是Ser或Thr。在示例性方面，X1是Lys或鸟氨酸或Arg。在示例性方面，X1是Pro、Phe、Tyr、Trp、Asn、Gln、His、Cys或Met。

在示例性方面，所述肽包含EX1EX2，其中X1和X2的每一个独立地为任何氨基酸。在示例性方面，所述肽包含EX1EX2(SEQ ID NO:96)，其中X1是任何氨基酸且X2是Lys、Arg或Gln。在示例性方面，X1是Glu或Asp。在示例性方面，X1是Ala、Gly、Val、Leu或Ile。在示例性方面，X1是Glu或Asp。在示例性方面，X1是Ser或Thr。在示例性方面，X1是Lys或鸟氨酸或Arg。在示例性方面，X1是Pro、Phe、Tyr、Trp、Asn、Gln、His、Cys或Met。

在示例性方面，所述肽包含X1FEX2E，其中X1和X2的每一个独立地为任何氨基酸。在示例性方面，所述肽包含X1FEX2E(SEQ ID NO:97)，其中X1是Lys或Arg且X2是任何氨基酸。在示例性方面，X2是Glu或Asp。在示例性方面，X2是Ala、Gly、Val、Leu或Ile。在示例性方面，X2是Glu或Asp。在示例性方面，X2是Ser或Thr。在示例性方面，X2是Lys或鸟氨酸或Arg。在示例性方面，X2是Pro、Phe、Tyr、Trp、Asn、Gln、His、Cys或Met。

在示例性方面，所述肽包含X1FEX2EX3，其中X1、X2和X3的每一个独立地为任何氨基酸。在示例性方面，所述肽包含X1FEX2EX3(SEQ ID NO:98)，其中X1是Lys或Arg，其中X2是任何氨基酸且X3是Lys、Arg或Gln。在示例性方面，X2是Glu或Asp。在示例性方面，X2是Ala、Gly、Val、Leu或Ile。在示例性方面，X2是Glu或Asp。在示例性方面，X2是Ser或Thr。在示例性方面，X2是Lys或鸟氨酸或Arg。在示例性方面，X2是Pro、Phe、Tyr、Trp、Asn、Gln、His、Cys或Met。

在示例性方面，所述肽包含X1FEX2EX3X4，其中X1、X2、X3和X4的每一个独立地为任何氨基酸。在示例性方面，所述肽包含X1FEX2EX3X4(SEQ ID NO:99)，其中X1是Lys或Arg，X2是任何氨基酸，X3是Lys、Arg或Gln且X4是任何氨基酸任选Met、Ala、Leu、Ser或Gln。在示例性方面，X2是Glu或Asp。在示例性方面，X2是Ala、Gly、Val、Leu或Ile。在示例性方面，X2是Glu或Asp。在示例性方面，X2是Ser或Thr。在示例性方面，X2是Lys或鸟氨酸或Arg。在示例性方面，X2是Pro、Phe、Tyr、Trp、Asn、Gln、His、Cys或Met。

在示例性方面，所述肽包含SEQ ID NO:100-122的任一个。

在本发明的示例性实施方案中，所述化合物包含氨基酸序列X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇KX₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂(SEQ ID NO:44)。在示例性方面，X₁、X₂、X₃、X₈和X₉的每一个独立地为脂族氨基酸。在示例性方面，X₄、X₅和X₁₀的每一个独立地为碱性氨基酸。在示例性方面，X₆是Pro。在示例性方面，X₇和X₁₂独立地为含羟基氨基酸。在示例性方面，X₁₁是酸性氨基酸。在示例性方面，X₁、X₂、X₃、X₈和X₉的每一个独立选自L、A、G和I。在示例性方面，X₄、X₅和X₁₀的每一个独立地为选自R和H。在示例性方面，X₇和X₁₂独立地为T或Y。在示例性方面，X₁₁是E或D。因此，在示例性方面，所述化合物包含氨基酸序列LLARRPTKGIHEY(SEQ ID NO:45)。

额外的肽修饰

在本发明的可选或另外的实施方案中，所述肽被脂化(如，肉豆蔻酰化、棕榈酰化)、糖基化、酰胺化、羧化、磷酸化、酯化、酰基化、乙酰基化、环化或者转化为酸加成盐和/或任选地二聚化或聚合或缀合，如本文进一步描述。

脂化

在示例性方面，所述肽被脂化或另外连接至脂质。所述脂质，在一些实施方案中，是脂肪酸、类花生酸、前列腺素、白细胞三烯、血栓烷、N-酰基乙醇胺)、甘油脂(如，单、二、三-取代的甘油)、甘油磷脂(如，磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸)、鞘脂(如，鞘氨醇、神经酰胺)、固醇脂(如，类固醇、胆固醇)、异戊烯醇(prenol)脂、糖脂或聚酮、油、蜡、胆固醇、固醇、脂溶性维生素、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂。

在示例性方面，所述肽被共价连接至脂肪酸。在一些特定的实施方案中，所述脂肪酸是C4至C30脂肪酸。在示例性方面，所述脂肪酸是C4脂肪酸、C6脂肪酸、C8脂肪酸、C10脂肪酸、C12脂肪酸、C14脂肪酸、C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸、C24脂肪酸、C26脂肪酸、C28脂肪酸或C30脂肪酸的任一个。在一些实施方案中，所述脂肪酸是C8至C20脂肪酸、C12至C29脂肪酸或C14至C18脂肪酸，如C14脂肪酸或C16脂肪酸。

在示例性方面，所述肽被共价连接至脂肪酸，并且所述脂肪酸被连接至N-末端氨基酸或C-末端氨基酸。在可选的方面，所述肽被共价连接至脂肪酸，并且所述脂肪酸如经由远离内部氨基酸侧链的官能团被连接至所述肽的内部氨基酸。例如，所述脂肪酸可被连接至内部氨基酸的侧链的胺、羟基或硫醇。在示例性方面，所述肽被共价连接至脂肪酸，并且所述脂肪酸被连接至第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一或第十二氨基酸。

在示例性方面，所述肽包含SEQ ID NO:19-39、84-90和93-122的任一个的氨基酸序列，并且所述肽被共价连接至C4-C30脂肪酸。在示例性方面，所述肽是SEQ ID NO:355-412的任一个。

在一些方面，所述肽的第一氨基酸在N-端被肉豆蔻酰化，其中未修饰的肽的N-末端α-NH₂基团被连接至脂肪酸。在示例性方面，所述肽是SEQ ID NO:123-180的任一个。

在一些方面，所述肽的第一氨基酸在N-端被肉豆蔻酰化，其中未修饰的肽的N-末端α-NH₂基团被连接至C4-C30脂肪酸。在示例性方面，所述肽是SEQ ID NO:181-238的任一个。

在一些方面，所述肽的第一氨基酸在N-端被肉豆蔻酰化，其中未修饰的肽的N-末端α-NH₂基团被连接至C12-C18脂肪酸。在示例性方面，所述肽是SEQ ID NO:239-296的任一个。

在一些方面，所述肽的第一氨基酸在N-端被肉豆蔻酰化，其中未修饰的肽的N-末端α-NH₂基团被连接至肉豆蔻酸酯。在示例性方面，所述肽是SEQ ID NO:297-354的任一个。

在示例性方面，所述肽包含my。

在示例性方面，被连接至肽的脂质促进所述肽的胶束形成。为了进一步描述所述肽的胶束形式，参见“胶束”一章中的描述。

环化

在示例性方面，所述肽被环化。例如，所述肽可包含两个Cys残基，其硫原子参与二硫桥的形成。在示例性方面，所述肽包含Cys残基作为末端残基。适于用二硫桥或基于硫的环化修饰肽的方法描述于例如，Jackson等,J.Am.Chem.Soc.113:9391-9392(1991)及Rudinger和Jost,Experientia 20:570-571(1964)中。

替代地，类似物的α螺旋可通过其它肽环化方式稳定，所述方法综述于Davies,J.Peptide.Sci.9:471-501(2003)中。α螺旋可经由酰胺桥、硫醚桥、硫酯桥、脲桥、氨基甲酸酯桥、磺酰胺桥等的形成而稳定。例如，硫酯桥可在Cys残基的C-端和侧链之间形成。可选地，硫酯可经由具有硫醇(Cys)和羧酸(如，Asp、Glu)的氨基酸侧链形成。在另一种方法中，交联剂，诸如二羧酸，如辛二酸(软木酸)等可在氨基酸侧链的两个官能团(诸如游离氨基、羟基、硫醇基团及其组合)之间引入连接。

肽类似物

在一些实施方案中，所述化合物是具有基于本文公开一种肽(“母体肽”)的肽类似物，但在一个或多个方面不同于母体。因此，如由本领域普通技术人员所理解的那样，本文提供的关于母体肽的教导也可适用于肽类似物。

在一些方面，所述肽类似物包含母体肽的结构，除了所述肽类似物包含一个或多个非肽键来替代肽键。在示例性方面，所述肽类似物包含替代肽键的酯键、醚键、硫醚键、酰胺键等。在一些方面，所述肽类似物是包含替代肽键的酯键的缩酚酸肽。

在一些方面，所述肽类似物包含本文所述的母体肽的结构，除了所述肽类似物包含一种或多种氨基酸取代，如一种或多种保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是本领域中已知的，并且包括其中一种具有某些物理和/或化学性质的氨基酸被交换为另一种具有相同化学或物理性质的氨基酸的氨基酸取代。例如，保守氨基酸取代可为酸性氨基酸替换为另一种酸性氨基酸(如，Asp或Glu)、具有非极性侧链的氨基酸替换为具有非极性侧链的另一种氨基酸(如，Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Val等)、碱性氨基酸替换为另一种碱性氨基酸(Lys、Arg等)、具有极性侧链的氨基酸替换为另一种具有极性侧链的氨基酸(Asn、Cys、Gln、Ser、Thr、Tyr等)等。

在一些方面，所述肽类似物包含一种或多种合成氨基酸，如哺乳动物非天然氨基酸。合成氨基酸包括β-丙氨酸(β-Ala)、N-α-甲基-丙氨酸(Me-Ala)、氨基丁酸(Abu)、γ-氨基丁酸(γ-Abu)、氨基己酸(ε-Ahx)、氨基异丁酸(Aib)、氨基甲基吡咯羧酸、氨基哌啶羧酸、氨基丝氨酸(Ams)、氨基四氢吡喃-4-羧酸、精氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、β-天冬氨酸(β-Asp)、氮杂环丁烷羧酸、3-(2-苯并噻唑基)丙氨酸、α-叔丁基甘氨酸、2-氨基-5-脲基-n-戊酸(瓜氨酸，Cit)、β-环己基丙氨酸(Cha)、乙酰氨基甲基-半胱氨酸、二氨基丁酸(Dab)、二氨基丙酸(Dpr)、二羟基苯基丙氨酸(DOPA)、二甲基噻唑烷(DMTA)、γ-谷氨酸(γ-Glu)、高丝氨酸(Hse)、羟脯氨酸(Hyp)、异亮氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、甲基-异亮氨酸(MeIle)、异哌啶酸(Isn)、甲基-亮氨酸(MeLeu)、甲基-赖氨酸、二甲基-赖氨酸、三甲基-赖氨酸、甲醇基脯氨酸(methanoproline)、甲硫氨酸-亚砜(Met(O))、甲硫氨酸-砜(Met(O₂))、正亮氨酸(Nle)、甲基-正亮氨酸(Me-Nle)、正缬氨酸(Nva)、鸟氨酸(Orn)、对氨基苯甲酸(PABA)、青霉胺(Pen)、甲基苯基丙氨酸(MePhe)、4-氯苯基丙氨酸(Phe(4-Cl))、4-氟苯基丙氨酸(Phe(4-F))、4-硝基苯基丙氨酸(Phe(4-NO₂))、4-氰基苯基丙氨酸((Phe(4-CN))、苯基甘氨酸(Phg)、哌啶基丙氨酸、哌啶基甘氨酸、3,4-脱氢脯氨酸、吡咯烷基丙氨酸、肌氨酸(Sar)、硒半胱氨酸(Sec)、O-苄基-磷酸丝氨酸、4-氨基-3-羟-6-甲基庚酸(Sta)、4-氨基-5-环己基-3-羟戊酸(ACHPA)、4-氨基-3-羟-5-苯基戊酸(AHPPA)、1,2,3,4,-四氢-异喹啉-3-羧酸(Tic)、四氢吡喃甘氨酸、噻吩基丙氨酸(Thi)、O-苄基-磷酸酪氨酸、O-磷酸酪氨酸、甲氧基酪氨酸、乙氧基酪氨酸、O-(双-二甲基氨基-膦酰基)-酪氨酸、酪氨酸硫酸四丁胺、甲基-缬氨酸(MeVal)和烷基化3-巯基丙酸。

在一些实施方案中，所述肽类似物包含一种或多种非保守氨基酸取代，并且所述肽类似物仍以类似程度、相同程度或改善的程度起到母体肽的作用。在某些方面，包含一种或多种非保守氨基酸取代的肽类似物以比母体肽抑制程度更甚的程度抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间的结合相互作用。

在一些实施方案中，和/或一个或多个氨基酸插入或缺失，就本文所述的母体肽而言。在一些实施方案中，所述肽类似物包含就母体肽而言在N-或C-端一种或多种氨基酸的插入。在一些实施方案中，所述肽类似物包含就母体肽而言在N-或C-端一种或多种氨基酸的缺失。在这些方面，所述肽类似物仍以类似程度、相同程度或改善的程度起到母体肽的作用以抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间的结合相互作用。

在一些方面，所述肽类似物是肽模拟物。肽模拟物以及制备其的方法是本领域中已知的。参见，例如，Advances in Amino Acid Mimetics and Peptidomimetics,第1和2卷,Abell,A.编辑,JAI Press Inc.,Greenwich,CT,2006。在一些方面，所述肽模拟物是包含D-异构体氨基酸的D-肽肽模拟物。在一些方面，所述肽模拟物是其中氨基酸的侧链链接至肽主链的α氮原子的类肽。制备类肽的方法是本领域中已知的。参见，如Zuckermann等,JACS 114(26):10646-10647(1992)and Design,Synthesis,and Evaluation of Novel Peptoids,Fowler,Sarah,University of Wisconsin-Madison,2008。在一些方面，所述肽模拟物是包含β氨基酸的β-肽，所述β氨基酸的氨基键合至β-碳而非α碳。制备β-肽的方法是本领域中已知的。参见，例如，Seebach等,Helvetica Chimica Acta 79(4):913-941(1996)。

药学上可接受的盐

就本发明而言，抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间的结合相互作用的化合物(所述化合物在后文中被统称为“活性剂”)在一些方面呈盐如药学上可接受的盐的形式。此类盐可在活性剂的最后分离和纯化期间原位制备，或通过使游离碱功能与适合的酸接触单独制备。可用于形成药学上可接受的酸加成盐的酸的实例包括，例如无机酸(如，盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸)和有机酸(如，草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸)。

代表性酸加成盐包括但不限于乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸酸盐、己酸酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟乙烷磺酸盐(异硫代硫酸盐)、乳酸盐、马来酸盐、甲烷磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸酯、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。

碱加成盐也可在活性剂的最后分离和纯化期间原位制备，或者通过使含羧酸部分与适合的碱诸如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐或与氨或有机伯胺、仲胺或叔胺反应来制备。药学上可接受的盐包括但不限于基于碱金属或碱土金属的阳离子的盐，诸如锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和铝盐等，及无毒性季氨盐和胺阳离子盐(包括铵盐、四甲铵盐、四乙铵盐、甲铵盐、二甲铵盐、三甲铵盐、三乙铵盐、二乙铵盐和乙铵盐等)。其它用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括例如，乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等。

此外，碱性含硝基基团可用诸如以下的活性剂季铵化：低级烷基卤化物，诸如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；长链卤化物，诸如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂酰基氯化物、溴化物和碘化物；芳烷基卤化物，如苄基和苯乙基溴化物及其它物质。从而获得水或油-可溶性或分散性产物。

分离和纯化

可分离和/或纯化抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间的结合相互作用的本发明的化合物。如本文所用的术语"分离的"意指已从其天然环境中移出。如本文所用的术语"纯化的"意指其纯度已提高，其中"纯度"是一个相对术语，并不一定理解为绝对纯度。在示例性方面，所述化合物(如，在所述组合物中)的纯度是至少或约50％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约80％、至少或约90％、至少或约95％或者至少或约98％或约100％。

制备肽的方法

本公开的肽可由本领域已知的方法获得。适于从头合成肽的方法描述于例如，Chan等,Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis,Oxford University Press,Oxford,United Kingdom,2005；Peptide and蛋白Drug分析,Reid,R.编辑,Marcel Dekker,Inc.,2000；Epitope Mapping,Westwood等编辑,Oxford University Press,Oxford,UnitedKingdom,2000；及美国专利No.5,449,752。额外的制备本发明肽的示例性方法在本文中示出。

在一些实施方案中，本文所述的肽可由公司商业合成，诸如Synpep(Dublin,CA)、Peptide Technologies Corp.(Gaithersburg,MD)、Multiple Peptide Systems(SanDiego,CA)、Peptide 2.0Inc.(Chantilly,VA)和American Peptide Co.(Sunnyvale,CA)。在这方面，所述肽可被合成、重组、分离和/或纯化。

此外，在一些方面，所述肽可使用标准重组方法用编码所述肽氨基酸序列的核酸重组产生。参见，例如，Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第3版,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY 2001；和Ausubel等,CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons,NY,1994。

核酸

在本发明的示例性实施方案中，抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间结合相互作用的化合物包含或是核酸，所述核酸包括编码本文所述的任一种抗体或肽(包括其类似物)的核苷酸序列。所述核酸可包括编码任一种抗体、肽或其类食物的任何核苷酸序列。

在本发明的示例性实施方案中，所述化合物是抑制β整联蛋白或G蛋白α亚基表达的核酸。在示例性方面，所述化合物是反义分子、微小RNA(miRNA)、小发夹(shRNA)等。在本发明的示例性实施方案中，所述化合物是抑制本文所述的任一种β整联蛋白或G蛋白α亚基表达的核酸。在示例性方面，所述化合物是小干扰RNA分子(siRNA)。在一些方面，所述siRNA抑制Gα₁₃表达。例如，所述siRNA包含SEQ ID NO:7或8的序列。

如本文所用，借由"核酸"包括"多核苷酸"、"寡核苷酸"和"核酸分子"，并且一般意指DNA或RNA的聚合物，其可为单链或双链、从天然来源合成或获得(如，分离和/或纯化)，其可含有天然、非天然或改变的核苷酸并且可含有天然、非天然或改变的核苷酸内键，诸如氨基磷酸酯键或硫代磷酸酯键，而非未修饰的寡核苷酸的核苷酸之间存在的磷酸二酯。在一些实施方案中，所述核酸不包含任何插入、缺失、倒置和/或取代。在其它实施方案中，所述核酸包含一种或多种插入、缺失、倒置和/或取代。

在一些方面，本发明的核酸被重组。如本文所用，术语"重组"是指(i)在活细胞外通过将天然或合成核酸区段与可在活细胞中复制的核酸分子合起来构建的分子，或(ii)从以上(i)中描述的那些的复制产生的分子。为了本文的目的，复制可为体外复制或体内复制。

在一些方面，基于化学合成和/或酶促连接反应使用本领域已知的程序构建所述核酸。参见，例如，Sambrook等，同上；和Ausubel等，同上。例如，可使用天然存在的核苷酸或经设计以提高分子生物稳定性或提高杂交后形成的复合物的物理稳定性的各种修饰的核苷酸(如，硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)化学合成核酸。可用于产生所述核酸的经修饰的核苷酸的实例包括但不限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷(5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridme)、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辨苷、肌苷、N⁶-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N-取代的腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖基辨苷、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N⁶-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸(v)、怀丁氧苷、假尿嘧啶(pseudouratil)、辨苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。可选地，本发明的一种或多种核酸可从诸如Macromolecular Resources(Fort Collins,CO)和Synthegen(Houston,TX)的公司购买。

重组表达载体

在一些方面，本发明的核酸被掺入重组表达载体中。就此而言，本发明提供包含任一种本发明公开的核酸的重组表达载体。为了本发明的目的，术语"重组表达载体"意指经遗传修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，其当所述构建体包含编码mRNA、蛋白、多肽或肽的核苷酸序列，并且所述载体与所述细胞在足以在细胞内表达所述mRNA、蛋白、多肽或肽的条件下接触时允许宿主细胞表达所述mRNA蛋白、多肽或肽。本发明的载体不是作为一个整体天然存在的。然而，载体的一部分可为天然存在的。本发明公开的重组表达载体可包含任何类型的核苷酸，包括但不限于DNA和RNA，其可为单链或双链、合成或部分从天然来源获得并含有天然、非天然或改变的核苷酸。重组表达载体可包含天然存在的或非天然存在的核苷酸内键，或者两种类型的键。在一些方面，所述改变的核苷酸或非天然存在的核苷酸内键不阻碍载体的转录或复制。

本发明的重组表达载体可为任何适合的重组表达载体，并且可用于转化或转染任何适合的宿主。适合的载体包括那些被设计用于繁殖和扩增或用于表达或用于这两个目的的载体，诸如质粒和病毒。所述载体可选自pUC系列(Fermentas Life Sciences)、pBluescript系列(Stratagene,LaJoIIa,CA)、pET系列(Novagen,Madison,WI)、pGEX系列(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)和pEX系列(Clontech,Palo Alto,CA)。还可使用噬菌体载体，诸如λGTIO、λGTl 1、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNMl 149。植物表达载体的实例包括pBIOl、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。动物表达载体的实例包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。在一些方面，所述重组表达载体是病毒载体，如逆转录病毒载体。

本发明的重组表达载体可使用描述于例如，Sambrook等，同上和Ausubel等，同上中的标准重组DNA技术制备。可为环状或线性的表达载体的构建体可被制备为含有在原核或真核宿主细胞起作用的复制系统。复制系统可来源于如CoIEl、2μ质粒、λ、SV40、牛乳头瘤病毒等。

在一些方面，所述重组表达载体包含调控序列，诸如转录和翻译起始和终止密码子，其视情况并考虑所述载体是基于DNA还是基于RNA的，对所述载体所引入的某一类型的宿主(如，细菌、真菌、植物或动物)具有特异。

所述重组表达载体可包含一个或多个使得能够选择经转化或转染宿主的标记基因。标记基因包括杀菌剂抗性，如抗生素抗性、重金属抗性等，在营养缺陷型宿主中互补以提供原养型等。适用于本发明公开的表达载体的标记基因包括例如，新霉素/G418抗性基因、潮霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因和氨苄西林抗性基因。

所述重组表达载体可包含可操作性连接至编码所述多肽(包括其功能片段或功能变体)的核苷酸序列或与编码所述多肽的核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列的天然或非天然启动子。对如强的、弱的、可诱导的、组织特异性的和发育特异性的启动子的选择在技术人员的一般技艺范围内。类似地，将核苷酸序列与启动子合并也在技术人员的技艺范围内。所述启动子可为非病毒启动子或病毒启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子和在鼠科动物干细胞病毒的长末端重复中存在的启动子。

本发明公开的重组表达载体可被设计用于瞬时表达、稳定表达或两者。此外，所述重组表达载体可被制备用于组成型表达或诱导型表达。此外，所述重组表达载体可被制备为包含自杀基因。

如本文所用，术语"自杀基因"是指导致表达自杀基因的细胞死亡的基因。在一些方面，自杀基因是一种基因，其赋予表达所述基因的细胞对试剂如药物的敏感性并且当所述细胞与所述试剂接触或暴露于所述试剂时导致细胞死亡。自杀基因是本领域中已知的(参见，例如，Suicide Gene Therapy:Methods and Reviews.Springer,Caroline J.(Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of CancerResearch,Sutton,Surrey,UK),人a Press,2004)，并包括例如，单纯性疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶(cytosine daminase)、嘌呤核苷磷酸化酶和硝基还原酶。

宿主细胞

在示例性实施方案中，所述化合物是表达本发明核酸的细胞，任选地，其中所述核酸是重组表达载体的一部分(pary)。如本文所用，术语"宿主细胞"是指可含有本发明公开的重组表达载体的任何类型的细胞。在一些方面，所述宿主细胞是真核细胞，如植物、动物、真菌或藻类，或可为原核细胞，如细菌或原生动物。在一些方面，所述宿主细胞是培养的细胞或原代细胞，即直接从生物体如人分离。在一些方面，宿主细胞是粘附细胞或悬浮细胞，即悬浮生长的细胞。适合的宿主细胞是本领域中已知的，并且包括例如，DH5α大肠杆菌细胞、中国仓鼠卵巢细胞、猴VERO细胞、COS细胞、HEK293细胞等。为了扩增或复制重组表达载体的目的，宿主细胞在一些方面是原核细胞，如DH5α细胞。为了产生重组多肽的目的，所述宿主细胞在一些方面是哺乳动物细胞，如人细胞。所述宿主细胞可为任何细胞类型，可来源于任何类型的组织，及可处于任何发育阶段。

本发明还提供了包括至少一种本文所述的宿主细胞的细胞类群。在一些方面，所述细胞类群是包括宿主细胞的混杂类群，其包括除至少一种其它不包含任何重组表达载体的细胞之外的包含所述任何重组表达载体的宿主细胞。可选地，在一些方面，细胞类群基本上同种的类群，其中实施类群主要包括包含重组表达载体的宿主细胞(如，基本上由宿主细胞组成)。在一些方面，所述类群是细胞的克隆类群，其中该类群的所有细胞是包含重组表达载体的单个宿主细胞的克隆，使得该类群的所有细胞包含重组表达载体。在本发明的一个实施方案中，所述细胞类群是克隆类群，包括包含如本文所述的重组表达载体的宿主细胞。

缀合物

在一些实施方案中，本发明的化合物被附接或连接或缀合至第二部分(如，异源部分、缀合部分)。如本文所用，术语“异源部分”与“缀合部分”含义相同，并且是指任何不同于本发明化合物的分子(化学或生物化学，天然存在的或非编码的)。示例性异源部分包括但不限于聚合物、碳水化合物、脂质、核酸、寡核苷酸、DNA或RNA、氨基酸、肽、多肽、蛋白、治疗剂(如，细胞毒性剂、细胞因子)或诊断剂。

在一些实施方案中，所述化合物被各种取代基化学修饰。在一些实施方案中，所述化学修饰赋予如本文所讨论的额外所需的特性。在一些方面，化学修饰采取多种不同形式，诸如异源肽、多糖、脂质、放射性同位素、非标准氨基酸残基和核酸、金属螯合物及各种细胞毒性剂。

在一些实施方案中，所述化合物被融合至异源肽以赋予各种性质，如增加的溶解度和/或稳定性和/或半衰期、对溶蛋白性裂解的抗性、调控清除、靶向特定细胞或组织类型。在一些实施方案中，所述化合物被连接至IgG或其它免疫球蛋白的Fc结构域。在一些实施方案中，所述化合物被融合至碱性磷酸酶(AP)。制备Fc或AP融合构建体的方法参见WO02/060950。通过将所述化合物与具有特定性质(如，半衰期、生物利用度)的蛋白结构域融合，可能将这些性质赋予本发明的化合物。

如上所讨论，当所述化合物是肽，它们可通过例如糖基化、酰胺化、羧基化或磷酸化，或通过产生酸加成盐、酰胺、酯特别是C-末端酯和N-酰基衍生物修饰。所述肽还可通过与其它部分形成共价或非共价复合物被修饰以产生肽衍生物。共价键合的复合物可通过将化学部分连接至氨基酸侧链上或者N-或C-端的官能团(包括所述肽)制备。

肽可被缀合至报告基团，包括但不限于放射性标记、荧光标记、酶(如，催化量热或荧光反应)、底物、固体基质或载体(如，生物素或亲和素)。类似物的实例描述于WO 98/28621和Olofsson等,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,95:11709-11714(1998)、美国专利No.5,512,545和5,474,982；美国专利申请No.20020164687和20020164710中。

半胱氨酰残基最常与卤代乙酸酯(和相应的胺)诸如氯乙酸或氯乙酰胺反应，得到羧甲基或脲甲基(carbocyamidomethyl)衍生物反应。半胱氨酰残基也可通过与溴代三氟丙酮、α-溴-.β.(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰基磷酸盐、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞苯甲酸盐、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-噁-1,3-二唑反应而衍生。

组氨酰基残基通过与二乙基焦碳酸酯在pH 5.5-7.0下反应衍生，因为该试剂对所述组氨酰基侧链具有相对特异性。对溴苯酰甲基溴也是有用的；所述反应优选在0.1M二甲砷酸钠中于pH 6.0下进行。

使赖氨酰基和氨基末端残基与琥珀酸酐或羧酸酐反应。用这些试剂衍生化具有反转赖氨酰基残基的电荷的效果。其它适用于衍生化含α-氨基的残基的试剂包括亚胺酸酯诸如甲基吡啶亚胺甲酯；吡哆醛磷酸酯；吡哆醛；氯硼氢化物；三硝基苯磺酸；邻甲基异脲；2,4-乙酰基丙酮，以及转氨酶催化的与乙醛酸盐的反应。

精氨酰残基通过与苯基乙二醛、2,3-丁二酮、1,2-环己二酮和茚三酮中的一种或若干种常规试剂反应而被修饰。精氨酸残基的衍生化由于胍官能团的高pK需要所述反应在碱性条件下进行。此外，这些试剂可与赖氨酸的基团以及精氨酸ε-氨基反应。

带着通过使酪氨酰基残基与芳族重氮基化合物或四硝基甲烷反应而将光谱标记引入酪氨酰基残基中的特定兴趣，可对酪氨酰残基本身的特定修饰进行广泛研究。最通常地，N-乙酰基咪唑(imidizol)和四硝基甲烷用于分别形成O-乙酰基酪氨酰基种类和3-硝基衍生物。将酪氨酰基残基使用¹²⁵I或¹³¹I碘化以制备经标记的蛋白用于放射免疫测定。

羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)通过与碳二亚胺(R1)诸如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳二亚胺反应而被选择性地修饰。此外，天冬氨酰基和谷氨酰基残基可通过与铵离子反应转化为天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基残基。

用双功能试剂进行衍生化可用于将结合构建体交联至水溶性支撑基质。此类派生物(derivation)还可提供可将相邻的结合元件连接在结合构建体中或者将结合元件连接至异源肽如Fc片段的接头。常用的交联剂包括如，1,1-双(重氮乙酰基)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羟琥珀酰亚胺酯(例如与4-叠氮水杨酸形成的酯、同源双功能亚胺酸酯(homo-bifunctional imidoesters)，包括二琥珀酰亚胺基酯诸如3,3'-二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯))及双功能马来酰亚胺诸如双-N-马来酰亚胺-1,8-辛烷。衍生试剂诸如甲基-3-[(对叠氮苯基)二硫代]丙酰亚氨酸酯(methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidate)产生能够在光的存在下形成交联的可光活化的中间体。可选地，采用通过引用并入本文的美国专利No.3,969,287；3,691,016；4,195,128；4,247,642；4,229,537；和4,330,440中描述的反应性水不溶性基质诸如溴化氰活化的碳水化合物和反应性底物，以用于蛋白固定化。

谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基经常被去酰胺化为相应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基。可选地，这些残基在轻度酸性的条件下被去酰胺化。这些残基的任一种形式均在本发明的范围内。

其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Structureand Molecule Properties,W.H.Freeman&Co.,San Francisco,第79-86页,1983)，N-末端胺的乙酰基化，及在一些情况下C-末端羧基的酰胺化。此类衍生物为经化学修饰的多肽组合物，其中结合构建体多肽被连接至聚合物。

通常，化学衍生化可在任何适于使蛋白与活化的聚合物分子反应的条件下进行。制备多肽化学衍生物的方法通常将包括一些步骤(a)使所述多肽与活化的聚合物分子(诸如所述聚合物分子的反应性酯或醛衍生物)在一定条件下反应，从而结合构建体附接至一个或多个聚合物分子，和(b)获得反应产物。最佳反应条件将基于已知的参数和所需的结果确定。例如，聚合物分子：蛋白的比率越大，则附接的聚合物分子的量越高。在一些实施方案中，所述化合物可具有在氨基端的单个聚合物分子部分。(参见，如美国专利No.5,234,784)。

本文公开的衍生化的结合构建体与非衍生化分子相比可具有额外的活性、增强或减弱的生物活性，或者其它特性，诸如增长或减短的半衰期。

在一些实施方案中，所述化合物在接头不存在的情况下被直接连接至缀合部分。在可选的方面，所述化合物经由一个或多个接头间接连接至缀合部分。无论是直接连接在一起还是通过接头间接连接在一起，所述化合物可通过共价键(如，肽键、酯键、酰胺键或硫氢基键)或非共价键(如，经由疏水相互作用、氢键、范德华键(van der Waals bond)、静电或离子相互作用)或其组合连接。本发明的化合物和缀合部分可经由本领域已知的任何方式连接，包括但不限于经由本发明的任何接头。参见，例如，本文中题为“接头”的一章。

缀合物：Fc融合体

对于取代基诸如人IgG的Fc区，融合体可被直接融合至本发明的化合物或通过插入序列融合。例如，人IgG铰链区、CH2区和CH3区可融合在结合构建体的N-端或C-端以附接Fc区。所得的Fc-融合体构建体使得能够经由蛋白A亲和柱子(Pierce,Rockford,Ill.)纯化。融合至Fc区的肽和蛋白可展现出未融合的对应物基本上更佳的体内半衰期。融合至Fc区使得融合体多肽能够二聚化/多聚化。Fc区可为天然存在的Fc区，或可经修饰以具有优良的特性，如治疗质量、循环时间、聚集减少。如上所述，在一些实施方案中，所述化合物缀合如融合至免疫球蛋白或其部分(如，可变区、CDR或Fc区)。已知类型的免疫球蛋白(Ig)包括IgG、IgA、IgE、IgD或IgM。Fc区是Ig重链的C-末端区，其负责结合至进行活动(诸如循环(导致半衰期增长)、抗体依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)及补体依赖性细胞毒性(CDC))的Fc受体。

例如，根据一些定义，人IgG重链Fc区从Cys226延伸至重链C-端。"铰链区"一般从人IgG1的Glu216延伸至Pro230(其它IgG同种型的铰链区可通过比对半胱氨酸键合中涉及的半胱氨酸而与IgG1序列比对)。IgG的Fc区包括两个恒定结构域，CH2和CH3。人IgG Fc区的CH2结构域通常从氨基酸231延伸至氨基酸341。人IgG Fc区的CH3结构域通常从氨基酸342延伸至447。对免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段或区的氨基酸编号进行的参考，全部基于Kabat等1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department ofPublic Health,Bethesda,Md。在相关的实施方案中，Fc区可包含来自免疫球蛋白重链的一个或多个天然或经修饰的恒定区而非CH1，例如IgG和IgA的CH2和CH3区或者IgE的CH3和CH4区。

适合的缀合部分包括免疫球蛋白序列中包含FcRn结合位点的部分。拯救受体FcRn负责在血液中循环免疫球蛋白并将其送回循环。IgG的Fc部分中结合至FcRn受体的区域已经基于X射线结晶学进行了描述(Burmeister等1994,Nature 372:379)。Fc与FcRn主要接触的区域在CH2和CH3结构域的接合处附近。Fc-FcRn接触都在单个Ig重链内。主要接触位点包括CH2结构域的氨基酸残基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314及CH3结构域的氨基酸残基385-387、428和433-436。

一些缀合部分可包括或可不包括FcγR结合位点。FcγR负责ADCC和CDC。Fc区内与FcγR直接接触的位置的实例是氨基酸234-239(下部铰链区)、氨基酸265-269(B/C环)、氨基酸297-299(C'/E环)及氨基酸327-332(F/G)环(Sondermann等,Nature 406:267-273,2000)。IgE的下部铰链区也已经牵涉在FcRI结合中(Henry,等,Biochemistry 36,15568-15578,1997)。IgA受体结合中涉及的残基描述于Lewis等,(J Immunol.175:6694-701,2005)中。IgE受体结合中涉及的氨基酸残基描述于Sayers等(J Biol Chem.279(34):35320-5,2004)中。

可对免疫球蛋白的Fc区进行氨基酸修饰。此类变体Fc区包含在Fc区的CH3结构域(残基342-447)中的至少一种氨基酸修饰和/或Fc区的CH2结构域(残基231-341)中的至少一种氨基酸修饰。据信赋予对FcRn提高的亲和力的突变包括T256A、T307A、E380A和N434A(Shields等2001,J.Biol.Chem.276:6591)。其它突变可减少Fc区与FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和/或FcγRIIIA的结合而不限制降低对FcRn的亲和力。例如，用Ala或另一种氨基酸取代Fc区位置297处的Asn移除了高度保守的N-糖基化位点，并且可导致免疫原性减小并伴随Fc区的半衰期延长以及与FcγR结合减少(Routledge等1995,Transplantation 60:847；Friend等1999,Transplantation 68:1632；Shields等1995,J.Biol.Chem.276:6591)。已经进行了在IgG1的位置233-236处的氨基酸修饰，其使与FcγR的结合减少(Ward和Ghetie1995,Therapeutic Immunology 2:77及Armour等1999,Eur.J.Immunol.29:2613)。一些示例性氨基酸取代描述于美国专利7,355,008和7,381,408中，其各自通过引用以其整体并入本文。

异源部分：聚合物、碳水化合物和脂质

在一些实施方案中，所述异源部分是聚合物。所述聚合物可为支链或非支链。所述聚合物可具有任何分子量。在一些实施方案中，所述聚合物的平均分子量为约2kDa至约100kDa(术语"约"表明在制备水溶性聚合物中，一些分子将比指定的分子量更重、稍微更轻)。在一些方面，所述聚合物的平均分子量为约5kDa至约50kDa、约12kDa至约40kDa或约20kDa至约35kDa。

在一些实施方案中，所述聚合物被修饰以具有单一的反应基团，诸如用于酰基化的活性酯或者用于烷基化的醛，使得聚合程度可控制。在一些实施方案中，所述聚合物是水溶性的使得其附接的蛋白不在水性环境诸如生理环境中沉淀。在一些实施方案中，例如当所述组合物用作治疗用途时，所述聚合物是药学上可接受的。此外，在一些方面，所述聚合物是聚合物的混合物，如共聚物、嵌段共聚物。

在一些实施方案中，所述聚合物选自：聚酰胺，聚碳酸酯，聚亚烷基及其衍生物包括聚(亚烷基)二醇、聚环氧烷、聚亚烷基对苯二酸酯(polyalkylene terepthalates)，丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物包括聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁基酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八烷基酯)，聚乙烯聚合物包括聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物、聚(乙酸乙烯酯)和聚乙烯吡咯烷酮，聚乙交酯，聚硅氧烷，聚氨酯及其共聚物，纤维素包括烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟-丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、乙酸纤维素、丙酸纤维素、丁酸乙酸纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素、羧基乙基纤维素、三乙酸纤维素和硫酸纤维素钠盐，聚丙烯，聚乙烯包括聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)和聚(对苯二甲酸乙二酯)及聚苯乙烯。

在一些方面，所述聚合物是可生物降解的聚合物，包括合成可生物降解的聚合物(如，乳酸和羟基乙酸的聚合物、聚酐、聚(邻)酯、聚氨酯、聚(丁酸)(ploy(butic acid))、聚(戊酸)及聚(丙交酯-共已内酯))，和天然可生物降解的聚合物(如，藻酸盐和其它多糖(包括葡聚糖和纤维素)、胶原、其化学衍生物(取代、添加化学基团(例如，烷基、亚烷基)、羟基化、氧化和由本领域技术人员常规进行的其它修饰)、白蛋白和其它亲水性蛋白(如，玉米醇溶蛋白和其它醇溶谷蛋白及疏水性蛋白))以及其任何共聚物或混合物。通常，这些材料通过在体内酶促水解或暴露于水通过表面或本体溶蚀降解。

在一些方面，所述聚合物是生物粘附聚合物，诸如生物溶蚀水凝胶(由H.S.Sawhney,C.P.Pathak和J.A.Hubbell描述于Macromolecules,1993,26,581-587中，其教导内容并入本文)、聚透明质酸、酪蛋白、明胶、明胶蛋白、聚酐、聚丙烯酸、藻酸盐、壳聚糖、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八烷基酯)。

在一些实施方案中，所述聚合物是水溶性聚合物或亲水性聚合物。适合的水溶性聚合物是本领域中已知的并包括例如，聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素(HPC；Klucel)、羟丙基甲基纤维素(HPMC；Methocel)、硝基纤维素、羟丙基乙基纤维素、羟丙基丁基纤维素、羟丙基戊基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素(Ethocel)、羟乙基纤维素、各种烷基纤维素和羟烷基纤维素、各种纤维素醚、乙酸纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、乙酸乙烯酯/巴豆酸共聚物、甲基丙烯酸聚-羟烷酯、甲基丙烯酸羟甲酯、甲基丙烯酸共聚物、聚甲基丙烯酸、聚甲基甲基丙烯酸酯、马来酸酐/甲基乙烯醚共聚物、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠和钙、聚丙烯酸、酸性羧基聚合物、羧聚乙烯(carboxypolymethylene)、羧乙烯基聚合物、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、甲基乙烯醚共-马来酸酐共聚物、羧甲基酰胺、甲基丙烯酸钾二乙烯基苯共聚物、聚氧乙烯二醇、聚环氧乙烷及其衍生物、盐和其组合。在一些方面，水溶性聚合物或其混合物包括但不限于，N-连接或O-连接的碳水化合物、糖、磷酸盐、碳水化合物；糖；磷酸盐；聚乙二醇(PEG)(包括已被用于衍生化蛋白的PEG形式，包括单-(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇)；单甲氧基-聚乙二醇；葡聚糖(诸如例如约6kD的低分子量葡聚糖)、纤维素；纤维素；其它基于碳水化合物的聚合物、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇同聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(如,甘油)及聚乙烯醇。本发明还涵盖了可用于制备共价附接的多聚体的双功能交联分子。

可用于本文中的特别优选的水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)。如本文所用聚乙二醇意在涵盖可用于衍生化其它蛋白的任何形式的PEG，诸如单-(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇。PEG是直链或支链中性聚醚，可以广泛的分子量提供，并且可溶于水和大多数有机溶剂中。PEG当存在于水中时主要通过其高动态链运动性(high dynamic chainmobility)和疏水(hydrophibic)特性有效地排除其它聚合物或肽，从而在附接至其它蛋白或聚合物表面时产生水壳或水合球。PEG无毒、无免疫原，并且由食品和药品管理局(Foodand Drug Administration)批准用于国内消费。

蛋白或酶当缀合至PEG在动物中给药时具有证明了的生物活性、非抗原性质及降低的清除速率。F.M.Veronese等,Preparation and Properties of Monomethoxypoly(ethylene glycol)-modified Enzymes for Therapeutic Applications,于J.M.Harris编辑,poly(ethylene glycol)Chemistry--Biotechnical and BiomedicalApplications,127-36,1992中，其通过引用并入本文。这些现象是由于PEG的排阻性质防止了免疫系统的识别。此外，PEG已广泛用于表面修饰程序以减少蛋白吸附并改善血液相容性。S.W.Kim等,Ann.N.Y.Acad.Sci.516:116-30 1987；Jacobs等,Artif.Organs 12:500-501,1988；Park等,J.Poly.Sci,Part A 29:1725-31,1991，其通过引用并入本文。疏水性聚合物表面，诸如聚氨酯和聚苯乙烯可通过PEG(MW 3,400)的接枝修饰，并用作为抗血栓表面。表面性质(接触角度)可能与亲水性表面更一致，这是由于PEG的水合作用。更重要的是，蛋白(白蛋白和其它血浆蛋白)吸附可显著减少，这是由于PEG的高链能动性、水合球及蛋白排除性质所导致。

PEG(MW 3,400)在表面固定化研究中被确定为最佳尺寸，Park等,J.Biomed.Mat.Res.26:739-45,1992，而PEG(MW 5,000)在降低蛋白抗原性方面最有益。(F.M.Veronese等,In J.M.Harris,等,Poly(Ethylene Glycol)Chemistry--Biotechnicaland Biomedical Applications,127-36.)

制备聚乙二醇化化合物的方法可包括以下步骤：(a)使所述化合物与聚乙二醇(诸如PEG的反应性酯或醛衍生物)在条件下反应从而所述化合物附接至一个或多个PEG基团上，和(b)获得反应产物。通常，酰基化反应的最佳反应条件将基于已知的产生和所需的结果来确定。例如，PEG：化合物的比率越大，聚-聚乙二醇化产物的百分比越高。在一些实施方案中，所述化合物将在N-端具有单个PEG部分。参见美国专利No.8,234,784，在通过引用并入本文。

在一些实施方案中，异源部分是碳水化合物。在一些实施方案中，所述碳水化合物是单糖(如，葡萄糖、半乳糖、果糖)、二糖(如，蔗糖、乳糖、麦芽糖)、寡糖(如，棉籽糖、水苏糖)、多糖(淀粉、淀粉酶、支链淀粉、纤维素、几丁质、胼胝质、昆布多糖、木聚糖、甘露聚糖、褐藻糖胶、半乳甘露聚。

在一些实施方案中，异源部分是脂质。所述脂质，在一些实施方案中，是脂肪酸、类花生酸、前列腺素、白细胞三烯、血栓烷、N-酰基乙醇胺)、甘油脂(如，单、二、三-取代的甘油)、甘油基磷脂(如，磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸)、鞘脂(如，鞘氨醇、神经酰胺)、固醇脂(如，类固醇、胆固醇)、异戊烯醇脂、糖脂或聚酮、油、蜡、胆固醇、固醇、脂溶性维生素、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂。

异源部分：治疗剂

在一些实施方案中，异源部分是治疗剂。所述治疗剂可以是本领域已知的任何治疗剂。本文涵盖的治疗剂的实例包括但不限于，天然酶、来源于天然来源的蛋白、重组蛋白、天然肽、合成肽、环肽、抗体、受体激动剂、细胞毒性剂、免疫球蛋白、β-肾上腺素能阻断剂、钙通道阻滞剂、冠状血管扩张剂、强心苷、抗心律不齐药、心拟交感神经药(cardiacsympathomemetics)、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、利尿剂、肌力药(inotropes)、胆固醇和甘油三酯还原剂、胆酸多价螯合剂(sequestrants)、贝特类、3-羟-3-甲基戊二酸(HMG)-CoA还原酶抑制剂、烟酸衍生物、抗肾上腺素剂、α-肾上腺素能阻断剂、中枢作用性抗肾上腺素剂、血管舒张剂、保钾药、噻嗪及相关药剂、血管紧张素II受体拮抗剂、外周血管舒张剂、抗雄激素、雌激素、抗生素、类视黄醇、胰岛素及类似物、α-葡糖苷酶抑制剂、双胍、氯茴苯酸、磺酰脲、噻唑烷二酮(thizaolidinediones)、雄激素、孕激素、骨代谢调节剂、垂体前叶激素、下丘脑激素、垂体后叶激素、促性腺激素、促性腺激素-释放激素拮抗剂、促排卵药、选择性雌激素受体调节剂、抗甲状腺药、甲状腺激素、容积性药物、缓泻剂、抗蠕动药、菌群调节剂、肠道吸附剂、肠道抗-感染药、抗厌食药(antianorexic)、抗恶病质药(anticachexic)、抗贪食症药(antibulimics)、食欲抑制剂、减肥药、抗酸剂、上消化道药、抗胆碱能药、氨基水杨酸衍生物、生物效应调节物、皮质类固醇、解痉药、5-HT₄部分激动剂、抗组胺、大麻、多巴胺拮抗剂、血清素拮抗剂、细胞保护剂、组胺H2-受体拮抗剂、粘膜保护剂、质子泵抑制剂、根除幽门螺杆菌治疗、红细胞生成刺激剂、造血剂、贫血剂、肝素、抗纤维蛋白溶解剂、止血剂、血液凝血因子、二磷酸腺苷抑制剂、糖蛋白受体抑制剂、纤维蛋白原-血小板结合抑制剂、血栓烷-A₂抑制剂、纤溶酶原激活物、抗血栓药、糖皮质激素、盐皮质激素、皮质类固醇、选择性免疫抑制剂、抗真菌剂、预防性疗法中涉及的药物、AIDS-相关的感染、巨细胞病毒、非核苷逆转录酶抑制剂、核苷类似物逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、贫血、卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、氨基糖苷、碳青霉烯、头孢菌素、糖肽(glycopoptides)、林可酰胺、大环内酯物(macrolies)、噁唑烷酮、青霉素、链阳菌素、磺酰胺、甲氧苄啶及衍生物、四环素、驱虫剂、amebicies、双胍、金鸡纳生物碱、叶酸拮抗剂、喹啉衍生物、卡氏肺孢子虫治疗(Pneumocystis carinii therapy)、酰肼、咪唑、三唑、硝基咪唑、环胺、神经氨酸酶抑制剂、核苷、磷酸盐粘合剂、胆碱酯酶抑制剂、辅助治疗、巴比妥类及衍生物、苯并二氮卓、γ氨基丁酸衍生物、乙内酰脲衍生物、亚氨基芪衍生物、琥珀酰亚胺衍生物、抗惊厥药、麦角生物碱、抗偏头痛制剂(antimigrane preparations)、生物应答调节剂、氨基甲酸酯、三环衍生物、去极化剂、非去极化剂、神经肌肉麻痹剂、CNS刺激剂、多巴胺能试剂、单胺氧化酶抑制剂、COMT抑制剂、磺酸烷酯、乙烯亚胺、咪唑四嗪、氮芥、亚硝基脲、含铂化合物、抗代谢药、嘌呤类似物、嘧啶类似物、脲衍生物、蒽环类、放线菌素D、喜树碱衍生物、表鬼臼毒素、紫杉烷、长春花生物碱及类似物、抗雄激素、抗雌激素、非类固醇芳香化酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂抗肿瘤药、氮杂螺癸二酮衍生物、抗焦虑药、刺激剂、单胺再摄取抑制剂(monoamind reuptake inhibitors)、选择性血清素再摄取抑制剂、抗抑郁药、苯并异噁唑衍生物、丁酰苯衍生物、二苯二氮平衍生物、二苯二氮平衍生物、二苯基丁基哌啶衍生物、吩噻嗪、噻吩并苯二氮平衍生物、噻吨衍生物、变应原提取物、非类固醇药、白细胞三烯受体拮抗剂、黄嘌呤、内皮素受体拮抗剂、前列腺素、肺表面活性剂、溶黏痰剂、抗有丝分裂剂、排尿酸药、黄嘌呤氧化酶抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂、六亚甲基四胺盐(metheaminesalts)、硝基呋喃衍生物、喹诺酮、平滑肌松弛剂、拟副交感神经药、卤代烃、氨基苯甲酸酯、酰胺(如利多卡因、阿替卡因盐酸盐、布比卡因盐酸盐)、退热剂、催眠药和镇静药、环吡咯酮、吡唑并嘧啶、非类固醇抗盐要、阿片类、对氨基苯酚衍生物、醇脱氢酶抑制剂、肝素拮抗剂、吸附剂、催吐剂、阿片类拮抗剂、胆碱酯酶重活化剂、尼古丁替代疗法、维生素A类似物和拮抗剂、维生素B类似物和拮抗剂、维生素C类似物和拮抗剂、维生素D类似物和拮抗剂、维生素E类似物和拮抗剂、维生素K类似物和拮抗剂。

本发明的化合物可被缀合至可有效抑制肿瘤转移的一个或多个细胞因子和生长因子，并且其中所述细胞因子或生长因子已显示出对至少一种细胞类群具有抗增殖作用。此类细胞因子、淋巴因子、生长因子或其它造血因子包括但不限于：M-CSF、GM-CSF、TNF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IFN、TNFα、TNF1、TNF2、G-CSF、Meg-CSF、GM-CSF、血小板生成素、干细胞因子和红细胞生成素。另外用于本文中的生长因子包括血管生成素、骨形态发生蛋白-1、骨形态发生蛋白-2、骨形态发生蛋白-3、骨形态发生蛋白-4、骨形态发生蛋白-5、骨形态发生蛋白-6、骨形态发生蛋白-7、骨形态发生蛋白-8、骨形态发生蛋白-9、骨形态发生蛋白-10、骨形态发生蛋白-11、骨形态发生蛋白-12、骨形态发生蛋白-13、骨形态发生蛋白-14、骨形态发生蛋白-15、骨形态发生蛋白受体IA、骨形态发生蛋白受体IB、脑源神经营养因子、纤毛神经营养因子、纤毛神经营养因子受体α、细胞因子-诱导的嗜中性白细胞趋化因子1、细胞因子-诱导的嗜中性白细胞趋化因子2α、细胞因子-诱导的嗜中性白细胞趋化因子2β、β内皮细胞生长因子、内皮素1、上皮细胞来源的嗜中性粒细胞趋化物、神经胶质细胞系-来源的神经营养因子受体α1、神经胶质细胞系-来源的神经营养因子受体α2、生长相关蛋白、生长相关蛋白α、生长相关蛋白β、生长相关蛋白γ、肝素结合表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子受体、胰岛素样生长因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白、角质形成细胞生长因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受体α、神经生长因子、神经生长因子受体、神经营养因子-3、神经营养因子-4、前-B细胞生长刺激因子、干细胞因子、干细胞因子受体、转化生长因子α、转化生长因子β、转化生长因子β1、转化生长因子β1.2、转化生长因子β2、转化生长因子β₃、转化生长因子β5、潜伏转化生长因子β1、转化生长因子β结合蛋白I、转化生长因子β结合蛋白II、转化生长因子β结合蛋白III、I型肿瘤坏死因子受体、II型肿瘤坏死因子受体、尿激酶-型纤溶酶原激活物受体和嵌合蛋白及其生物或免疫活性片段。

在一些实施方案中，所述缀合物包括如本文所述的化合物和细胞毒性剂。所述细胞毒性剂是对细胞有毒性的任何分子(化学或生物化学)。在一些方面，当细胞毒性剂缀合至本发明的化合物时，所获得的结果是协同的。也就是说，化合物和细胞毒性剂的联合疗法的效果是协同的，即所述效果比所期望的这两个单独效果累加起来更好。因此，可减少细胞毒性剂的剂量并因此伴随着毒性问题和其它副作用减小。在一些实施方案中，所述细胞毒性剂是化学治疗剂。化学治疗剂是本领域中已知的并且包括但不限于铂配位化合物、拓扑异构体酶抑制剂、抗生素、抗有丝分裂的生物碱和二氟核苷，如在美国专利No.6,630,124中所述。

在一些实施方案中，所述化学治疗剂是铂配位化合物。术语"铂配位化合物"是指任何抑制肿瘤细胞生长的铂配位化合物，其提供离子形式的铂。在一些实施方案中，所述铂配位化合物是顺式-二氨二水合铂(II)-离子(cis-diamminediaquoplatinum(II)-ion)；氯(二亚乙基三胺)-铂(II)氯化物；二氯(乙二胺)-铂(II)、二氨(1,1-环丁烷二羧基化离子)铂(II)(diammine(1,1-cyclobutanedicarboxylato)platinum(II)，卡铂)；螺铂；异丙铂；二氨(2-乙基丙二酸)-铂(II)(diammine(2-ethylmalonato)-platinum(II))；乙二胺丙二酸铂(II)；水合(1,2-二氨基二环己烷)-硫酸铂(II)(aqua(1,2-diaminodyclohexane)-sulfatoplatinum(II))；(1,2-二氨基环己烷)丙二酸铂(II)；(4-羧甲基邻苯二甲酸)(1,2-二氨基环己烷)铂(II)((4-caroxyphthalato)(1,2-diaminocyclohexane)platinum(II))；(1,2-二氨基环己烷)-(异柠檬酸)铂(II)；(1,2-二氨基环己烷)顺式(丙酮酸)铂(II)；(1,2-二氨基环己烷)草酸铂(II)；奥马铂；和四铂。

在一些实施方案中，顺铂是本发明的组合物和方法中采用的铂配位化合物。顺铂可以PLATINOL^TM的名称从Bristol Myers-Squibb Corporation商购获得，并且可呈粉末状获得以用水、无菌盐水或其它适合的媒介物复溶(constitution)。其它适用于本发明的铂配位化合物是已知的，并可商购获得和/或可通过常规技术制备。顺铂或顺式-二氯二氨铂II，已作为化学治疗剂多年成功用于治疗各种人恶性实体瘤。更近以来，其它二氨基-铂复合物也已经显示出作为化学治疗剂在各种人恶性实体瘤的治疗中的功效。此类二氨基-铂复合物包括但不限于螺铂和卡铂。尽管顺铂和其它二氨基-铂复合物已经在人类中广泛用作化学治疗剂，但它们必须以高剂量水平递送，这可导致毒性问题诸如肾损伤。

在一些实施方案中，所述化学治疗剂是拓扑异构酶抑制剂。拓扑异构酶是真核细胞中能够改变DNA拓扑学的酶。它们对于细胞功能和细胞增殖很重要。通常，在真核细胞中存在两类拓扑异构酶，I型和II型。拓扑异构酶I是分子量大约100,000的单体酶。所述酶结合DNA并引入瞬时单链断裂、解开双螺旋(或使其解开)及随后重新封装断裂之后从DNA链解离。各种拓扑异构酶抑制剂最近已经在罹患卵巢癌/食管癌或非小细胞肺癌的人的治疗中显示出临床功效。

在一些方面，拓扑异构酶抑制剂是喜树碱或喜树碱类似物。喜树碱水是由中国特有树喜树(Camptotheca accuminat)和印度特有树臭味假柴龙树(Nothapodytes foetida)产生的不溶性、有细胞毒性的生物碱。喜树碱展现出针对多种肿瘤细胞具有肿瘤细胞生长抑制活性。喜树碱类似物类的化合物通常是DNA拓扑异构酶I的特异性抑制剂。借由术语"拓扑异构酶的抑制剂"意指任何在结构上与喜树碱相关的肿瘤细胞生长抑制化合物。喜树碱类似物类的化合物包括但不限于；拓扑替康、伊立替康和9-氨基-喜树碱。

在另外的实施方案中，所述细胞毒性剂是以下要求保护或描述的任何肿瘤细胞生长抑制喜树碱类似物：1991年4月2日授予的美国专利No.5,004,758和1989年6月21日以20'公布No.EP 0 321 122公布的欧洲专利申请No.88311366.4；1986年8月5日授予的美国专利No.4,604,463和1985年4约17日公布的欧洲专利申请公布No.EP 0 137 145；1984年9月25日授予的美国专利No.4,473,692和1983年3月16日公布的欧洲专利申请公布No.EP 0 074256；1985年10约8日授予的美国专利No.4,545,880和1983年3月16日公布的欧洲专利申请公布No.EP 0 074 256；1983年9月14日公布的欧洲专利申请公布No.EP 0 088 642；Wani等,J.Med.Chem.,29,2358-2363(1986)；Nitta 等,Proc.14th InternationalCongr.Chemotherapy,Kyoto,1985,Tokyo Press,Anticancer Section 1,第28-30页，特别是一种被称为CPT-11的化合物。CPT-11是喜树碱类似物，其4-(哌啶子基)-哌啶侧链通过氨基甲酸酯键连接在10-羟-7-乙基喜树碱的C-10处。CPT-11当前正在进行人临床试验，并且也被称为伊立替康；Wani等,J.Med.Chem.,23,554(1980)；Wani等,J.Med.Chem.,30,1774(1987)；1982年8月3日授予的美国专利No.4,342,776；1990年9月13日提交的美国专利申请序列No.581,916和1991年3月20日公布的欧洲专利申请公布No.EP 418 099；1985年4月23日授予的美国专利No.4,513,138和1983年3月23日公布的欧洲专利申请公布No.EP 0 074770；1983年8月16日颁布的美国专利No.4,399,276和1982年7月28日公布的欧洲专利申请公布No.0 056 692；其每一个的全部公开内容在此通过引用并入。所有以上列出的喜树碱类似物类的化合物可商购获得和/或可通过常规技术制备，包括包括以上列出的参考文献中所述的那些技术。拓扑异构酶抑制剂可选自拓扑替康、伊立替康和9-氨基喜树碱。

喜树碱类似物类的多种化合物(包括其药学上可接受的盐、水合物和溶剂合物)的制备以及包含此类喜树碱类似物类化合物和惰性剂、药学上可接受的载体或稀释剂的口服和胃肠外药物组合物的制备，广泛描述于1991年4月2日颁布的美国专利No.5,004,758和1989年6月21日以公布No.EP 0 321 122公布的欧洲专利申请，其教导内容通过引用并入本文。

在本发明的又一些其它实施方案中，所述化学治疗剂是抗生素化合物。适合的抗生素包括但不限于多柔比星、丝裂霉素、博来霉素、柔红霉素和链佐星。

在一些实施方案中，所述化学治疗剂是抗有丝分裂生物碱。通常，抗有丝分裂的生物碱可从长春花(Cantharanthus roseus)提取，并且已经显示出可有效作为抗癌化疗剂。已经在化学和药理学上研究了多种半合成衍生物(参见，O.Van Tellingen等,AnticancerResearch,12,1699-1716(1992))。本发明的抗有丝分裂生物碱包括但不限于长春碱、长春新碱、长春地辛、泰素(Taxol)和长春瑞滨。后两种抗有丝分裂生物碱可分别从Eli Lillyand Company和Pierre Fabre Laboratories商购获得(参见，美国专利No.5,620,985)。在本发明优选的方面，抗有丝分裂生物碱是长春瑞滨。

在本发明的其它实施方案中，所述化学治疗剂是二氟核苷。2'-脱氧-2',2'-二氟核苷在本领域中已知具有抗病毒活性。此类化合物于美国专利No.4,526,988和4,808614中公开并教导。欧洲专利申请公布184,365公开了这些相同的二氟核苷具有溶瘤活性。在某些特定方面，本发明的组合物和方法中所用的2'-脱氧-2',2'-二氟核苷是2'-脱氧-2',2'-二氟胞苷盐酸盐，也被称为吉西他滨盐酸盐。吉西他滨可商购获得或如美国专利No.4,526,988、4,808,614和5,223,608中所公开和教导的那样以多步过程合成，其教导内容通过引用并入本文。

缀合物：靶向形式

本领域的普通技术人员将容易理解本公开的化合物可以任何数量的方式进行修饰，使得本发明的化合物的治疗性或预防性功效通过所述修饰增加。例如，本公开的化合物可直接或间接通过接头缀合至靶向部分。使化合物缀合至靶向部分的实践是本领域中已知的。参见，例如，Wadhwa等,J Drug Targeting,3,111-127(1995)和美国专利No.5,087,616。如本文所用的术语“靶向部分”是指任何特异性识别并结合至细胞-表面受体的分子或试剂，使得靶向部分将本发明的化合物引导递送至在其表面表达受体的细胞类群。靶向部分包括但不限于，抗体或其片段、肽、激素、生长因子、细胞因子及任何其它结合至细胞表面受体的天然或非天然配体(如，上皮生长因子受体(EGFR)、T-细胞受体(TCR)、B-细胞受体(BCR)、CD28、血小板来源的生长因子受体(PDGF)、烟碱性乙酰胆碱受体(nAChR)等)。如本文所用，“接头”是键、分子或分子中使两个分开的实体彼此结合的基团。接头可提供两个实体间的最佳间隔或可另外提供使得两个实体彼此分离的不稳定键。不稳定键包括光可切割基团、酸-不稳定部分、碱-不稳定部分及酶可切割基团。术语“接头”在一些实施方案中，是指任何将本发明的化合物桥接至靶向部分的试剂或分子。所述接头可以是本文于题为“接头”一章中所述的任何接头。本领域的普通技术人员认识到本发明的化合物上非化合物功能所必需的位点是附接接头和/或靶向部分的理想位点，前提是所述接头和/或靶向部分一旦附接至所述化合物就不干扰所述化合物的功能，即如本文所述抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间的结合相互作用的能力。

接头

在一些实施方案中，所述缀合物包含将本发明的化合物连接至异源部分的接头。在一些方面，所述接头包含1至约60个原子，或1至30个原子或更长，2至5个原子，2至10个原子，5至10个原子，或10至20个原子长的链。在一些实施方案中，所述链原子可都为碳原子。在一些实施方案中，接头主链中的链原子选自C、O、N和S。链原子和接头可根据它们预期的溶解度(亲水性)选择，以提供更可溶的缀合物。在一些实施方案中，所述接头提供经受酶或其它催化剂或靶组织或器官或细胞中存在的水解条件切割的官能团。在一些实施方案中，所述接头的长度足够长以减少空间位阻的势能。在一些实施方案中，所述接头是氨基酸或肽基接头。此类肽基接头可为任何长。示例性接头为约1至50个氨基酸长，5至50、3至5、5至10、5至15或10至30个氨基酸长。

二聚体和多聚体

在一些实施方案中，所述化合物作为其中一个以上的本发明化合物连接在一起的二聚体或多聚体提供。在一些方面，所述二聚体是包含两个连接在一起的相同类型化合物(如，相同结构)的同源二聚体。在可选的方面，所述二聚体是包含本发明的两个化合物的异源二聚体，其中所述两个化合物在结构上彼此不同。在一些方面，所述多聚体是包含一个以上的本发明化合物的同源多聚体，并且每个化合物是相同的类型(如，相同结构)。在可选的方面，所述多聚体是包含一个以上本发明化合物的异源多聚体，并且其中所述异源多聚体至少两个化合物在结构上彼此不同。两个或多个化合物可使用本领域技术人员已知的标准连接剂(linking agents)和程序连接在一起。在某些实施方案中，所述连接两个(或多个)化合物的接头是如题为“接头”一章中所述的接头。在一些实施方案中，所述接头是二硫键。例如，二聚体的每一个单体可包含硫氢基，并且每一个单体的硫原子参与二硫键的形成。

组合物

本发明还提供了包含抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间结合相互作用的化合物的组合物，所述化合物例如如本文所述的抗体、抗原结合片段、适体、肽、肽类似物、药学上可接受的盐、缀合物、多聚体、二聚体。在一些方面，所述组合物包含呈经分离和/或经纯化形式的化合物。在一些方面，所述组合物包含单一类型(如，结构)的本发明化合物，或包含两种或多种本发明化合物的组合，其中所述组合包括不同类型(如，结构)的两种或多种化合物。

在一些方面，所述组合物包含如经由在某些温度如室温下稳定化合物、增加所述化合物的保存期、减少所述化合物的降解如氧化蛋白酶介导的降解、增加所述化合物的半衰期等增强化合物的物理-化学特性的试剂。在一些方面，所述组合物包含任选地与本发明的化合物配混或缀合至所述化合物的本文公开的任何试剂作为异源部分或缀合部分。

在某些方面，所述组合物包含有助于将本发明的化合物定位至适当位置的递送剂。在示例性实施方案中，所述组合物包含有助于将本发明的化合物送到细胞外的媒介物。在示例性方面，所述媒介物共价连接至所述化合物。在可选的方面，所述组合物包含与所述化合物配混的媒介物。在示例性方面，所述媒介物包含或是就缀合物而言本文所述的任何异源部分。例如，所述媒介物可为聚合物，如水溶性聚合物，其可为直链或支链。在示例性方面，所述水溶性聚合物选自：聚乙二醇(PEG)、支链PEG、聚唾液酸(PSA)、碳水化合物、多糖、出芽短梗孢糖、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉或淀粉衍生物、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷(PAO)、聚(亚烷基)二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、苯乙烯-共-马来酸酐共聚物、聚(1-羟甲基乙烯基-羟甲基甲醛)(PHF)和2-甲基丙烯酰氧基-2’-乙基三甲基铵磷酸盐(MPC)。

在示例性实施方案中，所述媒介物包括碳水化合物，诸如本文所述的任何碳水化合物。在示例性方面，所述媒介物包括多糖。

在示例性方面，所述媒介物包括亲脂性部分。在示例性方面，所述媒介物包括脂肪酸。所述脂肪酸可为C4至C30脂肪酸，如C4脂肪酸、C6脂肪酸、C8脂肪酸、C10脂肪酸、C12脂肪酸、C14脂肪酸、C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸、C24脂肪酸、C26脂肪酸、C28脂肪酸或C30脂肪酸。在示例性方面，所述脂肪酸是C12至C30脂肪酸。在示例性方面，所述脂肪酸是肉豆蔻酰基或棕榈酰基。在示例性方面，所述化合物是肽或肽类似物，并且所述脂肪酸共价连接至所述肽或肽类似物。例如，所述脂肪酸在N-端或C-端或经由所述肽或肽类似物的非末端氨基酸的侧链共价连接至所述肽或肽类似物。

在示例性方面，所述媒介物包括多肽，当所述多肽在组合物中时与所述多肽不存在时所述组合物的能力相比改善了所述组合物进入细胞的能力。在某些方面，所述组合物包含本发明的化合物(如，抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间结合相互作用的肽)和肽递送剂。在一些方面，所述肽递送剂是细胞穿透肽(CPP)。在特定的方面，所述组合物包含融合至所述化合物的CPP，如所述组合物包含融合肽产物，所述融合肽产物包括本发明的融合至CPP的抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间结合相互作用的肽。

药物组合物和制剂

在本发明的又一些方面，所述组合物包含抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间结合相互作用的化合物，并另外包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一些实施方案中，本发明的化合物、本发明的药学上可接受的盐、缀合物、二聚体或多聚体(在下文被称为“活性剂”)连同药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂被配制为包含所述活性剂的药物组合物。就此而言，本发明还提供了包含意在给予个体如哺乳动物的抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间结合相互作用的活性剂的药物组合物。

在一些实施方案中，所述活性剂以适于给予患者的纯度水平存在于所述药物组合物中。在一些实施方案中，所述活性剂的纯度水平为至少约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％，及药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。在一些方面，所述药物组合物包含至少A浓度的本公开的活性剂，其中A是约0.001mg/ml、约0.01mg/ml、0约1mg/ml、约0.5mg/ml、约1mg/ml、约2mg/ml、约3mg/ml、约4mg/ml、约5mg/ml、约6mg/ml、约7mg/ml、约8mg/ml、约9mg/ml、约10mg/ml、约11mg/ml、约12mg/ml、约13mg/ml、约14mg/ml、约15mg/ml、约16mg/ml、约17mg/ml、约18mg/ml、约19mg/ml、约20mg/ml、约21mg/ml、约22mg/ml、约23mg/ml、约24mg/ml、约25mg/ml或更高。在一些实施方案中，所述药物组合物包含至少B浓度的活性剂。其中B是约30mg/ml、约25mg/ml、约24mg/ml、约23mg/ml、约22mg/ml、约21mg/ml、约20mg/ml、约19mg/ml、约18mg/ml、约17mg/ml、约16mg/ml、约15mg/ml、约14mg/ml、约13mg/ml、约12mg/ml、约11mg/ml、约10mg/ml、约9mg/ml、约8mg/ml、约7mg/ml、约6mg/ml、约5mg/ml、约4mg/ml、约3mg/ml、约2mg/ml、约1mg/ml或约0.1mg/ml。在一些实施方案中，所述组合物可含有A至B mg/ml浓度范围的活性剂，例如约0.001至约30.0mg/ml。

根据给药途径，意在使用的具体活性剂以及其它因素，所述药物组合物可包含额外的药学上可接受的成分，包括例如酸化剂、添加剂、吸附剂、气雾剂推进剂、排气剂、碱化剂、防结堆剂、抗凝血剂、抗微生物防腐剂、抗氧化剂、抗菌剂、基质、粘合剂、缓冲剂、螯合剂、涂覆剂、着色剂、干燥剂、去污剂、稀释剂、消毒剂、崩解剂、分散剂、溶解增强剂、染料、软化剂、乳化剂、乳液稳定剂、填充剂、成膜剂、增味剂、调味剂、流动增强剂、胶凝剂、粒化剂、保湿剂、润滑剂、粘膜粘附剂、软膏剂基质、软膏剂、油性媒介物、有机基质、糖果锭剂基质、颜料、增塑剂、抛光剂、防腐剂、多价螯合剂、皮肤渗透剂、增溶剂、溶剂、稳定剂、栓剂基质、表面活性剂(surface active agents，surfactants)、助悬剂、甜味剂、治疗剂、增稠剂、张度剂、毒性剂、增粘剂、吸水剂、与水混溶的共溶剂、软水剂或润湿剂。

因此，在一些实施方案中，所述药物组合物包含以下组分的任何一种或其组合：阿拉伯树胶、乙酰氨基磺酸钾、乙酰基三丁基柠檬酸盐、乙酰基三乙基柠檬酸盐、琼脂、白蛋白、醇、脱水醇、变性醇、稀醇、紫胶酮酸、藻酸、脂族聚酯、氧化铝、氢氧化铝、硬脂酸铝、支链淀粉、α-直链淀粉、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、阿司帕坦、注射用抑菌水、膨润土、膨润土乳浆、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲酸、苄基醇、苄基苯甲酸盐、溴硝丙二醇、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸丁酯钠、藻酸钙、抗坏血酸钙、碳酸钙、环己基磺酰胺酸钙、无水磷酸氢钙、脱水磷酸氢钙、正磷酸钙、丙酸钙、硅酸钙、山梨醇钙、硬脂酸钙、硫酸钙、硫酸钙半水合物、芸苔油、卡波姆、二氧化碳、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、β-胡萝卜素、卡拉胶、蓖麻油、氢化蓖麻油、阳离子乳化蜡、乙酸纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、粉末状纤维素、硅化微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、十八醇十六醇混合物、溴棕三甲胺、鲸蜡醇、氯己定、氯丁醇、氯甲酚、胆固醇、醋酸氯己定、葡萄糖氯己定、盐酸氯己定、氯二氟乙烷(HCFC)、氯二氟甲烷、氯氟碳(CFC)氯苯氧乙醇、氯氯二甲酚、玉米糖浆固体、无水柠檬酸、柠檬酸单水合物、可可脂、着色剂、玉米油、棉籽油油、甲酚、间甲酚、邻甲酚、对甲酚、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、环己氨磺酸、环糊精、葡聚糖结合剂(dextrates)、糊精、葡萄糖、无水葡萄糖、重氮烷基咪唑脲、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、二乙醇胺、邻苯二甲酸二乙酯、二氟乙烷(HFC)、二甲基-β-环糊精、环糊精型化合物诸如二甲醚、邻苯二甲酸二甲酯、依地酸二钾(dipotassiumedentate)、依地酸二钠(disodium edentate)、磷酸氢二钠、多库酯钙、多库酯钾、多库酯钠、五倍子酸十二烷基酯、十二烷基三甲基溴化铵、依地酸钙钠(edentate calciumdisodium)、依地酸(edtic acid)、乙葡胺(eglumine)、乙醇、乙基纤维素、五倍子酸乙酯、月桂酸乙酯、乙基麦芽酚、油酸乙酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸乙酯钾、对羟基苯甲酸乙酯钠、乙基香草精、果糖、液体果糖、研磨的果糖、不含致热原的果糖、粉末状果糖、富马酸、明胶、葡萄糖、液体葡萄糖、饱和植物脂肪酸的甘油酯混合物、甘油、山嵛酸甘油酯、单油酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、自乳化的单硬脂酸甘油酯、棕榈酸硬脂酸甘油酯、甘氨酸、二醇、四氢呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)、瓜尔胶、庚氟丙烷(HFC)、十六烷基三甲基溴化铵、高果糖糖浆、人血清白蛋白、烃(HC)、稀盐酸、II型氢化植物油、羟乙基纤维素、2-羟乙基-β-环糊精、羟丙基纤维素、低取代的羟丙基纤维素、2-羟丙基-β-环糊精、羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、咪脲、靛胭脂、离子交换剂、氧化铁、异丙醇、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、等渗盐水、高岭土、乳酸、乳糖醇、乳糖、羊毛脂、羊毛脂醇、无水羊毛脂、卵磷脂、硅酸镁铝、碳酸镁、正常碳酸镁、无水碳酸镁、碱式碳酸镁、氢氧化镁、十二烷基硫酸镁、氧化镁、硅酸镁、硬脂酸镁、三硅酸镁、无水三硅酸镁、苹果酸、麦芽、麦芽糖醇、麦芽糖醇溶液、麦芽糊精、麦芽酚、麦芽糖、甘露醇、中链甘油三酯、葡甲胺、薄荷醇、甲基纤维素、甲基丙烯酸甲酯、油酸甲酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸甲酯钾、对羟基苯甲酸甲酯钠、微晶纤维素和羧甲基纤维素钠、矿物油、轻质矿物油、矿物油和羊毛脂醇、油、橄榄油、单乙醇胺、蒙脱石、五倍子酸辛酯、油酸、棕榈酸、石蜡、花生油、矿脂、矿脂和羊毛脂醇、药用釉、苯酚、液化苯酚、苯氧乙醇、苯氧基丙醇、苯乙醇、醋酸苯汞、硼酸苯汞、硝酸苯汞、波拉克林、波拉克林钾、泊洛沙姆、聚葡萄糖、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚丙烯酸酯、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段共聚物、聚甲基丙烯酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸钾、苯甲酸钾、碳酸氢钾、亚硫酸氢钾、氯化钾、柠檬酸钾、无水柠檬酸钾、磷酸氢钾、偏亚硫酸氢钾、磷酸二氢钾、丙酸钾、山梨酸钾、聚维酮、丙醇、丙酸、碳酸亚丙酯、丙二醇、丙二醇藻酸盐、五倍子酸丙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丙酯钾、对羟基苯甲酸丙酯钠、鱼精蛋白硫酸盐、油菜籽油、林格氏溶液(Ringer's solution)、糖精、糖精铵/糖精钙、糖精钠、红花油、皂石、血清蛋白、芝麻油、胶态二氧化硅(colloidal silica，colloidal silicon dioxide)、藻酸钠、抗坏血酸钠、苯甲酸钠、碳酸氢钠、亚硫酸氢钠、氯化钠、无水柠檬酸钠、脱水柠檬酸钠、氯化钠、环己基氨基磺酸钠、依地酸钠(sodium edentate)、十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、偏亚硫酸氢钠、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸三钠、无水丙酸钠、丙酸钠、山梨酸钠、淀粉乙醇酸钠、硬脂酰基富马酸钠、亚硫酸钠、山梨酸、脱水山梨糖醇酯(脱水山梨糖醇脂肪酯)、山梨糖醇、山梨糖醇溶液70％、大豆油、鲸蜡蜡、淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、预胶凝淀粉、可灭菌玉米淀粉、硬脂酸、纯化的硬脂酸、硬脂酰醇、蔗糖、糖、可压缩的糖、糕点师糖、糖球、转化糖、蔗糖-转化糖聚合物(Sugartab)、日落黄FCF、合成石蜡、滑石、酒石酸、酒石黄、四氟乙烷(HFC)、可可油、硫柳汞、二氧化钛、α生育酚、生育酚乙酸酯、α生育酚酸琥珀酸酯、β-生育酚、δ-生育酚、γ-生育酚、黄蓍胶、三乙酸甘油酯、柠檬酸三丁酯、三乙醇胺、柠檬酸三乙酯、三甲基-β-环糊精、三甲基四癸基铵溴化物、tris缓冲液、依地酸三钠(trisodium edentate)、香草精、I型氢化植物油、水、软水、硬水、不含二氧化碳的水、不含致热原的水、注射用水、吸入用无菌水、注射用无菌水、冲洗用无菌水、蜡、阴离子乳化蜡、巴西棕榈蜡、阳离子乳化蜡、鲸蜡酯蜡、微晶蜡、非离子型乳化蜡、栓剂蜡、白蜡、黄蜡、白矿脂、羊毛脂、黄原胶、木糖醇、玉米醇溶蛋白、丙酸锌、锌盐、硬脂酸锌或Handbook of Pharmaceutical Excipients,第3版,A.H.Kibbe(Pharmaceutical Press,London,UK,2000)(其通过引用以其整体并入)中的任何赋形剂。Remington’s Pharmaceutical Sciences,第16版,E.W.Martin(MackPublishing Co.,Easton,Pa.,1980)，其通过引用以其整体并入，公开了各种用于配制药学上可接受的组合物的组分和已知的制备其的技术。除了任何常规试剂与所述的药物组合物不相容的情况下之外，涵盖了其在所述药物组合物中的用途。补充性活性成分也可掺入所述组合物中。

在一些实施方案中，前述组分可以诸如例如至少A的任何浓度存在于所述药物组合物中，其中A是0.0001％w/v、0.001％w/v、0.01％w/v、0.1％w/v、1％w/v、2％w/v、5％w/v、10％w/v、20％w/v、30％w/v、40％w/v、50％w/v、60％w/v、70％w/v、80％w/v或90％w/v。在一些实施方案中，前述组分可以诸如例如至多B的任何浓度存在于所述药物组合物中，其中B是90％w/v、80％w/v、70％w/v、60％w/v、50％w/v、40％w/v、30％w/v、20％w/v、10％w/v、5％w/v、2％w/v、1％w/v、0.1％w/v、0.001％w/v或0.0001％。在其它实施方案中，前述组分可以任何浓度范围存在于所述药物组合物中，诸如，例如约A至约B。在一些实施方案中，A是0.0001％且B是90％。

所述药物组合物可被配制以实现生理相容的pH。在一些实施方案中，所述药物组合物的pH可为至少5、至少5.5、至少6、至少6.5、至少7、至少7.5、至少8、至少8.5、至少9、至少9.5、至少10或至少10.5，高达且包括pH 11，这取决于所述制剂和给药途径。在某些实施方案中，所述药物组合物可包含缓冲剂以实现生理相容的pH。所述缓冲剂可包括任何能够在所需pH下缓存的化合物，诸如例如磷酸盐缓冲液(如，PBS)、三乙醇胺、Tris、N-二(羟乙基)甘氨酸、TAPS、三甲基甘氨酸(tricine)、HEPES、TES、MOPS、PIPES、二甲砷酸盐、MES及其它。在某些实施方案中，缓冲液的强度为至少0.5mM、至少1mM、至少5mM、至少10mM、至少20mM、至少30mM、至少40mM、至少50mM、至少60mM、至少70mM、至少80mM、至少90mM、至少100mM、至少120mM、至少150mM或至少200mM。在一些实施方案中，缓冲液的强度不超过300mM(如，至多200mM、至多100mM、至多90mM、至多80mM、至多70mM、至多60mM、至多50mM、至多40mM、至多30mM、至多20mM、至多10mM、至多5mM、至多1mM)。

给药途径

就本发明而言，所述活性剂、包含所述活性剂的药物组合物可经由任何适合的给药途径给予个体。仅提供了对以下给药途径的讨论说明示例性实施方案，并且不应理解为以任何方式限制范围。

适于口服给药的制剂可由以下物质组成：(a)液体溶液，诸如溶解于诸如水、盐水或桔汁的稀释剂中的有效量的本公开的活性剂；(b)胶囊剂、囊剂、片剂、锭剂和含片，各自含有预定量的呈固体或颗粒的活性成分；(c)粉剂；(d)于适当的液体中的混悬剂；和(e)适合的乳剂。液体制剂可包含添加或未添加药学上可接受的表面活性剂的稀释剂，诸如水和醇(例如乙醇、苄醇和聚乙二醇)。胶囊形式可为含有例如，表面活性剂、润滑剂及惰性填充剂(诸如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉)的常见硬壳或软壳明胶形式。片剂形式可包含以下的一种或多种：乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸、微晶纤维素、阿拉伯树胶、明胶、瓜尔胶、胶态二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸及其它赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、润湿剂、防腐剂、调味剂和其它药理学相容的赋形剂。锭剂形式可在调味剂(通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中包含活性剂，以及糖果锭剂在惰性基质(诸如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯树胶、乳剂、凝胶等)中包含活性剂，除了活性剂以外，还包含本领域已知的赋形剂。

本公开的活性剂，单独或与其它适合的组分组合，可经由肺给药递送和可制备为气雾剂制剂以经由吸入给药。这些气溶胶制剂可被置于可接受的加压推进剂诸如二氟二氯甲烷、丙烷、氮等中。它们也可被配制为用于非加压制备诸如喷雾器或雾化器的药剂。此类喷雾制剂也可用于喷撒粘膜。在一些实施方案中，所述活性剂被配制为粉末共混物或微粒或纳米颗粒。适合的肺制剂是本领域中已知的。参见，如Qian等,Int J Pharm 366:218-220(2009)；Adjei和Garren,Pharmaceutical Research,7(6):565-569(1990)；Kawashima等,JControlled Release 62(1-2):279-287(1999)；Liu等,Pharm Res 10(2):228-232(1993)；国际专利申请公布No.WO 2007/133747和WO 2007/141411。

适用于胃肠外给药的制剂包括可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和赋予制剂与预期受者血液等渗的溶质的水性和非水性等渗无菌注射溶液，以及可包含助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌混悬液。术语“胃肠外”意指不通过消化道而通过一些其它途径诸如皮下、肌内、脊柱内或静脉内。在添加或不添加药学上可接受的表面活性剂诸如皂或去污剂，助悬剂诸如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧基甲基纤维素，或乳化剂和其它药用佐剂的情况下，本公开的活性剂可与生理上可接受的稀释剂于药物载体中配混，诸如无菌液体或液体混合物，包括水、盐水、水性葡萄糖和相关糖溶液、醇(诸如乙醇或十六烷醇)、二醇(诸如丙二醇或聚乙二醇)、二甲亚砜、甘油、缩酮诸如2,2-二甲基-l53-二氧戊环-4-甲醇、醚、聚(乙二醇)400、油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯、或乙酰基化脂肪酸甘油酯。

可用于胃肠外制剂中的油包括石油、动物油、植物油或合成油。油的特定实例包括花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、矿脂油和矿物油。适用于胃肠外制剂的脂肪酸包括油酸、硬脂酸、和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是适合的脂肪酸酯的实例。

适用于胃肠外制剂的皂包括脂肪碱金属、铵和三乙醇胺盐，并且适合的去污剂包括(a)阳离子去污剂，诸如例如二甲基二烷基铵卤化物和烷基吡啶鎓卤化物，(b)阴离子去污剂，诸如例如烷基磺酸盐、芳基磺酸盐和烯烃磺酸盐(olefin sulfonates)，烷基硫酸盐、烯烃硫酸盐、醚硫酸盐和甘油单酯硫酸盐，及磺基琥珀酸盐，(c)非离子型去污剂，诸如例如脂肪胺氧化物、脂肪酸链烷醇酰胺和聚氧乙烯聚丙烯共聚物，(d)两性去污剂，诸如例如烷基-β-氨基丙酸酯和2-烷基-咪唑啉季铵盐，及(e)其混合物。

在一些实施方案中，所述胃肠外制剂含有于溶液中的约0.5重量％至约25重量％本公开的活性剂。可使用防腐剂和缓冲剂。为了将注射位点的刺激最小化或消除，此类组合物可含有一种或多种亲水亲油平衡(HLB)为约12至约17的非离子型表面活性剂。此类制剂中的表面活性剂的量将通常在约5重量％至约15重量％的范围内。适合的表面活性剂包括聚乙二醇脱水山梨糖醇脂肪酸酯，诸如脱水山梨糖醇单油酸酯，和由环氧乙烷与丙二醇的缩合形成的环氧乙烷与疏水性基质的高分子量加合物。在一些方面，所述胃肠外制剂在单位剂量或多剂量密封容器诸如安瓿和小瓶中呈现，并且可贮藏在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需在使用前立即添加注射用无菌液体赋形剂例如水。在一些方面，可由前述种类的无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备临时的注射溶液和混悬液。

可注射制剂是根据本发明的。对可注射组合物的有效药用载体的要求为本领域的普通技术人员熟知(参见，如Pharmaceutics and Pharmacy Practice,J.B.LippincottCompany,Philadelphia,PA,Banker和Chalmers编辑,第238-250页(1982),and ASHPHandbook on Injectable Drugs,Toissel,第4版,第622-630页(1986)).

此外，本发明的活性剂可通过与多种基质诸如乳化基质或水溶性基质混合，被制备为用于经直肠给药的栓剂。适用于经阴道给药的制剂可呈现为阴道栓剂、棉塞、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂制剂，其除了活性成分之外含有本领域中已知是适当的载体。

本领域的技术人员应理解除了上述药物组合物之外，本公开的活性剂可被配制为包合配合物，诸如环糊精包合配合物或脂质体。

剂量

本公开的活性剂据信可用于抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间的结合相互作用的方法以及如本领域中另外描述的其它方法(包括治疗或预防中风、心脏病发作、癌症或炎症的方法)中。为了本公开的目的，给药的活性剂的量或剂量应足以在个体或动物中在合理的时间框范围内产生如治疗性或预防性响应。例如，本公开的活性剂的剂量应该在距给药时间约1至4分钟、1至4小时或1至4周或更久(5至20或更多周)的时间内足以治疗如本文所述的癌症。在某些实施方案中，所述时段可以甚至更长。所述剂量将由具体活性剂的功效和动物(如，人)的情况以及动物(如，人)的体重所确定。

许多用于确定给药剂量的测定是本领域中已知的。为了本发明的目的，包括比较在向一组哺乳动物中的哺乳动物给予定剂量的本公开活性剂之后癌症得以治疗的程度(其中给予每一组哺乳动物不同剂量的活性剂)的测定可用于确定待给予哺乳动物的起始剂量。在给予某些剂量之后癌症得以治疗的程度可由例如在小鼠异种移植模型中活性剂的细胞毒性或用活性剂获得的肿瘤消退的程度表示。测量化合物细胞毒性的方法和测定肿瘤消退的方法是本领域中已知的，包括例如如下所示的实施例中所述的方法。

本公开的活性剂的剂量还将由给予特定本公开的活性剂可能相伴的任何不良副作用的存在、性质和程度所确定。通常，主治医师将考虑多种因素(诸如年龄、体重、一般健康状况、饮食、性别，给予的本公开的活性剂，给药途径和待治疗病况的严重程度)决定本公开的活性剂的剂量治疗每一个单个患者。举例来说而并非意在限制本发明，本公开的活性剂的剂量可为约0.0001至约1g/kg待治疗个体的体重/天、约0.0001至约0.001g/kg体重/天、或约0.01mg至约1g/kg体重/天。

控制释放的制剂

在一些实施方案中，本文所述的活性剂可被改成储库形式，使得本发明的活性剂释放至给予其的体内的方式就时间和体内位置而言是可控的(参见，例如，美国专利No.4,450,150)。本发明的活性剂的贮库形式可为例如包含所述活性剂和多孔或非多孔材料(诸如聚合物)的可植入组合物，其中所述活性剂所述材料包封或在整个材料中弥撒和/或被非多孔材料降解。然后所述贮库被植入个体体内期望的位置，并且所述活性剂以预定速率从植入物中释放。

在某些方面，包含所述活性剂的药物组合物被修饰以具有任何类型的体内释放特征。在一些方面，所述药物组合物是立即释放、控制释放、持续释放、延长释放、延迟释放或双相释放制剂。控制释放所用的肽的方法是本领域中已知的。参见，例如，Qian等,J Pharm374:46-52(2009)和国际专利申请公布No.WO 2008/130158、WO2004/033036；WO2000/032218；和WO 1999/040942。

本组合物还可包括例如胶束或脂质体或一些其他包封形式，或者可以延长释放的形式给药以提供更久的贮藏和/或递送效果。

胶束

本发明还提供了包含本发明的肽或肽类似物和至少一种脂质的胶束，任选地，其中所述脂质共价连接至水溶性聚合物。在示例性方面，所述胶束的肽或肽类似物共价连接至脂肪酸或其它脂质部分。在示例性方面，所述胶束的肽由FEEERA(SEQ ID NO:87)组成，其中在位置1处的Phe共价连接至C16脂肪酸。在示例性方面，所述胶束包括共价连接至水溶性聚合物的脂质和不含水溶性聚合物的脂质。适用于胶束合成的脂质是本领域中已知的。参见，如Banerjee和Onyuksel,Peptide Delivery Using Phospholipids,WIREs NanomedNanobiotechnol 4:562-574(2012)。在示例性方面，共价连接至水溶性聚合物的脂质是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000]并且不含水溶性聚合物的脂质是磷脂酰胆碱。

本发明还包括包含本文所述的任一种胶束和水溶液的组合物。

给药时间

所公开的药物组合物和制剂可根据任何方案给药，包括例如每天(每天1次、每天2次、每天3次、每天4次、每天5次、每天6次)、每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周、每两周、每三周、每月或每两月。时间，如剂量可更加剂量响应研究、功效和毒性数据微调，并且根据其它抗体治疗剂所用的时间来定最初规格。

组合

在一些实施方案中，本文所述的活性剂单独使用，并且在可选的实施方案中，本文所述的活性剂与另一种治疗剂(如本发明的另一种不同类型(如，结构)的活性剂)或不抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间的结合相互作用的另一种治疗剂组合给药。在一些方面，另一种治疗剂用于治疗或预防癌症。在特定方面，另一种治疗剂是于题为“异源部分：治疗剂”的一章中所列的一种治疗剂。在一些实施方案中，另一种治疗剂是化学治疗剂。在一些实施方案中，另一种治疗剂是治疗癌症的放射疗法中所用的试剂。

在示例性方面，本文所述的活性剂与抗-血栓药组合给药或包装。在示例性实施方案中，所述抗-血栓药是抗凝剂，如磺达肝素和比伐卢定。在示例性实施方案中，所述抗-血栓性剂是抗-血小板剂，如阿司匹林、氯吡格雷、双嘧达莫和阿昔单抗。

在示例性方面，本文公开的活性剂与抗-血小板药物组合给药或包装。在示例性方面，所述抗血小板药物是不可逆环氧合酶抑制剂(如，阿司匹林)、腺苷二磷酸盐(ADP)受体抑制剂(如，氯吡格雷、普拉格雷、替格瑞洛、噻氯匹定)、磷酸二酯酶抑制剂(如，西洛他唑)、糖蛋白IIb/IIIa抑制剂(如，阿昔单抗、埃替非巴肽)、替罗非班)、腺苷再摄取抑制剂(如，双嘧达莫)或血栓烷抑制剂(如，血栓烷合酶抑制剂、血栓烷受体拮抗剂(如，特鲁曲班)。在示例性方面，所述抗-血小板药是阿司匹林、噻吩并吡啶、环氧合酶抑制剂或P2Y12抑制剂。

在示例性方面，本文所述的活性剂与整联蛋白拮抗剂或整联蛋白抑制剂组合给药或包装。在示例性方面，所述整联蛋白抑制剂是埃替非巴肽。

在示例性实施方案中，所述活性剂与另一种治疗剂同时给药。在可选的实施方案中，所述活性剂在另一种治疗剂之前或之后给药。

使用方法

考虑到β整联蛋白和G蛋白α亚基各自或者如本文所示彼此联合起来的重要生物作用，本发明的活性剂可用于各种情况下的多种应用中。例如并且最极端简化地，本发明的活性剂可用于在细胞中抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间的结合相互作用。就此而言，本发明提供了在细胞中抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间的结合相互作用的方法。所述方法包括使细胞与有效抑制结合相互作用的量的本发明化合物或组合物接触。在一些方面，所述细胞是体外或离体细胞培养物的一部分，或者是体外或离体组织样品。在一些方面，所述细胞是体内细胞。在某些实施方案中，所述方法意在用于研究目的，并且在其它实施方案中，所述方法意在用于治疗目的。

本发明还提供了在细胞中抑制整联蛋白依赖性Src激活的方法。所述方法包括使所述细胞与有效抑制Src激活的量的本发明的化合物或组合物接触的步骤。测量整联蛋白依赖性Src激活的方法是本领域中已知的，并且包括例如本文实施例中示出的那些方法和使用Src-家族激酶测定(Promega,Madison,WI)或可从Millipore(Billerica,MA)获得的Src活性测定试剂盒。

本发明另外提供了激活小GTP酶的方法。所述方法包括使G蛋白亚基与有效激活小GTP酶的量的化合物或组合物接触的步骤。在示例性方面，本发明方法的小GTP酶是RhoA。测量GTP酶活性的方法是本领域中已知的，并且包括例如本文实施例中示出的那些方法。此外，所述GTP酶活性水平可使用可商购获得的试剂盒(Thermo Fisher Scientific,Inc.(Rockford,IL),Innova Biosciences(Cambridge,UK),Cell Biolabs,Inc.(San Diego,CA)测量。

本发明还提供了抑制细胞铺展或迁移的方法。所述方法包括使所述细胞与有效抑制铺展和迁移的量的本发明的化合物或组合物接触的步骤。所述细胞可以是任何进行整联蛋白依赖性粘附、铺展、收缩或迁移的细胞，或者任何进行贴壁依赖性存活和增殖的细胞。在示例性方面，所述细胞是血小板、白细胞、内皮细胞、成纤维细胞、上皮细胞。测量细胞铺展或细胞迁移的方法是本领域中已知的。参见，例如，本文实施例中所述的方法。

本发明还提供了抑制血小板粘附的方法。所述方法包括使血小板与有效抑制血小板粘附的量的本发明的化合物或组合物接触的步骤。本发明还提供了抑制血小板颗粒分泌和血小板聚集的方法。所述方法包括使血小板与有效抑制颗粒分泌和聚集的量的本发明的化合物或组合物接触的步骤。测量血小板颗粒分泌或血小板聚集的方法是本领域中已知的。例如，血小板聚集可在富含血小板血浆(PRP)中使用浊度血小板凝集计测量以分析经洗涤的血小板。聚集可由通过PRP或血小板混悬液的透光性增加来指示。血小板聚集也可在全血中使用全血小板凝集计测量，其中血小板聚集由电极的电阻增加指示。参见，例如本文的实施例中所述的方法。

本发明的化合物和组合物被另外涵盖以用于治疗目的。例如，本发明的化合物和组合物可用于在有需要的个体中增强血块凝缩或抑制血栓形成。因此，本发明提供在有需要的个体中增强血块凝缩的方法。所述方法包括向个体给予有效增强血块凝缩的量的本发明的化合物或组合物的步骤。还提供了在有需要的个体中抑制血栓形成的方法。所述方法包括向个体给予有效抑制血栓形成的量的本发明的化合物或组合物的步骤。

由于血液凝块和血栓形成在中风和心脏病发作中起作用，本发明另外提供了在有需要的个体中治疗或预防中风或心脏病发作的方法。所述方法包括向个体给予有效治疗或预防中风或心脏病发作的量的本发明的化合物或组合物的步骤。由于本文提供的化合物和组合物涉及协同的细胞铺展-收缩过程，其进而在细胞迁移中很重要，本发明还提供了抑制肿瘤细胞转移的方法。所述方法包括使肿瘤细胞与有效抑制转移的量的本发明的化合物或组合物接触的步骤。所述化合物和组合物还被涵盖以用于抑制血管生成中。因此，本发明提供了在有需要的个体中抑制血管生成的方法。所述方法包括向个体给予抑制血管生成的量的本发明的化合物或组合物的步骤。

本发明的化合物促进凝血和细胞收缩还可促进伤口愈合。因此，本发明提供在有需要的个体中促进伤口愈合的方法。所述方法包括向个体给予有效促进伤口愈合的量的本发明的化合物或组合物的步骤。在示例性方面，所述化合物或组合物被局部给予至个体的伤口附近或伤口处。在示例性实施方案中，与在不给予本发明的化合物或组合物的情况下伤口愈合的时间相比，伤口愈合的速率增加至少10％、25％、50％、75％、90％或更多。

因为转移和血管生成是癌症中的重要方面，本发明还提供了在有需要的个体中治疗或预防癌症的方法。所述方法包括向个体给予有效治疗或预防癌症的量的本发明的化合物或组合物的步骤。在示例性方面，所述主体是实体瘤并且本发明的化合物或组合物被给予在肿瘤位点附近或肿瘤位点处。在示例性方面，本发明的化合物或组合物经由注射被给予在肿瘤位点处。

本文提供的化合物和组合物还可用于影响白细胞功能。本发明因此提供了抑制白细胞粘附、铺展、迁移或趋化性的方法。所述方法包括使白细胞与有效抑制白细胞粘附、铺展、迁移或趋化性的量的本发明的化合物或组合物接触的步骤。因为这些白细胞功能与炎症有关，所以本发明另外提供了在有需要的个体中抑制或治疗炎症的方法。所述方法包括向个体给予抑制或治疗炎症的量的本发明的化合物或组合物的步骤。在示例性实施方案中，所述化合物或组合物全身如胃肠外(如，经由静脉内注射)给予个体。

治疗、预防和抑制

如本文所用，术语“治疗”以及其相关词汇不必然指100％或完全治疗。相反，存在本领域的普通技术人员认为具有潜在益处或治疗效果的各种程度的治疗。在这方面，治疗中风或心脏病发作或癌症或炎症的本发明的方法可提供任何量或任何水平的治疗。此外，由本发明的方法提供的治疗可包括正在治疗的中风、心脏病发作、癌症或炎症的一种或多种病况或症状或体征的治疗。此外，由本发明的方法提供的治疗可涵盖减缓中风、心脏病发作、癌症或炎症的进展。例如，所述方法可借由减缓肿瘤或癌症生长、减少肿瘤细胞转移、增加肿瘤或癌症细胞的细胞死亡等来治疗癌症。

如本文所用，术语“预防”和由此引发的词汇涵盖延缓正预防的医学病况的发作。在示例性方面，所述方法延缓医学病况发作1天、2天、4天、6天、8天、10天、15天、30天、两个月、4个月、6个月、1年、2年、4年或更久。如本文所用，术语“预防”和由此引发的词汇涵盖降低正预防的医学病况的风险。在示例性方面，所述方法降低SCD的风险2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多。

如本文所用，术语“抑制”和由此引发的词汇可能不是100％或完全抑制或终止。相反，存在本领域的普通技术人员认为具有潜在的益处或治疗效果的各种程度的抑制。在这方面，本发明的化合物可抑制β整联蛋白与G蛋白α亚基之间的结合相互作用至任何量或水平。在示例性实施方案中，由本发明的方法提供的抑制是至少或约10％(如，至少或约20％的抑制、至少或约30％的抑制、至少或约40％的抑制、至少或约50％的抑制、至少或约60％的抑制、至少或约70％的抑制、至少或约80％的抑制、至少或约90％的抑制、至少或约95％的抑制、至少或约98％的抑制)。

癌症

可由本文公开的方法治疗的癌症可为任何癌症，如由异常和不可控的细胞分裂引起的可通过淋巴系统或血流分散至身体的其它部分的任何恶性生长或肿瘤。在一些实施方案中，所述癌症是其中整联蛋白和G蛋白α亚基在细胞表面表达的癌症。

在一些方面，所述癌症是选自以下的一种癌症：急性淋巴细胞性癌、急性骨髓性白血病、腺泡状横纹肌肉瘤、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓癌、结肠癌、食管癌、宫颈癌、胃肠道类癌肿瘤、霍奇金氏淋巴癌(Hodgkin lymphoma)、下咽癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、恶性间皮瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金氏淋巴癌、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌和肠系膜癌、咽癌、前列腺癌症、直肠癌、肾癌(如，肾细胞癌(RCC))、小肠癌、软组织癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、输尿管癌和泌尿膀胱癌。在特定的方面，所述癌症选自：头颈癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌和食管癌、胰腺癌、胃肠道癌、胃癌、乳腺癌、子宫内膜癌和结肠直肠癌、肝细胞癌、胶质母细胞瘤、膀胱癌、肺癌如非小细胞肺癌(NSCLC)、细支气管肺泡癌。

个体

在本发明的一些实施方案中，所述个体是哺乳动物，包括但不限于啮齿(Rodentia)目的哺乳动物诸如小鼠和仓鼠，和兔形目(Logomorpha)的哺乳动物诸如兔，食肉目(Carnivora)的哺乳动物包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)，偶蹄目(Artiodactyla)的哺乳动物包括牛科动物(牛)和猪(Swines，pigs)或者奇蹄目(Perssodactyla)的包括马科动物(马)。在一些方面，所述哺乳动物属于灵长目(Primates)、猿目(Ceboids)或猴目(Simoids)(猴)或者类人猿目(Anthropoids)(人和猿)。在一些方面，所述哺乳动物是人。在一些方面，所述人是18岁或更大的成人。在一些方面，所述人是17岁或更小的儿童。

在示例性方面，所述个体具有服用整联蛋白拮抗剂或抗-血小板药的医疗史，或者所述个体已经被开出整联蛋白拮抗剂或抗-血小板药的处方。在示例性方面，所述个体具有冠心病、心脏病发作、心绞痛、中风、短暂性脑缺血发作、外周动脉病、心肌梗死、心房颤动和/或缺血性中风的医疗史。在示例性方面，所述个体具有包括血管成形术、支架置入和/或心脏搭桥或心瓣膜更换手术。的医疗史。在示例性方面，所述个体患有急性冠状动脉综合征、不稳定心绞痛或非ST段抬高性心肌梗死。

试剂盒

在一些实施方案中，包含本发明的化合物、其药学上可接受的盐的组合物，包含所述化合物的缀合物，或者包含所述化合物的多聚体或二聚体作为试剂盒或包裹或单位剂量提供。“单位剂量"是分散量的于适合载体中分散的治疗组合物。因此，本文提供了试剂盒，其包含本发明的化合物、其药学上可接受的盐、包含所述化合物的缀合物、或包含所述化合物的多聚体或二聚体。

在一些实施方案中，所述试剂盒/单位剂量的组分与说明书包装在一起以向患者给药。在一些实施方案中，所述试剂盒包括一种或多种向患者给药的装置，如针头和注射器、滴管、量勺或量杯或类似装置、吸入器等。在一些方面，将本发明的化合物、其药学上可接受的盐、包含所述化合物的缀合物、或包含所述化合物的多聚体或二聚体预包装为即用形式，如注射器、静脉内袋、吸入剂、片剂、胶囊等。在一些方面，所述试剂盒还包括其它治疗剂或诊断剂或药学上可接受的载体(如，溶剂、缓冲剂、稀释剂等)，包括本文中描述的那些中的任何。在特定的方面，所述试剂盒包括本发明的化合物、其药学上可接受的盐、包含所述化合物的缀合物、或者包含所述化合物的多聚体或二聚体，连同化疗或放射疗法中所用的试剂如治疗剂。

以下实施例仅为了说明本发明而给出，并非以任何方式限制其范围。

实施例

实施例1

以下材料和方法用于实施例2所述的研究中。

试剂

在Research Resource Center，University of Illinois,Chicago(S1)合成和纯化肉豆蔻酰化的Gα₁₃ SRI肽、Myr-LLARRPTKGIHEY(mSRI；SEQ ID NO:46)和肉豆蔻酰化-乱序肽(Myr-LIRYALHRPTKEG；SEQ ID NO:47)。之前已描述了重组Gα₁₃表达和纯化(S2)。抗-RhoA抗体和细胞渗透性的C3转移酶(C3毒素)是从Cytoskeleton,Inc.购买的；抗-Gα₁₃(SC410)、抗-c-Src(sc-18)和抗-小鼠整联蛋白β₃(sc-6627)抗体来自Santa Cruz Biotechnology,Inc；抗-磷酸-Src Y⁴¹⁶抗体是从Cell Signaling获得的；抗-人整联蛋白β₃抗体MAb 15，和抗-α_IIb β₃抗体D57由Dr.Mark Ginsberg(University of California,San Diego,LaJolla,CA)友情提供；抗-GPIb单克隆抗体LJP3由Dr.Zaverio Ruggeri,the ScrippsResearch Institute,La,Jolla,CA)友情提供；抗-微管蛋白和抗-flag抗体是从Sigma-Aldrich购买的；lipofectamine 2000、viraPower慢病毒表达系统、Alexa Fluor 546-缀合的鬼笔环肽、Alexa Fluor 633-缀合的鬼笔环肽和Alexa Fluor 546-缀合的抗-小鼠IgG抗体来自于Invitrogen；Y27632是从Calbiochem购买的。

血小板制备、血小板铺展和血块收缩。

使用人血小板的研究由Institutional Review Board of University ofIllinois，Chicago批准。人经洗涤的血小板是从健康志愿者新鲜抽取的血液制备的，并且重悬浮在改良的缓冲液蒂罗德缓冲液(Tyrode's buffer)中(12mM NaHCO₃,138mM NaCl,5.5mM葡萄糖,2.9mM KCl,2mM MgCl₂,0.42mM NaH₂PO₄,10mM HEPES,(pH 7.4)(S3,S4)。动物研究由institutional Animal Care Committee of University of Illinois，Chicago批准。血液是从异氟醚麻醉的小鼠的下腔静脉新鲜抽取的。使用前述方法分离和洗涤小鼠血小板(S4,S5)。为了分析血小板在整联蛋白配体纤维蛋白原上的铺展，将经洗涤的血小板在37℃下铺展在100μg/ml纤维蛋白原-涂覆的盖玻片上90分钟，染色并如前所述用Leica RMIRB显微镜或Zeiss LSM510 META共聚焦显微镜观察(S5)。用前述方法分析血块收缩(S6，S7)。简而言之，将小鼠血小板(6×10⁸/ml)重悬浮在去血小板的人血浆中，并添加0.4U/mlα-凝血酶以启动凝血。在各个时间点对血块拍照。使用NIH Image J软件对照片上收缩的血块的尺寸进行定量。使用t检验确定统计显著性。

免疫共沉淀和结合测定

将人血小板或表达重组整联蛋白α_IIbβ₃的CHO细胞溶解于改良的RIPA缓冲液(50mMTris,pH 7.4,10mM MgCl₂,150mM NaCl,1％ NP-40,1mM原钒酸钠，1mM NaF)，或RIPA缓冲液(25mM Tris,pH 7.6,150mM NaCl,1％NP-40,1％脱氧胆酸钠,0.1％SDS)和完全蛋白酶抑制剂混合物片剂(1片/5ml缓冲液，Roche)中。如前所述(S7)，将细胞裂解物与2μg/m1的D57(整联蛋白α_IIbβ₃的抗体)、LJP3(GPIb的抗体)或小鼠IgG孵育，并与蛋白G-缀合的琼脂糖珠进一步孵育。还将细胞裂解物与兔抗-Gα₁₃IgG抗体(1.5μg/ml)或等量的兔IgG孵育，并与蛋白A-缀合的琼脂糖珠进一步孵育。在用裂解缓冲液洗涤3-6次后，将免疫沉淀物通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和使用β₃的抗体(MAb15)、GPIb的抗体(抗-IbαC(S8))或Gα₁₃的抗体的蛋白质印迹进行分析。在一些实验中，将1μM GDP、1μM GTPγS或30[tM A1F₄ ^-添加至反应物以评估Gα₁₃激活对整联蛋白结合的作用。在其它实验中，在免疫沉淀之前，将250μM mSRI或乱序对照肽与血小板裂解物孵育。之前已经描述了GST珠下拉分析(S7)。将纯化的Gα₁₃与结合至GST、GST-β₁CD或GST-β₃ CD的谷胱甘肽珠在4℃下孵育过夜。通过免疫印迹分析珠结合蛋白。对于GST-β₃CD cDNA构建，通过PCR产生整联蛋白-β₃细胞质结构域(716-762)cDNA，并使用Bam HI和Xho I限制位点克隆至pGEX-4T2载体中。正向引物是5'-CGTGGATCCAAACTCCTCATCACCATCCACGACC-3'(SEQ ID NO:48)；反向引物是5'-GCGCTCGAGTTAAGTGCCCCGGTACGTGATATTG-3'(SEQ ID NO:49)。对于GST-I31CD cDNA构建，通过PCR扩增β₁细胞质结构域(752-798)cDNA并使用EcoRI和Xho I限制位点克隆至pGEX-4T1载体。引物序列是：(1)正向：5'-GCGAATTCAAGCTTTTAATGATAATTCATGAC-3'(SEQ ID NO:50)；(2)反向：GCGCTCGAGTCATTTTCCCTCATACTTCGGATT-3'(SEQ ID NO:51)。使用谷胱甘肽-缀合珠从BL21(DE3)大肠杆菌纯化GST、GST-β₁CD和GST-β₃CD。

用于β₃结合的野生型Gα₁₃和截短突变型的表达

使用PCR将人Gα₁₃cDNA(S9)在N-端用Flag-表位标记，其中Flag cDNA序列被掺入至正向引物中，然后使用Kpn I和Not I限制位点将其亚克隆到pCDEF3载体中。正向引物序列是5'-GCGGGTACCGCCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGGCGGACTTCC-TGCCGTCGCGGTCCGT-3'(SEQ ID NO:52)。反向引物序列是5'-GGCCGGCGGCCGCTCACTGTAGCATAAGCTGCTTGAGGTT-3'(SEQ ID NO:53)。使用PCR用反向引物序列5'-GGCCGGCGGCCGCTCAAATATCTTGTTGTGATGGAAT-ATAATCTGGTTCTCCAAGTTTATCCAAG-3'(SEQ ID NO:54)(针对突变型1-196)；和用5'-GGCCGGCGGCCGCTCATTCAAAGTCGTATTCATGGATGCC-3'(SEQ ID NO:55)(对于突变型1-212)产生Gα₁₃的截短突变型。

使用lipofectamine 2000将编码Flag-标记的野生型Gα₁₃或Gα₁₃突变型的cDNA转染到293FT细胞中。在转染后48小时制备细胞裂解物。将在293FT细胞裂解物中的Flag-标记的野生型或突变型Gα₁₃与谷胱甘肽珠结合的GST或GST-β₃CD在4℃下孵育过夜。在离心和洗涤后，将珠结合的蛋白用抗-Flag抗体进行免疫印迹。

RhoA活性测定。

将改良的蒂罗德缓冲液中或粘附在固定纤维蛋白原上的血小板在0.8ml裂解缓冲液(50mM Tris,pH 7.4,10mM MgCl₂,500mM NaCl,1％Triton X-100,0.1％SDS,0.5％脱氧胆酸盐，抑肽酶和亮肽素各10μg/m1，1mM苯甲基磺酰氟及200μM钒酸钠)中快速裂解。通过在4℃下18,000g离心2分钟使裂解物澄清，并将上清液与30μg结合至谷胱甘肽-琼脂糖珠的经纯化的GST-Rhotekin RhoA-结合结构域融合蛋白孵育1小时(S10)。使用洗涤缓冲液(50mMTris,pH 7.4,10mM MgCl₂,150mM NaCl,1％Triton X-100)洗涤样品三次，然后用抗-RhoA单克隆抗体进行免疫印迹。还将细胞裂解物用抗-RhoA进行免疫印迹来作为上样对照。

用siRNA干扰Gα₁₃表达，用抗siRNA的Gα₁₃拯救Gα₁₃表达，及骨髓移植。

使用两种不同的Gα₁₃siRNA靶序列：siRNA#1，5'-GTCCACCTTCCTGAAGCAG(SEQ IDNO:56)；siRNAi#2,5'-GGAGATCGACAAATGCCTG(SEQ ID NO:57)。乱序siRNA序列是5'-GAGGAGCCGACGCTTAATA-3'(SEQ ID NO:58)。这些序列在仓鼠和小鼠中是保守的。使用Lipofectamine 2000通过用pLP1、pLP2和pLP/VSVG质粒(Invitrogen)共转染pLL3.7-乱序siRNA或pLL3.7-Gα₁₃siRNA(#1和#2)到约90％汇合的293FT细胞中来制备慢病毒。转染后48小时，将含有病毒的细胞培养基过滤、滴定并贮藏在-80℃。将来自6-8周龄健康C57/BL小鼠的骨髓细胞从股骨和胫骨无菌分离。通过MACS系别细胞去除试剂盒(Miltenyi Biotec)阴选干细胞并将其培养在含10ng/ml白细胞介素-3、10ng/ml白细胞介素-6、10ng/ml粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和100ng/ml干细胞因子(SCF)的RPMI 1640完全培养基中。将感染复数(MOI)为50的慢病毒用于在6μg/ml聚凝胺的存在下感染小鼠骨髓干细胞两次。感染后48小时，重悬浮于PBS中的5×10⁶干细胞通过眼球后注射移植到经致死性辐射(10.5Gy)的C57/BL小鼠(在辐射后一天)(S11)。通过PCR产生抗siRNA的突变型Gα₁₃。

这些突变型在不改变Gα₁₃的氨基酸序列的情况下将Gα₁₃ siRNA#1靶序列改变成5’-GTCCACCTTttTaAAGCAG-3'(SEQ ID NO:59)或将siRNA#2靶序列改变成5'-GGAGATCGAtAAgTGCCTG-3'(SEQ ID NO:60)。使用PCR片段中的EcoR I和Sal I限制位点和使用载体中的EcoRI和Xho I限制位点将所述突变型亚克隆到pLenti6/V5-Dest载体中。引物序列如下：(1)Flag靶向的正向引物：5'-CGGAATTCG-CCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGGCGGACTTCCTGCCGTCGCGGTCCGT-3'(SEQ ID NO:61)；(2)反向引物：5'-GCCGTCGACTCACTGTAGCATAAGCTGCTTGAGGTT-3'(SEQ ID NO:62)；(3)对于针对siRNA#1的抗性，突变位点正向引物：5'-GTCCAAGGAGATCGATAAGTGCCTGTCTCGGGAA-3'(SEQID NO:63)；(4)对于针对siRNA#1的抗性，突变位点反向引物：5'-TTCCCGAGACAGGCACTTATCGATCTCCTTGGAC-3'(SEQ ID NO:64)；(5)对于针对siRNA#2的抗性，突变位点正向引物：5'-CGGCAAGTCCACCTTTTTAAAGCAGATGCGGATC-3'(SEQ ID NO:65)；(6)对于针对siRNA#2的抗性，突变位点反向引物：5'-GATCCGCATCTGCTTTAAAAAGGTGGACTTGCCG-3'(SEQ ID NO:66)。

将表达人α_IIbβ₃细胞的CHO细胞(123细胞)在共转染或未共转染有Flag-标记的抗siRNA的Gα₁₃质粒的情况下，使用Lipofectamine 2000用Gα₁₃ siRNA构建体转染。30小时后，用磷酸盐-缓冲盐水中的0.53mM EDTA使所述细胞脱离，并使其铺展在100μg/ml纤维蛋白原上。对于c-Src磷酸化，将细胞溶解于SDS-样品缓冲液中，并用抗c-Src pY416抗体进行免疫印迹。对于免疫染色实验，使共转染了Gα₁₃ siRNA质粒和抗siRNA的Gα₁₃质粒的123细胞粘附至100μg/ml纤维蛋白原1小时，用4％低聚甲醛固定，并用抗-flag抗体和Alexa Fluor 546-缀合的第二抗体及Alexa Fluor 633-缀合的鬼笔环肽染色。使用Zeiss LSM510META共聚焦显微镜获得图像。

定量和统计

将蛋白质印迹条带扫描并使用NIH Image J软件分析未校准的光密度。使用学生t检验确定统计显著性。

实施例2

整联蛋白介导细胞粘附并在细胞内传递信号，所述信号导致细胞铺展、收缩、迁移和增殖(1)。因此，整联蛋白在生物过程诸如发育、免疫、癌症、伤口愈合、止血和血栓形成中起到关键作用。血小板整联蛋白，α_IIbβ₃，通常表现出双向信号转导功能(2,3)。细胞内的信号激活α_IIbβ₃与胞外配体结合，进而触发细胞内由占据的受体启动的信号转导(所谓的“由外向内”信号转导)。整联蛋白“由外向内”信号转导的早期主要结果是细胞铺展，这需要激活小鸟苷三磷酸酶(GTP酶)RhoA的蛋白激酶c-Src和c-Src-介导的抑制(4-7)。随后由钙蛋白酶切割β₃中的c-Src结合位点，从而使RhoA激活，进而刺激细胞收缩(7,8)。使配体-结合的α_IIbβ₃偶联至这些信号转导事件的分子机制仍然未知。

异源三聚体鸟嘌呤核苷酸-结合蛋白(G蛋白)由Gα、Gβ和Gγ亚基组成(9)。G蛋白结合至G-蛋白偶联受体(GPCR)的胞内侧并传递在许多胞内事件中很重要的信号(9-11)。Gα₁₃，当被GPCR激活时，与Rho鸟嘌呤-核苷酸交换因子(RhoGEF)相互作用，并因此激活RhoA(11-14)，从而促进饼状血小板收缩和变圆(形状变化)。为了确定Gα₁₃是否在来自配体-占据的整联蛋白的信号转导中起作用，我们研究了小干扰RNA(siRNA)对Gα₁₃表达的抑制是否影响纤维蛋白原(其是整联蛋白配体)上血小板的α_IIbβ₃依赖性铺展。我们分离了小鼠骨髓干细胞并用编码Gα₁₃ siRNA的慢病毒转染它们。将所述转染的干细胞移植到经辐射的C57/BL6小鼠中(15)。移植后四至六周，如由慢病毒载体中编码的绿色荧光蛋白(EGFP)增强所指示，几乎所有从接受者小鼠分离的血小板都来源于移植干细胞(图5，图1A)。来自Gα₁₃ siRNA-转染的干细胞接受者小鼠的血小板显示出>80％的Gα₁₃表达增加(图1B)。当使血小板粘附至固定纤维蛋白原[α_IIbβ₃结合至固定纤维蛋白原不需要先前“由内向外”信号转导激活(16)]时，与对照血小板相比，去Gα₁₃的血小板铺展较差(图1A，图6)。Gα₁₃缺陷的抑制作用不可能由其对GPCR-刺激的Gα₁₃信号转导的作用导致，因为(i)使用了经洗涤的静息血小板并且没有添加GPCR激动剂，并且(ii)使用1mM阿司匹林[其消除了血栓烷A₂(TXA₂)产生(17)]的先前处理不影响血小板在纤维蛋白原上铺展(图6)，从而使得其不可能是内源性TXA₂-介导的Gα₁₃刺激。此外，Gα₁₃ siRNA抑制了表达人α_IIbβ₃的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(123细胞)的铺展(18)，这由抗siRNA的Gα₁₃拯救(图7)。因此，Gα₁₃似乎在导致细胞铺展的整联蛋白“由外向内”信号转导中很重要。

为了确定Gα₁₃在介导整联蛋白-诱导的c-Src激活的早期信号转导机制中是否起作用，我们测量了对照和纤维蛋白原结合的细胞中的c-Src在Tyr⁴¹⁶处的磷酸化(其指示c-Src激活)。在小鼠血小板或123细胞中去除Gα₁₃消除了c-Src Tyr⁴¹⁶的磷酸化(图1C，图7)，这表明Gα₁₃可使整联蛋白α_IIbβ₃与c-Src激活相关联。由于c-Src抑制RhoA(7,19)，我们还测试了Gα₁₃在调控RhoA激活中的作用。在血小板粘附之后，RhoA活性抑制至基线15分钟，并且在30分钟时激活(图1C)，这与c-Src瞬时抑制RhoA一致(7)。整联蛋白依赖性延迟的RhoA激活不被去除Gα₁₃抑制，表明了其不依赖于GPCR-Gα₁₃-RhoGEF通路(图1C)。相反，去除Gα₁₃加速了RhoA激活(图1C)。因此，Gα₁₃似乎介导RhoA的抑制。去除Gα₁₃对血小板铺展的抑制作用被Rho-激酶抑制剂Y27632逆转(图1A)，表明了Gα₁₃-介导的RhoA抑制在刺激血小板铺展中很重要。这些数据与Gα₁₃介导诱导c-Src激活、RhoA抑制和细胞铺展的整联蛋白“由外向内信号转导”一致。

将整联蛋白α_IIbβ₃用来自血小板裂解物的抗-Gα₁₃抗体而非对照IgG进行免疫共沉淀(图2A)。相反，针对β₃的抗体在β₃的存在下免疫沉淀Gα₁₃(图2B)。β₃与Gα₁₃的免疫共沉淀被GTP-γS或AlF₄ ^-增强(图2A，图8)。因此，β₃存在于与Gα₁₃、优选活性GTP结合的Gα₁₃的复合物中。为了确定Gα₁₃是否直接结合至整联蛋白细胞质结构域，我们将经纯化的重组Gα₁₃(20)与缀合有谷胱甘肽S-转移酶(GST)或GST-β₃细胞质结构域融合蛋白(GST-β₃CD)的琼脂糖珠孵育。经纯化的Gα₁₃结合至GST-β₃CD，而不结合至GST(图2C)。经纯化的Gα₁₃也结合至融合GST的β₁整联蛋白细胞质结构域(GST-β₁CD)(图2D)。用GDP-负载的Gα₁₃检测到Gα₁₃与GST-β₃CD和GST-β₁CD的结合，但由GTP-γS和AlF₄ ^-增强(图2C，2D)，表明了β₃和β₁的细胞质结构域可直接与Gα₁₃相互作用，并且GTP增强了所述相互作用。Gα₁₃-β₃相互作用在粘附至纤维蛋白原的血小板中增强，并由经由GPCR刺激GTP结合至Gα₁₃的凝血酶增强(图2E)。因此，所述相互作用由整联蛋白占据和GPCR信号转导调控。

为了对Gα₁₃中的β₃结合位点作图，我们将含有Flag-标记的野生型或截短突变型Gα₁₃的细胞裂解物(图9)与GST-β₃CD珠孵育。GST-β₃CD与野生型Gα₁₃和含有α螺旋区和转换区I(SRI)的Gα₁₃1-212片段相缔合，而不与含有缺乏SRI的残基1-196的Gα₁₃片段相缔合(图2F)。因此，SRI似乎对于β₃结合很重要。为了进一步确定SRI的重要性，在肉豆蔻酰化合成肽Myr-LLARRPTKGIHEY(mSRI；SEQ ID NO:45)(对应于Gα₁₃(197-209)的SRI序列)的存在下对Gα₁₃-β₃结合进行评估(21)。mSRI肽抑制了Gα₁₃结合至β₃，而非肉豆蔻酰化乱序肽不抑制(图2G)，表明了mSRI是β₃-Gα₁₃相互作用的有效抑制剂。因此，我们进一步检查了mSRI是否可能抑制整联蛋白信号转导。用mSRI处理血小板抑制了整联蛋白-依赖性c-Src Tyr⁴¹⁶磷酸化并且加速了RhoA激活(图3A)。mSRI的作用不可能由其对RhoGEF与Gα₁₃SRI的结合的抑制作用引起，因为Gα₁₃结合至RhoGEF刺激了RhoA激活，这应该被mSRI所抑制而不是促进(21)。因此，这些数据表明β₃-Gα₁₃相互作用介导c-Src的激活和RhoA的抑制。此外，mSRI抑制整联蛋白-介导的血小板铺展(图3B)，并且这种抑制作用被C3毒素(其催化RhoA的ADP核糖基化)或Y27632逆转，证实了Gα₁₃依赖性抑制RhoA在血小板铺展中的重要性。凝血酶促进血小板铺展，这需要cdc42/Rac通路(22)。然而，凝血酶促进的血小板铺展也可由mSRI消除(图3B)，表明了Gα₁₃-β₃相互作用的重要性。因此，Gα₁₃-整联蛋白相互作用似乎是介导整联蛋白信号转导至c-Src和RhoA因此调控细胞铺展的机制。

为了进一步确定Gα₁₃是否介导抑制整联蛋白-诱导的RhoA依赖性收缩信号转导，我们研究了mSRI和去除Gα₁₃对血小板依赖性血块收缩(血块的收缩和固结需要其内部的血小板的整联蛋白依赖性收缩)的作用(7，8)。血块收缩被mSRI和去除Gα₁₃加速(图4，A和B，图10)，表明了Gα₁₃负向调控RhoA依赖性血小板收缩并协调细胞铺展和收缩。协同性细胞铺展-收缩过程在伤口愈合、细胞迁移和增殖中也很重要(23)。

Gα₁₃在介导RhoA的整联蛋白依赖性抑制中的功能与Gα₁₃的介导GPCR-诱导的RhoA激活的传统作用相反。然而，GPCR-介导的RhoA激活是瞬时的，在血小板暴露至凝血酶后1分钟达到顶峰，表明了负调控信号存在(图4、D和F)。此外，凝血酶-刺激的RhoA激活在血小板形状改变期间在配体显著结合至整联蛋白之前发生(图4，C、D和F)。相反，在凝血酶刺激之后，当Gα₁₃依赖性激活RhoA发生1分钟时，β₃结合至Gα₁₃消除，但在整联蛋白依赖性血小板聚集发生之后增加(图4，E和F)。凝血酶-刺激的Gα₁₃结合至α_IIbβ₃和同时的RhoA抑制都需要配体占据α_IIbβ₃，并且被整联蛋白抑制剂RGDS抑制(图4，D-F)。因此，我们的研究表明了不仅整联蛋白α_IIbβ₃作为非典型Gα₁₃-偶联受体的功能而且还表明了Gα₁₃依赖性动态调控RhoA的新概念，其中Gα₁₃介导初始GPCR-诱导的RhoA激活和随后的整联蛋白依赖性RhoA抑制(图4G)。这些发现对于我们理解细胞如何铺展、收缩、迁移和增殖是很重要的，这些对于发育、癌症、免疫、伤口愈合、止血和血栓形成是必要的。

实施例3

进行以下材料和方法，并且一些材料和方法的结果描述于实施例4中。

动物和试剂

整联蛋白β₃ ^-/-小鼠是从Jackson Laboratory获得的。在Research ResourceCenter，University of Illinois合成和纯化肉豆蔻酰化肽。这些肽包括：mP₁₃(Myr-KFEEERARAKWDT；SEQ ID NO:67)、mP₇(Myr-K FEEERA)和mP₅(Myr-EEERA；SEQ I DNO:68)及mP₁₃的肉豆蔻酰化乱序肽(Myr-EEARERKDWAKFT；SEQ ID NO:69)；mP₇的肉豆蔻酰化乱序肽(Myr-EAREKFE；SEQ ID NO:70)和mP₅的肉豆蔻酰化乱序肽(Myr-EEARE；SEQ ID NO:71)。在用Hind III和Xho I消化之后将人整联蛋白β₃ cDNA克隆到pCDNA3.1载体中，或者在用EcoRI、Mfe I和Xho I消化之后将人整联蛋白β₃ cDNA克隆到pLenti6-V5/Dest载体中。截短突变型和整联蛋白E至A突变型之前已经报道²³或使用PCR产生，并且将其通过Bam HI和Xho I克隆到pCDNA3.1载体中。所用的引物序列是：(1)：ITGB₃-UP：5'-GCGAAGCTTGCCGCCATGGACCGAGCGCGGCCGCGGCCCCGGCCGCTCT-3'(SEQ ID NO:72)；(2)：ITGB₃-728DN：5'-GCGCTCGAGTCAAGCGAATTCTTTTCGGTCGTGGATGGTGATGAG-3'(SEQ ID NO:73)；(3)：ITGB₃-715DN：5'-GCGCTCGAGTCACCAGATGAGCAGGGCGGCAAGGCCAATGAGCAG-3'(SEQ ID NO:74)；(4)：Itgb₃-E731A-up：5'-AAGAATTCGCTAAATTTGCAGAAGAACGCGCCAGAGCAA-3'(SEQ IDNO:75)；(5)：Itgb₃-E732A-up：5'-AAGAATTCGCTAAATTTGAGGCAGAACGCGCCAGAGCAA-3'(SEQID NO:76)；(6)：Itgb₃-E733A-up：5'-AAGAATTCGCTAAATTTGAGGAAGCACGCGCCAGAGCAA-3'(SEQ ID NO:77)；(7)：Itgb₃-E731-733A-up：5'-AAGAATTCGCTAAATTTGCAGCAGCACGCGCCAGAGCAA-3'(SEQ ID NO:78)；(8)：Mfe-ITGB₃-Up：5'-CCGCAATTGGCCGCCATGGACCGAGCGCGGCCGCGGCCCCGGCCGCTCT-3'(SEQ ID NO:79)；(9)：Xho I-ITGB₃-DN：5'-GCGCTCGAGTTAAGTGCCCCGGTACGTGATATTG-3'(SEQ ID NO:80)。在用Bam HI和Xho I消化之后，将人整联蛋白β₈-CD cDNA克隆到pGEX4T-1载体中。所用的引物序列是：(1)：ITGB₈-UP：5'-CGTGGATCC ATTAGACAGGTGATACTACAATGG-3'(SEQ ID NO:81)；(2):ITGB₈-Dn：5'-GCGCTCGAGTTAGAAGTTGCACCTGAAAGTTTC-3'(SEQ ID NO:82)。之前已经描述了GST-β₃CD和重组Gα₁₃纯化⁸。人踝蛋白头结构域cDNA对应于N-末端踝蛋白氨基酸残基1-433，将所述cDNA克隆到pCDNA3.1载体和pMal-C2载体中EcoR I和Xho I位点之间。抗-RhoA抗体是从Cytoskeleton,Inc.购买的；抗-Gα₁₃(sc410)、抗-总c-Src(sc18)、抗-踝蛋白(sc7534)及抗-整联蛋白β₃(sc6627)抗体来自Santa Cruz Biotechnology,Inc；抗-Gα₁₃(26004)来自NewEast；抗-磷酸-Src Y⁴¹⁶抗体是从Cell Signaling获得的；抗-踝蛋白(TA205)来自Millipore；抗-人整联蛋白β₃抗体、MAb 15和8053兔血清由Dr.Mark Ginsberg(Universityof California,San Diego,La Jolla,CA)友情提供；Lipofectamine 2000、viraPower慢病毒表达系统、Alexa Fluor546-缀合的鬼笔环肽及Fluor 546-缀合的抗-小鼠第二抗体来自Invitrogen；Y-27632来自Calbiochem。

在固定纤维蛋白原上的血小板制备和铺展

使用人血小板的研究由institutional review board of University ofIllinois，Chicago批准。如前所述，人经洗涤的血小板是从健康志愿者新鲜抽取的血液制备的，并且重悬浮在改良的蒂罗德缓冲液中(12mM NaHCO₃,138mM NaCl,5.5mM葡萄糖,2.6mM KCl,1mM MgCl₂,0.42mM NaH₂PO₄,2.5mM HEPES,1mM CaCl₂pH 7.4,0.1％BSA)²⁴。将小鼠用异氟醚(Pharmaceutical,Inc)麻醉，并且血小板是从下腔静脉新鲜抽取的血液制备的并使用前述方法洗涤²⁵。为了分析血小板在整联蛋白配体纤维蛋白原上的铺展，将经洗涤的血小板在37℃下铺展在100μg/ml纤维蛋白原-涂覆的盖玻片上持续不同的时间点，固定，透化，染色并如前所述用Leica RMI RB显微镜或Zeiss LSM510 META共聚焦显微镜观察(S5)⁸。

纤维蛋白原结合测定

如前所述，将重悬浮在改良的蒂罗德缓冲液(3×10⁸/ml,50μl)中的经洗涤的人或小鼠血小板与10μg/ml俄勒冈绿⁴⁸⁸-缀合的纤维蛋白原(Molecular Probes)和50μM PAR4AP在22℃下孵育30分钟²⁶。将反应物用0.5ml的PBS稀释并使用FACS Caliber(BDBiosciences,San Jose,CA)由流式细胞术分析。

免疫共沉淀和体外结合测定

将血小板或表达重组整联蛋白α_IIbβ₃ ^14,23的CHO-1b9细胞，在完全蛋白酶抑制剂混合物片剂的存在下溶解于改良的RIPA缓冲液(50mM Tris,pH 7.4,150mM NaCl,1％NP-40,1mM原钒酸钠,1mM NaF)中。将细胞裂解物与兔抗-Gα₁₃ IgG(1.5μg/ml)、抗-整联蛋白β₃兔血清(5μl/ml)或等量的兔IgG或预免疫血清在4℃下孵育过夜，随后与蛋白A-缀合的琼脂糖珠孵育1小时。对于整联蛋白β₃聚集实验(clustering experiment)，将人血小板(3×10⁸)用0.025U/mlα-凝血酶在室温下在存在或不存在2mM RGDS的情况下刺激2分钟(以避免血小板聚集)，然后与5μl抗-整联蛋白β₃ 8053兔血清在室温下孵育1小时，和与5μg山羊抗-兔二抗再孵育1小时。然后将血小板溶解在改良的RIPA缓冲液中。对于未聚集的对照和预免疫血清对照，将细胞首先溶解于改良的RIPA缓冲液中，然后与5μl 8053血清或预免疫血清孵育。在用裂解缓冲液洗涤3-6次后，将免疫沉淀物通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，并使用针对β₃、踝蛋白或Gα₁₃的抗体进行蛋白质印迹。在一些实验中，将500μM对照或抑制剂肽，mP₅，mP₇和mP₁₃与血小板裂解物在免疫沉淀之前孵育，或者在用0.025U/mlα-凝血酶刺激之前将2mMRGDS添加到经洗涤的人血小板中。之前已经描述了GST珠下拉分析⁸。将纯化的Gα₁₃或MBP-踝蛋白头与结合至GST或GST-β₃CD的谷胱甘肽珠在4℃下孵育过夜。通过免疫印迹分析珠结合蛋白。

RhoA活性测定

将在改良的蒂罗德缓冲液中的或粘附在固定纤维蛋白原上的血小板或α_IIbβ₃-表达CHO细胞溶解于0.8ml裂解缓冲液(50mM Tris,pH 7.4,10mM MgCl₂,500mM Nacl,1％Triton X-100,0.1％SDS，0.5％脱氧胆酸盐，抑肽酶和亮肽素各10μg/ml，1mM苯基甲基磺酰氟，及200μM钒酸钠)中。如前所述，将裂解物在4℃下以14,000rpm清除2分钟，并将上清液与30μg经纯化的结合至谷胱甘肽-琼脂糖珠的GST-Rhotekin RhoA-结合结构域融合蛋白(GST-RBD)孵育1小时²⁷。将样品用50mM Tris,pH 7.4、10mM MgCl₂、150mM NaCl、1％TritonX-100洗涤三次，然后用抗-RhoA单克隆抗体进行免疫印迹。还可将细胞裂解物作为上样对照与抗-RhoA进行免疫印迹。

骨髓移植

通过使用Lipofectamine 2000将插入整联蛋白β₃或AAA突变型β₃ cDNA的pLenti6/V5-Dest载体与pLP1、pLP2和pLP/VSVG质粒(Invitrogen)共转染至约90％汇合的293FT细胞中来制备慢病毒。转染后48-72小时，将含有病毒的细胞培养基浓缩、滴定并贮藏在-80℃。从股骨和胫骨分离来自6-8周龄整联蛋白β₃ ^-/-小鼠(Jackson Laboratories)的骨髓细胞。通过MACS系别细胞去除试剂盒(Miltenyi Biotech)阴选干细胞，并将其培养在含10ng/ml白细胞介素-3、10ng/ml白细胞介素-6、10ng/ml粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和100ng/ml干细胞因子(SCF)的RPMI 1640完全培养基中。感染复数(MOI)为50的慢病毒用于在6μg/ml聚凝胺的存在下感染小鼠骨髓干细胞两次。感染后48小时，将重悬浮于PBS中的5×10⁶干细胞通过眼球后注射移植到经辐射的(5Gy)整联蛋白β₃ ^-/-小鼠中(在辐射后一天)⁸。

免疫荧光和共聚焦显微术

将盖玻片预涂覆上100μg/ml纤维蛋白原，并用PBS中的5％BSA封闭。将300μl悬浮于蒂罗德缓冲液中的α_IIbβ₃-表达CHO细胞(表达野生型或突变型整联蛋白；1×10⁵/ml)或血小板(1×10⁷/ml)添加至盖玻片，并在37℃下孵育持续不同时间。将细胞用4％低聚甲醛(PFA)固定10分钟，并用PBS中的0.1％Triton X-100透化2分钟。在用5％BSA封闭10分钟后，将盖玻片与0.2μg/ml mAb 15或Alexa Fluor-546缀合的鬼笔环肽孵育。对于小鼠血小板重新表达(re-express)野生型β₃或β₃的AAA突变型，将β₃用抗-β₃单克隆抗体MAb 15和AlexaFluor-546缀合的鬼笔环肽免疫染色。如前所述，将所述玻片用Zeiss LSM510 META共聚焦显微镜扫描。¹¹

定量和统计

Image J软件用于对蛋白质印迹条带的未校准的光密度进行定量。配对t检验用于统计分析(平均值±SD)。

实施例4

如之前的实施例所示，G蛋白亚基Gα₁₃直接结合至β₃的细胞质结构域，并且为整联蛋白由外向内信号转导所需，进而导致c-Src激活、RhoA抑制和细胞铺展⁸。为了对Gα₁₃结合位点作图，我们表征了Gα₁₃与一组可与野生型α_IIb在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中稳定共表达的β₃C-末端截短突变型的结合¹⁴(图11A)。Gα₁₃结合至β₃缺失突变型Δ759和Δ741及野生型α_IIbβ₃。然而，Gα₁₃不能结合至缺失突变Δ728和Δ715(图11B)，表明了氨基酸残基K⁷²⁹和T⁷⁴¹之间的β₃序列为Gα₁₃结合所需。

为了确定这一区域中结合至Gα₁₃的氨基酸残基，我们制备了其中谷氨酸残基E731、E732或E733变为丙氨酸的β₃突变型(E731A、E732A和E733A)(图11A和C)。我们还制备了其中所有这三种谷氨酸残基被变为丙氨酸残基(AAA)的突变型。将这些突变型与α_IIb在CHO细胞中共表达，并用Gα₁₃进行免疫共沉淀(图11C)。野生型整联蛋白β₃结合至Gα₁₃(图11C)，而E731A、E733A或AAA突变型不结合，表明了所述区域中的E731和E733残基对于Gα₁₃结合是重要的。不同整联蛋白β亚基的序列的比对显示ExE基序在大多数β亚基中是保守的(β1-β7，在β5中第一谷氨酸被谷氨酰胺替换)(图11A)。在我们的实验中，含有ExE基序的β亚基(β₁、β₂和β₃)都与Gα₁₃相互作用，表明在大多数整联蛋白β亚基的细胞质结构域中保守的ExE基序对于Gα₁₃结合很重要。有趣的是，β₃的Gα₁₃结合-缺陷突变型，AAA，不对踝蛋白头结构域的结合产生负面影响。因此，ExE基序并非踝蛋白结合所需。因此，我们进一步研究了AAA突变对β₃的Gα₁₃依赖性由外向内信号转导的影响。将在慢病毒载体中的野生型β₃和AAA突变型β₃转染到从β₃ ^-/-小鼠分离的骨髓干细胞中。在高剂量辐射之后，将经转染的骨髓干细胞移植到β₃ ^-/-小鼠中。流式细胞术分析显示来自接受者小鼠的血小板表达类似水平的野生型或AAA突变型β₃(图11E)。当将血小板涂铺在整联蛋白配体纤维蛋白原上时，与不铺展的β₃ ^-/-血小板相比，大多数野生型β₃-表达血小板铺展。与表达野生型β₃的血小板相反，AAA突变型血小板在纤维蛋白原上的铺展减少(图11D)。类似地，与野生型α_IIbβ₃表达细胞相比，表达α_IIb/AAA突变型β₃的CHO细胞在纤维蛋白原上铺展方面有缺陷(图12A)。如由Tyr⁴¹⁶处的磷酸化所示，表达β₃AAA突变型的CHO细胞也显示在整联蛋白依赖性c-Src激活方面有缺陷，并且在细胞铺展期间消除整联蛋白依赖性早期瞬时RhoA抑制(图12B和C)。这些数据表明Gα₁₃-结合ExE基序在β₃中的破坏引起c-Src-依赖性整联蛋白由外向内信号转导中的缺陷。

为了进一步开发结合至β₃的Gα₁₃的潜在竞争性抑制剂，我们合成了三条在β₃的K⁷²⁹-T⁷⁴¹区内的肉豆蔻酰化肽镜像序列：mP₁₃(Myr-KFEEERARAKWDT)、mP₇(Myr-KFEEERA)和mP₅(Myr-EEERA)(图11A)。在Gα₁₃与β₃免疫共沉淀之前，将这些肽与血小板裂解物孵育。所有3种肽抑制Gα₁₃和β₃之间的免疫共沉淀(图13A)，显示mP₅)，表明序列EEERA是关键的Gα₁₃结合位点，并且这些合成肽是Gα₁₃-整联蛋白相互作用的新型抑制剂。

为了确定这些肽抑制剂是否干扰整联蛋白由外向内信号转导，我们测试了这些肉豆蔻酰化β₃细胞质结构域肽对整联蛋白由外向内信号转导的作用。用mP₅(和mP₇及mP₁₃，类似数据未显示)处理血小板还抑制了整联蛋白依赖性c-Src激活和c-Src依赖性瞬时RhoA抑制(图13B)，并且还消除了血小板在纤维蛋白原的铺展(图13C)。mP₅对血小板铺展的抑制作用被Rho激酶抑制剂Y27632逆转(图13C)，表明mP₅主要通过阻断Gα₁₃-和c-Src依赖性RhoA抑制性信号转导通路而抑制了血小板铺展，如在我们最近研究中所表征的那样⁸。此外，mP₅抑制了由凝血酶诱导的血小板聚集(图13E)。相反。mP₅对激动剂(凝血酶受体PAR4激动剂)-诱导的纤维蛋白原与血小板的结合没有影响(图13D)。因此，抑制剂肽mP₅抑制了Gα₁₃-依赖性整联蛋白由外向内信号转导而不影响由内向外信号转导。肽mP₁₃也抑制了整联蛋白由外向内信号转导(图14A)，但也显著影响了由内向外信号转导(如纤维蛋白原结合减少所指示)(图14B)，这与之前观察到该肽中的一些残基(特别是F⁷³⁰和W⁷³⁹)对于踝蛋白相互作用很重要一致。这些结果表明整联蛋白由外向内信号转导被Gα₁₃-整联蛋白相互作用的膜-可渗透肽抑制剂选择性抑制。这些数据还表明这些抑制剂还抑制血小板铺展和聚集并因此可用于治疗血栓形成。此类选择性抑制剂可使血小板粘附而对由外向内信号转导无显著放大效应，并因此可潜在地用作抗-血栓药而且与当前使用的整联蛋白抑制剂相比无显著的出血副作用。

实施例5

如下进行血小板聚集测定：在比浊血小板凝集计(Chronolog)中于37℃下在搅拌下(1000rpm)测量血小板聚集和分泌。将于改良的蒂罗德缓冲液中的经洗涤的血小板(3×10⁸/ml)用凝血酶(Enzyme Research Laboratories)刺激。为了用锰和ADP刺激的踝蛋白敲低血小板聚集测定，在实验前混合锰和ADP以获得在反应管中1mM锰和5μM ADP的最终浓度。显示的聚集迹线代表了至少三个独立实验。

实施例6

如下进行血小板粘附测定：如前所述(6)，将微量滴定孔用PBS中的30μg/ml纤维蛋白原涂覆过夜。将于改良的蒂罗德缓冲液中的经洗涤的人血小板在不存在或存在1mMMnCl₂的情况下，与微量滴定孔在37℃下于培养箱中孵育一小时。在3次洗涤后，将50μl反应缓冲液(1％Triton-X-100中的0.3％对硝基苯磷酸盐(p-nitrophenyl phosphate)(Sigma)，50mM乙酸钠，pH 5.0)添加到每个微量滴定孔中，并在37℃下孵育一小时。通过添加50μl的1M NaOH中止反应。通过读取405nm波长处的OD测定结果。从粘附血小板的读数与总血小板的读数之比估计血小板粘附的百分比。使用t检验确定统计显著性(n＝3)。

实施例7

如下进行血块收缩测定：与前述类似(2,3)，新鲜制备的人全血用1/10体积的3.8％柠檬酸钠柠檬酸化(citrated)。在1300rpm下可间断地离心22分钟之后，收集富含血小板的血浆(PRP)。将PRP与0.05％ DMSO(媒介物)、250μM mP5肽、250μM mP13肽或它们相应的乱序对照肽mP5Scr或mP13Scr在室温下预孵育5分钟。此后，将0.5U/ml凝血酶添加到PRP中，并轻轻混合。形成血块并使其在37℃带有CO₂的培养箱收缩，并在各时间点拍照。使用Image J软件对图片上收缩血块的二维尺寸进行定量，并表示为血块尺寸。使用t检验确定统计显著性(n＝3)。

实施例8

合成肉豆蔻酰化肽：mP₅(Myr-EEERA)和mP₁₃(Myr-KFEEERARAKWDT)。还制备了包含mP5和mP13乱序序列的对照肽。测试所述肽的抑制Gα₁₃和β₃之间的结合，及抑制踝蛋白和β₃之间的结合。两种肽都抑制了Gα₁₃和β₃之间的免疫共沉淀(图21A)，表明包含ExE基序的最小序列EEERA足以结合Gα₁₃。相反，仅mP₁₃抑制了踝蛋白与β₃之间的缔合，而mP₅不抑制，这与之前的mP₁₃中的序列含有重要的踝蛋白-相互作用残基数据(4、17、18、21)一致，并且表明EEERA序列不足以与踝蛋白相互作用。

还测试了所述肽对血小板在纤维蛋白原上铺展的抑制和对血小板粘附至固定纤维蛋白原的抑制。mP₅肽抑制了血小板在纤维蛋白原上的铺展(图21C)。mP₅对血小板铺展的抑制作用被Rho激酶抑制剂Y27632逆转(图21C)，表明mP₅主要通过阻断Gα₁₃-和c-Src依赖性RhoA抑制性信号转导通路抑制血小板铺展，这在我们最近的研究中表征(8)。相反，mP₅对激动剂-诱导的纤维蛋白原结合至血小板没有影响(图21B)，其也不影响血小板粘附至固定纤维蛋白原(图21D)。

另外还分析了所述肽抑制由血小板介导的血块收缩的能力。mP5不抑制反而加速由血小板介导的整联蛋白依赖性血块收缩，后者需要晚期由外向内信号转导。

这些数据表明基于β₃的Gα₁₃抑制剂肽mP₅选择性抑制了早期由外向内信号转导而不影响踝蛋白依赖性由内向外信号转导，或配体-诱导的整联蛋白激活。其也不抑制与第二波踝蛋白结合相关的晚期由外向内信号转导。因此，Gα₁₃在早期由外向内信号转导中(在这期间其结合至β₃)起到选择性作用。与mP₅相反，mP₁₃不仅抑制早期由外向内信号转导(图21C)，而且还抑制由内向外信号转导，如由纤维蛋白原结合减少所指示(图21B)。该肽还抑制了血小板粘附至固定纤维蛋白原(图21D)。此外，mP13抑制了血块收缩并且该抑制不锰逆转。

实施例9

测试了mP5(Myr-EEERA)对血小板聚集和分泌的影响。如图24所示，mP5抑制了血小板颗粒分泌和第二波的血小板聚集。这些结果支持mP5选择性抑制由外向内信号转导的观点。

实施例10

该实施例表明了经修饰形式的mP5肽(Myr-EEERA)的设计。制备了第一组经修饰的形式的mP5肽，其中所述组中的每条肽保留了EEE基序，但在所述EEE基序N-末端或所述EEE基序C-末端添加了1、2、3、4、5或更多个侧翼残基。所述侧翼残基基于β₃整联蛋白序列或其它β整联蛋白序列中天然存在的侧翼序列。经修饰的肽包括，例如KFEEE、FEEER、AKFEEE、KFEEER、FEEERA、EEERAR、EEERARA和EEERARAK。为了每一种经修饰的肽合成，合成两种对照肽：(1)具有相同的氨基酸组成但具有不同的氨基酸序列的乱序肽，和(2)损失了功能的肽，其中所述序列相同除了每一个ExE残基被变为丙氨酸。测试每条肽抑制踝蛋白结合的能力或直到所述肽的亲和力到达顶峰。

在第二组的肽中，修饰第一组的肽以使EEE基序中的第二谷氨酸变成另一种氨基酸。一些将被改成EAE或EKE。随后测试了这些肽针对Gα₁₃的亲和力。

制备第三组的经修饰的mP5肽，其中所述肽被环化。环化可提高递送效率并使所述肽的胞外切割最小化。在示例性情况下，将所述肽制备为在每端(N-和C-端)含有Cys，并且在条件下相互作用以形成二硫键。随后，测试所述环肽对Gα₁₃-整联蛋白相互作用、整联蛋白由外向内信号转导的生物化学标记、血小板粘附、血小板聚集和血栓形成的体外抑制作用。

通过体外结合测定，使用经纯化的Gα₁₃和经纯化的整联蛋白β₃细胞质结构域，测试以上各组肽抑制Gα₁₃-整联蛋白相互作用的能力^[14]。将重组β₃细胞质结构域-GST融合蛋白和对照GST蛋白固定至谷胱甘肽-珠。将所述珠与重组Gα₁₃在GTPγS的存在或不存在下混合。在洗涤后，通过蛋白质印迹分析结合的Gα₁₃。将经修饰的肽以及每一种对照肽添加至反应物以测定这些肽的抑制作用。

将修饰形式的mP5通过测定另外筛选，其中将经修饰的肽或对照肽添加至固定有重组β₃细胞质结构域的微量滴定孔。在将所述肽添加至各孔后，将生物素化的Gα₁₃添加至各孔。HRP-标记的链霉亲和素在ELISA测定中用于确定哪种肽抑制了Gα₁₃与固定的β₃细胞质结构域之间的相互作用，因为那些含有HRP-标记的链霉亲和素的孔结合至生物素化Gα₁₃表明所述肽成功抑制了Gα₁₃与固定的β₃细胞质结构域之间的结合。

ExE肽的筛选另外还通过构建表达具有随机侧翼氨基酸残基的ExE基序肽的噬菌体文库和使用涂覆有Gα₁₃蛋白的微量滴定孔筛选高亲和力结合来测试。对所述具有高亲和力结合序列的噬菌体克隆进行测序，并合成相应的肽以用于进一步测试，如本文所述。

如在以下实施例所述，选择表现最佳的肽并将其用于体内研究。

实施例11

胶束是通过两亲性分子在水中聚集形成的纳米大小的颗粒(图25)。附接至脂肪酸的本发明的肽可用于将所述肽配制成胶束。将SEQ ID NO:87的ExE基序肽如下制备成胶束制剂：将1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](PEG₂₀₀₀-DSPE；Northern Lipids Inc.,Vancouver,BC)、L-α-磷脂酰胆碱(蛋PC，XI-E型，Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)及肽以45：5：1的摩尔比混合。如前所述，使用膜再水合方法制备胶束^[21]。将脂质膜用10mM等渗的HEPES缓冲液(HEPES 10mM,NaCl 135mM,pH 7.4)再水合以形成胶束胶体。将脂质和肽的混合物溶解于甲醇和氯仿中，然后使用旋转蒸发仪R-215(40mbar,45℃,Buchi,New Castle,DE)蒸发以形成薄脂质层。将脂质膜真空干燥(在黑暗中)过夜，然后用10mM等渗HEPES缓冲液(HEPES 10mM,NaCl 135mM,pH 7.4)再水合以形成胶束胶体。

在初步剂量依赖性研究中，将FEEERA(SEQ ID NO:87)的胶束制剂与溶解于DMSO中的相同的肽比较。溶解于DMSO中的250μM该肽是体外血小板聚集的最大作用所需的，而当被制备成胶束制剂时仅4μM的该肽是最大作用所需的(图29)。

实施例12

使用从人供体和动物分离的血小板，富含血小板的血浆(PRP)或全血离体进行以下实验。

血小板聚集和颗粒分泌

从人供体或从麻醉小鼠的腔静脉抽血。为了制备经洗涤的血小板，将酸性柠檬酸盐葡萄糖(ACD；85mM柠檬酸三钠，83mM葡萄糖和21mM柠檬酸)用作抗凝剂。对于PRP，将3.2％柠檬酸钠用作抗凝剂。将经分离的血小板或PRP与浓度增加的胶束ExE基序肽或对照乱序肽预孵育，并且在添加荧光素酶/荧光素试剂之后，使用Lumi-凝集计(Chronolog)测试所述肽的血小板聚集并同时记录ATP从致密颗粒分泌。三磷酸腺苷(ADP)、凝血酶、PAR4AP、PAR1AP、U46619、瑞斯托霉素/美洲矛头腹毒蛋白和胶原用于刺激血小板。使用用抗-p-选择蛋白抗体的流式细胞术测量P-选择蛋白暴露，其是α-颗粒分泌的指标^[22]。

将经分离的血小板或PRP与溶解于DMSO中的各种浓度的FEEERA(SEQ ID NO:87)的肽或其乱序对照预孵育。然后将0.1U凝血酶添加至细胞以刺激ATP分泌。然后，使用lumi-凝集计测量细胞ATP分泌。相对于乱序对照肽的分泌％显示在图27中。

实施例13

在流动条件下的血小板粘附和血栓形成

在模拟动脉血液流动的流动条件下，离体测试胶束ExE基序肽，诸如mP5和FEEERA(SEQ ID NO:87)的肽对血小板粘附和血栓形成的影响。在实验室中，使用(1)分层气流室和(2)锥板式流变仪建立两种不同类型的流动粘附测定。将分层气流室用内皮下基质蛋白(诸如胶原)、冯威勒布兰德因子(VWF)或两者涂覆。将血小板用荧光染料(米帕林或5-氯甲基荧光素二醋酸盐(CMFDA))标记，并将抗凝血液、PRP或经分离的血小板以限定的血流剪切率用注射泵输注到室中。使用倒置荧光显微镜和电荷耦合设备(CCD)照相机，监测粘附和富含血小板的血栓的形成。在一些实验中，使用共聚焦显微镜对血栓尺寸进行定量(与下述相似)。当使用锥板式流变仪时，将载玻片用VWF或胶原涂覆，并置于具有恒定温度控制的Thermo-Haake流变仪的平台上。将用ExE肽胶束或对照胶束处理的米帕林-标记的血小板添加至玻璃板并经受恒定剪切应力。将稳定的血小板粘附和血小板聚集的形成拍照并在荧光显微镜下分析。将不同剂量的ExE基序肽或对照肽与血小板孵育以获得抑制常数(K_i)。

实施例14

ExE基序肽的PFA-100分析

PFA-100是一种临床使用的血小板功能测试，其使血液通过涂覆有血小板激动剂/粘附蛋白(诸如肾上腺素/胶原)的柱直到柱中发生血栓性阻塞时^[27]。在该装置中对血栓形成测试ExE基序肽如mP5和FEEERA SEQ ID NO:87)的肽。将来自两周没有服用血小板抑制剂的健康供体的血液用3.2％柠檬酸钠抗凝，并且添加胶束ExE基序肽或对照肽。然后基本上如[27]中描述那样通过PFA-100测定分析血液样品。

实施例15

用于止血功能的体内出血时间分析

出血时间分析是体内总体止血功能的指标。整联蛋白的配体-结合功能对于原发性血小板粘附和聚集是很重要的，并因此对止血也很重要。如下进行出血时间分析：将胶束配制的ExE基序肽(诸如mP5)和乱序对照眼球后注射给C57BL/6小鼠。如前所述，将小鼠尾的远端部分(5mm)用解剖刀截掉，并在37℃下将尾巴浸入0.15M NaCl^[28]。记录出血停止的时间。如果出血不能在900秒后停止，那么停止测定，并向尾巴施压以预防血液过多流失。测定是以双盲的方式进行的。类似地，还与ExE基序肽比较测试了用当前整联蛋白拮抗剂reopro和integrillin处理的野生型小鼠的出血时间。将Integrillin以该方式进行测试(用盐水对照和每组4只小鼠)。结果显示在图26中，其中表明了中间值。用integrillin处理的小鼠的出血时间超过测定的上限值(900s)。结果，停止测定并经由施加压力停止出血。

由于ExE基序肽不影响整联蛋白α_IIbβ₃的配体结合功能，期望这些肽对出血时间的影响与消除配体结合至整联蛋白的当前整联蛋白拮抗剂相比应显著降低。

实施例16

胶束ExE基序肽用于体内使用的安全性

测定C57BL小鼠中的最大耐受剂量(MTD)，以评估ExE基序肽的急性毒性。将5倍最大有效剂量(如通过离体研究测定)的初始剂量经由尾静脉注射到2只小鼠中。如果小鼠死亡或显示出不耐受的临床体征，则给予更低的剂量。相反，如果没有小鼠死亡或显示出不耐受的体征，则给予更高的剂量。重复该过程直至达到MTD。在另外的小鼠中测试MTD两周(每种性别5只小鼠)。小鼠可能在甚至比有效剂量显著更高的剂量下良好耐受这些胶束肽。如果是这种情况的话，则所述肽被认为可在体内安全使用。

实施例17

使用FeCl₃-和激光-诱导的损伤模型，测试各种剂量的ExE基序肽(如，mP5，FEEERA(SEQ ID NO:87)的肽)对体内血栓形成的影响。试验现有的整联蛋白拮抗剂和其它的抗-血小板药(环氧合酶抑制剂和P2Y12抑制剂)，使得可将EXE基序肽的影响与现有药物诱导的影响比较。阴性对照包括媒介物对照。可进行另外的测试以确定与一种或多种现有整联蛋白拮抗剂或抗-血小板药联合使用ExE基序肽是否产生对血栓形成的累加或协同影响。

氯化铁-诱导的血栓形成模型

在C57BL/6小鼠中，已经进行了氯化铁损伤-诱导的颈动脉血栓形成模型^[29,30]。FeCl₃-诱导的血栓形成广泛用于反映血小板在阻塞性动脉血栓形成中的作用^[31]。在该研究中，将成体小鼠通过腹腔内注射戊巴比妥(120mg/kg)麻醉。将左颈总动脉通过手术暴露，并将微型多普勒流探针(Doppler flow probe)(Model 0.5VB；Transonic Systems,Ithaca,NY)置于动脉表面。在添加0.9％氯化钠溶液在手术伤口中以进行多普勒监测(Dopplermonitoring)之后，使用超声血流仪记录基线血流量。此后，去除氯化钠溶液，并将用10％FeCl₃饱和的滤纸(圆形，直径为1.0mm)施加至与流探针紧邻的颈动脉的表面。3分钟后，移除滤纸，将盐水溶液再施加至伤口，并监测颈动脉血流量。如果阻塞性血栓形成发生在损伤的颈动脉，则血流量减少至零。将ExE基序肽胶束和对照经由尾静脉i.v.注射到C57BL/6小鼠中，然后使用该模型测试阻塞性血栓形成。

用两种EXE肽进行该测定：FEEERA和其乱序对照(ERAFEE)。如图28所示，当向小鼠给予FEEERA时，如与其乱序对照相比，阻塞的时间增加。

使用活体显微术的体内血栓形成的激光-诱导损伤模型

使用激光剥蚀广视共聚焦显微镜系统，检测ExE基序肽对体内血栓形成的影响^[32]。使用该系统，在小血管中实时观察到体内血栓形成。使用录像摄影，记录和分析血栓形成的动力学。注射荧光标记的血小板特异性抗体以监测血小板掺入血栓中。将对照或ExE基序肽-注射的小鼠(雄性，6-8周)经由腹腔内注射氯胺酮和赛拉嗪麻醉。将插管置于颈静脉中以用于注射药物。通过去除结缔组织使提睾肌外置。将所述肌肉以单片的形式固定在活体的显微镜托盘上的载玻片上。将缀合有Dylight 649的大鼠抗-小鼠CD42b抗体通过颈插管输注到小鼠中5分钟。使用具有60倍水浸物镜的Olympus荧光显微镜将血小板血栓形成显现并使用高速电子照相机记录。通过监测红细胞流速确定血管-阻塞状态。期望ExE基序肽-处理的小鼠显示出闭塞性血栓形成显著减少，但对响应于激光-诱导的损伤的初始血小板粘附影响最小。

实施例18

体内注射胶束ExE基序肽对离体血小板功能的影响

将含有ExE基序肽的胶束通过小鼠的尾静脉注射，并在限定的时间(诸如5分钟、10分钟和30分钟)后，麻醉小鼠并对其抽血。如本文所述，测试血小板的功能。这些实验使得能够确定注射ExE基序肽是否对总体血小板功能有影响。

实施例19

基本上如本文所述，用肉豆蔻酰化肽mP5、SEQ:ID NO:87的肉豆蔻酰化肽或它们各自的乱序对照肽进行血小板聚集测定。简而言之，将经洗涤的人血小板与溶解于DMSO中的25、50、100、250或500μM肽预孵育。随后，用0.09U/ml凝血酶诱导血小板，并在比浊血小板凝集计中测量血小板聚集。图30A提供了每种测试肽(mP5，SEQ ID NO:87的肉豆蔻酰化肽)在不同指定剂量下的得分表，其中所述得分指示肽抑制血小板聚集的程度。如图30A所示，与mP5肽相比，SEQ ID NO:87的肉豆蔻酰化肽能够在较低剂量下抑制血小板聚集。250μM的每种测试肽的聚集迹线示于图30B中。

实施例20

在实施例20中使用了以下材料和方法。

免疫共沉淀如前所述⁸使用血小板或α_IIbβ₃-表达CHO-1b9细胞²³进行。还参见仅在线方法(Online-only Methods)。

在Research Resource Center，University of Illinois，Chicago合成和纯化肉豆蔻酰化肽抑制剂。这些包括：mP₅、mP₆、mP₁₃和各个乱序对照：mP₁₃Scr(Myr-EEARERKDWAKFT；SEQ ID NO:69)、mP₅Scr(Myr-EEARE；SEQ ID NO:71)和mP₆Scr(Myr-ERAFEE；SEQ ID NO:413)。将所述肽在DMSO中制备以供体外使用，并在胶束制剂中制备以供体内(和体外)使用。所述胶束制剂具有摩尔比为45：5：2的PEG₂₀₀₀-DSPE、L-α-磷脂酰胆碱和肽，并且如前所述制备²⁴。mP₆与mP₆Scr在由血小板摄取方面类似(图43a)并且在体内不引起血像显著变化(图43b)。

骨髓干细胞，来自6-8周龄整联蛋白β₃ ^-/-或C57小鼠，被用浓缩的含shRNA或cDNA构建体的慢病毒感染两次，然后眼球后注射至经辐射的接受者小鼠(对于整联蛋白β₃ ^-/-小鼠为5Gy，和对于C57小鼠为9.6Gy)中(在辐射后一天)⁸。

血小板功能分析^13,25、流式细胞术²⁶、激光-诱导的提睾肌动脉血栓形成²⁷及FeCl₃-诱导的颈动脉血栓形成²⁸如前所述进行。使用t检验或单向ANOVA分析数据。

尾部出血时间分析如前所述进行²⁹。出血稳定停止的时间被定义为60秒不再出血。立即终止超过15分钟的出血。使用曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)分析数据。

动物和试剂

整联蛋白β₃ ^-/-小鼠是从Jackson Laboratory获得的。踝蛋白-1^(fl/fl)、PF4-Cre小鼠由Dr.Brian Petrich和Dr.David Critchley友情提供¹⁶。动物使用和方案由institutionalanimal care committee of the University of Illinois，Chicago批准。对于所有动物实验，具有类似年龄、体重和性别比例(1：1，除了用于激光-诱导的血栓形成)的小鼠用作对照和特定处理。随机选择特定处理所选用的各个小鼠。在用Hind III和Xho I消化之后将人整联蛋白β₃ cDNA克隆到pcDNA3.1载体中，或者在用EcoR I、Mfe I和Xho I消化之后将人整联蛋白β₃ cDNA克隆到pLenti6-V5/Dest载体中。截短突变型和整联蛋白E至A突变型之前已经报道²³或使用PCR产生并通过Bam HI和Xho I克隆到pcDNA3.1载体中。所用的引物序列是：

(1):ITGB₃-UP：

5'-GCGAAGCTTGCCGCCATGGACCGAGCGCGGCCGCGGCCCCGGCCGCTCT-3'

(SEQ ID NO:72)；

(2):ITGB₃-728DN：

5'-GCGCTCGAGTCAAGCGAATTCTTTTCGGTCGTGGATGGTGATGAG-3'

(SEQ ID NO:73)；

(3):ITGB₃-715DN：

5'-GCGCTCGAGTCACCAGATGAGCAGGGCGGCAAGGCCAATGAGCAG-3'

(SEQ ID NO:74)；

(4):Itgb₃-E731A-up：

5'-AAGAATTCGCTAAATTTGCAGAAGAACGCGCCAGAGCAA-3'

(SEQ ID NO:75)；

(5):Itgb₃-E732A-up：

5'-AAGAATTCGCTAAATTTGAGGCAGAACGCGCCAGAGCAA-3'；

(SEQ ID NO:76)

(6):Itgb₃-E733A-up：

5'-AAGAATTCGCTAAATTTGAGGAAGCACGCGCCAGAGCAA-3'；

(SEQ ID NO:77)

(7)：Itgb₃-E731-733A-up：

5'-AAGAATTCGCTAAATTTGCAGCAGCACGCGCCAGAGCAA-3'；

(SEQ ID NO:78)

(8)：Mfe-ITGB₃-Up:

5'-CCGCAATTGGCCGCCATGGACCGAGCGCGGCCGCGGCCCCGGCCGCTCT-3'；

(SEQ ID NO:79)

(9)：Xho I-ITGB₃-DN：

5'-GCGCTCGAGTTAAGTGCCCCGGTACGTGATATTG-3'

(SEQ ID NO:80)、

在用Bam HI和Xho I消化之后，将人整联蛋白β₈-CD cDNA克隆到pGEX4T-1载体中。使用的引物序列是：

(1)：ITGB₈-UP：

5'-CGTGGATCC ATTAGACAGGTGATACTACAATGG-3'；

(SEQ ID NO:81)

(2):ITGB₈-Dn：

5'-GCGCTCGAGTTAGA AGTTGCACCTGAAAGTTTC-3'

(SEQ ID NO:82)。

GST-β₃CD和重组Gα₁₃纯化如前所述⁸。将人踝蛋白头结构域(THD)cDNA，对应于N-末端踝蛋白氨基酸残基1-433，克隆到pcDNA3.1载体和pMal-C2载体中EcoR I和Xho I位点之间。抗-RhoA抗体是从Cytoskeleton,Inc.购买的；抗-Gα₁₃(sc410)、抗-c-Src(sc18)、抗-踝蛋白(sc7534)和抗-整联蛋白β₃(sc6627)抗体来自Santa Cruz Biotechnology,Inc.；抗-Gα₁₃(26004)来自NewEast；抗-磷酸-Src Y⁴¹⁶抗体是从Cell Signaling获得的；抗-踝蛋白(TA205)来自Millipore；抗-踝蛋白抗体8d4(T3287)是从Sigma获得的；PAC1抗体(340507)和抗-小鼠α_IIb抗体MWReg3(14-0411)是从BD Biosciences获得的；抗-人整联蛋白β₃抗体MAb15、LIBS6和8053兔血清由Dr.Mark Ginsberg(University of California,San Diego,La Jolla,CA)友情提供；Lipofectamine 2000、viraPower慢病毒表达系统、Alexa Fluor546-缀合的鬼笔环肽、Fluor 488-缀合的抗-小鼠第二抗体、踝蛋白-1shRNA质粒(NM-011602)及非特异性shRNA对照载体来自Invitrogen；Y-27632来自Calbiochem；纤维蛋白原来自Enzyme Research Laboratories。

结合至整联蛋白细胞质结构域的经纯化的Gα₁₃和THD

将GST-标记的整联蛋白细胞质结构域蛋白在4℃下涂覆到Pierce谷胱甘肽-涂覆的板(15140)上过夜。在用含完全蛋白酶抑制剂混合物片剂(1片/5ml缓冲液，Roche)的NP40缓冲液(50mM Tris,pH 7.4,10mM MgCl₂,150mM NaCl,1％NP-40,1mM原钒酸钠,1mM NaF)洗涤两次后，将经纯化的THD或Gα₁₃蛋白添加至板上NP40缓冲液中(对于Gα₁₃结合，缓冲液含有30μM AlF₄ ^-)。用抗-踝蛋白或抗-Gα₁₃抗体、辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的第二抗体和3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物(Pierce,34021)评估结合的THD或Gα₁₃。将各孔在这些步骤的每一个之间用NP40缓冲液洗涤三次。用1M硫酸终止反应，并测量OD₄₅₀。对于竞争性抑制测定，将浓度增加的THD或Gα₁₃添加至反应物中。

血小板制备

使用人血小板的研究由institutional review board，University ofIllinois，Chicago批准并从所有供体获得知情同意书。将来自在捐赠前两周内未服用药物的健康供体的经洗涤的人血小板和来自8-12周龄小鼠的血小板如前所述制备并重悬浮于改良的蒂罗德缓冲液中¹³。

血小板聚集测定

在比浊血小板凝集计(Chronolog)中于37℃下在搅拌(1000rpm)下测量血小板聚集和分泌。将于改良的蒂罗德缓冲液中的经洗涤的血小板(3×10⁸/ml)用凝血酶(EnzymeResearch Laboratories)刺激。显示的聚集迹线代表了至少三个独立实验。

纤维蛋白原和PAC1结合测定

对于纤维蛋白原结合测定，将重悬浮于改良的蒂罗德缓冲液中的经洗涤的人或小鼠血小板与10μg/ml俄勒冈绿-缀合的纤维蛋白原(Molecular Probes)和PAR4AP孵育，如前所述²³。将所述反应物用PBS稀释，并使用Accuri C6流式细胞仪(BD)通过流式细胞术分析。用FITC-标记的PAC1抗体(Molecular Probe)测量PAC1结合。

免疫共沉淀

如前所述⁸，将血小板或表达重组整联蛋白α_IIbβ₃ ²³的CHO-1b9细胞溶解于含完全蛋白酶抑制剂混合物片剂(1片/5ml缓冲液，Roche)的NP40裂解缓冲液(50mM Tris,pH 7.4,10mM MgCl₂,150mM NaCl,1％NP-40,1mM原钒酸钠，1mM NaF)中。在以14,000g离心10分钟后，清除裂解碎片。然后将裂解物用兔抗-Gα₁₃IgG、抗-整联蛋白β₃兔血清或等量的兔IgG或预免疫血清免疫沉淀2小时，之后添加蛋白A/G琼脂糖珠。在4℃下孵育蛋白A/G琼脂糖珠45分钟后，将珠离心下来，并用NP40裂解缓冲液洗涤六次。通过免疫印迹分析免疫沉淀物。

RhoA活性测定

将改良的蒂罗德缓冲液中或粘附在固定纤维蛋白原上的血小板或α_IIbβ₃-表达CHO细胞在4℃下溶解于冷NP40裂解缓冲液中，并将已清除碎片的裂解物与经纯化的GST-RBD珠孵育1小时、洗涤，然后用抗-RhoA单克隆抗体进行免疫印迹，如前所述⁸。

骨髓移植

如前所述⁸，使用MACS系别细胞去除试剂盒(Miltenyi Biotec)从6-8周龄整联蛋白β₃ ^-/-或C57/BL6小鼠的股骨和胫骨分离骨髓干细胞。如在动物和试剂一章中所述，随后使用Lenti-X浓缩器(Clontech)用含有shRNA或cDNA构建体的浓缩慢病毒感染干细胞两次。然后将所述细胞眼球后注射到经辐射的接受者小鼠(对于整联蛋白β₃ ^-/-小鼠为5Gy，和对于C57/BL6小鼠为9.6Gy，一百万个细胞/接受者小鼠)中(在辐射后一天)。

血小板粘附测定

如前所述²³，将经洗涤的血小板与媒介物或肽或1mM MnCl₂或0.18μg/ml LIBS6预孵育，之后涂覆。在37℃下孵育1小时后，通过用1％Triton X-100中的0.3％对硝基苯磷酸盐，50mM乙酸钠，pH 5.0测量血小板磷酸酶活性，评估粘附的血小板。用1M NaOH终止反应。通过读取OD₄₀₅测定结果。使用t检验确定统计显著性(n＝3)。

细胞铺展、免疫荧光和共聚焦显微术

将悬浮于改良的蒂罗德缓冲液中的经洗涤的血小板或α_IIbβ₃-表达CHO细胞添加到100μg/ml纤维蛋白原(Enzyme Research Laboratories)-涂覆的盖玻片，并在37℃下孵育不同时长。将细胞固定、透化、用改良的蒂罗德缓冲液中的0.5％牛血清白蛋白封闭、用mAb15染色(然后用Fluor 488-缀合的抗-小鼠第二抗体染色)和/或Alexa Fluor-546缀合的鬼笔环肽染色并用Zeiss LSM510 META共聚焦显微镜观察，如前所述⁸，或用Leica DMIRB荧光显微镜、Photometrics CoolSNAP HQ照相机及μManager软件观察。通过NIH ImageJ分析5-10张随机图片测量细胞表面积。使用t检验确定统计显著性。

血块收缩测定

如前所述⁸，将人PRP与媒介物或肽在室温下孵育5分钟，之后用凝血酶刺激。使用Image J软件对收缩的血块的二维尺寸进行定量，并且使用t检验确定统计显著性(n＝3)。

肽抑制剂

在Research Resource Center，University of Illinois，Chicago合成和纯化肉豆蔻酰化肽。这些肽包括：mP₁₃(Myr-KFEEERARAKWDT(SEQ ID NO:67))、mP₅(Myr-EEERA(SEQID NO:414))、mP₆(Myr-FEEERA(SEQ ID NO:415))，及相应的对照肽mP₁₃Scr(Myr-EEARERKDWAKFT(SEQ ID NO:69))、mP₅Scr(Myr-EEARE(SEQ ID NO:71))和mP₆Scr(Myr-ERAFEE(SEQ ID NO:413))。所述肽在DMSO中制备以供体外使用，和在胶束制剂中制备以供体内(和体外)使用。对于胶束制剂，将PEG₂₀₀₀-DSPE、L-α-磷脂酰胆碱和肽以45：5：2的摩尔比混合。将所述胶束悬浮在HEPES-盐水缓冲液(10mM HEPES,150mM NaCl,pH 7.4)，肽浓度1mM)中形成胶束胶体，如前所述²⁴。mP₆与mP₆Scr在由血小板摄取方面相类似(图43a)，并且在体内不引起血像显著变化(图43b)。

血小板中肽浓度的评估。

将mP₆和mP₆Scr肽溶解，并用1-芘基重氮甲烷(PDAM)在黑暗中于DMSO中缀合过夜，或在甲醇中缀合，并掺入至如上所述的胶束中。将血小板与PDAM-缀合的肽在室温下孵育5分钟，经由离心沉淀，洗涤，及用NP40裂解缓冲液裂解，并通过测量荧光强度(吸收340nm/发射395nm)评估PDAM-缀合的肽的浓度，如前所述³⁰。将血小板裂解物(未与肽孵育)用作空白对照。使用添加至血小板裂解物的已知浓度的肽获得标准曲线。

体内FeCl₃-诱导的血栓形成和尾部出血时间

将7-8周龄C57/BL6小鼠通过异氟醚吸入麻醉。在实验之前15分钟，进行眼球后注射肽胶束或integrilin(5μmol/kg小鼠重量)。颈动脉血栓形成被用1.2μl的7.5％FeCl₃浸泡的滤纸盘(d＝2mm)所诱导。用使用MA-0.5SB多普勒探针的TS420流量计(TransonicSystems,Ithaca,NY)监测血液流量。使用单向ANOVA分析数据。如前所述进行尾部出血时间分析²⁹。出血稳定停止的时间被定义为无出血迹象60秒的证据。超过15分钟的出血通过施压立即停止。使用曼-惠特尼检验确定统计显著性。用非参数ANOVA也获得类似结果。对于测量总血液损失的出血测定，将切断的小鼠尾在37℃下浸入含1.5ml的0.15M NaCl的微量离心管15分钟。使用HemoCue光度计测定管中的血红蛋白浓度。使用单向ANOVA分析数据。以双盲形式进行实验。

活体显微术和激光-诱导的血栓形成。

与前述方法相类似²⁷，将野生型雄性小鼠(6-8周龄)经由IP注射氯胺酮和赛拉嗪麻醉，并置于热控毯(37℃)上。将提睾肌外置并用热控(37℃)碳酸氢盐-缓存盐水浇注直至实验结束。使用具有60倍/1.0NA水浸物镜和高速照相机(Hamamatsu C9300)的Olympus BX61W显微镜通过增强器(Video Scope International)记录荧光和明场像。以每秒20帧捕捉荧光图像，并使用Slidebook v5.5(Intelligent Imaging Innovations)分析数据。小动脉壁损伤被微点激光剥蚀系统(Photonics Instruments)所诱导。通过输注Dylight 649-标记的抗-小鼠CD42c(Emfret，0.05μg/g体重体重)至小鼠中显现血小板累积。在激光损伤之前3分钟输注媒介物对照、Integrilin、乱序肽或mP₆。激光-诱导的血栓在血管内的不同位点产生，新位点在早期血栓的上游。在激光损伤之后，经5分钟收集数据。通过为时间函数的每组3只小鼠中大约30个血栓中的所述抗体的荧光中值分析血小板累积的动力学。还使用Welcht t检验确定了在给定时间点的荧光强度的统计差异(平均值±SD)。以双盲形式进行所述实验。

统计

对于参数数据，在确定正态分布和同方差(equal variances)之后，使用学生t检验(或对于非同方差(non-equal variances)的样品，Welch t检验)或ANOVA分析统计显著性。对于非参数数据(出血时间分析)，应用曼-惠特尼检验。用GraphPad Prism 4软件进行分析。使用GraphPad InStat 3用费希尔精确检验(Fisher’s exact test)进行样本尺寸估计。

实施例21

整联蛋白在血栓形成和止血中很重要¹。血小板整联蛋白α_IIbβ₃的拮抗剂是有效的抗-血栓药，但也具有威胁生命的出血不良作用^2,3。因此需要开发不引起出血的新型拮抗剂。整联蛋白双向传递信号^4,5。由内向外信号转导经由踝蛋白依赖性机制激活整联蛋白^6,7。整联蛋白连接介导血栓形成和由外向内信号转导^8,9，这需要Gα₁₃并极大地扩大血栓。在此我们显示了Gα₁₃和踝蛋白以相反的波(in opposing waves)结合至整联蛋白β₃细胞质结构域内相互排斥但不同的位点处。第一波踝蛋白结合介导由内向外信号转导以及也介导“配体-诱导的整联蛋白激活”，但不为由外向内信号转导所需。整联蛋白连接诱导瞬时踝蛋白解离和Gα₁₃结合至ExE基序，这选择性地介导了由外向内信号转导和血小板铺展。第二波踝蛋白结合与血块收缩相关。Gα₁₃-整联蛋白相互作用的基于ExE基序的抑制剂选择性地消除了由外向内信号转导而不影响整联蛋白连接，并且抑制了阻塞性动脉血栓形成而不影响出血时间。因此，我们已经发现了整联蛋白信号转导转向的新机制，并且基于该机制，我们设计了不引起出血的有效的新型抗-血栓药。

整联蛋白信号转导涉及数种分子结合至整联蛋白β亚基的细胞质结构域，所述分子包括踝蛋白^6,7、kindlin^10,11、c-Src^12,13和Gα₁₃ ⁸(图31a)。Gα₁₃与各种β₃C-末端截短突变型的免疫共沉淀表明Gα₁₃结合涉及K⁷²⁹和T⁷⁴¹之间的β₃序列(图31b,图36a)，但不涉及kindlin-/c-Src-结合序列(图31a，b)。不同β细胞质结构域的比对显示了在该区域中的ExE基序，其中第一和第三Glu残基在大多数β亚基中是保守的，但在β₈中不保守(图31a)。含有ExE基序的β₁、β₂和β₃都结合Gα₁₃，但β₈不结合(图31c，图36f)。野生型(Wt)和E732A突变型β₃结合至Gα₁₃，但E731A、E733A、AAA(图31d，图36b)、DED或QSE突变型(图36e)不结合，表明ExE基序中的第一和第三Glu对于Gα₁₃结合是很重要的。含有EEERA(SEQ ID NO:21)序列的合成肽抑制了Gα₁₃-β₃相互作用(见下文)，这验证了该含ExE基序的Gα₁₃结合位点。

ExE基序位于踝蛋白-结合区中(图31a)^14,15。整联蛋白-结合踝蛋白头结构域(THD)在α_IIbβ₃-表达细胞中的过表达抑制了Gα₁₃与β₃的免疫共沉淀(图31e)。纯化的重组THD和Gα₁₃直接竞争结合纯化的GST-β₃细胞质结构域融合蛋白(GST-β₃CD)(图31f，g)，表明了Gα₁₃和踝蛋白在结合至β₃方面是相互排斥的。有趣的是，踝蛋白和Gα₁₃的结合在整联蛋白信号转导期间在时间上被调控(图32)。第一波踝蛋白与α_IIbβ₃的缔合发生在凝血酶-刺激的由内向外信号转导之后(图32a，b)和整联蛋白连接开始之前(如由血小板聚集所指示(图32c))。然而，在整联蛋白连接之后，踝蛋白与α_IIbβ₃的缔合减少(图32a，b)。第二波踝蛋白-β₃缔合发生在完全血小板聚集之后(图32a-c)，所述完全血小板聚集的时间与血块收缩相关。与两波的踝蛋白结合相反，当第一波踝蛋白结合发生时，Gα₁₃-β₃缔合甚至比在由内向外信号转导期间的基线水平还要低(图32a，b)，但当第一波踝蛋白结合平息时在整联蛋白连接之后达到顶峰，然后在第二波踝蛋白-结合期间再次降低(图32a,b)。因此，由内向外和由外向内信号转导的各个时期与Gα₁₃和踝蛋白与β₃结合的协同和相反的波相关。

重要的是，Gα₁₃与整联蛋白结合的增加仅可当在纤维蛋白原存在下激活整联蛋白时被诱导，但不被整联蛋白激活单独诱导(图37a)。相反，整联蛋白抑制剂RGDS(图32a，b)或EDTA(图37b，c)在凝血酶-刺激的血小板中防止踝蛋白从β₃解离并抑制Gα₁₃-β₃相互作用。因此，α_IIbβ₃从踝蛋白-结合状态转换为Gα₁₃-结合状态是由大分子配体的结合所启动的。

踝蛋白和Gα₁₃与β₃结合的相反波表明这两种蛋白与β₃的相互作用分别选择性介导由内向外和由外向内信号转导。这种假设可使用踝蛋白-敲除¹⁶和shRNA-诱导的踝蛋白-敲低血小板来测试，所述血小板在ADP/纤维蛋白原-诱导的整联蛋白依赖性聚集方面存在缺陷(图32d，e；图38a，c)。它们的缺陷型聚集与

锰或整联蛋白-激活抗体(LIBS6)完全相关(图32e，图38c)，其不依赖于由内向外信号转导而激活整联蛋白。这些数据确定了踝蛋白在由内向外信号转导中的作用^6,15,17。已经确定了由内向外信号转导不是α_IIbβ₃激活的唯一通路。当纤维蛋白原通过固定化或转化为纤维蛋白而改变构象时，整联蛋白-纤维蛋白原相互作用可不依赖于由内向外信号转导而发生^18,19。这是由于暴露的配体识别序列RGD与静息整联蛋白的初始接触触发了“配体-诱导的整联蛋白激活”²⁰。有趣的是，静息踝蛋白-敲除或-敲低血小板粘附至固定纤维蛋白原是有缺陷的(图32f，图38b)，表明了在由内向外信号转导不存在的情况下踝蛋白在血小板粘附至固定纤维蛋白原中的重要性。然而，添加锰/整联蛋白-激活抗体完全修正了踝蛋白-敲除/敲低血小板在固定纤维蛋白原上的粘附和铺展(及还有踝蛋白-结合缺陷突变型β₃-表达CHO细胞的铺展²¹)(图32f、g，图38b、d、e)。因此，踝蛋白在静息血小板粘附至纤维蛋白原中的作用仅归结于其在“配体-诱导的整联蛋白激活”中的重要性。由于细胞铺展需要早期的由外向内信号转导，因此这些数据进一步说明一旦忽视其在整联蛋白激活中的作用，那么踝蛋白并非导致细胞铺展的早期由外向内信号转导所需。

为了评估Gα₁₃结合至ExE基序是否选择性介导由外向内信号转导而不干扰踝蛋白-依赖性整联蛋白功能，将野生型和AAA突变型β₃-转染的骨髓干细胞(来自β₃ ^-/-小鼠)移植到经辐射的β₃ ^-/-小鼠中。来自接受者小鼠的血小板表达了类似水平的野生型或AAA突变型β₃(图33a，图39a)。在整联蛋白信号转导期间，AAA突变抑制了β₃与Gα₁₃的相互作用，但不抑制与踝蛋白(或c-Src)的相互作用(图33b，图39b)。AAA突变对激动剂-诱导的可溶性纤维蛋白原结合也没有影响(图33c)。因此，ExE基序并非踝蛋白依赖性由内向外信号转导所需。相反，AAA突变型β₃-表达血小板在固定纤维蛋白原上的铺展方面有缺陷(图33d，图39c、d)。因此，β₃中的Gα₁₃结合缺陷引起整联蛋白由外向内信号转导和血小板铺展方面的选择性缺陷。类似地，在CHO细胞中表达的α_IIb/AAA和更保守的α_IIb/DED或α_IIb/QSE突变型，都在Gα₁₃结合方面存在缺陷(图36e)，也在纤维蛋白原上的铺展方面存在缺陷(图33e、f，图40a、b、c)。然而，与Y747A突变型相反，在CHO细胞中表达的AAA突变型β₃对THD结合没有副作用(图40d，e)。此外，AAA-表达细胞显示出在细胞铺展期间在整联蛋白依赖性c-Src激活(如由Tyr⁴¹⁶处的磷酸化所示)和RhoA的瞬时抑制方面存在缺陷(图33g，图40f)，这两者都是由外向内信号转导的重要元件。连同之前鉴别介导踝蛋白结合的β₃序列的研究(图31a)^6,15,17,22，我们的数据表明踝蛋白和Gα₁₃与β₃的相同区中的不同识别序列动态相互作用以作为控制整联蛋白信号转导方向的分子开关。

ExE基序在由外向内信号转导中的特定作用促使我们设计了由外向内信号转导的选择性抑制剂。我们合成了数种含肉豆蔻酰化ExE基序的β₃肽：mP₅(Myr-EEERA(SEQ ID NO:414))、mP₆(Myr-FEEERA(SEQ ID NO:415))和mP₁₃(Myr-KFEEERARAKWDT(SEQ ID NO:67))。这些肽抑制了Gα₁₃与β₃之间的免疫共沉淀(图34a，图41a-d)，表明了EEERA(SEQ ID NO:21)的最小序列足以结合Gα₁₃。相反，仅mP₁₃而非mP₆(或mP₅)抑制了踝蛋白与β₃的缔合(图34a)，表明mP₆不与踝蛋白相互作用。mP₆抑制了血小板在纤维蛋白原上的铺展(图34b，图41e)，但对激动剂-诱导的纤维蛋白原/PAC1结合至血小板(图34c，图41f、g)或血小板粘附至固定纤维蛋白原(图34d)没影响。有趣的是，mP₆不抑制但反而加速了血小板依赖性血块收缩(图34e)。这些数据表明基于ExE的抑制剂mP₆选择性抑制了早期由外向内信号转导而不影响踝蛋白依赖性由内向外信号转导、配体-诱导的整联蛋白激活或与第二波踝蛋白结合相关的晚期由外向内信号转导。相反，mP₁₃抑制了由内向外和由外向内信号转导，如同其抑制了纤维蛋白原结合(图41h)、血小板粘附(图34d)和血块收缩(图34e)(不被锰逆转，如前使用踝蛋白^-/-血小板所示¹⁶)。因此，mP₆选择性干扰早期由外向内信号转导，但mP₁₃影响所有时期的整联蛋白信号转导。重要的是，mP₆体外抑制了第二波凝血酶-诱导的血小板聚集(图34f)，并且当被作为胶束注射到小鼠中时，如当前使用的整联蛋白拮抗剂Integrilin在抑制激光-诱导的小动脉血栓形成(图34g、h，图42a、b)和FeCl₃-诱导的阻塞性颈动脉血栓形成(图34i，图42c)方面一样有效。更醒目地，在Integrilin和mP₆都类似地抑制了阻塞性血栓形成的浓度下，Integrilin显著延长了尾出血并增加了血液损失，而mP₆不具有此类不良作用(图34j，图42d)。因此，我们已经发现了防止血栓形成而不引起出血的新型抗-血栓药。

总之，我们的研究通过揭示控制整联蛋白信号转导方向和结果的分子开关而提供了概念上的进步。我们展示了由内向外和由外向内信号转导之间的转换是由踝蛋白和Gα₁₃结合至β₃细胞质结构域内不同但相邻的序列的协同但相反的波所介导。这种信号转导转换的发现形成了选择性抑制由外向内信号转导而不干扰整联蛋白的配体结合功能的概念基础。重要的是，我们将这种新概念转化为有效的新型抗-血栓药，不像当前可获得的整联蛋白拮抗剂或其它抗-血栓药，其可有效抑制动脉血栓形成而无出血的不良作用(图34g-j)，所述出血的不良作用是潜在的威胁生命的问题，其限制了当前抗-整联蛋白和抗-血栓药疗法的临床用途。

实施例22

该实施例表明了与较长肽mP7和mP13相比，较短肽mP5和mP6选择性抑制了由外向内信号转导。在该实施例中，mP5、mP6和mP13的结构如实施例20和21所述。mP7的结构是KFEEERA(SEQ ID NO:68)，其中C-端的Lys以与肉豆蔻酰化的mP5、mP6和mP13类似的方式被肉豆蔻酰化。乱序型的mP5、mP6、mP7和mP13的结构是Myr-EEARE(SEQ ID NO:71)、Myr-ERAFEE(SEQ ID NO:413)、Myr-ERKAFEE(SEQ ID NO:416)和Myr-EEARERKDWAKFT(SEQ IDNO:69)。

测试肉豆蔻酰化肽(mP5、mP6、mP7或mP13)对纤维蛋白原结合至血小板上的整联蛋白的影响，并将其与已知的整联蛋白拮抗剂Integrilin的影响相比较。

基本上如实施例20所述那样，测试测试纤维蛋白原结合。简而言之，将重悬浮于改良的蒂罗德缓冲液中的经洗涤的人血小板与200μM肽在室温下在激活前预孵育5分钟。静息血小板用作阴性对照。与10μM Integrilin预孵育的血小板也用作抑制剂作用的参考。孵育后，如前所述，然后将血小板与10μg/ml俄勒冈绿-缀合的纤维蛋白原(Molecular Probes)和100μM PAR4AP孵育。将反应物用PBS稀释，并使用Accuri C6流式细胞仪(BD)通过流式细胞术分析。

如图44所示，mP5或mP6均不抑制激动剂-诱导的纤维蛋白原结合至血小板，而mP7和mP13就像Integrilin一样抑制纤维蛋白原结合至血小板。mP7与mP13相比具有较弱的抑制作用。

基本上如实施例20所述，还测试了肉豆蔻酰化肽(mP6、mP7或mP13)对血小板聚集的影响。简而言之，在比浊血小板凝集计(Chronolog)中于37℃下在搅拌(1000rpm)下测量血小板聚集和分泌。将于改良的蒂罗德缓冲液中的经洗涤的人血小板(3×10⁸/ml)与250μM肽在室温下预孵育5分钟，然后用0.030U/mlα-凝血酶凝血酶(Enzyme ResearchLaboratories)刺激。

如图45所示，较长肽mP7和mP13两者都完全抑制了凝血酶-刺激的血小板聚集，而mP6仅部分抑制了血小板聚集。这些结果表明mP6仅抑制第二波血小板聚集扩大，而较长的肽抑制了第一波血小板聚集和第二波血小板聚集。第一波血小板聚集直接由激动剂-刺激的由内向外信号转导和纤维蛋白原结合所导致。第二波血小板聚集需要整联蛋白由外向内信号转导(第一波纤维蛋白原结合和血小板聚集的结果)、血小板颗粒分泌以及血小板激活和由内向外信号转导及进一步的纤维蛋白原结合随之放大。

基本上如实施例20所述，测试了肉豆蔻酰化肽(mP5、mP6、mP7或mP13)对血小板粘附的影响，并将其与Integrilin或HEPES缓冲液的影响相比。简而言之，将经洗涤的血小板与100μM肽在室温下在涂覆前预孵育5分钟。在37℃下孵育1小时后，通过用1％Triton X-10中的0.3％对硝基苯磷酸盐，50mM乙酸钠，pH 5.0在37℃下测量血小板磷酸酶活性1小时，评估粘附的血小板。用1M NaOH终止反应。通过读取OD₄₀₅确定结果。使用学生t检验确定统计显著性(n＝4)。

如图46所示，mP5或mP6均不抑制血小板粘附至固定纤维蛋白原，而mP7部分抑制且mP13几乎完全抑制血小板粘附。这些数据进一步支持较短的肽(mP5和mP6)对由内向外信号转导没有影响。由于这些肽不对由内向外信号转导产生影响，所以这些肽可使得原发性血栓发生，从而防止在当前使用的整联蛋白拮抗剂和其它抗-血栓药所见到的潜在威胁生命的出血不利作用。mP7部分抑制血小板粘附，表明了其产生了在较短肽(mP5和mP6)与较长肽mP13之间的中间作用。

总之，这些数据进一步支持mP5和mP6选择性抑制早期由外向内信号转导而不影响踝蛋白依赖性由内向外信号转导、配体诱导的整联蛋白激活，或者与第二波踝蛋白结合相关的晚期由外向内信号转导。相反，mP7和mP13抑制了由内向外和由外向内的信号转导，如其抑制纤维蛋白原结合一样(图44)，完全抑制了血小板聚集(图45)，及抑制了血小板粘附(图46)。mP13具有mP6和mP13之间的中间作用，即部分抑制纤维蛋白原结合和血小板粘附。因此，使用较短的肽如mP5和mP6，可将选择性抑制阻塞性血栓形成而无出血风险最优化。

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本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，通过引用并入本文，如同每个参考文献被单独地和具体地指出以通过引用以其整体并入本文并在此示出。

除非在本文中另外说明或上下文中明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别是在以下的权利要求书中)使用术语“一个/一种(a)”和“一个/一种(an)”和“所述”及类似指称被理解为涵盖单数和复数。除非另外说明，否则术语“包含/包括”、“具有”、“包括”和“含有”被理解为是开放式术语(即，意为“包括但不限于,”)。

除非在本文中另外说明，否则对本文各值的范围的引用仅意图充当单独涉及落在所述范围内的每个单独值和每个端值的简易方法，并且每个单独的值和端值如同其在本文中单独引用被并入本说明书。

除非在本文另外说明或上下文中明显矛盾，否则本文所述的所有方法可以任何适合的顺序进行。除非另有要求，否则使用本文提供的任何或所有实例，或者示例性用语(如，“诸如”)仅意在更好说明本发明而并非限制本发明的范围。在本说明书中的用语不应被理解为指代任何未要求保护的为本发明实践所必需的要素。

在本文中描述了本发明的优选实施方案，包括已知进行本发明的最佳模式。本领域普通技术人员在阅读上述描述后，那些优选实施方案的变更将变得显而易见。本发明人期望技术人员酌情采用此类变更，并且本发明人旨在以不同于本文具体描述的方式实施该发明。因此，本发明包括了如适用法律所许可的随附的权利要求书中引用的对象的所有修改和等同物。此外，在其所有可能的变更中，上述要素的任何组合均由本发明涵盖，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。

Claims (18)

1.包含氨基酸序列FEEERA(SEQ ID NO:87)的肽，其中所述肽的长度为6个氨基酸，或者所述肽为通过氨基酸序列FEEERA(SEQ ID NO:87)形成的环肽，所述环肽具有形成二硫桥的两个Cys残基。

2.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽由氨基酸序列FEEERA(SEQ ID NO:87)组成。

3.根据权利要求1所述的肽，其包含脂肪酸。

4.根据权利要求3所述的肽，其中所述脂肪酸是C4-C30脂肪酸。

5.根据权利要求4所述的肽，其中所述脂肪酸是C12至C20脂肪酸。

6.根据权利要求5所述的肽，其中所述脂肪酸是C14至C18脂肪酸。

7.根据权利要求3所述的肽，其中所述脂肪酸共价连接至所述肽的N-端。

8.根据权利要求7所述的肽，其中所述肽由氨基酸序列FEEERA(SEQ ID NO:87)组成，其中位置1处的Phe共价连接至脂肪酸。

9.胶束，其包含权利要求1-8中任一项所述的肽以及至少一种脂质。

10.根据权利要求9所述的胶束，其包含共价连接至水溶性聚合物的脂质和不含水溶性聚合物的脂质。

11.根据权利要求10所述的胶束，其中所述肽由FEEERA(SEQ ID NO:87)组成，其中位置1处的Phe共价连接至C14脂肪酸。

12.组合物，其包含权利要求9至11中任一项所述的胶束和水溶液。

13.药物组合物，其包含权利要求1-8中任一项所述的肽，或含所述肽的胶束，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述肽由氨基酸序列FEEERA(SEQ ID NO:87)组成，其中位置1处的Phe共价连接至C14脂肪酸。

15.权利要求13或14所述的药物组合物在制备用于在有需要的个体中抑制血栓形成，或者治疗或预防中风或心脏病发作的药物中的用途。

16.权利要求1至8中任一项所述的肽在制备用于在个体中抑制细胞铺展或迁移、抑制血小板颗粒分泌和血小板聚集、抑制血小板粘附、抑制或治疗炎症、促进伤口愈合、抑制血管生成、增强血块凝缩、抑制血栓形成、治疗或预防中风或心脏病发作或治疗癌症的药物中的用途。

17.权利要求1至8中任一项所述的肽在制备用于抑制肿瘤细胞转移的药物中的用途。

18.权利要求1至8中任一项所述的肽在制备用于抑制白细胞粘附、铺展、迁移或趋化性的药物中的用途。