DE19710496A1

DE19710496A1 - Verfahren zum Nachweis antigenspezifischer T-Zellen nach Anreicherung von mononukleären Zellpopulationen

Info

Publication number: DE19710496A1
Application number: DE19710496A
Authority: DE
Inventors: Barbara Dreisbusch; Josef Dr Endl; Peter Dr Stahl; Sabine Fessele
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1997-03-13
Filing date: 1997-03-13
Publication date: 1998-09-17
Also published as: JP2002500627A; WO1998040745A1; EP0972199A1; AU7035198A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer an antigenspezifischen T-Zellen angereicherten T-Zellpopulation, die Verwendung dieser T-Zellpopulation in der Diagnostik und zur Herstellung eines therapeutischen Mittels sowie einen Testkit für ein Verfahren zum Nachweis der antigenspezifischen Aktivierung einer T-Zellpopulation.

Das Immunsystem der Vertebraten ist ein komplexes System, in dem eine Vielzahl von Molekülen und Zellen in feinabgestimmten Reaktionen zusammenwirken. Seine vorrangige Aufgabe ist es, den Organismus vor Mikroorganismen, wie Viren, Bakterien und anderen Parasiten zu schützen. Dazu haben sich im Laufe der Entwicklung zwei unterschiedliche Systeme herausgebildet, die sich in kommunizierender Weise zur Sicherstellung dieser Auf gabe ergänzen.

Man unterscheidet das Erkennungssystem der humoralen Immunant wort, welches aus löslichen Proteinen, den Antikörpern be steht, die in Plasmazellen hergestellt werden, und der zellu lären Immunantwort, bei der Zellen, die fremde Strukturen an ihren Oberflächen aufweisen, von T-Lymphozyten erkannt und aus dem Organismus entfernt werden. Darüber hinaus stimulieren die T-Lymphozyten die humorale Immunantwort, indem sie mit den B-Zellen, den Vorläufern der Plasma-Zellen, wechselwirken.

Bei diesen Vorgängen muß das Immunsystem eigene Strukturen, d. h. Zellen des eigenen Organismus von fremden Bestandteilen und Zellen, die dem Organismus schaden könnten, unterscheiden. Man bezeichnet die körpereigenen Strukturen auch als "Selbst" und fremde Strukturen als "Nicht-Selbst".

Bei Störungen dieses "Selbsterkennungsmechanismus" kann es zu Erkrankungen, wie Allergien oder Autoimmunkrankheiten kommen.

Ein Beispiel für eine Erkrankung, bei der ein Autoimmundefekt als Ursache vermutet wird, ist der insulinabhängige Diabetes mellitus (IDDM). Hierbei kommt es zu einer T-Lymphozytenver mittelten Zerstörung der insulinproduzierenden beta-Zellen des Pankreas. Man nimmt an, daß eine Autoimmunität gegen Glutamat decarboxylase (GAD) die T-Zellantwort für andere beta-Zellan tigene vermittelt. Das GAD-Antigen, welches in den beta-Zellen enthalten ist, führt zu einer proliferativen T-Zellantwort mit einem gleichzeitigen Einsetzen einer Insulitis und im folgen den durch Zusammenwirken verschiedener Vorgänge zur Zerstörung der beta-Zellen des Pankreas.

Diese Erkenntnisse weisen darauf hin, daß eine Anti-GAD-Immun antwort eine kritische Rolle beim Krankheitsbild des IDDM spielt. Der Nachweis von autoreaktiven T-Zellen, die durch das GAD-Antigen stimuliert werden können, stellt ein Verfahren zur Verfügung mit dessen Hilfe die Entstehung oder das Vorliegen von IDDM diagnostiziert werden kann. Durch in vitro Stimulie rung der Proliferation oder der Expression von Aktivierungs markern oder der Cytokinfreisetzung von peripheren Blutlymp hozyten mit einem oder mehreren Autoantigenen in einer Blut probe kann dieser Nachweis durchgeführt werden.

Ein Problem bei diesem Nachweisverfahren stellt die geringe Frequenz der autoantigenspezifischen T-Zellen im peripheren Blut dar, die mit einer Häufigkeit von nur 1 in 10⁵ bis 1 in 10⁶ der gesamten T-Zellen vorliegen. Zusätzlich kann oftmals eine Autostimulation, die als sogenannte "autologous mixed lymphocyte reaction" bezeichnet wird, zu einem hohen Hinter grundsignal führen, das die Nachweisempfindlichkeit und -zu verlässigkeit entscheidend beeinträchtigt.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb die Nachteile des Standes der Technik mindestens teilweise zu beseitigen und insbesondere die Empfindlichkeit und Zuverläs sigkeit von T-Zellproliferationstests zu erhöhen.

Die erfindungsgemäße Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Herstellung einer an antigenspezifischen T-Zellen angereicher ten Zellpopulation gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man aus einer mononukleären Population von Zellen durch spezi fische Abreicherungsschritte naive T-Zellen und eine Subpopu lation von B-, T- oder/und NK-Zellen, die eine unspezifische Aktivierung oder/und Proliferation bewirken, entfernt.

Überraschenderweise wurde festgestellt, daß durch Abreicherung von naiven T-Zellen und einer mononukleären Subpopulation von Lymphozyten, die eine unspezifische Aktivierung oder/und Pro liferation von T-Zellen bewirkt und insbesondere eine Subpopu lation von B-, T- und NK- (natürliche Killer) Zellen umfaßt, nicht nur die Frequenz der antigenspezifischen T-Zellen er höht, sondern auch die Autostimulationsreaktion zumindest weitgehend verhindert werden kann.

Im Gegensatz dazu wurde gefunden, daß eine Gewinnung von anti genspezifischen T-Zellen nicht durch gezielte "positive" An reicherungsschritte möglich war, da hierbei stets eine ganz erhebliche Zunahme der Autostimulation eintritt. Überraschend und neu ist, daß lediglich die Abreicherung gemäß dem erfin dungsgemäßen Verfahren von naiven T-Zellen und einer Subpopu lation von B-, T- oder/und NK-Zellen zu der gewünschten anti genspezifischen Zellpopulation führt.

Als besonders günstig erwies sich die Entfernung unerwünschter Zellen durch die erfindungsgemäße Kombination von Abreiche rungsschritten unter Verwendung von Bindemolekülen, z. B. Antikörpern, die spezifisch an charakteristische Oberflächen strukturen der unerwünschten Zellen binden können. Von großem Vorteil ist dabei, daß unerwünschte Zellen mittels chromato graphischer Trennverfahren entfernt werden können, wenn man auf einem Träger immobilisierte Bindemoleküle einsetzt, an die die erwünschten antigenspezifischen T-Zellen nicht gebunden werden. Auf diese Weise kommen die antigenspezifischen T-Zel len nicht in Kontakt mit damit bindefähigen Molekülen, wodurch eine unspezifische Autostimulation verhindert wird.

Überraschend war insbesondere, daß gerade die erfindungsgemäße Kombination einer Abreicherung von naiven T-Zellen und einer Subpopulation von B-, T- oder/und NK-Zellen zu einem hohen Grad der Anreicherung von antigenspezifischen T-Zellen führte, ohne daß gleichzeitig eine nachteilige Autostimulation ein trat.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können ge eignete Oberflächendeterminanten der abzureichernden Zellen bestimmt werden und geeignete dagegen gerichtete Bindemolekü le, z. B. Antikörper verwendet werden. Als Antikörper werden vorzugsweise monoklonale Antikörper oder Fragmente davon ein gesetzt. Es können jedoch auch polyklonale Antiseren mit aus reichender Spezifität verwendet werden.

Vorzugsweise verwendet man zur Entfernung der naiven T-Zellen Antikörper gegen die Oberflächendeterminanten CD62L (Reinherz, E. L. et al., 1982, J. Immunol. 184, 1508) oder/und CD45RA (Morimoto C. et al., 1985, J. Immunol. 184, 1508).

Zur Entfernung einer Subpopulation von B-, T- oder/und NK-Zellen werden vorzugsweise Antikörper gegen die Oberflächende terminante CD39 verwendet (Kansas, G. S. et al., 1991, J. Immunol. 146, 2235).

Das Verfahren der Erfindung kann so angepaßt werden, daß je weils gewünschte Zellpopulationen als Ausgangsmaterial ver wendet werden können. Ein bevorzugtes Ausgangsmaterial sind periphere Blutlymphozyten, besonders bevorzugt sind periphere mononukleäre Zellen, z. B. aus Blut. Durch das Verfahren wird vorzugsweise eine Zellpopulation, die mit Memory-T-Zellen und in vivo präaktivierten T-Zellen angereichert ist, gewonnen.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine angerei cherte Zellpopulation, die erhältlich ist durch das oben dar gestellte Verfahren. In einer bevorzugten Ausführungsform, ist der Gehalt der Zellpopulation ≧ 80% an Memory-T-Zellen und in vivo präaktivierten T-Zellen. Besonders bevorzugt ist der Gehalt ≧ 90%.

Der Gehalt an naiven T-Zellen sowie an der störenden Subpopu lation von B-, T-, oder/und NK-Zellen wird durch das erfin dungsgemäße Verfahren verringert. Vorzugsweise enthält die Zellpoppulation einen Gehalt an naiven T-Zellen von ≦ 10%. Der Gehalt der störenden Subpopulation von B-, T- oder/und NK-Zellen in der Zellpopulation beträgt vorzugsweise ≦ 20% des Ausgangswerts.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung der nach dem beschriebenen Verfahren erhältlichen Zellpopu lation in der Diagnostik, vorzugsweise in einem Verfahren zum Nachweis der T-Zellreaktion gegen ein spezifisches Antigen, bei dem es sich um ein Autoantigen, Tumorantigen oder/und Pathogen oder ein Fragment davon handeln kann. Besonders be vorzugt ist das Antigen ein Autoantigen oder ein Fragment davon, das zum Nachweis von Autoimmunerkrankungen oder einer Prädisposition dafür eingesetzt werden kann. Ein Beispiel hierfür ist der Nachweis von IDDM, der über spezifische Auto antigene wie humane GAD (Baekkeskov S. et al., 1987, J. Clin. Invest., 79, 926) oder IA-2 (Payton, M. A., et al., 1995, J. Clin. Invest., 96, 1506) erfolgen kann. Am meisten bevorzugt ist humane GAD oder ein Fragment davon, z. B. ein Teilpeptid wie es in der deutschen Patentanmeldung Nr. P 44 01 629.8 be schrieben ist.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung der Zellpopulation in einem Verfahren zur Kontrolle eines Vakzinierungserfolges, z. B. bei der Vakzinierung gegen ein Pathogen, wie beispielsweise Tetanus.

In noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Ver wendung der Zellpopulation in einem Verfahren zur Kontrolle der Verringerung der antigenspezifischen T-Zellen. Allgemein kann ein solches Verfahren zum Therapiemonitoring eingesetzt werden. Insbesondere nach therapeutischen Maßnahmen, wie bei spielsweise einer Anergieinduktion oder Depletion, z. B. durch Antikörper vermittelte Komplementlyse, ist ein solches Kon trollverfahren einsetzbar.

Das Antigen wird in dem Verfahren in einer geeigneten Form eingesetzt, vorzugsweise wird es in einer hochgereinigten Form verwendet. Das Antigen kann auch chemisch modifiziert werden, um eine erhöhte Aufnahme in die antigenpräsentierenden Zellen (dendritische Zellen, Makrophagen) zu erzielen. Besonders bevorzugt wird das Antigen glykosyliert, z. B. mannosyliert, da hierdurch eine erhöhte Aufnahme über den Mannose-Rezeptor, der vor allem auf dendritischen Zellen exprimiert wird, ver mittelt wird (Sallusto, F. et al., 1995, J. Exp. Med., 182, 389). Besonders bevorzugt wird das Antigen als Immunkomplex gebunden an einen Antikörper oder an ein Antikörperfragment verwendet, da die Antigenmenge auf diese Weise um einen Faktor von bis zu 10 verringert werden kann bzw. das Maximum der Aktivierung erhöht werden kann.

Der Antikörper kann jeder geeignete polyklonale oder monoklo nale Antikörper sein. Es können aber auch Komplexe aus Antigen und Antikörperfragmenten verwendet werden. Vorzugsweise ist der Antikörper ein humaner Antikörper.

Alternativ zur Verwendung von vorgefertigten Immunkomplexen können in dem beschriebenen Verfahren auch Humanseren verwen det werden, die bereits Antikörper enthalten, welche gegen das relevante Antigen gerichtet sind, wie z. B. Autoantikörper positive Seren von Patienten mit Autoimmunerkrankungen oder Seren von Personen mit Antikörpern gegen Pathogene.

Die erfindungsgemäße T-Zellpopulation kann auch zur Herstel lung eines therapeutischen Mittels eingesetzt werden, z. B. eines Mittels für die Gentherapie. Hierzu wird die gewünschte T-Zellpopulation in präparativem Maßstab gewonnen und kann dann in vitro den im Rahmen von gentherapeutischen Verfahren üblichen Behandlungsschritten unterzogen werden.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Testkit für ein Verfahren zum Nachweis der antigenspezifischen Reakti vität von T-Zellen, umfassend ein Reagenz zur Entfernung von naiven T-Zellen, ein Reagenz zur Entfernung einer Subpopula tion von B-, T- oder/und NK-Zellen, die eine unspezifische Aktivierung oder/und Proliferation bewirkt, und Reagenzien zur Durchführung eines Assays zum Nachweis antigenspezifischer T-Zellen.

Vorzugsweise enthält der Testkit als Reagenz zur Entfernung von naiven T-Zellen Antikörper gegen CD45RA oder/und L-Selek tin (CD62L). Zur Entfernung der Subpopulation von B-, T- oder/ und NK-Zellen , die eine unspezifische Aktivierung oder/und Proliferation bewirken, enthält der Testkit vorzugsweise als Reagenz Antikörper gegen CD39. Als Reagenzien für einen T-Zellassay enthält der Testkit jeweils die entsprechenden Auto antigene, Tumor-antigene oder/und Pathogene bzw. Fragmente davon. Die Reagenzien liegen in einer geeigneten Form vor, beispielsweise als Lösung, Suspension oder Lyophilisat und sie können durch geeignete Puffer oder Lösungen rekonstituiert werden.

Besonders bevorzugt enthält der Testkit das humane Autoantigen GAD oder/und Fragmente davon. Am meisten bevorzugt liegt das GAD-Antigen im Komplex mit einem Antikörper vor.

Vorzugsweise ist der Antikörper ein humaner Antikörper gegen GAD. Beispiele für geeignete Antikörper sind die MICA3- oder/und MICA4-Antikörper (Richter, W. et al., 1992, PNAS 89, 8467).

In noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Ver fahren zum Nachweis von antigenspezifischen T-Zellen, insbe sondere von autoantigenspezifischen humanen T-Zellen, wobei man eine zu testende Zellpopulation mit einem Immunkomplex in Kontakt bringt, der das betreffende Antigen gebunden an einen dagegen gerichteten Antikörper, insbesondere an einen humanen Antikörper umfaßt, und anschließend die antigenspezifische Reaktivität der T-Zellpopulation bestimmt.

Zur Erläuterung der Erfindung dienen die folgenden Beispiele und Abbildung. Abb. 1 zeigt die Stimulation der T-Zel linie 40/2#38 (ICL 40/2#38) durch freie bzw. durch mit MICA 4 komplexierte GAD.

Beispiele Beispiel 1 Gewinnung von aktivierten bzw. Memory-T-Zellen durch positive Anreicherung 1.1 Einleitung

Zur Anreicherung aktivierter T-Zellen bzw. Memory-T-Zellen wurden periphere mononukleäre Zellen (PBMNC) mit verschiedenen monoklonalen Antikörpern markiert, die gegen Oberflächenanti gene gerichtet waren, welche auf aktivierten Lymphozyten bzw. Memory-T-Zellen exprimiert werden. Die markierten Zellen wur den in einem zweiten Schritt mit magnetisierbaren Microbeads markiert und über einen Magneten von den nicht markierten Zellen abgetrennt. Die nicht zurückgehaltene Zellfraktion (Ne gativfraktion) wurde aufgefangen. Nach dem Entfernen des Ma gneten wurde auch die immobilisierte Fraktion durch Waschen der Säule gesammelt (Positivfraktion). Um den Effekt der Zel lanreicherung messen zu können, wurde ein Stimulationstest mit Tetanustoxoid (TT) als Antigen durchgeführt.

1.2 Versuchsdurchführung

Die folgenden Antikörper wurden evaluiert:

Die mittels Ficollseparation gewonnenen PBMNC wurden in kaltem (4°C) Vollmedium auf eine Zellzahl von ca. 3 × 10⁶ Z/ml ein gestellt. Es erfolgte die Zugabe der monoklonalen Antiköper in einer Konzentration von 5-10 µg/ml. Anschließend wurde für ca. 30 Min. bei 4°C inkubiert. Die PBMNC wurden dann zuerst in Medium (RPMI/10% Humanserum), dann in PBS/0,5% RSA gewa schen. Das Zellpellet wurde dann in Puffer resuspendiert (max. 10 Zellen in 80 µl). Anschließend wurden dialysierte und ste rilfiltrierte Microbeads (Miltenyi) zugegeben (20 µl auf 10⁷ Zellen bzw. 80 µl Zellsuspension) und 15 Minuten bei 6 bis 12°C inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und anschließend in gleichem (100 µl) Volumen Puffer wie zuvor resuspendiert.

Nun wurde die Trennsäule in den Separator gehängt (bei negati ver Selektion mit Flow-Resistor). Die Trennsäule wurde mit 500 µl Puffer vorgespült und die gut resuspendierte Zellsuspension auf die Säule aufgetragen und langsam durchlaufen gelassen. Dann wurde mit 500 µl Puffer nachgespült. Beide Fraktionen wurden zur Negativfraktion vereinigt.

Nun wurde der Flow-Resistor entfernt und die Säule zwei- bis dreimal mit jeweils 500 µl Puffer durchgespült. Die Säule wurde anschließend aus dem Separator genommen, auf ein steri les 15 ml Zellkultur-Röhrchen aufgesetzt und die markierte Zellfraktion mit 1 ml Puffer aus der Säule gedrückt. Dies ergab die Positivfraktion.

Positiv- und Negativfraktion wurden einmal mit Vollmedium gewaschen, in Vollmedium resuspendiert und anschließend in 96-Well Rundbodenplatten in verschiedenen Zellkonzentrationen verteilt. Falls sehr wenige (unter 20 000 PBMNC je Well) ein gesetzt wurden, fügte man bestrahlte sogenannte Feederzellen zu. Dies waren PBMNC desselben Blutspenders, die mit 4000 rad bestrahlt wurden, um die Proliferation dieser Feederzellen zu unterbinden. Es wurden meistens Triplikate ohne Antigen (nur mit Medium) und mit Tetanustoxoid (TT) als Stimulationsantigen angesetzt. Anschließend wurde 5 Tage bei 37°C/7% CO₂ inku biert. Dann erfolgte ein Puls mit ³H-Thymidin für 16 Stunden. Die Zellen wurden anschließend über einen Filter abgesaugt und die eingebaute Radioaktivität mittels beta-Zähler direkt be stimmt. Die Auswertung erfolgte durch Ermittlung des Stimula tionsindex (SI), der sich wie folgt definiert: cpm (counts per minute) in Anwesenheit von TT/cpm mit Medium.

Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse dieser Untersuchungen. In die ser Versuchsreihe wurden jeweils 10 000 PBMNC aus der Positiv fraktion (P) oder der Negativfraktion (N) zusammen mit 100 000 bestrahlten unseparierten Feederzellen in den Stimulations tests eingesetzt.

Ergebnisse mit Positivmarkern für die Anreicherung von aktivierten bzw. Memory-T-Zellen

Aus diesem Experiment ergeben sich die folgenden Schlußfolge rungen: Eine Positivselektion mit gegen CD25, CD71, CD54 oder CD80 gerichteten Antikörpern bringt eine Erhöhung des Stimula tionsindex gegenüber unseparierten PBMNC. Eine relative Anrei cherung der TT-reaktiven T-Zellen findet sich auch in der positiv selektionierten Fraktion mit den monoklonalen Antikör pern gegen CD4SR0 gegenüber der mit diesem Markern depletier ten Zellpopulation.

Eine deutliche Verringerung der Stimulationsfähigkeit gegen über TT findet sich in den Positivfraktionen, die über Markie rung mit anti-HLA-DR- und anti-HLA-DQ-Antikörpern gewonnen wurden. Ein überraschendes Ergebnis wurde bei dem Separations experiment mit anti-CD39-Antikörpern beobachtet. Hier ergab sich ein höherer Stimulationsindex mit der Negativfraktion im Vergleich zur Positivfraktion. Dies war vor allem auch auf eine deutlich erniedrigte Spontanproliferation mit der Medien kontrolle zurückzuführen.

Beispiel 2 Untersuchung der Modulation der Immunreaktion durch Anwesenheit von monoklonalen Antikörpern gegen IL-2 Rezeptor (CD 25)

Aus Beispiel 1 geht zunächst hervor, daß die Positivselektion mit anti-CD25-Antikörpern zur stärksten Erhöhung des Stimula tionsindex im Vergleich zu den unseparierten PBMNC führte. Um zu bestimmen, ob diese Stimulationserhöhung antigenspezifisch ist, wurde folgender Versuch durchgeführt:
PBMNC wurden, wie unter Beispiel 1 beschrieben, mit anti-CD25- Antikörpern markiert. Die so mit monoklonalen Antikörpern be ladenen Zellen wurden nicht weiter separiert, sondern direkt in einen Proliferationsassay wie unter 1 beschrieben, einge setzt. Als Vergleich diente ein Kontrollansatz mit gleichen Zellzahlen an nicht markierten PBMNC.

Tabelle 2 zeigt das Ergebnis dieses Versuchs.

Tabelle 2

Modulation der Immunreaktion durch anti IL-2 Rezeptor

Es ist zu erkennen, daß durch den monoklonalen Antikörper gegen den IL-2 Rezeptor die in vitro Immunantwort gegen TT positiv moduliert wird. Die Steigerung der Stimulation nach Positivselektion der PBMNC mit dem anti-CD25-Antikörper geht deshalb wahrscheinlich nicht auf eine Anreicherung der rele vanten T-Zellpopulation zurück, sondern ist das Ergebnis einer Kostimulation über den gegen den IL-2 Rezeptor gerichteten Antikörper. Folglich konnte für eine Anreicherung der relevan ten T-Zellsubpopulation nicht eine Positivselektion gewählt werden, da die an Zellrezeptoren gebundenen Antikörper entwe der eine Positivmodulation (z B. durch CD25) oder eine Nega tivmodulation (z. B. durch HLA-DR oder HLA-DQ) der T-Zellen in der nachfolgenden antigenspezifischen Stimulation bewirkten.

Beispiel 3 Stimulationsversuche mit PBMNC nach Entfernung von naiven t-Zellen bzw. Entfernung der CD39 positiven Zellpopulation

Es wurde nun versucht, durch eine Negativselektion die ge wünschte antigenspezifische T-Zellpopulation anzureichern. Hierzu wurden naive und unreife T-Zellen über die Marker CD4SRA (Morimoto C. et al., 1985. J. Immunol. 184, 1508) und CD62L (Reinherz, E. L. et al., 1982. J. Immunol. 128, 4639) entfernt. Weiterhin wurde für die Negativselektion der bereits in Beispiel 1 identifizierte Marker CD39 eingesetzt, der eine mononukleäre Subpopulation von B-, T- und NK-Zellen erkennt, die eine unspezifische Aktivierung bzw. Proliferation verur sacht.

Für dieses Experiment wurden erstmals PBMNC von IDDM-Patienten verwendet. Es wurde als Modellantigen weiterhin TT getestet, aber zusätzlich auch das IDDM-relevante Antigen GAD.

Die über Ficollseparation isolierten PBMNC wurden wie unter Beispiel 1 beschrieben mit anti-CD39-Antikörpern allein oder mit den Antikörper-Mischungen gegen CD39/CD62L bzw. CD39/CD45RA markiert. Die weitere Behandlung der Zellen ver lief wie unter Beispiel 1 für die Negativseparation beschrie ben.

Tabelle 3 zeigt das Ergebnis dieser Versuchsreihe.

Die Entfernung der CD39-Subpopulation alleine bewirkte in allen Fällen eine starke Abnahme der Proliferation mit der Medienkontrolle, bei den Patienten 27 und 31 aber auch in Anwesenheit des Antigens TT. Mit GAD war weder mit unseparier ten PBL noch mit anti-CD39-Antikörpern depletierten Zellen eine Proliferation zu beobachten. Wurde zusätzlich mit anti- CD62L-Antikörpern depletiert, so war bei den Patienten 27 und 31 ein deutlicher Anstieg des Stimulationsindex gegenüber den beiden Antigenen GAD und TT zu beobachten. Als ideale Kombina tion für eine Steigerung des Stimulationsindex insbesondere gegen das Autoantigen GAD erwies sich die Kombination der anti-CD39-/anti-CD45RA-Antikörper. Es konnte eine hochsignifi kante Steigerung der in vitro Stimulation mit GAD und mit TT beobachtet werden.

Somit wird mit der Kombination der anti-CD39-/anti-CD45RA- Antikörpern die relevante PBMNC-Population optimal angerei chert. Eine mögliche Markerkombination bildet jedoch auch das Antikörperpaar anti-CD39-/anti-CD62L-Antikörper.

Beispiel 4 Zellseparation mit Proben von Kontrollpersonen und Patienten im Vergleich

In einer weiteren Versuchsreihe wurde die Frage geklärt, ob die Depletion der CD39- und CD4SRA-Subpopulation nicht den unerwünschten Effekt hat, daß auch bei Normalpersonen eine Steigerung der in vitro Proliferation gegen das Diabetes-rele vante Autoantigen GAD erfolgt. Zu diesem Zweck wurde eine Serie von PBMNC verglichen. Da die Reaktionsfähigkeit von T-Zellen auf bestimmte Antigene stark vom HLA-Typus der PBMNC-Spender abhängt, wurden nur solche Kontrollpersonen verwendet, die ebenfalls die für Typ I Diabetiker charakteristischen HLA-Klasse II Suszeptibilitätsantigene experimentierten. Die Ein zelergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.

Aus dieser Versuchsserie ergibt sich Folgendes:

1. Nach Depletion von CD39- und CD4SRA-Subpopulationen steigt bei der überwiegenden Mehrheit der Kontrollperso nen der Stimulationsindex gegenüber TT deutlich an. Dage gen sinkt bei der überwiegenden Mehrheit der Kontroll personen der SI gegenüber dem Autoantigen GAD.
2. Im Gegensatz dazu wird bei den untersuchten IDDM-Patien ten nach Zelldepletion eine deutliche Steigerung des SI gegen GAD beobachtet.
3. Durch die Erniedrigung des SI gegenüber GAD bei der Kon trollgruppe und gleichzeitiger Erhöhung des SI bei den Patienten resultiert ein hochsignifikanter Unterschied in der GAD-Reaktivität dieser beiden Vergleichsgruppen. Somit bietet sich diese Methode als verbessertes Nach weissystem zur Diagnose der T-Zell vermittelten Reaktivi tät gegen das Autoantigen GAD an.

Zellseparation mit PBMNC von Kontrollpersonen (KP) und Patienten (Pat.) im Vergleich

Beispiel 5 Steigerung der in vitro Stimulation durch GAD nach Immunkomplexbildung mit MICA 4 5.1 Einleitung

GAD-spezifische T-Zell-Linien können durch PBMNC von partiell HLA-identischen Spendern stimuliert werden, wenn diese PBMNC mit 10 µg/ml GAD gepulst worden sind. Durch Komplexierung der GAD durch GAD-spezifische humane monoklonale inselzellspezi fische Antikörper (MICA) sollte die Immunogenität der GAD verstärkt werden. Es wurde erwartet, daß komplexierte GAD bereits in Konzentrationen unter 10 µg/ml stimulatorisch wirkt.

Es wurde die Proliferation der T-Zell-Linie 40/2#38 (TCL 40/2#38) in Anwesendheit verschiedener Konzentrationen an freier bzw. komplexierter GAD miteinander verglichen. Zur Komplexierung wurde der GAD-spezifische Antikörper MICA 4 verwendet (zur Nomenklatur und Charakteristik der Antikörper siehe Richter et al., 1992, PNAS, 89, 8467 sowie Offenle gungsschrift DE 41 29 849 A1). Dieser erkennt ein Konforma tionsepitop in der Mitte der GAD-Sequenz (Aminosäuren 309- 440). Die GAD-Konzentration wurde zwischen 0,1 und 6,3 µg/ml variiert. Zur Komplexierung wurde jeweils MICA 4 in achtfachem molaren Überschuß zugegeben. Dieses Verhältnis hatte in Vor versuchen zu einer optimalen Steigerung der Stimulation ge führt. Anstatt MICA 4 können auch andere, der unter Richter et al., (1992), PNAS, 89, 8467 beschriebenen inselzellspezifi schen humanen monoklonalen Antikörper verwendet werden, z. B. MICA 3.

5.2 Versuchsdurchführung

Es wurde eine Mischung aus 12,5 µg/ml GAD und 118 µg/ml MICA 4 in RPMI/10% HS hergestellt. In dieser Mischung lag ein acht facher molarer Überschuß an MICA gegenüber GAD vor. Als Ver gleichsansatz diente eine GAD-Verdünnung ohne Antikörper (CGAD ebenfalls 12,5 µg/ml). Die beiden Ansätze wurden 2 Stunden bei 37°C, 7% CO₂ inkubiert und anschließend seriell verdünnt.

Von jeder Verdünnungsstufe wurden Duplikate angesetzt, für die 50 µl freie bzw. komplexierte GAD mit 50 µl PBMNC-Suspension (2 × 10⁶ Z/ml) in den Wells einer 96-Well-Rundbodenplatte ver einigt wurden. Die GAD wurde dabei um den Faktor zwei ver dünnt. Es resultierte eine PBMNC-Konzentration von 100 000 Zellen/Well. Nach einem dreistündigen Antigenpuls bei 37°C, 7% CO₂ wurden die Zellen einer Strahlung von 40 Gy ausgesetzt. Pro Well wurden schließlich 50 µl T-Zell-Suspension (1,6 × 10⁵ Z/ml) zugegeben, was in einer T-Zell-Konzentration von 8000 Zellen/Well resultierte.

Die Zellen wurden nach 48-stündiger Inkubation bei 37°C, 7% CO₂ mit 1 µCi [³H]-Thymidin pro Well gepulst und nach weiteren 16 Stunden Inkubation über einen Filter abgesaugt. Die einge baute Radioaktivität wurde mittels beta-Zähler direkt be stimmt. Sie wird als Maß für die Stimulation verwendet.

5.3 Ergebnis

Die für freie bzw. komplexierte GAD ermittelten Titrations kurven sind in Abb. 1 dargestellt. Während freie GAD in einer Konzentration von 0,4 µg/ml nicht stimulierend wirkt, kann in Gegenwart von 0,4 µg/ml komplexierter GAD schon eine beträchtliche Stimulation beobachtet werden. Auch bei den höheren getesteten GAD-Konzentrationen bewirkt die komple xierte GAD eine deutlich stärkere Stimulation als die freie GAD.

Um eine Stimulation der Stärke zu erreichen, die in Gegenwart von 6,3 oder 3,1 µg/ml freier GAD erreicht wird, reicht eine jeweils zehnmal geringere Konzentration an komplexierter GAD aus.

Durch Komplexierung mit MICA 4 wird also die zur Stimulation benötigte GAD-Konzentration verringert. Bei einer gegebenen Konzentration bewirkt komplexierte GAD eine stärkere Stimula tion als freie GAD.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer an antigenspezifischen T-Zellen angereicherten Zellpopulation, dadurch gekennzeichnet, daß man aus einer mononukleären Population von Zellen durch spezifische Abreicherungsschritte

a) naive T-Zellen und
b) eine Subpopulation von B-, T- oder/ und NK-Zellen, die eine unspezifische Aktivierung oder/und Prolife ration bewirken, entfernt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Entfernung der naiven T-Zellen Antikörper gegen CD4SRA oder/und CD62L verwendet.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Entfernung der Subpopulation von B-, T- oder/und NK-Zellen Antikörper gegen CD39 verwendet.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Zellpopulation herstellt, die an Memory-T-Zellen und in vivo präaktivierten T-Zellen angereichert ist.

5. Angereicherte Zellpopulation erhältlich durch das Ver fahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.

6. Zellpopulation nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Gehalt ≧ 80% an Memory-T-Zellen und in vivo präaktivierten T-Zellen enthält.

7. Zellpopulation nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Gehalt ≦ 10% an naiven T-Zellen enthält.

8. Verwendung der Zellpopulation gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7 in der Diagnostik.

9. Verwendung nach Anspruch 8 in einem Verfahren zum Nach weis der T-Zellreaktion gegen ein spezifisches Antigen.

10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das spezifische Antigen ein Autoantigen, Tumorantigen oder/und Pathogen ist.

11. Verwendung nach Anspruch 9 zum Nachweis von Diabetes, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen ein Autoantigen ist, welches humane GAD oder Fragmente davon umfaßt.

12. Verwendung der Zellpopulation gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7 in einem Verfahren zur Kontrolle eines Vakzinie rungserfolges.

13. Verwendung der Zellpopulation gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7 in einem Verfahren zur Kontrolle der Verringerung der antigenspezifischen T-Zellen.

14. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen ein Tetanustoxoid ist.

15. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antigen als Immunkomplex gebunden an einen Antikörper einsetzt.

16. Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein humaner Antikörper ist.

17. Verwendung der Zellpopulation gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7 zur Herstellung eines therapeutischen Mittels.

18. Testkit für ein Verfahren zum Nachweis der antigenspezi fischen Reaktivität von T-Zellen, umfassend

a) ein Reagenz zur Entfernung von naiven T-Zellen,
b) ein Reagenz zur Entfernung einer Subpopulation von B-, T- oder/und NK-Zellen, die eine unspezifische Aktivierung oder/und Proliferation bewirkt, und
c) Reagenzien zur Durchführung eines Assays zum Nach weis antigenspezifischer T-Zellen.

19. Testkit nach Anspruch 18 dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz zur Entfernung von naiven T-Zellen Anti körper gegen CD4SRA oder/und CD62L umfaßt.

20. Testkit nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz zur Entfernung einer Subpopulation von B-, T- oder/und NK-Zellen Antikörper gegen CD39 umfaßt.

21. Testkit nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß er Autoantigene, Tumorantigene, oder/und Pathogene umfaßt.

22. Testkit nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß er humane GAD oder/und Fragmente davon umfaßt.

23. Testkit nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das GAD-Antigen im Komplex mit einem Antikörper vor liegt.

24. Testkit nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein humaner Antikörper gegen GAD ist.