JP4526749B2 - 免疫ロゼットを用いる細胞分離法 - Google Patents
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Description
(発明の分野)
本発明は、免疫ロゼットを用いて細胞を分離する方法に関する。本発明は、本発明の方法に用いるための新規な抗体組成物を含む。
【0002】
(発明の背景)
多くの応用例において、生物試料中のある種の細胞集団を濃縮、あるいは枯渇することが望ましい。血液学、免疫学、および腫瘍学の分野は、骨髄、脾臓、胸腺、および胎児肝臓など、関連する組織からの末梢血、および細胞懸濁液の試料に依存している。これらの不均質な試料から特定の細胞型を分離することが、これらの分野での研究や、ある種の悪性疾患や免疫/造血障害の診断と治療にとって不可欠である。
【0003】
T細胞、および抗原提示細胞などの免疫細胞が精製された集団は、免疫機能の研究のために必要であり、免疫療法に用いられている。細胞、分子、および生化学的プロセスの研究では、単離された特定の細胞型を分析する必要がある。T細胞サブセット、B細胞、好塩基性細胞、NK細胞、および樹状細胞を単離するために、数多くの手法が用いられてきた。
【0004】
造血幹細胞の単離もまた、非常に関心の高い分野である。幹細胞の純粋な集団は、造血の研究を容易にすることになり、末梢血および/または骨髄由来の造血細胞の移植は、悪性、非悪性および遺伝的疾患を含む多様な疾患の治療のために、高用量化学療法および/または放射線療法と組み合わせて用いられることが多くなった。そのような移植物中には、長期の造血再構築が可能な細胞は非常に少なく、したがって造血幹細胞を精製するための手法を開発することが強く鼓舞される。さらに、移植受容者にリスクをもたらす移植組織中の細胞を除去するために用いられる手法の有効性が、重大な合併症、さらに言えば移植手法の成功を左右する。そのような細胞には、同種異系移植片における移植片対宿主病(GVHD)の原因であるTリンパ球、悪性増殖の再発を引き起こす可能性のある自己移植における腫瘍細胞が含まれる。不必要な細胞を除去して移植物の量を減らすことにより、注入される低温保存剤の量を低減することも重要である。
【0005】
場合によっては、たとえば骨髄移植組織のような生物試料から腫瘍細胞を除去する、または枯渇させることが望ましい。気管支、乳管、胃腸管および尿生殖管の上皮癌は、今日見られる固形腫瘍の主要な型である。微小転移性腫瘍細胞の移動は、上皮癌患者の予後経過を示す重要な因子であると考えられている(Braun等、2000年、Vaughan等、1990年)。そのような転移性細胞を検出する能力は、組織、または液体試料採取の有効性、および腫瘍検出法の感度によって制限される。血液試料中の循環上皮腫瘍細胞を濃縮する手法は、転移性疾患を検出する能力を高め、そのような希少な細胞の研究や、疾病の拡散を可能にする生物的変化を確定することが容易となろう。
【0006】
造血細胞、および免疫細胞は、密度などの物理特性に基づいて、および周期細胞を殺傷するある種の薬剤への感受性に基づいて分離されてきた。細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体の登場は、異なる細胞型の識別、および分離の可能性を大いに広げた。モノクローナル抗体を用いて血液、および関連する細胞懸濁液から細胞集団を分離するには、2つの基本的なアプローチがある。それらの違いは、抗体で識別/標識される細胞が所望の細胞であるか、または所望でない細胞であるかという点である。
【0007】
ポジティブ選択法では、所望の細胞を抗体で標識し、残りの標識されていない/所望でない細胞から回収する。ネガティブ選択では、所望でない細胞を標識し、除去する。抗体/補体処理や免疫毒素の使用は、ネガティブ選択法であるが、FACS選別やほとんどのバッチ式免疫吸着法は、ポジティブ選択とネガティブ選択の両方に使用することができる。免疫吸着法では、細胞はモノクローナル抗体で選択され、残りの細胞から回収することのできるもの、たとえばビーズカラム、フラスコ、磁性粒子などの表面に優先的に結合させる。免疫吸着法は、モノクローナル抗体を用い標的細胞に対する高い特異性を維持するが、FAC選別とは違って臨床採取で多量の細胞を直接に処理するためにスケールアップすることができ、かつ免疫毒素などの細胞毒性試薬は補体を用いる危険を回避できるので、臨床でも研究でも人気があった。しかしながら、免疫吸着法は、デバイスすなわち細胞を分離するための表面、たとえばビーズカラム、パンニングフラスコ、または磁石などの使用を必要とする。
【0008】
造血幹細胞、免疫細胞、および循環上皮腫瘍細胞を単離するための現在の手法はすべて、まず赤血球を除去し、次にデバイスまたは人工粒子に抗体を介して付着させる段階を含む(Firat等、1988年;de Wynter等、1975年;Shpall等、1994年;Thomas等、1994年;Miltenyi Biotec Inc.、Gladbach、Germany)。ポジティブ選択の場合、装置または粒子から細胞を回収するさらなる段階がある。これらの複数の工程はすべて時間がかかり、細胞損失を招く。Slaper−Cortenbach等(1990年)は、免疫ロゼット形成を用いて、通常急性白血病(cALL)細胞の骨髄を駆逐する方法を述べている。この方法は、最初に骨髄試料から赤血球を除去してcALL細胞に結合する抗体で標識する必要がある。次に標識赤血球を試料に戻して添加するとcALL細胞は免疫ロゼットを形成する。この枯渇方法は、続いてcALL細胞を補体を介して溶解させるとき、もっとも有効に機能する。
【0009】
密度分離は、顆粒細胞、および赤血球から末梢血単核細胞を単離するために通例用いられる。フィコール(Ficoll)(Amersham Pharmacia Biotech AB、Uppsala、Sweden)は、この用途に用いられるもっとも一般的な密度溶液である。フィコール密度分離では、全血をフィコールに重層し、次に遠心分離する。赤血球と顆粒細胞は細胞ペレットとして沈降し、単核細胞はフィコールと血漿の界面に残留する。この手法が成功するかどうかは、単核細胞と顆粒細胞の間の密度の差異にかかっている。全血が24時間より長く保存された場合顆粒細胞の密度が変化し、赤血球と共にペレットとならない。保存血液または細胞密度が変化した試料からは、1回の密度分離で純粋な単核細胞の懸濁液を得ることはできない。
【0010】
これまでに述べたように、生物試料から所望の細胞を分離する、または所望でない細胞を除去する新規な方法を提供することが当分野において求められている。
(発明の概要)
【0011】
本発明者等は、細胞を試料中に存在している赤血球と免疫ロゼット形成させることによって、その細胞を分離する方法を開発した。本発明の方法は、従来技術の方法に比べてはるかに簡単であるにもかかわらず、同等に有効な免疫アフィニティ手法である。「デバイス」、すなわち細胞懸濁液に通常存在しない人工分離表面(たとえば、磁性粒子、アフィニティカラム)を必要としない。最初に試料から赤血球を回収して抗体で標識した後にそれらを再び添加する必要もない。特定の細胞型を、試料内に存在する自己赤血球と交差結合させ、できたロゼットをその後、沈降、または遠心分離によって除去する。
【0012】
したがって、実施形態の1つでは、本発明は、
(1)有核細胞と赤血球が免疫ロゼットを形成できる条件下で、(a)少なくとも1種の、分離しようとする有核細胞上の抗原に結合する抗体と、それが直接または間接的に結合している(b)少なくとも1種の、赤血球に結合する抗体、とを含む抗体組成物に試料を接触させる段階、および
(2)試料から免疫ロゼットを除去する段階を含む、有核細胞と赤血球を含む試料から有核細胞を分離する方法を提供する。
【0013】
この方法は、ポジティブ選択とネガティブ選択プロトコルの両方に用いることができる。この方法は、全血、骨髄、胎児肝臓、臍帯血、軟膜懸濁液、胸膜および腹膜滲出液、ならびに胸腺細胞および脾細胞の試料を含む、赤血球を含有する任意の試料に用いることができる。
ここで本発明を図面に関して説明する。
【0014】
発明の詳細な説明
I.本発明の方法
前述のとおり、本発明は、細胞を赤血球と共に免疫ロゼット形成させることによって、その細胞を分離する方法に関する。
【0015】
もっとも広い態様では、本発明は、
(1)有核細胞と赤血球が免疫ロゼットを形成できる条件下で、(a)少なくとも1種の、分離しようとする有核細胞上の抗原に結合する抗体と、それが直接または間接的に結合している(b)少なくとも1種の、赤血球に結合する抗体、とを含む抗体組成物に試料を接触させる段階、および
(2)試料から免疫ロゼットを除去する段階を含む、有核細胞と赤血球を含む試料から有核細胞を分離する方法を提供する。
【0016】
この方法は、ポジティブおよびネガティブ選択プロトコルの両方に用いることができる。ポジティブ選択においては、所望の細胞がロゼットを形成する。そのような実施形態ではこの方法はさらに、免疫ロゼットの赤血球を溶解し、所望の細胞を分離する段階を含むことになる。したがって、ポジティブ選択法において、抗体組成物は、(a)試料から得るまたは分離することを所望する有核細胞に特異的な少なくとも1種の抗体を含有する。
【0017】
好ましくは本発明の方法は、ネガティブ選択プロトコルに用いられる。ネガティブ選択においては、所望の細胞は免疫ロゼット形成せず、免疫ロゼット除去後も試料中に残存する。ネガティブ選択法において抗体組成物は、(a)試料から除去することを所望する細胞に特異的な少なくとも1種の抗体を含有することになる。したがって、本発明は、
(1)所望でない細胞と赤血球が免疫ロゼットを形成できる条件下で、(a)少なくとも1種の、所望でない細胞上の抗原に結合する抗体と、それが直接または間接的に結合している(b)少なくとも1種の、赤血球に結合する抗体、とを含む抗体組成物に試料を接触させる段階、および
(2)試料から免疫ロゼットを除去する段階を含む、所望の細胞、赤血球、および所望でない細胞を含む試料において所望の細胞を濃縮し回収するためのネガティブ選択法を提供する。
【0018】
段階(1)で形成された赤血球と所望でない細胞との間の免疫ロゼットは、様々な手法を用いて所望の細胞から分離することができる。1つのやり方は、免疫ロゼットを含有する試料を、浮遊密度溶液(icoll−Hypaqueなど)に重層し、遠心分離する。免疫ロゼットはペレットとなり、所望の細胞は、浮遊密度溶液と試料との間の界面に留まる。次に所望の細胞をその後の使用のために界面から回収する。別のやりかたでは、段階(1)で得られた免疫ロゼットを含有する試料を、沈殿試薬(ヒドロキシエチルデンプン、ゼラチン、メチルセルロースなど)と混合して、ロゼットを沈降させる。懸濁状態の所望の細胞はその後の使用のために回収する。他の実施形態において、段階(1)で得られた免疫ロゼットを含有する試料を、遠心分離や向流溶離(Counter Flow Elutriation)を利用してまたは利用せずに沈降させる。所望の細胞は懸濁液中に留まり、後で使用するために回収される。
【0019】
本発明に用いる抗体組成物は、以下にさらに詳しく記載する。
本発明の方法は、血液(特に臍帯血、および全血)、骨髄、胎児肝臓、軟膜懸濁液、胸膜および腹膜滲出液、ならびに胸腺細胞および脾細胞の懸濁液を含む、赤血球を含有する生物試料の処理に用いることができる。驚いたことに、本発明者等は、この方法で前処理なしに全血または全骨髄から細胞を直接除去できることを見出した。これは、従来技術の方法と比べて、本発明の方法の著しい利点である。特に、赤血球を除去し、標識し、試料に戻して添加する必要がない。
【0020】
本発明の方法は、これに限定されるものではないが、T細胞、B細胞、NK細胞、樹状細胞、単核細胞、好塩基性細胞、マスト細胞、前駆細胞、幹細胞、および腫瘍細胞を含む任意の細胞型の濃縮された試料を調製するために用いることができる。
【0021】
一実施形態において、本発明の方法は、骨髄試料から造血前駆細胞および幹細胞標品を調製するために用いることができる。たとえば、本発明の方法は、試料からBリンパ球、Tリンパ球、単核細胞、NK細胞、顆粒細胞、および/または腫瘍細胞を枯渇させまたは除いて、移植や当分野の技術者ならすぐわかる他の治療法に用いる造血前駆細胞および幹細胞標品を調製するためのネガティブ選択プロトコルに用いることができる。たとえば、同種異系移植組織の場合、ドナーから骨髄または血液を採取し、本明細書に記載の方法によって前駆細胞および幹細胞を濃縮することができる。ネガティブ選択を用いることにより、標品中のヒト造血前駆細胞および幹細胞は抗体で被覆または変性されておらず、移植などの当分野の技術者に容易に認められる他の治療法に極めて適している。
【0022】
他の実施形態において、本発明の方法は、血液から成熟樹状細胞およびそれらの前駆体を単離回収するために用いることができる。樹状細胞は、in vitroおよびin vivoの両方でT細胞を活性化することのできる抗原提示細胞を含み、いろいろ有用な適用ができる。一例として、抗腫瘍T細胞反応を誘発するために、in vitroで樹状細胞に腫瘍抗原を負荷(パルス)し、in vivoに注入することができる。
【0023】
他の実施形態において、本発明の方法はさらに、血液や骨髄などの試料から、T細胞、B細胞、NK細胞、単核細胞、樹状細胞、好塩基性細胞、プラスマ細胞など選択された分化細胞型が濃縮された細胞標品を調製するのに用いることができる。これは、成長因子産生とその成長因子に対する反応などの特定の細胞間相互作用を研究を可能にする。さらに、特定の細胞型に関する分子的、生化学的分析を可能にする。NK細胞、樹状細胞、およびT細胞が濃縮された細胞標品は、ある種の悪性疾患に対する免疫療法に用いることもできる。
【0024】
他の実施形態において、本発明の方法は、非造血転移性腫瘍細胞などの腫瘍細胞を試料から分離するために用いることができる。この方法は、転移性疾患の診断および検出、転移性疾患の進行の監視、または治療の効能の監視を助けるために、患者の血液、骨髄、ならびに腹膜および胸膜滲出液から、非造血腫瘍細胞を検出する際に有用である。
【0025】
II.抗体組成物
本発明は、本発明の方法に用いるための抗体組成物を含む。この抗体組成物は(a)有核細胞上の抗原に結合する抗体少なくとも1種と、それが直接または間接的に結合している(b)少なくとも1種の、赤血球上の抗原に結合する抗体、とを含むことになる。
【0026】
「少なくとも1種の抗体」という用語は、その抗体組成物が、少なくとも1種類の抗体(少なくとも1つの抗体分子とは異なる)を含むことを意味する。1種類の抗体とは、特定の抗原に結合する抗体を意味する。たとえば、抗原CD2に結合する抗体は、1種類の抗体とみなされる。好ましくは、本発明の抗体組成物は、(a)有核細胞に結合する複数種の抗体を含有する。
【0027】
2種の抗体(a)および(b)は、二価抗体または二重特異性抗体を調製することによって、直接結合してもよい。2種の抗体(a)および(b)は、たとえばテトラマー抗体複合体を調製することによって、間接的に結合してもよい。これらはすべて以下に記載する。
【0028】
一態様では、有核細胞に特異的な抗体は、赤血球に特異的な抗体と直接結合している。一実施形態において、本発明の抗体組成物は、有核細胞に特異的な少なくとも1種の抗体、その抗体が直接結合している(b)赤血球に特異的な少なくとも1種の抗体、とを含む二価抗体を含有する。二価抗体は、たとえばN−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)を用いることによって、1つの抗体を他の抗体に化学的に結合することによって調製できる。
【0029】
他の実施形態において、抗体組成物は二重特異性抗体を含有する。二重特異性抗体は、赤血球に特異的な抗体の可変領域と、分離する有核細胞の表面上の少なくとも1種の抗原に特異的な可変領域とを含む。この二重特異性抗体は、ハイブリッドハイブリドーマを形成することによって調製することができる。このハイブリッドハイブリドーマは、Staerz、およびBevan(1986年、PNAS(USA)83:1453)、ならびにStaerz、およびBevan(1986年、Immunology Today 7:241)に開示されているものなど、当分野で知られている手法によって調製することができる。二重特異性抗体はまた、Staerz等(1985年、Nature 314:628)、およびPerez等(1985年、Nature 316:354)に記載されているような手法を用いて化学的手段によって、または組換え免疫グロブリン遺伝子構築体を発現させることによって構築することができる。
【0030】
他の態様において、本発明の抗体組成物は、(a)有核細胞型に特異的な少なくとも1種の抗体、その抗体が間接的に結合している(b)赤血球に特異的な少なくとも1種の抗体、とを含む。「間接的に結合」とは、抗体(a)および抗体(b)が互いに直接には共有結合してはいないが、免疫複合体などの結合部分によって連結していることを意味する。好ましい実施形態では、テトラマー抗体複合体を形成することで有核細胞型に対する抗体は赤血球に特異的な抗体に間接的に結合する。テトラマー抗体複合体は、赤血球に結合することのできる第1のモノクローナル抗体と、分離する有核細胞に結合することのできる第2のモノクローナル抗体を混合することによって調製することができる。この第1および第2のモノクローナル抗体は第1の動物種由来である。第1の動物種の抗体のFc部分に対する第2の動物種のモノクローナル抗体のほぼ等モル量を、第1および第2の抗体と反応させる。第1および第2の抗体は、第1の動物種の抗体のFc部分に対する第2の動物種のモノクローナル抗体のF(ab’)2部分と反応させることもできる(テトラマー抗体複合体、およびその調製方法の説明として参照により本明細書の一部とするLansdorpの米国特許第4868109号を参照のこと)。
【0031】
好ましくは、赤血球に特異的な抗体は、抗グリコフォリンA抗体である。本発明の抗体組成物に含まれる抗グリコフォリンA抗体は、赤血球を結合するために用いられる。グリコフォリンAに特異的なモノクローナル抗体の例は、10F7MN(米国特許第4752582号、細胞系統:ATCC受託番号HB−8162)、およびD2.10(Immunotech、Marseille、France)である。
【0032】
好ましくは、有核細胞に特異的な抗体は、抗体の組み合わせである。この抗体の組み合わせは、多くの細胞型を試料から除去することができるように、いくつかの細胞型に特異的であってよい。抗体の組み合わせを用いるとき、各抗体は赤血球に特異的な抗体に(直接、または間接的に)結合される。
【0033】
好ましい実施形態において、抗体組成物は、(a)赤血球に結合する抗グリコフォリンA抗体、(b)免疫ロゼット形成を望む有核細胞型と結合する抗体、ならびに(c)(a)および(b)両方のFc部分と結合する抗体、任意選択でF(ab’)2抗体断片でもよい、からなるテトラマー複合体である。(a):(b):(c)のモル比は、およそ1:3:4である。数種の細胞型を分離するとき、複合体は数種の抗有核細胞抗体(b)を用いて作製される。次にこの複合体を混合し、本発明の方法で用いるための抗体組成物を形成することができる。図1は、テトラマー抗体複合体によって形成されたロゼットの概略図である。
【0034】
本発明のコンテクストにおいて、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片(たとえばFabやF(ab’)2)、キメラ抗体、2価または二重特異性抗体、およびテトラマー抗体複合体を含むものと理解される。抗体は、それらが適切な親和性(結合定数)、たとえば107M−1以上、で結合する場合、有核細胞または赤血球の表面上の選択された抗原に対して反応性であると理解される。
【0035】
モノクローナル抗体は、好ましくは本発明の抗体組成物に用いられる。有核細胞の表面上の選択された抗原に特異的なモノクローナル抗体は、通常の手法を用いて容易に生成することができる。たとえば、モノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein、1975年によって最初に開発されたハイブリドーマ手法によって生成することができる(Nature 256、495〜497;参照により本明細書の一部とする米国特許RE32011、第4902614号、第4543439号、および第4411993号も参照のこと;Monoclonal Antibodies、Hybridomas:A New Dimension in Biological Analyses、Plenum Press、Kennett、McKearn、およびBechtol(編)、1980年、ならびにAntibodies:A Laboratory Manual、HarlowおよびLane(編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1988年も参照のこと)。モノクローナル抗体を構築するために、他の手法も用いることができる(たとえば、William D.Huse等、1989年、「Generation of a Large Combinational Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda」、Science 246:1275〜1281、L.Sastry等;1989年、「Cloning of the Immunological Repertoire in Escherichia coli for Generation of Monoclonal Catalytic Antibodies:Construction of a Heavy Chain Variable Region−Specific cDNA Library」、Proc.Natl.Acad.Sci USA 86:5728〜5732;Kozbor等、1983年、Immunol.Today 4、72、ヒトB細胞ハイブリドーマ手法に関して;Cole等、1985年、Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy、Allen R.Bliss,Inc.、77〜96頁、ヒトモノクローナル抗体を生成するためのEBVハイブリドーマ手法に関して、を参照のこと;さらに、Michelle Alting−Mees等、1990年、「Monoclonal Antibody Expression Libraries:A Rapid Alternative to Hybridomas」、Strategies in Molecular Biology 3:1〜9も参照のこと)。ハイブリドーマ細胞は、抗原に特異的に反応する抗体産生について免疫化学的にスクリ−ニングすることができ、モノクローナル抗体を単離することができる。
【0036】
抗体は通常の手法を用いて断片にし、全抗体に関して上述したものと同じ方法で使う断片を選別することができる。たとえば、抗体をペプシンで処理することによって、F(ab’)2断片をつくることができる。結果として生じるF(ab’)2断片は、処理してジスルフィド架橋を還元することにより、Fab’断片とすることができる。
【0037】
本発明はさらに、キメラ抗体誘導体、すなわち非ヒト動物可変領域とヒト不変領域とを合わせた抗体分子を企図する。キメラ抗体分子は、たとえばマウス、ラット、または他の種の抗体に由来する抗原結合ドメインとヒト不変領域とを含むことができる。これまでにキメラ抗体を作製するための様々なアプローチが述べられており、それを用いて、分化細胞、または腫瘍細胞表面上の選択された抗原を認識する免疫グロブリン可変領域を持つキメラ抗体を作製することができる。たとえば、Morrison等、1985年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81、6851;Takeda等、1985年、Nature 314:452;Cabilly他、米国特許第4816567号;Boss他、米国特許第4816397号;Tanaguchi他、欧州特許公開EP171496;欧州特許公開第0173494号、英国特許GB2177096Bを参照のこと。
【0038】
2価抗体は、化学的複合、体細胞ハイブリダイゼーション、または遺伝子工学手法によって調製することができる。
【0039】
化学的連結は、ε−アミノ基またはヒンジ部のチオール基と、ホモおよびヘテロ2官能性試薬の使用に基づく。5,5’−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)(DNTB)などのホモ2官能性試薬は、2つのFabの間にジスルフィド結合を生成し、0−フェニレンジマレイミド(O−PDM)は、2つのFabの間にチオエーテル結合を生成する(Brenner等、1985年、Glennie等、1987年)。N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)などのヘテロ2官能性試薬は、クラスやアイソタイプに関わらず、抗体の露出アミノ基とFab部分を連結する(Van Dijk等、1989年)。
【0040】
体細胞ハイブリダイゼーションには、クアドローマを生成する、2つの確立したハイブリドーマの融合(MilsteinおよびCuello、1983年)、またはトリオーマを生成する、第2の抗原で免疫化されたマウス由来のリンパ球と1種の確立したハイブリドーマの融合(NolanおよびKennedy、1990年)が含まれる。ハイブリッドハイブリドーマは、特定の薬剤耐性マーカに耐性の各ハイブリドーマ細胞系統を作ることによって(De Lau等、1989年)、または各ハイブリドーマを異なる蛍光色素で標識し、ヘテロ蛍光細胞を選別することによって(Karawajew等、1987年)選択される。
【0041】
遺伝子工学には、プラスミドに特定の抗体断片をコードするDNA配列とプラスミドを連結し、組換えタンパク質を発現させる組換えDNAに基づく技術を使用することが含まれる。二重特異性抗体はまた、リンカーを用いて2つの1本鎖Fv(scFv)断片をつなぐことによって単一共有結合構造とする(WinterおよびMilstein、1991年)、転写因子fosおよびjun由来のロイシンジッパー共発現配列とする(Kostelny等、1992年)、p53の相互作用領域を共発現するヘリックス−ターン−ヘリックスとする(Rheinnecker等、1996年)、またはダイアボディとする(Holliger等、1993年)ことにより作製することもできる。
【0042】
表1は、本発明の方法に用いることのできる、有核細胞上の特定のヒト抗原に対する抗体の例を示す。本発明の方法は、他の種に関しても用いることができる。有核細胞に対する1種または複数の抗体の選択は、試料の性質、濃縮または枯渇する細胞の選択、方法がポジティブかネガティブ選択プロトコルであるかによって決まることになる。すべての場合において、免疫ロゼットが形成される有核細胞に対する抗体(または複数の抗体)は、本発明の方法に用いられるとき、赤血球に特異的な抗体に直接または間接に結合することになる。
【0043】
本発明の方法および抗体組成物は、好ましくは、特定の細胞型に関して濃縮された細胞標品を調製するためにネガティブ選択プロトコルにおいて用いられる。これは、単離したい特定の細胞型に対する抗体を欠く抗体組成物を用いることによって達成される。したがって、本発明は、(a)所望でない細胞上の抗原に結合する少なくとも1種の抗体、その抗体が結合している(b)赤血球に結合する少なくとも1種の抗体、とを含む、所望の細胞、赤血球および所望でない細胞を含有する試料中において、所望の細胞を濃縮し回収するための抗体組成物を提供する。ヒトの細胞に関して本発明のネガティブ選択プロトコルにおいて用いることのできる抗体組成物の特定の実施形態を、表2に記載する。この表は、特定の細胞型を濃縮する上述の方法において抗体(a)として用いることのできる、特定の抗原に対する抗体のリストまたはカクテルを提供する。ほとんどの場合において、必須の抗体に関するいくつかの選択、ならびにいくつかの任意選択の抗体を提供する。たとえば、T細胞を濃縮する場合、抗体(a)は、(1)CD16および/またはCD66bおよび/またはCD11bおよび/またはCD15、(2)CD19および/またはCD20および/またはCD21および/またはCD22および/またはCD24および/またはIg、ならびに(3)CD36および/またはCD14に対する抗体のカクテルであることができる。このカクテルは任意選択で、CD33および/またはCD56および/またはIgEおよび/またはCD41に対する抗体を含むことができる。表2に挙げた抗体の組み合わせに加えて、参照により本明細書の一部とする米国特許第5877299号に記載されているような特定の細胞型を濃縮するために他の抗体組み合わせを用いてよいことを、当分野の技術者は理解するであろう。本発明は細胞濃縮標品を調製するための免疫ロゼットの形成に関するので、当分野の技術者は、他の抗体や抗体組み合わせを用いてもよいことが理解できよう。
【0044】
本発明の方法および抗体組成物は、細胞標品を調製するために、所望の細胞が免疫ロゼット形成されるポジティブ選択プロトコルに用いることができる。ポジティブ選択プロトコルに有用な抗体組み合わせのいくつかの例を以下に記載する。
【0045】
ポジティブ選択プロトコルで非造血性腫瘍細胞を分離するための抗体組成物は、腫瘍細胞に発現した非造血性抗原に特異的な抗体、たとえば乳癌や肺癌腫、ならびに神経芽腫細胞の表面上に発現した抗原に対する抗体などを含む。上皮腫瘍細胞に発現した非造血抗原に対する抗体は、(たとえば、表3に示したように)市販品製造元から入手でき、あるいは当分野で知られている手法を用いて調製することもできる。
【0046】
ポジティブ選択プロトコルでB細胞を分離するには抗体組成物は、CD24および/またはCD19および/またはCD20および/またはCD22に対する抗体を含有する。
【0047】
ポジティブ選択プロトコルでT細胞を分離するには、抗体組成物はCD3および/またはCD2および/またはCD5および/または、CD4およびCD8の両方に対する抗体を含有する。
【0048】
ポジティブ選択プロトコルでNK細胞を分離するには、抗体組成物はCD56に対する抗体を含有する。
【0049】
ポジティブ選択プロトコルで顆粒細胞を分離するには、抗体組成物はCD16および/またはCD66eおよび/またはCD66bに対する抗体を含有する。
【0050】
ポジティブ選択プロトコルで単核細胞を分離するには、抗体組成物はCD14に対する抗体を含有する。
以下の非限定的な実施例は本発明を例示するものである。
【0051】
【実施例】
実施例1
テトラマーの調製
本発明の方法に使用するテトラマー抗体複合体を調製するために、以下のプロトコルを用いることができる。(a)ロゼット形成する細胞に特異的な抗体(たとえば、抗CD2、CD3、CD4、CD8、CD14、CD16、CD19など)1mgを取る。(b)3mgの抗グリコフォリンA抗体(対赤血球)を添加し、充分に混合する。(c)次に4.0mgのP9抗体、または2.72mgのP9F(ab’)2抗体断片を添加する。37℃で一晩インキュベートする。P9抗体は、段階(a)および(b)で添加した抗体のFc部分に結合し、テトラマー抗体複合体を生じる。テトラマーの調製に関するさらなる情報は、参照により本明細書の一部とするLansdorpの米国特許第4868109号を参照されたい。有核細胞に発現した抗原に対する異なる抗体を包含するテトラマー抗体複合体は別々に調製し、その後混合する。
この抗体組成物は、枯渇を望む細胞に応じて、種々のテトラマー抗体複合体を合わせることによって作製する。種々のテトラマー抗体複合体の濃度は多様であり、典型的に、有核細胞に発現した抗原に対する抗体は、テトラマー複合体中10〜30μg/mlである。次にこの組成物を細胞中1/10に希釈し、それにより細胞懸濁液中の各抗有核細胞抗体の最終濃度は1.0〜3.0μg/mlとなる。
【0052】
実施例2
フィコールを用いる免疫ロゼット法
フィコールハイペークを用いて、全末梢血から細胞を免疫ロゼット形成させるためのネガティブ選択プロトコルを以下に述べる。
1.全末梢血1ml当たり100μlの抗体組成物を添加する。
2.室温で20分インキュベートする。
3.等量のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)+2%子ウシ胎児血清(FCS)で試料を希釈し、緩やかに混合する。
4.フィコールハイパークの上部に希釈試料を加層するか、または希釈試料の下部にフィコールを加層する。
5.ブレーキなし、室温、1200×gで20分間、遠心分離する。
6.フィコール、プラスマ界面から濃縮細胞を除去する。
7.濃縮細胞を5〜10倍量のPBS+2%FBSで洗浄する。
注:単核細胞や他の付着細胞を濃縮する場合、1mMのEDTAを全血試料、およびすべての洗浄/希釈溶液に添加する。
【0053】
実施例3
ヘタスターチ(hetastarch)沈降を用いる免疫ロゼット法
ヘタスターチを用いて、全末梢血から細胞を免疫ロゼット形成させるためのネガティブ選択プロトコルを以下に述べる。ヘタスターチは、凝集作用によって赤血球沈降速度を高める化合物の1つである。
1.血液5ml当たり1mlの食塩水中6%ヘタスターチを添加し、混合する。
2.各抗有核細胞抗体の最終濃度が1.0〜2.0μg/mlとなるように、実施例1に記載した抗体組成物を全血に添加する。
3.室温で10分インキュベートする。
4.室温、50×gで5分間、遠心分離する。
5.上澄みを除去する。この分画は濃縮細胞を含有する。
6.濃縮細胞分画を2〜5倍量のPBS+2%ウシ胎児血清(FBS)で洗浄する。
【0054】
実施例4
ヘタスターチ/イオジキサノール混合物を用いる免疫ロゼット法
全末梢血から細胞を免疫ロゼット形成させるためのネガティブ選択プロトコルを以下に述べる。
1.血液5ml当たり1mlの食塩水中6%ヘタスターチを添加し、混合する。
2.0.6mlの60%w/vイオジキサノールを添加し混合する。イオジキサノールは、水溶液密度を相当に高める化合物の1つである。
3.各抗有核細胞抗体の最終濃度が1.0〜2.0μg/mlとなるように、実施例1に記載した抗体組成物を全血に添加する。
3.室温で10分インキュベートする。
4.室温、50×gで5分間、遠心分離する。
5.上澄みを回収する。この分画は濃縮細胞を含有する。
6.濃縮細胞分画を2〜5倍量のPBS+2%FBSで洗浄する。
【0055】
実施例5
免疫ロゼット法 ポジティブ選択
全末梢血から細胞を免疫ロゼット形成させるためのポジティブ選択プロトコルを以下に述べる。
1.1mlの血液を取りわけておく。
2.10mlの血液をフィコールパーク(Ficoll−Paque)に重層し、ブレーキなし、室温、1200×gで、20分間、遠心分離する。
3.フィコール−血漿界面のMNC層をとり、PBS+2%FBSで洗浄する。
4.細胞をカウントし、1×108/mlになるよう再懸濁する。
5.試料の量を測定し、量Aとする。
6.段階1で取っておいた血液0.2mlを添加する。
7.PBS+2%FBSで、全量を量Aの2倍にする。
8.実施例1に合成を記載した、所与の抗原に特異的なテトラマー抗体複合体を、最終濃度1.0μg/mlで添加する。
9.室温で20分インキュベートする。
10.PBS+2%FBSで2倍に希釈し、密度1.085g/ml、オスモル濃度280mOsmに調製したパーコール(Percoll)に重層する。
11.段階2のとおり、1200×gで20分間、遠心分離する。
12.上澄みを捨て、濃縮細胞を含有するペレットを再懸濁する。
13.赤血球を塩化アンモニウム溶液で溶解し、PBS+2%FBSで洗浄する。
【0056】
実施例6
T細胞の濃縮 フィコールを用いる免疫ロゼット形成
本実施例は、実施例2に記載した方法を用いる、全末梢血からのT細胞の濃縮を例示する。CD16、CD19、CD36、およびCD56に対する抗体を含有するテトラマー抗体複合体のT細胞濃縮カクテルを調製した。表4に示した結果は、本発明の方法が50%に近い回収率で、T細胞の純度95%をもたらすことを示す。
【0057】
実施例7
CD8+T細胞の濃縮 フィコールを用いる免疫ロゼット形成
本実施例は、実施例2に記載した方法を用いる、全末梢血からのCD8+T細胞の濃縮を例示する。テトラマー抗体複合体の2種のカクテルを試験した。1つのカクテルは、CD4、CD16、CD19、CD36、およびCD56に対する抗体を含有し、もう一方は、CD4、CD16、CD19、CD36、CD56、およびIgEに対する抗体を含有した。表5に示した結果は、カクテルに抗IgEを添加することで、回収率に影響を及ぼさず、CD8+T細胞の純度が向上することを示す。
【0058】
実施例8
CD4+T細胞の濃縮 フィコールを用いる免疫ロゼット形成
本実施例は、実施例2に記載した方法を用いる、全末梢血からのCD4+T細胞の濃縮を例示する。テトラマー抗体複合体の2種のCD4T細胞濃縮カクテルを調製した。1つのカクテルは、CD8、CD16、CD19、CD36、およびCD56に対する抗体を含有した。もう一方のカクテルは、CD8、CD16、CD19、CD36、CD56、およびIgEに対する抗体を含有した。表6に示した結果は、本発明の方法が回収率46%で、CD4+T細胞の純度93%をもたらし、かつ濃縮カクテルに抗IgEを添加することで、CD4+T細胞の純度が向上することを示す。
【0059】
実施例9
B細胞の濃縮 フィコールを用いる免疫ロゼット形成
本実施例は、実施例2に記載した方法を用いる、全末梢血からのB細胞の濃縮を例示する。テトラマー抗体複合体の2種のB細胞濃縮カクテルを調製した。1つのカクテルは、CD2、CD3、CD16、CD36、およびCD56に対する抗体を含有した。もう一方のカクテルは、CD2、CD3、CD16、CD36、CD56、およびIgEに対する抗体を含有した。表7に示した結果は、本発明の方法が回収率43%で、B細胞の純度88%をもたらし、かつカクテルに抗IgEを添加することで、B細胞の純度が向上することを示す。
【0060】
実施例10
NK細胞の濃縮−フィコールを用いる免疫ロゼット形成
本実施例は、実施例2に記載した方法を用いる、全末梢血からのNK細胞の濃縮を例示する。テトラマー抗体複合体の2種のNK細胞濃縮カクテルを調製した。1つのカクテルは、CD3、CD4、CD19、CD66b、およびCD36に対する抗体を含有した。もう一方のカクテルは、CD3、CD4、CD19、CD66b、CD36、およびIgEに対する抗体を含有した。表8に示した結果は、本発明の方法が回収率44%で、NK細胞の純度74%をもたらし、かつカクテルに抗IgEを添加することで、純度は向上するが、回収率が低下することを示す。
【0061】
実施例11
前駆細胞の濃縮
本実施例は、実施例2に記載した方法を用いる、全臍帯血からの前駆細胞の濃縮を例示する。テトラマー抗体複合体の2種の異なるカクテル、
(a)CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD24、CD56、およびCD66bに対するテトラマー抗体複合体を含有する前駆細胞濃縮カクテル、
(b)CD2、CD14、CD19、およびCD66bに対するテトラマー抗体複合体を含有する減量(debulking)カクテルを用いた。
表9に示した結果は、本発明の方法が、広範な前駆細胞濃縮カクテルの場合、回収率53%で、CD34+細胞の純度29%のをもたらし、4抗体減量カクテルの場合、純度はわずか5%、回収率45%となることを示す。
【0062】
実施例12
単核細胞の濃縮 フィコールを用いる免疫ロゼット形成
本実施例は、実施例2に記載した方法を用いる、全末梢血からの単核細胞の濃縮を例示する。テトラマー抗体の単核細胞濃縮カクテルをいくつか調製した(表10を参照)。表10に示した結果は、本発明の方法がCD14+の回収率65%で、CD14+細胞の純度76%をもたらし、抗CD8または抗IgEの添加は単核細胞の純度を向上させたが、抗CD8とIgE両方の添加は付加的な効果を有さなかったことを示す。
【0063】
実施例13
非造血腫瘍細胞の濃縮
本実施例は、実施例2に記載した方法を用いる、全末梢血からの乳癌細胞の濃縮を例示する。CAMA乳癌細胞系統由来の細胞を、頻度1/103、1/104、および1/105で全末梢血の試料に接種した。テトラマー抗体複合体の3種の腫瘍細胞濃縮カクテルを調製した。このカクテルの抗体組成を表11に記載する。表12に示した結果は、本発明の方法が、腫瘍細胞の回収率20〜50%で、2logを超える腫瘍細胞の濃縮をもたらすことを示す。より広範なカクテルは、より高度の腫瘍細胞の濃縮をもたらす。
【0064】
実施例14
T細胞の濃縮−抗CD36による抗CD14代替の効果
本実施例は、抗CD14を抗CD36に変えて濃縮カクテルを変更したとき、実施例2に記載した方法を用いる全末梢血からのT細胞の濃縮が向上することを例示する。表13の結果は、抗体を置き換えた場合、CD3+の純度%が24%増加することを示している。
【0065】
実施例15
ヘタスターチ沈降を用いる特定細胞集団の濃縮
本実施例は、実施例3に記載した方法を用いる、全末梢血からの多様な細胞集団の濃縮を例示する。
CD16、CD19、CD36、およびCD56に対する抗体を含有するテトラマー抗体複合体のT細胞濃縮カクテルを調製した。本発明の方法は、回収率60%で、95%を超えるT細胞の純度をもたらす。
CD2、CD3、CD16、CD36、およびCD56に対する抗体を含有するテトラマー抗体複合体のB細胞濃縮カクテルを調製した。本発明の方法は、回収率39%で、B細胞の純度75%をもたらす。
CD3、CD4、CD19、CD36、およびCD66bに対する抗体を含有するテトラマー抗体複合体のNK細胞濃縮カクテルを調製した。本発明の方法は、回収率27%で、NK細胞の純度65%をもたらす。
【0066】
実施例16
ヘタスターチ/イオジキサノール混合物を用いる特定細胞集団の濃縮
本実施例は、実施例4に記載した方法を用いる、全末梢血からの多様な細胞集団の濃縮を例示する。表14に記載した結果を以下に要約する。
CD16、CD19、CD36、およびCD56に対する抗体を含有するテトラマー抗体複合体のT細胞濃縮カクテルを調製した。本発明の方法は、回収率61%で、T細胞の純度95%をもたらす。
CD8、CD16、CD19、CD36、およびCD56に対する抗体を含有するテトラマー抗体複合体のCD4+T細胞濃縮カクテルを調製した。本発明の方法は、回収率64%で、CD4+T細胞の純度89%をもたらす。
CD4、CD16、CD19、CD36、およびCD56に対する抗体を含有するテトラマー抗体複合体のCD8+T細胞濃縮カクテルを調製した。本発明の方法は、回収率43%で、CD8+T細胞の純度80%をもたらす。
CD2、CD3、CD16、CD36、およびCD56に対する抗体を含有するテトラマー抗体複合体のB細胞濃縮カクテルを調製した。本発明の方法は、回収率58%で、B細胞の純度84%をもたらす。
CD3、CD4、CD19、CD36、およびCD66bに対する抗体を含有するテトラマー抗体複合体のNK細胞濃縮カクテルを調製した。本発明の方法は、回収率50%で、NK細胞の純度80%をもたらす。
【0067】
実施例17
異なる成層媒質を用いる免疫ロゼット形成
本実施例は、段階4のフィコールハイペークを異なる媒質に替えることによって、実施例2の方法を変更できることを例示する。フィコールの密度は1.077g/ml、オスモル濃度は約300mOsmであった。パーコールとイオジキサノールの溶液を、密度1.085g/ml、オスモル濃度は280mOsmで調製した。CD2、CD3、CD16、CD36、およびCD56に対する抗体複合体を含有するB細胞濃縮カクテルを調製した。
表15に示した2つの別の試料に関するB細胞濃縮の結果は、より高い密度の別の成層媒質を使用することによって、B細胞の純度を低下させることなく、B細胞の回収率を増大できることを示す。
【0068】
実施例18
免疫ロゼットを用いるT細胞の駆逐
本実施例は、実施例2に記載した方法を用いる、全末梢血からのT細胞の除去を例示する。CD3に対するテトラマー抗体複合体のT細胞駆逐カクテルを調製した。本発明の方法は、2.3logでCD3+細胞の枯渇をもたらした。
【0069】
実施例19
免疫ロゼットを用いるB細胞の駆逐
本実施例は、実施例2に記載した方法を用いる、全末梢血からのB細胞の除去を例示する。CD19に対するテトラマー抗体複合体のB細胞駆逐カクテルを調製した。本発明の方法は、3.0logでCD19+細胞の枯渇をもたらした。
【0070】
実施例20
免疫ロゼット形成を用いる乳癌細胞の駆逐
本実施例は、実施例2に記載した方法を用いる、1〜5%CAMA乳癌細胞を接種した全末梢血からの乳癌細胞の除去を例示する。抗乳癌抗体5E11、およびBRST1を含有するテトラマー抗体複合体の駆逐カクテルを調製した。表16に示した結果は、本発明の方法が1.0〜1.4logで乳癌細胞の枯渇をもたらすことを示す。
【0071】
実施例21
あらかじめ保存された全末梢血からの顆粒細胞の除去
全末梢血試料中の顆粒細胞の密度は、24時間を超える保存によって減少する。新鮮全血から赤血球と顆粒細胞を除去するために通例用いられる密度分離方法は、保存された血液試料からは有効に顆粒細胞を除去しない。保存顆粒細胞の沈降速度を、免疫ロゼット形成によって、標準フィコール密度分離(1.077g/ml)で有効に除去できるように増大することができる。本実施例は、実施例2に記載した方法を用いる、保存(48時間)全末梢血からの顆粒細胞の除去を例示する。CD66bに対するテトラマー抗体複合体を含有する顆粒細胞枯渇カクテルを調製した。表17に示した結果は、本発明の方法が1.8〜2.6logの顆粒細胞の枯渇をもたらすことを示す。
【0072】
実施例22
免疫ロゼット形成を用いる特定細胞集団のポジティブ選択
本実施例は、実施例5に記載したポジティブ選択方法を用いる、全末梢血からのCD8+の濃縮を例示する。CD8に対するテトラマー抗体複合体を調製した。本発明の方法はCD8+の濃縮をもたらし、単核細胞分画%は最初の25%からペレット中の32%となる。
【0073】
現在好ましいとみなされる実施例に関して本発明を述べたが、本発明は開示された実施例に限定されないものであると理解される。それとは反対に、本発明は添付される請求の範囲の精神および範囲内に包含される多様な修正、および同等の翻案を含むことを意図する。
【0074】
すべての出版物、特許、および特許出願は、それぞれ個々の出版物、特許、または特許出願が、完全な形で参照により組み込まれると明確かつ個別に指示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
表4
表5
表6
表7
表8
表9
表10
表11
表12
表13
表14
表15
表16
表17
本明細書で参照した参考文献のリスト
1. Braun等、N.Engl.J.Med.、342:525:533
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【図面の簡単な説明】
【図1】 テトラマー抗体複合体を用いて所望でない有核細胞の周囲に形成した赤血球のロゼットの概略図である。
Claims (74)
- 所望の細胞、赤血球、および所望でない細胞を含有する試料において所望の細胞を濃縮し回収するネガティブ選択方法であって、
(1)所望でない細胞と赤血球とが免疫ロゼットを形成可能な条件下で、(a)少なくとも1種の、所望でない細胞上の抗原に結合する抗体と、それが直接または間接的に結合している(b)少なくとも1種の、赤血球に結合する抗体、とを含む抗体組成物に試料を接触させる段階、および
(2)試料から免疫ロゼットを分離して所望の細胞が濃縮された試料を得る段階を含む方法。 - 段階(2)において免疫ロゼットが密度分離によって分離される請求項1に記載の方法。
- 段階(2)において免疫ロゼットが沈降によって分離される請求項1に記載の方法。
- 抗体(a)が、(1)CD2、CD3およびCD5からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(2)CD19、CD20、CD21、CD22およびCD24からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、ならびに(3)CD66bおよびCD16からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、を含む抗体組成物である、単核細胞を濃縮し回収するための請求項1に記載の方法。
- 抗体(a)が、さらにCD56および/またはCD8に結合することのできる抗体を含む請求項4に記載の方法。
- 抗体(a)が、(1)CD2、CD3、ならびにCD4およびCD8の両方、からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(2)CD16、CD66b、CD11bおよびCD15からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、ならびに(3)CD36およびCD14からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体を含む抗体組成物である、B細胞を濃縮し回収するための請求項1に記載の方法。
- 抗体(a)が、さらにCD56に結合することのできる抗体を含む請求項6に記載の方法。
- 抗体(a)が、(1)CD16、CD66b、CD11bおよびCD15からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(2)CD19、CD20、CD21、CD22、CD24およびIgからなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、ならびに(3)CD36およびCD14からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体を含む抗体組成物である、T細胞を濃縮および回収するための請求項1に記載の方法。
- 抗体(a)が、さらにCD56に結合することのできる抗体を含む請求項8に記載の方法。
- 抗体(a)が、(1)CD8に結合することのできる抗体、(2)CD16、CD66b、CD11bおよびCD15からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(3)CD19、CD20、CD21、CD22、CD24およびIgからなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、ならびに(4)CD36およびCD14からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体を含む抗体組成物である、CD4+T細胞を濃縮し回収するための請求項1に記載の方法。
- 抗体(a)が、さらにCD56に結合することのできる抗体を含む請求項10に記載の方法。
- 抗体(a)が、(1)CD4に結合することのできる抗体、(2)CD16、CD66b、CD11bおよびCD15からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(3)CD19、CD20、CD21、CD22、CD24およびIgからなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、ならびに(4)CD36およびCD14からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体を含む抗体組成物である、CD8+T細胞を濃縮し回収するための請求項1に記載の方法。
- 抗体(a)が、さらにCD56に結合することのできる抗体を含む請求項12に記載の方法。
- 抗体(a)が、(1)CD3に結合することのできる抗体、(2)CD66bおよびCD15からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(3)CD19、CD20、CD21、CD22およびCD24からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、ならびに(4)CD36およびCD14からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体を含む抗体組成物である、NK細胞を濃縮し回収するための請求項1に記載の方法。
- 抗体(a)が、さらにCD4に結合することのできる抗体を含む請求項14に記載の方法。
- 抗体(a)が、(1)CD3に結合することのできる抗体、(2)CD2に結合することのできる抗体、(3)CD14に結合することのできる抗体、(4)CD15に結合することのできる抗体、(5)CD16に結合することのできる抗体、(6)CD19に結合することのできる抗体、(7)CD24に結合することのできる抗体、(8)CD34に結合することのできる抗体、(9)CD36に結合することのできる抗体、(10)CD56に結合することのできる抗体、および(11)CD45RAに結合することのできる抗体を含む抗体組成物である、好塩基性細胞を濃縮し回収するための請求項1に記載の方法。
- 抗体(a)が、(1)CD3に結合することのできる抗体、(2)CD14に結合することのできる抗体、(3)CD16に結合することのできる抗体、(4)CD19に結合することのできる抗体、(5)CD34に結合することのできる抗体、(6)CD56に結合することのできる抗体、および(7)CD66bに結合することのできる抗体を含む抗体組成物である、樹状細胞を濃縮し回収するための請求項1に記載の方法。
- 抗体(a)が、(1)CD2およびCD3からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(2)CD16およびCD66bからなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(3)CD19およびCD24からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、ならびに(4)CD14に結合することのできる抗体を含む抗体組成物である、造血前駆細胞を濃縮し回収するための請求項1に記載の方法。
- 抗体(a)が、さらにCD56に結合することのできる抗体を含む請求項18に記載の方法。
- 抗体(a)が、(1)CD2およびCD3からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(2)CD16およびCD66bからなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(3)CD19およびCD24からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(4)CD14に結合することのできる抗体、(5)CD45RAに結合することのできる抗体、(6)CD33に結合することのできる抗体、ならびに(7)CD10に結合することのできる抗体を含む抗体組成物である、赤血球前駆細胞を濃縮し回収するための請求項1に記載の方法。
- 抗体(a)が、さらにCD56に結合することのできる抗体を含む請求項20に記載の方法。
- 抗体(a)が、(1)CD2およびCD3からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(2)CD16およびCD66bからなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(3)CD19およびCD24からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(4)CD14に結合することのできる抗体、(5)CD71に結合することのできる抗体、ならびに(6)CD10に結合することのできる抗体を含む抗体組成物である、骨髄前駆細胞を濃縮し回収するための請求項1に記載の方法。
- 抗体(a)が、さらにCD56に結合することのできる抗体を含む請求項22に記載の方法。
- 抗体(a)が、(1)CD2およびCD3からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(2)CD16およびCD66bからなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(3)CD19およびCD24からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(4)CD14に結合することのできる抗体、(5)CD45RAに結合することのできる抗体、ならびに(6)CD10に結合することのできる抗体を含む抗体組成物、巨核球前駆細胞を濃縮し回収するための請求項1に記載の方法。
- 抗体(a)が、さらにCD56に結合することのできる抗体を含む請求項24に記載の方法。
- 抗体(a)が、(1)CD45に結合することのできる抗体、および(2)CD66bに結合することのできる抗体を含む抗体組成物である、非造血腫瘍細胞を濃縮し回収するための請求項1に記載の方法。
- 抗体(a)が、さらにCD2、CD16、CD19、CD36、およびCD38からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体を含む抗体組成物である、請求項26に記載の方法。
- 抗体(a)が、(1)CD45に結合することのできる抗体、および(2)CD66bに結合することのできる抗体を含む抗体組成物である、上皮腫瘍細胞を濃縮し回収するための請求項1に記載の方法。
- 抗体(a)が、さらにCD2、CD16、CD19、CD36およびCD38からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体を含む抗体組成物である請求項28に記載の方法。
- 抗体(a)が、抗原CD66b、およびCD66abceからなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体を含む抗体組成物である、顆粒細胞を含有する試料から単核細胞を濃縮し回収するための請求項1に記載の方法。
- 試料が保存された全血または臍帯血である請求項30に記載の方法。
- 試料中の顆粒細胞の密度が、新鮮血液からの顆粒細胞の密度よりも低い請求項31に記載の方法。
- 抗体組成物がテトラマー抗体複合体を含み、テトラマー抗体複合体が(a)所望でない細胞上の抗原に結合する抗体、(b)赤血球に結合する抗体、ならびに(c)(a)および(b)で定義された抗体のFc部分に結合する2種の抗体を含み、(a)および(b)の抗体が同一の動物種の抗体であり、(c)の抗体が(a)および(b)の抗体と異なる動物種の抗体である、請求項1に記載の方法。
- 所望の細胞、赤血球、および所望でない細胞を含有する試料において単核細胞を濃縮し回収するための組成物であって、(a)(1)CD2、CD3およびCD5からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(2)CD19、CD20、CD21、CD22およびCD24からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、ならびに(3)CD66bおよびCD16からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、を含む抗体組成物、ならびに(a)が直接的または間接的に連結されている(b)赤血球に結合する少なくとも1種の抗体、を含んでなる組成物。
- 抗体組成物(a)が、さらにCD56および/またはCD8に結合することのできる抗体を含む請求項34に記載の組成物。
- 所望の細胞、赤血球、および所望でない細胞を含有する試料においてB細胞を濃縮し回収するための組成物であって、(a)(1)CD2、CD3、ならびにCD4およびCD8の両方、からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(2)CD16、CD66b、CD11bおよびCD15からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、ならびに(3)CD36およびCD14からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、を含む抗体組成物、ならびに(a)が直接的または間接的に連結されている(b)赤血球に結合する少なくとも1種の抗体、を含んでなる組成物。
- 抗体組成物(a)が、さらにCD56に結合することのできる抗体を含む請求項36に記載の組成物。
- 所望の細胞、赤血球、および所望でない細胞を含有する試料においてT細胞を濃縮し回収するための組成物であって、(a)(1)CD16、CD66b、CD11bおよびCD15からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(2)CD19、CD20、CD21、CD22、CD24およびIgからなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、ならびに(3)CD36およびCD14からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、を含む抗体組成物、ならびに(a)が直接的または間接的に連結されている(b)赤血球に結合する少なくとも1種の抗体、を含んでなる組成物。
- 抗体組成物(a)が、さらにCD56に結合することのできる抗体を含む請求項38に記載の組成物。
- 所望の細胞、赤血球、および所望でない細胞を含有する試料においてCD4+T細胞を濃縮し回収するための組成物であって、(a)(1)CD8に結合することのできる抗体、(2)CD16、CD66b、CD11bおよびCD15からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(3)CD19、CD20、CD21、CD22、CD24およびIgからなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、ならびに(4)CD36およびCD14からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、を含む抗体組成物、ならびに(a)が直接的または間接的に連結されている(b)赤血球に結合する少なくとも1種の抗体、を含んでなる組成物。
- 抗体組成物(a)が、さらにCD56に結合することのできる抗体を含む請求項40に記載の組成物。
- 所望の細胞、赤血球、および所望でない細胞を含有する試料においてCD8+T細胞を濃縮し回収するための組成物であって、(a)(1)CD4に結合することのできる抗体、(2)CD16、CD66b、CD11bおよびCD15からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(3)CD19、CD20、CD21、CD22、CD24およびIgからなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、ならびに(4)CD36およびCD14からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、を含む抗体組成物、ならびに(a)が直接的または間接的に連結されている(b)赤血球に結合する少なくとも1種の抗体、を含んでなる組成物。
- 抗体組成物(a)が、さらにCD56に結合することのできる抗体を含む請求項42に記載の組成物。
- 所望の細胞、赤血球、および所望でない細胞を含有する試料においてNK細胞を濃縮し回収するための組成物であって、(a)(1)CD3に結合することのできる抗体、(2)CD66bおよびCD15からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(3)CD19、CD20、CD21、CD22およびCD24からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、ならびに(4)CD36およびCD14からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、を含む抗体組成物、ならびに(a)が直接的または間接的に連結されている(b)赤血球に結合する少なくとも1種の抗体、を含んでなる組成物。
- 抗体組成物(a)が、さらにCD4に結合することのできる抗体を含む請求項44に記載の組成物。
- 所望の細胞、赤血球、および所望でない細胞を含有する試料において好塩基性細胞を濃縮し回収するための組成物であって、(a)(1)CD3に結合することのできる抗体、(2)CD2に結合することのできる抗体、(3)CD14に結合することのできる抗体、(4)CD15に結合することのできる抗体、(5)CD16に結合することのできる抗体、(6)CD19に結合することのできる抗体、(7)CD24に結合することのできる抗体、(8)CD34に結合することのできる抗体、(9)CD36に結合することのできる抗体、(10)CD56に結合することのできる抗体、および(11)CD45RAに結合することのできる抗体、を含む抗体組成物、ならびに(a)が直接的または間接的に連結されている(b)赤血球に結合する少なくとも1種の抗体、を含んでなる組成物。
- 所望の細胞、赤血球、および所望でない細胞を含有する試料において樹状細胞を濃縮し回収するための組成物であって、(a)(1)CD3に結合することのできる抗体、(2)CD14に結合することのできる抗体、(3)CD16に結合することのできる抗体、(4)CD19に結合することのできる抗体、(5)CD34に結合することのできる抗体、(6)CD56に結合することのできる抗体、および(7)CD66bに結合することのできる抗体、を含む抗体組成物、ならびに(a)が直接的または間接的に連結されている(b)赤血球に結合する少なくとも1種の抗体、を含んでなる組成物。
- 所望の細胞、赤血球、および所望でない細胞を含有する試料において造血前駆細胞を濃縮し回収するための組成物であって、(a)(1)CD2およびCD3からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(2)CD16およびCD66bからなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(3)CD19およびCD24からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、ならびに(4)CD14に結合することのできる抗体、を含む抗体組成物、ならびに(a)が直接的または間接的に連結されている(b)赤血球に結合する少なくとも1種の抗体、を含んでなる組成物。
- 抗体組成物(a)が、さらにCD56に結合することのできる抗体を含む請求項48に記載の組成物。
- 所望の細胞、赤血球、および所望でない細胞を含有する試料において赤血球前駆細胞を濃縮し回収するための組成物であって、(a)(1)CD2およびCD3からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(2)CD16およびCD66bからなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(3)CD19およびCD24からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(4)CD14に結合することのできる抗体、(5)CD45RAに結合することのできる抗体、(6)CD33に結合することのできる抗体、ならびに(7)CD10に結合することのできる抗体、を含む抗体組成物、ならびに(a)が直接的または間接的に連結されている(b)赤血球に結合する少なくとも1種の抗体、を含んでなる組成物。
- 抗体組成物(a)が、さらにCD56に結合することのできる抗体を含む請求項50に記載の組成物。
- 所望の細胞、赤血球、および所望でない細胞を含有する試料において骨髄前駆細胞を濃縮し回収するための組成物であって、(a)(1)CD2およびCD3からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(2)CD16およびCD66bからなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(3)CD19およびCD24からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、ならびに(4)CD14に結合することのできる抗体、(5)CD71に結合することのできる抗体、ならびに(6)CD10に結合することのできる抗体、を含む抗体組成物、ならびに(a)が直接的または間接的に連結されている(b)赤血球に結合する少なくとも1種の抗体、を含んでなる組成物。
- 抗体組成物(a)が、さらにCD56に結合することのできる抗体を含む請求項52に記載の組成物。
- 所望の細胞、赤血球、および所望でない細胞を含有する試料において巨核球前駆細胞を濃縮し回収するための組成物であって、(a)(1)CD2およびCD3からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(2)CD16およびCD66bからなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(3)CD19およびCD24からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体、(4)CD14に結合することのできる抗体、(5)CD45RAに結合することのできる抗体、ならびに(6)CD10に結合することのできる抗体、を含む抗体組成物、ならびに(a)が直接的または間接的に連結されている(b)赤血球に結合する少なくとも1種の抗体、を含んでなる組成物。
- 抗体組成物(a)が、さらにCD56に結合することのできる抗体を含む請求項54に記載の組成物。
- 所望の細胞、赤血球、および所望でない細胞を含有する試料において非造血腫瘍細胞を濃縮し回収するための組成物であって、(a)(1)CD45に結合することのできる抗体、および(2)CD66bに結合することのできる抗体、を含む抗体組成物、ならびに(a)が直接的または間接的に連結されている(b)赤血球に結合する少なくとも1種の抗体、を含んでなる組成物。
- 抗体組成物(a)が、さらにCD2、CD16、CD19、CD36、およびCD38からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体を含む請求項56に記載の組成物。
- 所望の細胞、赤血球、および所望でない細胞を含有する試料において上皮腫瘍細胞を濃縮し回収するための組成物であって、(a)(1)CD45に結合することのできる抗体、および(2)CD66bに結合することのできる抗体、を含む抗体組成物、ならびに(a)が直接的または間接的に連結されている(b)赤血球に結合する少なくとも1種の抗体、を含んでなる組成物。
- 抗体組成物(a)が、さらにCD2、CD16、CD19、CD36、およびCD38からなる群から選ばれた少なくとも1以上の抗原に結合することのできる抗体を含む請求項58に記載の組成物。
- 顆粒細胞と赤血球を含有する試料において単核細胞を濃縮し回収するための組成物であって、(a)抗原CD66bまたはCD66abceに結合することのできる抗体、を含む抗体組成物、ならびに(a)が直接的または間接的に連結されている(b)赤血球に結合する少なくとも1種の抗体、を含んでなる組成物。
- 有核細胞と赤血球を含む試料から有核細胞を分離する方法であって、
(1)(a)少なくとも1種の、分離されるべき有核細胞上の抗原に結合する抗体と、その抗体が直接または間接的に結合している(b)赤血球に結合する少なくとも1種の抗体と、を含む抗体組成物に、有核細胞と赤血球とが免疫ロゼットを形成可能な条件下で試料を接触させる段階、および
(2)試料の残部と免疫ロゼットとを分離する段階を含む方法。 - 抗体組成物が二価抗体を含み、有核細胞に結合する抗体が、赤血球に結合する抗体に直接結合している請求項61に記載の方法。
- 抗体組成物がテトラマー抗体複合体を含み、テトラマー抗体複合体が(a)有核細胞上の抗原に結合する抗体、(b)赤血球に結合する抗体、ならびに(c)(a)および(b)で定義された抗体のFc部分に結合する2種の抗体、を含み、(a)および(b)の抗体が同一の動物種の抗体であり、(c)の抗体が(a)および(b)の抗体と異なる動物種の抗体である、請求項61に記載の方法。
- 有核細胞が、T細胞、B細胞、NK細胞、樹状細胞、単核細胞、好塩基性細胞、プラスマ細胞、マスト細胞、造血前駆細胞、造血幹細胞、前駆細胞、および腫瘍細胞からなるグループから選択される請求項61に記載の方法。
- 赤血球に結合する抗体が、抗グリコフォリンA抗体である請求項61に記載の方法。
- さらに(3)免疫ロゼット中の赤血球を溶解して細胞を単離することを含む請求項61に記載の方法。
- さらに(1)において赤血球の凝集を引き起こす化合物をくわえることを含む、請求項1記載の方法。
- 化合物がヘタスターチである、請求項67に記載の方法。
- さらに(2)において沈降試薬を加えることを含む、請求項3記載の方法。
- 沈降試薬がヒドロキシエチルスターチ、ゼラチン、あるいはメチルセルロースである、請求項69記載の方法。
- 赤血球凝集を引き起こす化合物をさらにふくむ、請求項34−60のいずれかに記載の組成物。
- 化合物がヘタスターチである、請求項71記載の組成物。
- 沈降試薬をさらに含む、請求項34−60のいずれかに記載の組成物。
- 沈降試薬がヒドロキシエチルスターチ、ゼラチン、あるいはメチルセルロースである、請求項73記載の組成物。
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