JPH05502863A

JPH05502863A - 生体内適用および埋め込み用コーティング組成物同種グルロン酸―アルギン酸塩およびその使用方法

Info

Publication number: JPH05502863A
Application number: JP50111990A
Authority: JP
Inventors: シャク―ブレク、グドムンド; スミスロード、オーラヴ; エスペヴィク、テリエ; オッテリー、マリット; スーン―ショング、パトリック
Original assignee: トランセル・コーポレイション
Priority date: 1989-12-05
Filing date: 1990-12-04
Publication date: 1993-05-20
Also published as: EP0502949A1; WO1991007951A1; EP0502949A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】生体内適用および埋め込み用コーティング組成物同種グルロン酸−アルギン酸塩およびその使用方法［発明の背景１［発明の分野］この発明は米国特許出願第０７／４４６４６２号（１９８９年１２月５日出ｗｉ）の同時係属出願の継続出願である。

この発明はポリマー化学、免疫学、および移植分野に関するものであって、より詳細には外来細胞および生物学的物質の移植および埋め込みに関連して使用される物質の分野に関するものである。

［技術的背景１インスリン産生細胞（島）の移植によって、インスリン治療を必要とする糖尿病動物を治癒できるという証拠がある。糖尿病治療として島移植における臨床的成功を今日まで阻んでいた主な障害は、細胞の免疫属性および移植した移植片の拒絶反応であった。島の同種移植片および／または異種移植片の生存は、種々の免疫抑制方法および／または関連する免疫学的手法によって達成されてきた。然しなからそのような手法は、移植した高細胞が、拒絶反応が起こる前の短期間だけ生存する成功のみに限られていた。しかも免疫抑制剤を長く使用すると、腎障害、および移植受容個体に起こるガンのような重篤な合併症を招来することが多い。

移植片拒絶反応に関するこの問題を解決する１方法は、マイクロカプセル化の方法によって、移植した島と宿主の免疫系の間に物理的な半透性バリヤーを設けることである。マイクロカプセル化は、小さい独立した物質、生存能力のある生物学的な組織または細胞、液体小滴、もしくは気体を、好ましくはそれが置かれている生物系と適合し得る無傷な膜で完全に包みこむ方法である。マイクロカプセル膜の機能は、内包している物質を宿主による免疫的認識から保護し、膜を通してマイクロカプセルの内側と外側との物質流通を制御することにある。

マイクロカプセル化に関する文献の多数は、とりわけＳ、ダーギュイおよびＧ、リーチ［ディアベトロギア、（１９８５年）、２８巻、７７６〜７８０頁１、Ｆ、リムおよびＡ、サン［サイエンス、（１９８０年）、２１０巻、９０８〜９１０頁］、Ｆ、リムおよびＲ，モス［ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンシズ、（１９８１年４月）、３５１〜３５４頁］、オー・シーアも［バイオキミ力・工・バイオフイジカ・アクタ、８０４巻、（１９８４年）、１３３〜１３６頁］、リュングら［アーティフィンヤル・オーガンズ、（１９８３年）、７巻（２）、２０８〜２１２頁］、アラキら［ダイアビーテス、３４巻、（１９８５年９月）、８５０〜８５４頁］、および米国特許第４６９０６８２号、同第４４０９３３１号、同第４３９１９０９号等に報告されている。

高細胞以外にも、組織、木炭、微生物細胞、酵母、葉緑体、植物プロトプラスト、ミトコンドリア、酵素のようなその他の物質が、マイクロカプセル化の手法を用いて固定化され、封入された。

そのようなマイクロカプセル化された物質を患者へ移植して、宿主患者の体内で、その物質特有の機能を発揮させようとする試みがなされた。例えば活性炭を使用して血液を解毒することができ、またすい臓組織で患者のインスリン供給を補給することができた［例えばリムおよびサン（１９８０年）、サイエンス、２１０巻、９０８頁、オー・シーアら（１９８４年）、バイオキミカ・工・バイオフィジカ・アクタ、８０４巻、１３３頁参照］。

そのような試みは一部成功したが、患者の身体は、生体によるこの物質の繊維芽細胞過形成によってマイクロカプセルの活性を損なう形で反応することが多い。

可能性ある繊維芽細胞誘発の機序は、マクロファージの活性化、およびカプセル物質によってもたらされたサイトカイン類の刺激である。サイトカイン類は新しい抗原セットに反応して生体により分泌される分子であり、しばしばカプセル化した細胞に有毒である。さらにある種のサイトカイン類は、患者の免疫系を刺激する。したがって免疫応答は、その後もなおりプセル化した物質の有効期間の制限因子であり得る。

しかも繊維芽細胞は、新たに放出されたサイトカイン類に明らかに応答してマイクロカプセルに生いかぶさる傾向がある［ディネラ口、リンホカインズ・アンド・ジ・インミューン・レスポンス（コーエン編、１９９０年）、ＣＲＣプレス、１５６頁、ビエラおよびコーン、リンホカインズ・アンド・ジ・インミューン・レスポンス（コーエン編、１９９０年）、ＣＲＣプレス、２５５〜２７３頁］。

この繊維芽細胞の増殖はマイクロカプセルの多孔度を失わせる。

その結果、マイクロカプセル内の細胞性物質は栄養素を受け取ることができず、細胞性物質の生産物はマイクロカプセル壁を透過することができない。このため、内包された生きた物質は死滅し、送達システムとしてのマイクロカプセルの有効性を損なうこととなる。

カプセル化に使用される物質の中にアルギン酸カルシウムゲルがある。リムおよびサン（１９８０年）はアルギン酸塩ゲル、ポリーＬ−リンンおよびポリエチレンイミンを使用して島のマイクロカプセル化に成功した。カプセル化した島を糖尿病ラットへ腹腔的注射しｔ；。動物の血糖値は２〜３週間で正常値へ低下し、カプセル化した島か宿主の免疫系による侵入から保護されたことが推察された。

しかしこれらの研究で、マイクロカプセルは、繊維症またはマイクロカプセルを取り囲む繊維芽細胞形成の結果、ついには拒絶され、結局、マイクロカプセルに含有されている細胞への栄養素の流通、およびカプセルに内包されている島細胞によって作り出された物質のマイクロカプセルからの流出を制限することが判明した。

マイクロカプセルの主原料であるアルギン酸塩は、１−４−結合シタβ−Ｄ−マンヌロンＩＩ　（Ｍ）と、そのＣ−５−エピマーであるａ−Ｌ−グルロン酸（Ｇ）の直鎖状２成分系コポリマーからなる不均一な１群である。その七ツマ−は重合鎖に沿ってブロック状の配列で配置され、両ホモポリマー領域（Ｍ−ブロックおよびＧ−ブロック）は、双方の七ツマ−を含む配列（ＭＧ−ブロック）によってその間を隔てられている。アルギン酸塩中のウロン酸の割合および連続配列は、物質を調製した藻の種および藻の組織の種類によって変わる。異なった型のアルギン酸塩のさまざまな性質は個々のアルギン酸塩を構成するグルロン酸に基づく。例えば粘度は主として分子サイズによって定まり、ゲル形成性に不可欠な２価イオンに対する親和性はグルロン酸含量に比例する。具体的には２連の２軸結合したＧ残基はカルシウムイオンに結合部位を提供し、そのような部位の長い配列は、他のアルギン酸塩分子にある類似の配列と架橋結合を形成してゲル網目構造を生じる。

商業的なアルギン酸塩は、主としてラミナリア・ノーイパーポレア、マクロシスチス・ピリ７エラ、ラミナリア・ジギタータ、アスコフィラム・ノド−サム、ラミナリア・ヤボニカ、エフロニア・マキンマ、レソニア・不グレッセンス、およびサラガラスム種から生産される。

またアルギン酸塩はある種の細菌からも入手し得る。アゾトバクタ−・ビネランジイは１５〜９０％のし一グルロン酸含量を有する○−アセチル化アルギン酸塩を生産する。ある種の増殖条件下で、ンユードモナス・アルギン酸塩はポリマンヌロン酸を生産するが、そのような細菌、およびアルギン酸塩を生産するその他のシュードモナス菌はＧ−ブロックを含んだポリマーを生産することができない。

また高含量または低含量のＧ残基またはＭ残基を有するアルギン酸塩は、藻の組織の特殊な部分から入手し得る。例えば高含量のグルロン酸を有するアルギン酸塩はラミナリア・ハイパーポレアの吉い柄の外皮層から得ることができる。また高含量のグルロン酸を有するアルギン酸塩は化学的な分別により、またはマンヌロナンー〇−５−エピメラーゼを使用する酵素的修飾によって調製できる。この酵素は存在するアルギン酸塩ポリマーへＧ−ブロックを導入し、高いＧ−ブロック含量を有するポリマーを生産することができる。

アルギン酸塩自体、繊維症を起こすマイクロカプセル材料の一つであると信じられ、したがってアルギン酸塩をカプセル材料とした埋め込みまたは移植の試みは、短期間しか実施可能でない。

繊維症を起こし得る潜在力の程度は、ある物質の腫瘍壊死因子−σ（ＴＮＦ−σ ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、およびインターロイキン−６（ＩＬ− ６）等のサイトカイン生産物誘発能から得ることができる。これらのサイトカイン類は免疫応答および炎症反応で重要な役割をはたす。これらのマクロファージ由来の仲介因子は繊維芽細胞増殖を制御することが知られている［リビーら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション、（１９８６年）、７８巻、１４３２頁、ビルチェックら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン、（１９８６年）、１６３巻、６３２頁１゜埋め込んだマイクロカプセルに対する繊維性反応に関して考えられる機序は、商業的なアルギン酸塩内の混入物［例えばポリフェノール類またはリポ多糖類（ＬＰＳ）］　、あるいは直接アルギン酸塩七ツマ−によってマクロファージが活性化され、その結果、繊維芽細胞の遊走および増殖を促すサイトカインが放出されるためであろう。ＬＰＳは免疫応答を刺激することが知られている。

またＬＰＳ以外の多糖類も、抗腫瘍活性および単球機能の刺激等を含む免疫刺激効果を有することが報告されている。しかし単球からのサイトカイン生産に対する多糖類の効果に関してはほとんど分かっていない。

［発明の要約］この発明は、これまで発見されていなかったマイクロカプセル化および埋め込みの効果的な手段を提供する。

この発明は、非免疫原性で、繊維芽細胞を誘発せず、生体内で埋め込みまたは移植し得る物質を提供する。

この発明はまた、高いグルロン酸含量を有する純化したアルギン酸塩を利用するマイクロカプセル化の方法を提供する。

この発明はまた、コーティング外皮にポリーＬ−リシンを含まず、マイクロカプセルを取り囲む繊維芽細胞の増殖を全く生じないマイクロカプセル化の方法を提供する。

さらにこの発明は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）またはインターロイキン放出を誘発せず、それによって繊維芽細胞の生成を防止するマイクロカプセルを提供する。

またこの発明は、アルギン酸塩中のポリフェノール量を最小化することにより、実質上、細胞に対して無毒であるマイクロカプセル化の方法を提供する。

この発明は、生体内で、ＴＮＦ、ＩＬ−１およびＩＬ−６生産のようなサイトカイン類の産生を減少させる組成物および手段を提供する。

この発明はまた、ＴＮＦ、ＩＬ−１および／またはＩＬ−６生産によって起こる敗血症を予防し、または処置するための組成物および手段を提供する。

この発明は、アルギン酸塩、特にマンヌロン酸が微量であり、主としてグルロン酸を含有するアルギン酸塩からなる、哺乳動物体内に埋め込みまたは移植するのに生体内で有用である物質を提供する。この物質は、シートおよび臓器カプセル化等のような多くの形を取り得るが、好ましくは埋め込みを行う宿主とは異質である生きた細胞および組織のマイクロカプセル化に使用されるものである。またこの発明は、免疫性の細胞拒絶反応から、島細胞またはその他の移植された組織を保護する。またこの発明は繊維芽細胞の過形成を制限するマイクロカプセル化の方法を提供する。

またこの発明は、ＴＮＦ、ＩＬ−１およびＩＬ−６のようなサイトカイン類の生体内産生の抑制に作用する。したがってこの発明はそれ自体、敗血症、免疫拒絶反応、および炎症反応の処置のような目的のため、これらのサイトカイン類の産生を抑制する医薬品として有用である。

具体的にはこの発明は、完全にまたは実質上、グルロン酸からなり、完全にまたは実質上、マンヌロン酸を含有しないアルギン酸塩の外皮コーティングにより細胞またはその他の生物学的物質をカプセル化することに関する。またこれと同一のアルギン酸塩をさまざまな形で使用して、サイトカイン産生を抑制することができる。

［図面の簡単な説明］第１図はポリＭ、異種ＧＭＧＭポリマー、およびポリＧ−アルギン酸塩によるＴＮＦ誘発を示したグラフ、第２図はポリＭを併用しｔ；際のポリＧによるＴＮＦｌｔ発の減弱化効果を示したグラフ、第３図はポリＭ１異種Ｇ　Ｍ　Ｇ　Ｍポリマー、およびポリＧ−アルギン酸塩によるＩＬ−１誘発を示したグラフ、第４図はポリＭを併用した際のポリＧによるＩＬ−１誘発の減弱化効果を示したグラフ、第５図はポリＭ１異種Ｇ　Ｍ　Ｇ　Ｍポリマー、およびポリＧ−アルギン酸塩に　゛よるＩＬ−６誘発を示したグラフ、第６図はポリＭを併用した際のポリＧによるＩＬ−６誘発の減弱化効果を示したグラフである。

［発明の詳細な説明１この発明は、実質上、免疫製反応または繊維芽細胞の生成を誘発することなく、哺乳動物へ生体内で埋め込みまたは移植することができる物質を含む。この物質の重要なｌ用途は、マイクロカプセルのように生物学的物質をカプセル化することである。この発明はまた、薬物または生物学的物質の送達システムとして、埋め込みまたは移植に使用する生物学的細胞およびその他の物質をマイクロカプセル化する方法を提供する。本明細書で用いられる生物学的物質の語は、天然に存在し、もしくは遺伝子工学によって得られた厘核細胞および真核細胞、薬物または医薬品、酵素、ミトコンドリアおよびプロトプラストのような細胞の一部、またはその他、埋め込み得る任意の天然産または人工の物質等をいう。

この発明で使用する物質は、実質上、α−Ｌ−グルロン酸（Ｇ）（本明細書ではグルロン酸という）を含むアルギン酸塩である。また少量のマンヌロン酸（β− Ｄ−マンヌロン酸）ＣＭ）が存在する。少なくとも６５％またはそれ以上のＧ残基、好ましくは約８５％のＧ残基が存在し、１５％またはそれ以下のＭ残基が存在する。そのような組成をもつアルギン酸塩は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびＩＬ−１およびＩＬ−６を生産する単球から非常に低い応答しか引き出さず、その結果、繊維症は顕在化しない。

哺乳動物へ外来物質を移植しまたは埋め込むマイクロカプセルの作成に、この高Ｇ−アルギン酸塩を使用する。低Ｇ−アルギン酸塩のような少なくとも１層のポリアニオン型ポリマーの代わりに、高Ｇ−アルギン酸塩をマイクロカプセル膜に使用する。ｉＧ−アルギン酸塩は、内層、即ち内包された物質を取り巻く第１層として使用できる。ある種のマイクロカプセルでは、高Ｇ−アルギン酸塩は内包された物質を取り巻く唯一の層であり得る。またポリアニオン型ポリマーからなる第２層を、ゲル化した第１層を直接取り巻くか、あるいはポリカチオン型ポリマーからなる第２層を取り巻いて使用できる。別法としてポリカチオン型ポリマーまたは基底膜の何れかで作られた第１層を取り巻く第２層として、ポリアニオン型ポリマー層を使用することができる。好ましくはポリアニオン型ポリマーの最外層は高Ｇ−アルギン酸塩とする。またポリアニオン型ポリマーの任意の他の層も高Ｇ−アルギン酸塩で構成することができる。

マイクロカプセルを製造する方法は当業界既知であり、報告された例を下記に示す［例えばリムおよびサン、「マイクロエンカプシュレーティッド・アイレッツ・アズ・バイオアーティフィシャル・エンドクライン・パンクレアス」、サイエンス、１９８０年、２１巻、９０８頁、オー・シーアら、「プロロングド・サバイバル・オブ・トランスブランチイツト・アイレッツ・オブ・ランゲルハンス・エンカプシュレーティッド・イン・ア・バイオコンパティプル・メンプレイン」、バイオキミカ・工・バイオフイジカ・アクタ、１９８４年、８０４巻、１３３頁、グーセンら、「オプティマイゼーション・オブ・マイクロエンカプシュレーション・バラメーターズ；セミパーミアブル・マイクロカプセルールズ・アズ・ア・バイオアーティフィシャル・パンクレアス」、バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング、１９８５年、２７巻、１４６頁、サンら、「トランスプランテーション・オブ・マイクロエンカプシュレーティッド・アイレッツ・オブ・ランゲルハンス・アズ・ア・インスリン・プリバー・システム」、トピマウス・イン・ファーマシューティカル・サイエンシズ、１９８５年、９３頁、ツエら、「バイオコンパティビリティ−・アンド・イミュノロジカル・スタディーズ・オブ・マイクロエンカプシュレーション・クイズ・クロス−リンクド・アルジ不−ト・カブシュールズ」、トランスプランテーション、１９８２年、３３巻、５６３頁、サンおよびリム（１９８０年）、サイエンス、２１０巻、９０８〜９１０頁、ツアングら、米国特許第４６６３２８６号、ラーら、米国特許第４７４４９３３号（１９８８年５月１７日）］。これらを参考文献として本明細書に包含させる。

埋め込みまたは移植すべき物質を、最初にアルギン酸塩のような負の電荷をもった物質でコーティングし、上述のように、その周囲にゲル皮膜を作る。別法として、細胞物質を「マトリジェル」　（コラポレイティブ・リサーチ社、ベッド７オード、マサチューセッツ）のような組織基底膜でコーティングする。可溶化した組織基底膜は、プロテオグリカン、コラーゲン、およびラミニンおよび／またはインタフチンを含有している。「マトリジェル」の使用により、プロテオグリカンは選ばれた物質を細胞の内外へ移動させることができるマトリｌラスを作る。そのうえ組織基底膜の使用により、ゲル化と、そのあとの細胞を取り巻くゲル物質の再液化の必要性が解消される。しかも組織基底膜は細胞を支持する構造要素を提供し、増殖・分化等を含む多くの重要な細胞現象および細胞機能を媒介するものと信じられる。即ち、組織基底膜またはその対応物からなる細胞外マトリックスの構造要素をマイクロカプセル化した生物環境へ取り入れることによって、免疫的に隔離された島細胞の生存度および機能性は増強される。この環境は島の回復を増強するだけでなく、島細胞の長期生存度および機能にも好ましく作用する。好ましい態様では、組織基底膜として使用するプロテオグリカンの分子量は２０００００〜３０００００ダルトンの分子量を示す。

移植可能な物質を組織基底膜マトリックスまたはその対応物で被覆したのち、移植可能な物質を、次にポリーＬ−リジンのような正の電荷をもった物質でコーティングする。ポリーＬ−リシンをコーティング材料として使用することは当業界で既知であり、先に引用した多数の文献に報告されている。ただし分子量２００００以下のポリーＬ−リンンを使用することによって、繊維芽細胞生成の誘発を最小限にとどめることが特に有利である。別法として、キトサンのような正の電荷をもった多糖をコーティングの第２層として使用し得る。

第３のコーティング外層として、正の電荷をもった第２層を、上述のようにＧ残基を６５％以上、好ましくは８５％以上含有する高Ｇ含量のこの発明のアルギン酸塩層で被覆する。ただしマンヌロン酸残基をできるだけ最小にとどめ、アルギン酸塩中の対応するＧ残基を増大させることがこの発明によって期待され、これによって繊維症を一層減少させ得ることに注目すべきである。

この発明の生体内適用のため、高Ｇ含量を有するアルギン酸塩を含有する組成物を、臓器カプセル化、移植用アルギン酸塩ンート、中空繊維、マイクロカプセル、および対象組成物で作られた膜の形で使用し得る。

これらの知見にしたがい、この発明は、埋め込みまたは移植し得る任意の生物学的物質を被覆するコーティング材料として、ポリＧ−アルギン酸塩の使用を提供する。埋め込みまたは移植する物質としては、生きている組織、生きている細胞、活性炭、またはその他、免疫的に隔離された系内に移植すると有用である好適な大きさをもった任意の物質を含み得る。移植する物質は、好ましくは受容個体の体内へ移植すると生体内で機能し得る能力によって選ばれる。

生きｔ；細胞としては、インスリンを産生できるランゲルハンス島細胞、肝細胞または肝組織、および赤血球等を挙げることができるが、これだけに限定されるものではない。特にランゲルハンス島由来の島細胞のような細胞は、同時係属出願の特許出願第２３２３２８号にしたがい、または当業界で既知のその他の方法によって精製し得る。

マイクロカプセル中の高Ｇ−アルギン酸塩の有効性を試験するため、実験を行っｔ；。高Ｇ−アルギン酸塩を使用してマイクロカプセルを製造し、細胞反応を試験した。これらの反応を、高量−アルギン酸塩、主としてＭからなる連続ブロック（Ｍブロック）を有するアルギン酸塩、および主としてＧからなる連続ブロック（Ｇブロック）を有するアルギン酸塩等、各種の組成を有するアルギン酸塩によって惹起される反応と比較した。各種のアルギン酸塩に対する免疫応答をモニターする手段として、ＴＮＦ、ＩＬ−１，ＩＬ−６等を含む種々のサイトカイン類の誘発を試験した。

少なくとも高Ｇ−アルギン酸塩からなるｌ外層を有するマイクロカプセルでは、誘起される各種のサイトカイン類の量が最低であることが判明した（第１〜６図参照）。したがってそのようなマイクロカプセルは、生体によるマイクロカプセルへの免疫応答ヲ最小にとどめ得るはずであるから、哺乳動物の体内へ物質を埋め込みまたは移植するのに最も有効であり得る。

この発明で使用するアルギン酸塩は、当業界で既知の方法により　”調製することができる。例えばアルギン酸塩は、シグマ社（セントルイス、Ｍ○）、およびプロタンＡ／Ｓ　（ドラメン、ノルウェー）等をはじめ多数の代理店から商業的に入手することができる。ポリＧ−アルギン酸塩はプロタン社（ノルウェーまたはシアトル）から入手し得、あるいは天然供給源から物質の単離により、または文献上報告されている方法による化学的変換によって入手し得る。ある種のアルギン酸塩はＭ残基が比較的高く、この発明で使用するため低Ｍへ変換しなければならない。アルギン酸塩中のＭ濃度を低下させるのに使用できる方法の１例を以下の実施例に示す。

この発明の組成物のもう１つの用途は、ＴＮＦ、ＩＬ−１およびＩＬ−６のようなサイトカイン類の生体内産生を抑制することである。第２．４，６図に示したように、高Ｇ−アルギン酸塩はこれらのサイトカイン類の産生をいずれも抑制する。これらのサイトカイン類は、炎症反応、移植片拒絶反応、および敗血症等をはじめ、多くの疾患状態で役割を演じるが、これだけに限定されるものではない。したがってこの高Ｇ−アルギン酸塩組成物を投与して、そのような疾患状態を処置することかでさる。そのような処置に有用な高Ｇ−アルギン酸塩の濃度を第２．４．６図、および第１表に示し、実施例５および６で報告する。

実施例１アルギン酸塩標品藻類ラミナリア・ハイバーポレア（ＬＦ　Ｉ　Ｏ／６０、ロット番号ＢＬ５４１７３６８）から調製したグルロン酸残基６４％を含有する商業的なアルギン酸塩をプロタンＡ／Ｓ　（ドラメン、ノルウェー）から入手した。ポリミキシンーＢ −セファロース４Ｂ（ＰＢ−セフ４Ｂ）（７ア一マシア社、ウプサラ、スウェーデン）アフィニティー結合と透析用界面活性剤オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド０ＢＤＧ　（ングマ社、セントルイス、ＭＯ１米国）によるエンドトキンン蛋白解離との組み合わせを用いたカープラスらが報告した方法［「ア・二ニー・メソッド・フォア・リダクション・オン・ニンドトキシン・コンタミネーション・クロム・グロテイン・ソリューションズ」、ジャーナル・オン・イミュノロジカル・メソッズ、１９８７年、１０５巻、２１＋頁］により、アルギン酸塩中のＬＰＳ混入物を除去した。

簡単に説明すると、１％（ｗ／ｖ）ＯＢＣＤを１％（ｗ／ｖ）ＬＦＩＯ／６０溶液（ＮａＨＣ○、からなる溶出緩衝液（ｐＨ８，５）に溶解）へ添加し、室温で３０分間混合しｔ；。ＰＢ−セフ４Ｂ−ゲルおよび０ＢＧＤ／アルギン酸塩溶液の等容量を混合し、透析バッグ（ＭＷ１２−１４０００）へ移した。ついでバッグをリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）を満たした容器へ加え、室温で４８時間透析した。ついでＰＢ−セフ４Ｂ−ゲルを、２７５Ｏｒ−ｐ、ｍ、で１０分間（４℃ ）遠心により除去した。０．２％ＮａＣ１（ｗ／ｖ）をアルギン酸塩溶液へ加え、９６％エタノールでアルギン酸塩を沈殿させた。ついでアルギン酸塩を９６％エタノールで２回洗浄し、さらに９６％エタノールで１回洗浄し、もう一度ジエチルエーテルで洗浄したのち乾燥した。本明細書では、このアルギン酸塩をポリＧ−アルギン酸塩またはＧブロックーアルギン酸塩ト呼ぶ。

高Ｍ−および高Ｇ−アルギン酸塩、およびＭブロックおよびＧブロックを有するアルギン酸塩の細胞応答に対する効果を比較検討するため、各種の型のアルギン酸塩を下記のようにして得た。

Ｍブロック−アルギン酸塩［９５％Ｍ１重合度（ＤＰ、）＝３５１は、ハウクらが報告した方法［「コレレーション・ビトウィーン・ケミカル・ストラフチャー・アンド・フィジカル・ブロバティーズ・オン・アルジネーツＪ１アクタ・ケミ力・スカンジナビカ、１９６７年、２１巻、７６８頁１により、アスコフィラム・ノド−サム（Ａ、ノド−サム）の子実体の細胞内物質から単離したマンヌロン酸に富んだアルギン酸塩から得た。

Ｇ単位を８５％以上含有し、ＤＰ、＝４０であるアルギン酸塩断片（Ｇ−ブロック）はラミナリア・ジギタータから調製した。主として交互構造を有するアルギン酸塩断片、ＭＧ−ブロック（６３％Ｍ、ＤＰ、＝２５）は、ハウクらが報告した方法［［スタディーズ・オン・ザ・シーフェンス・オン・ウロニツク・アシッド・レシデューズ・イン・アルシニック・アシッドＪ、１９６７年、２１巻、６９１頁］によりアスコフイラム・ノド−サムから単離した。

グルロン酸残基含量が一層低い（４６％）アルギン酸塩試料は、ハウクらの報告のようにアスコフィラム・ノド−サムの組織から単離した。

モノマー組成および連続配列およびＤＰ、は、先にグラスダレンら［「ア・ｐ、ｍ、ｒ、・スタディ−・オン・コンポジション・アンド・ンークエンス・オン・ウロネート・レシデューズ・イン・アルジ不一ト」、カーポハイドレート・リサーチ、１９７９年、６８巻、２３頁１が報告したように、ブルーカー４００ＷＭスペクトロメーターを使用したｌＨ［磁気共鳴分光法により分析した。

精製または未精製のアルギン酸塩中のエンドトキシン含量はＬＡＬ−アッセイ（ツーテスト・エンドトキシン、カビ・ビトルム社、ストックホルム、スウェーデン）により定量した。

実施例２集球培養ポイムの報告［「セパレーション・オン・モノサイツ・アンド・リンホサイツ」、スカンジナビア・ジャーナル・オン・イミュノロジー、１９７６年、５巻、９頁１のようにヒトＡ＋血液バッフイーコート（ザ・ブラッドバンク、ユニバーンティー・オン・トロンヘイム、ノルウェー）から単球を単離した。単球を２４ウエルの培養プレート（コスタ−、ケンブリッジ、ＭＡ、米国）で、１％グルタミン、４０ｍｇ／ｍｌガラマイシン、および２５％Ａ−血清（ザ・ブランドバンク、ユニバージティー・オン・トロンヘイム）を添加したＰＲＭ１１６４０（ギブコ社、ペイズリ−１英国）からなる完全培地で培養した。

アルギン酸塩、Ｍ−ブロック、Ｇ−ブロック、およびＭＧ−プロ／りをＰ　Ｂ　Ｓ　ｆ：溶解し、０．２μｍフィルターにュークレポア社、プレザントン、ＣＡ、米国）で滅菌濾過した。市販の濾過していないアルギン酸塩は加圧により滅菌した。多糖溶液を完全培地で希釈して、これを単球へ添加し、１６〜２４時間のちに上清を回収した。工７ニリキア・コリ（０２６：０６株）由来のＬＰＳ　（シグマ社）、ｔたはｂ／１−３Ｄポリグルコース［ユニバージティー・オン・トロムセ−（ノルウェー）のＲ，セルジェルド教授から入手ｊを幾つかの集球培養へ添加した。

滅菌濾過したアルギン酸塩溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）　０　、５　ｍｌをウェルに添加することにより、アルギン酸塩ゲルを２４ウエルの培養プレート（コスタ− ）で作成した。ついでＯ，１Ｍ　ＣａＣ１２１ｍｌを添加し、１０分後にゲル上清を除いた。ついでゲルを食塩水１．５ｍｌで２回洗浄し、最後に完全培地で２回洗浄した。ヒｎｔ球を０．５ｘｉｏ’細胞／ウエルの濃度でアルギン酸塩ゲルへ加え、プレートを１６〜２４時間インキュベートしたのち、上溝を回収した。

実施例３単球からの上清中のＴＮＦ−σの検出測定エスペビノクらが報告したＴＮＦ−σ の繊維肉瞳細胞系ＷＥＨｒ１６４クローン１３に対する細胞毒効果［「ア・ハイツー・センシティ７゛・セル・ライン、ＷＥＨ１１６３クローン１３．７オ７・メジャーリング・サイトドキンツク・ファクター／ツモール・不りロンス・ファクター・クロム・ヒユーマン・モノサイツ」、イミュノロジカル・メンノズ、１９８６年、９５巻、９９頁］により、ＴＮＦ−αの量を測定した。組換え体ＴＮＦ−α（ｒ−ＴＮＦ−α、ジ工不ンテック社（サウス・サンフラッジスコ））の希釈液を標準として加えた。記録された活性を完全に中和するｒＴＮＦ−αに対する単クローン抗体によって、検定のＴＮＦ−α特異性を確かめた（データは示さない）。

実施例４単球からの上溝中のＩＬ−１の検出測定ＩＬ−１の量を２段階検定によって測定した。第１段階は、ヒトＩＬ−１に応答して高濃度のＩＬ−２（インターロイキン−２）を産生ずる、ゲーリングらが報告したマウス胸腺細胞ＥＬ−４Ｎ０Ｂ− １細胞系を使用する。ｒ−ＩＬＬ（グラキン、ジュネーブ、スイス）の希釈液を標準として使用した。ＣＯ２中で２４時間培養したのち、各上溝１００ｍ１ずつを重複９６ウエルの微量滴定板へ移した。検定の第２段階は、Ｔ、モスマンらが報告したＩＬ−２依存性マウスＴ細胞系ＨＴ−２を使用する［［ラピッド・カラリメトリック・アッセイ・フォア・セリュラー・プロウス・アンド・サバイバル：アブリケーンヨン・ツー・プロリフニレ−ジョン・アンド・サイトドキンシティ−・ア７セイズ」、ジャーナル・オン・イミュノロジー、１９８７年、１３９巻、４１１６頁１゜ＨＴ−２浮遊液（１，２ＸＩＯ’細胞／ｍｌ）　１００ｍｌを各ウェルへ添加し、さらに２４時間インキュベートした。ＩＬ−１活性をｒｌＬ−１ｂに対する２種の多クローン抗体により完全に中和した。測定を３回反復して、その結果を（ｐｇ／ｍｌ＋／−３，Ｅ、）で表した。

実施例５ＭＴＴ検定［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム・プロミド］を用いた生存率ＴＮＦ−α、ＩＬ−１，およびＩＬ−６検定における生存率を、モスマン（前掲）が報告したテトラゾリウム塩を使用する増殖および生存の比色検定で測定した。

第１図に示したように、３種の異なったアルギン酸塩組成物の、ＴＮＦ放出を誘発する単球誘発能について試験した。アルギン酸塩組成物は、ポリＧ−アルギン酸塩、１−４＝結合したβ−Ｄ−マンヌロン酸（Ｍ）と、そのＣ−５−エピマーであるα−Ｌ−グルロン酸（Ｇ）の直鎖状２成分系コポリマーからなる異種ＧＭＧＭアルギン酸塩、およびポリＭ（β−Ｄ−マンヌロン酸）−アルギン酸塩テある。第１〜６図では、上記の３種のアルギン酸塩物質をポリＧ１ＧＭＧＭ、およびポリＭで表す。第１．３．５図に示した異なった濃度で、各アルギン酸塩を、等濃度の単球を含有する組織培養培地に溶解した。第１図は、ポリＭおよびＧＭＧＭ−アルギン酸塩が、単球によるＴＮＦ産生を１ミリリツトル当たりＴＮＦ７０００〜１００００ピコグラムのオーダーで実質上誘発したのに対し、ポリＧ− アルギン酸塩は、ＴＮＦ産生をそれより２オーダー低い、即ちＴＮＦ約２００ｐｇ／ｍｌで誘発したことを示す。ＴＮＦは繊維芽細胞増殖のインデューサーであることが知られている。第３図は、単球によるＩＬ−１産土に関するこれに対応する結果を示す。第５図は、ｒＬ−６産土に関するこれＩこ対応する結果を示す。

第２図から分かるように、ポリＧは明らかに単球によるＴＮＦの産生を抑制する。第２図はポリＭおよびポリＭ＋ポリＧ　（ｌ　ｍｇ／ｍｌ）を単球培養に添加し、ＴＮＦ産土産生定した実験結果を示す。グラフから分かるように、ポリＭ〒ポリＧ試料はポリＭ単独より、実質上ＴＮＦ産生誘導が一層低い。即ちポリＧは極めて限定されたＴＮＦ誘発能を有するだけでなく、ポリＭ−アルギン酸塩による単球のＴＮＦ産生誘発能をも抑制するらしく、したがってポリＭ−アルギン酸塩の繊維症誘発を抑制することが考えられる。第４図は、これに対応する単球によるＩＬ−１産生誘発に関する結果を示す。第６図は、これに対応するＩＬ−６産生に関する結果を示す。

実施例６アルギン酸塩ゲル上の単球の増殖第１表はアルギン酸塩ゲル上で培養した単球からのサイトカイン放出を検討した実験結果を示す。組織培養プレート上の単球をゴム製ポリスマンで剥離し、ハンクスの平衡塩類溶液で一度洗浄し、これをアルギン酸塩ゲルを含有する培養ウエノ呟ＬＰＳを含有する培養ウエノ呟または増殖培地へ添加した。アルギン酸塩ゲルは前記と同様に作成した。１６〜２４時間後、上溝を回収し、ＴＮＦ、ＩＬ− ６、およびＩＬ−１について検定した。表から分かるように、６４％のＧ残基含量を有するＬＦ　Ｉ　Ｏ／６０で培養した単球は、４６％のＧ残基含量を有するアスコフィラム・ノド−サム（Ａ、ノド−サム）からのアルギン酸塩ゲルと比較して、ＴＮＦ、ＩＬ−１、およびＩＬ−６産土の誘発がそれぞれ実質上低かった。またＬＰＳは強いサイトカイン産生誘発能を示した。

［第１表］アルギン酸塩ゲル上で培養した単球からのサイトカイン放出処置　ＴＮＦ−α　ＩＬ−６ＩＬ−１（ｐｇ／ｍｌ）　（ｐｇ／ｍｌ）　（ｐｇ／ｍ１）ＬＦ−１ｏ／６０　７０００＋／−１１００１０９００＋／−１６００６４００＋／−１００アルギン酸塩ゲルＡ、ノド−サム　１５６００＋／−５３００１５２００＋／−２０００１６３００＋／−８００アルギン酸塩ゲルＬＰＳ（ｌμｇ／ｍｌ）　１２４００＋／−２６００２２２００＋／−５１００９６００＋／−９００増殖培地　５０＋／−１０７０＋／−２０９０＋／−１０実施例７ランゲルハンス島のマイクロカプセル化培養したラットのランゲルハンス島（培地０．２ｍｌ中に２ＸＩＯ’島）ヲ、１．５％（Ｗ／Ｗ）アルギン酸ナトリウムの生理食塩水溶液（粘度５１ａｐｓ）　２ｍｌに均一に懸濁させた。注射筒ポンプ／２２ゲージ注射針を通したエアジェツト押し出しにより、島を含有する球状の小滴を作り、これを１．５％（Ｗ／Ｗ）塩化カルシウム溶液に捕集した。上溝をデカントし、島を含有するゲル化した球状のアルギン酸塩小滴を希ＣＨＥＳ　（２−シクロへキシルアミノ−エタンスルホン酸）溶液および１．１％塩化カルシウム溶液で洗浄した。

上溝を吸引除去したのち、ゲル化した小滴を分子量１７０００を有する０、０５％（ｗ　／　ｗ　）ボリリンン溶液中で６分間インキュベートした。

上清をデカントし、ポリリシンカプセルを希ＣＨＥＳ、１．１％塩化カルシウム溶液、および生理食塩水で洗浄した。洗浄したポリリシンカプセルを０．０３％アルギン酸ナトリウム３０ｍ１で４分間インキュベートし、負の電荷を有するアルギン酸塩と正の電荷を有するボリリンンとの間のイオン交換により、最初のポリリシン膜上に外層のアルギン酸塩膜を生成させた。外層および内層コーティングに使用したアルギン酸塩は、前記のようにして作成したポリＧアルギン酸塩である。

得られたマイクロカプセルを食塩水、０．０５’Ｍクエン酸緩衝液で６分間洗浄し、内層のアルギン酸塩カルシウムを再液化し、さらにもう一度食塩水で洗浄した。マイクロカプセルは完全に球状を呈し、生存能力をもった島ｌ〜２個をそれぞれ含有していることが分かった。このマイクロカプセルは直径７００±５０μ ｍ１壁厚約５μｍであった。マイクロカプセルを栄養培地へ３７℃で懸濁した。

通常の当業者であれば、この発明がここに詳述した高細胞のようなカプセル化すべき特殊な生物学的物質、または具体的に説明したマイクロカプセルの他の内層による適用だけに限定されるものでないことは明白であろう。またこの発明は３層のマイクロカプセルだけに限定されるものではなく、この発明の高Ｇ含量のアルギン酸塩、および所望により低分子量のポリーＬ−リシン（２００００ダルトン以下）を使用した２層のカプセルにも同様に適用し得ることは容易に理解し得よう。添付した請求の範囲により、この発明の範囲０．０＋　０．１　’　＋　（測定せず）濃度（ｍｇ／ｍ１）０．０＋　０．１　１　（測定せず）濃度（ｍｇ／ｍｌ＞濃度（ｍｇ／ｒｎｌｌ濃度（ｍｇ／ｍｌ）濃度（■／ｍｌ）要約嘗物理的半透過性バリヤー内にカプセル化された物質を含む、免疫応答の発現を低下させる移植または埋め込み組成物を開示する。少なくとも、バリヤーの最外層が実質的にα−１−グルロン酸と少量のβ−１−マンヌロン酸からなるアルギン酸塩を含有する。さらに上記組成物の製造方法および用途も開示する。

補正音の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成４年６月４Ｈ回

Claims

【特許請求の範囲】

１．α−１−グルロン酸が５０％以上を占めるアルギン酸塩からなる物理的半透性バリヤー内にカプセル化された物質を含む、免疫応答の発現を低下させる移植または埋め込み組成物。
２．アルギン酸塩の少なくとも６５％がα−１−グルロン酸である、請求項１記載のバリヤー。
３．アルギン酸塩の少なくとも８５％がα−１−グルロン酸である、請求項２記載のバリヤー。
４．インスリンを産生できる精製した島からなる、請求項１記載の移植または埋め込み物質。
５．マイクロカプセル、中空繊維、および血管補機物からなる群から選ばれる、請求項１記載のバリヤー。
６．少量のβ−Ｄ−マンヌロン酸を含有する請求項１記載のアルギン酸塩。
７．少量のヒアルロン酸を含有する、請求項１記載のアルギン酸塩。
８．最外層がポリアニオン型ポリマーからなる、交互にポリアニオン型ポリマーおよびポリカチオン型ポリマーからなる層を含む、請求項１記載のバリヤー。
９．ポリアニオン型ポリマーがアルギン酸塩である、請求項８記載のバリヤー。
１０．ポリカチオン型ポリマーがポリ−Ｌ−リシンおよびキトーサンからなる群から選ばれる、請求項８記載のバリヤー。
１１．ポリ−Ｌ−リシンが１分子当たり２００００ダルトン以下の分子量を有する、請求項１０記載のバリヤー。
１２．少なくとも１層のアルギン酸塩で物質をコーティングし、上記アルギン酸塩の５０％以上がα−１−グルロン酸である、免疫応答の発現を低下させる態様で移植または埋め込み物質をカプセル化する方法。
１３．アルギン酸塩の少なくとも６５％がα−１−グルロン酸である、請求項１２記載の方法。
１４．アルギン酸塩の少なくとも８５％がα−１−グルロン酸である、請求項１３記載の方法。
１５．移植または埋め込み物質がインスリンを産生できる精製した島からなる、請求項１２記載の方法。
１６．バリヤーがマイクロカプセル、中空繊維、および血管補綴物からなる群から選ばれる、請求項１記載の方法。
１７．アルギン酸塩が少量のβ−Ｄ−マンヌロン酸を含有する、請求項１記載の方法。
１８．アルギン酸塩が少量のヒアルロン酸を含有する、請求項１記載の方法。
１９．最外層がポリアニオン型ポリマーからなる、バリヤーが交互にポリアニオン型ポリマーおよびポリカチオン型ポリマーからなる層を含む、請求項１２記載の方法。
２０．ポリアニオン型ポリマーがアルギン酸塩である、請求項１９記載の方法。
２１．ポリカチオン型ポリマーがポリ−Ｌ−リシンおよびキトーサンからなる群から選ばれるものである、請求項１９記載の方法。
２２．ポリ−Ｌ−リシンが１分子当たり２００００ダルトン以下の分子量を有する、請求項２１記載の方法。
２３．α−Ｌ−グルロン酸を少なくとも６５％含有する哺乳動物における生体内適用のためのアルギン酸塩組成物。
２４．α−Ｌ−グルロン酸を少なくとも８５％含有する、請求項２３記載のアルギン酸塩組成物。
２５．α−Ｌ−グルロン酸を少なくとも６５％含有するアルギン酸塩組成物を投与することを含む、サイトカイン類によって発症し、または増悪する疾患の処置方法。
２６．α−Ｌ−グルロン酸を少なくとも６５％含有するアルギン酸塩組成物を投与することを含む、ＴＮＦ、ＩＬ−１、およびＩＬ−６からなる群から選ばれるサイトカインによって発症し、または増悪する疾患の処置方法。
２７．アルギン酸塩組成物がα−Ｌ−グルロン酸を少なくとも８５％含有する、請求項２５または２６の何れか１項記載の方法。
２８．疾患状態が敗血症ショック、移植片拒絶反応、および炎症反応から選ばれるものである、請求項２５または２６の何れか１項記載の方法。
２９．α−Ｌ−グルロン酸を少なくとも６５％含有するアルギン酸塩組成物を投与することを含む、哺乳動物におけるサイトカイン類の生体内産生を抑制する方法。
３０．α−Ｌ−グルロン酸を少なくとも６５％含有するアルギン酸塩組成物を投与することを含む、哺乳動物におけるＴＮＦ、ＩＬ−１、およびＩＬ−６からなる群から選ばれるサイトカインの生体内産生を抑制する方法。
３１．アルギン酸塩組成物がα−Ｌ−グルロン酸を少なくとも８５％含有する、請求項２９または３０の何れか１項記載の方法。
３２．α−Ｌ−グルロン酸を少なくとも６５％含有するアルギン酸塩組成物を含む、哺乳動物におけるサイトカイン類の生体内産生を抑制する組成物。
３３．α−Ｌ−グルロン酸を少なくとも６５％含有するアルギン酸塩組成物を含む、哺乳動物におけるＴＮＦ、ＩＬ−１、およびＩＬ−６からなる群から選ばれるサイトカインの生体内産生を抑制する組成物。
３４．アルギン酸塩組成物がα−Ｌ−グルロン酸を少なくとも８５％含有する請求項３２または３３の何れか１項記載の組成物。
３５．哺乳動物におけるサイトカイン産生によって発症する炎症を抑制するため、α−Ｌ−グルロン酸を少なくとも６５％含有するアルギン酸塩組成物を使用する方法。
３６．哺乳動物におけるＴＮＦ、ＩＬ−１、およびＩＬ−６からなる群から選ばれたサイトカイン産生によって発症する炎症を抑制するため、α−Ｌ−グルロン酸を少なくとも６５％含有するアルギン酸塩組成物を使用する方法。
３７．アルギン酸塩組成物がα−Ｌ−グルロン酸を少なくとも８５％含有する、請求項３５または３６の何れか１項記載の方法。