JPH11501514A

JPH11501514A - 新規の封入組成物及び封入方法

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Publication number: JPH11501514A
Application number: JP8526955A
Authority: JP
Inventors: シー．エネボルド，カール
Original assignee: メタボレックス，インコーポレイティド
Priority date: 1995-03-03
Filing date: 1996-03-01
Publication date: 1999-02-09
Also published as: AU5090996A; WO1996027367A1; EP0814779A1; US6020200A; US5916790A; CA2214084A1

Abstract

(57)【要約】本発明は一般に新規の封入組成物及び封入方法に関連する。詳しくは、本発明は架橋化複合官能性ポリマーマトリックスの層を含んで成る安定化マイクロカプセル組成物及びその調製方法に関連する。この封入化組成物は架橋化ポリマーマトリックス層を封入化組成物全体の内層、外層又は中間層として含んで成りうる。この組成物はその中に封入された一般に生物学的材料、例えば細胞、タンパク質等をも含んで成るであろう。本発明の組成物及び方法は細胞培養及び移植治療等の様々な用途において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】新規の封入組成物及び封入方法本発明は一般に新規の封入組成物及び封入方法に関連する。詳しくは、本発明は架橋化複合官能性ポリマーマトリックスの層を含んで成る安定化マイクロカプセル組成物及びその調製方法に関連する。この封入化組成物は架橋化ポリマーマトリックス層を封入化組成物全体の内層、外層又は中間層として含んで成りうる。この組成物はその中に封入された一般に生物学的材料、例えば細胞、タンパク質等をも含んで成るであろう。本発明の組成物及び方法は細胞培養及び移植治療等の様々な用途において有用である。発明の背景様々なマイクロ封入方法及び組成物が当業界において公知である。これらの組成物は主に薬理製剤において、例えば苦みのある薬剤の味覚をマスキングするため、長期投与形態を処方するため、非相溶性材料を分離するため、化学薬品を水分もしくは酸化から保護するため、又は取扱い及び／もしくは加工をし易すくするように材料の物理特性を改変するために使用される。典型的な薬理封入組成物は例えばゼラチン、ポリビニルアルコール、エチルセルロース、セルロースアセテートフタレート及びスチレンマレイン酸無水物を含む。Remington のPharmace utical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton PA(1990)を参照のこと。マイクロ封入は移植療法による病気の処置においても適用されている。分泌及びその他の生物学的器官の機能不全に対する伝統的な医療処置は不全器官の特定された正常生成物を天然又は合成薬剤に置き換えることを焦点とするが、移植療法はその機能体の細胞又は器官移植体による置換を焦点とする。例えば、インスリン依存性真性糖尿病の処置は、膵臓のランゲルハンス島が不全の場合、膵臓の半島で、正常なインスリンの分泌性を代用することにより実施できる。インスリンは合成もしくは代用動物インスリンの毎日の投与により、又は機能性のヒトもしくは動物半島の移植により供給し得る。器官組織を免疫抑制抜きで遺伝子的に非類似の宿主に移植する試みは一般に宿主の免疫系により失敗している。従って、宿主の免疫系から移植組織を単離するため、例えばマイクロ封入により有効な保護バリヤーコーティングを施す試みがなされている。しかしながら、このような試みは一般にコーティング材料と宿主系との間の非混和性に基づき医療的な実用性が実証されていない。その結果、このようなコーティングを施した細胞又は組織移植片は宿主体において外来物体として処理され、そして免疫拒絶又は崩壊にかけられる。更に、従来開発された多くの封入又はコーティング工程は宿主において移植組織が長期且つ有効な機能性寿命を有するのに必要な所望の孔質性及び厚みを有する再現性のあるコーティングを生み出していない。有効な細胞又は組織移植片は一般に、宿主の免疫系によるその崩壊を防ぐ、繊維症を防ぐ、そして栄養物が浸透性であり、従ってコーティング化移植片に至る栄養物の自由拡散並びにコーティング化移植片からの分泌及び廃出物の除去を可能にするであろうコーティングを必要とする。生存組織及び細胞はポリリジンのコーティングされたアルギネートカプセルの中に固定されている。J．Pharm．Sci．70：351-354(1981)。糖尿病の症状又は動物の糖尿病を治すための膵臓半島移植におけるかかるコーティング化カプセルの利用も論述されている。Science 210 ：908-909(1981)。アルギネート−ポリリジンカプセルを利用するマイクロ封入化ラット半島の異種移植片によるマウスの糖尿病症状の長期回復が報告されている。Diabetes 40 ：1511-1516(1993)。ポリリジンと反応させたカルシウムアルギネートカプセルの中に封入された移植片の開発は例えば米国特許第 4,673,566、4,689,293、4,7 89,550、4,806,355及び 4,789,550号に記載されている。米国特許第 4,744,933号には相互反応したアルギネートとポリアミノ酸との膜の中に生物活性材料を含む封入用溶液が記載されている。米国特許第 4,696,286号には遺伝子的に非類似の個体への移植のために適切な移植片のコーティングのための方法が報告されている。この方法は、移植片にその表層成分と化学結合する多価材料の表層整合性結合架橋のコーティングを施し、それをその結合架橋層と化学結合するポリマーの半透過性生物適合層の中に封入することを含む。この方法の欠点は、それが第一ポリマーコーティングと細胞表層上のタンパク質の酸性残基との特異的な相互作用を頼りとし、それ故、特にその他の組織がその組織粒子に付着しており（例えば、半島上の腺房組織）、所望の結合を妨害しているような場合、組織の完全被覆を供することができないことがある点にある。米国特許第 5,227,298号にはポリリジンアルギネートで既にコーティングの施された細胞に第二アルギネートゲルコーティングを導入するための方法が記載されている。従来論じられた封入又はコーティング組成物の数多くの脱落は移植材料の崩壊を防ぐのに適する免疫バリヤーを供する能力の欠如に基づく。更に、従来論じられた封入方法及び封入組成物の多くは移植方法及びその他の用途における封入組成物について所望されるであろう構造保存性を欠く。例えば、当業界において論じられているアルギネートコーティングは往々にして、薄すぎて不十分なバリヤーを供するか、もしくは厚すぎて細胞の持続的な機能に必要とされる栄養物及び／もしくは細胞生成物の透過性の欠如を供するか、又はその厚みが不均一であり、封入化組成物の機能における予測性が欠如されるものとなる。従って、向上した構造的特徴及び免疫防御を供することのできる封入組成物及びその製造方法の提供が非常に所望されるであろう。かかる組成物及び方法は例えば機械的、化学的又は宿主内での免疫的崩壊に耐久しうる個別の移植片の製造において有用であり、そして移植片の機能を損う線維原反応を誘引せず、また栄養物並びに分泌及び廃棄生成物の自由透過性を更に供するであろう。発明の概要本発明の一の観点は少なくとも一層の一定のマトリックス孔質性を有する安定複合官能性ポリマーマトリックス（以降、「架橋化ポリマーマトリックス」と称する）を含んで成る安定化マイクロカプセル組成物の提供にある。好適な観点において、本発明のマイクロカプセル組成物は架橋化ポリマーマトリックスの層でコーティングされた生物材料を含んで成る。この生物材料は遊離、封入又は支持体に結合しているものであってよい。好適なポリマーマトリックスにはコラーゲン及び誘導化アルギネートを含んで成るものが含まれる。この組成物は任意的にこの架橋化ポリマーマトリックス層を覆っている生体適合性ポリマーの追加の層を含んで成ってよい。また、本発明により提供される方法は生物材料を封入するための方法である。この方法は生物材料を、架橋化可能な複合官能性ポリマーの溶液に入れ、この生物材料のまわりにポリマーを核形成させることを含んで成る。次いでこのポリマーマトリックスを架橋させて、コントロール可能な孔質性を有する架橋化ポリマーマトリックスの安定化層を作る。ここでも、この生物材料は、架橋化ポリマーマトリックスによるコーティングの前に、遊離、封入又は支持体結合していてよい。好ましくは、この生物材料は架橋化ポリマーマトリックスによるコーティングの前に第一組成物の中に封入しておく。更なる態様において、本発明は患者における特定の生物機能の欠如を特徴とする病気の処置の方法を提供する。この方法は患者に、特定の欠失生物機能を及ぼすことのできる生物材料の封入化組成物を導入することを含んで成り、ここでこの材料は本発明の方法に従って封入されたものである。好適な観点において、この封入化生物材料は膵臓の半島細胞であり、そしてこの方法は真性糖尿病の処置に利用される。別の態様において、本発明の細胞を培養するための方法を提供する。この方法は本発明の方法に従って架橋化複合官能性ポリマーマトリックスの層で細胞にコーティングを施し、次いで細胞を培養することを含んで成る。図面の簡単な説明図１Ａは 530nmの吸収として測定した、pH6.6〜6.9 での経時的な酸可溶性Ｉ型コラーゲンの核形成を示す。線分Ａは H₂O透析済酸可溶性コラーゲン（Vitrog en(登録商標)100の 0.012Ｎの HCl溶液、Collagen Corp.）の核形成を示す。線分Ｂは希薄酢酸に対して透析したコラーゲンの核形成を示す。線分Ｃは線分Ｂよりも高いレベルの酢酸ナトリウムを有するコラーゲンの核形成を示す。線分１Ｂは、1.5ｇの２Ｘスクロース溶液と混合した１ｇの透析コラーゲン溶液に添加した追加の酢酸の機能としてのコラーゲンの核形成レベルにおける相違の対比を示す（Ａ＝ 0.010ml HOAc添加、Ｂ＝ 0.012ml HOAc添加、Ｃ＝ 0.014ml HOAc添加）。図２Ａはアルギネート封入化赤血球（「Ｒ」）とコラーゲンコーティングしたアルギネート封入化赤血球（「Ｘ」）との溶血速度の対比を示す。種々の組成物を、ネガティブコントロールとして食塩水の中で（「Ｓ」）、ポジティブコントロールとして水の中で（「Ｗ」）、モルモット補体の存在下で（「Ｃ」）、及び抗ヒツジ赤血球抗体とモルモット補体（「Ａ＋Ｃ」）との存在下で試験した。従って、「Ｘ＋Ｓ」及び「Ｒ＋Ｓ」は食塩水の中でインキュベーションしたコラーゲンコーティングしたアルギネート封入化赤血球及びアルギネートのみに封入した赤血球のそれぞれを示す。「Ｒ＋Ｗ」及び「Ｘ＋Ｗ」は水の中でインキュベーションしたアルギネート封入化赤血球及びコラーゲンコーティングしたアルギネート封入化赤血球のそれぞれを示す。「Ｘ＋Ｃ」及び「Ｒ＋Ｃ」はモルモット補体の存在下でインキュベーションしたコラーゲンコーティングをアルギネート封入化赤血球及びアルギネート封入化赤血球のそれぞれを示す。「Ｒ＋Ａ＋Ｃ」及び「Ｘ＋Ａ＋Ｃ」は抗体及び補体とインキュベーションしたアルギネート封入化赤血球及びコラーゲンコーティングしたアルギネート封入化赤血球のそれぞれを示す。測定は表示の解説に従い 20，60，150及び 240分目に行った。図２Ｂはアルギネート封入化赤血球（「Ａ」）とコラーゲンコーティングしてアルギネート封入化赤血球との放出ヘモグロビンの関数として測定した溶血速度の対比を示し、ここでコラーゲン核形成反応物は図１Ｂに示す三通りの添加酢酸レベルを利用し（「Ｃ−Ａ」，「Ｃ−Ｂ」及び「Ｃ−Ｃ」）、食塩水、水及びモルモット補体と抗体とを含む溶液（「 GPC／Ab」）中で慎重に力価検定した。図３はアルギネートの中に封入し、そしてその後架橋させたコラーゲンでコーティングされた赤血球の写真を示す。次にこのマイクロカプセルをEDTAで処理して内部アルギネートカプセルを溶解させた。好適な態様の説明Ｉ．序論本発明は一般に新規の安定化マイクロカプセル組成物及びその製造方法を提供する。これらの組成物及び方法は安定化架橋化複合官能性ポリマーマトリックスの層の存在を特徴とする。本発明の組成物には様々な用途、例えば細胞培養における保護組成物、並びに移植片への免疫バリヤーの供与及び宿主への外性生物材料の移植がある。本発明の方法は溶液中で部分的に又は生体的に実施できるという利点を有する。この利点は封入工程、例えば静電液滴発生器、抽出液滴発生器等の外的装置の必要性を排除する。このような装置の利用は封入工程全体に追加の装置及び工程費用を課することがある。更に、このような方法に係る力、例えば剪断力は封入する一層感受性な材料、例えば組織サンプル及び動物細胞を潜在的に害しうる。例えば、Huら、Biotech．and Bioeng．27：585-595(1985)、Sins key ら、Ann．N.Y．Acad．Sci．369：47-59（1981）を参照のこと。更に、本発明の組成物は免疫反応に対する向上したバリヤー特性を供する。これは例えば哺乳宿主に移植すべき材料を当該組成物が含んで成る場合に所望されうる。この向上したバリヤーは本来宿主に害を及ぼしてしまうように移植片を損傷又は不活性化しまいうる免疫反応に対して一層耐久性である。更に、本発明の組成物はコントロール可能な孔性を有し、様々な需要及び用途に合う組成物の改変の可能なマイクロカプセル組成物を提供する。更に、本発明の組成物は当該マイクロカプセル組成物の耐久度を高める向上した構造特性をも供する。このような構造的に向上した組成物は取扱い及び操作がし易く、そして剪断及び摩擦の如き物理的な力により損傷されにくい。 II．マイクロカプセル組成物本明細書において用いる語「封入」とは一般に物理バリヤーにより規定された区画内での組成物又は領域の保持を意味する。例えば、本明細書記載の封入化生物材料とは物理バリヤー内に保持され、且つそれにより囲まれた生物材料を意味する。従って、「封入」なる語には、コーティングが物理バリヤーを担う限り、コーティングされた組成物が含まれる。本明細書において用いる語「マイクロカプセル」とは封入化ビーズとして存在する組成物を意味し、ここで各ビーズは直径約３μｍ〜約２mmのサイズの範囲である。より好ましくは、かかるビーズは直径約50μｍ〜約 300μｍの範囲である。「安定化マイクロカプセル」とは、それらが委ねられるであろう環境の正常なストレスに耐久するようにされたマイクロカプセルを意味する。例えば安定化封入組成物はそれが導入される環境に比較的不溶性且つ非反応性であろう。Ａ．架橋化ポリマーマトリックスコーティング本発明のマイクロカプセル組成物は安定化架橋化複合官能性ポリマーマトリックス層の存在を特徴とする。本発明のこの複合官能性ポリマーは正及び負の双方に帯電した基を有する長鎖ポリマー化合物を意味する。これらのポリマーは繊維性凝集物を形成する能力をも特徴とし、そして中性pH前後では巨視的な粒子のまわりに核形成する。特に、かかる核形成は約 pH4.0〜約pH11.0において起こるであろう。好ましくは、核形成は約pH５〜約 pH 9.0において起こるであろう。本発明において有用な複合官能性ポリマーの例には、例えばコラーゲン、合成コラーゲン様ポリペプチド、誘導化多糖ポリマー、例えばアルギネート、又は巨大分子複合体へと自己集成するであろうその他の誘導化ポリマーが含まれる。封入組成物として用いられる多くのゲルマトリックスに関係する一の問題は安定なマイクロカプセル組成物として維持する能力の欠如にある。マイクロカプセル組成物の溶解又は分解はマイクロカプセルの外側の環境への封入化材料の急速曝露を招きうる。これは材料の不活性化又は分散を招き得、当該組成物の目的を損うこととなる。しかしながら、本発明の組成物中の架橋化ポリマーマトリックス層はかかる溶解又は分解に耐える安定化マイクロカプセルをもたらす。ゲルマトリックスではなく、本明細書に記載の安定化ポリマーマトリックスによるコーティングは従来論じられているもの、例えばアルギネートイオン対型ゲルのみよりも硬質な封入組成物をもたらす。このような高められた構造特性はより硬質なコーティングポリマー及びこのポリマー内での架橋に由来する。本明細書で用いる「架橋」とは、化学結合、要素、基又は化合物のいづれかより成る分子間の架橋の形成によるポリマー分子の二本以上の鎖の結合を意味する。この架橋は一般に向上した構造特性及び免疫バリヤーを供する。架橋は以下により詳しく論じる。本発明において用いる架橋化ポリマーマトリックス層の追加の利点はその層の孔質性をコントロールする能力にある。層の孔質性をコントロールすることにより、この組成物はそれを使用する特定の用途に応じて調整し得る。詳しくは、この孔質性は組成物に所定サイズの分子を保持する又はそれから排除するように調整し得る。例えば、この組成物を哺乳宿主に移植する場合、宿主により産生される抗体及び補体タンパク質に対するバリヤーを作り上げることが所望されるであろう。この場合、このバリヤーは抗体及び／又は補体サイズのタンパク質を排除するように調整すればよい。他方、所定サイズのタンパク質又は分子を組成物内に保持したい場合、それに従って孔質性を調整すればよい。本発明の組成物の孔質性は好ましくは約20,000ダルトンより大きい分子に対して制約された拡散速度をその組成物が有するようにするものである。一般に、コーティング層の孔質性は適用するポリマーマトリックスコーティングのレベルを変更すること、架橋レベルを変更することにより、又はマトリックス保全性を促進せしめるもしくは弱めるように択一的なポリマーの量を変えて混合することにより調整し得る。架橋化ポリマーマトリックスの相対孔質性はコーティングの厚み及び／又はコーティングにおける架橋レベルに反比例するであろう。コーティングの孔質性の調整に加えて、架橋剤のレベルを調整することによりそのコーティングの強さをも調整し得る。例えば、コーティング化材料が剪断又は摩擦力にかけられる場合、例えば組織培養用途のためにはより高度な架橋レベルが所望されうる。他方、かかる力にあまり遭遇しがちでない材料は低い架橋レベルを有してよい。Ｂ．コラーゲンコーティング本発明の好適な観点において、この安定化架橋化複合官能性ポリマーマトリックスはコラーゲンを含んで成る。コラーゲンは動物における骨、皮膚、軟骨及び接続組織の主要タンパク質成分である。その天然形態において、コラーゲンは規則的に右向きの超らせん状で互いに巻き付いて約長さ 300nm直径 1.5nmのコラーゲン分子を築いているα−鎖と呼ぶポリペプチド鎖の三量体として存在する。各α−鎖は一回転当り３個のアミノ酸残基で左向きらせんとして並び、第三残基毎にグリシンが存在する。従って、コラーゲンのα−鎖の構造は Gly-X-Yとなり、ここでＸとＹは任意のアミノ酸であってよいが、好ましくはその一方は通常プロリンである。コラーゲンの天然三重らせん構造において、グリシン残基は分子のコア領域を占めている。コラーゲンポリペプチドは一般に、分子の約６％未満を構成する「テロペプチド」領域がいづれかの末端において結合している長い中央区画をも特徴とする。このようなテロペプチド領域は一般に微視的及び巨視的なプレフィブリル、フィブリル又はフィラメントの側部方向及び長軸方向集成を担う。テロペプチドの削除は主に巨視構造へと集成するコラーゲン分子の能力に影響する。これらは、テロペプチドが架橋部位となる点でフィブリル／フィラメント安定化にも関与する。しかしながら、らせん内架橋が一層有意義である。コラーゲンは様々な物理特性を有する多種多様なタイプで存在し、最も多いのはＩ型〜III型である。本発明の実施において有用なコラーゲンは一般に自己集成可能であろう。好ましくは、この自己集成は中性又は関連pH前後で起こるであろう。この「関連pH」とは封入すべき生物材料の種類又はその組成物を導入すべき生物環境に応じて変わりうる。例えば、ほとんどの哺乳動物用途において、この関連pHはほぼ中性であろう。しかしながら、コーティングを施す材料が塩基性又は酸性域のどららかの域を外れるpHに適応しないとき、この域においてコーティングが可能なコラーゲンを使用することが所望されうる。同様に、この組成物を導入すべき環境が酸性又は塩基性の域に属するとき、この域内で不溶性であり続けるコラーゲンコーティングを供することが所望されうる。天然コラーゲンのペプシン消化により調製したコラーゲンの酸可溶性形態が本発明の実施において極めて有用でありうる。このような可溶性コラーゲンは一般に市販されている。例えば、酸可溶性ペプシン抽出形態のＩ型コラーゲンはColl agen Corp.より 0.012Ｎの HClの中でVitrogen(登録商標)100として市販されている。本発明の方法及び組成物にとっては酸可溶性Ｉ型コラーゲンが好ましいが、当業者は多数の型のコラーゲンを本発明の実施のうえで利用し得ることを認識するであろう。例えばMiyataらの米国特許第 4,164,559号にはコラーゲンの誘導化を変えることによるフィブリル形成のpHプロフィールの改変が報告されている。その中に記載のコラーゲン形態は特定の封入化組成物についての関連pHが天然の域よりも低い又は高い場合に適用可能でありうる。コラーゲンマトリックスの利用は半島細胞の培養において報告されている。詳しくは、Chaoら、Cell Transplantation 1：51-60（1992）は半島細胞の培養における三次元コラーゲンゲルマトリックスの利用を論じている。大型コラーゲンゲルマトリックス中の半島細胞の懸濁物は培養容器への細胞付着を阻止し、それ故半島細胞の回復速度を高める。これはまた往々にして半島細胞の分解をもたらす培養容器からの細胞の機械的脱離についての必要性を回避する。同様に、Ohga waraらIn Vitro Cell．Dev．Biol．26：348-352（1990）はブタ膵臓偽半島の長期培養における類似のコラーゲンマトリックスの利用を報告している。既に論じた通り、コラーゲンはその天然の存在形態では中性pHにおいて可溶性でない。しかしながら、コラーゲンの改質、例えばペプシン抽出又は化学修飾は一層可溶性の特性を有し、且つ少なくなったテロペプチド含有量に基づく低められた抗原性／免疫原性を有する一層清浄なコラーゲンを供する。コラーゲンの多くの市販の形態はこの方法により調製され、そして無菌濾過された酸可溶性コラーゲン溶液として入手できる。多くの可溶性タンパク質と同様に、これらのコラーゲンの溶解度は数多くの要因、例えばpH、温度、コラーゲンが示す主要形態の分子量、溶液中のタンパク質濃度及び塩濃度に依存する。溶解に影響を及ぼすその他の要因は溶液中の粒状物体の存在であろう。かかる粒状物体は中程度に溶解性であるタンパク質にとっての核形成部位となりうる。特定の理論に拘束されるわけではないが、本明細書記載の方法を利用してコーティングする材料はコラーゲンにとっての巨視的な核形成部位を供する。従って、本発明の方法は使用するコラーゲン溶液の天然特性の利点をとることにより生物材料のコーティングを供する。詳しくは、封入、支持体結合又は遊離粒子である生物材料をコラーゲンの溶液に導入する。この溶液の条件は調整し得、これによりコラーゲンはフィブリルを形成し始め、そして生物材料のまわりで核形成し出す。詳しくは、コラーゲンのpH、塩濃度、温度及び／又は濃度をフィブリル形成の開始速度、程度及び品質をコントロールするように選定又は調整してよい。調整した特定の条件及びこのような調整の域は数多くの要因、例えば封入する材料のpH変化、温度及び塩濃度に対する変化に依存しうる。コラーゲンペプチドの酸可溶性形態は一般にその溶液のpHが中性pHに近づくときに溶液中で合体し始める。このような合体したコラーゲンペプチド又はフィブリルは溶液から簡単に沈殿し出す。例えば、Vitrogenコラーゲン溶液はコラーゲンフィブリルの予備集成により pH4.5において粘性となり始め、そしてpH５以上で容易に沈殿し出す。この合体又はフィブリル形成はフィブリル形成の核形成のための部位を担う巨視的な粒子の存在下で更に高まりうる。市販のコラーゲン（Vitrogen（登録商標）-100は 0.3％ｗ／ｖの溶液として入手できる。しかしながら、本発明の実施において利用するコラーゲン溶液の濃度はコラーゲンの溶解度及びコーティングする材料の量に応じて容易に変えられうる。本発明の好適な態様において、0.03％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）のコラーゲン濃度を有しうるコラーゲン溶液を使用してよく、0.3％が最も好ましい。前述の通り、コラーゲンの核形成はpH及び酸／塩濃度によっても影響される。特に、有機酸／塩は一般にフィブリル形成を阻害又は遅め、コラーゲンの溶解度の上昇をもたらし、一方無機塩、例えばNaClはフィブリル形成を加速し、コラーゲンの一層迅速な沈殿をもたらす。フィブリル形成の遅延化は大きめのフィブリルの集成を可能にし、これは封入化組成物により強い構造保全性を授けるであろう（図１参照）。従って、有機酸／塩、例えば酢酸の溶液状であり、且つ有意な量の無機塩、例えば塩化物を欠くコラーゲンの提供が所望されうる。コラーゲン核形成の条件の調整に加えて、本発明の方法に従って生物材料に適用するコラーゲンコーティングのレベルを調整することも所望されうる。コーティングの量はコーティングを施すべき材料の表面積に関係するため、コーティング工程に加えるコラーゲンの総量はコーティングする材料の種類に応じて変わりがちであろう。例えば、コーティングする材料が小粒子、例えばアルギネートマイクロカプセル又はビーズであって直径が約50〜約 250μｍのサイズの範囲のものである場合、コラーゲンは約 0.2〜約 2.0ｇのコラーゲン／１mlの充填ビーズ容量において加えてよい。より大きいサイズの粒子又はより薄いコラーゲンコーティングについては、低いレベルの全コラーゲンを加えてよく、一方より厚いコーティング又はより小さい粒子サイズ（１mlの充填ビーズ容量当り大きい表面積）については、より多くの総添加コラーゲンを使用してよい。架橋したコラーゲンマトリックスはコラーゲンポリマーと一緒に加える別のポリマーの添加を通じて更に調整し得、これはその結果のマトリックスの保全性を高めるか又はそうでなければ弱める。例えば、追加の架橋性ポリマーは相互連結パズルピースのようにマトリックスの保全性に実質的な強化を与えうる。他方、マトリックスの保全性はコラーゲンフィブリル間のスペーサーを担うポリマーの組込みにより架橋レベルを下げることで低まりうる。前述の通り、コラーゲンフィブリル形成は無機塩の存在下で高まり、そして有機酸／塩の存在下で阻害される。市販のコラーゲン調製品は一般に HCl溶液で供されるため、塩酸を有機酸と交換することが有用でありうる。この交換は例えば透析、ゲル濾過及び限外濾過の如き様々な手段により実施できうる。好適なコラーゲン溶液は約 pH4.5の希薄酢酸溶液（酢酸で pH4.5に調整した脱イオン水）であろう。pH4.5では、コラーゲン溶液は一般にフィブリルの事前集成により若干粘性であろう。pH５より高いpHへのコラーゲン溶液のpHの調整はフィブリル形成及びタンパク質核形成をもたらす。中性pH前後でのコラーゲンの核形成は極端な pHに感受性な生物材料のコーティングに極めて適切なものとする。従って、一般にコラーゲン核形成の開始は約pH４以上へのコラーゲン溶液のpHの調整により実施する。好ましくは、pHは約pH５〜pH8.0 の間、そして最も好ましくは約 pH6.5 〜約 pH6.9に調整する。コラーゲンタンパク質は約 8.5〜10の報告等電点を有する。即ち、核形成pH、例えば５〜８では、コラーゲンペプチドは一般に正味正の電荷を担持する。従って、好適な方法において、コーティングする生物材料は正味負の電荷を担持しうる。コラーゲンとそのまわりでの核形成が所望される材料上の官能基との正味の電荷の差は生物材料のまわりの核形成を高めうる。市販の型のコラーゲンに加えて、誘導化コラーゲンをも本発明の方法において使用し得ることも期待できうる。ポリマーの誘導化は当業界に公知であり、そして使用する特定のポリマーの特性の改変、例えば向上した核形成、架橋化形態の優れた安定性、核形成pHプロフィールの改変等を可能にしうる。誘導化コラーゲンの例にはペギル化コラーゲン（ポリエチレングリコールの共有結合したコラーゲン）、スクシニル化コラーゲン、アルキル化コラーゲン（例えばメチル化）、アミノ化コラーゲン、活性化アルデヒド誘導化コラーゲン等が含まれる。例えば米国特許第 4,164,559号を参照のこと。Ｃ．その他のポリマーマトリックス本発明は主にコラーゲンコーティングの観点で論じてきたが、様々なその他のポリマーをも使用し得ることが明らかでありうる。例えば、本明細書記載のコラーゲン組成物と類似の特性をもつポリマーが極めて有用でありうる。特に注目されるのは酸性pH又は塩基性pHでは可溶性だが、中性又は関連pH前後では沈殿し、コーティングする材料のまわりでポリマーの核形成を起こすようなポリマーである。より好ましいのは線維状凝集物を形成し、且つ中性pHにおいてコーティングする材料とは反対の正味の電荷を有するようなポリマーである。例えば、コラーゲンのアミノ酸配列に類似の構造を含んで成る合成ペプチド又はその他のポリマーが本発明の方法及び組成物において適用されうる。特に、コラーゲンの三重らせんの構造は小さめのグリシン、プロリン及びヒドロキシプロリン分子がらせんのコアにあり、一方、大きめのアミノ酸、例えば正に帯電した残基、例えばリジン、及び負に帯電した残基、例えばアスパラギン酸又はグルタミン酸が三量体の外側領域に位置することをもたらす。これはその表層上に交互の正及び負の電荷を有するポリマーをもたらす。ポリペプチドは一般に本発明において利用するために合成的に又は組換的に調製されうる。一般に、ポリペプチドの組換製造のための技術はSambrookら、Mo lecular Cloning：A Laboratory Manual(第２版)Vols．1-3，Cold Spring Harbo r Laboratory，(1989)に記載してある。ポリペプチドの合成技術は一般にMerrif ield，J．Amer．Chem．Soc．85：2149-2456(1963)，Atherton,らSolid Phase Pe ptide Synthesis：A Practical Approach，IRL Press，Oxford(1989)及びMerrif ield，Science 232：341-347(1986)に記載されている。別の観点において、安定化架橋化ポリマーマトリックスは誘導化多糖ポリマー、好ましくはアルギネートポリマーを含んで成りうる。本発明の誘導化アルギネートポリマーはコラーゲン分子の交互の電荷と類似して、各ポリマー内に複合の陰イオン及び陽イオン基を特徴とする。Ｄ．架橋ポリマーマトリックス層の適用後、その層を架橋させてその層を安定化させることができうる。使用する架橋剤の利用はコーティングプロセスにおいて使用するポリマーのタイプに一般に依存するであろう。長さゼロの架橋剤が本発明の実施のために好ましい。「長さゼロの架橋剤」とは二本のポリマー分子の官能基の間の直接架橋を中介又は生成するであろう架橋性化合物を意味する。例えば、二種類のタンパク質の架橋において、長さゼロの架橋剤は一のタンパク質のアミノ酸側鎖由来のカルボキシル基と別のアミノ基との間での橋又は架橋の形成を、外来材料の組込抜きでもたらすであろう。特に有用な架橋剤は水、アンモニア又はアミン含有化合物、アルコール又はその他の単純な基を遊離させる縮合反応を介して架橋を及ぼす。かかる架橋剤は縮合性架橋剤と呼ぶ。本発明の好適な観点において、コラーゲンをポリマーとして選んだ場合、当業界公知の数多くの有機架橋剤が使用できうる。カルボジイミドはタンパク質架橋剤として極めて有用であり、そして本発明の実施において好ましい。特に、カルボジイミドは一のタンパク質のカルボキシル基を別のタンパク質のアミノ基に縮合反応を介して架橋することができ、架橋化タンパク質及びイソ尿素をもたらす。しかしながら、有機溶媒において可溶性であるしかないほとんどのカルボジイミドの種類は多くの生物学的用途においてその用途が排除されうる。従って、溶剤作用が生物材料により寛容されうる限り有機可溶性架橋剤が使用できうる。従って、本発明は、より好適な観点において、水溶性カルボジイミドを利用するコラーゲン層の架橋を提供する。より好適な架橋剤は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（「 EDC」）である。架橋試薬の量は架橋すべき表面積の大きさに依存して変えてよい。例えば、二倍の量のポリマーマトリックス、例えばコラーゲンコーティングを含んで成る組成物は一般に二倍の量の架橋剤を含んで成る。他方、二倍の量の試薬及び／又は架橋時間はコーティングした材料にとっての個々の要件に依存して架橋のレベルを上げる又は下げるのに調整できうる。特に重要なのはコーティングを架橋する程度の調整を通じてコーティングポリマーマトリックスの孔質性を調整できる能力にある。例えば、架橋のレベルを高めることにより、コーティングの孔質性は低まり、一方架橋のレベルを低めることにより、孔質性は高まる。同様に、前述の通り、このマトリックスは架橋し得る又はし得ない追加のポリマーを含んで成ってよく。高められた又は低められた一体マトリックスがもたらされる。このような交互ポリマーの利用はマトリックスの所望の孔質性を達成するために架橋剤のレベルと共に調整してよい。Ｅ．コーティングの有効性の決定様々な方法がコーティング工程及び層の有効性を決定するうえで利用し得る。例えば、特定のコーティング工程に由来する層の孔質性は封入化赤血球に架橋化ポリマーマトリックスのコーティングを適用することにより決定し得る。RBCは適当な媒体に懸濁してよく、次いでこれをマイクロカプセル外のヘモグロブリン又は細胞の存在についてアッセイし得る。コーティング効率は、例えば顕微鏡を利用し、そして代表的なサンプル中のコーティングされた及びコーティングされた粒子、ビーズ又は細胞の数を計測することによって目視決定もできうる。コーティング工程の有効性はコーティング化／封入化組成物を組成物内の生物材料に対する抗体及び／又は補体タンパク質とインキュベートし、そしてこの生物材料に結合する抗体を検出することによっても決定し得る。抗体結合は例えば細胞の抗体誘導溶解により又は生物材料に結合したラベル化抗体の存在により示されうる。他方、コーティングの保全性は標準の平衡透析方法により決定し得る。 III．封入化生物材料好適な観点において、本発明の安定化マイクロカプセル組成物は一般にマイクロカプセル内に生物材料を含んで成る。本明細書において用いている表現「生物材料」は生物活性を有する生物を起源とする任意の材料と定義される。例えば、生物材料には細胞、即ち、細菌、菌類、哺乳動物、昆虫、植物等が含まれる。生物材料の定義の中にはタンパク質、酵素、細胞断片、オルガネラ等も含まれる。一般に、生物材料は細胞、野生型又は遺伝子操作した、そして好ましくは膵臓の半島細胞を含んで成るであろう。特定の理論に拘束されるわけではないが、この生物材料はそのまわりにコラーゲンフィブリルが形成し得る適切な核を供する。従って、本発明の方法は任意の粒子のまわりに安定化架橋化ポリマーマトリックスを適用するのに利用されうる。例えば、ある状況においては、この生物材料は本発明の方法に従って架橋化ポリマーマトリックスで直接コーティングされることができ、即ち、組織サンプル、独立細胞等である。しかしながら、ある状況においては生物材料を他の組成物の成分として、それがポリマーマトリックスの核形成のための適当な部位／粒子を担うように提供されることも所望されうる。例えば、本発明の方法を利用してタンパク質、酵素又はその他の可溶性生物材料を封入することを所望するとき、このタンパク質又は酵素を適当な固相支持体に結合させることが必要でありうる。次にこの支持体結合材料に本発明の方法を利用して架橋化ポリマーマトリックスをコーティングしてよい。適当な固相支持体には一般に当業者に公知のもの、例えばセルロース、アガロース、シリカ、デンプン、ジビニルベンゼン、ポリスチレン等が含まれる。生物材料が細胞又は細胞フラグメントより成る場合、適当な固相支持体も使用できうることが理解されるべきである。他方、かかる生物材料を第一組成物の中に封入してゲル粒子を形成し、それから架橋化ポリマーマトリックスによりコーティングしてよい。Ａ．封入化生物材料のコーティング好適な態様において、この生物材料を第一組成物の中に封入し、それから架橋化ポリマーマトリックスでコーティングする。より好適な観点において、この生物材料をアルギネートゲルの第一組成物の中に封入し、それからポリマーマトリックスコーティングにかける。コーティングを施すべき生物材料は、封入化、支持体結合化又は遊離であろうと関係なく、一般に比較的小さいものであろう。例えば、封入化生物材料の場合、個々のカプセルは一般にコラーゲンコーティングの前では直径において約20μｍ〜約 200μｍであろう。同様に、支持体結合生物材料は一般に、支持体を含んで、約20μｍ〜約 200μｍの直径であろう。遊離の生物材料、例えば細胞又は組織サンプルは、コラーゲンコーティングの前では、独立の細胞、例えば〜１μｍから、多数の細胞を含んで成り、そして直径 200μｍ〜２mmのサイズの範囲でありうる。アルギネートはマヌロン酸及びグルロン酸の線形ポリマーであり、それらはグルロネートブロックを形成している複数の隣接し合うグルロン酸残基のブロックと、マヌロネートブロックを形成している複数の隣接し合うグルロン酸残基のブロックとが並んでおり、グルロン酸残基とマヌロン酸残基が交互となった複合又は異質ブロックが介在している。一般に、一価のカチオンアルギネート塩、例えばNa−アルギネートは可溶性である。二価のカチオン、例えばCa⁺⁺，Ba⁺⁺，Sr⁺⁺ 又はFe^++/+++はグルロネートと反応する傾向を有し、そしてグルロネートブロック内でのこれらのカチオンの協奏結合は安定なアルギネートゲルの形成を担う一次分子内架橋を供する。本発明のある観点において、非線維原性であるアルギネートゲルを使用することも所望されうる。これは封入化生物材料を哺乳宿主内に移植する場合に特にそうである。アルギネートの線維原性は一般にフカン及びポリフェノールに富むフィソイデス(physoides)並びにその他の粒状夾雑物の夾雑の原因となる。このような夾雑物はその線維原性を除くためにアルギネートから除去しておいてよい。例えば、公開 PCT出願第93／24077 号を参照のこと。アルギネートゲル内への生物材料の封入は様々な方法により実施できうる。一般に、かかる封入方法は生物材料をアルギネートの一価のカチオンの塩、例えばアルギン酸ナトリウムの第一溶液に懸濁することより成る。次いで生物材料を含むアルギネート溶液の液滴を空気の中で作る。液滴の作製は任意の液滴製造装置を用いて行ってよい。例えば、液滴はチューブ又は針から大気に至る重力流により作製してよく、この場合表面張力の効果が懸濁物の球滴の形成をもたらす。他方、静電液滴発生器を使用してよく、この場合、アルギネート溶液と採取溶液との間で静電気の差を設け、アルギネートがチューブ又は針を通って小滴となるようにする。その他の装置も同等に有用であり、スピニングディスク液滴発生器又は層状エアーフロー押出装置の利用が含まれる。Groo sen，Fundamentals of Animal Cell Encapsulation，CRC Press(1993)、米国特許第 5,286,495号を参照のこと。一旦作製できたら、その液滴を二価の金属カチオン、例えばCa⁺⁺，Ba⁺⁺又はSr⁺⁺ を含んで成る分離溶液に集める。一般に、CaCl₂，BaCl₂及び SrCl₂溶液が好ましく、BaCl₂が最も好ましい。この液滴を回収溶液中のアルギネートと二価カチオンとの相互作用によりゲル化し、ゲル化アルギネート液体内に懸濁した生物材料を捕捉又は封入する。他の方法において、アルギネート封入は本願と同時に出願した同時係属米国特許出願第（代理人事件番号16325-13）に実質的に詳しく述べられている方法に従って溶液の中で実施してよい。これらの方法に従うと、アルギネート封入化生物材料は溶液中で全体的に、大気中での液滴の作製の必要性抜きで実施できうる。即ち、液滴発生器は不要である。簡単に述べると、他のアルギネート封入方法に従うと、本明細書において定義する生物材料は二価の金属カチオンの溶液で飽和又は満たすことができうる。遊離（未結合）カチオンを生物材料の表面から洗い落とし、次いでそれをアルギン酸ナトリウムの溶液に懸濁する。生物材料の中及び周囲のアルギネート溶液の中にある二価カチオンのレベルの差は生物材料からアルギネート溶液に至るカチオンの放射状拡散をもたらし、アルギネートをゲル化し、そして生物材料を囲むアルギネートバリヤーの形成をもたらし、これはその後二価のカチオン溶液による更なる処理により硬化し得る。1995年３月３日出願の米国特許出願第08／399,698 号参照のこと。アルギネート封入化材料をポリマーマトリックスでコーティングし、それを本発明の方法に従って架橋するか、又はそうでなければその構造を安定化するように更に処理してよい。アルギネート構造を安定化するための更なる処理は当業者に一般的に知られているもの、例えば多重アルギネートコーティング及び／又はポリリジンコーティング等がある。例えば、J．Pharm．Sci．70：351-354(1981) 及び米国特許第 5,286,495号参照のこと。Ｂ．生体適合性ポリマーの最終被覆ポリマーマトリックス層の架橋の後、この組成物は任意的にその架橋化ポリマーマトリックス層をコーティングしている生体適合性ポリマーマトリックスの追加の層を含んで成りうる。「生体適合性ポリマー」なる語は哺乳動物系に対して非毒性又はそうでなければ無害であるポリマーを意味する。生体適合性ポリマーの例にはアルギネートの非線維原性形態、並びにポリエチレングリコール及びリポソーム製剤が含まれる。この更なる生体適合性ポリマーの層はこの組成物を、架橋化ポリマーマトリックスコーティングに対して免疫反応性を有し得る哺乳動物に導入するときに極めて所望されうる。好適な観点において、本発明の組成物は生体適合性アルギネートゲルの更なる層を含んで成る。生体適合性アルギネートは実質的に上記した通りのものである。この更なるアルギネート層は既に記載のアルギネート封入方法に従って適用できうる。 III．その他のマイクロカプセル組成物本発明の方法は中空マイクロカプセルの調製において適用し得ることも理解すべきである。詳しくは、架橋化ポリマーマトリックス、例えばコラーゲンの層をビーズのまわりに形成してよい。架橋化の後、内部ビーズ構造を溶解し、そしてその内部から抽出し、架橋化ポリマー外殻又はマイクロカプセルが残る。特別な例として、上記の通りのコラーゲンの層によるアルギン酸カルシウムビーズのコーティングの後、このアルギネートビーズを溶解させ、そしてコラーゲン外殻から除去する。Ca−アルギネートの溶解は例えば最初にアルギネートをゲル化するのに用いたカルシウムカチオンのキレート化により行える。エチレンジアミン四酢酸（「EDTA」）又はエチレングリコールビス−（β−アミノエチルエーテル） −Ｎ，Ｎ−四酢酸（「EGTA」）がカルシウム及びその他の二価カチオンのキレート化に極めて有用である。アルギネートゲルが一旦溶解したら、それをカプセル内部から、例えば周囲媒体への逃散により容易に除去できる。架橋化コラーゲン外殻又はマイクロカプセルを様々な用途、例えば薬剤搬送系のための薬理製剤に用いるか、又は他に更なるアルギネートもしくはコラーゲンコーティングの追加の如き更なる処理にかけてよい。関連の観点において、アルギネート封入化コアのないコラーゲンコーティングした生物材料を作り上げることが所望されうる。例えば、コラーゲンマイクロカプセルを、適当な表面に対する付着についての生存要件を有する細胞のまわりに形成させてよい。例えば、肝細胞及びその他の一次細胞は成長促進及び維持用の細胞培養表層として改質プラスチックよりもコラーゲンを好むことが示されている。細胞をまずCa−アルギネートゲルの中に封入し、次いで架橋化ポリマーマトリックス、例えばコラーゲンでコーティングする。このようにしてCa−アルギネートゲルの溶解は架橋化コラーゲン微小球であって、注目の細胞を含み、規定の孔質性を有し、且つ好適な細胞付着面を有し、また任意的なアルギネート外層を有するものをもたらす。 IV．本発明の封入化生物材料についての利用免疫反応による崩壊に耐える本発明の封入化組成物の向上した能力及び向上した構造的特性はこれらの組成物が様々な工業的及び治療的用途において有用なものにする。Ａ．移植可能な生物材料の封入本発明の封入組成物は移植療法において極めて有用である。「移植」なる語は、広義には本明細書において「宿主」又は「患者」と呼ぶ動物への外性生物材料の導入を意味する。この外性材料は同一の宿主内の様々な箇所に由来するか、又は「ドナー」と呼ぶ別の動物に由来しうるものであってよい。ドナー及び宿主は同一でも異なる種であってもよい。同一の種に由来する移植は同種移植と呼び、一方二種類の種との間では異種移植と呼ぶ。一般に、同一又は異なる種の二匹の別々の動物との間での移植にとって、移植した材料に関する高まった免疫保護を有する移植可能組成物を提供することが所望されるであろう。本発明の組成物はこのような用途に極めて有用である。更に、移植組成物自体は宿主において有意な免疫反応を及ぼすことがない。従って、移植療法において使用するとき、本発明の封入化組成物は一般に架橋化ポリマーマトリックス層の上にアルギネートゲルの追加の層を含んで成るであろう。より好ましくは、移植すべき生物材料、例えば細胞を第一アルギネートゲル内に封入し、次いで架橋化ポリマーマトリックス層でコーティングし、そして第二アルギネートゲル層でコーティングする。本発明の移植方法にとって適当な好適な組織には分泌器官組織が含まれ、ここでドナー器官から宿主への移植は宿主においてドナーの器官の機能が再現され、これにより宿主の機能が代替される又は補助されることを意図している。当業者の様々な組織のタイプの移植における本発明の方法の有用性を理解するであろうが、特に好適なドナー器官組織には膵臓半島細胞、肝細胞、神経細胞、腎皮質細胞、血管内皮細胞、甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞及び卵巣細胞が含まれる。宿主における機能性欠如又は不全を示す野生型及び組換細胞系の双方が本発明の方法に組込まれ得、ここでそれらの宿主への導入は機能欠如又は不全を代替するであろう。極めて好適な例において、本発明の移植方法は膵臓半島細胞の移植に関連する。半島細胞の好適な起源には例えばヒト、亜ヒト霊長類、ブタ、ウシ、ウサギ、ラット、マウス等が含まれ、ヒト及びブタの半島が最も好ましい。本明細書に記載の半島細胞の移植は真性糖尿病に苦しむ患者を処置するうえで極めて有用でありうる。詳しくは、この処置方法は本発明の方法に従って封入した有効な量の半島細胞異種移植片又は同種移植片の患者への導入を含んで成る。有効な量は封入化細胞の量であって、糖尿病患者に導入したとき、患者の血液グルコース値の正常化をもたらすような量と定義される。正確な有効量は患者のサイズ及び処置すべき特定障害の症度に一般に依存するであろう。一般に、かかる有効量は処置を及ぼすのに十分な量の移植材料を確保するため、過剰量の封入化組成物を含んで成りうる。封入化組成物の移植は一般に、組成物に損傷を与えることなく封入化材料の懸濁物の通過を可能にするのに十分なボア直径を有する皮下組織注射を介する単純な注射により実施される。移植は切開手順の利用、又は当業界公知のその他の方法によっても実施し得る。特定の移植方法は移植すべき材料及び移植の箇所に依存してかわりうる。移植のため、本発明の封入化組成物は一般に薬理組成物として処方されるであろう。特に、この組成物は一般に１又は複数種の薬理又は治療的に許容される担体及び任意的なその他の治療成分と一緒に処方してよい。様々な所見が例えばGi lmanら(編)(1990)Goodman and GilmanのThe Pharmacological Bases of Therape ntics、第８版、Pergamon Press；Novel Drug Delivery Systems第２版 Norris( 編)Marcel Dekker Inc．(1989)及び RemingtonのPharmaccutical Sciences に記載されている。それらの全開示内容は引用することで本明細書に組入れる。薬理学的に許容される担体には水、含塩水、緩衝剤及び例えばMerck Index，Merck a nd Co.，Rahway，New Jerseyに記載のその他のの化合物を含むであろう。Ｂ．細胞培養本発明のマイクロカプセル組成物の向上した構造保全性は細胞培養法においても有用な利点を供する。この封入化組成物は細胞が一般の細胞培養法に適合しない場合に極めて有用である。この非適合性は、細胞培養工程及び装置、例えば撹拌、通気、材料の取り扱い等に関係する物理的な力に対する特定の細胞タイプの感受性でありうる。他方、この非適合性は注目の細胞タイプの特定の性質の結果、例えば培養槽への付着又は細胞の過剰分散でありうる。例えば膵臓半島細胞の培養はいくつかの障害、例えば細胞の分散、培養槽への付着及び機械的撹拌による崩壊を強いる。Chaoら、Cell Transplation 1：51-60(1992)を参照のこと。従って、本発明の封入化組成物は細胞培養技術においても有用である。詳しくは、培養すべき細胞をまず本明細書記載の方法に従って封入する。固相支持体等に固定されていようと関係なく、本発明の封入化組成物の高められた構造特性を有するこの封入化細胞を当業界公知の伝統的な培養技術に従って培養することができうる。例えば、Feker and Tolbert，Sci．Am．248：36-43(198 5)を参照のこと。上記の用途に加えて、当業者は本明細書記載の方法及び組成物が、経口又はその他の投与方法のための薬理搬送製剤の処方においても有用でありうることを理解するであろう。本発明を以下の実施例により更に説明する。これらの実施例は本発明の例示にすぎず、本発明を限定することは意図しない。実施例実施例１−コラーゲンコーティングＡ．コラーゲン核形成条件の決定 Vitrogen-100（登録商標）溶液は 100mlの無菌濾過した 0.3％のコラーゲン溶液pH2.0(0.012ＮのHCl)として市販されている。Vitrogen溶液を、（１）希薄酢酸（「HOAc」）pH4.5（pH4.5に達するように水にHOAcを添加）で 4.4〜4.6 のpH に溶液が達するまで透析し、次いで希薄HOAc（１Ｍ）を用いてpHを 3.5に調整し、そして希薄水酸化ナトリウム(NaOH)(１Ｎ)を用いて pH4.5にもどす（図１参照、線分Ａ）；（２）６リットルの脱 H₂Oに透析し、次いで１ＮのNaOHで 4.5にpH 調整する（図１参照、線分Ｂ）；(３)(１)の通りに希薄HOAc透析し、次いで１ＮのNaOHで約10にpH調整し、そして１ＮのHOAcを用いて pH6.7に調整する（図１参照、線分Ｃ）。このようにして得られるコラーゲン溶液は（１）よりも高い酢酸ナトリウム濃度を有する。その他のコラーゲン溶液は１ＮのNaOHを用いてpH 6.6 〜6.9 に調整し、そしてコラーゲン核形成／沈殿を 530nmでの吸収の上昇として光学的に測定した。希薄有機酸溶液中のコラーゲン（線Ａ及びＣのそれぞれ）は高いレベルの光屈折を示し(530nmでのAbs)、高めのレベルのコラーゲンフィブリル形成及び大きめのフィブリルを示唆する。残留塩化物の存在下で核形成（線分Ｂ）は低めのフィブリル形成レベルを示した。 Vitrogen溶液(100ml)を６リットルのHOAc，pH3.5 に対して透析した。この透析溶液を３日間にわたり４回交換した。吸光核形成アッセイはキュベットの中で 1.5ｇの２Ｘのスクロース溶液と混合するのに１ｇの透析コラーゲン溶液を必要とする。コラーゲン−スクロース溶液のpHを１ＮのNaOHで pH6.2に調整し、そして溶液の吸収をモニターした。図１Ｂにおいて、データーは追加的に添加したHO Ac(Ａ＝0.010ml，Ｂ＝0.012ml，Ｃ＝0.014ml)の関数としての核形成レベルの変化を対比させている。このデーターは、核形成反応における酢酸濃度の上昇が巨視的なコラーゲンファイバーの溶液依存性集成を阻害することを実証した。上記の通りに力価検定したコラーゲンでコーティングした赤血球を以下に詳細の溶血アッセイにかけた。Ｂ．コラーゲンコーティング方法封入化赤血球を含んで成るアギネートビーズのサンプルを、ビーズを食塩水２ mMの塩化カルシウム（「CaCl₂」）溶液の中に懸濁することにより洗浄した。これらのビーズを低速(1000〜2000rpm)で遠心分離し、そして上清液を捨てた。この洗浄工程を繰り返した。ビーズを２Ｘのスクロース溶液(18.5％のスクロース、２mMのCaCl₂)に懸濁することにより２回洗い、次いで遠心し、そして上清液を捨てた。充填ビーズの容積に対して半容量の２Ｘのスクロース溶液を加えた。0.5Ｍの２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸緩衝液(MES)pH6.0 を0.02Ｍの MES の最終濃度となるようにビーズ懸濁物に加えた。希薄酢酸中の0.25〜 0.3％のコラーゲン溶液約 pH3.4をこのビーズ懸濁物に加え、１ｇのコラーゲン／１mlの充填ビーズ容積のおよその比にした。１ＭのNaOHを加えて懸濁物のpHを約 6.2〜約 6.5にした。このビーズ懸濁物を試験管ローテーター上で室温で１時間回転させた。回転後、ビーズ懸濁物を１Ｘのスクロース溶液(9.25％のスクロース、２mMの CaCl₂，10mMの MES，pH6.0)で希釈した。希釈懸濁物を遠心し、洗浄し、そして上清液を除去して充填ビーズ容積を全容積の半分にした。0.1mlのEDC(１−エチル−３−（−３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩)溶液をビーズ懸濁物に１〜４mg／mlの最終 EDC濃度／１mlの充填ビーズ容積にした。これらのビーズを直ちにボルテックスにかけ、そして手で30分振った。ビーズを４mMの CaCl₂，0.5％のゼラチンを添加して媒体の中に希釈した。ビーズを遠心し、そして上清液をデカンテーションした。ビーズを再び媒体の中に懸濁した。Ｃ．コラーゲンコーティングしたビーズのアッセイコラーゲンコーティングしたアルギネート封入化 RBC_s （「コーティング化ビーズ」）をアルギネート封入化RBCs（「未コーティングビーズ」）と様々な試験で比較し、そして細胞溶解の指標としてヘモグロビン遊離についてアッセイした。約10,000個の封入化 RBCビーズを食塩水、水のいづれかの中で、モルモット補体又は抗ヒツジ RBC抗体及びモルモット補体の存在下でインキュベーションした。アリコート(0.1ml)を各処理から20分、60分、150分及び 240分目において取り出し、そして上容量の D rabkin試薬により上清液中のヘモグロビンの光学測定のために希釈した。ネガティブコントロールとして操作した食塩水中に懸濁したビーズは実験中に溶血を示さず、一方ポジティブコントロールを構成する水の中の懸濁物は図２Ａに示すようにほぼ完全な即時溶血を示した。示している通り、ネガティブ食塩水コントロールはアルギネート封入化RBCs（Ｒ＋Ｓ）又はコラーゲンコーティングしたアルギネート封入化RBCs（Ｘ＋Ｓ）に関して溶血を示さなかった。逆に、ポジティブの水コントロールはアルギネート封入化RBCs及びコラーゲンコーティング化アルギネート封入化RBCs（Ｒ＋Ｗ及びＸ＋Ｗのそれぞれ）についてほぼ完全な溶血を示した。コラーゲンコーティングしたRBCsの低減した溶血レベルは追加のコーティング工程の際に生ずる損失の結果を信じられる。モルモット補体又は抗体及びモルモット補体（「＋Ｃ」と「＋Ａ＋Ｃ」のそれぞれ）とインキュベーションすると、コラーゲンコーティングしたRBCsは、アルギネート封入のみのRBCsよりも明らかに低いレベルの溶血を示した。特に、コラーゲンコーティングしたビーズ対未コーティングビーズの対比は、コーティングしたビーズが未コーティングビーズよりも補体活性による溶解に対してはるかに耐性であることを示した。同様に、コーティング化ビーズは抗体依存性補体溶解によく耐え、一方未コーティングビーズは 150分で完全な溶解を示した。類似の実験において、約 5,000個のコラーゲンコーティングしたアルギネート封入化 RBCビーズを食塩水、水のいづれかの中で、又は抗−ヒツジ RBC抗体及びモルモット補体と共にインキュベーションした。アリコート(0.1ml)を４時間後に各処理から取り出し、そして上清液中のヘモグロビンの吸光測定のために４容量の Drabkin試薬で希釈した。ここでも、ネガティブコントロールを担う食塩水に懸濁したビーズは実験中に溶血を示さず、一方ポジティブコントロールを構成する水中の懸濁物に図２Ｂは示す通りほぼ完全な溶血を示した。数値は上記の三通りのコラーゲン核形成の力価を示し、そして図１Ｂに示す。図２Ｂに示すように、上記の方法に従う酢酸塩のより正確な滴定はコラーゲンコーティングしたアルギネート封入化ビーズ中のほぼ完全な免疫バリヤーの形成を可能にする。コラーゲンコーティングの保全性の追加の例を図３に示す。コラーゲンコーティングしたアルギネート封入化RBCsをEDTAで処理した。EDTAはカルシウムをキレートすることによりCa−アルギネートを溶解することを意図している。RBCsはマイクロカプセルから遊離することが示された。Ｄ．糖尿病のBalb／Ｃマウスにおける単一コーティングした及びコラーゲン架橋化オーバーコーティングしたイヌの半島の生存対比単一コーティングしたイヌの半島及びコラーゲン架橋化アルギネートオーバー（重）コーティングしたイヌの半島をストレプトゾシン処理したbalb／ｃマウスの中に腹腔内移植した。表１に示す通り、30日以上生存した糖尿病の動物の比率は、単一コーティングしたイヌの半島よりもコラーゲン架橋したアルギネートオーバーコーティングしたイヌの半島で移植した動物の方が高かった。以上は本発明を明確化及び理解し易くするために述べてきたが、当業者は本発明の範囲を逸脱することなく様々に変更することができる。本明細書に引用する公開物及び特許文献は全て引用することで本明細書にその内容を組入れるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも一層の複合官能性ポリマーを含んで成る安定化マイクロカプセル組成物であって、前記ポリマーの層がコントロール可能な孔質性を有する安定化架橋化複合官能性ポリマーマトリックスを含んで成る、組成物。２．前記組成物が前記少なくとも一層の複合官能性ポリマーによりコーティングされた生物材料を更に含んで成る、請求項１記載の安定化マイクロカプセル組成物。３．前記生物材料が前記少なくとも一層の複合官能性ポリマーによりコーティングされる前に最初に第一ポリマーゲルの中に封入されたものである、請求項２記載の安定化マイクロカプセル組成物。４．前記複合官能性ポリマーの層が架橋化コラーゲンを含んで成る、請求項１記載の安定化マイクロカプセル組成物。５．前記架橋化コラーゲンが架橋化Ｉ型コラーゲンを含んで成る、請求項４記載の安定化マイクロカプセル組成物。６．前記架橋化コラーゲンが架橋化ペギル化コラーゲンを含んで成る、請求項４記載の安定化マイクロカプセル組成物。７．前記複合官能性ポリマーの層が架橋化誘導化多糖類ポリマーを含んで成る、請求項１記載の安定化マイクロカプセル組成物。８．前記複合官能性アルギネートポリマーが複合アニオン及びカチオンアルギネートポリマーを含んで成る、請求項７記載の安定化マイクロカプセル組成物。９．前記組成物が前記少なくとも一層の複合官能性ポリマーでコーティングされた少なくとも一層の生体適合性ポリマーを更に含んで成る、請求項１記載の安定化マイクロカプセル組成物。 10．前記生体適合性ポリマーがアルギネートポリマーマトリックスを含んで成る、請求項９記載の安定化マイクロカプセル組成物。 11．前記生体適合性ポリマーがポリエチレングリコールポリマーマトリックスを含んで成る、請求項９記載の安定化マイクロカプセル組成物。 12．前記組成物が前記安定化架橋化複合官能性ポリマーマトリックスを通じる分子量20,000ダルトンより大きい分子の拡散を制約する、請求項１記載の安定化マイクロカプセル組成物。 13．前記生物材料が細胞又は細胞系である、請求項２記載の安定化マイクロカプセル組成物。 14．前記細胞が膵臓半島細胞である、請求項13記載の安定化マイクロカプセル組成物。 15．前記細胞が肝細胞である、請求項13記載の安定化マイクロカプセル組成物。 16．前記細胞系が遺伝子操作細胞系である、請求項13記載の安定化マイクロカプセル組成物。 17．前記第一ポリマーゲルがアルギネートポリマーマトリックスを含んで成る、請求項３記載の安定化マイクロカプセル組成物。 18．前記架橋化複合官能性ポリマーマトリックスが長さゼロの縮合可能架橋剤で架橋されたものである、請求項１記載の組成物。 19．前記長さゼロの縮合可能架橋剤がカルボジイミドである、請求項18記載の組成物。 20．前記カルボジイミドが水溶性カルボジイミドである、請求項19記載の組成物。 21．前記水溶性カルボジイミドが１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩である、請求項20記載の組成物。 22．生物材料を封入するための方法であって、前記生物材料を、架橋化可能な複合官能性ポリマーの溶液に入れる、ここでこのポリマーは前記生物材料のまわりに核形成する；前記核形成したポリマーを架橋して、コントロール可能な孔質性を有する架橋化複合官能性ポリマーマトリックスの安定化層を生成する；ことを含んで成る方法。 23．前記生物材料を第一ポリマーゲルの中に封入し、それから前記生物材料を複合官能性ポリマーの溶液の中に入れる、請求項22記載の方法。 24．前記ポリマーの核形成を、前記複合官能性ポリマー溶液のpH、塩濃度又は温度の変更により開始させる、請求項22記載の方法。 25．前記生物材料を封入した前記第一ポリマーゲルが前記複合官能性ポリマーとは反対の正味の電荷を含んで成る、請求項23記載の方法。 26．前記複合官能性ポリマーの層が架橋化コラーゲンを含んで成る、請求項22 記載の方法。 27．前記架橋化コラーゲンが架橋化Ｉ型コラーゲンを含んで成る、請求項24記載の方法。 28．前記架橋化コラーゲンが架橋化ペギル化コラーゲンを含んで成る、請求項 26記載の方法。 29．前記複合官能性ポリマーの層が架橋化複合官能性ポリマーを含んで成る、請求項22記載の方法。 30．前記複合官能性アルギネートポリマーが複合アニオン及びカチオンアルギネートポリマーを含んで成る、請求項29記載の方法。 31．前記安定化層を前記少なくとも一層の複合官能性ポリマーでコーティングされた少なくとも一層の生体適合性ポリマーでコーティングすることを更に含んで成る、請求項22記載の方法。 32．前記生体適合性ポリマーがアルギネートポリマーマトリックスを含んで成る、請求項31記載の方法。 33．前記生体適合性ポリマーがポリエチレングリコールポリマーマトリックスを含んで成る、請求項31記載の方法。 34．前記組成物が分子量20,000ダルトン以上の分子のマトリックスを通じる拡散を制約するものである、請求項22記載の方法。 35．前記生物材料が細胞である、請求項22記載の方法。 36．前記細胞が膵臓半島細胞である、請求項35記載の方法。 37．前記細胞が肝細胞である、請求項35記載の方法。 38．前記第一ポリマーゲルがアルギネートポリマーマトリックスを含んで成る、請求項23記載の方法。 39．前記架橋化複合官能性ポリマーマトリックスを長さゼロの縮合可能架橋剤で架橋する、請求項22記載の方法。 40．前記長さゼロの縮合可能架橋剤がカルボジイミドである、請求項39記載の方法。 41．前記カルボジイミドが水溶性カルボジイミドである、請求項40記載の方法。 42．前記カルボジイミドが１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩である、請求項41記載の方法。 43．患者の特定の生物学的機能の欠如を特徴とする障害を処置する方法であって、前記患者に、前記特定の生物学的機能を発揮できる封入化生物材料の組成物を投与することを含んで成り、ここで前記組成物は架橋化コラーゲンの層でコーティングされた前記生物材料を含んで成る、方法。 44．前記障害が真性糖尿病であり、そして前記生物材料が膵臓半島細胞を含んで成る、請求項43記載の方法。 45．細胞の培養方法であって、前記細胞を架橋化複合官能性ポリマーの層でコーティングし、そして前記細胞を培養することを含んで成る方法。 46．前記細胞をまずアルギネートの組成物で封入し、それから前記細胞を前記架橋化複合官能性ポリマーの層でコーティングする、請求項45記載の方法。 47．前記架橋化複合官能性ポリマーの層が架橋化コラーゲンを含んで成る、請求項46記載の方法。