CN101229192A - 卵巢细胞微囊 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种卵巢细胞微囊，其是应用海藻酸钠－多聚赖氨酸－海藻酸钠(APA)包裹卵巢细胞，制备成内含卵巢细胞的微囊。微囊中的卵巢细胞包括具有内分泌功能的卵巢颗粒细胞和卵泡膜细胞；未分化的卵巢内间充质细胞和结缔组织细胞。将本发明的微囊进行异体种植，微囊内的内分泌细胞可在体内不断地分泌性激素，并且其分泌功能可置身于受体自身的神经内分泌的调控之下，达到个性化补充性激素分泌不足的目的。应用卵巢细胞微囊异体种植可对机体退行性病变起到积极地防治作用。实验证明能减缓骨量丢失，对防治骨质疏松起积极的作用；同时能影响胰岛α细胞和β细胞的生物活性，调节胰岛素和胰高血糖素的分泌。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种卵巢细胞微囊。
背景技术
卵巢是女性重要的生殖内分泌器官，有明显的年龄性变化。卵巢功能的衰退始于30岁，并于绝经期开始，卵巢功能迅速下降，雌激素分泌锐减(绝经后雌激素水平可比高峰期下降90％)，从而导致机体出现一系列器官功能紊乱现象，特别是与雌激素关系密切的心血管、骨骼、大脑和皮肤等，在绝经后容易发生疾病。随着人类寿命的延长和生活水平的提高，人类生存的目标不仅是“活着”，而且要“活好”。因此临床上使用激素替代疗法纠正因卵巢功能衰退(卵巢早衰，更年期)造成的机体功能紊乱。激素替代疗法能有效地预防因性激素分泌不足而引发的一些疾病(如骨质疏松、女性绝经后综合征等)，但同时发现女性雌激素水平由于受下丘脑-腺垂体的调节，不仅有着明显的周期性变化，而且还有明显的个体差异，激素替代疗法很难做到个体化。由于外源性雌激素在体内呈非生理性释放，可产生一些较为严重的副反应，如增加心脑血管疾病的死亡率和乳腺癌、静脉血栓等的发生率，因此，近年来对应用激素替代疗法预防绝经前后妇女慢性病的方法出现了争议。目前只有那些有绝经期症状和存在有与绝经相关的生活质量逆向改变的妇女，首选激素替代治疗，并且使用最低的有效剂量和短疗程治疗。随着器官移植技术的进一步成熟和完善，人们希望当机体性腺功能衰退时，进行异体性腺移植，将能还机体一个置身于自体神经内分泌调控之下，适合于宿主本身内分泌水平的有功能的器官。卵巢移植的目的是为卵巢早衰、双侧卵巢切除或绝经期妇女，提供一种内源性雌性激素。目前主要有卵巢自体移植、胚胎卵巢移植、同种异体移植。卵巢自体移植由于供体卵巢来源充足，无免疫排斥，手术操作简单，临床上主要用于卵巢原位发生病变需放化疗的患者(卵巢组织冷冻用于自体异位移植已成为可能)。胚胎卵巢细胞有较强的分化能力，被移入异体内可生长发育至成熟，并有内分泌功能，而且还能接受上级器官-垂体激素的调控，虽然目前胚胎卵巢被认为是比较理想的供体，但仍存在排异反应和来源问题。同种异体移植可为供体来源提供又一渠道，但面临的最大问题是免疫排斥反应。
微囊技术起源于20世纪60年代，是组织工程的一个分支，是将外源性的细胞或组织包埋在半透性人工膜中进行体内移植，目的是通过微囊的免疫隔离作用，提高移植物在异体的存活率。采用微囊包埋技术进行细胞固定和移植要求所制备的微囊需具有透过性，以保证囊内细胞分泌产生的特定因子可通过囊膜进入细胞外间隙。APA生物微胶囊被认为是较好的微囊制备材料，海藻酸钠(ALG)是由海藻中提出的聚阴离子多糖，在多价阳离子如Ca2+存在时形成凝胶。多聚赖氨酸(PLL)是聚阳离子大分子，与ALG可形成大分子复合物。目前已有胰岛细胞、多巴胺细胞、甲状旁腺等分泌含氮类激素细胞的微囊包裹及移植实验取得可喜研究进展的报道，提示内分泌腺是微囊技术的适应组织，也证实微囊技术具有广泛的应用前景。但雌激素的合成与分泌具有特殊性与复杂性，即需要卵泡膜细胞和卵泡颗粒细胞共同协作完成，并受下丘脑-垂体-性腺轴的调控，呈周期性分泌。体外培养卵巢细胞是否能持续性分泌雌激素，应用微囊技术将卵巢细胞微囊化后是否能持续性分泌雌激素，以及移植入小鼠腹腔后是否能持续性分泌雌激素，同时是否能有效地预防机体各个生命必需器官的衰退(这是当前的激素替代疗法无法解决的难题)，国内外尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种卵巢细胞微囊，实现补充体内性激素个性化；
本发明的另一个目的在于提供上述卵巢细胞微囊的制备方法及应用。
本发明的卵巢细胞微囊是应用海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)包裹卵巢细胞，制备成内含卵巢细胞的微囊。微囊中的卵巢细胞是卵巢组织去除卵细胞外的其余细胞，包括具有内分泌功能的卵巢颗粒细胞和卵泡膜细胞；未分化的卵巢内间充质细胞和结缔组织细胞。
APA卵巢细胞微囊为圆球型，表面光滑透明。微囊膜属于生物半透膜，能阻止大分子物质进入膜内，小分子物质、细胞因子、性激素、O2、CO2等可以自由通过微囊膜。
上述微囊内的卵巢细胞是取卵巢组织，剪碎后制备成细胞悬液，经体外增殖培养获得。卵细胞在培养过程中自然去除。
本发明的卵巢细胞微囊的制备方法包括如下步骤：
1)将经体外增殖培养后的卵巢细胞消化后制成细胞悬液；
2)将步骤1)细胞悬液与1.5％(质量g/体积L)海藻酸钠混合制成终密度为2×106个/ml细胞悬液。
3)将细胞悬液滴入轻微搅动的1.1％(质量/体积)CaCl2中(20-25℃)，使其形成凝胶珠，倾去CaCl2溶液，加入0.05％(质量/体积)多聚赖氨酸作用6min。
4)用1％CaCl2清洗凝胶珠2次，再加入0.15％海藻酸钠，作用5min。
5)先后用1％CaCl2和生理盐水清洗凝胶珠，加入0.05mol/L构椽酸钠(pH 7.4，相对分子质量249.1)，作用6min(液化囊心)，即得到卵巢细胞微囊。每个微囊直径约2mm，含大约2×104个卵巢细胞。
用生理盐水清洗后，用培养液清洗数次，加入D/F12全培养液，37℃5％CO2培养箱培养，备用。或将清洗数次后的微囊进行冻存，待需要时，经融解后使用。
卵巢是产生卵子和分泌性激素的器官，是脑垂体前叶分泌的促性腺激素的靶器官之一，它不仅参与生殖并维持性周期，还对机体的内分泌功能和新陈代谢起着重要的调节作用，在生殖生理研究中占有重要地位。卵巢在性周期和妊娠期均发生形态及生化变化。在卵巢发生这些变化的过程中，不仅卵泡和黄体的形态及功能发生改变，而且卵巢间质细胞的增殖及内分泌功能也发生改变。雌激素的合成与分泌具有特殊性与复杂性，即需要卵泡膜细胞和卵泡颗粒细胞共同协作完成，并受多种细胞因子及下丘脑-垂体-性腺轴的调控，呈周期性分泌。目前主要有卵巢自体移植、胚胎卵巢移植、同种异体移植，均为组织块移植，尚未见分离卵巢细胞移植。实验表明分离纯化的卵泡膜细胞或卵泡颗粒细胞培养，细胞很快死亡。用分离的混合卵巢细胞移植，可以制成卵巢细胞微囊，而且保证了卵泡膜细胞和卵泡颗粒细胞的相互作用，并且移植入体内后，可受下丘脑-垂体分泌激素的调节，和细胞因子的作用，卵巢间质细胞可以不断分化补充形成具有分泌功能的卵泡膜细胞和卵泡颗粒细胞。因而微囊化的卵巢细胞具有一段时间分泌性激素的功能。
本发明的卵巢细胞微囊可以使用种植/注入或移植的方法移入体内。其可以种植在异体的各个部位如腹腔、四肢和皮下组织内；或者移植到异体的各种组织内，如结缔组织和肌组织内。
将本发明的微囊进行异体种植，其可在体内不断地分泌性激素，并且其分泌功能可置身于受体自身的神经内分泌的调控之下，达到个性化补充性激素分泌不足的目的。具体地说，其如下功能：
1)治疗卵巢早衰；
2)防治女性更年期综合征；
3)防治机体的退行性病变：包括①骨质疏松；②心血管疾患(包括高血压)；③调节胰岛素和胰高血糖素的分泌；④老年性痴呆；⑤老年性尿失禁；⑥泌尿生殖系统萎缩等；
4)女性美容。
附图说明
图1是体外培养的卵巢细胞；
图2是用APA技术制备的卵巢细胞微囊；
图3是小鼠腹腔内微囊状态；
图4是正常小鼠胫骨松质骨结构；
图5是正常小鼠胫骨上段成骨细胞(osteoblast，OB)、骨细胞结构；
图6是去卵巢小鼠胫骨松质骨结构；
图7是去卵巢小鼠胫骨上段OB、骨细胞结构；
图8是移植组小鼠胫骨松质骨结构；
图9是移植组小鼠胫骨上段OB、骨细胞结构；
图10是正常小鼠胫骨骺软骨细胞碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)的表达；
图11是去卵巢小鼠胫骨骺软骨细胞ALP的表达；
图12是移植组小鼠胫骨骺软骨细胞ALP的表达；
图13是正常小鼠胫骨上段软骨细胞、OB和破骨细胞(osteoclast，OC)的间质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases，MMP-9)表达；
图14是移植组小鼠胫骨上段软骨细胞、OB和OC的MMP-9表达；
图15是去卵巢小鼠胫骨上段软骨细胞、OB和OC的MMP-9表达；
图16是胰腺HE染色，其中A为正常对照组，B为去卵巢组，C为微囊移植组；
图17是免疫组织化学标记高血糖素，其中A为正常对照组，B为去卵巢组，C为微囊移植组；
图18免疫组织化学标记胰岛素，其中A为正常对照组，B为去卵巢组，C为微囊移植组；
图19免疫组织化学标记胰岛素受体-α，其中A为正常对照组，B为去卵巢组，C为微囊移植组；
图20免疫组织化学标记胰岛素受体底物II，其中A为正常对照组，B为去卵巢组，C为微囊移植组。
具体实施方式
下面是实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 卵巢细胞的离体培养
无菌条件下取小鼠双侧卵巢，去除周围脂肪组织，冷PBS冲洗，剪碎卵巢组织，加入消化液(0.2％胶原酶I与0.25％胰蛋白酶，以1∶1的比例混合)，置于37℃恒温水浴摇床消化，30min后加入含10％FBS D/F12培养液终止消化，179g离心10min，去除上清液，以无血清培养液清洗2次(离心，179g 10min)，轻轻吹打，制成细胞悬液，经60目细胞筛过滤，滤液以1×106的密度接种于25cm2培养瓶，加入D/F12(HyClone公司)全培养液(D/F12培养液内添加10％FBS，1％青-链霉素，pH 7.2～7.4)，置于37℃5％CO2培养箱培养。待细胞长满融合后，以0.25％胰蛋白酶与0.02％EDTA 1∶1混合消化液消化，将消化后的细胞悬液继续培养。
实施例2 微囊化卵巢细胞的制备
将传1～2代的卵巢细胞(其内不含生殖细胞)与1.5％海藻酸钠混合制成细胞悬液，细胞终密度为2×106。用4号针头将细胞悬液滴入轻微搅动的1.1％CaCl2中，使其形成凝胶珠，加入0.05％多聚赖氨酸作用6min。1％CaCl2清洗凝胶珠2次，再加入0.15％海藻酸钠，作用5min。先后用1％CaCl2和生理盐水清洗凝胶珠，加入0.05mol/L枸椽酸钠(pH 7.4，相对分子质量249.1)，作用6min液化囊心。生理盐水清洗后，用培养液清洗数次，加入D/F12全培养液，37℃5％CO2培养箱培养，待用。每个微囊直径约2mm，含大约2×104个卵巢细胞。
实施例3 微囊化卵巢细胞内分泌功能的测定
应用放射免疫检测方法(使用天津九鼎医学生物工程有限公司孕酮、雌激素放射免疫分析试剂盒，按照说明书进行操作)测定体外培养的卵巢细胞和微囊化卵巢细胞分泌的性激素水平。
结果：体外培养的卵巢细胞(图1)有内分泌功能，微囊化卵巢细胞(图2)的分泌量与同期体外培养的卵巢细胞相比没有差异(表1)，说明此微囊的通透效果良好，微囊内卵泡膜细胞和卵泡颗粒细胞仍能继续维持协同作用，合成和分泌雌激素、孕激素。将包入微囊内的卵巢细胞破壁再培养，从微囊内释放的卵巢细胞仍能迅速贴壁，生长良好，也表明卵巢细胞在APA微囊内可以成活。
表1体外培养卵巢细胞与微囊化卵巢细胞培养液中E2和孕酮值比较(x±s)
*P＞0.05vs培养组
实施例4 微囊化卵巢细胞的体内移植及内分泌功能检测
微囊化卵巢细胞的体内移植：摘除小鼠卵巢制成去卵巢小鼠模型，一组常规饲养3个月，造成骨质疏松，另一组去卵巢后即用微囊化的卵巢细胞移植入小鼠腹腔，设正常组作对照。术后(去卵巢组、微囊化的卵巢细胞移植组)90d，断头取血处死所有动物。观察腹腔内微囊化卵巢细胞的生长状态。
内分泌功能的测定：应用放射免疫检测方法(使用天津九鼎医学生物工程有限公司 孕酮、雌激素放射免疫分析试剂盒，按照说明书操作)测定小鼠血清雌二醇(E2)水平。
表2小鼠血清E2放射免疫检测结果(x±s)
***P＜0.001vs正常组
结果：腹腔为自然生理环境，体液条件适合细胞生长，微囊化的卵巢细胞在移植鼠腹腔中的生长状态(图3)和小鼠血清E2浓度(表2)，说明微囊壁有良好的通透性，微囊化的卵巢细胞在移植鼠体内仍能分泌雌激素，囊内细胞分泌产生的特定因子可透过囊膜进入受体细胞外间隙，同时囊内细胞也可能受到受体体液因子的作用。
实施例5 体内移植微囊化卵巢细胞的效果检测
预防骨质疏松的作用
实验方法：取小鼠右侧胫骨，经HE染色进行组织学观察，VanGieson染色观察骨基质中胶原纤维变化，免疫组织化学检测ALP和MMP-9的表达，应用图像分析仪行胫骨上段骨小梁形态计量学测定及分析免疫组织化学染色结果；取小鼠左侧股骨和第五腰椎体，用万能电子实验机进行骨生物力学测试；将左侧股骨水解，酶标仪测水解液羟脯氨酸、钙、磷含量(使用南京建成生物工程研究所 羟脯氨酸、钙、磷含量测定试剂盒，按照说明书操作)。
实验结果：HE染色胫骨形态(图4-9)计量学测定(表3)，骨小梁体积、平均骨小梁厚度：去卵巢组显著低于正常组；移植组与正常组之间无差异。平均骨小梁间距：去卵巢组显著高于正常组；移植组与正常组之间无差异。结点末端比：去卵巢组显著低于正常组；移植组低于正常组。免疫组织化学检测结果：胫骨骺软骨细胞ALP(图10-12)的平均光密度值(表4)，移植组与正常组之间无差异，去卵巢组低于正常组；MMP-9阳性(图13-15)软骨细胞和成骨细胞与破骨细胞的比值(表5)，移植组与正常组之间无差异，去卵巢组显著低于正常组。小鼠股骨三点弯曲试验的生物力学参数(表6)显示各组间、组内均数无差异。小鼠腰椎压缩实验的生物力学参数(表7)显示，破坏载荷：去卵巢组显著低于正常组，移植组低于正常组；弹性模量：去卵巢组低于正常组，移植组与正常组之间无差异；能量吸收：去卵巢组显著低于正常组，移植组与正常组之间无差异。小鼠股骨羟脯氨酸、钙、磷测定结果(表8)显示，去卵巢组低于正常组，移植组与正常组之间无差异。
表3各组别小鼠右侧胫骨上段骨小梁形态计量结果(x±s)
*P＜0.05vs正常组，***P＜0.001vs正常组
表4各组别小鼠胫骨骺软骨细胞ALP平均光密度值的比较(x±s)
*P＜0.05vs正常组
表5各组别小鼠胫骨上段MMP-9阳性软骨细胞、OB与OC个数的比值(x±s)
***P＜0.001vs正常组
表6各组别小鼠左侧股骨三点弯曲试验结果(x±s)
*P＞0.05vs正常组
表7各组别小鼠第5腰椎压缩试验的生物力学参数结果(x±s)
*P＜0.05vs正常组，**P＜0.01vs正常组，***P＜0.001vs正常组
表8各组别小鼠左侧股骨干重、骨矿物质和有机质含量(x±s)
*P＜0.05vs正常组
实施例6 对胰岛细胞(α细胞与β细胞)功能活性的影响
实验方法：处死小鼠取出胰腺组织，经Bouin液固定，制成石蜡切片，进行HE染色，用抗胰岛素单克隆抗体，兔抗胰高血糖素多克隆抗体，兔抗胰岛素受体-α多克隆抗体，兔抗胰岛素受体底物-2多克隆抗体进行免疫组织化学染色。光学显微镜行组织病理学观察，采用图像分析仪对染色阳性部位进行光密度值的测量。
实验结果：HE染色去卵巢组小鼠胰腺外分泌部细胞嗜酸性染色较正常对照组增强，细胞周围的嗜碱性物质减少甚至消失，移植组与对照组无明显差别(图16)。免疫组织化学染色高血糖素、胰岛素、胰岛素受体-α及胰岛素受体底物-2的阳性表达产物均呈棕黄色颗粒状。高血糖素阳性细胞主要分布在胰岛周围。胰岛素，胰岛素受体-α及胰岛素受体底物-2的阳性细胞主要分布在胰岛中央部(图17～20)。平均光密度值测量结果显示(表9～12)：去卵巢组胰高血糖素、胰岛素显著高于对照组，微囊移植组与对照组比较无明显差异；去卵巢组胰岛素受体-α和胰岛素受体底物-2显著低于对照组，移植组与对照组比较无明显差异。*P＞0.05表示差异无统计学意义，**P＜0.01为差异有显著统计学意义。
表9各组高血糖素阳性产物平均光密度值结果(x±s)
表10各组胰岛素阳性产物平均光密度值结果(x±s)
表11各组胰岛素受体-α阳性产物平均光密度值结果(x±s)
表12各组胰岛素受体底物-2阳性产物平均光密度值结果(x±s)
结论：微囊化的异体卵巢细胞在去卵巢小鼠腹腔内能够生存，并且具有分泌性激素的功能，能减缓骨量丢失，对防治骨质疏松起积极的作用；同时能影响胰岛α细胞和β细胞的生物活性，调节胰岛胰岛素和胰高血糖素的分泌。
Claims (10)
1.一种卵巢细胞微囊，其特征在于，所述微囊是应用海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠包裹卵巢细胞制备成的微囊。
2.如权利要求1所述的卵巢细胞微囊，其中所述卵巢细胞包括卵巢颗粒细胞、卵泡膜细胞、间充质细胞和结缔组织细胞。
3.如权利要求1或2所述的卵巢细胞微囊，其中所述卵巢细胞通过如下方法获得：取卵巢组织，制成细胞悬液，经体外增殖培养后获得。
4.如权利要求3所述的卵巢细胞微囊，其中所述的卵巢细胞通过如下方法获得：取卵巢组织，剪碎后，加入消化液置于37℃恒温水浴摇床消化，30min后加入含10％FBS培养液终止消化，179g离心10min，去除上清液，以无血清培养液清洗后制成细胞悬液，经60目细胞筛过滤，以106的密度接种于培养瓶内，加入D/F12全培养液，置于37℃5％CO2培养箱培养，待细胞长满融合后，以0.25％胰蛋白酶与0.02％EDTA 1∶1混合消化液消化，将消化后的细胞重新制备成细胞悬液，进行继代增殖培养。
5.一种制备权利要求1～4所述卵巢细胞微囊的方法，其包括如下步骤：
1)将经体外增殖培养后的卵巢细胞消化后重新制备成细胞悬液；
2)将步骤1)的细胞悬液与1.5％海藻酸钠混合制成终密度为2×106个/ml的细胞悬液。
3)将细胞悬液滴入轻微搅动的1.1％CaCl2中，使其形成凝胶珠，加入0.05％多聚赖氨酸作用6min。
4)用1％CaCl2清洗凝胶珠2次，再加入0.15％海藻酸钠，作用5min。
5)先后用1％CaCl2和生理盐水清洗凝胶珠，加入0.05mol/L构椽酸钠pH 7.4，作用6min。
6.如权利要求5所述的方法，其中步骤1)所述卵巢细胞通过如下方法获得：取卵巢组织，剪碎后，加入消化液置于37℃恒温水浴摇床消化，30min后加入含10％FBS培养液终止消化，179g离心10min，去除上清液，以无血清培养液清洗后制成细胞悬液，经60目细胞筛过滤，以106的密度接种于培养瓶内，加入D/F12全培养液，置于37℃5％CO2培养箱培养，待细胞长满融合后，以0.25％胰蛋白酶与0.02％EDTA 1∶1混合消化液消化，将消化后的细胞重新制备成细胞悬液，进行继代增殖培养。
7.如权利要求1～2任一项所述的卵巢细胞微囊在制备治疗卵巢早衰生物制剂中的应用。
8.如权利要求1～2任一项所述的卵巢细胞微囊在制备防治女性更年期综合征的生物制剂中的应用。
9.如权利要求1～2任一项所述的卵巢细胞微囊在制备防治机体的退行性病变的生物制剂中的应用。
10.如权利要求1～2任一项所述的卵巢细胞微囊在女性美容的生物制剂中的应用。
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