DE3504724A1

DE3504724A1 - Verfahren zur einkapselung eines einzuhuellenden materials

Info

Publication number: DE3504724A1
Application number: DE19853504724
Authority: DE
Inventors: Ann W. Newton Center Mass. Shyr; Wen-Ghih Lexington Mass. Tsang
Original assignee: Damon Biotech Inc
Current assignee: Abbott Biotech Inc
Priority date: 1984-02-13
Filing date: 1985-02-12
Publication date: 1985-09-05
Also published as: BE901704A; CH665137A5; FR2559502A1; IT8567142A1; FR2559502B1; SE8500623D0; AU572609B2; SE8500623L; AU3857285A; NO850535L; GB2153780B; US4663286A; IT1184885B; IT8567142A0; JPH0150454B2; DE3504724C2; GB2153780A; DK65285A; DK65285D0; JPS60190229A

Description

DAMON BIOTECH, INC.
Needham Heights, MA o2194
V.St.A.

Verfahren zur Einkapselung eines einzuhüllenden

Materials

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Einkapselung eines einzuhüllenden Materials, einschließlich lebender Zellen,
in eine semipermeable Membran und insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von großen Mengen von Kapseln mit einheitlichen Membranen, deren Porosität zur Beschleunigung des Zellwachstums innerhalb der Kapseln besser kontrolliert werden kann.

In der US-PS 4 352 883 ist ein Grundverfahren zur Einkapselung von einzuhüllendem Material, einschließlich lebender Zellen, in Kapseln mit semipermeablen Membranen beschrieben. Die auf diese Weise eingekapselten lebenden Zellen halten ihren Metabolismus, einschließlich der Mitose, aufrecht und sondern
Material ab, das sie normalerweise auch in nichteingekapselter Form absondern würden. Gemäß der US-PS 4 352 883 sind Kapseln herstellbar, deren Membranen für Moleküle unter einem bestimmten

0192-DBH-452/K/A1

Molekulargewicht durchlässig, jedoch für Moleküle mit einem höheren Molekulargewicht oder für Zellen praktisch undurchlässig sind. Es wird vermutet, daß die Poren der Membranen gewundene Durchgänge durch die Zwischenräume der Membranstruktur darstellen. Der Durchgang von Molekülen mit einem Molekulargewicht über einem gewissen Wert wird durch diese gewundenen Durchgangsporen behindert; ab einem gewissen Molekulargewicht und der entsprechenden Molekülgröße ist die Behinderung groß genug, um die Membran für diese Moleküle praktisch undurchlässig zu machen.

Die Einstellung der Porosität ist ein wichtiger Faktor bei einer Vielzahl von wichtigen Verwendungszwecken dieser Mikrokapseln. Die Mikrokapselmembran kann für eine differenzierte Trennung, d.h. die Trennung von Molekülen auf Molekulargewichtsbasis, verwendet werden. So beschreibt die US-PS 4 409 331 ein Verfahren, bei dem Substanzen, die von den Zellen innerhalb der Kapsel abgesondert werden, die Membran passieren können,wogegen andere Substanzen mit einem höheren Molekulargewicht innerhalb der Kapsel zurückgehalten werden. Derartige Kapseln können das Gewinnen einer interessierenden Substanz wesentlich vereinfachen. Interessierende Substanzen mit einem niedrigen Molekulargewicht können durch die Membran in das extrakapsuläre Medium diffundieren, wogegen Zelltrümmer, Substanzen mit einem höheren Molekulargewicht und Verunreinigungen, z.B. Pyrogene, innerhalb der Kapsel gefangen bleiben.

Die selektiven Trenneigenschaften der Kapselmembran gestatten den Einsatz der Kapsel für die Kreuzung von Stämmen zur invivo-Züchtung von Hybridomen. Die Kapselmembran macht es möglich, gekreute Hybridome in einer Körperhöhle eines Tieres , dessen Immunsystem normalerweiser die Hybridome angreifen würde, zu züchten. Geschicktes Einstellen der Membranpermeabilitätseigenschaften gestattet die hochspezifische Gewinnung der abgesonderten Substanz.

Das wirkungsvolle Einstellen der Membranpermeabilität ermöglicht es auch, die implantierte Kapsel, die ein Antigen absondernde Zellen enthält, als Immunisierungsmittel zu verwenden. Durch die Trenneigenschaften der Membran wird relativ reines Antigen als Immunisierungsmittel erhalten, ohne daß mühselige Antikörperreinigungsverfahren durchgeführt werden müssen^ Auf diese Weise kann die Produktion eines spezifischen Antikörpers stimuliert werden.

Kapseln mit derartigen Membranen können auch als Teil eines Zelltrennverfahrens verwendet werden. Das extrakapsuläre Medium wird auf eine Substanz untersucht, die durch die Membran abgesondert wird. Verunreinigungen, die ein größeres Molekulargewicht als die Substanz haben, werden innerhalb der Kapsel zurückgehalten und täuschen somit keine falschen positiven Ergebnisse vor.

In einer bevorzugten Ausführungsform der US-PS 4 352 883 werden formbeständige Gelklumpen, die das einzuhüllende Material enthalten, hergestellt, auf deren Oberfläche dann eine Membran aufgebracht wird. Die Membran wird durch das Inberührungbringen von relativ hochmolekularem Material mit den Gelklumpen und ionisches Vernetzen mit dem Gel gebildet. In der US-PS wird beschrieben, daß niedermolekulare, vernetzende Polymere weiter iii die Struktur der Gelklumpen eindringen und auf diese Weise die Poren verkleinern. Auch die Dauer der Membranbildung beeinflußt die Porengröße, das heißt, je langer die vernetzende Polymerlösung mit den Gelklumpen in Berührung ist, umso dicker und weniger durchlässig wird die Membran.

Obwohl auf diese Weise annehmbare Membranen herstellbar sind, könnten die Kapseln für viele der vorstehenden Anwendungen besser eingesetzt werden, wenn einheitlichere Membranen mit einer besser kontrollierten Porosität hergestellt werden könnten. Mit den Verfahren gemäß der US-PS 4 352 883 ist eine

feine Einstellung der Membranporosität nicht möglich, vielmehr werden ziemlich grobe_;unterschiedliche Filtergrenzen gesetzt.

Zusätzlich zur verbesserten Porosität ist es für Handelszwecke wichtig, beständig Mikrokapseln mit defektfreien Membranen in großer Anzahl herstellen zu können. Bei den gemäß der US-PS 4 352 883 hergestellten Membranen ragen gelegentlich Zellteile aus der Membran oder die Zellen haften an den Kapseln. Außerdem entstehen gelegentlich Kapseln mit Löchern, durch die die Zellen, die zu interessierende Substanz oder unerwünschte Verunreinigungen aus der Kapsel austreten können. Wenn geringe Anteile von Mikrokapseln, die für einen bestimmten Zweck hergestellt worden sind, Membranlöcher aufweisen, so sind viele der Aufgaben und Vorteile der Verfahren zunichte gemacht. Dementsprechend war ein verbessertes Verfahren, zur Einkapselung, in dem einheitlichere Membranen, die keine statistischen Defekte aufweisen, hergestellt werden könnten, günstig für die Wirtschaftlichkeit vieler der vorstehenden Verfahren.

Aufgabe der Erfindugn war es daher, ein Verfahren zur Herstellung von Mikrokapseln mit einheitlicheren Membranen und besser kontrollierbarer Porosität anzugeben, wobei das Zellwachstum und die Absonderung von Substanzen, die von den Zellen produziert wenden, optimiert werden sollten. Die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten durchlässigen Kapselmembranen sollten genauere Permeabilitätsgrenzen aufweisen und reproduzierbar herstellbar sein.

Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Einkapselung eines einzuhüllenden Materials in eine semipermeable Membran, das gekennzeichnet ist durch

A Gelieren eines wasserlöslichen, polyanionischen, ein einzuhüllendes Material enthaltenden Polymers mit einer wäßrigen, mehrwertige Kationen enthaltenden Lösung zu einzelnen, hydratisierten_;formbeständigen Gelklumpen,

B Expandieren der Gelklumpen mit einer wäßrigen Lösung, die einen Teil der mehrwertigen Kationen entfernt und die Gelklumpen weiter hydratisiert,

C Ausbilden einer Membran um die expandierten Gelklumpen zu Kapseln durch Umsetzung der Anionen des polyanionischen Polymers und der Kationen eines polykationischen Polymers mit einem Molekulargewicht von 3.000 Dalton.

Im erfindungsgemäßen Verfahren können Kapseln mit einer einheitlicheren Membran und einer besser kontrollierbaren Porosität herstellt werden, die für die Kultivierung von Zellen besser geeignet sind.

Wie in der US-PS 4 352 883 beschrieben, wird auch im erfindungsgemäßen Verfahren das einzuhüllende Material in einer Lösung eines wasserlöslichen, polyanionischen Polymers, das geliert werden kann, suspendiert; die Suspension des Polymers und des einzuhüllenden Materials wird dann in Tropfen oder andere einzelne Formen ausgebildet. Die Tropfen werden sofort mit einer Lösung mehrwertiger Kationen in Berührung gebracht, wobei weiche, formbeständige, hydratisierte Gelklumpen entstehen. Im erfindungsgemäßen Verfahren werden nun die Gelklumpen expandiert und durch Inberührungbringen mit einer wäßrigen Lösung, wie einer Natriumchloridlösung, die einen Teil der mehrwertigen Kationen entfernt, weiter hydratisiert. Anschließend wird um jeden der expandierten Gelklumpen eine Membran gebildet und zwar durch Umsetzen der Anionen des polyanionischen Polymer-Hydrogels und der Kationen eines polykationischen Polymers mit einem Molekulargewicht

von vorzugsweise über etwa 3.000 Dalton. Als polyanicnisches Polymer werden saure Polysaccharide und insbesondere Alginatsalze bevorzugt. Geeignete polykationische, vernetzende Polymere sind Proteine und Polypeptide mit einer Vielzahl von reaktiven, Stickstoff enthaltenden, kationischen Gruppen wie primäre Amine, Polyvinylamine, Polyethylenamine und/oder Aminogruppen enthaltende Polysaccharide und/oder ihre wasserlöslichen Salze. Im allgemeinen wird Polylysin als polykationisches Polymer bevorzugt. Polyglutamin und Polyornithin sind jedoch auch geeignet. Um die erste Membran kann eine zweite Membran gebildet werden und zwar durch Umsetzen mit einem anderen polykationischen Polymer. Jedes der angegebenen kationischen Polymere kann zur Ausbildung dieser zweiten Membran verwendet werden. Die Art und das Molekulargewicht des (der) verwendeten polykationischen Polymers (Polymere) wird nach den gewünschten Porositätseigenschaften der Kapseln ausgewählt. Es wurde festgestellt, daß die Ladungsdichte der polykationischen Polymere eine wesentliche Wirkung auf die Porosität haben kann.

Als einzuhüllendes Material können lebende Zellen, wie genetisch veränderte Zellen, beispielsweise Hybridome, eukariotische Zellen, einschließlich Tiergewebezellen oder prokariotische Zellen verwendet werden.

Im erfindungsgemäßen Verfahren kann die Membran auch mit einem wasserlöslichen polyanionischen Polymer, wie einem Alginat, das mit den restlichen Kationen der Membran reagiert, nachbeschichtet werden. Die Gelklumpen können nach der Membranbildung durch Umsetzen mit einemChelatbildner wieder verflüssigt werden. Ethylenglycol-bis-(2-aminoethyl)-N,N, N¹, N'-tetraessigsäure und ihre Salze (EGTA) sind bevorzugte Chelatbildner, wenn die Kapsel für die Züchtung von Zellen verwendet werden sollen. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, daß die Wiederverflüssigung mit EGTA, im Vergleich zu

anderen Chelatbildner, wie EDTA oder Citrat, die Produktion von biologischem Material durch die Zellen innerhalb der Kapseln wesentlich erhöht.

Die geeignete Auswahl der Reaktanten und der Reaktionsbedingungen gestattet die Bildung von Membranen mit einer relativ spezifischen Permeabilität. So können Membranen hergestellt werden, die für Moleküle mit einem Molekulargewicht über etwa 150.000 Dalton, das heißt für alle herkömmlichen Immunoglobuline, praktisch undurchlässig sind. Die Membranen können aber auch für Moleküle mit einem Molekulargewicht bis zu etwa 500.000 Dalton durchlässig sein, jedoch den Durchgang von höher molekularem Material verhindern. Derartige Kapseln lassen IgG durch, halten IgM jedoch zurück. Andererseits können die Membranen aber auch so ausgelegt werden, daß Moleküle mit einem Molekulargewicht über 500.000 Dalton durchgehen, Zellen aber zurückgehalten werden.

Wird zum Beispiel eine Trennung nach Molekulargewicht bei oder unter 150.000 Dalton gewünscht, so wird um die Kapseln eine zweite Membran gebildet und zwar mit einem polykationischen Polymer mit der gleichen oder vorzugsweise mit einer höher Ladungsdichte als die des ersten polykationischen Polymers; das heißt, eine Polylysinmembran kann durch Eintauchen in eine Polyornithin-oder Polyvinylaminlösung nachbehandelt werden. Soll die Membran Moleküle mit einem Gewicht über 500.000 Dalton durchlassen, so kann ein hochmolekulares vernetzendes Polymer, wie Polylysin, das ein Molekulargewicht über 200.000 Dalton hat, verwendet werden.

Das Expandieren der Gelklumpen im erfindungsgemäßen Verfahren verbessert deutlich die Einheitlichkeit der Kapselmembranen und gestattet eine wirkungsvollere Kontrolle der Porosität.

Das beruht zum Teil auf der Beobachtung, daß Gelklumpen aus polyanionischen Polymeren, wie Alginat, durch Veränderung des Hydratationsgrades des Polymers expandiert oder zusammengezogen werden können. Gelklumpen, die mehr als 982 Wasser enthalten, sind im wesentlichen weiche, formbeständige Kugeln mit einer vernetzten Gelstruktur. Es wurde festgestellt, daß das Expandieren der Gelklumpen nach dem Gelieren und vor dem Aufbringen der Membran eine bessere Kontrolle der Permeabilitätseigenschaften und der Einheitlichkeit der Membranen gewährleistet. Durch das Eintauchen der Gelklumpen in eine Lösung einwertiger Kationen, beispielsweise in eine Natriumchloridlösung, ein- oder mehrmals wird ein Teil der vernetzenden mehrwertigen Kationen aus dem Gel entfernt, wodurch der Hydratationsgrad erhöht und die Gelstruktur expandiert wird. Auf diese Weise entstehen einheitlich hydratisierte Gelklumpen, die für das anschließende Aufbringen der Membran gut geeignet sind. Wird eine solche Behandlung nicht durchgeführt, so sind die Größe und die Eigenschaften der Gelklumpen sehr verschieden, da die zuerst gebildeten Klumpen länger in der Gelierlösung bleiben als die zuletzt gebildeten Klumpen. Wichtig ist auch die Beobachtung, daß sich die Gelklumpen zusammenziehen, wenn sie mit einer Lösung, die mehrwertige Kationen enthält, wie eine Calciumchloridlösung, ins Gleichgewicht gebracht werden. Ist andererseits ein Gelklumpen einmal von einer Membran umgeben, so wird die Membran durch das Eintauchen der Kapsel in eine, einwertige Kationen enthaltende Lösung gedehnt, wodurch die Poren größer werden. Diese Beobachtungen sowie die Tatsache, daß Vernetzungsmittel mit einer höheren Ladungsdichte die Poren verkleinern, machen es möglich, die Membranpermeabilität genauer einzustellen. Werden diese Beobachtungen mit den Verfahren zur Permeabilitätskontrolle gemäß der US-PS 4 352 883 vereint, so stehen dem Fachmann eine Anzahl von Parametern zur Verfügung, die die Herstellung von einheitlichen Kapseln mit beständigeren und genaueren Permeabilitätseigenschaften ermöglichen.

Wie in der US-PS 4 352 883 beschrieben, wird das einzuhüllende Material in einer Lösung suspendiert, die ein wasserlösliches, reversibel gelierbares polyanionische Polymer und vorzugsweise Natriumalginat enthält. Die Suspension aus Polymer und einzuhüllendem Material wird in Tropfen unter Verwendung herkömmlicher Vorrichtungen, wie einer Tropfen bildenden Spritzkopf- Vorrichtung, ausgebildet. Die Spritzkopfvorrichtung besteht aus einem Gehäuse mit einer oberen Lufteinlaßdüse und einem länglichen, hohlen Reibungskörper, der in einen Stopfen eingepaßt ist. Eine Spritze und beispielsweise eine 1Oml-Spritze, die mit einer Stufenpumpe verbunden und einer Nadel ausgerüstet ist, wie einer Teflon-beschichteten Nadel mit einem inneren Durchmesser von 0,025 cm (0,01 inch), wird oben am Gehäuse so angebracht, daß die Nadel über die Länge des Gehäuses reicht. Das Innere des Gehäuses ist so ausgelegt, daß die Spitze der Nadel einem ständigen laminaren Luftstrom, der als Luftmesser wirkt, ausgesetzt ist. Bei der Verwendung wird die Spritze, die eine Lösung des einzuhüllenden Materials enthält, oben am Gehäuse angebracht* die Stufenpumpe drückt Tropfen der Lösung an die Spitze der Nadel, wo jeder Tropfen durch den Luftstrom abgeschnitten wird und etwa 2,5 bis 3,5 cm in eine Gelierlösung fällt, wo er sofort durch Absorption von vernetzenden Ionen geliert. Als Gelierlösung wird eine CaIc iumionenlösung, wie eine 1,2Sige (1,2 g/100 ml Lösung) Calciumchlorid bevorzugt. Der Abstand zwischen der Nadelspitze und der Caiciumchloridlösung wird vorzugsweise so gewählt, daß die Lösung von Polymer und einzuhüllendem Material die physikalisch günstigste Form , das heißt eine Kugelform (max. Volumen zu Oberfläche), annehmen kann. Die Luft im Rohr entweicht durch die öffnung im Stopfen. Die gelierten, formbeständigen, kugelförmigen Klumpen oder Übergangskapseln, die vorzugsweise einen Durchmesser von 50 μπι bis einigen mm haben, sammeln sich in der Lösung als getrennte Phase und können durch Absaugen gewonnen werden.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die Gelklumpen durch ein- oder mehrmaliges getrenntes Eintauchen oder Waschen in einer einwertige Kationen enthaltende Lösung, wie einer Natriumchloridlösung, expandiert. Dieses Eintauchen entfernt einen Teil der vernetzenden Calciumionen und hydratisiert das Gel weiter . Die auf diese Weise expandierten Gelklumpen können nun das einzuhüllende Material besser bedecken, das heißt, das feste,einzuhüllende Material ragt nicht durch die Oberfläche der Gelklumpen heraus. Festes,einzuhüllendes Material, das sich an die Außenseite des Gels angeheftet hat, wird durch das Waschen mit Natriumchloridlösung entfernt. Auf diese Weise wird nur einzuhüllendes Material, das sich im Inneren des Gels befindet, eingekapselt.

Die Waschvorgänge mit der Natriumchloridlösung fördern auch die Ausbildung einheitlicherer Kapselmembranen, da sie die Menge an (alciumionen, die die Alginatstruktur der Gelklumpen vernetzen, ausgleichen. Die Gelklumpen bilden sich nicht alle gleichzeitig; die Tropfen, die zuerst in das Calciumbad fallen, verbringen dort eine längere Zeit und nehmen mehr Calciumionen in die Gelstruktur auf als die Tropfen, die erst später mit den Calciumionen in Berührung kommen. Das Waschen mit Natriumchloridlösung entfernt mehr Calciumionen von den dichteren Klumpen, das heißt den zuerst gelierten Tropfen, als von den weniger dichten.,wodurch der Calciumgehalt der Gelklumpen ausgeglichen wird.

Um expandierte Gelklumpen gebildete Membranen zerreißen weniger leicht, wenn sie den durch die Wiederverflüssigung verursachten Belastungen ausgesetzt sind. Es scheint, daß das expandierte Strukturnetz elastischer ist und dadurch die durch die Wiederverflüssigung verursachte Belastung besser ausgleichen kann.

"Ij"

Die Membran um die expandierten Gelklumpen wird durch Umsetzen der Anionen des expandierten, gelierten, polyanionischen Polymers und der Kationen eines polykationischen Polymers, wie Polylysin, gebildet. Das polykationische Polymer kann ein so geringes Molekulargewicht wie 3.000 Dalton haben, Polylysin mit einem Molekulargewicht von 35.000 Dalton oder höher molekulare Verbindungen werden jedoch bevorzugt. Nach dem Aufbringen der Membran um die expandierten Gelklumpen werden weitere Stufen zur Feineinstellung der Membranporosität angewendet. So können beispielsweise die Poren der Membran durch mehrmaliges Waschen in einer Natriumchloridlösung ausgedehnt werden, wogegen sie sich durch mehrmaliges Waschen in einer CaI ciumchloridlösung zusammenziehen. Außerdem kann eine zweite Membran um die Kapseln unter Verwendung eines weiteren polykationischen Polymers gebildet werden, beispielsweise durch Inberührungbringen mit einer Polyornithinlösung oder mit einem Polymer mit einer höheren Ladungsdichte, wie Polyv inylamin. Diese Maßnahme kann zur Verkleinerung der Poren dienen.

Wie in der US-PS 4 352 883 beschrieben, wird der intrakapsuläre Raum vorzugsweise durch Immersion der Kapseln in eine Lösung eines Chelatbildners wieder verflüssigt. Che latbildner, die mit Erfolg verwendet worden sind, sind Ethylendiamin-tetraessigsäure (EDTA), Natriumeitrat, Natriumsuccinat und insbesondere Ethylenglycol-bis-(2-aminoethyl)-N,N,N^f,N'-tetraessigsäure (EGTA). Wird Natriumeitrat als Chelatbildner verwendet, so können Löcher in der Kapselmembran entstehen, da die Membran als Reaktion auf den Druck des Citrats eine unregelmäßige Form annimmt. Die Membran kehrt zwar zu ihrer ursprünglichen Form zurück, wenn das Citrat mit dem intrakapsulären Raum annähernd im Gleichgewicht ist,' ist jedoch das einzuhüllende Material eine gegenüber Citrat empfindliche lebende Zelle, so kann das Zellwachstum und die Fähigkeit der Zellen, biologisches Material zu produzieren, beeinträchtigt sein. Im Gegensatz dazu scheint sich die Membran nach innen zu falten, wenn die Kapsel

in eine EGTA-Lösung eingetaucht wird und bleibt in diesem Zustand, bis das EGTA entfernt wird. Es scheint, daß im Vergleich zu Citrat oder anderen untersuchten Chelatbildnern die Zellen in EGTA-behandelten Kapseln besser wachsen und metabolisch aktiver sind (vergl. auch Beispiel 4).

Wie in der US-PS 4 352 883 beschrieben, unterbindet das Nachbeschichten der Kapseln mit einer Lösung eines polyanionischen Polymers, beispielsweise Natriuma^ginat, die Neigung der Kapseln zu verklumpen. Das anionische Polymer reagiert mit den restlichen Kationen der Membran, wodurch eine negative Oberflächenpolarität entsteht. Es ist bekannt,daß negative Oberflächen das Wachstum und die Bindung der Zellen, auch das intrakapsuläre Zellwachstum hemmen und die Permeabilität beeinträchtigen können. Durch Eintauchen der Kapsel in ein Neutralisationsmittel, wie 2-N-Cyclohexylaminoethan-sulfonsäure (CHES) oder einen anderen Zwitterionpuffer können diese Nachteile beseitigt und die Kapselmembran verbessert werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1

Zur Herstellung von Kapseln, die für Moleküle mit einem Gewicht über etwa 150.000 Dalton undurchlässig sind, wird ein Hybridom, das IgG (Molekulargewicht etwa 160.000 Dalton) produziert, verwendet.

Etwa 2,1 1 einer Suspension, die etwa 2,2 χ 10 ZöJllen/ml in 11 (g/100 ml Lösung) Natriumalginat (NaG-Kelco LV) enthält, werden in eine wie oben beschriebene Spritzkopfvorrichtung übergeführt. Durch Durchdrücken der Suspension durch 16 geeichte 22-Nadeln mit einer Geschwindigkeit von etwa 50 ml/min werden Tropfen gebildet, die etwa 3 cm in 5 1 einer 1,2 !igen C al ciumchloridlösung fallen. Die gebildeten Gelklumpen werden durch Absaugen gesammelt und zur Gelexpansion

in eine 1O-1-Flasche, die etwa 5 1 isotone Natriumchloridlösung enthält, übergeführt. Die Natriumchloridlösung wird entfernt und zweimal wieder aufgefüllt. Insgesamt dauert die Expansion in der Salzlösung etwa 11 min. Dann wird um die Gelklumpen eine Membran gebildet durch Inberührungbringen mit 5 1 einer 850 mg/1 Poly-l-lysin(Sigma Chemical Company, mit einem Molekulargewicht von 65.000 Dalton) enthaltenden isotonen Natriumchloridlösung. Nach 12 min Reaktionszeit werden die entstandenen Kapseln 10 min mit 5 1 einer 1,4 g/l CHES-Puffer (Sigma) und 0,21 Calciumchlorid enthaltenden Natriumchloridlösung gewaschen. Die Kapseln werden etwa 8 min lang mit 5 1 einer 0,31 Calciumchlorid enthaltenden Natriumchloridlösung gewaschen. Eine zweite Membran wird um die Kapsel gebildet durch lOminütige Reaktion in 5 1 einer 150 mg/1 Polyv inylamin (Polyscience, mit einem Molekulargewicht von 50.000 - 150.000 Dalton) enthaltenden Natriumchloridlösung. Die Kapseln werden zweimal im Verlauf von 7 min mit je 5 1 isotoner Natriumchloridlösung gewaschen und durch 7 min langes Eintauchen in 5 1 einer 5x10 % Natriumalginat enthaltenden Natriumchloridlösung nachbeschichtet. Die Kapseln werden weitere 4 min in 5 1 Natriumchloridlösung gewaschen, dann wird der intrakapsuläre Raum durch zweimaliges Eintauchen in je 5 1 55mM (mMol/1) Natriumeitrat in Natriumchloridlösung wieder verflüssigt, und zwar das erste Mal 10 min lang und das zweite mal 6 min lang. Wie in Beispiel 4 angegeben ist, würde die Verwendung einer EGTA-Lösung anstelle der Natriumcitratlösung die Antikörperausbeute verbessern. Die Kapseln werden zweimal in 5 1 Natriumchloridlösung und einmal 4 min in RPMI-Medium gewaschen. Die Kapseln werden dann in Wachstumsmedium, das heißt RPMI und 10S embryonales Kälberserum, zur Züchtung der Zellen eingebracht. IgG sammelt sich innerhalb der Kapseln, es können nur Spuren im extrakapsulären Medium nachgewiesen werden. Die in diesen Verfahren hergestellten Kapseln sind für IgG praktisch undurchlässig, gestatten aber den freien Durchgang von benötigten Nährstoffen für das Zellwachstum und die Antikörperproduktion im intrakapsulären Raum.

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Beispiel 2

Zur Herstellung von Kapseln, die für IgG (mit einem Molekulargewicht von etwa 160.000 Dalton) durchlässig, jedoch für IgM (mit einem Molekulargewicht von 900.000 Dalton) undurchlässig sind, werden menschliche Hybridome 77 vom National Institute of Health, die Human-IgM produzieren und absondern, verwendet.

400 ml einer Lösung, die 1 χ 10 Zellen/ijil in 1ξ Natriumalginat enthält, werden unter Verwendung eines Bündels von 8 geeichten 22-Nadeln in einer wie oben beschriebenen Spritzkopfvorrichtung in Tropfen ausgebildet. Die Einspeisgeschwindigkeit beträgt etwa 30 ml/min und der Abstand von der Nadelspitze zu der Gelierlösung, nämlich 1 1 einer 1,2ligen calciumchloridlösung, etwa 3' cm. Die Gelklumpen werden 3mal mit je 1 1 isotoner Natriumchloridlösung im Verlauf von 8 min gewaschen und dann 10 min in 1 1 einer 750 mg/ml Poly-L-lysiniösung (Sigma, mit einem Molekulargewicht von 65.000 Dalton) zur Herstellung einer dauerhaften Membran eingetaucht. Die entstandenen Kapseln werden 5 min in 1 1 einer 1,4 g/l CHES-Lösung und 0,21 Calciumchlorid enthaltenden Natriumchloridlösung, dann 5 min mit 1 1 0,31 Calciumschlorid enthaltenden Natriumchloridlösung gewaschen. Die Kapseln werden 4 min lang mit 1 1 Natriumchloridlösung expandiert, dann während 7 min in 1 3x10 % Natriumalginat in Natriumchloridlösung nachbeschichtet. Die nachbeschichteten Kapseln werden 5 miu in 1 1 Natriumchloridlösung gewaschen, dann wird der intrakapsuläre Raum durch zwei 6 min dauernde Immersionen in je 1 1 55mM Natriumcitrat in einer Natriumchloridlösung wieder verflüssigt. Das Citrat wird durch zweimaliges Waschen mit je 1 1 Natriumchloridlösung entfernt; die entstandenen Kapseln werden 5 min in RPMI-Medium gewaschen^ dann in 1 1 Medium (RMPI, das mit 20& embryonales Kälberserum und Antibiotika versetzt wurde) suspendiert und die Zellen darin wachsen gelassen. Das extrakapsuläre Medium wurde untersucht : es enthält kein IgM, was darauf hinweist, daß die Kapseln

praktisch undurchlässig für Moleküle mit einem Molekulargewicht von 900.000 Dalton sind.

Beispiel 3

Es werden Kapseln gebildet, die für IgM (Molekulargewicht: etwa 900.000 Dalton) durchlässig, jedoch für Zellen undurchlässig sind. 200 ml einer Iligen Natriumalginatlösung (NaG-Kelco LV) und die Hybridomzellen des Beispiels 2 werden in Tropfen unter Verwendung von 5 geeichten 26-Nadeln in der oben beschriebenen Spritzkopfvorrichtung ausgebildet. Die entstandenen Tropfen fallen etwa 2,5 cm mit einer Geschwindigkeit von 9,5 ml/min in die Gelierlösung, nämlich 1 1 1 ,2$iges CaI ciumchlorid. Die entstandenen Gelklumpen werden durch 3maliges Eintauchen in je 0,5 1 Natriumchloridlösung expandiert. Durch lOminütiges Umsetzen mit 0,5 1 einer 1 g/l Poly-L-l,ysin enthaltenden Lösung (Sigma, mittleres Molekulargewicht von etwa 260.000 Dalton) wird eine dauerhafte Membran gebildet. Die Kapseln werden 5 min in 0,5 1 einer 1,4 g/l CHES-Natriumchloridlösung, die 0,61 Calciumchlorid enthält, und weitere 5 min in 0,5 1 0,81 Calciumchlorid in einer Natriumchloridlösung gewaschen. Die Kapseln werden dann einmal in 0,5 1 Natriumchloridlösung gewaschen und mit 0,5 1 0,031 Natriumalginat nachbeschichtet. Die nachbeschichteten Kapseln werden 5 min in 0,5 1 Natriumchloridlösung gewaschen, dann wird der intrakapsuläre Raum durch zwei 5 min dauernde Waschvorgänge in 0,5 1 55 mM Natriumeitrat wieder verflüssigt. Die Kapseln werden einmal in Natriumchloridlösung und einmal in Grundmedium gewaschen und im Grundmedium, das 20 % embryonales Kälberserum und Antibiotika enthält, suspendiert. IgM geht durch die Kapselmembran durch, Zellen werden jedoch zurückgehalten, was darauf hinweist, daß die Membran für Moleküle mit einem Gewicht von mindestens 900.000 Dalton durchlässig, für Zellen jedoch undurchlässig ist.

Beispiel 4

Dieses Beispiel zeigt, daß die metabolische Aktivität von eingekapselten Zellen durch geeignete Wahl des Chelatbildners, der zur Wiederverflüssigung des intrakapsulären Raumes verwendet wird, beträchtlich erhöht werden kann. Es werden vier verschiedene Chelatbildner getestet: EDTA, EGTA, Natriumeitrat und Natriumsuccinat, wobei als Testsystem eingekapselte IgG-produzierende Li8-Hybridome verwendet werden. Die Kapseln werden gemäß Beispiel 1 hergestellt, mit dem Unterschied, daß das in Beispiel 1 verwendete Natriumeitrat durch die in der Tabelle 1 angegebenen Konzentrationen anChelatbildnern ersetzt wird.

Tabelle 1

Chelat- Konz., Gesamtzellzahl bildner mM am (Tag)

Kulturdauer Kulturende, Tage ^g/ml (Tag)

EDTA
EGTA

Citrat

EGTA

Succinat

EGTA
EGTA
EGTA

55 1,0x106(6) 55 4,3xlO⁷(17)

55 2_r3xl0⁷(16) 55 3.5xlO⁷(16) 55 2,3xlO⁷(16)

55 3,6xlO⁷(19) 36 4_flxl0⁷(19) 28 3_f7xl0⁷(19)

28 9,3xlO⁷(27) 5_f3xl0⁷(20)

28 6,0xl0⁷(27) 4,lxl0⁷(20)

14 7_f3xl0⁷(27) 5,4xlO⁷(2O)

0 1026

366 741

939 892 734

659

578(20)

693 '

590(20)

887

780(20)

Tabelle 1 zeigt, daß das EGTA der beste Chelatbildner für das Zellwachstum ist und im Vergleich zu Citrat zu einer etwa um den Faktor 2 verbesserten Antikörperproduktion führt.

Tabelle 1 faßt auch Versuche zur Bestimmung der optimalen EGTA-Konzentration für die Wiederverflüssigung und die Antikörperproduktion zusammen. Daraus ist ersichtlich, daß EGTA-Konzentrationen von 36 mM und 55mM etwa gleich gut die Antikörperproduktion beschleunigen, wogegen niedrige EGTA-Konzentrationen zu niedrigeren Antikörperausbeuten führen, obwohl das Zellwachstum praktisch identisch ist.

Beispiel 5

Dieses Beispiel zeigt die Wirkung verschiedener Waschvorgänge mit Natriumchloridlösung zur Expansion der Gelklumpen vor der Membranbildung. Die Kapseln werden gemäß Beispiel 1 hergestellt mit dem Unterschied, daß die Anzahl der Waschvorgänge mit Natriumchloridlösung, die vor der Membranausbildung durchgeführt werden, geändert wird . Nach der Kapselbildung werden die eingekapselten Hybridome 20 Tage im Kulturmedium gezüchtet, dann werden die Gesamtzellzahl und die intrakapsuläre Antikörperkonzentration gemessen. Tabelle 2 faßt die Ergebnisse zusammen:

	Anzahl der Vorgänge	Tabelle	2	Gesamt zellzahl	Intrakaps. Antikörperkonz Mg/ml
Versuch		Wasch-	Kulturdauer Tage	4.3xlO⁷	360
441A	1		20	5;0xl0⁷	560
441B	2		20	7_;2xl0⁷	702
441C	3		20	6,5xlO⁷	717
441C		20

Wie aus Tabelle 2 ersichtlich, werden durch zwei oder dreimaliges Waschen mit Natriumchloridlösung die höchsten Zellzahlen und die höchsten intrakapsulären Antikörperkonzentrationen

erhalten. Das heißt insbesondere, daß nach dreimaligem Waschen mit Natriumchloridlösung vor der Membranbildung die Kultur um etwa 501 mehr Zellen und fast doppelt soviel Antikörper in der Kapsel bildet, wie eine Kultur, die nicht mit Natriumchlorid gewaschen wurde. Dieser Versuch zeigt, daß das Waschen mit Natriumchloridlösung vor der Membranbildung die Kapsel verbessert,so daß die eingekapselten Hybridome gesünder sind und mehr Antikörper bilden.

Mit den vorstehenden Angaben ist der Fachmann in der Lage, spezielle Verfahren zur Einkapselung durchzuführen, mit denen er beständig einheitliche Kapselmembranen mit Permeabilitätseigenschaften erhalten kann, die auf spezielle Zwecke unter Verwendung empirischer Verfahren zugeschnitten sind. Das heißt, durch geeigneten Einsatz der hier beschriebenen Parameter für die Einkapselung kann der Fachmann Kapseln herstellen, die den freien Transport durch die Membran von Molekülen bis zu einem gestimmten Molekulargewicht gewährleistet, den Transport von Molekülen in einem Bereich über diesem Wert behindert und den Durchgang von Molekülen mit einem Gewicht und einer entsprechenden effektiven Größe über diesen Bereich verhindert. Ist das Verfahren einmal entwickelt, so kann es für die Herstellung der gewünschten Anzahl von Kapseln für den beabsichtigten Zweck dienen.

Bei der Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung von Kapseln mit einem spezifischen Permeabilitätsverhalten, sollten die folgenden Richtlinien beachtet werden. Die Stufe der Gelexpansion verbessert die Einheitlichkeit der Kapselmembran und erhöht die Wirkung von Maßnahmen zur Porositätskontrolle. Steigende Ladungsdichten der die Membran bildenden polykationischen Polymere führt im allgemeinen zu kleineren Poren. Ein höheres Molekulargewicht des polykationischen Polymers verursacht im allgemeinen größere Poren und dünnere Membranen. Eine längere Berührungsdauer des polykationischen

Polymers mit den Gelklumpen gibt eine dickere, weniger durchlässige Membran. Das Aufbringen eines zweiten polykationischen Polymers über das erste Polymer vermindert die Porengröße. Die Expansion des Gels durch Hydratation nach der Membranbildung erhöht die Porosität, eine Kontraktion vermindert die Porosität. Sollen die Kapseln für eine Implantation verwendet werden, so ist eine Nafchbeschichtung mit einem poly an ionischen Polymer wünschenswert,· physiologisch unverträgliche, Membranbildende Materialien, die Entzündung oder fibroplastische Oberwucherung verursachen, sollten jedoch vermieden werden. Sind die Kapsel zur Kultivierung von Zellen bestimmt, so ist eine Wiederverflüssigung wünschenswert , die am besten mit EGTA durchgeführt wird.

Claims

Ansprüche

Verfahren zur Einkapselung eines einzuhüllenden Materials in eine semipermeable Membran,
gekennzeichnet durch

(A) Gelieren eines wasserlöslichen polyanionischen, ein einzuhüllendes Material enthaltenden Polymers mit einer wäßrigen, mehrwertige Kationen enthaltenden Lösung zu einzelnen, hydratisierten, formbeständigen Gelklumpen,

(B) Expandieren der Gelklumpen mit einer wäßrigen Lösung, die einen Teil der mehrwertigen Kationen entfernt und die Gelklumpen weiter hydratisiert,

(C) Ausbilden einer Membran um die expandierten Gelklumpen zu Kapseln durch Umsetzung der Anionen des polyanionischen Polymers und der Kationen eines polykationischen Polymers mit einem Molekulargewicht von über 3.000 Dalton.
2. Verfahren nach Anspruch 1,

gekennzeichnet durch die zusätzliche Stufe des Nachbeschichtens der in Stufe

C" gebildeten Membran mit einem wasserlöslichen polyanioschen Polymer durch Umsetzung der restlichen Kationen der Membran.

0192-DBH-452/K/A1
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch die zusätzliche Stufe der Wiederverflüssigung der Gelklumpen nach der Membranbildung.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch das Inberührungbringen der Kapseln mit einem Chelatbildner zur Wiederverflüssigung.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch die Verwendung von Ethylenglycol-bis-(2-aminoethyl)-N,N, N', N'-tetraessigsäure oder eines ihrer Salze als Chelatbildner.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet durch die zusätzliche Stufe des Ausbildens einer zweiten Membran, um die in Stufe C gebildete Membran durch Umsetzung mit einem zweiten polykationischen Polymer.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch die zusätzliche Stufe des Nachbeschichtens der zweiten Membran mit einem wasserlöslichen polyanionischen Polymer durch Umsetzung der restlichen Kationen mindestens eines der polykationischen Polymere.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, gekennzeichnet durch die zusätzliche Stufe der Wiederverflüssigung der Gelklumpen nach der Membranbildung.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet durch das Inberührungbringen der Kapseln mit einemChelatbildner zur Wiederverflüssigung.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet durch die Verwendung von Ethylenglycol-bis-(2-aminoethyl)-N,N,N',N'-tetraessigsäure oder eines ihrer Salze als Chelatbildner.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, gekennzeichnet durch die Verwendung von sauren Polysacchariden als polyanionische Polymere.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, / gekennzeichnet durch \ die Verwendung eines Alginatsalzes als saures Polysaccharid,
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, gekennzeichnet durch die Verwendung von Proteinen oder Polypeptiden mit mehreren aktiven, Stickstoff enthaltenden, kationischen Gruppen, Polyvinylaminen, Polyethylenaminen und/oder Aminogruppen enthaltenden Polysacchariden und/oder ihren Salzen als polykationisches Polymer.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, gekennzeichnet durch die Verwendung von Polylysin, Polyglutamin und/oder PoIyornithin als polykationisches Polymer.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, gekennzeichnet durch die Verwendung einer wäßrigen, einwertige.Kationen enthaltende Lösung in Stufe B. . *

• Ulli
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, gekennzeichnet durch die Verwendung von Natriumchloridlösung in Stufe B.
17. Kapseln, hergestellt in dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16.