CN103003302A - 人源化和嵌合抗-备解素抗体 - Google Patents
人源化和嵌合抗-备解素抗体 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103003302A CN103003302A CN201180023582XA CN201180023582A CN103003302A CN 103003302 A CN103003302 A CN 103003302A CN 201180023582X A CN201180023582X A CN 201180023582XA CN 201180023582 A CN201180023582 A CN 201180023582A CN 103003302 A CN103003302 A CN 103003302A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- cdr
- aminoacid sequence
- properdin
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/54—F(ab')2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
分离的抗-备解素抗体或其抗原结合部分,包括:重链可变结构域,包括SEQ ID NO:1中的三种CDR;和轻链可变结构域,包括SEQ ID NO:9中的三种CDR。
Description
相关申请
本申请要求2010年9月3日提交的美国申请No.12/920,997、2010年3月10日提交的美国临时申请No.61/312,469、2011年3月2日提交的PCT申请No.PCT/US2011/26841的优先权,其主旨通过引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及人源化和嵌合抗体及其抗原结合片段,其可以在其中交替途径有助于疾病病理学的疾病病症中结合备解素并选择性地抑制交替补体途径。这些抗体可以用于在人中治疗炎症疾病和病患。
背景技术
补体系统对于病原体清除和针对病原体的宿主防御来说是重要的。交替补体途径(AP)在多种病原体炎症病况和自身免疫疾病中活化。因此,抑制疾病诱导的AP活化是临床上有益的。
补体系统通过三种不同补体途径来活化:经典、凝集素和交替途径。经典途径通过抗原-抗体络合物活化。凝集素途径是经典途径的变体。交替途径由外源材料、人工表面、死亡组织、细菌和死亡酵母细胞所活化。在疾病病况中,AP活化产生C3a,C5a和C5b-9(也称为MAC络合物)。已经发现升高水平的C3a,C5a和C5b-9相关于多种急性和慢性疾病病况。这些炎症分子活化嗜中性粒细胞、单核细胞和血小板。因此,抑制疾病诱导的AP活化在其中补体活化在疾病病理中发挥作用的疾病中对于临床益处是重要的。
这些炎症分子通过活化白细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、血小板、肥大细胞和内皮细胞、血管渗透性、胞溶和组织损伤的活化来介导炎症。活化的细胞释放炎症介导因子,例如TNF-α、IL-Iβ、IL-6、IL-8、VEGF、嗜中性粒细胞、弹性蛋白酶和过氧化物。
交替补体途径的抑制要求备解素结合C3b,这高亲和性地发生。备解素-结合的C3b (PC3b)缔合因子B以形成PC3bB络合物,然后其被因子D切除以形成PC3bBb和Ba,其中Ba释放。备解素-耗尽的血清完全缺少AP活化活性,这显示备解素对于发生该引发过程是必需的。血液中的备解素浓度接近为5ug/ml,因此,和其他非蛋白酶分子相比,其仅仅是以更低浓度存在的非蛋白酶分子。
抑制AP活化将是减轻症状和延缓或预防疾病进展的重要治疗策略。耗尽备解素、中和备解素或失活备解素可以阻断AP活化而不会抑制经典补体途径,因此,其是可行和有希望的治疗策略。使典型途径完整有益于增加防止感染。
发明概述
本发明涉及分离的嵌合和人源化单克隆抗体,其特异地结合备解素并选择性地阻断交替补体途径。通过任何方法以产生Fab,Fab′,Fab2′和IgG的嵌合,人源化和全人抗体可以中和备解素功能活性,并且防止C3a,C5a和C5b-9的AP诱导的产生。结果,还可以防止细胞活化,炎症和炎症介导因子的释放。由于AP活化相关于多种急性和慢性人类疾病,因此使用嵌合,人源化和全人抗体产生的封锁还可以阻断炎症过程,从而为使用本发明的抗-备解素单克隆抗体治疗的人提供临床益处。
因此,本发明的一个方面涉及分离的抗-备解素抗体或其抗原结合部分,包含:重链可变结构域,包括SEQ ID NO:1中的3种CDR;和轻链可变结构域,包括SEQ ID NO:9中的3种CDR。
在一些方面中,抗-备解素抗体或其抗原结合部分包含:重链,选自:SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ IDNO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:45,SEQ IDNO:46,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50。
在其他方面中,抗-备解素抗体或其抗原结合部分包含:轻链,选自:SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ IDNO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ IDNO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33。
本申请的另一方面涉及分离的抗-备解素抗体或其抗原结合部分,包括至少一种CDR,选自:CDR-H1,包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;CDR-H2,包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列;CDR-H3,包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列;CDR-L1,包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列;CDR-L2,包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列;以及CDR-L3,包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
在一些方面中,分离的抗-备解素抗体或其抗原结合部分包括:SEQ IDNO:14的CDR-L1区多肽和SEQ ID NO:6的CDR-H1区多肽。
在其他方面中,抗-备解素抗体或其抗原结合部分包括:SEQ ID NO:15的CDR-L2区多肽和SEQ ID NO:7的CDR-H2-区多肽。
在其他方面中,抗-备解素抗体或其抗原结合部分包括:SEQ ID NO:16的CDR-L3区多肽和SEQ ID NO:8的CDR-H3-区多肽。
在甚至其他方面中,轻链CDR-L1包括SEQ ID NO:14,轻链CDR-L2包括SEQ ID NO:15;以及轻链CDR-L3包括SEQ ID NO:16。
在又一方面中,重链CDR-H1包括SEQ ID NO:6;重链CDR-H2包括SEQ ID NO:7,以及重链CDR-H3包括SEQ ID NO:8。
在另一方面中,轻链CDR-L2包括SEQ ID NO:14,轻链CDR-L2包括SEQ ID NO:15;轻链CDR-L3包括SEQ ID NO:16;重链CDR-H1包括SEQID NO:6;重链CDR-H2包括SEQ ID NO:7;以及重链CDR-H3包括SEQID NO:8。
在其他方面中,抗-备解素抗体或其抗原结合部分包括至少两个CDR,选自:CDR-H1,包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;CDR-H2,包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列;CDR-H3,包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列;CDR-L1包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列;CDR-L2,包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列;以及CDR-L3,包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
在其他方面中,抗-备解素抗体或其抗原结合部分包括至少三个CDR,选自:CDR-H1,包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;CDR-H2,包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列;CDR-H3,包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列;CDR-L1,包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列;CDR-L2,包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列;以及CDR-L3,包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
在其他方面中,抗-备解素抗体或其抗原结合部分包括至少四种CDR,选自:CDR-H1,包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;CDR-H2,包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列;CDR-H3,包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列;CDR-L1,SEQ ID NO:14的氨基酸序列;CDR-L2,包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列;以及CDR-L3,包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
在其他方面中,抗-备解素抗体或其抗原结合部分,包括至少五种CDR,选自:CDR-H1,包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;CDR-H2,包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列;CDR-H3,包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列;CDR-L1,包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列;CDR-L2,包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列;以及CDR-L3,包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
在其他方面中,抗-备解素抗体或其抗原结合部分包括和SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90%序列一致性的重链可变结构域。
在甚至其他方面中,抗-备解素抗体或其抗原结合部分包括和SEQ IDNO:9的氨基酸序列具有至少90%序列一致性的轻链可变结构域。
在又一方面中,抗-备解素抗体,包含:和选自SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90%序列一致性的重链可变结构域;和选自SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少90%序列一致性的轻链可变结构域。
在又一方面中,抗-备解素抗体或其抗原结合部分包括:重链可变结构域,选自:SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:41,SEQ IDNO:42,SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:46SEQ ID NO:47SEQ ID NO:48SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50。
在进一步方面中,抗-备解素抗体或抗原结合部分包括:轻链可变结构域,选自:SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ IDNO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33。
本发明的另一方面涉及在哺乳动物中抑制交替补体途径活化的方法。该方法包括下列步骤:向人或其他哺乳动物施用分离的抗-备解素抗体或其抗原结合部分,所述抗体或其抗原结合部分特异性地结合备解素并抑制交替补体途径活化。分离的抗-备解素抗体或其抗原结合部分,包括:重链可变结构域,包括SEQ ID NO:1中的三种CDR;和轻链可变结构域,包括SEQ ID NO:9中的三种CDR。
在另一方面中,该方法包括下列步骤:治疗其中交替补体途径的活化发挥作用的疾病或病患,包括向具有所述疾病或病患或者处于发展所述疾病或病患风险的个体施用嵌合或人源化抗-备解素抗体或其抗原结合片段。
在又一方面中,该方法包括下列步骤:治疗疾病或病患,选自炎症疾病和炎症病患。
在另一方面中,该方法包括下列步骤:治疗疾病或病患,选自自身免疫疾病和自身免疫病患。
在又一方面中,该方法包括下列步骤:治疗自身免疫疾病或自身免疫病患,选自系统性红斑狼疮,重症肌无力,关节炎病症,阿耳茨海默氏病和多发性硬化。
在另一方面中,该方法包括下列步骤:治疗关节炎病症。关节炎病症可以选自类风湿性关节炎,骨关节炎和青年类风湿性关节炎。
在又一方面中,该方法包括下列步骤:治疗补体相关的疾病或病患,选自眼部疾病和眼部病患。眼部疾病或眼部病患可以选自:糖尿病视网膜病,眼睛胞浆菌病,年龄相关的黄斑变性,糖尿病视网膜病,脉络膜新生血管(CNV),葡萄膜炎,糖尿病视网膜水肿,病理性近视,希-林二氏病,眼睛胞浆菌病,视网膜中央静脉阻塞(CRVO),角膜新生血管形成和视网膜新生血管形成。年龄相关的黄斑变性可以选自中间干性AMD和地图状委缩。
在另一方面中,治疗选自哮喘病和气道炎症病患的补体相关的病患的步骤。气道炎症病患可以选自:哮喘,慢性阻塞性肺病(″COPD″),过敏性支气管肺曲菌病,过敏性肺炎,嗜酸细胞性肺炎,气肿,支气管炎,过敏性支气管炎支气管扩张,囊肿性纤维化,肺结核,过敏性肺炎,职业性哮喘,类肉瘤,反应性气道病综合征,间质性肺炎,高嗜酸细胞综合征,鼻炎,鼻窦炎,运动引起的哮喘,污染引起的哮喘,感冒变体哮喘,肺寄生虫病,呼吸道合胞病毒(″RSV″)感染,副流感病毒(″PIV″)感染,鼻病毒(″RV″)感染和腺病毒感染。
附图简述
图1示出包括靶蛋白备解素的交替补体途径的图表。
图2显示抗-备解素抗体IgG,Fab2和Fab结合备解素。
图3示出抗-备解素单克隆抗体抑制AP活化,这通过兔红细胞胞溶的抑制来测量。
图4示出抗-备解素单克隆抗体在缓冲液的1%和10%的正常人血清中不抑制经典途径活化。
图5示出抗-备解素抗体IgG,Fab2和Fab抑制备解素高亲和性地结合C3b。
图6示出抗-备解素抗体IgG和NM4540不竞争结合备解素。
图7示出抗-备解素抗体IgG,Fab2和Fab在测定中抑制C3b的形成。
图8示出抗-备解素抗体IgG,Fab2和Fab在如图7中所示相同的测定中抑制PC3b的形成。
图9示出抗-备解素抗体IgG,Fab2和Fab在如图7中所示相同的测定中抑制PC3bBb的形成。
图10示出抗-备解素抗体在心肺分流术的全血模型的猪中抑制血小板功能异常。
图11示出抗-备解素抗体在经历心肺分流术的猪中体内抑制AP活化。
图12示出在经历心肺分流术的猪中抗-备解素抗体抑制血小板功能异常。
图13示出抗-备解素抗体在兔中抑制局部缺血再灌注损伤。
图14示出在经历黄斑变性的兔中抗-备解素抗体抑制CNV。
图15示出在类风湿性关节炎的兔模型中抗-备解素抗体抑制关节炎症。
图16示出SEQ ID NO:1至SEQ.ID NO:8的重链氨基酸序列。
图17示出SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:16的轻链氨基酸序列。
图18示出抗-备解素IgG抗体和抗-备解素抗体嵌合IgG抗体与备解素的结合亲和性。
图19示出人源化抗-备解素抗体和嵌合抗-备解素抗体抑制备解素结合C3b。
图20示出人源化IgG抗体和嵌合抗-备解素IgG在10%正常人血清中抑制rRBC的溶血。
图21示出SEQ ID NO:17至SEQ ID NO:21的轻链氨基酸序列。
图22示出SEQ ID NO:22至SEQ ID NO:27的轻链氨基酸序列。
图23示出SEQ ID NO:28至SEQ ID NO:33的轻链氨基酸序列。
图24示出SEQ ID NO:34至SEQ ID NO:39的重链氨基酸序列。
图25示出SEQ ID NO:40至SEQ ID NO:45的重链氨基酸序列。
图26示出SEQ ID NO:46至SEQ ID NO:50的重链氨基酸序列。
图27示出三种选择的人源化单克隆抗体SEQ ID NO:36,37和44的结合亲和性。
图28示出三种选择的人源化单克隆抗体抑制交替补体途径活化,这通过在AP缓冲液中抑制溶血活性来示出。
图29示出作为该抗体的抗原表位的备解素序列。
发明详述
如本文使用的,术语″受体人框架″是指包括衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的VL或VH框架的氨基酸序列的框架。
如本文使用的,术语″抗体″覆盖全长单克隆抗体,多克隆抗体,纳米体和多特异性抗体。生物抗体通常是约150,000道尔顿的杂-四聚体糖蛋白,其包含两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链。两个重链通过二硫键连接,并且各重链通过二硫键连接轻链。各全长IgG分子含有特异靶或抗原的至少两个结合位点。轻链是kappa或lambda。轻链都含有可变氨基酸序列的结构域,称为可变区(还称为″VL,″″Vkappa,″或″Vlambda-区″)和相对保守的氨基酸序列的结构域,称为恒定区(″CL-区″)。类似地,各重链含有可变区(″VH-区″)和三个恒定结构域(″CH1-,″″CH2-″和″CH3-区″)以及铰链区。
如本文使用的,术语″抗体片段″是指全长抗体的段,通常称为靶结合或可变区。例子包括Fab,Fab′,F(ab′)2和Fv片段。″Fv″片段是含有完整靶识别和结合位点的最小抗体片段。
如本文使用的,术语″抗原结合片段″是指抗体分子的一种或多种片段,所述抗体分子含有负责抗原结合的抗体可变区。Fab,Fab′和F(ab)2缺少Fc区。抗原结合片段可以通过蛋白酶消化从全长抗体制备。抗原结合片段可以由本领域技术人员使用标准的重组DNA方法来制备。
如本文使用的,补体-决定区(″CDR″)是指重链和轻链的可变区内的特定区。通常,可变区包括以下列方式布置的四个框架区(FR1,FR2,FR3,FR4)和三个CDR:NH2-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-COOH。术语″框架区″是指除了本文所述的CDR残基之外的那些可变结构域残基。
如本文使用的,术语″抗原表位″是指抗体及其片段结合和实施功能活性的备解素上的位点。术语″抗原表位″和″抗原位点″和抗体结合位点″相同。鼠源单克隆mAb71-110和本发明的嵌合和人源化抗体及其结合片段享有相同的结合位点。鼠源mAb描述于PCT申请No.PCT/US2008/068530。本领域技术人员可以将人备解素的序列比对另一动物物种的备解素的序列,并且确定抗原表位的位置。
如本文使用的,″Fab片段″是指轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域。Fab′片段和Fab片段的不同在于重链CH1结构域的羧基末端处的数个特别残基,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。F(ab′)片段是通过在F(ab′)2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处切除二硫键而制备的。
如本文使用的,术语抗体的″功能片段″是指和一样的全长抗体具有定性的生物活性的抗体片段。例如,功能抗体片段是这样的物质,其可以以这样的方式结合备解素,以防止或基本上降低交替补体活化。
如本文使用的,术语″人共有框架″是指框架,其表示在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最通常存在的氨基酸残基。通常,人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。
如本文使用的,″人源化抗体″是指由大部分人类序列构成的抗体,除了CDR1,CDR2和CDR3。所有框架区也都是人源化。嵌合抗体包含鼠源CDR,鼠源框架区和人恒定区。总的来说,嵌合抗体含有鼠源可变区和人恒定区。
如本文使用的,术语涉及抗体链肽序列的″一致″或″基本上一致″可以理解为抗体链和抗原结合片段的可变区存在的参照多肽序列表现出至少65%,70%,80%,90%或95%序列一致性。涉及核酸序列的术语可以理解为核苷酸序列和参照核酸序列表现出至少约65%,75%,85%,90%,95%或97%序列一致性。
如本文使用的,术语″个体″是指脊椎动物,优选哺乳动物,更优选人。适于治疗的个体包括目前无症状但是处于发展系统性病患的风险的那些人,其中交替补体途径发挥作用或其中交替补体途径活化发挥作用。
如本文使用的,术语″哺乳动物″是指分类为哺乳动物的任何动物,包括人、高级灵长类动物、家畜、马、猪、牛、犬、猫和雪貂等。在本发明的一个实施方案中,哺乳动物是人。
如本文使用的,″单克隆抗体″是指同源的抗体群。这些抗体是高度特异性的,并且针对单靶抗原导向。这些单克隆抗体由未被其他免疫球蛋白污染的杂交瘤培养物均匀产生。单克隆抗体还可以通过其他工序例如相展示法由熟知的方法来制备。
如本文使用的,术语″天然序列备解素″是指备解素的天然存在的前体形式、天然存在的变体形式和备解素的天然存在的等位变体、以及和衍生自天然的备解素多肽具有相同氨基酸序列的备解素分子的结构构型变体。非人动物包括高级灵长类动物和非人哺乳动物的备解素多肽包括在该定义内。
如本文使用的,术语″备解素″是指天然序列和变体备解素多肽。
如本文使用的,术语″SDR″是指IgG或其片段的第三补体决定区(″CDR3″)和第四框架区(″FR4″)的氨基酸序列的全部或一部分。
如本文使用的,术语″选择性抑制交替补体途径″是指优选和专门地抑制交替补体途径,但不抑制其他补体活化途径,包括经典补体途径。例如,人源化和嵌合抗体以及它们抗原结合片段选择性地抑制交替补体途径。该定义适用于其中交替补体途径被选择性抑制的本文所述的其他方法。
如本文使用的,术语″治疗有效量″是指″备解素拮抗剂″的量,所述″备解素拮抗剂″需要用来在状态(例如病理)中实现靶疾病或病症(例如补体相关的眼睛病症)的可测量的进展。
如本文使用的,术语″治疗″是指治疗性疗法和预防性或预防措施。
本发明可以提供用于预防和治疗补体相关的病症的抗-备解素剂。这些抗-备解素剂可以包括但不限于,抗-备解素抗体及其抗体变体,其抗原结合片段,其他结合多肽,肽,非肽小分子,适体以及DNA和RNA片段。这些抗-备解素剂可以结合备解素,并且可以能够中和、阻断、部分或全部抑制、撤销、降低或干扰备解素功能活性,例如备解素涉及任何补体相关的炎症疾病或病患的病理学的能力。
本发明的抗-备解素剂可以防止备解素结合C3b以通过选择性地结合备解素形成PC3b络合物。结果,不形成PC3b络合物和PC3bBb络合物。由于PC3bBb络合物将C5切除为C5a和C5b,因此也不形成MAC络合物(C5b-9)。因此,通过抑制备解素结合C3b,本发明的抗-备解素剂将抑制形成MAC络合物。已经发现升高水平的MAC络合物相关于多种急性和慢性疾病。因此,通过本发明的抗-备解素剂抑制MAC络合物对于其中补体活化在疾病病理学中发挥作用的疾病中的临床益处是重要的。
PC3b络合物、PC3bB络合物和PC3bBb络合物可以全部聚合。已知抑制这些络合物中的各种和抗-备解素剂的聚合,其中备解素与C3b,因子B或因子Bb中每种的摩尔比为1∶1。本发明的抗-备解素剂可以抑制这些络合物中的各种和抗-备解素剂的聚合,其中这些络合物中的各种分别包含比各络合物中C3b,因子B和因子Bb多至少1摩尔的备解素。在一个例子中,对于PC3b络合物,备解素和C3b的摩尔比可以表示为(P)x(C3b)y,其中X=Y+1。在另一例子中,对于PC3bB络合物,备解素,C,C3b和因子B的摩尔比可以表示为(P)x(C3b)y(B)z,其中X=Y+Z。该例子还可以表示PC3bBb络合物中备解素与C3b和因子Bb的摩尔比。
本发明的抗-备解素剂可以具有抑制备解素的任何生物活性的能力。这种能力可以在备解素-相关的疾病或病症(例如补体相关的炎症疾病或病患)的病理状态中带来可测量的改善。该活性可以体外或体内试验来评价,包括但不限于结合测定、使用相关动物模型的交替途径溶血测定或人临床试验。
在本发明的另一实施方案中,抗-备解素剂可以结合备解素上的特定抗原表位以抑制AP活化。在一个例子中,抗-备解素剂可以结合备解素的N-端结构域以抑制备解素结合C3b。用于本发明的抗-备解素剂的抗原表位映射序列表征为SEQ ID NO:51。
本发明的抗-备解素剂可以包括人源化单克隆抗-备解素抗体或其抗原结合片段,其选择性地结合备解素并选择性地抑制交替补体途径活化,其可以用于在人或其他哺乳动物中治疗任何交替途径相关的炎症疾病或病患。疾病和病患的综合列表包括在本文中。
人抗-备解素抗体可以包括抗体,该抗体以这样的方式特异性地结合人备解素,以在人中抑制或基本上降低补体活化。本发明还可以涉及这样的方法:降低由补体介导的炎症疾病或病患引起的炎症,以为人提供临床益处。
本发明可以包括人源化抗-备解素抗体及其片段的制备和使用的方法。本领域熟知制备人源化非人抗体的方法。通过取代啮齿动物CDR或人抗体的对应序列的CDR序列来基本上进行人源化。人可变结构域(轻和重)的选择用于制备人源化抗体在一些情况下可以对于降低抗原和/或人抗-小鼠抗体(HAMA)应答是重要的。本发明可以提供抗体,该抗体被人源化,使得HAMA应答降低或消除。任何抗体,无论嵌合,人源化或人抗体,可以结合备解素并抑制兔红细胞的AP-依赖性溶血。
通常,备解素可以和成熟人氨基酸序列具有下列范围的氨基酸序列一致性百分率:从至少约60%,至至少约70%,至至少约80%,至至少约85%,至至少约90%,至至少约95%,至至少约98%,至至少约99%。
抗体的可变结构域是指可变结构域的某些部分,其序列和抗体不同。本发明的抗体的变化可集中于位于轻链和重链可变结构域中的三个CDR段。可变结构域的高度保守部分称为框架(FR)区。在本发明的抗-备解素抗体中,存在四个FR区,它们有三个CDR连接,它们可包含可变链。各轻链和重链中的CDR通过FR区最接近地保持在一起,并且来自其他链的CDR可以有助于形成抗体的靶结合位点。
抗体人源化是这样的过程,其可以产生具有可变区(″V-区″)序列的工程化人抗体,所述可变区(″V-区″)序列基本上类似于实际人基因种系序列,同时保持参照抗体的结合特异性和亲和性,例如ATCC保藏号PTA-9019或ATCC保藏号PTA-10649。例如,该过程可以将重链和轻链序列的CDR1,CDR2和CDR3区移植到人源化人框架(其在开始该移植过程之前优化和之前鉴定)中。含有人源化框架的可变区可以产生Fab,Fab′或Fab2单链抗原-结合抗体片段。所得工程化人源化抗体片段可以保持亲本鼠源抗体对于抗原备解素的结合特异性,并且和亲本抗体相比可以对于特定抗原具有相等或更高的结合亲和性。相比于最接近的人基因种系抗体基因,工程化抗原结合片段可以具有高程度的氨基酸序列一致性的重链和轻链V-区。例如,在构建过程中,另外的成熟改变可以引入各链的CDR3区,以鉴定具有最佳结合动力学的抗体。
抗-备解素单克隆抗体或其抗原结合片段的嵌合和人源化变体可以联合其他分子(其具有药理效果,例如治疗剂)施用至个体。抗-备解素单克隆抗体联合至少一种治疗剂的施用可以通过同时或依次施用抗-备解素单克隆抗体和至少一种治疗剂来进行。
涉及本发明的实施方案的制剂或组合物
本发明可包括制剂或组合物,包含:交替补体途径的抑制剂和选择性抑制剂,包括但不限于在哺乳动物中抑制交替途径活化的鼠源,嵌合或人抗体。制剂包含:(a)本文所述的交替补体途径的抑制剂;和(b)药学上可接受的载体。在本发明的一个实施方案中,制剂或组合物可以包含一种或多种另外的试剂,例如适于在具有或处于发展炎症病患风险的哺乳动物中降低炎症的消炎剂。在本发明的另一实施方案中,制剂或组合物可以包含一种或多种另外的试剂,例如适于在哺乳动物中预防或降低局部缺血-再灌注损伤的另外的试剂。在本发明的又一实施方案中,制剂或组合物可以包含一种或多种另外的试剂,例如适于治疗和交替补体途径活化相关的另外疾病或病症的另外的试剂。
在另一实施方案中,抗体可以是双抗体,其中分子中的Fab源自两种不同的抗原,包括来自抗-备解素的一种和来自任何其他抗原的另一种。
抗-备解素剂可以联合药学上可接受的载体,包括但不限于药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的递送媒介物,其适用于将制剂或组合物施用至合适的体内位点。
一种类型的药学上可接受的载体可包括控制释放制剂,其能够缓慢地释放本发明的组合物至哺乳动物中。如本文使用的,控制释放制剂包含在控制释放媒介物中的本发明的药剂。合适的控制释放媒介物可以包括但不限于生物相容性聚合物,其他聚合物基质,胶囊,微囊,微粒,团块制剂,渗透泵,扩散装置,脂质体,脂质体球和透皮递送系统。其他合适的载体可包括任何载体,该载体可以结合或并入抗-备解素剂,该载体延长抗-备解素剂递送的半衰期。这种载体可包括当体内递送时延长蛋白的半衰期的任何合适的蛋白载体或融合片段。合适的递送媒介物可以包括但不限于脂质体,病毒载体或其他递送媒介物,包括核酶和含有天然脂质的递送媒介物例如细胞和细胞膜。
静脉内,腹膜内,肌内和肌肉内施用可以使用本领域标准的方法来进行。气溶胶递送可以使用本领域标准的方法来进行。递送气溶胶化制剂的装置可以包括但不限于加压计量的剂量吸入器(″MDI″),干粉吸入器(″DPI″)和计量的溶液装置(″MSI″),并且包括是雾化器和吸入器的装置。
本发明的抗体的剂量的另外类型、特别是抗体制剂通过雾化递送时包含下列范围的集合:约200ng/kg至约600μg/kg哺乳动物的体重,约200ng/kg至约500g kg,约200ng/kg至约400g kg,约200ng/kg至约300g kg,约200ng/kg至约200μg kg,约200ng/kg至约100μg kg,并且优选约200ng/kg至约50μg/kg哺乳动物的体重。
本发明的抗体可以在-SH基团或不干涉结合的任何其他位置处缀合合成或生物实体。本发明还可以覆盖这些缀合物。
疾病病症
在本发明的另一方面中,本发明的抗体可以用于在患有急性或慢性病理损伤的受试者(包括人)中通过体内交替途径抑制补体活化。本发明可以联合使用下列疾病、病患、损伤和治疗,包括但不限于:
体外循环疾病和病患:心肺分流术后炎症,手术后肺部障碍,心肺分流术,血液透析,白细胞清除术,血浆除去法,血小板除去法,肝素-引起的离体LDL沉降(HELP),灌注后综合征,体外膜式人工氧合法(ECMO),心肺分流术(CPB),灌注后综合征,系统炎症应答以及多种器官失效。
心血管疾病和病患:急性冠动脉综合征,Kawaski病(动脉炎),高安氏动脉炎,过敏性紫癜肾炎,血管渗漏综合征,经皮冠状动脉干预(PCI),心肌梗塞形成,急性心肌梗塞后缺血-再灌注损伤,动脉粥样硬化,血管炎,免疫复合体血管炎,和类风湿关节炎相关的血管炎(也称为恶性类风湿关节炎),系统性红斑狼疮-相关的血管炎,败血症,动脉炎,动脉瘤,心肌病,扩张性心肌病,心脏手术,外周血管病症,肾血管性病症,心血管病症,脑血管病症,肠系膜/肠道血管病症,糖尿病血管病,静脉性气栓(VGE),韦格内氏肉芽肿症,肝素-引起的体外膜式人工氧合法以及白塞氏综合征。
骨/肌与骨骼的疾病和病患:关节炎,炎性关节病,非-炎性关节病,类风湿关节炎,青年类风湿性关节炎,系统性青年类风湿性关节炎,骨关节炎,骨质疏松症,全身性红斑狼疮(SLE),白塞氏综合征以及斯耶格伦氏综合征。
移植疾病和病患:移植排斥,异种移植,移植物抗宿主病,器官或移植物的异种移植,器官或移植物的异体移植以及超急性排斥。
眼睛/眼部疾病和病患:湿和干年龄相关的黄斑变性(AMD),脉络膜新生血管(CNV),视网膜损伤,糖尿病视网膜病,糖尿病视网膜毛细管病,眼睛的网状内皮细胞真菌病,葡萄膜炎,糖尿病视网膜水肿,糖尿病视网膜病,糖尿病视多膜微动脉瘤,病理性近视,视网膜中央静脉阻塞(CRVO),角膜新生血管形成,视网膜新生血管形成,视网膜色素上皮细胞(RPE),眼睛的网状内皮细胞真菌病和普尔夏氏视网膜病。
血/血液疾病和病患:脓毒症,系统性炎症应答综合征(SIRS),失血性休克,急性呼吸窘迫综合征(ARDS),灾难性抗-磷脂综合征(CAPS),冷凝集素病(CAD),自身免疫性血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP),内毒血症,溶血性尿毒症(HUS),非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS),阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH),败血症,败血病性休克,镰状细胞血症,溶血性贫血,嗜酸性白细胞增多综合征和抗-磷脂综合征(APLS)。
呼吸/肺疾病和病患:哮喘,韦格内氏肉芽肿症,输血-相关的急性肺部损伤(TRALI),抗肾小球基底膜抗体(古德帕斯彻氏病),嗜酸细胞性肺炎,过敏性肺炎,过敏性支气管炎,支气管扩张,反应性气道病综合征,呼吸道合胞病毒(RSV)感染,副流感病毒感染,鼻病毒感染,腺病毒感染,变应性支气管肺曲菌病(ABPA),肺结核,肺寄生虫病,成人型呼吸窘迫综合征,慢性阻塞性肺病(COPD),类肉瘤病,气肿,支气管炎,囊性纤维变性,间质性肺炎,急性呼吸窘迫综合征(ARDS),输血-相关的急性肺部损伤,局部缺血/再灌注急性肺部损伤,棉屑沉着病,肝素-引起的体外膜式人工氧合法,过敏性休克和石棉-引起的炎症。
中枢和周围神经系统/神经疾病和病患:多发性硬化(MS),重症肌无力(MG),假麻痹性重症肌无力,多发性硬化,格-巴二氏综合征,Miller-Fisher综合征,中风,中风后再灌注,阿耳茨海默氏病,变集运动神经病(MMN),脱髓鞘,亨延顿氏舞蹈病,夏科氏综合征(ALS),帕金森氏病,视乳头变性疾病(DDD),脑膜炎,来自脑膜炎的脑神经损害,变异克雅氏病(vCJD),特发性多神经炎,脑/脑创伤(包括但不限于出血,炎症和水肿)和神经性疼痛。
创伤-引起的损伤和疾患:失血性休克,低血容量性休克,脊髓损伤,脑损伤,脑创伤,脑缺血再灌注,挫伤,伤愈,重度烧伤和冻伤。
肾部疾病和病患:肾再灌注损伤,链球菌感染后肾小球性肾炎(PSGN),古德帕斯彻氏病,膜性肾炎,贝格尔氏病/IgA肾病,膜增生性肾小球性肾炎,膜状肾小球性肾炎,膜增殖性肾小球性肾炎(肾小球膜毛细血管肾小球性肾炎),急性感染后肾小球性肾炎,冷球蛋白性肾小球性肾炎,狼疮肾炎,埃诺克-多恩莱因炎和肾皮质坏死(RCN)。
器官的再灌注损伤和疾患:包括但不限于心脏、脑部、肾脏和肝脏。
生殖和泌尿生殖疾病和病患:痛性膀胱疾病和病患,感官膀胱疾病和病患,自发流产,男性和女性不孕不育病,孕期疾病,胎儿母体耐性,子痫前期,泌尿生殖炎症,胎盘功能障碍的疾病和病患,流产慢性非细菌性膀胱炎和间质性膀胱炎的疾病和病患。
皮肤/皮疾病和病患:烧伤,牛皮癣,特应性皮炎(AD),嗜酸细胞性海绵层水肿,荨麻疹,热损伤,类天疱疮,后天性表皮松解大疤性皮肤棘层松解,自身免疫大疱性皮肤病,大疱性类天疱疮,硬皮病,血管性水肿,遗传性血管神经水肿(HAE),猫眼疮,妊娠疱疹,斯耶格伦氏综合征,皮肌炎以及疱疹样皮炎。
胃肠道疾病和病患:克罗恩氏病,腹腔疾病/谷朊-敏感性肠病,惠普耳氏病,肠缺血,炎症性肠病和溃疡性结肠炎。
内分泌疾病和病患:淋巴瘤性甲状腺肿,幼稚淋巴细胞性甲状腺炎,压力焦虑,和影响泌乳刺激素的其他疾病,生长或胰岛素-样生长因子,促肾上腺皮质激素释放,胰腺炎,艾迪生氏病,糖尿病包括但不限于1型和2型糖尿病,I型糖尿症,类肉瘤病,糖尿病视多膜毛细管病,非-肥胖糖尿病(IDDM),血管病,IDDM或2型糖尿病的神经病或视网膜病并发症以及胰岛素耐性。
恶性肿瘤的治疗:源自化疗和放射疗法的疾病和病患。
实施例
根据制定的工序来培养小鼠杂交瘤细胞。收集细胞,并且通过本领域技术人员已知的标准工序将信使RNA(″mRNA″)从细胞小球中分离。根据本领域技术人员已知的标准方法通过使用oligoDT引物进行引物延伸,从纯化的mRNA产生第一链互补DNA(″cDNA″)。根据标准的工序使用简并引物,将cDNA用作模版以用于抗体V-区序列的扩增。使用BioAtla拥有的小鼠特异性kappa引物组从cDNA扩增Kappa轻链可变结构域。正向引物被设计联合kappa特异性反向引物来扩增小鼠轻链可变结构域。七种不同的引物组合(mK2,mK3,mK7,mK8,mK9,mk10,mK11)导致预期尺寸的PCR产物。将PCR产物凝胶纯化,TOPO-TA克隆和测序。序列分析揭示引物组合mK2,mK3,mK7,mK8,mK9和mK11扩增相同的轻链序列(基于引物模糊性仅有微小的变化)。这些克隆在CDR3/框架4区中具有终止密码子,从而产生非生产性V-J重排。该序列通常发现于使用源自初始MOPC-21瘤的融合配体制备的杂交瘤。该转录体的量可以超过生产性轻链mRNA的量。源自引物组合mk10的克隆的序列分析表明单一轻链扩增。为了验证获得的序列的N-端,使用退火至分泌信号的正向引物和对于克隆mK10中CDR3具有特异性的反向引物进行另外的PCR反应。使用第二引物组获得完全相同的DNA序列。使用BioAtla拥有的小鼠特异性重链引物组从cDNA扩增重链可变结构域。正向引物被设计联合IgGl/2特异性反向引物来扩增小鼠重链可变结构域。五种不同的引物组合(mH1,mH2,mH4,mH5和mH6)导致预期尺寸的PCR产物。将PCR产物凝胶纯化,TOPO-TA克隆和测序。序列分析揭示引物mH2仅仅扩增非-抗体特异性小鼠转录体。
引物组合mH4和mH5扩增相同的转录体。其是非生产性重排的重链,这描述于文献例如Genbank entry FJ147352中。引物组合mH1和mH6导致具有轻微氨基酸变化的三种克隆。框架1(7至9的aa位置)中的三种氨基酸差别由于引物序列。64位的氨基酸改变可能由PCR错误引起。进行针对小鼠基因组的BLAST检索,以鉴别对应的基因种系V区基因。小鼠基因种系基因IgHl-4鉴别为最接近的匹配(89%一致性)。使用对于基因种系基因IgHl-4的N-端具有特异性的正向引物和对于在前面步骤中鉴别的CDR3具有特异性的反向引物进行另外的PCR反应。所得PCR产物是TOPO-TA克隆,并且将10种克隆测序。所有克隆具有完全相同的序列。
重链和轻链可变结构域克隆到哺乳动物表达体系中。之前鉴别的可变结构域(轻链克隆mK10,重链克隆mH6-3g)克隆到BioAtla拥有的哺乳动物表达体系中。轻链可变结构域框内融合人kappa恒定区;重链可变结构域框内融合人IgGl恒定区。两种基因前面加上引导肽以使全长IgGl抗体分泌到基质中。五种克隆被测序以证实LC和HC阅读框的完整性和序列转移到表达载体中。所有克隆含有正确的序列(数据未显示)。选择一种克隆用于表达试验:克隆BAP010_1。制备克隆BAP010_1的甘油储液,并且制备不含内毒素的质粒DNA以在CHO细胞中进行表达试验。重组BAP010_1进行表达和功能表征。
克隆BAP010_1转移到CHO-S细胞中,并且在转染后48小时,72小时,96小时和120小时收集细胞培养物上清。只有并行载体转染到CHO-S细胞中。将阴性对照按照和克隆BAP010_1相同的方式处理,并且在相同的时间点收集上清。
定量ELISA:使用方法中描述的ELISA测定来确定细胞培养物上清中IgG的量。在嵌合抗体中证实功能活性时引发BAP010_001的人源化。用于来自克隆BAP010_1的轻链和重链CDR序列编码的双链DNA片段联合BioAtla拥有的人框架池。然后全长可变结构域克隆到BioAtla的哺乳动物表达载体中。分析48种轻链和48种重链序列以证实CDR和框架片段的正确装配和文库的多样性(数据未示出)。
将克隆集合并冷冻以用作后面使用的甘油储液。将人源化文库的等分部分接种,并且单一菌落转移至96孔板。各板还含有具有阳性对照(BAP010_1)和阴性对照(只有载体)的三个孔。使培养物生长过夜,并且制备质粒DNA用于转染。将CHO细胞种于96孔板中,并且使用人源化克隆的小量制备DNA来转染。在转染后48小时收集细胞培养物上清,并且使用用于人IgG的定量的BioAtla的ELISA方案来测定IgG浓度。使用NovelMed提供的抗原和方案来平行测试人源化克隆与抗原NM9401的结合。
计算各克隆的特定活性(亲和性/量),并且和相同板上的阳性对照(BAP010_1)的平均特定活性进行比较。然后,滤出具有低表达水平(低于BAP010_1)的克隆以用于选择初始打击。低表达水平人工放大特定活性,并且当选择打击时需要避免。选择来自各板的顶级打击以用于证实。
纯化:使用蛋白G柱从400ml无血清细胞培养物上清中纯化抗体。基于ELISA数据,集合部分4-6(峰1,1.5ml)和部分3,7-18(峰2,6.5ml)。使用Milipore旋转柱(MWCO 50,000Da)浓缩各集合部分的一半。
人源化构建体的初级筛选:将人源化文库的等分部分接种,并且将单一菌落转移至96孔板。各板还含有具有阳性对照(BAP010_1)和阴性对照(只有载体)的三个孔。使培养物生长过夜,并且制备质粒DNA用于转染。将CHO细胞种于96孔板中,并且使用人源化克隆的小量制备DNA来转染。
计算各克隆的特定活性(亲和性/量),并且和相同板上的阳性对照(BAP010_1)的平均特定活性进行比较。然后,滤出具有低表达水平(低于BAP010_1)的克隆以用于选择初始打击。低表达水平人工放大特定活性,并且当选择打击时需要避免。选择来自各板的顶级打击以用于证实。
实施例1
抗-备解素IgG and F(ab′)2高亲和性地结合人备解素
抗-备解素IgG和F(ab)2与人备解素的亲和性在低pM范围。抗体及其片段以类似的亲和性结合备解素。
将聚苯乙烯微量滴定板包覆磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中的人备解素在4℃下过夜。在吸气备解素溶液后,所述孔使用含有牛血清清蛋白(BSA)的PBS在室温下阻断1小时。没有备解素包覆的孔作为背景对照。将单克隆抗-备解素抗体IgG,F(ab′)2和Fab的等分部分加入备解素包覆的孔中,并且使孵育1小时以允许抗体及其片段的结合。在室温下孵育1小时后,将板使用PBS洗涤五次,并且和1∶2000稀释的检测过氧化物酶-缀合的山羊抗-小鼠单克隆抗体孵育。在该孵育后,将板冲洗,并且使用TMB试剂来鉴定结合的过氧化物酶。如图2中所示,NM9401-IgG,NM9401-F(ab′)2和NM9401-Fab高亲和性地结合备解素。
实施例2
抗-备解素IgG,F(ab′)2和Fab抑制交替途径(AP)依赖性兔血红细胞(rRBC)胞溶
该红细胞胞溶测定基于rRBC表面上末端补体络合物的形成。由于形成该络合物,rRBC胞溶。在700nm处光散射的进展性降低是红细胞胞溶的直接量度。rRBC在含有5mM MgCl2的明胶佛罗拿缓冲液(AP缓冲液)中、在正常人血清中孵育。在这些条件下,rRBC的表面在正常人血清中引发交替途径的活化。交替途径活化导致在rRBC的表面上形成C5b-9络合物。期望抑制C5b-9络合物形成的药剂抑制细胞胞溶。为了评价抗-备解素抗体及其片段的效果,各种浓度的IgG,F(ab′)2和Fab和正常人血清(10%NHS)在AP缓冲液中在37℃下和固定浓度的兔红细胞孵育。使用能够在700nm处读取的温度控制的ELISA板读数器评价rRBC胞溶。在700nm处测量的光散射的进展性降低(由于完整细胞的胞溶)是时间的函数。记录数据,并且使用SpectraMax 190板读数器和SoftMax软件分析。为了评价,在各浓度的IgG,F(ab′)2和Fab处计算总抑制,并且结果表示为未胞溶对照的百分比。各浓度处的数据使用MicroCal Origin软件在S形图中绘制。如图3中所示,IgG和IgG片段在正常人血清中抑制rRBC的AP依赖性溶血,IC50为约5.8和17.2nM。
实施例3
抗-备解素单克隆抗体不抑制经典途径活化
本发明的单克隆抗体不抑制宿主防御所需要的经典途径。抗体增敏的绵羊红细胞和1%或10%正常人血清在含有钙(5mM CaCl2/MgCl2)缓冲液的明胶佛罗拿缓冲液(CP缓冲液)中孵育。抗体增敏的绵羊细胞活化经典途径。结果,C5b-9形成在红细胞表面上并引起细胞胞溶。我们检测1%和10%正常人血清。在两种条件下,NM9401抑制红细胞胞溶。在典型测定中,红细胞在CP缓冲液中的1/10正常人血清中孵育以允许发生补体活化。由于CP活化,C5b-9形成在红细胞表面上,从而引起细胞胞溶。在700nm处测量的光散射的进展性降低(由于细胞胞溶)是时间的函数。如图4中所示,在两种血清浓度下NM9401IgG不抑制抗体增敏的绵羊细胞的胞溶。没有血清对照显示可忽略的效果。这些结果表明抗-备解素抗体能够选择性抑制交替补体途径而不影响经典途径活化。
实施例4
本发明的抗-备解素抗体抑制备解素结合C3b
备解素高亲和性地结合C3b。本发明的抗-备解素抗体,在含有固定浓度的备解素(50nM)的溶液中具有各种浓度,在已经包覆C3b的孔中孵育。建立该实验以评价是否抗-备解素抗体将抑制备解素结合C3b。如图5中所示,对于Fab2在29nM下NM9401抑制备解素结合C3b,对于Fab在72nM下抑制备解素结合C3b,从而表明抗体和备解素的摩尔比在0.5至约1.2的范围内。
实施例5
结合相同抗原表位的抗体竞争和抗原表位的结合
使聚苯乙烯微量滴定孔板包覆备解素。将孔和50nM浓度的抗-备解素生物素酰化的完整抗体孵育以产生饱和曲线。将固定浓度的生物素酰化的抗体和改变浓度的未标记的指定为ATCC号(PT A-10649)的抗体孵育。使用HRPO-neutavidin缀合物通过检测生物素酰化的抗体来产生抑制曲线。这些研究表明,结合备解素上的特定抗原表位的抗体不竞争备解素上的相同结合位点。数据示于图6。
实施例6
抗-备解素IgG,Fab′2和Fab抑制C3b的形成和沉积
由于交替补体途径的C3转化酶切除C3,AP活化产生C3a和C3b。在这样的条件下交替补体途径在正常人血清中被来自Salmonella Typhosa的脂多糖活化,该条件允许交替补体途径的活化。我们利用该测定来证实是否本发明的抗-备解素抗体将抑制C3b的形成和沉积。C3b的沉积引发交替补体途径的开始。作为机理,活化和沉积的C3b提供结合备解素的高亲和性。备解素-C3b络合物结合因子B,并且络合物被因子D切除以产生PC3bBb,交替途径C3转化酶。随着交替途径进行,C5b-9络合物形成和沉积。如图7,8和9中所示,抑制C3b的形成和沉积。因为抑制C3b的形成和沉积,所以也抑制其他组分例如备解素、因子Bb和C5b-9的沉积。
在典型测定中,聚苯乙烯微量滴定板孔以2μg/50μl在PBS中包覆LPS(来自Salmonella Typhosa的脂多糖)过夜。将孔和PBS中的BSA孵育以阻断孔中的未占据的位点。在室温下进行2小时阻断并且使用PBS冲洗后,AP缓冲液中的正常人血清(10%)混合各种浓度的抗-备解素抗体和衍生的片段。将混合物孵育到LPS包覆的孔上去。使板在37℃下孵育2小时以允许发生补体AP活化。在孵育后,将板使用PBS彻底洗涤,并且使用合适抗体来检测C3转化酶组分。我们使用在阻断溶液中1∶2000的兔抗-人C3c检测C3b,使用山羊抗-人P检测备解素,使用在阻断溶液中1∶500的山羊抗-人因子Bb检测Bb,以及使用在阻断溶液中1∶2000的HRPO缀合的抗-人C5b-9检测C5b-9。板和它们各自抗体一起在室温下孵育1小时。在孵育后,将板使用PBS冲洗,并且使用在阻断溶液中1∶2000(对于C3b)过氧化物酶标记的山羊抗-兔和1∶2000(对于P检测)过氧化物酶标记的兔抗-山羊检测结合的抗体。将所有板使用TMB显色,之后使用PBS彻底洗涤。使用1M亚磷酸淬灭蓝色。C3b,P和Bb以及MAC一起存在指示AP C3转化酶形成。本发明的抗体显示抑制C3b形成并因此抑制沉积(图7),PC3b沉积(图8)和PC3bBb沉积(图9)。该数据提供下列的直接证据:抗-备解素单克隆抗体预防C3转化酶形成,并因此预防AP活化。
实施例7
NM9405在猪全血管道回路模型中抑制血小板功能异常
当血小板活化时发生血小板功能的损失。活化的血小板往往和白细胞聚集,并且从血液循环中除去,从而引起血小板减少。血小板功能异常源自血小板活化。封闭时间的测量良好地指示血小板功能。封闭时间定义为使血小板聚集并且阻断膜中的孔的时间。将全血(0.8ml)转移到试验柱的储库中。将血液加热至37℃,并且在真空下通过200μm不锈钢毛细管和包覆胶原蛋白的硝基纤维素膜中150μm的孔。在血液移动通过毛细管时,其接触胶原蛋白包覆的膜。胶原蛋白引起形成血小板阻塞,这阻断血流通过孔。闭塞孔的时间记录为封闭时间。在该过程中,血小板初始粘附膜中的胶原蛋白覆层,从而导致聚集。延长的封闭时间指示血小板功能异常。沿着离体血液循环的管道回路模型,评价猪血的AP活性(未示出)和血小板功能。将全猪血的等分部分(0.8ml)转移自Dade Behring的一次性试验柱的储库中。将血液加热至37℃,并且在真空下通过200μm不锈钢毛细管和包覆胶原蛋白的硝基纤维素膜中150μm的孔。记录各样品的封闭时间并绘图。因为实验需要大量的血液,因此仅测试少量回路。如图10中所示,旋转的样品展示在2h循环期间中封闭时间增加3倍。NM9401-F(ab′)2-处理的血样显示抑制血小板功能异常。
实施例8
NM9401-F(ab′)2在经历心肺分流术的猪中抑制AP活化
尽管NM9401-F(ab′)2抑制AP活化,全血中的细胞活化,TNF-α和弹性蛋白酶以及血小板功能异常,但是确定是否这样的研究将体内适用于经历心肺分流术的猪。在IACUC批准的方案下进行该猪研究。在该非存活性开胸CPB研究中,使两只雌性猪(30Kg重量)进行开胸CPB,其中一只处理并且一只作为对照。在手术步骤之前将两只动物镇静和插管。两只动物都接受和标准CPB手术步骤一致的临床剂量的肝素。在整个试验中监控生命指标例如温度,pCO2,pO2,pH,血钙和EKG,以确保猪是稳定的。根据需要给猪施用白蛋白。也监控提间、血压和心率以及脉搏速率。使用400ml容量的CPB回路以及plasmalyte用于引发回路。在手术和分支的过程中,在手术前、劈开胸骨术后、以及分支术的过程中在各时间点收集血样(3.0mis):0,15,30,75,90,105,120,135,150和165分钟。一只猪接受NM9401-F(ab′),另一只猪接受媒介物(盐水)。以3mg/Kg体重i.v.施用快速灌注剂量的NM9401-F(ab′),并且评价对于AP活化,备解素水平,血小板功能异常和血液损失的作用。以规则时间间隔测量血浆样品中的AP补体活性。我们利用红细胞胞溶测定来测量C5b-9。
NM9401-F(ab′)处理的猪显示在整个CPB过程中抑制交替途径活化。NM9401-F(ab′)在经历分支术的猪中中和备解素-备解素结合C3b和C5,并且通过转化酶装配来引发AP活化。NM9401-F(ab′)2在其活性位点结合备解素并阻断其功能。结果,AP活化不会发生。如图11中所示,NM9401-F(ab′)2抑制AP活化,这通过总备解素保留在血清中来测量。血小板功能异常是流血并发症的主要标志之一。在CPB过程中,血小板活化,活化的血小板聚集,白细胞-血小板聚集物从血液循环中除去,从而引起血小板减少。血小板表示C3a受体,当被补体活化过程中产生的C3a占据时,使血小板变得功能异常。功能异常的血小板显示封闭时间增加,因为它们失去对应于胶原蛋白凝结的能力。因此,血小板功能异常由PFA-100测量。盐水处理的猪证实封闭时间远多于NM9401-F(ab′)2处理的猪。这些数据和我们上面列出的数据一致,其中NM9401-F(ab′)2在经历离体血液循环的分离血液中防止血小板功能异常。通过在CPB过程中在抽吸体系储库中收集的全部体积的血液测量的血液损失在NM9401-F(ab′)2处理的猪中明显地降低。这些数据表明,NM9401-F(ab′)2对于降低CPB并发症是重要的。血液损失降低是有意义的发现,因为其具有临床意义和临床环境中每位患者的手术成本的意义。在经历分支术的患者中记录过多的血液损失。我们测量在经历CPB的猪中总血液损失。和未处理的对照相比,使用NM9401-F(ab′)2处理的猪证实血液损失总共降低67%。还防止血小板功能异常,如图12中所示。
实施例9
NM9405在兔中抑制心肌局部缺血再灌注损伤
该研究评价快速灌注剂量的NM9401-F(ab′)2在十二只兔中的效果,其中六只处理并且六只作为对照。该研究使用30分钟的局部缺血、之后进行2小时的再灌注。如图13中所示,处理组表示和对照组(左组)相比,在六只动物(右组)中梗塞尺寸减小。使用产生梗塞的工序和四唑染色的方法和工序。这些初始数据显示NM9401-F(ab′)2处理的动物具有比对照动物小的梗塞。从对照内曲的心脏和NM9401-F(ab′)2处理的心脏制作着色的两组图。在加工后心脏部分切片,并且使用四唑(TTC)染色。在实验中,在再灌注结束时,冠状动脉再次闭塞,并且将荧光聚合物微球注入灌注液中以将局部缺血区(危险区域)划分为没有荧光的组织区域。将心脏称重,冷冻,并且切成2mm厚切片。将切片和1%TTC(四唑染色)在PBS中在37℃下孵育10-12分钟。TTC使非梗塞的心肌层染色为砖红色。然后使切片在10%福尔马林中固定以保存染色的(存活)和未染色的(坏死)组织。通过使用UV光照射切片来鉴定危险区域。通过各切片的测面法来确定梗塞和危险区域的面积,并且通过使各心脏的各面积乘以切片厚度、然后使它们求和来计算体积。
实施例10
NM9401-F(ab)2在兔中抑制脉络膜新生血管
脉络膜新生血管(CNV)可以在兔眼中通过激光来引起。该模型以多种方式模拟湿AMD模型。12只健康兔(平均体重,约2.5-4.0kg)用于该研究。根据Care and Use of Laboratory Animals of the National Research Council(National Academy Press,1996修订)的指南,所有动物接受人文关怀。使用盐酸氯胺酮(24mg/kg)和盐酸赛拉嗪(6mg/kg)的混合物(4∶1)麻醉兔。使用1%托品酰胺和2.5%盐酸苯肾上腺素滴眼液放大瞳孔。通过使用手持盖片作为隐形眼镜,Krypton红色激光器光凝固术(50-μm斑点尺寸,0.05-s持续时间,250mW)用于在围绕视神经的各眼中产生多种激光斑点。在激光斑点处形成的气泡指示Bruch膜的破裂。在激光处理后,使用共聚焦显微镜术来评价激光斑点用于在28天存在CNV。在麻醉和瞳孔放大后,使用28-口径注射针通过角膜缘进入前房,以使眼睛减压。在运行显微镜下,其允许视网膜的可视化,32-口径(无峰)注射针通过巩膜切开部(仅在角膜缘后面),进入玻璃体房或视网膜下空间。Hamilton注射器用于注射NM9401-F(ab′)2。在安乐死时,使用过剂量的氯胺酮/赛拉嗪混合物(4∶1)来麻醉兔,并且使用含有50mg/ml荧光素-标记的右旋糖酐(FITC-右旋糖酐,2百万平均分子量,Sigma)的1ml PBS灌注通过心脏。将眼睛除去,并且在10%磷酸盐缓冲的福尔马林中固定1h。将角膜和水晶体除去,并且从眼窝中仔细地切割感觉神经的视网膜。从眼窝边缘至中纬线制备5个径向切片;使巩膜-脉络膜-视网膜色素上皮组织(RPE)络合物平坦支架,其中巩膜朝下,在aquamount中的载玻片上。将平坦支架染色,并且使用共聚焦显微镜(Zeiss LSM510)检查。CNV染为绿色而Bruch膜中的弹性蛋白染为红色。具有绿色血管的激光斑点记录为CNV-阳性,缺少绿色血管的激光斑点记录为CNV-阴性。在激光处理后28天,使所有动物灌注含有50mg/ml荧光素-标记的右旋糖酐(FITC-右旋糖酐;平均分子质量,2x106;Sigma-Aldrich)的1ml的PBS,并处死。收集眼睛,并且在10%磷酸盐缓冲的福尔马林中固定,并且如上所示制备视网膜色素上皮组织(RPE)-脉络膜-巩膜瓣支架。激光斑点中的绿色是CNV络合物。如果发现CNV<3%的总激光斑点面积,则其评级为阴性,而CNV>3%认为是阳性。如图14中所示,在28天的时间内快速灌注预防剂量的NM9401降低兔中的CNV。
实施例11
NM9401-Fab2在使用单预防剂量处理的兔中抑制类风湿性关节炎中的关节损害
使用文献中已知的公开的方法在兔中诱导关节炎。通过关节内、静脉内、腹膜内或皮下工序来给予动物快速灌注剂量。在28天处死动物。使四肢经历放射照相、CT扫描和组织评价。在200μg/膝关节下NM9401-Fab2处理的动物防止关节损伤。如图15中所示,这些数据显示NM9401-Fab2提供组织、软骨和骨骼避免关节损伤。
实施例12
鼠源单克隆抗体的测序
将杂交瘤筛选NM9401-IgGl小球化,并且将总RNA分离。oligo dT引物和逆转录酶合成cDNA。使用一组小鼠特异性kappa引物从cDNA扩增Kappa轻链可变结构域。正向引物被设计联合kappa特异性反向引物来扩增小鼠轻链可变结构域。七种不同的引物组合(mK2,mK3,mK7,mK8,mK9,mk10,mK11)导致预期尺寸的PCR产物。将PCR产物凝胶纯化,TOPO-TA克隆和测序(各4个克隆)。序列分析揭示引物组合mK2,mK3,mK7,mK8,mK9和mK11扩增相同的轻链序列(基于引物模糊性仅有微小的变化)。这些克隆在CDR3/框架4区中具有终止密码子,从而产生非生产性V-J重排。源自引物组合mk10的克隆的序列分析表明单一轻链扩增。为了验证获得的序列的N-端,使用退火至分泌信号的正向引物和对于克隆mK10中CDR3具有特异性的反向引物进行另外的PCR反应。使用第二引物组获得完全相同的DNA序列。还使用特定组的小鼠特异性重链引物以类似的方式从cDNA扩增重链可变结构域。正向引物被设计联合IgGl/2特异性反向引物来扩增小鼠重链可变结构域。五种不同的引物组合(mH1,mH2,mH4,mH5和mH6)导致预期尺寸的PCR产物。将PCR产物凝胶纯化,TOPO-TA克隆和测序(各4个克隆)。序列分析揭示引物mH2仅仅扩增非-抗体特异性小鼠转录体。引物组合mH4和mH5扩增相同的转录体。
引物组合mH1和mH6导致具有轻微氨基酸变化的三种克隆。框架1(7至9的aa位置)中的三种氨基酸差别由于引物序列。64位的氨基酸改变可能由PCR错误引起。进行针对小鼠基因组的BLAST检索,以鉴别对应的基因种系V区基因。小鼠基因种系基因IgHl-4鉴别为最接近的匹配(89%一致性)。使用对于基因种系基因IgHl-4的N-端具有特异性的正向引物和对于在前面步骤中鉴别的CDR3具有特异性的反向引物进行另外的PCR反应。所得PCR产物是TOPO-TA克隆,并且将10种克隆测序。所有克隆具有完全相同的序列。CDR-H1,CDR-H2和CDR-H3是抗体的可变区内的三种CDR序列。重链序列示于图16,24,25和26。相应地,轻链序列示于图17,21,22和23。抗原表位映射序列示于图29。
实施例13
测试纯化的重组抗体BAP0101与抗原备解素的结合
计算的Kd值和初始小鼠抗体的Kd具有良好的相关性。也在溶血测定中测试重组抗体。在该测定中,不能检测到活性。从400ml无血清细胞培养物上清中纯化嵌合抗体。将细胞培养物上清上柱到蛋白G住(在10mMNa2HPO4/Na H2PO4,pH 7.0中平衡)上。将柱使用20CV的结合缓冲液来洗涤。使用不连续梯度(洗脱缓冲液:12.5mM柠檬酸,pH 2.7)来洗脱结合的蛋白。收集0.5ml馏分并且立即中和(50ul,0.5M Na2HPO4/NaH2PO4,pH 8.0)。使用标准ELISA方案测定来自蛋白G柱的各个馏分中的重组IgG的量,其中抗-人IgG缀合HR作为第二抗体和纯化的人IgG。
嵌合抗-备解素单克隆抗体和NM9401-IgG的结合亲和性如所预期的那样显示为相当的。这示于图18。
通过鼠源和嵌合抗-备解素单克隆抗体抑制备解素结合C3b显示为相当的,这由图19指示。
此外,使用兔红细胞作为用于MAC胞溶的靶细胞在红细胞胞溶测定中评价两种单克隆抗体。NM9401-IgG和嵌合单克隆BAP010_1都显示为相当的,抑制的IC50值为约20-30nM,这由图20所示。
实施例14
人源化抗-备解素单克隆抗体的结合和功能活性
将来自16个鉴定的克隆中的每个的上清浓缩,定量,和在备解素ELISA中评价,以确定结合常数,如图40中所示。13pM至57pM的结合亲和性和嵌合金标准BAP010_1的54pM的亲和性进行比较。各种克隆的亲和性显示高于初始金标准Kd=255pM。在给定浓度下评价各克隆的功能活性。如图41中所示,所有克隆以变化的效果来抑制交替途径活化。基于结合亲和性和AP活化选择三种克隆。选择这些三种克隆以用于进一步表征。如下面所示:
SEQ ID NO 19>BAP010hum02_LC
SEQ ID NO 36>BAP010hum02_HC
SEQ ID NO 20>BAP010hum03_LC
SEQ ID NO 37>BAP010hum03_HC
SEQ ID NO 27>BAP010huml0_LC
SEQ ID NO 44>BAP010huml0_HC
图27示出三种选择的人源化单克隆抗体的结合亲和性。而且,图28示出红细胞胞溶测定的结果,其证实所有三种能够在正常人血清中抑制交替途径活化。
从本发明的上述描述,本领域技术人员将意识到改善、改变和修改。本领域内的这些改善、改变和修改旨在被所附权利要求书覆盖。本申请中引用的所有引用文献、公开文献和专利通过引用的方式全部并入本文。
Claims (38)
1.分离的抗-备解素抗体或其抗原结合部分,包含:重链可变结构域,包括SEQ ID NO:1中的三种CDR;和轻链可变结构域,包括SEQ ID NO:9中的三种CDR。
2.权利要求1所述的抗-备解素抗体或其抗原结合部分,包含重链,选自:SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:45,SEQ IDNO:46,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50。
3.权利要求1所述的抗-备解素抗体或其抗原结合部分,包含轻链,选自:SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ IDNO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33。
4.分离的抗-备解素抗体或其抗原结合部分,包含选自下列的至少一种CDR:
CDR-H1,包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;
CDR-H2,包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列;
CDR-H3,包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列;
CDR-L1,包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列;
CDR-L2,包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列;以及
CDR-L3,包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
5.权利要求4所述的分离的抗-备解素抗体或其抗原结合部分,其中所述抗-备解素抗体或其抗原结合片段包含:SEQ ID NO:14的CDR-L1区多肽和SEQ ID NO:6的CDR-H1区多肽。
6.权利要求4所述的抗-备解素抗体或其抗原结合部分,其中所述抗-备解素抗体或其抗原结合片段包含:SEQ ID NO:15的CDR-L2区多肽和SEQ ID NO:7的CDR-H2-区多肽。
7.权利要求4所述的抗-备解素抗体或其抗原结合部分,其中所述抗-备解素抗体或其抗原结合片段包含:SEQ ID NO:16的CDR-L3区多肽和SEQ ID NO:8的CDR-H3区多肽。
8.权利要求4所述的抗-备解素抗体或其抗原结合部分,其中所述轻链CDR-L1包含SEQ ID NO:14,所述轻链CDR-L2包含SEQ ID NO:15;以及所述轻链CDR-L3包含SEQ ID NO:16。
9.权利要求4所述的抗-备解素抗体或其抗原结合部分,其中所述重链CDR-H1包含SEQ ID NO:6;所述重链CDR-H2包含SEQ ID NO:7,以及所述重链CDR-H3包含SEQ ID NO:8。
10.权利要求4所述的抗-备解素抗体或其抗原结合部分,其中所述轻链CDR-L2包含SEQ ID NO:14,其中所述轻链CDR-L2包含SEQ ID NO:15;其中所述轻链CDR-L3包含SEQ ID NO:16;所述重链CDR-H1包含SEQ ID NO:6;所述重链CDR-H2包含SEQ ID NO:7;以及所述重链CDR-H3包含SEQ ID NO:8。
11.权利要求4所述的抗-备解素抗体或其抗原结合部分,其中至少两种CDR选自:
CDR-H1,包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;
CDR-H2,包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列;
CDR-H3,包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列;
CDR-L1,包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列;
CDR-L2,包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列;以及
CDR-L3,包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
12.权利要求4所述的抗-备解素抗体或其抗原结合部分,其中至少三种CDR选自:
CDR-H1,包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;
CDR-H2,包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列;
CDR-H3,包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列;
CDR-L1,包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列;
CDR-L2,包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列;以及
CDR-L3,包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
13.权利要求4所述的抗-备解素抗体或其抗原结合部分,其中至少四种CDR选自:
CDR-H1,包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;
CDR-H2,包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列;
CDR-H3,包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列;
CDR-L1,包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列;
CDR-L2,包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列;以及
CDR-L3,包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
14.权利要求4所述的抗-备解素抗体或其抗原结合部分,其中至少五种CDR选自:
CDR-H1,包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列;
CDR-H2,包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列;
CDR-H3,包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列;
CDR-L1,包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列;
CDR-L2,包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列;以及
CDR-L3,包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
15.权利要求4所述的抗-备解素抗体或其抗原结合部分,其中所述抗-备解素抗体或其抗原结合部分包含和SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90%序列一致性的重链可变结构域。
16.权利要求4所述的抗-备解素抗体或其抗原结合部分,其中所述抗-备解素抗体或其抗原结合部分包含和SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少90%序列一致性的轻链可变结构域。
17.权利要求4所述的抗-备解素抗体或其抗原结合部分,其中所述抗-备解素抗体包含和选自SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90%序列一致性的重链可变结构域、以及和选自SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少90%序列一致性的轻链可变结构域。
18.权利要求4所述的抗-备解素抗体或其抗原结合部分,进一步包含重链可变结构域,选自:SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQ IDNO:41,SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:46SEQ ID NO:47SEQ ID NO:48SEQ ID NO:49和SEQ IDNO:50。
19.权利要求4所述的抗-备解素抗体或其抗原结合部分,进一步包含:轻链可变结构域,选自:SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ IDNO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33。
20.分离的多肽,包含氨基酸序列,选自:SEQ ID NO 34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQID NO:40,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:46SEQ ID NO:47SEQ ID NO:48SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50。
21.抗-备解素抗体,包含权利要求20所述的多肽。
22.分离的多肽,包含氨基酸序列,选自:SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32和SEQ IDNO:33。
23.抗-备解素抗体,包含权利要求22所述的多肽。
24.一种在哺乳动物中抑制交替补体途径活化的方法,所述方法包括下列步骤:向人或其他哺乳动物施用权利要求1所述的分离的抗-备解素抗体或其抗原结合部分,所述抗体或其抗原结合部分特异性地结合备解素并抑制交替补体途径活化。
25.权利要求24所述的方法,其中该方法进一步包括下列步骤:治疗其中所述交替补体途径活化发挥作用的疾病或病患,包括向具有所述疾病或病患或者处于发展所述疾病或病患风险的个体施用嵌合或人源化抗-备解素抗体或其抗原结合片段。
26.权利要求25所述的方法,其中该方法进一步包括下列步骤:治疗选自炎症疾病和炎症病患的疾病或病患。
27.权利要求26所述的方法,其中该方法进一步包括下列步骤:治疗选自自身免疫疾病和自身免疫病患的疾病或病患。
28.权利要求27所述的方法,其中该方法进一步包括下列步骤:治疗选自下列的自身免疫疾病活自身免疫病患:系统性红斑狼疮,重症肌无力,关节炎病症,阿耳茨海默氏病和多发性硬化。
29.权利要求24所述的方法,其中该方法进一步包括下列步骤:治疗关节炎病症。
30.权利要求29所述的方法,其中该方法进一步包括下列步骤:治疗选自下列的关节炎病症:类风湿性关节炎,骨关节炎和青年类风湿性关节炎。
31.权利要求24所述的方法,其中该方法进一步包括下列步骤:治疗选自眼部疾病和眼部病患的补体相关的疾病或病患。
32.权利要求24所述的方法,其中该方法进一步包括下列步骤:治疗选自下列的眼部疾病或眼部病患:糖尿病视网膜病,眼睛胞浆菌病,年龄相关的黄斑变性,糖尿病视网膜病,脉络膜新生血管(CNV),葡萄膜炎,糖尿病视网膜水肿,病理性近视,希-林二氏病,眼睛胞浆菌病,视网膜中央静脉阻塞(CRVO),角膜新生血管形成和视网膜新生血管形成。
33.权利要求32所述的方法,其中该方法进一步包括下列步骤:治疗选自下列的年龄相关的黄斑变性:中间干性AMD和地图状委缩。
34.权利要求24所述的方法,其中该方法进一步包括下列步骤:治疗选自哮喘病或气道炎症病患的补体相关的病患。
35.权利要求34所述的方法,其中该方法进一步包括下列步骤:治疗选自下列的气道炎症病患:哮喘,慢性阻塞性肺病(″COPD″),过敏性支气管肺曲菌病,过敏性肺炎,嗜酸细胞性肺炎,气肿,支气管炎,过敏性支气管炎支气管扩张,囊肿性纤维化,肺结核,过敏性肺炎,职业性哮喘,类肉瘤,反应性气道病综合征,间质性肺炎,高嗜酸细胞综合征,鼻炎,鼻窦炎,运动引起的哮喘,污染引起的哮喘,感冒变体哮喘,肺寄生虫病,呼吸道合胞病毒(″RSV″)感染,副流感病毒(″PIV″)感染,鼻病毒(″RV″)感染和腺病毒感染。
36.一种在具有或处于发展这样的病症或疾病的风险的哺乳动物中抑制交替途径活化的方法,在所述病症或疾病中交替途径有助于疾病病理学或加重至少一种症状以引起所述病症或疾病,该方法包括向需要的个体施用权利要求1所述的抗-备解素抗体或其抗原结合部分。
37.权利要求36所述的方法,其中该方法进一步包括下列步骤:施用的嵌合或人源化抗-备解素抗体或其抗原结合片段聚乙二醇化和/或偶合合成化学实体。
38.药物组合物,包含:有效量的权利要求1所述的嵌合或人源化抗-备解素抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US31246910P | 2010-03-10 | 2010-03-10 | |
US61/312,469 | 2010-03-10 | ||
US92099710A | 2010-09-03 | 2010-09-03 | |
US12/920,997 | 2010-09-03 | ||
PCT/US2011/026841 WO2011109494A2 (en) | 2010-03-02 | 2011-03-02 | A method for inhibiting alternative pathway mediated disorders with anti-properdin antibodies that inhibit c5 interactions with properdin |
USPCT/2011/026841 | 2011-03-02 | ||
PCT/US2011/027964 WO2011112850A2 (en) | 2010-03-10 | 2011-03-10 | Humanized and chimeric anti-properdin antibodies |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103003302A true CN103003302A (zh) | 2013-03-27 |
CN103003302B CN103003302B (zh) | 2015-09-30 |
Family
ID=44564125
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201180023582.XA Active CN103003302B (zh) | 2010-03-10 | 2011-03-10 | 人源化和嵌合抗-备解素抗体 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP2545075B1 (zh) |
CN (1) | CN103003302B (zh) |
AU (1) | AU2011224224B2 (zh) |
CA (1) | CA2811221C (zh) |
WO (1) | WO2011112850A2 (zh) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102159843B1 (ko) * | 2011-12-21 | 2020-09-24 | 노파르티스 아게 | 인자 p를 표적화하는 항체에 대한 조성물 및 방법 |
JP2015532303A (ja) * | 2012-10-04 | 2015-11-09 | ノベルメド セラピューティクス,インコーポレーテッド | 溶血性疾患を治療するための補体第2経路特異的抗体 |
US10183989B2 (en) | 2013-12-24 | 2019-01-22 | Novelmed Therapeutics, Inc. | Methods of treating ocular diseases |
WO2015120130A1 (en) * | 2014-02-07 | 2015-08-13 | Novartis Ag | Impact of genetic factors on disease progression and response to anti-c5 antibody in geographic atrophy |
IL309890A (en) * | 2017-01-30 | 2024-03-01 | Alexion Pharma Inc | Monovalent antibodies against properdin and their fragments |
AU2018301412A1 (en) | 2017-07-11 | 2020-01-30 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Polypeptides that bind complement component C5 or serum albumin and fusion proteins thereof |
CN115003694A (zh) * | 2020-01-08 | 2022-09-02 | 载度思生命科学有限公司 | 抗备解素抗体及其制备 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030198636A1 (en) * | 1997-08-26 | 2003-10-23 | Rekha Gupta-Bansal | Process for inhibiting complement activation via the alternative pathway |
US20060093599A1 (en) * | 2004-11-03 | 2006-05-04 | Gadi Gazit-Bornstein | Anti-properdin antibodies, and methods for making and using same |
CN1787741A (zh) * | 2003-05-15 | 2006-06-14 | 唐纳士公司 | 用于预防和治疗败血症的方法与组合物 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101932337A (zh) * | 2007-06-11 | 2010-12-29 | 宾夕法尼亚大学董事会 | 替代途径的血清灭菌蛋白调节及其应用 |
PT2262831E (pt) * | 2008-03-03 | 2015-05-18 | Novelmed Therapeutics Inc | Anticorpos antiproperdina |
JP5421366B2 (ja) * | 2008-07-21 | 2014-02-19 | オトノミ―,インク. | 制御放出性の耳の構造体調節および生来の免疫システム調節化合物および耳の障害の処置のための方法 |
-
2011
- 2011-03-10 EP EP11754104.5A patent/EP2545075B1/en active Active
- 2011-03-10 CA CA2811221A patent/CA2811221C/en active Active
- 2011-03-10 AU AU2011224224A patent/AU2011224224B2/en active Active
- 2011-03-10 WO PCT/US2011/027964 patent/WO2011112850A2/en active Application Filing
- 2011-03-10 CN CN201180023582.XA patent/CN103003302B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030198636A1 (en) * | 1997-08-26 | 2003-10-23 | Rekha Gupta-Bansal | Process for inhibiting complement activation via the alternative pathway |
CN1787741A (zh) * | 2003-05-15 | 2006-06-14 | 唐纳士公司 | 用于预防和治疗败血症的方法与组合物 |
US20060093599A1 (en) * | 2004-11-03 | 2006-05-04 | Gadi Gazit-Bornstein | Anti-properdin antibodies, and methods for making and using same |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2011112850A3 (en) | 2012-01-19 |
WO2011112850A2 (en) | 2011-09-15 |
EP2545075A4 (en) | 2014-01-22 |
CA2811221A1 (en) | 2011-09-15 |
AU2011224224A1 (en) | 2012-11-01 |
EP2545075A2 (en) | 2013-01-16 |
AU2011224224B2 (en) | 2015-07-09 |
CN103003302B (zh) | 2015-09-30 |
CA2811221C (en) | 2018-01-09 |
EP2545075B1 (en) | 2020-07-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104220454B (zh) | 人源化的嵌合抗因子Bb抗体及其用途 | |
CN103003302B (zh) | 人源化和嵌合抗-备解素抗体 | |
JP5484063B2 (ja) | Angptl3に対するモノクローナル抗体 | |
CN104884473B (zh) | Il-17a/f il-23双特异性抗体及其应用 | |
JP5366406B2 (ja) | アンジオポエチン様タンパク質4(angptl4)に対するモノクローナル抗体 | |
US8664362B2 (en) | Humanized and chimeric anti-properdin antibodies | |
US10040852B2 (en) | Neutralizing monoclonal antibodies against the Nogo-66 receptor (NgR) and uses thereof | |
CN108779171A (zh) | 抗补体因子c1q的fab片段及其应用 | |
TW200944234A (en) | Humanized anti-Factor D antibodies and uses thereof | |
IL185754A (en) | An antigen-binding molecule capable of binding a marginal growth factor, uses of the above molecule, and a pharmaceutical composition comprising such a molecule | |
CN105820245B (zh) | 抗vegf抗体 | |
US20140186348A1 (en) | Humanized and chimeric anti-properdin antibodies | |
CN105820244B (zh) | 抗vegf抗体 | |
WO2016109943A1 (zh) | 抗vegf抗体 | |
CN103068396B (zh) | 抑制c5和备解素相互作用的抗-备解素抗体在制备抑制交替途径活化的药剂中的用途 | |
WO2023216981A1 (zh) | 松弛素或类似物的融合蛋白及其医药用途 | |
TW202246319A (zh) | 補體c3抗原結合蛋白 | |
AU2022327397A1 (en) | Anti-vegf a and -vegf c bispecific antibody and use thereof | |
CN117500828A (zh) | 结合VEGF和Ang2的双特异性结合分子以及其用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |