CH665137A5

CH665137A5 - Verfahren zum einkapseln eines kernmaterials.

Info

Publication number: CH665137A5
Application number: CH642/85A
Authority: CH
Inventors: Wen-Ghih Tsang; Ann W Shyr
Original assignee: Damon Biotech Inc
Priority date: 1984-02-13
Filing date: 1985-02-12
Publication date: 1988-04-29
Also published as: BE901704A; IT8567142A0; GB2153780B; NO850535L; IT1184885B; JPH0150454B2; JPS60190229A; DE3504724C2; AU572609B2; DE3504724A1; DK65285D0; FR2559502A1; GB8503247D0; GB2153780A; SE8500623L; AU3857285A; NL8500352A; US4663286A; SE8500623D0; CA1238273A

Description

BESCHREIBUNG Die Erfindung betrifft allgemein die Einkapselung von Kernmaterialien einschliesslich lebensfähiger Zellen in ein durch eine semipermeable Membran begrenztes intrakapsu-25 lares Volumen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung grosser Mengen von Kapseln mit gleichmässigen Membranen mit verbesserter Porositätsregelung, wodurch das Zellwachstum innerhalb der Kapseln begünstigt werden kann.

30 In der auf Dr. Franklin Lim basierenden am 5. Oktober 1982 erteilten US-PS 4 352 883 wird ein grundlegendes Verfahren zur Einkapselung von Kernmaterialien einschliesslich lebensfähiger Zellen in Kapseln mit semipermeablen Membranen beschrieben. Nach dem Lim-Verfahren eingekapselte 35 lebensfähige Zellen sind zur Fortsetzung des Stoffwechsels einschliesslich der Mitose befähigt und scheiden Materialien ab, die sie normalerweise in ihrer nichteingekapselten Form abscheiden würden. Nach der Lim-Technik hergestellte Kapseln können so ausgebildet werden, dass sie Membranen 40 aufweisen, die für Moleküle unterhalb eines bestimmten Molekulargewichts durchlässig sind, jedoch im wesentlichen undurchlässig für Moleküle von höherem Molekulargewicht und Zellen sind. Man nimmt an, dass die Poren der Membranen gewundene Bahnen aufweisen, die durch die Zwi-45 schenräume der Membranstruktur begrenzt werden. Der Durchgang von Molekülen oberhalb eines bestimmten Molekulargewichts wird durch diese Poren mit gewundenen Bahnen behindert, und oberhalb eines bestimmten höheren Molekulargewichts und entsprechend wirksamer Moleküldi-50 mension ist die Behinderung ausreichend gross, so dass die Membran für diese Moleküle praktisch undurchlässig ist.

Die Porositätsregelung ist ein wichtiger Faktor bei einer Reihe von wichtigen Verwendungen derartiger Mikrokap-seln. Die Mikrokapselmembran kann zum Differentialsieben 55 verwendet werden, d.h. zur Abtrennung von Molekülen auf einer Molekulargewichtsbasis. Beispielsweise wird in der am 11. Oktober 1983 erteilten US-PS 4 409 331 ein Verfahren angegeben, in dem durch Zellen in der Kapsel abgeschiedene Substanzen die Membran durchqueren können, während an-60 dere Materialien von höherem Molekulargewicht innerhalb der Kapseln eingeschlossen sind. Derartige Kapseln können das Sammeln einer interessierenden Substanz erheblich vereinfachen. Interessierende Substanzen von niedrigem Molekulargewicht können durch die Membran in das extrakapsu-65 lare Medium diffundieren, während Zellbruchstücke und Substanzen von höherem Molekulargewicht und Verunreinigungen, beispielsweise Pyrogene, in dem intrakapsularen Volumen eingeschlossen sind.

Die selektiven Siebeigenschaften der Kapselmembran ermöglichen auch, dass die Kapseln für das Kreuzungsstamm-in-vivo-Wachstum von Hybridomen vérwendet werden. Die Kapselmembran ermöglicht es, dass Kreuzungsstammhybri-dome innerhalb einer Körperhöhle eines Lebewesens wachsen, dessen Immunsystem normalerweise die Hybridome angreifen würden. Eine scharfsinnige Manipulation der Eigenschaften der Membranpermeabilität ermöglicht eine hochspezifische Sammlung der abgeschiedenen Substanz.

Die effektive Membranpermeabilitätsregelung ermöglicht auch die Verwendung von implantierten Kapseln, die Zellen enthalten, welche ein Antigen als ein Immunisierungsmittel abscheiden. Die Siebeigenschaften der Membran erzeugen relativ reines Antigen als Immunisierungsmittel ohne die Notwendigkeit eines langwierigen Antikörper-Reini-gungsverfahrens und können zur Stimulierung spezifischer Antikörperbildung führen.

Kapseln mit derartigen Membranen können auch als Teil eines Zellsiebverfahrens verwendet werden. Extrakapsuläres Medium wird auf eine durch die Membran abgeschiedene Substanz getestet. Verunreinigungen mit einem höheren Molekulargewicht als die Substanz werden in der Kapsel gehalten, wodurch falsche positive Ergebnisse verringert werden.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Lim-Einkapse-lungstechnik umfasst die Bildung von die Form beibehaltenden gelierten Massen, die das einzukapselnde Material enthalten, wonach sich die Abscheidung einer Membran auf die Oberfläche der gelierten Massen anschliesst. Die Membran bildet sich, wenn relativ hochmolekulare Materialien die Gelmassen berühren und bildet ionische Vernetzungen mit dem Gel. Lim beschreibt, dass Vernetzungspolymere mit niedrigerem Molekulargewicht weiter in die Struktur der gelierten Massen eindringen und eine Herabsetzung der Poren-grösse herbeiführen. Lim gibt auch an, dass die Dauer der Membranausbildung die Porengrösse beeinflusst. Bei einem gegebenen Paar von Reaktionsmitteln gilt, je länger die poly-mere Vernetzungslösung der gelierten Masse ausgesetzt ist, umso dicker und weniger durchlässig ist die Membran.

Während auf Grund der im Patent von Lim angegebenen Techniken zur Porositätsregelung und Membranbildung annehmbare Membranen hergestellt werden können, könnten viele der vorstehend angegebenen Anwendungen der Kapseltechnologie verbessert werden, wenn Membranen mit verbesserter Porositätsregelung und besserer Gleichmässigkeit hergestellt werden könnten. Die Porositätsregelungstechniken nach Lim ermöglichen keine feine Abstimmung der Membranporosität, sondern setzen eher grobe Differentialfiltergrenzen.

Zusätzlich zu der verbesserten Porosität ist es für technische Zwecke auch wichtig, in der Lage zu sein, beständige Mikrokapseln in grosser Anzahl mit fehlerfreien Membranen zu erzeugen. In dieser Hinsicht haben nach den Lim-Techniken gebildete Membranen gelegentlich vorstehende Zellteile oder haben Zellen, die auf den Kapseln festhaften. Die Lim-Techniken können auch Hohlräume enthaltende Kapseln erzeugen, wodurch es möglich ist, dass Zellen, die interessierende Substanz oder unerwünschte Verunreinigungen aus der Kapsel entweichen. Wenn ein gewisser kleiner Anteil der im Hinblick auf einen spezifischen Zweck hergestellten Mikrokapseln Membranlücken oder -hohlräume aufweisen, würden viele Ziele und Vorteile der Verfahren zunichte gemacht. Folglich sind Modifikationen der Einkapse-lungsverfahren, welche die Gleichmässigkeit der Membran fördern und beliebige Membranfehler vermeiden, für die wirtschaftliche Durchführung vieler der vorstehend angegebenen Verfahren vorteilhaft.

Somit besteht eine Aufgabe der Erfindung in der verbesserten Porositätsregelung von Mikrokapselmembranen. Eine

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andere Aufgabe besteht darin, eine gleichmässigere Membranbildung zu fördern. Eine weitere Aufgabe besteht in der Entwicklung eines Verfahrens, das die Ausbildung von Membranen ermöglicht, welche das Zellwachstum und die 5 Abscheidung von durch die Zellen erzeugten Substanzen optimieren. Eine andere Aufgabe der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Herstellung permeabler Kapselmembranen mit genaueren Permeabilitätsgrenzen und zur reproduzierbaren Errichtung derartiger Grenzen. Andere Aufgaben io und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung.

Die Erfindung stellt eine Verbesserung der Lim-Technik zur Einkapselung eines Kernmaterials in ein durch eine Membran begrenztes intrakapsulares Volumen dar. Die ls Durchführung der Erfindung kann verbesserte Membran-gleichmässigkeit und Porositätsregelung herbeiführen und kann die Kapseln für die Zellzüchtung geeigneter machen.

Wie im Patent von Lim angegeben, wird das Kernmaterial in einer Lösung eines wasserlöslichen polyanionischen 20 Polymeren, das zur Gelierung befähigt ist, suspendiert, und die Suspension aus Polymerem und Kernmaterial wird zu Tröpfchen oder anderen diskreten Formen ausgebildet. Die Tröpfchen werden dann unmittelbar einer Lösung mehrwertiger Kationen ausgesetzt, um weiche, die Form beibehalten-25 de hydratisierte gelierte Massen zu bilden. Gemäss der Erfindung werden die gelierten Massen für die nachfolgend aufgeführten Zwecke zunächst expandiert und weiter durch Kontakt mit einer wässrigen Lösung hydratisiert, die einen Teil der mehrwertigen Kationen, z.B. Salzlösung, entfernt. Da-30 nach bildet sich um jede der expandierten gelierten Massen-durch Reaktion zwischen anionischen Gruppen an dem polyanionischen polymeren Hydrogel und den kationischen Gruppen an einem polykationischen Polymeren mit einem Molekulargewicht von vorzugsweise über etwa 3000 u eine 35 Membran. Die bevorzugten polyanionischen Polymeren sind saure Polysaccharide, am stärksten bevorzugt Alginatsalze. Zu geeigneten polykationischen Vernetzungspolymeren gehören Proteine und Polypeptide mit mehrfachen reaktiven stickstoffhaltigen kationischen Gruppen, z. B. primäre Ami-40 ne, Polyvinylamine, aminierte Polysaccharide, deren wasserlösliche Salze und deren Gemische. Das derzeit bevorzugte polykationische Polymere ist Polylysin. Polyglutamin und Polyornithin können gleichfalls zufriedenstellend arbeiten. Eine zweite Membranschicht kann über die erste durch Um-45 setzung mit einem anderen polykationischen Polymeren ausgebildet werden. Irgendeines der angegebenen kationischen Materialien kann zur Bildung der zweiten Membran verwendet werden. Die Identität des Reaktionsmittels und des Molekulargewichts des oder der verwendeten polykationischen so Polymeren werden ausgewählt, um die Porositätseigenschaften der Kapseln zu bestimmen. Es wurde auch festgestellt, dass die Ladungsdichte der verwendeten polykationischen Polymeren eine erhebliche Wirkung auf die Porositätsregelung ausüben kann.

55 Das Kernmaterial kann aus lebensfähigen Zellen bestehen, wie beispielsweise genetisch modifizierten Zellen, z. B. Hybridome, eukaryotische Zellen, einschliesslich tierischen Gewebezellen, oder prokaryotischen Zellen. Das Verfahren kann auch die Stufe des Nachüberziehens der Membran mit 60 einem wasserlöslichen polyanionischen Polymeren, z. B. Al-ginat, das mit restlichen kationischen Stellen auf der Membran reagiert, enthalten. Die gelierten Massen können nach der Membranbildung durch Umsetzung mit einem Chelatbildner wieder verflüssigt werden. Ethylenglykol-bis-(ß-65 aminoethylether)-N,N-tetraessigsäure und deren Salze (EGTA) sind die Chelatbildner der Wahl, wenn die Kapseln zur Verwendung in sich vermehrenden Zellen bestimmt sind. In dieser Hinsicht wurde festgestellt, dass die Wiederverflüs-

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sigung mit EGTA die Wirkung hat, die Zellproduktion von biologischen Materialien mit den Kapseln im Vergleich mit anderen Chelaten, wie beispielsweise EDTA oder Citrat, erheblich zu erhöhen.

Die richtige Auswahl der Reaktionsteilnehmer und Reaktionsbedingungen ermöglicht die Bildung von Membranen mit relativ spezifischer Permeabilität. Beispielsweise können Membranen so ausgebildet sein, dass sie gegenüber Molekülen mit einem Molekulargewicht von über etwa 150 000 u im wesentlichen undurchlässig sind und somit praktisch undurchlässig für alle üblichen Immunglobuline. Die Membranen können durchlässig für Moleküle mit einem Molekulargewicht von bis zu etwa 500 000 u sein, während der Durchgang von Materialien mit höherem Molekulargewicht ausgeschlossen ist. Derartige Kapseln erlauben das Entweichen von IgG, während IgM beibehalten wird. Alternativ können die Membranen so ausgebildet sein, dass sie durchlässig für Moleküle mit einem Gewicht von mehr als 500 000 u sind, jedoch praktisch undurchlässig für Zellen.

Wenn beispielsweise ein bei oder unterhalb 150 000 u abgeschnittenes Molekulargewicht gesucht wird, kann eine zweite Membran um die Kapseln mit einem polykationischen Polymeren der gleichen oder vorzugsweise einer höheren Ladungsdichte als ein erstes polykationisches Polymeres gebildet werden, beispielsweise kann eine Polylysinmembran durch Eintauchen in eine Polyornithin- oder Polyvinylamin-lösung nachbehandelt werden. Wenn die Membran durchlässig für Moleküle von einem grösseren Gewicht als 500 000 u sein soll, kann ein Vernetzungspolymeres mit hohem Molekulargewicht, wie beispielsweise Polylysin, mit einem Molekulargewicht von mehr als 200 000 u verwendet werden. Die erfmdungsgemässe Durchführung der Gelexpansionsstufe verbessert die Gleichmässigkeit der Kapselmembran erheblich und erhöht die Wirksamkeit der Porositätsregeltechniken.

Wie vorstehend angegeben, gestattet die vorliegende Erfindung verbesserte Regelung der Membranporosität und fördert die Bildung gleichmässigerer Membranen. Die Erfindung beruht teilweise auf der Beobachtung, dass gelierte Massen, die polyanionische Polymere, wie beispielsweise Al-ginat, umfassen, durch Änderung des Hydratationsausmas-ses des Polymeren expandiert oder kontrahiert werden können. Die Gelmassen enthalten mehr als 98% Wasser und sind im wesentlichen weiche, die Form beibehaltende Kugeln. mit einem vernetzten Gelgitter. Es wurde festgestellt, dass das Expandieren der Gelmassen nach dem Gelieren und vor der Membranabscheidung einem ermöglicht, die Permeabilitätseigenschaften und die Gleichmässigkeit der Membranen besser zu regeln. Durch ein- oder mehrmaliges Eintauchen der gelierten Masse in eine Lösung einwertiger Kationen. z.B. Kochsalzlösung (Salinelösung), wird ein Teil der mehrwertigen Vernetzungskationen aus dem Gel entfernt, und der Hydratationszustand wird erhöht, wodurch das Gelgitter expandiert wird. Diese Behandlung führt zur Bildung gleichmässig hydratisierter Gelmassen, die für die nachfolgende Membranabscheidungsstufe gut geeignet sind. Ohne diese Behandlung variieren die Gelmassen hinsichtlich der Grösse und Eigenschaften, weil die zuerst gebildeten Massen in die Gelierlösung länger eingetaucht worden sind als die zuletzt gebildeten Massen. Eine andere wichtige Beobachtung besteht darin, dass durch Einstellung des Gleichgewichts der gelierten Masse mit einer mehrwertige Kationen " enthaltenden Lösung, wie beispielsweise einer Calciumchlo-ridlösung. die gelierte Masse kontrahiert wird. Ein weiteres festgestelltes Phänomen besteht darin, dass, wenn eine Membran um eine gelierte Mass einmal gebildet worden ist, durch Eintauchen der Kapsel in eine Lösung einwertiger Kationen, die Membran gestreckt wird, wodurch die Porengrösse erhöht wird. Diese Phänomene, verbunden mit der Beobachtung, dass Vernetzer höherer Ladungsdichte leicht die Po-

rengrösse verringern, macht es möglich, die Membranpermeabilität genauer zu regeln. Wenn diese Beobachtungen 5 mit den in dem vorstehend erwähnten Patent von Lim angegebenen Permeabilitätsregeltechniken verbunden werden, ergibt sich dem Fachmann eine Reihe von Parametern, welche die Bildung gleichmässiger Kapseln mit beständigen und genaueren Permeabilitätseigenschaften ermöglicht.

io Wie in dem Patent von Lim angegeben, wird das Kernmaterial in einer Lösung suspendiert, die ein wasserlösliches reversibel gelierbares polyanionisches Polymeres, vorzugsweise Natriumalginat, enthält, und die Polymer-ICernmateri-alsuspension wird unter Anwendung üblicher Mittel, bei-15 spielsweise einer Düsenkopfvorrichtung zur Tröpfchenbildung, zu Tröpfchen gebildet. Die Düsenkopfvorrichtung besteht aus einem Gehäuse mit einer oberen Luftansaugdüse und einer in einen Stopfen eingepassten Friktion aus einem länglichen Hohlkörper. Eine Spritze, beispielsweise eine mit 20 einer Stufenpumpe ausgestattete 10 cm3-Spritze, ist auf dem Gehäuse angeordnet, wobei eine Nadel, beispielsweise eine Teflon-überzogene Nadel, mit einem Innendurchmesser von 0,25 mm, (0,01 inch) durch die Länge des Gehäuses hindurchgeht. Das Innere des Gehäuses ist so ausgebildet, dass 25 die Spitze der Nadel einer konstanten laminaren Luftströmung ausgesetzt ist, die als Luftmesser wirkt. Bei Gebrauch wird die mit der Lösung, welche das einzukapselnde Material enthält, gefüllte Spritze auf dem Gehäuse angebracht und die Stufenpumpe wird betätigt, um zunehmend Tröpfchen 30 der Lösung zu der Spitze der Nadel zu drücken. Jeder Tropfen wird von dem Luftstrom «abgeschnitten» und fällt etwa 2,5 bis 3,5 cm in eine Gelierlösung, wo er augenblicklich durch Absorption der Vernetzungsionen geliert. Die bevorzugte Gelierlösung ist eine Lösung von Calciumionen, bei-35 spielsweise l,2%iges (Gew./V) Calciumchlorid. Der Abstand zwischen der Spitze der Nadel und der Calciumchloridlö-sung wird vorzugsweise so angesetzt, dass die Polymer-Kernmateriallösung die physikalisch günstigste Form, eine Kugel (maximales Volumen/Oberflächenbereich) annehmen 40 kann. Luft innerhalb des Rohrs wird durch eine Öffnung in dem Stopfen abgelassen. Die gelierten, die Form beibehaltenden kugelförmigen Massen oder zeitweiligen Kapseln, die vorzugsweise einen Durchmesser zwischen 50 um und wenigen Millimetern aufweisen, sammeln sich in der Lösung als 45 eine getrennte Phase und können durch Ansaugen gewonnen werden.

Gemäss der Erfindung werden die gelierten Massen dann durch ein- oder mehrmaliges getrenntes Eintauchen oder Waschen in einer Lösung einwertiger Kationen, z.B. einer so Salzlösung expandiert. Dieses Eintauchen entfernt einen Teil der Vernetzungscalciumionen und hydratisiert weiter das Gel. Die gelierten Massen dehnen sich somit aus und liefern einen besser deckenden Belag des Kernmaterials, d.h. das Kernmaterial der festen Phase tritt nicht durch die Oberflä-55 che der gelierten Massen hervor. Das Kernmaterial der festen Phase, das auf der Aussenseite des Gels festhaftet, wird durch das Waschen mit Salzlösung entfernt. Daher wird nur Kernmaterial im Innern des Gels eingekapselt.

Die Salzlösung-Waschvorgänge begünstigen auch gleich-6o mässigere Kapselmembranen, indem die Menge der das Al-ginatgitter der Gelmassen vernetzenden Calciumionen ins Gleichgewicht gebracht wird. Die Gelmassen werden nicht alle gleichzeitig gebildet; die Tröpfchen, welche das Calcium-bad in dem Zyklus früh erreichen, verweilen längere Zeit in 65 dem Bad und behalten daher mehr Calciumionen in der Gelstruktur zurück als solche, die spät in den Zyklus eintreten. Die Salzlösung-Waschvorgänge entfernen mehr Calciumionen aus den Massen höherer Dichte (die frühzeitig ge-

Herten Tröpfchen) als aus den Gelmassen mit geringerer Dichte, wodurch der Calciumgehalt der Gelmassen ins Gleichgewicht gebracht wird.

Aus expandierten Gelmassen gebildete Membranen neigen auch weniger zum Zerbrechen auf Grund von Spannungen, die durch Entgelierung verursacht werden. Es scheint, dass das expandierte Gitternetzwerk höhere Elastizität besitzt, wodurch eine bessere Kompensation für die Entgelie-rungsspannung ermöglicht wird.

Dann wird eine Membran um die expandierte gelierte Masse durch Umsetzung zwischen kationischen Gruppen auf dem expandierten, gelierten polyanionischen Polymeren und anionischen Gruppen auf einem polykationischen Polymeren, z.B. Polylysin, gebildet. Das polykationische Polymere kann ein Molekulargewicht bis herab zu 3000 u aufweisen, jedoch wird Polylysin mit einem Molekulargewicht von 35 000 u oder höher bevorzugt. Nach Bildung der Membran um die expandierten gelierten Massen werden andere Stufen angewendet, um eine Feineinstellung der Porosität der Membran vorzunehmen. Beispielsweise führt eine Reihe von Waschvorgängen in Salinenlösungen zur Expandierung der Poren der Membran, während eine Reihe von Waschvorgängen in einer Calciumchloridlösung die Poren kontrahiert. Eine zweite Membranschicht kann um die Kapseln unter Verwendung eines zusätzlichen polykationischen Polymeren, beispielsweise durch Aussetzung an eine Polyornithinlösung oder durch Aussetzung an ein Polymeres höherer Ladungsdichte, wie beispielsweise Polyvinylamin, gebildet werden. Diese Technik kann zur Verringerung der Porengrösse verwendet werden.

Wie im Patent von Lim angegeben, wird das intrakapsu-lare Volumen vorzugsweise durch Eintauchen der Kapseln in eine Lösung eines Chelatbildners wieder verflüssigt. Zu Chelatbildnern, die mit Erfolg verwendet worden sind, gehören Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Natriumeitrat, Natriumsuccinat und am stärksten bevorzugt Ethylenglykol-bis-(ß-aminoethylether)-N,N-tetraessigsäure (EGTA). Falls Natriumeitrat als Chelatbildner verwendet wird, können sich Hohlräume in den Kapselmembranen bilden, wenn die Membranen eine unregelmässige Form als Erwiderung auf den Citratdruck annehmen. Die Membran kehrt in ihre ursprüngliche Form zurück, wenn sich das Citrat dem Gleichgewicht mit dem intrakapsularen Volumen nähert, wenn jedoch das Kernmaterial eine gegenüber Citrat empfindliche lebende Zelle ist, kann das Zellwachstum oder die Fähigkeit der Zellen biologische Materialien zu bilden, nachteilig be-einflusst werden. Dagegen scheint ein Eintauchen einer Kapsel in EGTA-Lösung dazu zu führen, dass die Membran sich nach innen faltet und in dieser veränderten Konfiguration bleibt, bis das EGTA entfernt ist. Wie im folgenden Beispiel 4 angegeben, scheint es, dass die Zellen in Kapseln, die mit EGTA im Gegensatz zu Citrat oder anderen untersuchten Chelatbildnern behandelt wurden, besser wachsen und bezüglich des Stoffwechsels aktiver sind.

Wie im Patent von Lim angegeben, wird durch das Nachüberziehen der Kapseln mit einer Lösung eines polyanionischen Polymeren, z. B. Natriumalginat, die Tendenz der Kapseln zum Zusammenballen im wesentlichen beseitigt. Das anionische Polymere reagiert mit restlichen kationischen Stellen auf der Membran und verursacht negative Oberflächenpolarität. Wie aus dem Stand der Technik bekannt, können negative Oberflächen das Wachstum und das Anhaften von Zellen hemmen. Ein derartiges Wachstum kann das intrakapsulare Zellwachstum behindern oder die Permeabilität nächteilig beeinflussen. Ferner kann das Eintauchen der Kapsel in ein Neutralisierungsmittel, wie beispielsweise 2-N-Cyclohexylaminoethansulfonsäure (CHES)

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oder andere Zwitterionenpuffer die Reaktionsfähigkeit herabsetzen und die Kapselmembran verbessern.

Die folgenden nicht-begrenzenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Verfahren der Erfindung und deren Vorteile.

Beispiel 1

Das folgende Verfahren wurde zur Herstellung von Kapseln verwendet, die praktisch undurchlässig für Moleküle mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 150 000 u sind. Ein Hybridom, das IgG erzeugt (Molekulargewicht etwa 160 000 u), wurde in diesem Versuch verwendet.

Etwa 2,11 einer Suspension mit einem Gehalt von 2,2 x 106 Zellen/ml in l%igem (Gew./V) Natriumalginat (NaG-Kelco LV) wurden in eine wie vorstehend beschriebene Düsenkopfvorrichtung überführt, und es wurden Tröpfchen gebildet, indem die Suspension durch sechzehn Nadeln von 5,6 |im (22 gauge) mit einer Geschwindigkeit von etwa 50 ml/min gedrückt wurde. Die Tröpfchen fielen etwa 3 cm in 51 einer l,2%igen (Gew./V) Calciumchloridlösung unter Bildung gelierter Massen, die durch Ansaugen gesammelt und in einen 101-Kolben, der etwa 51 isotonische Kochsalzlösung enthielt, zur Gelexpansion gebracht wurden. Die Kochsalzlösung wurde entfernt und zweimal wieder ergänzt. Insgesamt erforderte die Kochsalzlösung-Expansion etwa 11 Minuten. Dann wurde eine Membran um die gelierten Massen durch Kontakt mit 51 einer Lösung aus 750 mg/1 Poly-L-lysin (Sigma Chemical Company; Molekulargewicht 65 000 u) in isotonischer Kochsalzlösung gebildet. Nach 12-minütiger Reaktion wurden die erhaltenen Kapseln 10 Minuten mit 51 einer 1,4 g/1 CHES-Pufferlösung (Sigma) gewaschen, die 0,2% (Gew./V) Calciumchlorid in Kochsalzlösung enthielt. Die Kapseln wurden während etwa 8 Minuten mit 510,3%igem (Gew./V) Calciumchlorid in Kochsalzlösung gewaschen, und es wurde eine zweite Membran um die Kapseln durch eine 10-minütige Reaktion in 51 einer Lösung von 150 mg/1 Polyvinylamin (Polyscience; Molekulargewicht 50 000 bis 150 000 u) in Kochsalzlösung gebildet. Die Kapseln wurden wieder mit zwei 51 Volumen an isotonischer Kochsalzlösung über 7 Minuten gewaschen und durch 7-minütiges Eintauchen in 5 1 einer Lösung von 5 x 10~2% (Gew./V) NaG in Kochsalzlösung nachüberzogen. Die Kapseln wurden weitere 4 Minuten in 51 Kochsalzlösung gewaschen, dann wurden die intrakapsularen Volumen durch zwei Tauchungen in 51 Volumen von 55 mM-Natriumcitrat in Kochsalzlösung wieder verflüssigt, wobei die erste 10 Minuten und die zweite 6 Minuten dauerte. Wie im nachfolgenden Beispiel 4 angegeben, kann der Ersatz der Natriumci-tratlösung mit EGTA-Lösung die Antikörperausbeute verbessern. Die Kapseln wurden zweimal in 51 Kochsalzlösung gewaschen und einmal 4 Minuten in RPMI-Medium. Man liess dann die Kapseln in dem Wuchsmedium, RPMI plus 10% fötales Kalbserum wachsen. Das IgG sammelt sich in den Kapseln, und lediglich Spurenmengen können in dem extrakapsulären Medium ermittelt werden. Nach diesem Verfahren hergestellte Kapseln sind daher im wesentlichen undurchlässig für IgG, ermöglichen jedoch freien Durchgang der erforderlichen Nährstoffe, wodurch das Zellwachstum und die Antikörpererzeugung innerhalb des intrakapsularen Volumens ermöglicht werden.

Beispiel 2

Dieses Beispiel erläutert ein Verfahren zur Bildung von Kapseln, die für IgG (Molekulargewicht etwa 160 000 u) durchlässig sind, jedoch praktisch undurchlässig für IgM (Molekulargewicht etwa 900 000 u). Die verwendeten Zellen waren ein Human-Human-Hybridom 77 des National Institute of Health, wobei dieses Hybridom menschliches IgM erzeugt und abscheidet.

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10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

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6

400 ml einer Lösung, die 1 x IO6 Zellen/ml in l%igem NaG (Gew./V) enthielt, wurden unter Verwendung eines Bündels von acht Nadeln von 5,6 [im in einer Düsenkopfvorrichtung, wie vorstehend beschrieben, in Tröpfchen überführt. Die Zufuhrgeschwindigkeit lag bei etwa 30 ml/min, und der Abstand von der Nadelspitze zu der Gelierlösung aus 1 1 l,2%igem (Gew./V) Calciumchlorid betrug etwa 3 cm. Die gelierten Massen wurden dreimal mit 11 Volumen isotonischer Kochsalzlösung über einen Zeitraum von 8 Minuten gewaschen und während 10 Minuten in 1 1750 mg/ml Poly-L-lysin (Sigma; Molekulargewicht 65 000 u) enthaltende Lösung zur Bildung einer permanenten Membran getaucht. Die erhaltenen Kapseln wurden 5 Minuten in 11 mit

1.4 g/1 CHES, das 0,2% (Gew./V) Calciumchlorid in Kochsalzlösung enthielt, gewaschen, dann 5 Minuten mit 110,3-%iger (Gew./V) Lösung von Calciumchlorid in Kochsalzlösung gewaschen. Die Kapseln wurden 4 Minuten mit 11 Kochsalzlösung expandiert, dann während 7 Minuten in 11 mit 3 x 10~2% (Gew./V) NaG in Kochsalzlösung nachüberzogen. Die nachüberzogenen Kapseln wurden 5 Minuten in

11 Kochsalzlösung gewaschen, dann wurden die intrakapsularen Volumen durch zwei 6-minütige Tauchungen in 11 einer 55 mM-Natriumcitrat-in-Kochsalzlösung wieder verflüssigt. Das Citrat wurde durch zwei Waschvorgänge mit Kochsalzlösung von jeweils 11 entfernt, und die erhaltenen Kapseln wurden 5 Minuten in RPMI-Medium gewaschen. Die Kapseln wurden dann in einem Liter Medium (RPMI plus 20% fötales Kalbserum und Antibiotika) suspendiert, und man Hess die Zellen darin wachsen. Von dem extrakapsulären Medium wurden Proben genommen. Durch Assay wurde ermittelt, dass das extrakapsuläre Medium kein IgM enthält, was besagt, dass die Kapseln praktisch undurchlässig für Moleküle mit einem Molekulargewicht von 900 000 u waren.

Beispiel 3

Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Bildung von Kapseln, die durchlässig für IgM (Molekulargewicht etwa 900 000 u), jedoch undurchlässig für Zellen sind. 200 ml einer 1 %igen (Gew./V) Lösung von NaG (Kelco LV) und die Hybridomzellen von Beispiel 2 wurden durch fünf Nadeln von 6,6 |im in einer Düsenkopfvorrichtung wie vorstehend beschrieben in Tröpfchen überführt. Die erhaltenen Tröpfchen fielen etwa 2,5 cm in die Gelierlösung aus 11 mit 1,2% (Gew./V) Calciumchlorid bei einer Geschwindigkeit von

9.5 ml/min. Die erhaltenen geHerten Massen wurden durch drei Tauchungen in 0,51 Volumen Kochsalzlösung expandiert, und es wurde eine permanente Membran durch lOmi-nütige Reaktion mittels 0,51 mit 1 g/1 Poly-L-lysin (Sigma; Molekulargewicht etwa 260 000 u) gebildet. Die Kapseln wurden 5 Minuten in 0,51 einer 1,4 g/1 CHES-Kochsalzlö-sung mit einem Gehalt von 0,6% (Gew./V) Calciumchlorid und während weiterer 5 Minuten in 0,510,8%iger (Gew./V) Lösung von Calciumchlorid in Kochsalzlösung gewaschen. Die Kapseln wurden dann einmal in 0,51 Kochsalzlösung gewaschen und mit 0,510,03%igem (Gew./V) NaG nachüberzogen. Die nachüberzogenen Kapseln wurden 5 Minuten in 0,5 1 Kochsalzlösung gewaschen, und das intrakapsu-lare Volumen wurde durch zwei 5minütige Waschungen von jeweils 0,5 1 55 mM Natriumeitrat wieder verflüssigt. Die Kapseln wurden einmal in Kochsalzlösung gewaschen, einmal in Grundmedium und in Grundmedium mit einem Gehalt an 20% fötalem Kalbserum plus Antibiotika suspendiert. Es wurde festgestellt, dass IgM die Kapselmembran durchquert, jedoch Zellen zurückgehalten wurden, was anzeigt, dass die Membran für Moleküle mit einem Molekulargewicht von wenigstens 900 000 durchlässig, jedoch undurchlässig für Zellen ist.

Beispiel 4

Dieses Beispiel ziegt, dass die Stoffwechselaktivität eingekapselter Zellen durch geeignete Auswahl des verwendeten Chelatbildners zur Wiederverflüssigung des intrakapsularen s Volumens erheblich erhöht werden kann. Vier verschiedene Chelatbildner wurden geprüft:

EDTA, EGTA, Natriumeitrat und Natriumsuccinat, wobei Li8 Hybridom erzeugendes eingekapseltes IgG als ein Testsystem verwendet wurde. Die Kapseln wurden nach dem io in Beispiel 1 angegebenen Verfahren mit der Ausnahme hergestellt, dass das Natriumeitrat von Beispiel 1 mit den Konzentrationen der nachfolgend aufgeführten Chelatbildner ersetzt wurde.

15

Tabelle I

Ent-

Konzen

Gesamtzellen

Tage der

Endkultur gelierungs-

tration

Anzahl an (Tag)

Züchtung

Hg/ml mittel

(mM)

(Tag)

EDTA

55

1,0 x 106 (6)

6

0

EGTA

55

4,3 x 107 (17)

27

1026

Citrat

55

2,3 x 107 (16)

19

366

EGTA

55

3,5 x 107 (16)

19

741

Succinat

55

2,3 x 107 (16)

19

—

EGTA

55

3,6 x 107 (19)

21

939

EGTA

36

4,1 x 107 (19)

21

892

EGTA

28

3,7 x 107 (19)

21

734

EGTA

28

9,3 x 107 (27)

27

659

5,3 x 107 (20)

578 (20)

EGTA

28

6,0 x 107 (27)

27

693

4,1 x 107 (20)

590 (20)

EGTA

14

7,3 x 107 (27)

27

887

5,4 x 107 (20)

780 (20)

40

Tabelle I erläutert, dass EGTA der beste Chelatbildner für das Zellwachstum ist und zu einer verbesserten Antikörperproduktion im Vergleich mit Citrat etwa um einen Faktor von 2 führt.

45 Die restlichen Posten in Tabelle I erläutern Versuche zur Bestimmung der optimalen EGTA-Konzentration zur Ent-gelierung und Antikörpererzeugung. Wie aus den Daten ersichtlich, scheint es, dass 36 mM und 55 mM Konzentrationen von EGTA etwa äquivalent hinsichtlich der Förderung so der Antikörpererzeugung sind, während niedrigere Konzentrationen an EGTA geringere Antikörperkonzentrationen ergeben, obgleich sie in etwa identisches Zellwachstum haben.

55

Beispiel 5

Dieses Beispiel erläutert die Wirkung der Anwendung mehrfacher Wäschen mit Kochsalzlösung, um die Gelmassen vor der Membranbildung zu expandieren. Das gleiche 60 Kapselbildungsverfahren und Hybridom, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden mit der Ausnahme verwendet, dass die Anzahl der vor der Membranbildung durchgeführten Wäsche mit Kochsalzlösung modifiziert wurde. Nach der Kapselbildung wurden die eingekapselten Hybridome 20 Tage in 65 dem Kulturmedium vermehrt, und die gesamte Zellsumme und die intrakapsulare Antikörperkonzentration wurden gemessen. In Tabelle II sind die Ergebnisse dieses Versuchs wiedergegeben.

Tabelle II

Versuch-

Anzahl der

Tage der

Anzahl der

Intrakapsulare

Nr.

Wäschen mit

Züchtung

Gesamtzellen Antikörper-

Kochsalzlö

konzentration

sung

Hg/ml

441A

keine

20

4,3 x 107

360

441B

1

20

5,0 X 107

560

441C

2

20

7,2 xlO7

702

441C

3

20

6,5 x 107

717

Wie sich aus den in Tabelle II aufgeführten Daten ergibt, lieferte die Anwendung von zwei oder drei Wäschen mit Kochsalzlösung die höchste Zellsumme und die höchste in-trakapsulare Antikörperkonzentration. Genauer ausgedrückt, wuchsen nach drei Wäschen mit Kochsalzlösung vor der Membranbildung in der Kultur etwa 50% mehr Zellen, und es ergab sich etwa die doppelte intrakapsulare Antikörperkonzentration wie bei der Kultur, die nicht mit Kochsalzlösung gewaschen worden war. Dieser Versuch erläutert,

dass das Waschen mit Kochsalzlösung vor der Membranbildung die Kapseln verbessert, so dass die eingekapselten Hybridome gesünder sind und mehr Antikörper erzeugen.

Aus dem Vorstehenden ist ersichtlich, dass der Fachmann im Hinblick auf diese Ausführungen in der Lage ist, spezifische Einkapselungstechniken auszubilden, die beständig gleichmässige Kapselmembranen mit auf spezifische Anwendungen zugeschnittenen Permeabilitätseigenschaften unter Verwendung empirischer Massnahmen erzeugen. Somit kann bei kluger Auswertung der hier angegebenen Einkapse-lungsparameter der Techniker Kapseln herstellen, die den freien Transport durch die Membran der Moleküle bis zu einem gewählten Molekulargewicht gestatten, den behinderten Transport von Molekülen in einem Bereich oberhalb dieses

7 665137

Gewichts ermöglichen und einen Durchgang von Molekülen eines Molekulargewichts und damit verbundener wirksamer Molekulardimensionen oberhalb des Bereichs ausschliessen. Wenn das Verfahren einmal entwickelt ist, kann es ausge-5 führt werden, um so viele Kapseln wie für den beabsichtigten Zweck erwünscht herzustellen.

Bei der Ausbildung eines Verfahrens zur Herstellung von Kapseln eines spezifischen Permeabilitätsverhaltens sollte folgendes als generelle Leitprinzipien angewendet werden, io Die Gelexpansionsstufe verbessert die Gleichmässigkeit der Kapselmembran und erhöht die Wirksamkeit der Porositätsregeltechniken. Steigerungen der Ladungsdichte der die po-lykationische Membran bildenden Polymeren ergibt im allgemeinen kleinere Poren. Erhöhungen des Molekularge-15 wichts des polykationischen Polymeren ergeben im allgemeinen grössere Poren und dünnere Membranen. Erhöhungen der Dauer der Aussetzung des polykationischen Polymeren an die Gelmassen erzeugen eine dickere weniger durchlässige Membran. Die Abscheidung eines zweiten polykationischen 20 Polymeren über das erste verringert die Porengrösse. Die Expansion des Gels durch Hydratation nach der Membranbildung erhöht die Porosität, und eine Kontraktion verringert die Porosität. Bei der Ausbildung von Kapseln für die Implantation ist ein Nachüberziehen mit einem polyanioni-25 sehen Polymeren zweckmässig, und physiologisch unverträgliche Materialien zur Membranbildung, welche Entzündung oder fibroplastisches übermässiges Wachstum verursachen, sollten vermieden werden. Bei der Ausbildung von Kapseln zur Züchtung von Zellen ist die Wiederverflüssigung zweck-30 mässig und sie wird am besten unter Verwendung von EGTA durchgeführt.

Somit kann die Erfindung in anderen spezifischen Formen ausgeführt werden, ohne den Rahmen zu verlassen und sämtliche vorstehenden Ausführungsformen sind als erläu-35 ternd zu betrachten. Andere Ausführungsformen sind von den Ansprüchen umfasst.

50

60

Claims

665 137 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Einkapselung eines Kernmaterials in einem durch eine semipermeable Membran begrenzten intra-kapsularen Volumen, gekennzeichnet durch folgende Stufen:

A. Gelierung eines wasserlöslichen ein Kernmaterial enthaltenden polyanionischen Polymeren mit einer wässrigen Lösung, die mehrwertige Kationen umfasst, zur Bildung hy-dratisierter, diskreter, die Form beibehaltender gelierter Massen;

B. Expandierung der gelierten Massen mit einer wässrigen Lösung, die einen Teil der mehrwertigen Kationen entfernt und die gelierten Massen weiter hydratisiert;

C. Bildung einer Membran um die expandierten gelierten Massen unter Bildung von Kapseln durch Umsetzung zwischen anionischen Gruppen an dem polyanionischen Polymeren und kationischen Gruppen an mindestens einem poly-kationischen Polymeren mit einem Molekulargewicht von über 3000 u.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als zusätzliche Stufe die in Stufe C gebildete Membran mit einem wasserlöslichen polyanionischen Polymeren durch Umsetzung mit restlichen kationischen Stellen auf der Membran nachüberzogen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als zusätzliche Stufe die gelierten Massen nach der Membranbildung wieder verflüssigt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass in der Wiederverflüssigungsstufe die Kapseln einem Chelatbildner ausgesetzt werden.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Chelatbildner Ethylenglykol-bis-(ß-aminoethyl-ether)-N,N-tetraessigsäure oder deren Salz aufweist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als zusätzliche Stufe eine zweite Membranschicht um die in Stufe C gebildete Membran durch Umsetzung mit einem zweiten polykationischen Polymeren gebildet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass als zusätzliche Stufe die Membran mit einem wasserlöslichen polyanionischen Polymeren durch Umsetzung mit restlichen kationischen Stellen auf wenigstens einem der polykationischen Polymeren nachüberzogen wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als zusätzliche Stufe die gelierten Massen nach der Membranbildung wieder verflüssigt werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass in der Wiederverflüssigungsstufe die Kapseln einem Chelatbildner ausgesetzt werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass als Chelatbildner Ethylenglykol-bis-(ß-aminoethyl-ether)-N,N-tetraessigsäure oder deren Salz verwendet wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass als polyanionisches Polymeres saure Polysaccharide verwendet werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass als saures Polysaccharid ein Alginatsalz verwendet wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass als polykationisches Polymeres Proteine mit mehrfach reaktiven stickstoffhaltigen kationischen Gruppen, Polypeptide mit mehrfach reaktiven stickstoffhaltigen kationischen Gruppen, Polyvinylamine, ami-nierte Polysaccharide, deren Salze und/oder deren Gemische verwendet werden.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass als polykationisches Polymeres Polylysin, Poly-glutamin und/oder Polyornithin verwendet werden.

15. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass als zweites polykationisches Polymeres Proteine mit mehrfach reaktiven stickstoffhaltigen kationischen Gruppen, Polypeptide mit mehrfach reaktiven stickstoffhaltigen s kationischen Gruppen, Polyvinylamine, Polyethylenamine, aminierte Polysaccharide, deren Gemische und/oder deren Salze verwendet werden.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass als zweites polykationisches Polymeres Polylysin,

io Polyglutamin und/oder Polyornithin verwendet werden.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung der Stufe B einwertige Kationen umfasst.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, da-

15 durch gekennzeichnet, dass die in Stufe B verwendete wässrige Lösung Salzlösung, insbesondere Kochsalzlösung, umfasst.