MX2013011040A - Metodo para productos terapeuticos encapsulados y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

La invención actual se relaciona con métodos de encapsulación que comprenden microencapsulación a base de alginato para la protección inmune y funcionamiento a largo plazo de material biológico o productos terapéuticos. El material biológico o los productos terapéuticos son abarcados por una membrana formada mediante la gelificación de un polímero de alginato. Específicamente aunque en ningún caso exclusivamente, el sistema de encapsulación está previsto para uso en alo- o xeno-transplante. La membrana proporciona una barrera protectora del material encapsulado, asegurando la longevidad y previniendo influencias no deseadas del exterior de la barrera, tal como reacciones inflamatorias o respuestas inmunes. La invención además está dirigida a métodos de producir y proporcionar los productos encapsulados para uso en terapias celulares. Los productos terapéuticos obtenidos por el método de encapsulación pueden proporcionar un método para mejorar o tratar una gama de enfermedades.

Description

METODO PARA PRODUCTOS TERAPEUTICOS ENCAPSULADOS Y USOS DE LOS i MISMOS í I ' I I Campo de la Invención 1 i La invención se refiere a métodos de encapsulación que I comprenden microencapsulacion a base de alginato! para la I" protección del sistema inmune y el funcionamiento a largo i plazo de las células vivas o terapéuticas. Específicamente, aunque no de modo exclusivo, el sistema de encapsulación es para su uso en alo- y xenotrasplantes . La invenció también i. está dirigida a métodos para hacer y usar el sistema de i -encapsulación y el uso de productos de células énc'apsuladas en terapias celulares. i Antecedentes de la Invención El trasplante celular se está volviendo cada ¡ vez más i exitoso tanto experimentalmente como clínicamente. J Se toma ventaja de los avances en la ciencia de materiales, ¡.biología celular y administración de fármacos para desarrollar plataformas de terapia de células micro y macro-encapsuladas . i Estos constructos permiten la liberación controlada de i moléculas terapéuticas para el tratamiento de enfermedades i agudas y crónicas, pero su uso generalizado 1 se ve obstaculizado por la necesidad de una administración i frecuente para materiales erosionables , y recuperación y i problemas de biocompatibilidad crónicos para materiales no Re'¿.: 243949 degradables. En el caso de materiales biodegradables , el éxito de la terapia de células encapsuladas dependerá en gran medida de una comprensión de la estabilidad del material una vez trasplantado y en última instancia, como la estabilidad afecta la capacidad del injerto a soportar la supervivencia de las células, la secreción y difusión de proteínas, el aislamiento inmunológico, biocompatibilidad, la colocación y la fijación física, degradación, y la eficacia y farmacodinámica del producto secretado. La (micro) i encapsulación de células es un concepto bien establecido que puede ser implementado para muchas aplicaciones, tales como terapia celular, biosensores celulares, inmovilización de células para la producción de proteínas y anticuerpos, I" encapsulación probiótica por la industria alimenticia o nutracéutica . La terapia celular, que es el uso de¡" células Í vivas para tratar condiciones patológicas, podría I ser una i solución a las dificultades encontradas en el suministro de proteínas terapéuticas. De hecho, la producció · y la I" administración de proteínas son un reto debido! a sus características físico-químicas y biológicas. ¡ La microencapsulación es el proceso en el" cual, i sustancias discretas pequeñas de por ejemplo origen biológico son envueltas por una membrana que es preferiblemente compatible con el receptor en el que se coloca. i i< La membrana producida es semipermeable lo que permite la i I , , . i afluencia de moléculas esenciales para el metabolismo celular i (nutrientes, oxígeno, factores de crecimiento, etc.) y la I difusión hacia el exterior de proteínas terapéuticas y productos de desecho. Al mismo tiempo, las células y las moléculas más grandes del sistema inmune se mantienen lejos, evitando la exposición de resitencia a fármacos inmunosupresores altamente tóxicos. Se han propuesto muchos tipos de dispositivos, pero la integración en uña matriz I muestra ventajas significativas, tales como dispositivos que optimizan la transferencia de masa debido 'a altas i proporciones de superficie vs volumen interno, lo¡, cual es crítico para la viabilidad de células y las respuestas secretoras rápidas a señal externa. Aunque tales dispositivos artificiales no están conectados directamente al cuerpo y órganos del huésped (dispositivos extravasculares) , ¡han sido mostrados que soportan el metabolismo, crecimiento, y diferenciación de células atrapadas. Por otra parte, la deposición de sustancias integradas en la matriz en compartimentos del cuerpo específicos alcanza una i concentración de proteínas alta, local, sostenida, disminuyendo los efectos secundarios potenciales. Matrices y i esferas huecas se pueden producir de manera eficiente por i muchas técnicas bien descritas para la administración de fármacos y otras aplicaciones no farmacológicas. Sin embargo, i en las aplicaciones de encapsulación de células, los requerimientos complejos y conflictivos se tienen que cumplir. No sólo son métodos muy reproducibles necesarios para la preparación de dispositivos con parámetros muy precisos (permeabilidad, tamaño, superficie) , sirio también estos métodos deberían soportar, además, la integridad y la viabilidad celular durante el proceso de encapsulación y después del implante. Por último, el método de preparación debe garantizar el flujo adecuado a través de la membrana de la partícula para la supervivencia y función de las células, I asi como biocompatibilidad a largo plazo con los tejidos del huésped sin reacciones inflamatorias asociadas (incl. neovascularización eficaz) .

I"¦ ' Mientras que los intentos para trasplantar tal,, material encapsulado en un paciente para realizar la¡ función específica de ese material en el interior del ¡" paciente receptor han tenido un éxito parcial, el cuerpo deJ paciente reacciona f ecuentemente en formas que alteran la 'actividad ,.. i- . de los dispositivos por fibroblastos u otro crecimiento i" excesivo relacionado con la inflamación de esta sustancia por el cuerpo. Un mecanismo potencial para la inducción de los i" fibroblastos es la activación de los macrófagojs, y la estimulación resultante de citocinas por la sustancia de partículas. Las citocinas son moléculas secretadas1 por el cuerpo en respuesta a un nuevo conjunto de antígenos, y son i frecuentemente tóxicas para las células encapsuladas;. Algunas citocinas a su vez estimulan el sistema inmunol gico del I· paciente. Por lo tanto, la respuesta inmune todavía ! uede ser i un factor limitante en la vida eficaz del material i encapsulado. Además, las células de fibroblastos ¡tienden a j crecer demasiado los dispositivos, también aparentemente en respuesta a las citocinas recién liberadas. Este crecimiento I de fibroblastos hace que los dispositivos pierdan su i porosidad. Como resultado, el material celular dentro de los dispositivos no puede recibir los nutrientes y el¡ producto i del material celular no puede penetrar en la pared del i dispositivo. Esto puede provocar que el material vivo encapsulado muera, y puede poner en peligro la eficacia de los dispositivos como un sistema de liberación. ¡, i La naturaleza del biomaterial es fundamental i para la I ' viabilidad de los dispositivos trasplantados.1' Varios i materiales biocompatibles se describe que son apropiados para su uso en las células de encapsulación . Ejemplos de ello son, i» por ejemplo, agar, alginato, carragenina, celulosa "y sus derivados, quitosano, colágeno, gelatina, resina epoxi , resinas foto reticulables , poliacrilamida , poliéster, i poliestireno y poliuretano, polietilen glicol (PEG) . i i.

Se ha hecho mucho trabajo usando alginato 1 que es I· considerado como un biomaterial altamente eficiente ' para la microencapsulación de células. El alginato es un ¡polímero i natural, que puede ser extraído de algas. i El alginato comprende un grupo heterogéneo de copolímeros binarios lineales de ácido ß-D-manuróhico y su i epímero C5 ácido a-L-gulurónico unidos en 1-4. El alginato se ha estudiado mucho tiempo como un biomaterial en una amplia i gama de aplicaciones fisiológicas y terapéuticas. Su potencial como un material de implante biocompatible se I exploró por primera vez en 1964 en el papel quirúrgico de ampliar artificialmente el volumen de plasma (Murphy et al., Surgery 56: 1099-108, 1964). Durante los últimos veinte años, ha habido un progreso notable en la microencapsulación de células de alginato para el tratamiento de enfermedades tales r j como diabetes, entre otros. í A pesar del éxito en numerosos modelos animales y en I alo-trasplante clínico, ha habido cinética de degradación variable que afecta la difusión, aislamiento inmune, y en ultima instancia conduce a la pérdida de la supervivencia del injerto y rechazo. La comprensión general de la estabilidad de las partículas de alginato in vivo desde una perspectiva de materiales estricta está limitada y esto a su vez. limita SU USO .

I.· Aunque se han hecho algunos intentos para optimizar el rendimiento de las partículas mediante la mejora,» de su i. biocompatibilidad y estabilidad (ver, por ejemplo, Sun et al., (1987)), relativamente se ha hecho poco, para i correlacionar la estructura molecular y el tamaño del principal componente de polímero de las partículas, el i alginato, a las propiedades funcionales de la ^partícula i resultante. ( Varias patentes y solicitudes de patente han intentado i perfeccionar los materiales y métodos de encapsulación: I" El documento WO 91/09119 describe un método de i encapsulamiento de material biológico, más específicamente células de islotes, en una gota con un gel de alginato, que a continuación es encapsulado por una segunda capa, preferentemente poli-L-lisina, y una tercera capa que consiste de alginato. ¡ i' La patente US 5,084,350 proporciona un método para encapsular material biológicamente activo en una grari matriz, I que subsecuentemente es seguida por la licuación' de las microcápsulas . 1 La patente US 4,663,286 describe un método de fabricación de microcápsulas mediante gelatinización de la microcápsula, y la posterior expansión de la microcápsula por hidratación para controlar la permeabilidad de la cápsula. i Las cápsulas del arte previo sufren de varios problemas I" que afectan su longevidad, puesto que el requerimiento para la licuación del núcleo compromete la integridad estructural de la cápsula. Además, la desgelatinización es !un duro tratamiento para las células vivas. Además, un revestimiento i" de poli-lisina, que si se expone puede causar fibrosis,, no es ¦ I G tan fuertemente unido a la capa interna de alginato de calcio, como podría ser. Por otra parte, la desgelatinización del núcleo de la cápsula puede resultar en la lixiviación de alginato solubilizado o poli-lisina no unida, cau'sando una reacción fibrótica de la microcápsula . Además, la forma y la estructura del dispositivo igualmente juegan un papel en la viabilidad del material biológico encapsulado después del implante. Una complicación significativa derivada de los sistemas encapsulados es la eficiencia disminuida por la que el oxígeno, los nutrientes y desechos metabólicos se difunden ?' dentro y fuera del dispositivo. Las esferas tienden a formar grandes agregados dentro de una cavidad del cuerpo j y por lo tanto, las células en el centro de estos agregados son más propensas a la muerte celular y necrosis, debido a' la falta I' de nutrientes. Eventualmente, el efecto previst de la implantación se verá seriamente reducido o incluso s'é pierde. La presente invención está dirigida a superar por menos parte de los problemas mencionados anteriormente en el arte previo . j" Sumario de la Invención ! Es un objeto de la presente invención mejorar la estabilidad de los biodispositivos a base de alginato y para producir productos terapéuticos basados eri estos biodispositivos que pueden ser utilizados para aplicaciones in vivo. j, I" En comparación con las cápsulas de policationes de alginato del arte previo, los procedimientos de encapsulación i de la presente invención muestran varias características 'r mejoradas, en este caso, (i) una estabilidad química y mecánica mayor, (ii) no causa ninguna o muy baja1 reacción inflamatoria en el receptor (iii) permite procédlmientos quirúrgicos de bajo impacto para la implantación, (iv) refuerza la durabilidad de los microdispositivos después de la implantación, reduciendo el riesgo de necrosis.

La encapsulación a base de alginato de la "presente invención (que tiene estabilidad y biocompatibilidad 'mecánica i y química mejoradas) se hace mediante la selección del i material que sera utilizado para encapsular (y los ¡iones de gelificación de los mismos) de acuerdo con la estructura I I química deseada y tamaños moleculares, así como mediante el i control de la cinética de la formación de la matriz. Los i ¦ dispositivos de la invención son preferiblemente . hechos de alginato enriquecido con ácido gulurónico. El dispositivo se caracteriza además por una proporción definida de alginatos i de calcio/bario. Se pueden producir varias formas de dispositivos de alginato. En una modalidad preferida, el dispositivo consiste en una forma filamentosa. Mediante el uso de células encapsuladas en una forma filamentosa, se garantiza la longevidad del implante. Los inventores han encontrado que implantar micropartículas en unai- forma filamentosa tiene la ventaja de que las células encapsuladas son menos propensas a la muerte celular y necrosis, puesto que los filamentos no tienden a formar agregados grandes I" ¦ después de la implantación, puesto que se conoce hacer otras formas en el arte previo. La formación de agregado,s grandes perjudica la afluencia de nutrientes a las células'( internas del agregado, lo que provoca inanición y, finalmente, la pérdida de estas células internas. Los filamentos pueden ser, además, más fácilmente manejados y quirúrgicamente o laparoscópicamente trasplantados por los cirujanos en sitios distintos del peritoneo, tales como, pero no se limitan a grasa, el omento o sitios subcutáneos. En ¡caso de complicaciones clínicas también podrían ser más fácilmente retirados que las cápsulas de alginato comunes. ¡ A diferencia de muchos dispositivos del arte previo, no hay desgelatinización del núcleo de alginato ¡ de las partículas de la invención puesto que perjudica la viabilidad de las células. ¡" También, debido a que, en una modalidad preferida, el alginato de núcleo interno está hecho de alginato de 1 bario y calcio iónicamente reticulado, es más estable que alginato de calcio del arte previo, y menos tóxicos que el alginato de bario del arte previo. 1 Aunque el bario tiene la afinidad más fuerte, es tóxico en grandes cantidades , y por lo tanto, crea un ri|esgo de seguridad que no es deseable. Sin embargo, de acuerdo con la presente invención, se ha encontrado inesperadamente que una I combinación de bario y calcio, dentro de un intervalo de I concentración particular, tiene los beneficios ¡, de alta afinidad sin las desventajas de un alto riesgo de toxicidad.

Breve Descripción de las Figuras G I Figura 1. Niveles de glucosa en sangre sin i ayuno en ratones Nod/SCID diabéticos tratados con 2.9 M de células beta humanas encapsuladas en comparación con ' animales i diabéticos no tratados y controles de no diabéticos no tratados. Los datos representan los promedios (cuando sea apropiado) ± SD . j Figura 2. Niveles de péptido C humano en los grupos I-experimentales y de control después de la implantación de 2.9M de células beta humanas encapsuladas en ratones'(i Nod/Scid diabéticos. 1 i I- Figura 3. Efecto del tratamiento sobre el peso ¡ corporal i;, -de los ratones . ¡„ i' Figura 4. Ejemplo del tipo de boquilla utilizada para obtener células encapsuladas en la forma de filamentó's.

Descripción Detallada de la Invención ¡ i La presente invención se refiere a un sistema de encapsulación de células vivas y terapéuticas 'que han i. mejorado la bioestabilidad cuando las células encapáüladas y terapéuticas se implantan en un receptor. Esta formulación ?' i G mejorada permite que las células encapsuladas y terapéuticas sigan funcionando dentro de un cuerpo vivo durante períodos más largos de lo que es actualmente el caso que resulta en una liberación de productos terapéuticos mejorada ' y por lo G tanto la eficacia del tratamiento. J A menos que se defina lo contrario, todos los términos utilizados en la descripción de la invención, incluyendo términos técnicos y científicos, tienen el significado que se i entiende comúnmente por una persona experimentada en la técnica a la que pertenece esta invención. Por I"medio de orientación adicional, se incluyen definiciones dej términos para apreciar mejor la enseñanza de la presente invención.

I1 Como se usa en este documento, el término ' material biológico incluye ADN, ARN, proteínas, drganelos, I· anticuerpos, inmuno-proteínas, péptidos, hormonas^, tejido viable o células procarioticas o eucarióticas viables: Como se usa en este documento, el terminp ; matriz biocompatible comprende un compuesto seleccionado del grupo de agar, alginato, carragenma , celulosa y sus derivados, I quitosano, colágeno, gelatina, resina epoxi , resijnas foto reticulables , poliacrilamida, poliéster, poliestlíreno y poliuretano, polietilenglicol (PEG) . , Como se usa en este documento, el término conjugados de alginato puede incluir, pero no se limita a, álginato-colágeno, alginato-laminina, alginato-elastina, alginato- !? i fibronectina, alginato-colágeno-laminina y alginato-ácido hialurónico en el que el colágeno, laminina, "elastina, colágeno-laminina o ácido hialurónico están unidos (o no I" unidos) de forma covalente al alginato. j "Un", "una", y "el", como se usa aquí, se refieren tanto i a los referentes singulares y plurales a menos que el i contexto dicte claramente lo contrario. A modo de1 ejemplo, "un compartimiento" se refiere a uno o más' de un compartimento. · "Aproximadamente" , como se usa en este documento hace referencia a un valor medible como un parámetro, una cantidad, una duración temporal, y similares, se entiende que abarca variaciones de +/-20% o menos, preferiblemente +/-10% o menos, más preferiblemente +/-5% o menos, incluso más preferiblemente +/-1% o menos, y aún más preferiblemente +/- 0.1% o menos y del valor especificado, en la medida en que tales variaciones son apropiadas para llevar a cab;o , en la invención descrita. Sin embargo, debe ser entendido que el i- i valor al que el modificador "aproximadamente" se refiere en sí también es descrito específicamente.

"Comprender" , "que comprende" y "comprende" y "comprendido" como se usan en este documento son sinónimos de I "incluir", "que incluye", "incluye" o "contener",' " que contiene", "contiene" y son inclusivos o términos abiertos i ¦ que especifican la presencia de lo que sigue, por ejemplo, componente y no excluye o impide la presencia de componentes adicionales no recitados, características, elementos, miembros, pasos, conocidos en el arte previo o descritos en los mismos.

La recitación de intervalos numéricos por puntos finales incluye todos los números y fracciones subsumidas ¡dentro de ese intervalo, así como los puntos finales indicados1.

La expresión "% en peso" (por ciento en peso) , ^quí y en toda la descripción a menos que se defina lo contrario, se refiere al peso relativo del componente respectivo con base en el peso total de la formulación. j En un primer aspecto, la invención proporciona un sistema de encapsulación que comprende alginato qué es alto en ácido gulurónico. El alginato es un polisacáridó lineal que consiste de ß-D-manuronato (M) unido en (1-+ ) - y su epímero C-5 a-L-guluronato (G) . Los monómeros pueden'' aparecer en bloques homopolímericos de residuos G consecutivos (bloques G) , residuos M consecutivos (bloques M) , alternando residuos M y G (bloques MG) o bloques organizados aleatoriamente. Puesto que se ha mostrado que el grado de pureza del alginato para determinar la biocompatibilidad de partículas a base de alginato es obligatorio proporcionar detalles de la pureza. De acuerdo con los requerimientos de la FDA para la implantación del dispositivo el contenido de endotoxina debe estar por debajo de 350 EU por paciente (por debajo de 15 EU para aplicaciones del CNS) . Puesto que las I propiedades químicas de endotoxinas son muy similares a los í" alginatos, su eliminación ha sido una tarea difícil pero alginatos purificados con un contenido de éndotoxina I especificado a continuación de 100 UE/g están ahora disponibles en el comercio. GMP requiere que los alginatos se caractericen por métodos validados de acuerdo cori la guía ASTM 2064. Por lote un certificado debe ser liberado. La I' presente invención proporciona una composición que ¡comprende un alginato de ácido gulurónico alto, con un contenido en ácido gulurónico de por lo menos 60% y cationes. !" I" En una modalidad preferida de la invención, las¡ matrices i a base de alginato biocompatible preparadas ujsando la metodología de encapsulación combina un generador ci micro-gotas y una solución amortiguadora de gelificaqión para encapsular el material biológico de interés en micropartículas de alginato-Ca2+/Ba2+ no homogéneas! Durante la extrusión a través de un generador de micro-gotas las gotas se producen por una combinación de cortes de aire y presión mecánica por una bomba peristáltica.

Alternativamente, un generador de gotas electrostáticas se puede utilizar para producir las gotas. El material biológico que contiene microgotas se recoge subsecuentemente en una J" solución de reticulación catiónica con una I solución I¦ amortiguadora (pH 7.2 hasta 7.4) . Cuando se pone en ¡contacto l i ¦ i- con esta solución amortiguadora las microgotas se gelifican. El agente de reticulación catiónico puede ser seleccionado de sales del grupo que consiste de Ag+, Al3+, Ba2+, Ca+ , Cd2+, i Cu2+, Fe2+, Fe3+, H+, K+, Li+, Mg2+, Mn2+, Na+, NH4+, i2+, Pb2+, Sn2+ y Zn2+ . Preferiblemente, el agente de reticulación catiónico es una combinación de cloruro de bario y cloruro de calcio. El agente de reticulación está preferiblemente en exceso, por ejemplo de lmM a 20 mM de cloruro de¡ bario y desde lmM a 20 mM de cloruro de calcio. Más preferiblemente lOmM de cloruro de bario y lOMm de cloruro de calcio." Después de esto, las microgotas se lavan tres y;eces con solución de inger y son mantenidas en medio de Ham F-10 libre de suero a 37 °C y 5% de C02 hasta el trasplante. El tamaño de la microgota varía entre 200-800 ym. Las microgotas pueden tomar muchas formas, tales como gránulos, 'esferas, láminas o estructuras filamentosas. En una modalidad más preferida, las microgotas toman la forma de filamentos a base de alginato mediante el uso de un procedimiento ligeramente modificado . , L .

(„ Las microgotas formadas se hinchan aproximadamente¦ 10% o más en volumen cuando se colocan in vitro en condiciones fisiológicas durante aproximadamente un mes o más. La hinchazón de estas matrices de alginato se cree ique es causada por cationes divalentes excedentes causando un gradiente osmótico que conduce a la absorción de agiiia . Las I i I esferas y los filamentos de la invención son muy estables. Se espera que las microgotas de la presente invención serán i capaces de permanecer funcionales in vivo en un sujeto durante un periodo de tiempo significativo y, ciertamente, por períodos de hasta 4 meses y más. i i · En una modalidad preferida adicional, el 1 material biológico encapsulado comprende células, tales como', pero no limitado a células de islotes, hepatocitos, ¡ células neuronales, células pituitarias, células crbmafines, condrocitos, células de la línea germinal y células que son i capaces de segregar factores. Las células se procesan de i acuerdo con los métodos apropiados (por ejemplo, para células de islotes el método descrito en EP1146117 y relacionados) y se mezclan con una solución de alginato ultrapura estéril al 1.8% para obtener una densidad celular final entre1 10-30 x i 106 células/ml de alginato. ' i- En una modalidad particularmente preferida, el ¡material biológico encapsulado comprende un grupo de ¡ células endocrinas páncreaticas , que se originan a partir de ¡páncreas I" de porcino inmaduro, capaz de secretar insulina, útiles para el tratamiento de la diabetes. Las células pueden comprender, alternativamente, células de hepatocitos o no hepatocitos capaces de secretar factores de secreción del hígado útiles en el tratamiento de enfermedades o trastornos hepáticos. Las células pueden comprender, alternativamente, ¡ células i- I¦ I ' I' i neuronales, tales como el plexo coroideo, ! células I pituitarias, células cromafines, condrocitos y cualquier otra célula capaz de secretar factores neuronales útiles en el [ tratamiento de enfermedades neuronales tal como la enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, epilepsia, enfermedad de Huntington, accidente cerebrovascular , enfermedad neuronal I' de Reiter, esclerosis lateral amiotrófica (ALS , , por sus siglas en inglés) , esclerosis múltiple, envejecimiento, enfermedad vascular, Síndrome del cabello ensortijado de I:. , Menkes, enfermedad de Wilson, trauma o lesión del sistema nervioso. |.

En otra modalidad preferida, el material ^biológico encapsulado puede modificarse por células manipuladas genéticamente produciendo proteínas terapéuticas tales como, pero no limitado a eritropoyetina, insulina, IGF-1, IL-2, I citocromo P450, CNTF, NGF, BMP, BDNF, GDNF, VEGF, factores de coagulación de sangre, interferones , dopamina, end' statina, neuropilina- 1 , GH3 y anticuerpos. i« En otra modalidad, el material biológico encapsulado puede comprender células madre o células progenitoras . Las células madre y progenitoras tienen la potencia para diferenciarse en varios linajes de células y por ¡lio tanto I' mantener un enorme potencial en la terapia celular en la medicina regenerativa . Sin embargo, el fracaso!' de la j regeneración de tejido y la remodelación se atribuye I .en parte a la falta de protección de las células madre y prpgenitoras a factores extrínsecos. La microencapsulación puede inmovilizar las células madre para proporcionar un i microambiente favorable para la supervivencia de las células madre y su funcionamiento, por lo tanto, la creación de un i nicho de células madre bioartificial que imita las características físico-químicas y bioquímicas especificas del nicho de células madre normal. 1 I La invención proporciona además un método para mejorar o i-tratar una enfermedad o condición en un animal, incluyendo un ser humano, que comprende trasplantar una cantidad eficaz de las matrices de alginato que contienen células de la invención en el animal, en donde las células segregan un agente terapéutico que es eficaz en el mejoramiento o tratamiento de la enfermedad o condición.

La invención proporciona además un método para mejorar o tratar una enfermedad o condición en un animal, incluyendo un ser humano, que comprende trasplantar una cantidad eficaz de la membrana inmuno-protectora que contiene células revestidas con un constructo de liberación de células no degradable de la invención en el animal, en donde las células secretan un agente terapéutico que es eficaz en la mejora o tratamiento i de la enfermedad o condición. ?· La invención proporciona además un método para mejorar o i tratar una enfermedad o condición en un animal, incluyendo un i ser humano, que comprende trasplantar una cantidad Ieficaz de las matrices de alginato que contienen el '( producto terapéutico de la invención en el animal, en el que el producto terapéutico es eficaz en mejorar o tratar la enfermedad o condición. j En estos métodos de tratamiento, las matrices o constructos de liberación revestidos de la invención se I pueden administrar en una cantidad QUE liberaría suficientes 1 productos terapéuticos con el fin de ser eficaces contra la enfermedad. Por ejemplo, en el tratamiento de diabetes, se I implanta una cantidad mínima de un millón de j células productoras de insulina encapsuladas por kilogramo de peso corporal del receptor. ¡" Una persona experimentada en la técnica sería papaz de probar el índice de secreción del producto terapéutico i particular de las matrices de alginato in vitro jy/; para cualquier necesidad del paciente en particular, sería, capaz de calcular cuantas esferas o filamentos se requerirían para el tratamiento de ese paciente en particular efectivamente.

Las matrices de la invención pueden ser formuladas para alo-o xenotrasplantes dependiendo de la fuente de ¡.células vivas y/o productos terapéuticos. Las matrices I- de la invención pueden ser transplantadas dentro de los tej dos del cuerpo o dentro de espacios llenos de fluido del cuerpo, que es el más apropiado en términos de accesibilidad y eficacia.

? I I Más específicamente, el sitio de implantación o trasplante puede ser subcutáneo, intramuscular, intra-organo, intravenoso, vascularidad arterial/venosa de un órgano, fluido cerebroespinal, y fluido linfático. Por ejemplo, si las células vivas dentro de las matrices son células beta, i que se pueden trasplantar en la cavidad peritoneal. En una modalidad preferida, las células encapsuladas se implantan en el omento, una estructura altamente vascularizada dentro de la cavidad peritoneal . En caso de problemas de seguridad con las matrices de alginato, una omentectomía directa ¡ se puede i realizar, eliminando de forma segura las matrices. Otros sitios de implantación incluyen sitios de grasa y subcutáneos. Otra vez, en caso de complicaciones ¡clínicas i pueden ser removidas fácilmente. ¡ En una modalidad, los dispositivos pueden proporcionarse en una forma inyectable, que permite una implantación o trasplante directo. Alternativamente, los dispositivos ',pueden i ¦ ser formulados para administración oral o tópica, en i particular cuando contienen un agente terapéutico bioactivo, tal como un antibiótico. ¡.

La presente invención se describirá ahora ¡en más detalle, se hace referencia a ejemplos que ¡no son limitativos. 1 Ejemplos , I' Ejemplo 1: islotes humanos encapsulados en i i I- micropartículas de alginato - normalización en ratones I I- Un dispositivo de flujo de aire coaxial (un generador de microgotas) en combinación con una solución amortiguadora de I" gelificación de bario/calcio, se utiliza para encapsular los I" islotes pancreáticos humanos en micropartículas de ¡alginato- i Ca2+/Ba2+ no homogéneas. 1 i a) Preparación de células antes de la encapsulación - La suspensión de islotes humanos es centrifugada a 270 i g (1100 rpm en Beckman GS-6R) ; 3 min; 15 - 30°C 1 i - Se elimina el sobrenadante (Ham FIO) . ,.. , i - Las células se lavan dos veces con NaCl al ¡0.9% con centrifugación intermedia: 270 g (1100 rpm en Beckman GS-6R) ; 3 min; 15 - 30°C El sedimento de células se mezcla suavemente con alginato al 1.8% utilizando una pipeta hasta que se, obtiene I suspensión homogénea. Islotes humanos se mezclan ¡con una i solución de alginato ultrapura estéril al 1.8% para¡ obtener una densidad celular final entre 5-50 x 106 célulás/ml de i alginato en un tubo Falcon de 50 mi. ,.. , - Esta mezcla se deja enfriar en hielo durante,, por lo I menos 5 min. '· I"¦ · i b) Encapsulación i' i · La mezcla de células-alginato descrita anteriormente se i procesa posteriormente a través del dispositivo de flujo de aire coaxial usando los siguientes ajustes: ;· - Bomba de caudal: 0.5-1.5 ml/min ¡ - Medidor de flujo de aire: 2.5-3 1/min j - válvula de presión 1: 0.2 Pa - válvula de presión 2: 0.1 MPa j Estos valores variarán (mayor o menor) dependiendo del tamaño de las partículas que uno quiere producir.

Usando una bomba peristáltica la mezcla de células-alginato es aspirada fuera del tubo Falcon de 50 mi utilizando una aguja con centro metálico (calibre 16) , y se hace avanzar a través de un tubo hacia la aguja de chorro de aire de calibre 22. Durante la extrusión a través de ',1a aguja i de chorro de aire calibre 22 las gotas se producen por una combinación de cortes de aire y presión mecánica mediante la bomba peristáltica. Las gotas que contienen islotes en alginato se producen por extrusión (0.5-1.5 ml/min) a través de una aguja de chorro de aire de calibre 22 (flujo "de aire 2.5-3 1/min) . ¡" Las gotas caen 2 cm más abajo en un vaso de precipitados de 20 mi que contiene una solución de 50 mM de CaCl¡ 2; mM y I¦ lmM de BaCl2 (en lOMm de MOPS, 0.14 M de manitol y T een 20 i al 0.05%, pH 7.2 a 7.4) como solución de gelificación . Al entrar en contacto con esta solución amortiguadora las microgotas se gelifican (Qi et al.; 2008) . El tamaño de gota variará entre 200-800 µ?a, dependiendo del caudal de la bomba y del flujo de aire utilizado. ¡ Las gotas son dejadas durante 7 minutos en la solución i de gelificación de BaCl2. Después de que las cápsulas se I retiran de la solución de gelificación vertiendo estas cápsulas que contienen solución de gelificación l'sobre un i tamiz en forma de cilindro con una rejilla de malla 22 en la i parte inferior. I i Después las cápsulas se lavan suavemente 1 mediante inmersión en el tamiz en forma de cilindro que contiene las i partículas varias veces en un recipiente de vidrio j lleno de I solución salina equilibrada de Ringer o Hanks . Esté paso se repite tres veces con cada vez una renovación completa de la solución de lavado. i Después de la toma de muestras para QC, las cápsulas se cultivan en medio Ham F-10 que contiene albúmina o |libre de albúmina a 37°C y C02 al 5% hasta el trasplante. ¡,.

I" Alternativamente un generador electrostático de ] gotas se puede utilizar para producir las gotas, c) Trasplante y resultados: normalización desj=més del trasplante j La diabetes fue inducida en ratones ¡NOD/SCID i inmunodeficientes , mediante tratamiento con 50mg/kg de aloxano monohidratado (2 , 4 , 5 , 6 -tetraoxipirimidina ,- ¡2,,4,5,6-pirimidinatetrona, un análogo de la glucosa) . Los ¡animales fueron monitoreados para un estado diabético estable antes de entrar en el estudio. Como un control, se utilizó un ratón i I I I sano. Los trasplantes se realizaron 2 días después del I tratamiento de aloxano. Cinco animales fueron implantados con 2.9 millones de células beta humanas encapsuladas de alginato/animal en la cavidad peritoneal (19M células beta/ml j, , de alginato) . Una pequeña incisión fue hecha en ¡.la pared abdominal y el peritoneo de los animales a lo largo de la línea alba. Células encapsuladas fueron posteriormente transferidas en la cavidad peritoneal usando una pipeta de 5 mi llena con 4 mi de solución amortiguadora. Dos animales diabéticos no recibieron ningún implante. Los I animales después se monitorearon, por hasta 258 días. Mediciones de glucosa en sangre fueron tomadas bajo condiciones sin ayuno.

El experimento se dividió en tres grupos experimentales: • Grupo 1 (representado con triángulos en las 'figuras) : I" ratones diabéticos implantados con células betal humanas encapsuladas en la cavidad peritoneal (n = 5) ¡, • Grupo 2 (representado con cuadrados en las figuras) : ratones diabéticos, los cuales no fueron trasplantados con células beta humanas (n = 2) ' · Grupo 3 (representado con diamantes en las figuras) : ratón no diabético, control negativo (n = 1) . Sólo un animal se incluyó en este grupo ya que no hay suficientes datos históricos para este grupo. ¡»¦..

Se extrajo sangre de los animales para medir la glucosa en sangre, el péptido C y los niveles de pro- insulina .

¡- También se midió el peso corporal de los animales. Después I del sacrificio de los animales (en la semana cinco y 37) cápsulas flotantes libres fueron recuperadas y tanto las I células como las cápsulas se analizaron utilizando i microscopía de luz (H & E) , sección semi -delgada1, sección ultra-delgada y microscopía electrónica para determinar la viabilidad celular, la producción de insulina y la producción de glucagón. ¡ r La microscopía electrónica se utilizó para estimar la viabilidad celular (mediante el conteo de 1000 células) y i mostró que después de la encapsulacion la viabilidad1 fue 81%, en comparación con 88% para las células no encapsuladas. La viabilidad se midió también justo antes de la implantación y I se encontró que era 62% en comparación con las células no j encapsuladas tratadas de una manera similar que mostró 94% de viabilidad. El diámetro promedio de las cápsulas fue 620ym, antes de la implantación. Después del sacrificio;' de los animales, tanto en el día 35 y 258, la mayorí de las cápsulas que eran de flotación libre en la cavidad péritoneal y se recogieron mediante la limpieza de la cavidad. Hubo una ligera reducción en el tamaño de las capsulas después de la i implantación con una reducción de 7 y 8% en el diámetro de í ¦ las cápsulas en los días 35 y 258, respectivamente. El porcentaje de células viables parecía i variar significativamente entre los animales, pero era siempCre mayor que 57%, incluso después de 258 días. A pesar de que el i . porcentaje de células viables varió, el porcentaje de células positivas para insulina y glucagón se mantuvo más constante a I 1 55 y 15.5%, respectivamente. No fue posible cuantjificar el número total de células encapsuladas . ' Antes de la implantación ambos grupos de diabéticos i (grupos 1 y 2) mostraron altos niveles de glucosa en la sangre en comparación con el control de no diabéticos (grupo 3) . Esto es característico de la pérdida de control de glucosa observado en los pacientes diabéticos. La primera í ' medición de glucosa en la sangre después de la implantación i se realizó en 24 horas y mostró que en todos los cinco 1 animales del grupo 2 (tratado con células bétaj humanas encapsuladas) mostró una disminución muy significativa de la glucosa en la sangre a un nivel comparable con el observado para el control de no diabéticos normales (Figura 1) . La normalización de glucosa en sangre fue mantenida durante un período de por lo menos 110 días. Después de este período inicial se observó una variación en los niveles de glucosa en sangre entre los an males y entre los puntos de tiempo, lo que sugiere que la ventaja terapéutica de las células beta humanas se fue perdiendo gradualmente. Los niveles de glucosa en la sangre, sin embargo, permaneció significatjivamente inferior a los de los controles diabéticos (grupo 2) . Para los animales diabéticos que no fueron implantados conj células beta humanas los niveles de glucosa en sangre sin ayuno se I mantuvieron altos. 1 Para caracterizar además la normalización de los niveles de glucosa en sangre, el nivel de circulación de péptido C I humano y la proinsulina humana fueron monitoreados . Los I ensayos utilizados son capaces de diferenciar oligopéptidos humanos de roedores y por lo tanto proporciona una medida directa de la funcionalidad de las células beta humanas. La circulación de péptido C humano se detecta en el ¡punto de tiempo inicial probado (una semana) en todos los cinco animales implantados con células beta humanas encapsuladas .

Parece que hay un aumento gradual en péptido C sjpbre las primeras ocho semanas después de la implantación. El inivel de circulación de péptido C humano muestra una fluctuación significativa sobre el resto del estudio se mantiene por encima 3ng/ml. Estos datos son consistentes con los datos de glucosa en sangre en 2. Ningún péptido C fue detectado, en los ratones que no fueron implantados con células beta humanas. Esto confirma la especificidad de la prueba para el péptido C humano. El nivel de péptido C humano observado en este experimento se considera que es fisiológicamente relevante, ya que están por encima del nivel de circulación de péptido C humano en los seres humanos sanos normales (0.9 a 1.8 jng/ml) .

Datos similares son observados cuando se caracteriza el nivel de la circulación de proinsulina humana. Los cinco animales diabéticos tratados con las células beta humanas muestran niveles cuantificables de promsulina en el primer punto de tiempo de la semana. Sólo los animales del grupo 1, que contienen células humanas encapsuladas implantadas, muestran expresión de pro- insulina constante por encima del límite de detección de la prueba (mayor que 14 pmol/;l durante toda la duración del estudio) (figura 2) . ].

El peso corporal de los animales también fue monitoreado durante todo el estudio con el fin de medir cualquier toxicidad asociada con el estado y/o tratamiento diabético (figura 3) . Todos los animales tratados con las células beta humanas encapsuladas (grupo 1) mantuvieron o «· incluso aumentaron ligeramente su peso corporal lo que sugiere que no hubo efectos tóxicos asociados con la implantación. El grupo diabético no tratado (grupo 2) mantuvo el peso corporal para la mayoría del estudio, pero mostró una disminución en el peso corporal más adelante en el estudio, lo que fue asociado con la patología diabética. Sorprendentemente el animal de control normal (grupo 3) mostró una disminución en <el peso temprano en el estudio y se excluyó. Esto no ha sido observado previamente en datos históricos y es considerado que no está relacionado con este experimento. , No se observaron otros signos de efectos adversos en este estudio.

Ejemplo 2: Encapsulación de células en filamentos de alginato. Células beta humanas o porcinas se mezclan con alginato al 1.8% utilizando una pipeta hasta que se obtiene suspensión homogénea. Islotes humanos se mezclan con una solución de alginato ultrapura estéril al 1.8% para obtener una» densidad celular final entre 5-50 x 106 células/ml de alginato en un tubo Falcon de 50 mi. Esta mezcla se dejó enfriar ; en hielo durante por lo menos 5 min. Utilizando una bomba peristáltica la mezcla de células-alginato es aspirada fuera del tubo Falcon de 50 mi utilizando una aguja con centro ¡metálico (calibre 16) , y se hace avanzar a través de un tubo ;hacia la aguja calibre 22. La punta de la aguja se colock en la solución de gelificación .

Durante la extrusión a través de la aguja de calibre 22 el alginato inmediatamente hace contacto con la solución de gelificación (50 mM de CaCl2 y 1 mM de BaCl2 en lOmM dé MOPS, manitol 0.14 M y Tween 200 al 0.05%, pH 7.2-7.4) inmediatamente formando un filamento cilindrico que contiene células. Filamentos ininterrumpidos de varios metros d'e largo por lo tanto se pueden generar. > Con el fin de obtener una superficie lisa cié los filamentos preferiblemente un vaso de precipitados alto (preferiblemente más de 20 cm de altó) se utiliza como receptor para la solución de gelificación.

El diámetro de los filamentos puede variar entre 50-1200 µp?, dependiendo del índice de flujo de la bomba y \ n el calibre o diámetro interior de la agu a usada.

Preferiblemente, el diámetro del filamento se mantiene por debajo 800µp? con el fin de no influir negativamente en el ? intercambio de nutrientes y gases con el medio ambiente.

Los filamentos se dejan durante 7 minutos en la solución i de gelificación con BaCl2. Después, los filamentos se eliminan de la solución de gelificación mediante el vertido r ' de estos filamentos que contienen solución de gelificación sobre un tamiz en forma de cilindro con una rejilla 'de malla 22 en la parte inferior. " Después los filamentos se lavan suavemente 'mediante inmersión en el tamiz en forma de cilindro que contiene los filamentos repetidamente en un recipiente de vidrio ¡lleno de solución salina equilibrada de Hanks o Ringer. Este1, paso se repite tres veces con cada vez una renovación compleja de la solución de lavado. ¡, Después de la toma de muestras para control de ¡calidad, las partículas se cultivan en un medio Ham F-10 que 'contiene albúmina o libre de albúmina a 37 °C y C02 al 5% hasta el trasplante . ¡ i¦ ' En lugar de una aguja una boquilla desarrollada i "internamente" puede ser utilizada (Figura 4) . Esta boquilla consiste de un plástico cilindrico o una pieza de plexiglás (1), que puede ser insertada en el extremo de cola del tubo (2) . Con un láser un orificio de forma rectangular o de huevo (3) se ha quemado a través de esta pieza de plástico o plexiglás. Cuando se coloca la punta del tubo (que contiene i la boquilla de plástico o plexiglás) se coloca debajo de la i superficie de la solución amortiguadora de gelif cación de bario/calcio y cuando el alginato o una mezcla de células- I alginato se empujan a través de esta pieza de boquilla (4) (utilizando una bomba peristáltica) también s,e pueden i producir filamentos. La forma de los filamentos variará de cilindrica a lámina (haz) como, en función de la anchura de la perforación hecha de láser en la pieza. 1 I Hay ventajas inherentes a la propia forma filamentosa: pueden ser más fácilmente manipulados y quirúrgicamente o I,. laparoscópicamente trasplantados en lugares distintos del i peritoneo, tales como, pero no limitado a grasa,, omento, subcutáneo. En caso de complicaciones clínicas podría ser más fácil de retirar que las cápsulas de alginato comunes.

Ejemplo 3: Generación de cápsulas de par¾d , doble mediante rondas consecutivas de encapsulacion. ¡ Las células pueden ser encapsuladas en cápsulas de alginato de doble pared. Al hacerlo, las células o grupos de I células atrapadas cerca o en la pared de la cápsula! después de la primera ronda de encapsulacion serán cubiertas] por una i segunda capa de alginato durante la segunda ronda de i-encapsulacion. De esta manera, la exposición de las! células encapsuladas directamente al cuerpo será aún más limitada.

I I Una respuesta inmune directa hacia las células mediante la i extrusión de la cápsula después de una sola ! ronda de I' ' encapsulacion por lo tanto se puede excluir. I I En una primera ronda de encapsulacion las células serán i encapsuladas de la siguiente manera: utilizando una bomba I·¦ peristáltica de la mezcla de células-alginato es( aspirada fuera del tubo Falcon de 50 mi utilizando una aguja con centro metálico (calibre 16) , y se hace avanzar a 'través de un tubo hacia la aguja de chorro de aire calibre 25'. Durante i la extrusión a través de la aguja de chorro de| aire de I < calibre 25 las gotas se producen por una combinación de cortes de aire y la presión mecánica por la bomba peristáltica. Las gotas que contienen islotes en alginato se r producen por extrusión (1.2-1.5 ml/min) a través de una aguja i de chorro de aire de calibre 22 (flujo de aire 2.5-3l/min) .

I Gotas caen 2 cm más bajo en un vaso de 20.¦ mi que contiene 50 mM de CaCl2 y lmM de BaCl2 (en lOmM ¡de MOPS, manitol 0.14 M y Tween 20 al 0.05%, pH 7.2 a 7.4) como solución de gelificación . Al entrar en contactó 'con esta solución amortiguadora las microgotas se gelificari (Qi et al, . 2008) . El tamaño de partícula puede variar entre 200-800 \im, dependiendo de la velocidad de flujo de la bomba y del flujo de aire utilizado. ( Las partículas se dejan durante 7 minutos en la "solución con BaCl2. Después de que las partículas se eliminan de la I» .

I" G i,;¦ solución de gelificación mediante el vertido ¡de estas I-partículas que contienen esta solución de gelificación sobre i un tamiz en forma de cilindro con una rejilla de malla 22 en la parte inferior.

Después, las partículas se lavan suavemente mediante inmersión en el tamiz en forma de cilindro que contiene las partículas en varias ocasiones en un recipiente de vidrio lleno con solución salina equilibrada de Ringer o Hanks. Este paso se repite tres veces cada vez con una renovación completa de la solución de lavado. !' Las cápsulas obtenidas de esta manera serán sometidas posteriormente a una segunda ronda de encapsulacion. ¡Cápsulas generadas durante la primera ronda de encapsulacion por lo i tanto, se pueden mezclar de nuevo con alginato ¡al 1.8% utilizando una pipeta hasta que se obtiene suspensión homogénea .

La segunda ronda de encapsulacion se realiza;, de una manera similar a la primera con la excepción de que <¦ para la segunda ronda de la encapsulacion la mezcla de alginato más I¦ partículas es extruída a través de una aguja de calibré 22.

I El tamaño de calibre de las agujas no se limita a la combinación (calibre 25 y calibre 22) utilizada I anteriormente. El diámetro de las partículas producidas después de la primera ronda de encapsulacion y el espesor de la segunda capa de alginato (generada durante la ¡segunda ronda de encapsulación) están determinados en gran medida por el diámetro interior de las dos agujas. , El alginato utilizado durante la primera ¡ ronda de encapsulación puede ser alginato de alto G o alginato de alto M. El alginato utilizado durante la segunda ; ronda de encapsulación puede ser alginato de alto G o alginato de alto M.

La concentración de alginato durante la primera y segunda ronda de encapsulación puede variar entre 1.4 y 2 por ciento.

Ejemplo 4: Maduración de células en matrices de < alginato Islotes de porcinos perinatales podrían ser encápsulados en matrices de alginato que contienen el colágeno de proteínas de membrana basal de tipo IV y laminina, individualmente y en combinación, en una concentración de proteína total de 10-200 µg/ml. Es de esperar! que la secreción de insulina de los islotes será incrementada comparada con los islotes encápsulados en partículas de alginato sin estas proteínas de membrana basal. , Los conjugados de alginato pueden incluir, pero no se limitan a, alginato-colágeno, alginato- laminina , elastina-alginato, alginato- fibronectina, alginato- laminina y alginato colágeno-laminina y alginato-ácido hialurónico en la que el i colágeno, laminina, elastina, colágeno o ácido hialurónico están unidos covalentemente (o no unidos) al alginato.

I I Ejemplos de sales que se pueden utilizar para gel de los constructos de alginato incluyen, pero no se limitan a, cloruro de calcio (CaCl2) , cloruro de bario (BaCl2) ¡ o cloruro de estroncio (SRC12) .

Laminina y colágeno tipo I pueden aumentar la liberación i" de insulina acumulada, mientras que la fibronectina podría resultar en un aumento de la proliferación celular.

I" Ejemplo 5: Encapsulación de células beta y ádipocitos para mejorar la funcionalidad.

?· Los resultados han mostrado que el trasplante en el í" tejido graso puede ser beneficioso para la funcionalidad de las células beta. Chen et al. (2009) mostraron que los I ratones FVB/NJ diabéticos inducidos con estreptozotocina se podrían volver normoglicémicos con una masa terapéutica de islotes singénicos implantados en la almohadilla ' de grasa epididimal, seguidos de una implantación capsular subrenal de una masa subterapéuticas de 25 islotes de ratones j'óvenes (3 meses) o (24 meses) viejos. Tres semanas después del segundo trasplante, se retiró el islote que contiene la almohadilla de grasa para volver a introducir hiperglucemia . ! Los ádipocitos se pueden preparar a partir de almohadillas de grasa epididimal blancas después de la disociación de tejido con digestión de colagenása, la filtración a través de membrana de nilón de 1!50-µp?, y centrifugación (5 min, 300 rpm) . Adipocitos aislados pueden I ser cultivados en medio DMEM mínimo (Life Technologies) suplementado con estreptomicina/penicilina (100 m¡g/ml cada uno) a 37°C. I ' Las mezclas de diferentes porcentajes de célullas beta y i; adipocitos recién aislados o cultivados posteriormente se pueden encapsular en una solución de alginato ultrapuro estéril al 1.8% para obtener una densidad celular final entre 5-50 x 106 células/ml de alginato. Al hacer esto, los adipocitos que fueron co-encapsulados con las células beta pueden proporcionar la matriz adecuada para las céllúlas beta e iniciar o estimular la funcionalidad de estas células beta encapsuladas in vivo. i I" Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor I método conocido por la solicitante para llevar a práctica la citada invención, es el que resulta claro de presente descripción de la invención. |„ , I.- I" ' '" , ' I I' G I i"

Claims (15)

!" REIVINDICACIONES ¡, Habiéndose descrito la invención como antécede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para encapsular material biológico, caracterizado porque comprende los pasos de: ' a) formar una mezcla del material biológico con una composición de matriz biocompatible, l b) proporcionar la mezcla a una solución que I comprende agentes de reticulación catiónicos de bario y calcio, i · c) formar microgotas en la mezcla obtenida en el paso b) mediante la gelificación de la composición de matriz biocompatible, j d) enjuagar las microgotas en una solución amortiguadora acuosa y mantener las microgotas en una ^ solución amortiguadora de nutriente libre de suero hasta la i' trasplante. ¡ .

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la composición de matriz biocompatible es seleccionada del grupo que comprende agar, alginato, carragenina, celulosa y sus derivados, quitosano, ;c0lágeno, gelatina, resina epoxi , resinas foto reti'cülables , poliacrilamida, poliéster, poliestireno o poliuretano, ¡ polietilenglicol ; preferiblemente la composición de la matriz biocompatible comprende por lo menos alginato o conjugado de I11 alginato. j

3. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1-2, caracterizado porque las microgotas tienen forma de gránulos, esferas o filamentos, más preferiblemente filamentos. |-

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque las microgotas son de tamaño entre 200 y 800 µ??. ¡

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el material biológico comprende ADN, ARN, organelos, hormonas, tejido viable y/o células viables, proteínas, tales como anticuerpos, inmunoproteínas y péptidos. j,

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el material biológico comprende células viables, preferiblemente células de mamífero, células de progenitores o derivadas de progenitores, células' madre y células derivadas de células madre o células manipuladas genéticamente. ,.. ,

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, G caracterizado porque las células son seleccionadas del grupo I·: , que comprende células de islotes, hepatoci os , ' células i" neuronales, células pituitarias, células cromafines, i» , condrocitos o cualquier otro tipo celular que es capaz de secretar factores, preferiblemente insulina. 40

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque las microgotas comprenden una densidad celular entre células 10 x 106 y 30 x 106 por mi de alginato.

9. El producto encapsulado caracterizado porque se puede obtener de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones I anteriores 1-8.

10. El producto de conformidad con la reivindicación 9, i caracterizado porque está en una forma filamentosa.

11. El producto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, caracterizado porque es un agente terapéutico apropiado para mejorar o tratar una condición en un animal, incluyendo un ser humano, preferiblemente la condición que será tratada o mejorada es diabetes, i preferiblemente en seres humanos.

12. El producto de conformidad con cualquiera de las i reivindicaciones 9-11, caracterizado porque está en forma implantable, trasplantable o inyectable.

13. El producto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-12, caracterizado porque el ' material biológico comprende células endocrinas pancreáticas de origen mamífero. 1

14. El producto de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque las células endocrinas pancreáticas se originan de páncreas porcino inmaduro, preferiblemente capaz de producir el factor de secreción de insulina. j

15. El producto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-14, como material de implantación o trasplante, caracterizado porque el sitio de implantación o trasplante es seleccionado del grupo que consiste de subcutáneo, intramuscular, intra-organo, inpravenoso, vascularidad arterial/venosa de un órgano,| fluido cerebroespinal fluido, y linfático. I I' 42 1 ?· i' RESUMEN DE LA INVENCIÓN ¡ i- La invención actual se relaciona con métodos de encapsulacion que comprenden microencapsulación base de alginato para la protección inmune y funcionamiento a largo plazo de material biológico o productos terapéuticos. El I" material biológico o los productos terapéuticos sonj abarcados por una membrana formada mediante la gelificacd!on de un I polímero de alginato. Específicamente aunque en ningún caso exclusivamente, el sistema de encapsulacion está' previsto i para uso en alo- o xeno-transplante . La membrana proporciona una barrera protectora del material encapsulado, asegurando la longevidad y previniendo influencias no deseadas del exterior de la barrera, tal como reacciones inflamatorias o respuestas inmunes. La invención además está dirigida a métodos de producir y proporcionar los productos encapsulados I para uso en terapias celulares. Los productos terapéuticos obtenidos por el método de encapsulacion pueden proporcionar un método para mejorar o tratar una gama de enfermedades. H 1 l„ j„ , i- |. |: i I I