NO158284B - Fremgangsmaate for selektiv oppbrytning av en permeabel membran. - Google Patents

Description

Det beskrives her en innkapslingsmetode som er reversibel, d.v.s en fremgangsmåte som kan anvendes for å innkapsle en væske eller et fast materiale, og deretter å frigjøre materialet ved selektiv oppbrytning av kapselmembranene. En viktig utførelsesform av oppfinnelsen innebærer mikroinnkapsling av levende celler som etterpå kan frigis fra det indre av de fremstilte kapselmembraner uten skade.

NO-søknad nr. 800901 åpenbarer en mikroinnkapslingsteknikk som kan anvendes for å innkapsle ethvert fast eller flytende materiale i semipermeable eller i alt vesentlig upermeable kapselmembraner. En fremragende fordel ved fremgangsmåten er at de betingelser under hvilke kapselmembranene dannes, ikke involverer noen toksiske eller denaturerende reagenser,

ekstreme temperaturer eller andre betingelser som skader levende celler. Fremgangsmåten i henhold til nevnte søknad er følgelig godt egnet for fremstilling av mikroinnkapslede.

levende materialer som forblir viable og i sunn tilstand.

Fordi fremgangsmåten muliggjør en grad av styring av permeabili-teteten til membranen, er det nå mulig å mikroinnkapsle cellekulturer av prokaryotisk, eukaryotisk eller annen opprinnelse slik at celler av kulturen beskyttes mot kontaminerende bakterier, immunoglobuliner med høy molekylvekt og andre potensielt skadelige faktorer, og forblir avgrenset inne i et mikromiljø som er godt egnet for deres fortsatte viabilitet og pågående metaboliske funksjoner. Hvis mikroinnkapsler suspenderes i et konvensjonelt dyrkningsmedium som er tilstrekkelig til å understøtte vekst av de levende celler som er involvert,

er de mikroinnkapslede celler fri til å oppta substanser som trenges for metabolisme, som diffunderer gjennom membranen, og å utskille sine metaboliske produkter gjennom kapselmembranen inn i det omgivende medium.

Oppfinnelsen er rettet mot en fremgangsmåte for selektivt

å oppbryte visse membraner som syntetiseres under den mikro-innkapslingsprosess som er beskrevet i den ovenfor omtalte patentsøknad, uten noen påvisbar skade på det innkapslede kjernemateriale. Mer spesifikt utføres fremgangsmåten i

henhold til oppfinnelsen på membraner som omfatter en vann-uløselig matriks dannet av minst to vannløselige komponenter: en polymer som inkluderer et flertall av kationiske grupper (polykationisk polymer, f.eks. polyetylenamin); og en polymer som har et flertall av anioniske grupper (polyanionisk polymer, f.eks. natriumalginatgummi). De to komponenter er forbundet ved saltbroer mellom de anioniske og kationiske grupper slik at matriksen dannes.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen omfatter de

trinn som går ut på å eksponere membraner av den type som er beskrevet ovenfor, for en løsning av flerverdige kationer, fortrinnsvis monoatomiske kationer med svært lav molekylvekt,

og en strippepolymer som har et flertall anioniske grupper. Polymerens anioniske ladning må være tilstrekkelig til å oppbryte saltbroene og bør fortrinnsvis være lik eller større enn ladningstettheten til den polyanioniske polymer i- membranen. Løsningen bringes i kontakt med med kapslene slik at kationene, f.eks. kalsium eller aluminium, tillates å konkurrere mot den polykationiske polymer i kapselmembranen om anioniske plasser på den polyanioniske polymer. Samtidig konkurrerer strippepolymeren som har et flertall anioniske grupper med den polyanioniske polymer om kationiske plasser på polymerkjedene. Dette resulterer i "mykning" eller åpning ("unzipping")' i kapselmembranene. For å fullføre oppbrytningen vaskes kapslene og eksponeres deretter for et sekvestreringsmiddel (maskerings-middel) for fjerning av kationer som er assosiert med den polyanioniske polymer. De foretrukne sekvestreringsmidler er chelateringsmidler, f.eks. citrationer eller EDTA-ioner. Hvis kapslene, som i en viktig utførelsesform inneholder viable celler, foretrekkes det å blande sekvestreringsmidlet med en isotonisk saltløsning. Det henvises forøvrig til de medfølgende krav.

Det kation som for tiden for tiden foretrekkes, er

kalsium. Eksempler på strippepolymeren som har et flertall anioniske grupper som anvendes i den blandede løsning, inkluderer polysulfonsyrer eller (fortrinnsvis) deres salter, enten

naturlige eller syntetiske. Fremragende resultater er oppnådd under anvendelse av heparin, en naturlig polymer som inneholder et flertall av sulfonatgrupper. Polymerer som inneholder polyfosfor- eller polyakrylsyresaltgrupper kan også anvendes. Det sekvestreringsmiddel som for tiden foretrekkes, er natriumcitrat.

En utførelsesform av oppfinnelsen går ut på at det

anvendes en permeabel membran som definerer en mikrokapsel som inneholder en levende celle. Derved kan viable celler innkapsles i et beskyttende miljø og cellene deretter frigjøres. Levende cellekulturer av enhver opprinnelse kan holdes i et sterilt, stabiliserende miljø hvor de kan gjennomgå normal metabolisme og til og med mitose og deretter frigjøres ved at membranene oppbrytes selektivt.

Ved anvendelse av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan således membraner oppbrytes uten at nærliggende levende vev skades. Fremgangsmåten kan også benyttes når findelte materialer, væsker og løsninger er innkapslet og senere skal frigj øres.

Den selektive membranoppbrytningsprosess i henhold til oppfinnelsen utføres på membraner som består av en saltbrobundet matriks av en polykationsk polymer og en polyanionisk polymer. Vanligvis vil membranene ha en sfæroidal form som definerer et innelukket indre som inneholder en innkapslet substans. Imidlertid kan fremgangsmåten også utføres på membraner av

denne type som har noe annet enn sfæroidal form.

Selv om i alt vesentlig ethvert materiale (forlikelig med vandige omgivelser) i flytende eller fast form kan innkapsles og etterpå frigjøres uten skade ved anvendelse av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, ligger den mest bemerkelsesverdige nytte i muligheten til å innkapsle og etterpå frigjøre levende systemer, f.eks. cellekulturer. Følgelig vil den beskrivelse som følger primært være begrenset til en diskusjon av innkapslingen og frigjøringen av celler. Fagmannen på området vil være i stand til å tilpasse prosessen uten vanskelighet, til innkapsling av mindre skjøre materialer.

Innkapsling

Vevet eller cellene som skal innkapsles suspenderes i

et vandig medium som er egnet for opprettholdelse <q>g under-støttelse av de pågående metaboliske prosesser av den spesiel-

le celletype som er involvert. Medier som er egnet for dette formål, er velkjente for fagmannen på området og er ofte tilgjengelige kommersielt. Den gjennomsnittlige diameter av cel-lemassen eller annet materiale som skal innkapsles, kan varie-

re innen vide grenser mellom noen få pm og 1 mm eller mer. Langerhans-øyer fra pattedyr, f.eks., er typisk 50-200 pm i diameter. Vev-fragmenter og individuelle celler så som fibroblaster, leukocytter, lymfoblastoider, pankreatiske 3-, a- eller 6-celler, Langerhans-øyer, hepatocytter, eller cellene av annet vev kan innkapsles etter ønske. Også mikroorganismer kan innkapsles, inklusive slike som er genetisk modifisert ved rekombinant-DNA- eller andre teknikker.

Den fortsatte viabilitet hos slikt levende materiale er bl.a. avhengig av tilgjengeligheten av nødvendige næringsstoffer, oksygenoverføring, fravær av toksiske substanser i mediet og mediets pH-verdi. Hittil har det ikke vært mulig å opprett-holde slikt levende materiale i et fysiologisk forlikelig mil-

jø med samtidig innkapsling. Problemet har vært at de betingelser som kreves for membrandannelse har vært letale eller skadelige for vevet, og før oppfinnelsen i henhold til den ovenfor omtalte søknad ble gjort, var det ikke kjent noen fremgangsmåte for membrandannelse som tillot vev å overleve i sunn tilstand.

Imidlertid er det oppdaget at visse vannløselige substanser som er fysiologisk forlikelige med levende vev og kan gjø-res vann-uløselige slik at det dannes en formbevarende koehe-rent masse, kan anvendes for dannelse av en "temporær kapsel" eller et beskyttende barrieresjikt rundt individuelle celler, grupper av celler eller vev. En slik substans tilsettes, typisk i en konsentrasjon av størrelsesorden 1-2 vekt%, til vev-dyrkningsmediet. Løsningen dannes deretter til dråper som inneholder vev sammen med dets opprettholdelses- eller vekstmedium og gjøres umiddelbart vann-uløselig og geleres, idet minste i et overflatesjikt. Deretter forsynes de formbevarende temporære kapsler med en mer permanent membran som, i overensstemmelse med oppfinnelsen, etterpå kan oppbrytes selektivt for å frigjøre det innkapslede vev uten skade. Der hvor materialet anvendt"' for å danne de temporære kapsler tillater det, kan kapselens indre gjøres flytende igjen etter dannelse av den permanente membran. Dette gjøres ved å reetablere betingelsene i mediet ved hvilke materialet er løselig.

Det materiale som anvendes for å danne de temporære kapsler, kan være hvilkeb som helst ikke-toksisk, vannløselig materiale som, ved en endring i det omgivende ioniske miljø eller konsentrasjonen, kan omdannes til en formbevarende masse. Materialet omfatter også et flertall, lett ioniserte anioniske grupper, f.eks. karboksylgrupper, som kan reagere ved saltbindingsdannelse med polymerer som inneholder et flertall kationiske grupper. Som det skal forklares nedenunder, mulig-gjør denne type materiale deponering av den permanente membran med en selektert permeabilitet (inklusive i alt vesentlig ikke-porøs til et nivå av flere hundre tusen daltons).

Det polyanioniske materiale som for tiden foretrekkes for dannelse av den temporære kapsel, er sure, vannløselige, naturlige eller syntetiske polysakkaridgummier. Mange slike materialer er kommersielt tilgjengelige. De er typisk ekstrahert fra vegetabilsk materiale og anvendes ofte som additiver til forskjellige matvarer. Natriumalginat er den anioniske polymer som for tiden foretrekkes. Alginat i molekylvektområdet 150 000+ daltons kan anvendes, men på grunn av dets molekyl-dimensjoner vil det vanligvis være ute av stand til å perme-ere de til slutt dannede kapselmembraner. For å lage kapsler uten innfanget flytende alginat kan alginat med lavere molekylvekt, f.eks. 40 000-80 000, anvendes. I den ferdige kapsel kan alginatet deretter fjernes lettere fra det intrakapsulære volum ved diffundering gjennom en membran med tilstrekkelig porøsitet. Andre brukbare polyanioniske gummier inkluderer sure fraksjoner av guargummi, karageenan, pektin, tragant-gummi eller xantangummi.

Disse materialer omfatter glykosidbundne sakkaridkjeder. Deres frie' syregrupper er ofte til stede i alkalimetallione-formen, f.eks. natriumformen. Hvis et slikt flerverdig ion som kalsium, strontium eller aluminium byttes ut mot alkali-metallionet, "tverrbindes" de flytende, vannløselige poly-sakkaridmolekyler slik at det dannes en vann-uløselig formbevarende gel som kan bli resolubilisert ved fjerning av ionene ved ionebytting eller via et sekvestreringsmiddél. Selv om i alt vesentlig ethvert flerverdig ion som kan danne et salt med den sure gummi kan benyttes, foretrekkes det at fysiologisk forlikelige ioner, f.eks. kalsium, anvendes. Dette har tendens til å konservere vevet i levende tilstand. Andre flerverdige kationer kan anvendes for mindre skjørt materiale. Magnesiumioner er ineffektive med hensyn til å gelere natriumalginat.

En typisk løsningssammensetning omfatter like volumdeler av en cellesuspensjon i sitt medium og en 1-2 % løsning av gummi i fysiologisk saltvann. Ved anvendelse av natriumalginat er en 1,2-1,6 % løsning blitt anvendt med hell.

I neste trinn av innkapslingsprosessen dannes gummiløs-ningen som inneholder vevet til dråper av ønsket størrelse tilstrekkelig til å omhylle de celler som skal innkapsles. Deretter geleres dråpene umiddelbart for dannelse av formbevarende sfæriske eller sfæroidale masser. Dråpedannelsen kan utfø-res ved kjente teknikker.

Et rør som inneholder en vandig løsning av flerverdige kationer, f.eks. 1,5 % CaC^-løsning, forsynes med en propp som holder en dråpeformende apparatur. Apparaturen omfatter et hus som har en øvre luftinntaksmunning og en avlang, hul-legeme-friksjon innpasset i proppen. En 10.cm^ sprøyte som er forsynt med en trinnpumpe monteres på toppen av huset med f. eks. en 0,254 mm I.D. Teflon-belagt nål som fører gjennom lengden av huset. Det indre av huset er slik konstruert at nålespissen utsettes for en konstant laminær luftstrømning som tjener som en luftkniv. I bruk, med sprøyten full av løsning som inneholder det materiale som skal innkapsles, aktueres trinnpumpen for porsjonsvis å tvinge dråper av løsning fra nålespissen. Hver dråpe "kuttes av" ved hjelp av luftstrøm-men og faller tilnærmet 2,5 cm ned i CaCl2-løsningen hvor den umiddelbart geleres ved absorpsjon av kalsiumioner. Avstan-den mellom nålespissen og overflaten av CaC^-løsningen er i dette tilfelle stor nok til å tillate natriumalginat/cellesuspensjonen å anta den fysisk gunstigste form; en kule (makasimalt volum med minimalt overflateareal). Luft inne i røret "blør" gjennom en åpning i proppen. Dette resulterer i "tverrbinding" av gelen og i dannelse av en formbevarende beskyttende, temporær kapsel med høy viskositet som inneholdes i det suspenderte vev og dets medium. Kapslene oppsamles i løsningen som en separat fase og separeres ved aspirering.

I neste trinn i prosessen deponeres en membran omkring overflaten av de temporære kapsler ved tverrbinding av over-flates jiktet. Dette gjøres ved å utsette de temporære kapsler som omfatter polyanion, for en vandig løsning av en polymer som inneholder kationiske grupper som er i reaktive med anioniske funksjonaliteter i den polyanioniske polymer. Polymerer som inneholder reaktive kationiske grupper, f.eks. frie amin-grupper eller kombinasjoner av amin- og imingrupper, foretrekkes. I denne situasjon tverrbindes polysakkaridgummien ved vekselvirkning (saltbindingsdannelse) mellom karboksyl-gruppene og amin- eller imingruppene i den polykationiske polymer. Permeabiliteten kan med fordel styres innen grenser ved å selektere molekylvekten til den tverrbindende polymer som anvendes, og ved å variere eksponeringstid og konsentrasjon for polymer i løsning. En løsning av polymer med lav molekyivekt, i et gitt tidsrom, vil penetrere videre inn i de temporære kapsler enn hva en polymer med høy molekyivekt vil gjøre. Penetreringsgraden for tverrbindere er jevnført med den resulterende permeabilitet. Generelt kan man si at jo høyere molekylvekten og jo mindre penetreringen er, desto større er pore-størrelsen.. Lengre eksponeringer og mer konsentrerte poly-merløsninger har tendens til å nedsette den resulterende mem-brans øvre permeabilitetsgrense. Imidlertid er den gjennomsnittlige molekyivekt for polymeren den dominante determinant. Grovt sett kan polymerer innen molekylvektområdet 10 000-100 000 daltons eller høyere anvendes, avhengig av varigheten av reak-sjonen, konsentrasjonen av polymerløsningen og den ønskede permeabilitetsgrad. Ett vellykket sett med reaksjonsbetingelser, hvor det anvendes polylysin med gjennomsnittlig molekyivekt ca. 35 000 daltons, involverte reaksjon i 3 minutter, under røxing, av en fysiologisk saltløsning som inneholdt 0,0167 % polylysin. Dette resulterer i membraner som har en øvre permeabilitetsgrense på ca. 100 000 daltons. Generelt sagt danner materialer med høyere molekyivekt membran som er vanskeligere å oppbryte etterpå, sammenlignet med materialer med lavere molekyivekt. Ladningstettheten for den tverrbindende polykationiske polymer påvirker også porestørrelsen og lettheten av membranoppbrytning. Generelt danner materialer med høyere ladningstetthet mindre porøse membraner som er vanskeligere å oppbryte. Optimale reaksjonsbetingelser som er egnet for styring av permeabiliteten i et gitt system, kan lett bestemmes empirisk på bakgrunn av de foranstående ret-ningslinjer.

Eksempler på egnede tverrbindingspolymerer inkluderer proteiner og polypeptider, enten naturlige eller syntetiske, som har frie aminogrupper eller kombinasjoner av amino- og iminogrupper, polyetylenaminer, polyetyleniminer og polyvinylaminer. Polylysin, både i D- og L-form, er blitt anvendt med hell. Proteiner, f.eks. polyarginin, polycitrullin eller poly-ornitin, er også brukbare. Polymerer i det høyere område av positiv ladningstetthet (f.eks. polyvinylamin) adhererer kraftig til de anioniske grupper i de polyanioniske molekyler og er vanskeligere å oppbryte.

På dette punkt i innkapslingen kan kapsler oppsamles som omfatter en "permanent" semipermeabel membran som omgir en gelert løsning av gummi, celletype-forlikelig kulturmedium, samt cellene. Hvis formålet simpelthen er å konservere cellene i et beskyttende miljø, trenger ingen flere trinn å bli utført. Hvis imidlertid masseoverføring skal påskynnes i kapslene og tvers over membranene, foretrekkes det å flytendegjøre gelen igjen til dens vannløselige form. Dette kan gjøres ved å reetablere de betingelser under hvilke gummien er en væske, f. eks. ved å fjerne kalsiumet eller andre multifunksjonelle kationer fra gelen. Mediet i kapslen kan resolubiliseres simpelthen ved neddypping av kapslene i fosfatpufret saltvann,

som inneholder alkalimetallioner og hydrogenioner. Enverdige ioner byttes ut mot kalsium eller andre multifunksjonelle ioner i gummien når kapslene er neddyppet i løsningen under røring. Natriumcitratløsninger som anvendes for samme formål og tjener til å sekvestrere de toverdige ioner. Gummimolekyler som har molekyivekt under den øvre permeabilitetsgrense for membranene, kan deretter fjernes fra det intrakapsulære volum ved diffundering.

Til slutt kan det være ønskelig å behandle kapslene for

å stanse frie aminogrupper eller lignende, som ellers kunne gjøre at kapslene fikk tendens til å danne klumper. Dette kan f.eks. gjøres ved å neddyppe kapslene i en fortynnet løsning av natriumalginat.

Av ovenstående vil det fremgå at det ikke er nødvendig å benytte noen kraftige reagenser, ekstreme temperaturer eller andre betingelser som er skadelige for cellens helse og viabilitet, i membrandannelsesprosessen. Således kan selv svært øm-fintlige celler, f.eks. pattedyr-hepatocytter, -leukocytter, fibroblaster, lymfoblaster, og celler fra forskjellig endo-krint vev innkapsles uten vanskelighet. Naturligvis kan også celler av mikrobiologisk opprinnelse, f.eks. gjær, muggsopper og bakterier som er bedre tilpasset til å overleve i fiendtlige omg'ivelser, såvel som inerte reagenser, faststoffer eller bio-logisk aktive materialer, også innkapsles uten skade.

Innkapslede celler av den type som er beskrevet ovenfor, kan suspenderes i opprettholdelsesmedium eller vekstmedium for lagring eller kultur og vil forbli fri for bakteriell infek-sjon. Hvis de er suspendert i vekstmedium, vil celler som gjennomgår mitose in vitro, gjøre det i kapslene. Normal in vitro-metabolisme fortsetter, forutsatt at de faktorer som trenges for metaboliske prosesser, er av tilstrekkelig lav molekyivekt til at de kan penetrere kapselmembranen, eller de blir innkapslet sammen med cellene. Metaboliske produkter fra cellene (hvis de har en molekyivekt under den øvre permeabilitetsgrense) penetrerer membranen og oppsamles i mediet. Cellene i innkapslet form kan lagres, skipes eller dyrkes etter ønske, og de kan frigjøres fra sitt beskyttende miljø uten skade ved hjelp av den følgende prosess som går ut på selektivt å oppbryte membranene.

Oppbrytning av membraner

I overensstemmelse med oppfinnelsen kan det innkapslede materiale frigjøres ved en totrinnsprosess som innebærer bruk av kommersielt tilgjengelige reagenser med egenskaper som ikke innvirker ugunstig på de innkapslede celler.

For det første separeres kapslene fra sitt suspenderings-medium, vaskes grundig for fjerning av eventuelle kontaminanter og dispergeres deretter, under agitering, i en separat eller fortrinnsvis blandet løsning av kationer, f.eks. kalsiumioner eller annet monoatomisk materiale (lav molekyivekt, flerverdig kation) og en strippepolymer som har et flertall av anioniske grupper, f.eks. polysulfonsyregrupper. Polymerer som inneholder polyfosfor- eller polyakrylsyregrupper kan også anvendes. Heparin, et naturlig sulfonert polysakkarid, foretrekkes for oppbrytning av membraner som inneholder celler. Den anioniske ladning i den strippepolymer som anvendes,

må være tilstrekkelig til å oppbryte saltbroene. Således kan den anioniske ladningstetthet være lik eller fortrinnsvis stør-re enn ladningstettheten for den indre polyanioniske polymer (dvs. gummien) som opprinnelig ble benyttet for å danne membranene. Molekylvekten til strippepolymeren bør være mirfst sammenlignbar med og fortrinna/is større enn molekylvekten til den indre polykationiske polymer som anvendes ved dannelse av membranen. I suspensjonen konkurrerer kalsiumionene med den indre polykationiske polymer som omfatter membranen, om anioniske plasser på den polyanioniske polymer. Samtidig konkurrerer strippepolymeren som er oppløst i løsningen, med den polyanioniske gruppe i membranen, om kationiske plasser på den polykationiske polymer. Dette resulterer i et vanndisper-gerbart eller fortrinnsvis vannløselig kompleks, f.eks. av polylysin og den polyanioniske polymer, og i assosiasjon mellom kationene og gelmolekyler.

Dette trinn gjør membranen utsatt for påfølgende eksponering for et sekvestreringsmiddel som fullfører oppbrytnings-prosessen ved å ta opp to- eller treverdige ioner fra gelen. Typisk kan kapselmembran-debris, om sådant forblir i mediet, lett separeres fra cellene.

Den løsning som for tiden foretrekkes for det første trinn i den selektive oppbrytningsprosess omfatter 1,1 vekt/vol.% kalsiumklorid og mellom 500 og 1500 enheter heparin pr. ml løs-ning. Et volum av mikrokapsler tilsettes til denne løsning som er tilstrekkelig til å utgjøre mellom ca. 20 og 30 .% av det totale volum av suspensjonen. Kalsiumklorid og heparin foretrekkes ved oppbrytning av membraner av celleholdige kapsler, siden begge reagenser er fysiologisk forlikelige med de fleste celler og reduserer muligheten for celleskader til et minimum. Blandinger av aluminiumsalter eller andre flerverdige kationer (men ikke Mg<++->ioner) kan også anvendes sammen med polysulfonsyresaltet eller saltet av en annen syre av den type som er angitt ovenfor.

Generelt kan konsentrasjonen av ionene og den anioniske polymer i den anvendte løsning i dette trinn variere innen vi-de grenser. Optimale konsentrasjoner kan lett bestemmes empirisk. Den lavest brukbare konsentrasjon for en spesiell sats av innkapslede celler foretrekkes.

Det : sekvestreringsmiddel som for tiden foretrekkes for å utføre den selektive oppbrytning er natriumcitrat, selv om andre alkalimetallcitratsalter og alkalimetall-EDTA også kan anvendes. Hvis natriumcitrat anvendes, så er den optimale konsentrasjon av størrelsesorden 55 mM. Hvis kapselmembranene som oppbrytes, inneholder viabelt vev, foretrekkes det at cit-ratet blir oppløst i isotonisk saltløsning for at skadene på celler skal reduseres til et minimum.

Oppfinnelsen skal i det følgende forklares ved eksempler.

Kapseldannelse

Eksempel 1: Innkapsling av pankreatisk vev

Langerhans-øyer oppnås fra rottepankreas og tilsettes til en komplett vevkultur (CMRL-1969 Connaught Laboratories, Toronto, Canada) i en konsentrasjon av tilnærmet 10 3 øyer

pr. ml. Vevkulturen inneholder alle næringsstoffer som trenges for fortsatt viabilitet hos øyene, så vel som de aminosyrer som benyttes for cellene for å lage hormoner. 4/10 ml av en øy-suspensjon som inneholder tilnærmet 10 3 øyer pr. ml tilsettes deretter til 1/2 ml volum av 1,2 % natriumalginat (Sigma Chemical Company) i fysiologisk saltvann.

Deretter anvendes en 1,5 % kalsiumkloridløsning for å gele dråper av størrelsesorden 300-400 Mm i diameter. Etter at den supernatante løsning er fjernet ved aspirering, overføres de gelerte dråper til et begerglass som inneholder 15 ml av en del av en 2 % 2(cykloheksylamino)etansulfonsyre-pufferløsning i 0,6 % NaCl (isotonisk, pH=8,2) fortynnet med 20 deler av 1 % CaCl2- Etter 3 minutters neddypping vaskes kapslene to ganger i 1 % CaCl2-

Kapslene overføres deretter til en 32 ml løsning som omfatter 1/80 av 1 % polylysin (gjennomsnittlig MV 35 000 amu)

i fysiologisk saltvann. Etter 3 minutter dekanteres polylysin-løsningen. Kapslene vaskes med 1 % CaC^ og resuspenderes eventuelt i 3 minutter i en løsning av polyetylenimin (MV 40 000 - 60 000) fremstilt ved fortynning av en forrådsløsning av 3,3 % polyetylenimin i morfolinpropansulfonsyre-puffer (0,2 M,

pH=6) med tilstrekkelig 1 % CaC^ til å resultere i en endelig polymerkonsentrasjon på 0,12 %. De resulterende kapsler, med "permanente" semipermeable membraner, vaskes deretter to ganger med 1 % CaC^? to ganger med fysiologisk saltvann og blandes med 10 ml av 0,12 % alginsyreløsning.

Kapslene motstår klumpdannelse, og mange kan sees å inneholde Langerhans-øyer. Gel på det indre av kapslene gjøres flytende igjen ved neddypping av kapslene i en blanding av saltvann og citratpuffer (pH=7,4) i 5 minutter. Til slutt suspenderes kapslene i CMLR-69 medium.

Under mikroskopet observeres disse kapsler å omfatte en tynn membran som omsirkler en øy i hvilken individuelle celler kan sees. Molekyler som har en molekyivekt opp til ca. 100 000 kan gå gjennom membranene. Dette tillater oksygen, aminosyrer, næringsstoffer og plasmakomponenter som anvendes i kulturmedier (f.eks. lavmolekylære fetal-kalveserumkomponenter) å nå øyen

og tillater utskillelse av insulin.

Eksempel 2: Innkapsling av hepatocytter

Fremgangsmåten fra eksempel 1 gjentas med unntagelse av at 0,5 ml av en levercellesuspensjon som inneholder ca. 10 celler pr. ml anvendes istedenfor 0,4 ml øysuspensjon. Den fortsatte viabilitet hos levercellene er vist ved farvestoffeksklude-ringsteknikken (tryptanblått-utelukkelse) og ved deres obser-verte evne til kontinuerlig å produsere urinstoff. Det er kjent at levervev in vitro kan oppta toksiner fra omgivelsene. Følgelig detoksifiseres toksiner med molekyivekt som er lav nok til å passere gjennom de semipermeable membraner, av cellen .

Eksempel 3: Aktivert trekullinnkapsling

Fremgangsmåten fra eksempel 1 gjentas med unntagelse av

at partikkelformig aktivert trekull suspenderes direkte i natriumalginatløsningen, den halve ml av vevsuspensjon utela-tes og polylysin med en gjennomsnittlig molekyivekt på 35 000 anvendes som tverrbinder. Så lenge som trekullpartiklene er mindre enn den minste innvendige diameter for det kapillar-

rør som brukes for å produsere dråpene, blir resultatet trekull med høyt overflateareal omgitt av en semipermeabel membran. Disse forhindrer effektivt unnslippelse av trekullspon eller støv, men kan allikevel anvendes til å absorbere materialer av ethvert preselektert molekylvektområde fra fluid som føres gjennom kapslene.

Eksempel 4; Innkapsling av humanfibroblaster

Humanfibroblaster oppnådd ved behandling av pannevev fra mennesker med trypsin og EDTA i 5 minutter ved 37°C på kjent måte, suspenderes i et komplett vekstmedium (CMLR 1969, Connaught Laboratories) supplert med 40 vol.% renset fetal-kalveserum, 0,8 % natriumalginat (Sigma) og 200 mg/ml renset kalvehudkollagen. Tettheten til cellesuspensjonen er ca.

1,5 x 10 7 celler/ml. Temporære alginatkapsler dannes som angitt ovenfor. Semipermeable membraner deponeres i overflatesjikt i kapslene ved at de suspenderes i en 0,005 vekt/vol.% vandig løsning av poly-L-lysin, (MV 43 000 daltons) i 3 min.

De resulterende kapsler suspenderes i CMLR-1969 supplert med 10 % fetal-kalveserum. De foregående trinn utføres alle ved 37°C. Etter inkubering ved den samme temperatur vil kapslene, hvis de undersøkes under mikroskopet,-, finnes å inneholde fibroblaster som har gjennomgått mitose og viser tredimensjo-nalfibroblastisk morfologi i mikrokapslene.

Eksempel 5: Selektiv oppbrytning av membranene

Mikrokapsler fra hvert av eksemplene 1-4 kan behandles

som følger i den hensikt selektivt å oppbryte kapselmembranene uten skade på det innkapslede kjernemateriale.

10 ml porsjoner av mikrokapselsuspensjoner som inneholder ca. 500-5000 kapsler pr. ml tillates å sette seg, og suspen-sjonsmediet aspireres fra. Kapslene vaskes to ganger med saltvann. De vaskede kapsler blandes så med en 3,0 ml alikvot av saltvann som inneholder heparin i forskjellige konsentra-ner som angitt nedenunder, og 1,1 vekt/vol.% CaCl2. Kapsler med alginat innelukket i seg viser, etter at dette trinn er ferdig, en gelert, formbevarende innvendig kjerne. Suspensjonen agiteres ved 37°C i 10 minutter, hvoretter kapslene tillates å sette seg, supernatanten aspireres fra og kapslene vaskes to ganger med 3,0 ml av 0,15 M NaCl. Etter aspirering av den annen vaskeløsning blandes kapslene med 2,0 mL av en blandet løsning som omfatter like volumdeler av 110 mM natriumcitrat og 0,15 M NaCl (pH = 7,4).

Kapselmembraner som var behandlet med 1000 enheter /ml heparin og virvlet i NaCl-Na-citrat-løsningen i 1 minutt ble fullstendig desintegrert. Det samme resultat oppnås med kapsler som behandles med 2000 enheter /ml heparin i 2 minutter fulgt av 15-30 sekunder med hånd-virvling. Lavere konsentrasjoner av heparin foretrekkes, da muligheten for celleskader reduseres.

Etter oppløsning av membranene kan eventuelt membrandebris fjernes ved aspirering og vasking. Etter at de frigjorte celler er resuspendert i kulturmedium, kan de testes ved tryptanblått-farvestoff-ekskluderingsteknikken og vil finnes å være i sunn, viabel tilstand, med relativt få celler som viser farve-stoffopptak.

Eksempel 6

Kapsler fremstilt i overensstemmelse med eksempel 3 behandles ,etter vask, med en 3,0 ml løsning som inneholder 1000 enheter/ml heparin og 1,0 % AlCl^ i 6 minutter med agitering. Etter aspirering av supernatanten frigjøres fjerne-materialet ved å virvle kapslene med en 0,1M løsning av natriumcitrat i 30-90 sekunder.

Eksempel 7

Fremgangsmåten fra eksempel 6 gjentas med unntagelse av at 0,10 M EDTA (natrium-form) ved pH 7,0 anvendes istedenfor natriumcitratet, hvilket resulterer i hurtig oppbrytning av kapselmembranene.

Eksempel 8

Kapsler fremstilt i overensstemmelse med eksempel 3 behandles, etter vask, med en 3,0 ml vandig løsning som inneholder 10 mg/ml av polyvinylsulfat (MV ca. 50 000 daltons) og 1 % CaCl2. Etter-behandling med 0,10M natriumcitrat resulterer i i alt vesentlig komplett oppløsning av kapslene.

Claims (14)

1. Fremgangsmåte for selektivt å oppbryte en permeabel membran, omfattende matriks av: en første polymer som har multiple kationiske grupper; og en annen polymer som har multiple anioniske grupper og en første ladningstetthet, idet den første og annen polymer er forbundet ved saltbroer mellom de anioniske og kationiske grupper; karakterisert ved følgende trinn; A. å eksponere membranen for en løsning av flerverdige kationer og en strippepolymer som har et flertall anioniske grupper, idet strippepolymeren har tilstrekkelig ladning til å oppbryte saltbroene, B. å tillate kationene å konkurrere med den første polymer om anioniske plasser på den annen polymer, og strippepolymeren å konkurrere med den annen polymer om kationiske plasser på den første polymer; og C. sekvestrere kationer som er assosiert med den annen polymer etter trinn B.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at sekvestreringstrinnet (C) utføres ved å eksponere membranene for en løsning som inneholder et chelateringsmiddel.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at det anvendes et chelateringsmiddel som består av citrationer og EDTA-ioner.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som første polymer anvendes en som omfatter multiple aminogrupper.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at det som annen polymer anvendes en som omfatter en sur, vannløselig gummi.

6. Fremgangmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at det som den annen polymer anvendes en som omfatter alginat.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at det som strippepolymer anvendes en som omfatter heparin og kationer som omfatter Ca++.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som den første polymer anvendes en som er utvalgt fra gruppen bestående av: a) proteiner som omfatter et flertall aminosyreenheter som har frie aminogrupper; b) proteiner som omfatter et flertall aminosyreenheter som har frie iminogrupper; c) polypeptider som omfatter et flertall aminosyreenheter som har frie aminogrupper; d) polypeptider som omfatter et flertall aminosyreenheter som har frie iminogrupper; e) polyvinylaminer; f) polyetyleniminer; g) polyetylenaminer; og h) blandinger derav.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det anvendes en strippepolymer som er utvalgt fra gruppen som består av: a) polysulfonsyrer; b) polyfosfonsyrer; c) salter derav; og d) blandinger derav.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som strippepolymer anvendes en polysulfonsyresaltpolymer.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det anvendes en strippepolymer som har et flertall anioniske grupper med en ladningstetthet som er større enn den første ladningstetthet.

12. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det anvendes en permeabel membran som definerer en mikrokapsel som inneholder en levende celle.

13. Fremgangsmåte som angitt i krav 12, karakterisert ved at det anvendes en første polymer som omfatter et protein, en vannløselig gummi som omfatter natriumalginat, kationer som omfatter kalsium og strippepolymer som har et flertall anioniske grupper som omfatter heparin.

14. Fremgangsmåte som angitt i krav 13, karakterisert ved at sekvestreringstrinnet utføres med citrat oppløst i en løsning som er fysiologisk forlikelig med cellen.