CN105820244B - 抗vegf抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了特异性结合血管内皮生长因子(VEGF)的抗体，特别是重链抗体，更特别是单域抗体。还公开了所述抗体的制备方法和治疗用途。

Description

抗VEGF抗体

技术领域

本发明涉及抗体及其应用，具体而言，本发明涉及特异性结合血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)的抗体，特别是重链抗体，更特别是单域抗体；以及所述抗体的制备方法和治疗用途。

背景技术

血管生成是指从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管，是一个涉及多种细胞的多种分子的复杂过程。血管生成是促血管形成因子和抑制因子协调作用的复杂过程，正常情况下二者处于平衡状态，一旦此平衡打破就会激活血管系统，使血管生成过度或抑制血管系统使血管退化。

已知许多疾病与血管生成失控和不希望有的血管生成有关。这些疾病包括但不限于肿瘤如所谓的实体瘤和液体(或血液)瘤(如白血病和淋巴瘤)，炎症如类风湿或风湿性炎症，尤其是关节炎(包括类风湿性关节炎)，或其它慢性炎症如慢性哮喘，动脉硬化或移植后动脉硬化、子宫内膜异位，眼新生血管疾病，如视网膜病 (包括糖尿病视网膜病)、老年黄斑变性、牛皮癣、成血管细胞瘤、血管瘤、动脉硬化。其它与血管生成失控和不希望有的血管生成有关的疾病对本领域技术人员是显然的。

血管内皮生长因子，是对血管内皮细胞具有特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生。包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和胎盘生长因子。

VEGF-A的主要作用为促进血管内皮细胞增殖、迁移和管腔的形成，同时也会增加血管渗漏、促进单核细胞趋化和B细胞生成。VEGF-A的生物学效应是依靠与其特异性受体结合而介导的，与其结合的主要是特异性受体血管内皮生长因子受体1 (VEGFR-1)和VEGFR-2。其中，VEGFR-2被认为是主要的VEGFR，其对血管内皮细胞的增生有重要影响。VEGFR-2通过细胞内激酶诱导VEGF绑定二聚体和需要自身磷酸化的受体，从而加强细胞的有丝分裂(Klettner A, Roider J．Treating age-related macular degeneration interactionof VEGF-antagonists with their target．Mini Rev Med Chem, 2009, 9 (9) : 1127-1135)。VEGF-A 包括8个外显子和7个内含子，其转录剪接成多个亚型，主要为：VEGF121、VEGF145、VEGF206、VEGF165、VEGF189，这些亚型有不同的分子质量、溶解度和肝素结合能力，其中VEGF165 是VEGF-A最主要的亚型(Ferrara N, Gerber HP, Le Couter J． Thebiology of VEGF and its receptors．Nat Med, 2003, 9 (6) : 669-676)。VEGF165是分泌型可溶性蛋白，能直接作用于血管内皮细胞促进血管内皮细胞增殖，加速血管内皮细胞损伤的修复，增加血管通透性，使血管内血栓形成及血栓性闭塞减少，并抑制内膜增生(黄晨星, 沈祖光. 血管内皮生长因子的研究及在组织修复中的应用J . 中国修复重建外科杂志. 2002 , 160 : 64 – 68)。

现有的血管内皮生长因子药物包括哌加他尼钠(Pegaptanib sodium，商品名Macugen)、Ranibizumab (商品名为Lucentis)、贝伐单抗(Bevacizumab，商品名为Avastin)、VEGF Trap等。目前针对抗VEGF制剂争议的焦点是可能加重组织纤维膜的形成。目前临床用于治疗多种疾病(如年龄相关性黄斑变性)的抗VEGF药物，需要频繁进行眼内注药，导致发生眼内炎的潜在风险，这是抗VEGF治疗存在的明显问题。有研究者使用脐静脉内皮细胞和Tenon囊的纤维细胞，观察倍伐单抗和Macugen对VEGF不同亚型的作用，结果证实VEGF-165、VEGF-121主要影响血管生长，VEGF-189主要影响纤维化形成过程。倍伐单抗和雷珠单抗能抑制全部有活性的VEGF-A亚型(Van Bergen T, Vandewalle E, Van de VeireS, et a1．The role of different VEGF isoforms in scar formation after glaucomafiltration surgery. Exp Eye Res, 2011, 93: 689-699; and CATT research group,Martin DF, Maguire MG, et al. Ranibizumab and Bevacizumab for neovascularage-related macular degeneration. N Engl J Med, 2011. 364: 1897-1908)，这可能是倍伐单抗导致某些患者玻璃体腔内纤维化的原因。

目前抗VEGF的药物每4～6周需要重复治疗,雷珠单抗治疗第1年的平均年注射量约6.9次，倍伐单抗约7.7次(Li X, Hu Y, Sun X, Zhang J, Zhang M. Bevacizumab forneovascular age-related macular degeneration in China. Ophthalmology. 2012Oct., 119(10): 2087-93)，如此频繁的眼内注药治疗存在发生眼内炎的潜在风险，急需开发药效长，视网膜通透吸收更好的新型抗体药物，以延长给药周期，降低注射给药给患者带来的不适与风险。

除此之外，目前抗VEGF制剂表达纯化工艺复杂，普遍存在成本高，稳定性差、应用面不广等现实问题。

重链抗体是从骆驼科动物的血清中分离出的一种抗体，仅由重链构成，其抗原结合区仅是一个通过铰链区与Fc区连接的单结构域，而且这个抗原结合区自抗体上分离后仍具有结合抗原的功能，故称为单域抗体(single-domain antibody, sdAb)或纳米抗体(nanobody)。与传统抗体不同的是，单域抗体是一个含有大约110个氨基酸的肽链，其分子量约为传统抗体的1/10，这就为抗体的分子构建提供了一个新方法(Muyldermans. Singledomain camel antibodies: current status. J Biotechnol 2001, 74:277-302)。这类单域抗体具有分子小、热稳定性好、在清洁剂和高浓度尿酸环境下稳定、体内组织渗透性好、可溶性好(Stanfield R, Dooley H, Flajnik M, Wilson I. Crystal structure ofa shark single-domain antibody V region in complex with lysozyme. Science.2004, 305 (5691))、易表达、利于原核系统表达、生产成本低、抗原识别表位独特，且能识别隐藏的抗原性位点等特性，在免疫实验、诊断与治疗中，逐渐发挥着超乎想象的巨大功能(Dirk Saerens, Gholamreza Hassanzadeh Ghassabeh, Serge Muyldermans. Single-domain antibodies as building blocks for novel therapeutics. Current Opinionin Pharmacology 2008, 8:600–608)。

因此，本领域需要一种能够克服现有抗VEGF制剂的上述缺陷的抗体，例如可特异性结合VEGF并抑制其活性的单域抗体。

发明内容

本发明提供了抗VEGF抗体、其变体或衍生物，其中所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含：(i) SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15所示的CDR1、CDR2和CDR3或其功能活性变体；或(ii) SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18所示的CDR1、CDR2和CDR3或其功能活性变体；或(iii) SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20和SEQ IDNO: 21所示的CDR1、CDR2和CDR3或其功能活性变体；所述功能活性变体是与SEQ ID NO:13-21中任一个的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的功能活性变体。

在具体的实施方案中，本发明提供了重链抗体，所述抗体由重链组成，所述重链的可变区包含：(i) SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15所示的CDR1、CDR2和CDR3或其功能活性变体；或(ii) SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18所示的CDR1、CDR2和CDR3或其功能活性变体；或(iii) SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20和SEQ IDNO: 21所示的CDR1、CDR2和CDR3或其功能活性变体。

一方面，本发明抗体的重链可变区可包含至少一个氨基酸添加、插入、缺失和/或置换。另一方面，本发明的抗体可以是单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体、多特异性抗体和/或双特异性抗体以及它们的片段。在一个具体实施方案中，本发明的抗体为人源化抗体。

在一个具体的实施方案中，本发明抗体的重链还可含有恒定区。在另一具体的实施方案中，本发明抗体的重链还含有Fc片段。

在一些具体的实施方案中，本发明的抗体是重链抗体，即，仅由重链组成。在一些具体的实施方案中，本发明的抗体是单域抗体。

另外，本发明提供了与参比抗体竞争结合VEGF的抗体，所述参比抗体为上述抗体的任一个。

本发明还涉及编码上述抗体的核酸序列；包含这些核酸序列的载体；以及宿主细胞，所述宿主细胞表达上述抗体，和/或包含这些核酸序列或载体。

本发明还提供了制备抗体的方法，步骤包括：在允许表达所述抗体的条件下培养上述宿主细胞；和从所得培养产物中纯化抗体。

本发明还涉及药物组合物，包含本发明的抗体和药学上可接受的赋形剂。所述药物组合物还可包含一种或多种治疗活性化合物，所述治疗活性化合物例如已知的抗VEGF药物或抗肿瘤药物。

另一方面，本发明还涉及抗体偶联药物(Antibody-drug conjugate, ADC)，其包含偶联于其它药剂的本发明抗体，所述其它药剂例如化疗剂、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即放射性偶联物)。

抗体偶联药物还可包含位于药物单元和抗体单元之间的接头单元。

另外，本发明涉及通过给予有效量的本发明的抗体来调节VEGF活性的方法。本发明涉及通过向有需要的患者给予有效量的本发明的抗体来抑制血管生成的方法。

本发明还提供了一种治疗与VEGF相关疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的患者给予有效量的至少一种本发明的抗体。所述疾病或病症包括肿瘤或癌症或眼科疾病。所述肿瘤或癌症包括乳腺癌、脑肿瘤、肾癌、卵巢癌、甲状腺癌、肺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、血管肉瘤、膀胱癌、胚胎组织癌、颈部肿瘤、恶性胶质瘤、胃癌、胰腺癌、鼻咽癌等。所述眼科疾病包括各种原因引起的黄斑水肿(包括糖尿病性黄斑水肿、白内障术后或葡萄膜炎后等各种疾病引起的黄斑水肿)、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、视网膜中央静脉阻塞、新生血管性青光眼以及其它涉及新生血管的眼科疾病。

另外，本发明还涉及本发明的抗体在制备用于调节VEGF活性的药物中的用途；本发明的抗体在制备用于抑制血管生成的药物中的用途；本发明的抗体在制备用于治疗与VEGF相关疾病或病症的药物中的用途。

本发明还提供了药盒，其包含a) 本发明的抗体，或所述药物组合物；以及b) 使用说明。

附图说明

图1是纯化的hVEGF165蛋白的SDS-PAGE检测结果的图。其中，第1泳道是标准蛋白Marker (Invitrogen, Cat. No.: LC5677)；第2泳道是2 μg非还原hVEGF165；第3泳道是5μg非还原hVEGF165；第4泳道是2 μg还原hVEGF165；第5泳道是5 μg还原hVEGF165。

图2是免疫反应测试结果，表明动物在注射了抗原后产生了较好的免疫反应，血清效价约为1: 100k。

图3是总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果，表明所得RNA质量符合文库构建的需求。

图4是将图3的总RNA反转录成cDNA后，经PCR得到的扩增V_HH片段的琼脂糖凝胶电泳纯化结果。

图5是用于连接V_HH片段的噬菌粒载体图谱。

图6是噬菌体展示文库片段插入率检测的图。通过对72个随机克隆的PCR检测，其中有69个克隆有单域抗体基因片段的插入，插入率69/72= 95.8%。

图7是通过对图6中有插入片段的阳性克隆进行测序，而得到的单域抗体文库序列多样性检测图，可见文库多样性良好。

图8是FASEBA筛选专用载体图谱。该载体为氨苄青霉素抗性，含有SASA及6×Histag，可以用于抗体的分泌表达。

图9是FASEBA筛选后抗体的亲和力排序；9A、9B、9C为3个不同批次的亲和力排序结果。其中左上图：不同克隆的结合、解离的传感图；右上图：不同克隆的结合、解离速率的矩阵图；左下图：不同克隆经过归一化的传感图；右下图：选取部分亲和力较高的抗体的传感图。

图10是受体竞争性筛选结果图，其中将经过表达量水平筛选和亲和力排序而优选的15个单域抗体用于该筛选。根据该竞争性结果和对照相比，选择其中4个较好的克隆用于重链抗体制备，用于细胞增殖抑制实验。

图11是重链抗体对HUVEC细胞增殖抑制试验的曲线图。通过不同浓度抗体对细胞增殖抑制的程度来判断，5个重链抗体均具有抑制功能。

图12是实施例11中5个重链抗体的可变区序列。

具体实施方式

本发明涉及特异性结合VEGF的抗体、其变体或衍生物；以及所述抗体的制备方法和治疗用途。例如，本发明涉及特异性结合VEGF的重链抗体，更特别地为单域抗体。同时，本发明抗体在抑制细胞增殖以及血管生成方面显示出优于现有技术抗VEGF单克隆抗体(例如Avastin)的优异效果，如以下实施例所进一步描述的。

本发明的单域抗体具有比Fab片段和全长IgG抗体更小的分子量，一般12-15kD，可以用于构建多价抗体，并通过基因工程改造以提高亲和力和延长半衰期，延长间隔给药周期等特性。与普通抗体药物相比，单域抗体药物与抗原的结合能力，在高温、胃酸、蛋白酶等极端条件下更加稳定，并具有高度的构象稳定性。与全抗体药物易诱发补体效应细胞毒反应不同，单域抗体药物缺少Fc片段，不会引起补体效应。同时，因为单域抗体分子量小，该抗体在眼组织和肿瘤组织给药中可具有更好渗透性。处于蛋白酶、极端温度和pH环境中的稳定性，高亲和力、使其口服和其它给药途径提供了可行性。

单域抗体可以在原核或真核细胞中，例如大肠杆菌或酵母细胞中进行规模化表达，表达量很大，这样就极大地便利了批量生产，有利于控制生产成本，也有利于后期药物开发的市场前景。

除非本文另外定义，与本文相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员所理解的含义。

术语“抗体”在生物学和生物医学领域中被充分理解，通常是指完整抗体及任何抗体片段或其单链。抗体是由称为浆细胞的特化B淋巴细胞分泌的糖蛋白。其亦被称为免疫球蛋白(Ig)，因为其含有存在于许多蛋白质中的共有结构域。抗体最可能包含通常由二硫键连接的2条重(H)链和2条轻(L)链或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(V_H)和重链恒定区组成。每条轻链同样由可变区(V_L)和恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。V_H和V_L区可进一步再分成超变区，称为互补决定区(CDR)，其散布有称为构架区(FR)的更保守的区域。在一些具体的实施方案中，本发明的抗体仅由重链组成。在一些具体的实施方案中，本发明的抗体是单域抗体。

可使用Kabat等在Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, 1991中描述的方法确定给定抗体的互补决定区(CDR)和构架区(FR)。

本发明包括抗体的“变体”，例如，本发明抗体的重链可变区可包含至少一个氨基酸添加、插入、缺失和/或置换，例如10、20、30、40、50个，优选例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸添加、插入、缺失和/或置换。

本发明亦包括抗体的“衍生物”。抗体的“衍生物”为经化学修饰的抗体，例如通过与其它化学部分例如聚乙二醇、白蛋白(例如人血清白蛋白)结合、磷酸化和糖基化。除非另外说明，否则术语“抗体”包括其片段、衍生物、变体。

一方面，本发明提供了抗VEGF抗体、其变体或衍生物，其中所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含：(i) SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15所示的CDR1、CDR2和CDR3或其功能活性变体；或(ii) SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17和SEQ IDNO: 18所示的CDR1、CDR2和CDR3或其功能活性变体；或(iii) SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO: 21所示的CDR1、CDR2和CDR3或其功能活性变体。

所述功能活性变体是与SEQ ID NO: 13-21中任一个的氨基酸序列具有至少70%，例如至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的功能活性变体。

在具体的实施方案中，本发明提供了重链抗体，所述抗体由重链组成，所述重链的可变区包含：(i) SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15所示的CDR1、CDR2和CDR3或其功能活性变体；或(ii) SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18所示的CDR1、CDR2和CDR3或其功能活性变体；或(iii) SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20和SEQ IDNO: 21所示的CDR1、CDR2和CDR3或其功能活性变体。

在一个具体的实施方案中，本发明抗体的重链还可含有恒定区。在另一具体的实施方案中，本发明抗体的重链还含有Fc片段。

在一些具体的实施方案中，本发明的抗体是重链抗体，即，仅由重链组成。在一些具体的实施方案中，本发明的抗体是单域抗体。

在更具体的实施方案中，本发明抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO: 38、SEQ IDNO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42所示。

另外，本发明还提供了与参比抗体竞争结合VEGF抗体，所述参比抗体为上述抗体的任一个。

本发明还涉及编码上述抗体的核酸序列；包含这些核酸序列的载体；以及宿主细胞，所述宿主细胞表达上述抗体，和/或包含这些核酸序列或载体。“宿主细胞”为用于表达核酸例如本发明核酸的细胞。宿主细胞可为原核生物，例如大肠杆菌，或者其可为真核生物，例如单细胞真核生物(例如，酵母)。

在具体的实施方案中，所述核酸序列如SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ IDNO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55所示，如以下实施例所详述的。

本发明还提供了制备抗体的方法，步骤包括：在允许表达所述抗体的条件下培养上述宿主细胞；和从所得培养产物中纯化抗体，如以下实施例所详述的。

本发明还涉及药物组合物，其包含本发明的抗体和药学上可接受的赋形剂。所述药物组合物还可包含一种或多种治疗活性化合物，所述治疗活性化合物例如已知的抗VEGF药物或抗肿瘤药物。

所述治疗活性化合物可与本发明的抗体同时给药或序贯给药。

药物组合物可按照本领域已知的技术制备。术语“赋形剂”概括地指一种或多种活性治疗成分外的任何组分。赋形剂可为惰性物质、无活性物质和/或无药物活性的物质。赋形剂可用作多种目的，例如，用作载体、溶媒、稀释剂、片剂辅助剂，和/或改善活性物质的给药和/或吸收。药学活性成分与各种赋形剂的配制为本领域已知，参见例如Remington: TheScience and Practice of Pharmacy (例如第19版(1995), 和任何之后的版本)。赋形剂的非限制性实例为：溶剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、张度调节剂、螯合剂和稳定剂。

本发明的抗体可以以药物组合物的形式给予。其不仅可以制备成为注射液、冻干制剂、喷雾剂等液体制剂，还可以制备成为胶囊剂等固体制剂。给药途径可为，例如，静脉内注射、口服或局部给药，例如经皮，经结膜，和/或经眼睛等。在具体的实施方案中，给药途径为经口服。在另一具体的实施方案中，给药途径为经眼睛。

另一方面，本发明还涉及抗体偶联药物，其包含偶联于其它药剂的本发明抗体，所述其它药剂例如化疗剂、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即放射性偶联物)。

采用抗体偶联药物进行其它药剂的局部递送能将药剂靶向递送到肿瘤，并在肿瘤中胞内积累，而全身性给予这些未偶联的药剂可能会导致对正常细胞以及需要去除的肿瘤细胞不可接受程度的细胞毒性。

抗体偶联药物通常包含位于药物单元和抗体单元之间的接头单元。在一些实施方案中，该接头可在胞内条件下切割，从而接头的切割导致药物单元在胞内环境中从抗体释放。接头可为例如可被胞内肽酶或蛋白酶(包括但不限于：溶酶体或内含体蛋白酶)切割的肽基接头。在一些实施方案中，肽基接头的长度至少为两个氨基酸或至少为3个氨基酸。在一个具体的实施方式中，可被胞内蛋白酶切割的肽基接头是Val-Cit接头或Phe-Lys接头。

在其它实施方案中，接头单元不可切割，药物通过，例如抗体的降解而释放。

另外，本发明还涉及通过给予有效量的本发明的抗体来调节(优选抑制)VEGF活性、抑制哺乳动物的血管生成的方法。

另外，本发明涉及通过给予有效量的本发明的抗体来调节VEGF活性的方法。本发明涉及通过向有需要的患者给予有效量的本发明的抗体来抑制血管生成的方法。

本发明还提供了一种治疗与VEGF相关疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的患者给予有效量的至少一种本发明的抗体。所述疾病或病症包括肿瘤或癌症或眼科疾病。所述肿瘤或癌症包括乳腺癌、脑肿瘤、肾癌、卵巢癌、甲状腺癌、肺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、血管肉瘤、膀胱癌、胚胎组织癌、颈部肿瘤、恶性胶质瘤、胃癌、胰腺癌、鼻咽癌等。所述眼科疾病包括各种原因引起的黄斑水肿(包括糖尿病性黄斑水肿、白内障术后或葡萄膜炎后等各种疾病引起的黄斑水肿)、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、视网膜中央静脉阻塞、新生血管性青光眼以及其它涉及新生血管的眼科疾病。

所述“有需要的患者”意指任何哺乳动物，所述哺乳动物例如但不限于人、马、牛、猫、小鼠、兔、大鼠、山羊等。优选地，所述哺乳动物是人。

在一些治疗应用中，多种本发明的抗体组合给予。

另外，本发明还涉及本发明的抗体在制备用于调节VEGF活性的药物中的用途；本发明的抗体在制备用于抑制血管生成的药物中的用途；本发明的抗体在制备用于治疗与VEGF相关疾病或病症的药物中的用途。

本发明还提供了药盒，其包含a) 本发明的抗体，或所述药物组合物；以及b) 使用说明。

参考以下的非限制性实施例进一步描述本发明。

实施例1. 抗原制备

本实施例针对的抗原为人VEGF165 (Human vascular endothelial growthfactor 165，hVEGF165)分子(Park JE, Keller GA, Ferrara N. The vascularendothelial growth factor (VEGF) isoforms: differential deposition into thesubepithelial extracellular matrix and bioactivity of extracellular matrix-bound VEGF. Mol Biol Cell. 1993 Dec., 4(12):1317-26; Gengrinovitch S,Greenberg SM, Cohen T, Gitay-Goren H, Rockwell P, Maione TE, Levi BZ, NeufeldG. Platelet factor-4 inhibits the mitogenic activity of VEGF121 and VEGF165using several concurrent mechanisms. J Biol Chem. 1995 Jun 23; 270(25):15059-65; and Keyt BA, Berleau LT, Nguyen HV, Chen H, Heinsohn H, Vandlen R,Ferrara N. The carboxyl-terminal domain (111-165) of vascular endothelialgrowth factor is critical for its mitogenic potency. J Biol Chem. 1996 Mar29; 271(13):7788-95)，其中人VEGF165抗原的核酸序列如SEQ ID NO: 61所示；人VEGF165抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO: 62所示。

根据该氨基酸序列，对其进行哺乳动物表达的密码子优化后，通过全合成的方式得到优化后的DNA，克隆入真核表达载体pTT5 (由发明机构NRC授权)后，用于制备转染级质粒。转染HEK293E 细胞后培养7天，通过离心收集细胞并培养上清液用于手动装配的Capto柱和HiTrap^TM Q HP的两步离子交换纯化，纯化并进行去内毒素处理。蛋白浓度检测采用UV_280nm吸光值检测，蛋白内毒素水平采用LAL方法检测，抗原的活性通过HUVEC细胞增殖实验测定。共得浓度为1.25 mg/ml，体积为22 ml，总量为27.5mg的hVEGF165蛋白，内毒素水平为0.537 EU/ml(表1)，SDS-PAGE检测结果见图1，蛋白于-80℃保存。

表1 hVEGF165纯化蛋白信息

实施例2. 动物免疫和免疫反应测定

1. 动物免疫

选择羊驼(Lama pacos)作为实验动物，在4个不同时间点，分别在肩胛及背部进行六点注射免疫。PBS为抗原的稀释液，每次免疫体积为1 ml，抗原量及佐剂信息见表2。免疫试剂含终浓度1 mg/ml的BSA，抗原与佐剂均在注射前新鲜配制混匀后再免疫。

表2 羊驼免疫抗原信息

免疫过程设计(表3)分四次不同时间分别于颈静脉采血，采集血液时加入抗凝剂。首次采血5 ml，其余三次各15 ml。利用Ficoll 1.077 试剂(Sangon, Cat. No.: F760014-100)和抗凝血进行梯度离心后，分离外周血淋巴细胞并进行细胞重悬计数，添加RNAlater(TIANGEN, Cat. No.:DP408-02)，于-20°C保存。梯度离心获得的血清也于-20°C保存。

表3 羊驼免疫时间安排表

2. 免疫反应测试

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)分别对免疫前、第三次免疫和第四次免疫后的血清样品进行抗原特异性免疫反应测试。以NaHCO₃ (pH 9.6)溶液稀释免疫原，包被微孔板(Corning，Cat.No.:9018)，4℃过夜。用PBS-T溶液在洗板机中洗板四次后，使用3% BSA封闭液，37℃封闭2 h。PBS-T四次洗板后，37℃过夜孵育梯度稀释的血清。PBS-T四次洗板后，孵育辣根过氧化物酶标记的羊抗美洲驼第二抗体(Novus Biologicals，Cat.No.:NB7242)。使用TMB显色10 min，加入1M HCl终止显色。反应终止后的体系使用MK3 (Thermo) 酶标仪检测450 nm处的吸光值。通过ELISA的反应结果可以判断，动物在注射了蛋白抗原后产生了较好的免疫反应，血清效价约为1: 100k (图2)。

实施例3. 抗体噬菌体文库构建

3.1. RNA提取

根据细胞数目将对应体积的TRIzol试剂加入分离的外周血淋巴细胞中，细胞裂解完成后，按照TRIzol® Plus RNA纯化系统的操作说明(Invitrogen，Cat. No.:12183-555)完成总RNA的提取分离。通过琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量，并利用吸光法测定RNA的浓度。根据测定结果，共获得105.6μg总RNA。RNA在琼脂糖凝胶电泳图上形态完整(图3)，质量上符合文库构建的需求。

3.2. 反转录PCR

根据SuperScriptTM III First-Strand Synthesis System使用技术说明书(Invitrogen，Cat. No.: 18080-051)，使用Oligo (dT)20引物将总RNA反转录成cDNA。根据骆驼抗体的序列特征，选择特异性的正向引物和反向引物用于VHH的扩增(A. Bell etal., Differential tumor-targeting abilities of three single-domain antibodyformats, Cancer Lett. 2010 Mar 1;289(1): 81-90; and Honda Toshio, Akahori,Yasushi, Kurosawa Yoshikazu. Methods of constructing camel antibodylibraries. United States Patent 2005/0037421 A1),引物的具体序列见表4。通过第一轮对cDNA的PCR，根据PCR产物的分子量分离纯化约为600bp的含有VHH的片段，此后再通过第二轮PCR扩增获得VHH的片段并同时在DNA片段两端引入两个识别序列不同的Sfi I限制性酶切位点，共获得101μg 凝胶纯化的VHH片段(图4)。

表4. 引物序列信息及PCR扩增作用

3.3 文库构建

将用不同批次细胞和不同引物扩增得到的V_HH片段混合，然后利用限制性内切酶Sfi I进行酶切。通过2%琼脂糖凝胶电泳进行分离、纯化并获得酶切后的V_HH；同时，利用限制性内切酶Sfi I对噬菌粒载体(图5)进行酶切，通过1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分离、纯化并获得酶切后的载体。通过吸光法测定酶切后的V_HH和噬菌粒载体的浓度后，按照载体/片段摩尔比分别为1:3, 1:5, 1:10混合，加入T4连接酶(NEB，Cat. No.: M0202L)后进行同体积连接反应体系的制备，于16℃过夜进行连接。对连接体系按顺序进行酚/氯仿抽提、氯仿抽提、乙醇沉淀，对纯化得到的连接产物通过吸光法进行浓度的测定。对于3个不同连接体系获得的产物均进行等量DNA和TG1电转化感受态的电转化，通过涂布平板和梯度稀释法计算3个连接体系的文库即转化效率的大小，随机挑取阳性克隆送测检测文库多样性。选择转化效率最高的体系进行大量连接和转化，并统计库容。根据平板计数结果显示，文库库容约为1.8×10⁸(表5)。

表5 单域抗体噬菌体展示文库库容计算

对文库菌落进行随机克隆PCR，可见文库的片段插入率为95.8% (图6)，对其中有插入片段的阳性克隆进行测序，通过对单域抗体CDR区域的氨基酸序列进行比对，可见文库多样性良好(图7)。对涂布的过夜平板使用含100 μg/ml氨苄青霉素和2%葡萄糖的2YT培养基进行菌体收集，5,000g离心去除细胞代谢产物，并用相同培养基重悬细胞，分为两份进行文库储存。

实施例4. 噬菌体展示及筛选

4.1. 抗原生物素酰化复合物制备

根据EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation试剂盒(Pierce, Cat. No.: 21335)的操作过程说明，将hVEGF165蛋白进行生物素化标记。通过HABA实验检测蛋白生物素化标记的程度。将生物素化标记的hVEGF165与0.5 ml M-280链霉亲和素的磁珠混合(Invitrogen, Cat. No.: 112.06D)，4℃过夜孵育，然后通过磁力架分离磁珠，并用PBS溶液洗脱未能和磁珠结合的生物素化蛋白，用来制备抗原磁珠偶联复合物。生物素酰化反应和纯化后获得0.52 mg hVEGF165蛋白，HABA实验显示生物素偶联水平为每摩尔蛋白偶联6摩尔生物素分子。

4.2. 噬菌体文库复苏

取大约100μl (MOI约为20)的噬菌体文库储液接种到2YT培养基中，225 rpm，30℃进行培养，在培养至对数生长期(OD₆₀₀=0.5)时加入M13KO7辅助噬菌体(NEB, Cat. No.:N0315S)，225 rpm，30℃过夜培养。离心收集噬菌体，将培养上清液和PEG/NaCl溶液混合并离心沉淀噬菌体，通过多次离心及重悬，最后将复苏得到的噬菌体颗粒悬浮在1-2ml的PBS中。通过有限梯度稀释法计算复苏得到的噬菌体文库的效价，获得3.15×10¹³ pfu/ml的文库。

4.3. 针对靶蛋白噬菌体筛选

取~2×10¹¹ pfu的噬菌体作为第一轮的投入和10ul的抗原磁珠偶联复合物进行常温孵育，并在旋转仪上温和混匀2小时；通过磁力架将磁珠分离，将没有与磁珠结合的噬菌体洗去，对磁珠的重悬和非特异性结合的洗脱需要进行7次；将最后一次重悬的磁珠加入TEA溶液，将与抗原磁珠偶联复合物结合的噬菌体洗脱并分离，迅速加入Tris-HCl缓冲液进行中和；通过有限梯度稀释法计算第一轮筛选后噬菌体的产出，同时对第一轮洗脱得到的噬菌体进行过夜培养和扩增，具体参数和过程和此前文库复苏描述相同。第二轮筛选将以~10¹¹ pfu 的第一轮产出噬菌体扩增后的文库作为投入，和1ul的抗原磁珠偶联复合物进行孵育和筛选，具体操作过程和参数与第一轮筛选相同。

4.4. 噬菌体ELISA鉴定

挑取用于第二轮筛选噬菌体产出计算的过夜平板上的单克隆噬菌斑，放入每孔含有500 μl 2YT培养基的96孔深孔板，225 rpm，30℃进行培养，在培养至对数生长期(OD₆₀₀=0.5)时加入M13KO7辅助噬菌体(NEB, Cat. No.: N0315S)，225 rpm，30℃过夜培养。离心收集菌体，取上清液，加入预先包被hVEGF165并封闭好的微孔板中，以HRP/ 抗-M13单克隆抗体 (GE Healthcare, Cat. No.: 27-9421-01)作为第二抗体检测，其它ELISA操作参数与免疫反应检测相同，根据吸光值评估产出的阳性率。将随机挑取的部分与抗原识别的阳性噬菌体克隆进行V_HH片段的测序，通过序列比对和分析，推断通过噬菌体展示产出的克隆多样性。通过阳性率和序列的多样性来确定是否需要进行更多轮次的噬菌体展示筛选。噬菌体克隆阳性大于50%，且满足多样性需求。因此选用第二轮产出噬菌体克隆sdAb基因构建FASEBA文库，用于进一步克隆筛选。

表6 噬菌体淘筛及ELISA检测

实施例5. FASEBA筛选

5.1. FASEBA文库构建

提取最后一轮噬菌体展示产出的噬菌体DNA，通过PCR扩增编码V_HH的片段通过连接克隆到专利的FASEBA载体中，所有构建克隆结构为V_HH–linker–SASA–6×His (图8)。连接产物将转化入TG1菌体。

5.2. FASEBA筛选

5.2.1. 样品制备及表达水平评估

从构建的FASEBA文库中随机挑取单克隆，放入每孔含有500 μl 2YT培养基的96孔深孔板，在培养至OD₆₀₀=0.6-0.8时，加入IPTG过夜诱导表达。离心收集菌体后去除澄清的100 μl培养上清液，加入到预先包被BSA并封闭的微孔板中，使用HPR标记的鼠抗His单克隆抗体作为第二抗体检测(GenScript, Cat. No.: A00186)；同时，取等量培养上清液加入到预先包被hVEGF165蛋白并封闭的微孔板中，使用HPR标记的鼠抗His单克隆抗体作为第二抗体检测(GenScript, Cat. No.: A00186)，以OD₄₅₀吸光值来评估不同克隆的表达水平。不同批次总计超过5000个单克隆被用于表达量和抗原结合力的筛选，将表达量较高且与抗原有高结合力的138个阳性克隆用于亲和力排序和后续筛选。

5.2.2. 芯片准备

根据BIAcore T200设备使用说明书，将BSA蛋白通过标准偶联操作流程固定在CM5(GE healthcare, Cat. No.: BR-1006-68)芯片表面上。基本过程如下：在25℃条件下，以HBS-EP 溶液 (0.01 M HEPES [pH 7.4], 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA和0.005% [v/v]表面活性剂P20)为设备运行缓冲液，流速为10 ml/min。首先注射大于7 分钟的0.4 M 1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)/0.1M N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) (1:1)，用于活化羧甲基葡聚糖表面，然后通过注射7分钟稀释于10 mM醋酸钠(pH4.5)的20μg/ml BSA蛋白溶液，最后再注射7分钟的1M氨基乙醇(pH8.5)对未结合的活化位点进行封闭。上述操作获得BSA偶联反应水平在327反应单位(resonance units, RU)。

5.2.3. 抗hVEGF165单域抗体的亲和力排序

将上述提到的sdAb-SASA克隆表达上清液，经96孔过滤板(Pall, Cat. No.:PN5045)在4℃, 以4000g离心过滤5分钟以除去细菌和其它颗粒，用HBS-EP溶液稀释检测sdAb抗体并顺序流过BSA偶联芯片表面。排序分析过程包括以下四个步骤：a. 使用固定BSA的芯片捕获SASA偶联的单域抗体；b. 注射hVEGF165，使其与捕获有单域抗体的芯片表面结合；c. 注射运行缓冲液，并监测解离阶段 300 s；d. 对偶联BSA的芯片表面注射10 mM甘氨酸/HCl (pH 2.0)，30 μl/min，30 s进行重生。每一轮的芯片捕获抗体、抗原结合、抗原解离、BSA芯片表面均需要再生。以浓度200 nM的纯化SASA蛋白流过BSA芯片表面作为对照检测芯片重生效果的检验。138个克隆分3批次进行排序，以克隆A10981为参照，6个A10981重复克隆在不同批次间的一致性很好，400s 解离程度约~20%，其中93个克隆解离速率比A10981慢(图9)，挑取进行测序。选取其中53个单域抗体用于原核表达并用细胞增殖抑制实验进行测试，其中15个单域抗体用于进一步的竞争性筛选。

5.2.4. hVEGFR2竞争性筛选

将经过表达量水平筛选和亲和力排序优选的15个单域抗体用于受体竞争性筛选，以期获得能够封闭抗原hVEGF165和其受体hVEGFR结合抗体。具体过程如下：

a. 通过氨基偶联固定的方法(同5.2.2)将hVEGFR2蛋白固定在CM5芯片表面；b.注射hVEGF165蛋白，观察结合特征，在结合曲线接近饱和时停止注射；c. 在hVEGF165结合的芯片表面上注射不同的单域抗体并观察结合特征，同时注射已经上市的抗VEGF的药物Avastin作为对照；d. 如果抗体结合VEGF165的表位恰是VEGF和VEGFR2结合表位的话，抗体将不能再与VEGF结合，或者将已结合VEGFR2的VEGF竞争下来，结合信号将明显小于VEGF本身；如果抗体结合VEGF165的表位和VEGF&VEGFR2结合表位不同或者无关的话，抗体将结合已经与受体结合的VEGF165，产生的结合信号将明显高于VEGF本身。根据竞争性结果和对照相比(图10)，选择其中的4个较好的克隆用于重链抗体制备用于细胞增殖抑制实验。

实施例6：单域抗体的制备

单域抗体的原核表达、纯化、内毒素去除过程如下。

6.1. 试剂准备

6.1.1. 原核表达试剂

Tryptone, OXOID LP0042

Yeast extract, OXOID LP0021

Casein acid hydrolysate, Sigma C9386

KH₂PO₄, 国药 AR CAS [7778-77-0]

Na₂HPO₄.12H₂O, 国药 AR 10020318

NH₄Cl, 国药 AR CAS [12125-02-9]

NaCl, 国药 AR 10019318

MgCl₂, 国药 AR 7791-18-6

CaCl₂, 国药 AR 10043-52-4

葡萄糖, 国药 AR 10010518

甘油, Sigma G5516-500ML

IPTG, Amresco 0487-100G

VB1, 阿拉丁 AR 1099302

氨苄青霉素, 100 mg/ml ，0.22 μm 滤器过滤处理；

IPTG 母液：1 M，0.22 μm 滤器过滤处理，1-2 ml 分装，﹣20℃冻存(有效期3个月)；

MgCl₂ 母液：1 M，121℃湿热灭菌30 min，1-2 ml 分装，4℃存放(有效期6个月)；

CaCl₂ 母液：1 M，0.22 μm 滤器过滤处理，1-2 ml 分装，4℃存放(有效期6个月)；

VB1 母液：50 mg/ml，0.22 μm 滤器过滤处理，1-2 ml 分装，4℃存放(有效期6个月)；

葡萄糖母液：20% (W/V)，0.22 μm 滤器过滤处理，4℃存放(有效期3个月)；

甘油母液：50% (V/V)，121 ℃湿热灭菌30 min，4℃存放(有效期6个月)；

Casein acid hydrolysate 母液：4%，121 ℃湿热灭菌30 min，室温存放(有效期3个月)；

10ΧM9 盐溶液： 6% Na₂HPO₄ (W/V) 、3% KH₂PO₄ (W/V) 、1% NH₄Cl (W/V) 、0.5%；

NaCl (W/V)，121℃湿热灭菌30 min，室温存放(有效期3 个月)；

2YT 培养基：1.6% (W/V) Tryptone、1.0% (W/V) yeast extract、0.5% (W/V)NaCl、121 ℃ 湿热灭菌30 min；

10Χ TB 培养基：12% (W/V) Tryptone、24% (W/V) yeast extract、4% (V/V)Glycerol、121 ℃ 湿热灭菌30 min。

6.1.2. 蛋白纯化试剂及设备

10Χ BugBuster Protein Extraction Reagent(Novagen，70921-4)；

100 mM PMSF：1.74 g PMSF in 100 ml 异丙醇溶液(碧云天，ST506)；

10 mg/ml 核酸酶(DNaseⅠ)：通常每克湿重菌体用1 μl(Life Science Productand Service，DD0099-1)；

5 mg/ml 溶菌酶(Lysozyme)：通常每克湿重菌体用100 μl(生兴生物，L0005-10)；

Quick StartTM Bradford试剂(Bio-Rad，500-0204)；

High Affinity Ni-NTA Resin(GenScript，L00250)；

HiTrapTM Desalting，5ml，(GE Healthcare，17-1408-01)；

ÄKTA purifier 10 (GE Healthcare)；

裂解缓冲液：20 mM HEPES，150 mM NaCl，10%(V/V)甘油，40mM咪唑，pH 8.0；

结合缓冲液：20 mM Na₂HPO₄， 0.5 M NaCl，20 mM咪唑，pH 7.4；

洗杂缓冲液：20 mM Na₂HPO₄，0. 5 M NaCl，40 mM咪唑，pH 7.4；

洗脱缓冲液：20 mM Na₂HPO₄，0. 5 M NaCl，300 mM咪唑，pH 7.4；

1Χ PBS：137 mM NaCl，10 mM Na₂HPO₄，2 mM KH₂PO₄，pH 7.4。

6.1.3. 内毒素去除试剂及设备

ToxinEraser TM Endotoxin Removal Resin 1.5 ml树脂(GenScript，L00402)；

PD-10 Columns；ToxinEraser TM Regeneration Buffer (GenScript，M01053)；

ToxinEraser TM Equilibration Buffer(GenScript M01054)；

凝胶法内毒素检测试剂盒(GenScript，L00451)；

鲎试剂(Tachypleus Amebocyte Lysate 简称TAL灵敏度0.25 EU/ml，厦门市鲎试剂实验厂有限公司)；

0.1 M NaOH(无热源水配制)；

0.1 M盐酸(无热源水配制)；

37℃恒温培养箱。

6.1.4. 过滤除菌试剂及设备

Millex-GP Filter Unit，0.22 µm (Millipore，Lot：R4AA43868)。

6.1.5. 蛋白浓度测定及检测试剂及设备

Nanodrop 2000分光光度计(Thermo)；

ExpressPlus PAGE Gel：4-20%，12 wells(GenScript，M42012)；

MOPS Running Buffer Powder (GenScript，M00138)；

Loading Buffer(5 Χ，非还原)：0.25 M Tris-HCl(pH 6.8)，10% SDS，0.5%溴酚蓝，50%甘油，7.8%DTT；

Loading Buffer(5 Χ，还原)：0.25 M Tris-HCl(pH 6.8)，10% SDS，0.5%溴酚蓝，50%甘油。

6.2.方法与流程

6.2.1. 菌株制备

a) 转化：将构建入单域抗体基因的原核表达质粒通过化学转化或电转化转入菌株TG1，涂布在2YT氨苄青霉素抗性的平板上，37℃恒温过夜培养；

b) 挑取单克隆：在10 ml的2YT培养基中加入终浓度200 μg/ml氨苄青霉素和2%(W/V)葡萄糖；将镊子在酒精灯上充分烧灼，冷却后夹取10 μl灭菌枪头，从转化平板上挑取1个单克隆，放入培养基，225 rpm， 37℃，恒温培养过夜。

6.2.2. 转接诱导

a) 配制M9 培养基：向1X M9 盐溶液中添加终浓度0.2%(W/V)葡萄糖、1 mMMgCl₂、0.1 mM CaCl₂、0.4%(W/V) Casein acid hydrolysate， 5 mg/L VB1， 200 μg/ml 氨苄青霉素，置37℃摇床预热；

b) 转接：将过夜培养菌液从摇床取出，按1:100 转接体系，取过夜培养产物4000rpm 离心10 min，用新鲜1X M9 盐溶液重悬，4000 rpm 离心10 min，再次重悬后转接至预热的培养基中，后置37℃摇床，225 rpm 培养24 h；

c) 诱导：向M9 培养基中补加终浓度1X TB培养基及终浓度为1 mM的IPTG和200 μg/ml的氨苄青霉素，225 rpm，25℃培养48 h(24 h 补加一次终浓度为200 μg/ml氨苄青霉素)；

d) 收样：在诱导结束后，将过夜培养物分装至离心杯，4℃，11, 000 rpm，离心15min，收集菌体。

6.2.3. 蛋白纯化

a) BugBuster裂解法样品制备

i. 裂解：表达沉淀根据每克湿重菌体加5 ml 裂解缓冲液重悬 (裂解缓冲液：用结合缓冲液稀释10X BugBuster Protein Extraction Reagent至1X，并加入终浓度100 μg/ml 溶菌酶、2 μg/ml核酸酶及1 mM PMSF)，室温中速振荡孵育1 h；

ii. 蛋白粗提液制备：将裂解的样品于4℃，12, 000 g，离心30 min，收集上清液并用0.22 μm滤膜过滤。

b) 镍柱亲和纯化

i. 平衡柱料：用5倍柱料体积的ddH₂O及平衡缓冲液平衡High Affinity Ni-NTAResin；

ii. 结合：将蛋白粗提液与适量High Affinity Ni-NTA Resin 混合，震荡孵育1h。孵育结束后，将粗提液与柱料的混合液加入PD-10空柱收集柱料，并收集流出液待下一步分析用；

iii. 洗杂：用至少50个柱体积的洗杂缓冲液洗脱杂蛋白。(洗杂过程用Bradford染液作为指示剂：5 μl 洗杂液加入200 μl Bradford染液观察是否变蓝，若变蓝，则继续进行杂蛋白洗脱至染液基本不变色，此时方可进行下一步。)；

iv. 洗脱：用至少10个柱体积的洗脱缓冲液洗脱目标蛋白。(洗脱过程用Bradford染液作为指示剂，方法同步骤iii，判断是否洗脱完全)。

c) 脱盐/缓冲液置换

i. 平衡：在ÄKTA purifier 10系统上以适当流速(0.5 ml/min)用5倍柱体积的ddH₂O及PBS平衡5 ml 的HiTrapTM Desalting柱；

ii. 上样：用适当流速(0.5 ml/min)将适量(0.5 ml)镍柱纯化后的蛋白液加入HiTrapTM Desalting柱中；

iii. 洗脱：在适当流速下(0.5 ml/min)继续用至少10倍柱体积的PBS进行洗脱，收集蛋白所在的目标紫外峰。

6.2.4. 内毒素去除及检测

a) 内毒素去除

i. 样品处理：纯化之前使用1 M氯化钠调节离子强度到0.2±0.5 M，使用0.1 M氢氧化钠或0.1 M盐酸调节pH值在7.4±0.2；

ii. 活化树脂：将PD-10 Columns垂直固定，去除预装柱顶部的盖子，加入ToxinEraser TM Endotoxin Removal 树脂，打开流速控制器，使保护液在重力作用下流干，加入5 ml的再生缓冲液，调节流速控制器，保持流速在0.25 ml/min (约10滴/min) ，待再生缓冲液流干，再加入5 ml 再生缓冲液，重复操作两次，确保体系保持无热原 (即无内毒素) 存在；

iii. 平衡树脂：PD-10 Columns活化完毕，加入6 ml的平衡缓冲液，调节流速控制器，保持流速在0.5 ml/min，流干平衡缓冲液，再按此操作重复两次；

iv. 内毒素去除：将流速控制器关闭，使用无热源枪头将样品加入，打开控制器，控制流速不高于 0.25 ml/min，流出液体积达到1.5 ml后，开始使用无热源接收管接受样品，样品流干后，再加入1.5 ml-3.0 ml平衡缓冲液淋洗，收集淋洗液。检测样品浓度及内毒素水平(洗脱过程用Bradford染液作为指示剂，判断是否收集完全)。

b) 凝胶法测定内毒素

i. 稀释样品：根据鲎试剂灵敏度(0.25 EU/ml)需要将样品稀释到合适的浓度(0.005 μg /ml；0.05 μg /ml；0.5 μg /ml；5 μg /ml)；

ii. 稀释内毒素标准品：准备好内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水复溶后置涡旋振荡器混匀15 min，再稀释至适当浓度(0.5 EU/ml)；

iii. 检测：取TAL试剂，加入100 μl细菌内毒素检查用水轻轻振摇至少30 s至试剂完全溶解，注意不要引起气泡，分别加入100 μl以下样品：阳性对照(内毒素标准品0.5EU/ml)、阴性对照(无内毒素水)、稀释后待检测样品：(1)中四个浓度待测样品，封闭管口，轻轻摇匀，垂直放置在37℃ 培养箱孵育1小时，然后取出观察；

iv. 结果记录：将试管从恒温培养箱轻轻取出，缓慢倒置试管180°，管内内容物呈现实凝胶，不变形，不从管壁滑落为阳性；其他情况则为阴性。阳性管为阳性，阴性管为阴性，同一范围内状态相同，实验有效。

6.2.5. 过滤除菌

在生物安全柜中无菌操作情况下用0.22 µm的滤器过滤样品，并取适量样品留待后续检测。

6.2.6. 浓度、纯度检测

a) 蛋白浓度测定

i. 根据提供的蛋白氨基酸序列，计算出该蛋白的吸光系数

ii. 测定蛋白溶液的紫外吸收值(A280)

iii. 根据公式算出蛋白浓度：蛋白浓度=蛋白溶液的紫外吸收值(A₂₈₀)/ 蛋白的吸光系数

b) 蛋白纯度检测

根据上述测定浓度取一定量的蛋白(如2 µg)与等量的标准蛋白(如2 µg BSA)在还原及非还原条件下进行SDS-PAGE，检测纯度及确认浓度。

实施例7. 单域抗体的HUVEC细胞增殖抑制试验

7.1. 细胞制备

将约为3 ×10⁵ HUVEC (ATCC, Cat No.PCS-100-010) 细胞复苏接种于10 cm的培养皿并每隔3-4天加入新鲜的培养基；当细胞融合程度达到85%-95%时分盘培养，并加入新鲜的培养基，7代之内的细胞会用于增殖抑制试验，一般固定在第6代。

7.2. VEGF诱导的HUVEC增殖抑制试验

分别用M199 缓冲液体 (Medium-199 1X Earle's Salts (Invitrogen # 11150-059); 10% Fetal Bovine Serum (Gibco, Cat# 10100139), heat inactivated; 10 mMHEPES (Invitrogen, Cat# 15630080);100 units/ml Penicillin 100 µg/mlStreptomycin (Invitrogen, Cat# 10378016))制备 2×VEGF和待测不同浓度的抗体样品；将50 µL 2×VEGF和各待测不同浓度的抗体样品预混合，在微孔板上设置复孔，以细胞培养基作为反应的空白对照，以Avastin作为阳性对照；将经过胰蛋白酶消解的细胞收集，用M199缓冲液清晰并重悬细胞两次，将细胞重悬至细胞密度为1×10⁵个细胞/ml后，微孔板的每个孔加入50 µL细胞重悬液；将加入细胞的微孔板置于培养中，37 °C，5% CO₂培养96小时；培养完成后使用CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay Kit(Promega, Cat No: G7571) 检测细胞存活率，同时通过PHERAStar Plus (BMG Labtech)检测检测荧光强度并记录其相对发光单位；通过以下公式计算生产抑制率，生长抑制率% =100*(1 – 相对发光单位/最大生产值)，其中相关发光单位为各样样品的测定值，最大生产值为只加入VEGF时的相对发光单位。综合最大抑制率和EC50两方面数据，从53个原核表达的单域抗体中选取4个用于构建重链抗体及后续的增殖抑制实验。

表7：HUVEC细胞增殖抑制试验的EC50值如下：

实施例8. 重链抗体的表达

将实施例7中初步筛选有一定增殖抑制功能的4个以及经过受体竞争性筛选的1个单域抗体，一起和人IgG1的Fc片段(SEQ ID NO: 60)融合构建为重链抗体，克隆入pTT5载体于HEK293E中表达纯化及内毒素去除，具体过程如下：

8.1. 试剂准备

同实施例6。

8.2. 方法与流程

8.2.1. 细胞培养

a) 将HEK293悬浮细胞从液氮或-86℃冰箱中取出后，迅速放入37℃水浴锅中，在1~2 min内将细胞融解；

b) 将融解的细胞加入10倍体积的预热FreeStyle^TM 293 Expression Medium中，轻柔颠倒混匀，低速离心收集细胞并用适量新鲜预热的培养基重悬；

c) 将重悬的细胞转入培养瓶中并在37℃，5%CO₂，110 rpm转速条件下培养。

8.2.2. 转染

a) 转染前一天，以合适密度传代HEK293悬浮细胞，转染当天细胞密度需达到1.5~2.0×10⁶个细胞/ ml，细胞活力需要大于95%；

b) 将适量的DNA与PEI以最佳比例(如1：3)于适量预热FreeStyle^TM 293Expression Medium中充分混匀，室温下静置10 分钟；

c) 将上述PEI-DNA混合物加入细胞培养物中，轻柔旋转混匀，继续在37℃, 5%CO₂，110 rpm转速条件下培养；

d) 转染后16~24小时内，加入终浓度为0.5% (w/v)的Tryptone N1；

e) 转染后第6天离心收集培养上清液并用0.22 μm滤膜过滤以待纯化。

8.2.3. 蛋白纯化

a) Protein A亲和纯化

i. 平衡柱料：用5倍柱料体积的ddH₂O及Binding Buffer平衡Protein A 柱料；

ii. 结合：过滤后的表达上清液与柱料混合后孵育结合1 h，孵育结束后将柱料装于PD-10手动纯化柱中；

iii. 洗杂：用至少30倍柱料体积的Binding Buffer洗去杂蛋白(洗杂过程用Bradford染液作为指示剂：5 μl洗杂液加入200 μl Bradford染液观察是否变蓝，若变蓝，则继续进行洗杂过程至染液基本不变色，此时方可进行下一步)；

iv. 洗脱：用至少10倍柱料体积的Elution Buffer洗脱目标蛋白并用Neutralization Buffer调节pH值至7.0左右(洗脱过程用Bradford染液作为指示剂，方法同步骤iii，判断是否洗脱完全)。

b) 脱盐/缓冲液更换：

将亲和纯化所得蛋白用HiTrap^TM Desalting柱在ÄKTA purifier 10系统上置换到PBS缓冲液中。后续的内毒素去除、过滤除菌、浓度、纯度测定等步骤同实施例6。

表8 重链抗体、单域抗体克隆号对应关系及其可变区氨基酸序列和核苷酸序列编号

单域抗体克隆号	重链抗体克隆号	氨基酸序列编号	核苷酸序列编号
				A14942	A69452	SEQ ID NO: 38	SEQ ID NO: 51
A15411	A69457	SEQ ID NO: 39	SEQ ID NO: 52
				A14972	A69462	SEQ ID NO: 40	SEQ ID NO: 53
A10981	A60724	SEQ ID NO: 41	SEQ ID NO: 54
				A15922	A80744	SEQ ID NO: 42	SEQ ID NO: 55

实施例9. 重链抗体的HUVEC细胞增殖抑制试验

将5个重链抗体(表8)共设置8个梯度稀释浓度，抗体的起始浓度为20μg/ml，1:4梯度稀释，以Avastin (A68467)作为对照，其它实验条件完全同实施例7。通过对不同浓度抗体对细胞增殖抑制的程度来判断，5个重链抗体均有不同程度的抑制功能(图11)。

表9 重链抗体样品信息

虽然本发明某些特征已经在本文中阐释和描述，但本领域技术人员将想到许多修改、替代、变更和等同。因此，应理解的是，所附权利要求书意在涵盖落入本发明真实精神范围之内的所有此类修改和变更。

Claims (5)

1.一种抗VEGF抗体，其特征在于：其由重链可变区和Fc片段组成，Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：60所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：38所示。

2.一种核酸，其编码权利要求1中的重链可变区，其序列如SEQ ID NO：51所示。

3.一种载体，其特征在于含有权利要求2所述的核酸。

4.一种宿主细胞，其表达权利要求1的抗VEGF抗体，或其包含权利要求2所述的核酸或权利要求3所述的载体。

5.一种药物组合物，所述组合物包含权利要求1的抗VEGF抗体和药学上可接受的赋形剂。