JP6210683B2 - 細胞の入れ子式カプセル封入 - Google Patents
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Description
該細胞を身体の免疫応答から隔離するマイクロカプセルを入手した。さらに、例えば米国特許第4,353,888号明細書も参照されたい。
(a)各々が1つ以上の細胞を含む1つ以上の細胞単位を提供するステップと、
(b)前記細胞単位を1つ以上の第1標識と一緒にマイクロカプセル封入するステップ
とを含む方法を提供する。
(c)第2標識と一緒に(b)のマイクロカプセル封入するステップを繰り返すステップをさらに含んでいる。
(a)各々が1つ以上の細胞を含む1つ以上の細胞単位を提供するステップと、
(b)前記細胞単位を第1識別標識と一緒にマイクロカプセル封入するステップと、
(c)任意選択的に、該細胞単位を第2識別標識とともにマイクロカプセル封入された1つ以上の細胞単位と混合するステップと、
(d)ステップ(b)を、任意選択的に第3識別標識を用いて繰り返すステップと
を含む方法が提供される。
(a)各々が1つ以上の細胞を含む第1セットの細胞単位群を提供し、前記群を所望の培養条件に曝露させるステップと;
(b)前記細胞単位を1つの識別標識と一緒にマイクロカプセル封入するステップと、
(c)少なくとも1つのプールを形成するために2つ以上の前記群をプールするステップと、
(d)さらなるセットの細胞単位群を作製するために前記プールを再分割するステップと、
(d)前記さらなる群を所望の培養条件に曝露させるステップと、
(e)ステップ(b)〜(d)を繰り返すステップと
を含む方法を提供する。
本明細書で使用する用語「培養条件」は、細胞が、前記細胞の成長または分化を促進するために、その中に配置される、または曝露される環境に関する。したがって、この用語は、細胞の成長および/または分化に影響を及ぼすことができる培地、温度、大気条件、基板、攪拌条件などに関する。より詳細には、この用語は、培養培地中に組み込むことのできる、および細胞の成長および/または分化に影響を及ぼすことのできる特異的作用物質に関する。
カプセル封入は、任意の適切な技術を使用して実施することができる。マイクロカプセル技術は、例えば、特にエマルジョンマイクロカプセル封入技術について記載しているが、さらにまた少なくともそれらのうちの一部が生細胞をカプセル封入するために適切な他のマイクロカプセル封入方法についても規定している米国特許第6,808,882号明細書および同第7,138,233号明細書に記載されている。
上述したように、タグは標識として使用できる。先行技術の方法では、タグは、マイクロキャリアまたは細胞単位とコンジュゲートされていて、このアプローチは本発明による入れ子式カプセル封入の最初に適用することができ、この場合にはタグは細胞単位と直接接触させることができる。しかしその後のカプセル封入では、タグは細胞単位内のマイクロキャリアとは接触していないので、それらと錯体を形成しない。
i.それらは、それらが標識化する細胞単位と比較してサイズが小さい。
ii.それらはタグの固有の性質を混乱させない条件下で細胞単位から分離可能である。このとき、タグは細胞単位と直接接触しておらず、例えばそれらが外側マイクロカプセル層内にある場合は、この特徴はより広範囲のタグの化学的性質によってより容易に達成できる。
iii.それらは細胞単位の生物学的性質に実質的には影響を及ぼさない、そして順に細胞単位またはそれらの生物学的性質によって影響を受けない1つ以上の不活性物質から作製される。さらに、これは外側マイクロカプセル層内のより広範囲のタグを用いるとより容易に達成できる可能性がある。
iv.それらは多数入手でき、かつ、さらに関連し、しかし適切な技術を用いて容易に識別可能な別個の多数の変種として入手できる。
v.それらは、便宜的で高度に信頼性の、そして例えばFACSによって自動化できる方法によって識別可能である。
代替の、もしくは補完的な標識戦略では、標識はそれからマイクロカプセルの壁が構築される材料内に組み込むことができる。例えば、蛍光標識ポリマーは、細胞をコーティングするために使用できる。ポリマーがアルギネートである場合、例えば、フルオレシナミン(fluorescinamine)(C20H13NO3)などの標識は、アルギネート上のカルボキシル基を曝露させることによってアルギネートと反応させることができる。ポリ−L−リジン(PLL)は、Molecular Probes社(オランダ国ライデン)からのAlexa(登録商標)546タンパク質標識キットなどの市販のタンパク質標識試薬を使用して標識することができる。例えば、Strand et al.,Biotechnol Bioeng(2003)82:386−94を参照されたい。
形状およびサイズに及ぶ、そして様々な材料から作製される様々なマイクロキャリアが使用可能である。マイクロキャリアは、多孔性、マクロ多孔性、微孔性または固体であり得る。例えば、マイクロキャリアは、Cultispherマイクロキャリア、Cultispher−Gマイクロキャリア、Cultispher−GLマイクロキャリア、Cultispher−Sマイクロキャリア、Informatrixマイクロキャリア、マイクロスフェア・マイクロキャリア、シラン・マイクロキャリア、FibraCel(登録商標)Disksマイクロキャリア、Cytolineマイクロキャリア(例えば、Cytoline1マイクロキャリアもしくはCytoline2マイクロキャリア)、Cytodexマイクロキャリア(例えば、Cytodex1、Cytodex2もしくはCytodex3マイクロキャリア)、Cytoporeマイクロキャリア(例えば、Cytopore1マイクロキャリアもしくはCytopore2マイクロキャリア)、Biosilonマイクロキャリア、Bioglassマイクロキャリア、FACT IIIマイクロキャリア、コラーゲンCマイクロキャリア、HillexIIマイクロキャリア、ProNectinFマイクロキャリア、Plasticeマイクロキャリア、Plastic Plusマイクロキャリア、Nunc 2D MicroHex(商標)マイクロキャリア、ガラスマイクロキャリア(Sigma Aldrich社)、DE 52/53マイクロキャリアまたはそれらの組み合わせからなる群から選択されるマイクロキャリアであり得る。
細胞の細胞単位内への組み込みは、様々な条件下の細胞培養中での細胞群(細胞コロニー)の成長を促進する実体の形成、ならびに混乱させられた場合や他のコロニーと混合された場合に、様々な条件下での細胞群の完全性の保持をもたらす。そのような群またはコロニーを本明細書では細胞単位と称する。細胞単位の形成は、例えば、担体などの固体基板上の付着培養として細胞を成長させることによって達成できる。細胞増殖が担体上での播種後に発生する場合は、娘細胞は同一担体上で付着し、同一コロニーの一部を形成する。一般に、付着性生細胞はそれらの成長基板から容易には解離しないので、細胞コロニーの完全性は担体の任意の機械的操作、培養培地の攪拌、またはまた別の組織培養系内への移動にもかかわらず存続する。同様に、常に複数担体が同一容器内に配置される(例えば、ビーズがプールされる)場合は、1つのビーズから他のビーズへの細胞の実質的移動は発生しない。
さらに、本発明は、細胞カプセル封入のためのキットに関する。そのようなキットは、少なくともアルギン酸ナトリウム、1つ以上のマイクロキャリアおよび1つ以上の検出可能なタグを含んでいる。アルギネートは、固体または溶液形であり得、その溶液は、そのまま使用できる、または希釈することを意図できる。マイクロキャリアおよびタグは、上に記載したものから選択することができる。
<スプリット−プール細胞培養>
さらに、各細胞単位は様々な細胞培養条件に曝露させることのできる容易に取り扱える単位を構成するので、細胞単位(特に顕微鏡的細胞単位)を形成することは、複数の組織培養条件をサンプリングするために有用である。本発明によると、典型的に細胞群は、細胞をマイクロキャリア培養中で成長させることによって生成され、用語「細胞単位」、「細胞群」、「コロニー」および「ビーズ」は、マイクロキャリア細胞培養の成分を記載するために使用される。多数の細胞培養条件をサンプリングするために特に効率的な方法は、組み合わせ細胞培養またはスプリット−プール細胞培養と呼ばれ、1つの実施形態では、細胞培養条件の複数の組み合わせをサンプリングするために、細胞単位の連続再分割および群の結合を包含している。本発明の1つの態様では、本方法は、各々が相違する培養条件下で個別に成長させられる複数のビーズ(群/コロニー/担体)を含有するX1数のアリコートに、細胞単位の初期スターター培養(または相違するスターター培養)を分割することによって機能する。所定時間にわたる細胞培養後、細胞単位は特異的標識とともにカプセル封入することができ、その後に相違するアリコートからのビーズを結合して混合することによってプールすることができる。このプールは再び、X2数のアリコートに分割することができ、その各々はある期間にわたって相違する条件下で培養され、また別の特異的標識(同一、または好ましくは相違することができる)とともにカプセル封入され、引き続いて同様にプールされる。細胞単位を分割する、培養する、カプセル封入する、およびプールする(またはサイクルに進入する場所に依存してプールする、分割する、および培養する)反復手順は、細胞培養条件の多数の様々な組み合わせの系統的サンプリングを可能にする。実験の複雑さ、または言い換えると試験される細胞培養条件の様々な組み合わせの数は、各ラウンドでサンプリングされる相違する条件の数の積(X1×X2×...Xn)と同等である。その後の分割に先行する全細胞単位をプールするステップが最適となる可能性があることに留意されたい;限定数の細胞単位がプールされるステップは同一作用を有する可能性がある。このため本発明は、細胞単位の群がバルクで取り扱われる細胞培養条件の複数の組み合わせを系統的にサンプリングする多数の関連方法を具体化する。
<アルギネート溶液の調製>
粉末形にあるアルギネートを、脱イオン水またはCaもしくはMgイオンを伴わないPBS溶液であるリン酸緩衝食塩液−CaCl2−MgCl2(PBS−−)中に混合して、1〜5重量%のアルギネート混合物を得る。約20mLの、PBS中に溶解させたマイクロキャリア1g当たり3%の溶液を使用する。この混合液は、完全に溶解するまで攪拌するに任せる。
Ca2+、Sr2+またはBa2+イオンはアルギネート溶液をヒドロゲルに架橋結合させる。凝固溶液は、200mMの濃度でCaCl2を水中に溶解させることによって作製する。この溶液は、完全に溶解するまでマグネチック・スターラーを用いて攪拌する。
カプセル封入は、NISCOカプセル封入装置(NISCO Engineering社、スイス国)を使用して実施する。事前に実施していない場合は、機械および全構成部品は、新規のシリコーンパイプを使用して清潔にして消毒する。
先行カプセル封入ステップからのマイクロキャリア、細胞(集合または分散している)またはビーズであるカプセル封入する単位をPBS中で洗浄し、液体を取り除き、アルギネート溶液中に再懸濁させる。
第2シリンジに、カプセル封入する材料を押し出すために単純アルギネートを充填し、シリンジポンプへ接続する。
液滴を噴霧するために、装置の取扱説明書にしたがってニードルおよび電極に圧力をかける。この手順は、さらなる材料をカプセル封入するために、より多くのビーズを調製し、それらを機械に注入することによって繰り返すことができる。
加工処理が終了した時点に、シリンジポンプ、電圧およびマグネット・スターラーのスイッチを切り、架橋結合溶液およびカプセル封入物を含有する収集ビーカーを取り外す。カプセル封入物はビーカーの底部に沈降し、ファルコンチューブまたは他の容器内へ取り除くことができる。
細胞単位を実施例1にしたがってアルギネートでコーティングし、引き続いて以下のようにLbLアプローチを使用して高分子電解質でコーティングする。
1.細胞を含むアルギネート懸濁液を調製する
2.スプレー装置を用意する
3.塩基性アルギネートビーズを作製する
4.ビーズを洗浄する
a.30秒間という短時間にわたり使用される0.1%の溶液は、既にアルギネートビーズの表面上に極めて薄いフィルムを作製する所望の作用を生じさせる。この溶液中にビーズを懸濁させる濃度または時間を変化させると、吸着速度が変化するが、層はこの濃度で1分間未満後には飽和するので十分であると思われる。正確な厚さは公知ではないが、光学顕微鏡上で視認できないほど十分に薄い。
b.好ましい設定は、30秒間にわたり1%である。設定は、1分間未満から数時間までの間に、食塩液中で0.05〜0.1重量%のPLLで変動できる。およそ5〜10分間の時間が好ましい。
6.PBS(−−)を用いて洗浄する
a.過剰のPLLを除去するためには、細胞ストレーナー内でビーズを数回洗浄することが必要である
7.蛍光標識したタグとともに懸濁させる
a.タグを加えて溶液を攪拌する場合、液体をピペッティングすることによって最も容易に実施でき、負に荷電したタグはアルギネート−PLLビーズの表面に付着する。
8.PBS(−−)を用いて過剰なタグを洗い流す
a.再び、付着していないタグを洗浄しながら、ビーズを保持するために細胞ストレーナー(70μm)内で実施する
9.また別のアニオン性高分子電解質の調製した溶液中にビーズを懸濁させる。
a.これはアルギネート中で実施できる。10分間にわたる0.05〜1%などの数値が一般的であると思われる(例えば、(Strand et al.,2003))。しかし、層は厚く、非均一になる可能性がある(これは、相違するアルギネートを使用することによって、またはそれを修飾する[より短い鎖長もしくはより低分子量を使用するなど]ことによって避けることが可能である)。
b.PLLの周囲に第2層を形成するために、類似の曝露時間および濃度を用いて、ポリ(スルホン酸スチレンナトリウム)(PSS)を含有する溶液を使用する。
c.この第2層は、タグを固定し、また別のタグセットを用いてプロセスを繰り返すために、その上に第1高分子電解質(カチオン性物質)を翌週に再び加えることのできるまた別の逆極性の層を加えるためである。
10.過剰な高分子電解質を除去するためにPBS(−−)を用いて洗浄する。
11.実験の次のスプリット−プール段階まで細胞培地中に懸濁させる。
12.ビーズがタグ付けされる次のスプリット−プール段階には、追加の層を加えるために必要に応じてステップ3〜10を繰り返す。
最初のアルギネートビーズ:6.5kV、10mL/h、1cm間隔、0.5mmニードル。
第1層:
PLL 0.1%、120秒間
およそ25mLのPBS−−を用いて細胞ストレーナー中で洗浄する
青色蛍光タグ
およそ10mLのPBS−−を用いて細胞ストレーナー中で洗浄する
アルギネート0.5%、120秒間
およそ25mLのPBS−−を用いて細胞ストレーナー中で洗浄する
第2層:
PLL 0.1%、120秒間
およそ25mLのPBS−−を用いて細胞ストレーナー中で洗浄する
赤色蛍光タグ
およそ10mLのPBS−−を用いて細胞ストレーナー中で洗浄する
アルギネート0.5%、120秒間
およそ25mLのPBS−−を用いて細胞ストレーナー中で洗浄する
Claims (11)
- 細胞単位を標識するための方法であって、
(a)各々が1つ以上の細胞を含む1つ以上の細胞単位を提供するステップと、
(b)前記細胞単位を1つ以上の第1識別標識と一緒にマイクロカプセル封入するステップと、
(c)(b)で得られたマイクロカプセル封入された細胞単位を、第2識別標識と一緒にマイクロカプセル封入するステップと
を含み、前記第1識別標識および前記第2識別標識が、核酸およびマイクロスフェアからなる群から選択され、かつ、前記第1識別標識と前記第2識別標識が相違する、方法。 - 各々が1つ以上の細胞を含む細胞単位の第1群および第2群を含む複数の細胞単位を複数の標識を用いて標識するための方法であって、
(a)前記細胞単位の第1群を第1識別標識と一緒にマイクロカプセル封入するステップと、
(b)前記細胞単位の第2群を第2識別標識と一緒にマイクロカプセル封入するステップと、
(c)前記ステップ(a)により得られた細胞単位の第1群および前記ステップ(b)により得られた細胞単位の第2群を混合し、細胞単位の第3群を形成するステップと、
(d)前記細胞単位の第3群を第3識別標識と一緒にマイクロカプセル封入するステップと
を含み、前記第1識別標識、第2識別標識および第3識別標識が、核酸およびマイクロスフェアからなる群から選択され、かつ、前記第1識別標識、第2識別標識および第3識別標識のうちの少なくとも2つは相違する、方法。 - 細胞単位の前記第1群は、ステップ(c)の前に2つ以上の群に分割される、請求項2に記載の方法。
- 前記細胞単位の群は、相違する培養条件に曝露される、請求項2または3に記載の方法。
- 複数の培養条件に曝露した細胞培養歴にしたがって細胞単位を標識するための方法であって、
(a)細胞単位の各々が1つ以上の細胞を含む、第1の細胞単位群を2つ以上提供し、前記2つ以上の第1の細胞単位群を第1の相違する培養条件にそれぞれ曝露させるステップと、これにより、細胞単位群の第1のセットが得られ、
(b)前記2つ以上の第1の細胞単位群について、各群中の細胞単位を、識別標識の第1のセットから選択される識別標識と一緒にマイクロカプセル封入するステップと、
(c)前記ステップ(b)により得られた前記細胞単位群の第1のセットを単一のプール中にプールするステップと、
(d)前記ステップ(c)により得られたプールを、2つ以上の第2の細胞単位群に分割するステップと、
(e)前記ステップ(d)により得られた2つ以上の第2の細胞単位群を第2の相違する培養条件にそれぞれ曝露させるステップと、これにより、細胞単位群の第2のセットが得られ、
(f)前記2つ以上の第2の細胞単位群について、各群中の細胞単位を、識別標識の第2のセットから選択される識別標識と一緒にマイクロカプセル封入するステップと、
(g)前記ステップ(f)により得られた前記細胞単位群の第2のセットを単一のプール中にプールするステップと、
(h)前記ステップ(g)により得られたプールを、2つ以上の第3の細胞単位群に分割するステップと、
(i)前記ステップ(h)により得られた2つ以上の第3の細胞単位群を第3の相違する培養条件にそれぞれ曝露させるステップと、これにより、細胞単位群の第3のセットが得られ、
(j)前記2つ以上の第3の細胞単位群について、各群中の細胞単位を、識別標識の第3のセットから選択される識別標識と一緒にマイクロカプセル封入するステップと
を含み、前記識別標識の第1、第2および第3のセットから選択される識別標識が、核酸およびマイクロスフェアからなる群から選択され、かつ、前記識別標識の第1、第2および第3のセット中の識別標識がそれぞれ互いに相違する、方法。 - 前記マイクロカプセル封入は、バイオエレクトロスプレージェッティング法、空気力学支援バイオジェッティング法および圧力支援細胞ジェッティング法からなる群から任意に選択されるジェッティング手順によって実施される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マイクロカプセル封入は、高分子電解質のレイヤー・バイ・レイヤー添加によって実施される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記識別標識がマイクロスフェアタグである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養条件は、成長培地、温度管理、基板、大気条件および物理的細胞取扱いからなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
- 1つ以上の生細胞の群を含む細胞単位を含むマイクロカプセルであって、前記マイクロカプセルが、2つ以上のカプセル層と2つ以上の識別標識とを含み、第1カプセル層が前記細胞単位を包囲し、かつ、第1識別標識を含み、第2カプセル層が前記第1カプセル層を包囲し、かつ、第2識別標識を含み、前記第1カプセル層内の前記第1識別標識が、前記第2カプセル層内の前記第2識別標識とは相違し、前記第1識別標識および前記第2識別標識が、核酸およびマイクロスフェアからなる群から選択される、マイクロカプセル。
- 前記マイクロカプセルは、ポリマーから構成され、前記カプセル層を含む前記ポリマーは、蛍光色素を組み込むことによって標識される、請求項10に記載のマイクロカプセル。
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