DE2551576B2

DE2551576B2 - Traeger fuer immunochemische messungen

Info

Publication number: DE2551576B2
Application number: DE19752551576
Authority: DE
Inventors: Nobuhisa Omiya Saitama; Hashimoto Masakatsu Tokio; Ogawa (Japan)
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1974-11-16
Filing date: 1975-11-17
Publication date: 1977-11-10
Also published as: JPS5247012B2; NL180546C; NL180546B; DK513375A; GB1487698A; DK143045C; NL7513302A; FR2291496B1; US4062936A; CA1049404A; DE2551576C3; DK143045B; FR2291496A1; BR7507475A; JPS5157818A; DE2551576A1

Description

In den vergangenen Jahren wurde die Messung bioeisch aktiver Komponenten in einem lebenden Körper, wie Insulin, Wachstumshormonen, Prolactin, Gasirin, Nebennierenrindenhormone!!, Schilddrüsenhormonen, Angiotensin oder dergleichen, als wichtig für die Diagnose, Therapie und Verhinderung von . menschlischen Krankheiten oder zur Durchführung von verschiedenen Funktionstests angesehen. Die Folge ist, daß derartige Messungen nunmehr sehr häufig durchgeführt werden.

Da jedoch alle diese biologischen Komponenten in

ι sehr kleinen Mengen vorliegen, können sie nicht nach einer herkömmlichen chemischen Methode gemessen werden, vielmehr werden sie nach einer immunochemischen Methode gemessen, beispielsweise durch eine Radioimmunoanulyse, die nachfolgend als RIA bezeichnet wird. Diese Analyse ermöglicht eine außergewöhnliche Messung.

Die RIA-Methode eignet sich jedoch nicht zum Messen von Komponenten des menschlichen Körpers im Rahmen einer Routineuntersuchung in medizinischen Labors, da sie spezielle Instrumente erfordert, die unter Einsatz von Isotopen arbeiten, wobei die Bedienung dieser Instrumente schwierig und nicht sehr bequem ist.

Eine bekannte einfache Methode zur Messung von biologischen Komponenten im menschlichen Körper besteht darin, einen Träger aus Blutzellen, Polystyrollatex, Kaolinit, Betonit, Aktivkohle, kristallinem Cholesterin oder dergleichen mit einem Antigen oder Antikörper zu sensibilisieren und dann den Träger mit dem Antikörper oder Antigen in der Probe umzusetzen, wodurch eine immunochemische Agglutinierungsreaktion oder eine Agglutinierungsinhibierungsreaktion erfolgt. Eine Methode unter Einsatz von Blutzellen als Träger ist infolge ihrer hohen Empfindlichkeit besonders vorzuziehen. (Kabat and Mayer's, Experimental Immunochemistry, 2. Auflage, 2. Druck, Springfield, III, 1964, Seite 119-122).

Die Blutzellen, die als Träger für die vorstehend erwähnte immunochemische Messung eingesetzt werden, werden gewöhnlich aus Blutzellen hergestellt, die von verschiedenen Tieren ohne eine chemische Behandlung erhalten werden. Man kann auch auf Blutzellen zurückgreifen, die zuerst mit einem geeigneten Fixiermittel, wie Formaldehyd, Pyruvinaldehyd, Wasserstoffperoxyd oder dergleichen und dann mit einem Bindemittel, wie Gerbsäure, Bisdiazobenzidin, 1,3-Difluor-4,6-dinitrobenzol oder dergleichen, behandelt worden sind.

Die Tiere, aus denen die Blutzellen erhalten werden, sind im allgemeinen Säugetiere, beispielsweise Rinder, Pferde, Schafe, Kaninchen, Menschen etc., oder Vögel, beispielsweise Küken, Tauben, Truthähne oder dergleichen, man kann jedoch auch auf andere Tiere zurückgreifen, beispielsweise Reptilien, wie Krokodile und Schlangen, sowie Amphibien, wie Frösche etc., ferner auf Wassertiere, wie Delphine.

Die Blutzellen, die aus diesen Tieren erhalten werden, können in unbehandeltem Zustand verwendet werden, in den meisten Fällen werden jedoch fixierte Blutzellen, die mit den vorstehend geschilderten Fixiermitteln behandelt worden sind, verwendet, da nichtbehandelte Blutzellen in ihrer natürlichen Form eine schlechte Festigkeit besitzen und zu einer Hämolyse während mechanischer oder chemischer Behandlungen neigen.

Unter dem Begriff »Blutzellen« soll die Materialkomponente in dem Blut verstanden werden, die sich hauptsächlich aus roten Blutzellen zusammensetzt,

-owohl nichtbehandelte Blutzeilen, die keinerlei ^,Hliinn unterzogen worden sind, als auch die er-^Be. fixierten Blutzellen in Frage kommen. Die «,ahnten ^ _Bjutze,|_{en w}j_rcj d^n das scheinbare VoIu-M^enge ßiutzellen wiedergegeben, das beim Zentrifu^me"nvon Blut ermittelt wird.

^g ■ Blutzellen müssen mit dem vorstehend ei-•Siten Bindemittel behandelt werden, bevor sie als ^War verwendet werden. Es ist schwer. Antigene oder rkfiroer an Blutzellen zu binden, die nicht mit ■, Bindemittel behandelt worden sind. Auch dann, ,ie gebunden sind, läßt sich kein gleichmäßiges Zm erhalten, so daß es unmöglich ist, einen Träger «,innen er eine reproduzierbare Empfindlichkeit St Andererseits besitzen Blutzellen, die mit • pm Bindemittel behandelt worden si.id, ein ver-' "rtes Bindevermögen auf ihren Oberflächen, wo-Hnirh die Bindung an ein Antigen oder an einen Anti- IZ' erhöht wird, so daß ein Träger mit einer besse_n immunochemischen Agglutinierungsreaktion oder Solutinierungsinhibierungsreaktion erhalten wird. urrH beispielsweise Gerbsäure als Bindemittel bei der Durchführung von üblichen Methoden verwendet, S. wird eine Suspension von Blutzellen in einer Serlösung (Blutzellenkonzentration 2 bis 8%) mit einem gleichen Volumen einer Losung eines Bindern tels in der Pufferlösung vermischt, woraul beide Komponenten bei 37 bis 56C während einer Zeitname von 30 bis 60 Minuten reagieren gelassen werft Die Gerbsäurelösung besitzt gewöhnlich eine Konzentration von 1/20 000 bis 1/40 000. Die Angabe Ϊ/50 000 im Zusammenhang mit der Gerbsäurelösung hPdeutet daß 20 000 ml der Lösung durch Zugabe von U des gelösten Stoffes zu dem Lösungsmittel hergestellt worden sind. Aui weitere Fälle wird nachfolgend "weSerTSiutzellen mit Gerbsäure behandelt, dann

Ju

werden ungefähr 0,3 bis 2,5 mg Gerbsäure an 1 ml Blutzellen gebunden. Die Blutzellen besitzen eine Empfindlichkeit von ungefähr lOOng/ml bei der Messung von menschlichem Serumalbumin (nachfolgend als HSA bezeichnet) mit den Blutzellen als Träger. Dieser Empfindlichkeitsweit ist vergleichsweise hoch im Vergleich zu anderen Trägertypen als Blutzellen, beispielsweise kleinen Polystyrollatexteilchen. Dennoch ist dieser Wert nicht mehr als '/|₀ bis '/I₀₀₀₀ der Empfindlichkeit der RIA-Methode.

Daher ist es bei der Durchführung von immunochemischen Agglutinierungsreaktionen oder Agglutinierungsinhibierungsreaktionen unmöglich, eine Empfindlichkeit zu erzielen, die mit derjenigen einer RIA-Methode unter Einsatz eines herkömmlichen Trägers vergleichbar ist. Dies bedeutet mit anderen Worten, daß die Messung mit einer derartig hohen Empfindlichkeit einen neuen Träger erfordert.

Als stark empfindlicher und sehr spezifischer Träger für die Durchführung einer immunochemischen Messung sollte er folgende Eigenschaften besitzen: Wird der Träger mit einem Antigen oder Antikörper entsprechend der zu messenden Substanz sensibilisiert. dann kann eine geringe Menge Antigen oder Antikörper in einem lebenden Körper als biologische Komponente leicht eine immunochemische Reaktion mit dem Antikörper oder Antigen, mit welchem der Träger sensibilisiert worden ist, verursachen, so daß auf der Grundlage dieser Reaktion der sensibilisierte Träger eine vollständige Agglutinierungsreaktion eingeht. Für Hp.n Fall, daß die immunochemische Reaktion nicht stattfindet, tritt keine spontane Agglutinierungsreaktion ein.

Aufgabe der Erfindung ist die Schalung eines Trägers, der bei einer vereinfachten Messung von biologischen Komponenten unter Anwendung einer immunochemischen Agglutinierungsreaktion oder einer AggU'-tinierjngsinhibierungsreaktion eine hohe Empfindlichkeit und Spezifitäl wie im Falle einer Radioimmunoan.lyse ergibt.

Die Erfindung bezieht sich auf einen Träger für immunochemische Messungen, bestehend aus Blutzellen, an die Gerbsäure gebunden ist. Dieser Träger ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß die Gerbsäure in einer Menge von 30 bis 50Ü mg Gerbsäure pro ml der Bljtzellen gebunden ist.

Es wurde gefunden, daß durch Vermischen der Blutzellen mit einer großen Menge an Gerbsäure ein Träger aus Blutzellen erhalten wird, bei welchem 30 bis 500 mg Gerbsäure an 1 ml Blutzellen gebunden sind, wobei dieser Träger bei der Durchführung von immunochemischen Messungen ganz hervorragende Eigenschaften besitzt.

Der erfindungsgemäße Träger wird vorzugsweise in der Weise hergestellt, daß eine Blutzeilensuspension, -, die durch Suspendieren von Blutzcllen in einer Pufferlösung hergestellt worden ist, mit einer Gerbsäurelösung umgesetzt wird, wobei die Konzentrationen und das Mischungsverhältnis derart eingestellt werden, daß 30 bis; 500 mg Gerbsäure pro 1 ml der Blutzellen ;n gebunden werden.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Blutzellen können allen Typen entsprechen, die als Träger für herkömmliche immunochemische Messungen eingesetzt worden sind.

s-, 1st die Menge der an die Blutzellen gebundenen Gerbsäure geringer als 30 mg, dann kann der Trager nicht die gewünschte hohe Empfindlichkeit und Spezifität erreichen. Übersteigt sie 500 mg, dann ist die Agglutinierungswirkung des Trägers zu intensiv, um ₄₍₁ nach der nachfolgend geschilderten Methode kontrolliert werden zu können, so daß daher der Trager nicht mehr zur Durchführung einer immunochemischen Messung eingesetzt werden kann.

Vorzugsweise werden zur Umsetzung zwischen BIu t-,- zellen und Gerbsäure eine Blutzellensuspension, die ' 2 bis 4% Blutzellen in einer Pufferlösung enthalt, sowie eine Lösung von Gerbsäure in der gleichen Pu lerlösung mit einer Konzentration von 1/50 bis l/lüuu vermischt. Die Konzentration der Blutzellen in der -,„ Suspension, die Konzentration der Gerbsäure in der Gerbsäurelösung sowie das Mischungsverhältnis der Blutzellensuspension zu der Gerbsäurelösung werden dabei so gewählt, daß die erforderliche große Menge an Gerbsäure an die Blutzellen gebunden wird. v, Die Pufferlösung zur Suspendierung der Blutzeuen sowie zur Auflösung der Gerbsäure kann jede Pufferlösung sein, wie sie in herkömmlicher Weise zur Durchführung von immunochemischen Reaktionen eingesetzt wird. Bevorzugt verwendete Pufferlosungen sind im Anspruch 7 beschrieben.

Die Blutzcllen können mit der Gerbsaure bu Zimmertemperatur umgesetzt werden. Bessere Ergebnisse werden jedoch erhalten, wenn man auf eine Temperatur zwischen 37 und 56 C erhitz, dies ist der ubl.cl e

_ . . :„u .1^₁-;™ .»iiopmeinen hei der Uurcn-

fühTung von immunochemischen Verfahren eingehal-

^te dI" erfindungsgemäße Träger, der eine größere

Menge an Gerbsäure als übliche Träger festhäli, besitzt eine wesentlich gesteigerte Agglutinierungswirkung und vermag gleichzeitig eine größere Menge an Antigen oder Antikörper an sich zu binden als herkömmliche Träger.

Die Beziehung zwischen der Menge an Gerbsäure, die zur Behandlung von Blutzellen zugesetzt worden ist, und der Menge an Gerbsäure, die an die Blutzellen gebunden ist, geht aus der Tabelle I hervor.

Tabelle I

Menge an	Gerb-	üerbsäure, die	Bindungsgrad
säure, die	1 ml	an 1 ml Blut
Blutzellen	zuge-	zellen gebunden
setzt wird		ist
(mg)		(mg)	(%)
1		0,94	94,0
10		8,82	88,2
100		86,2	86,2
600		498	83,0

Die in der Tabelle I angegebenen Werte sind Gerbsäurewerte, die unter Verwendung von Folin-Denis-Reagens in Äthanolextrakten aus Blutzellen, die mit Gerbsäure behandelt worden sind, gemessen worden sind. Ungefähr die gleichen Werte werden durch Messen des Restgerbsäuregehaltes in der überstehenden Flüssigkeit nach dem Binden der Gerbsäure an die Blutzellen und Abziehen von der Ausgangsmenge an Gerbsäure erhalten. Aus dieser Tabelle geht hervor, daß der größte Teil der zugesetzten Gerbsäure an den Blutzellen gebunden ist, und zwar unabhängig von der Menge an Gerbsäure, die den Blutzellen zugesetzt wird.

Die Agglutinierungswirkung des Trägers selbst, die Agglutinierungswirkung, die dann ermittelt wird, wenn Rinderserumalbumin als Stabilisierungsmittel für ein Reaktionssystein zugesetzt wird, und die Agglutinierungswirkung eines ι rägers, der mit einem Anti-HSA-Antikörper sensibilisiert worden ist, wurden zur Durchrührung eines Vergleichs der herkömmlichen -, Träger mit dem erfindungsgemäßen Träger ermittelt. Die Agglutinierungswirkung eines Trägers selbst schwankt im allgemeinen mit dem pH-Wert, der lonenstärke etc. der Pufferlösung, in welcher der Träger suspendiert ist. In dem vorliegenden Beispiel werden

in Träger, an die verschiedenen Mengen Gerbsäure gebunden sind, in einer Phosphatpuffersalzlösung (pH 6,4 und Konzentration 0,067 Mol) mit einer Konzentration von 0,133% suspendiert, wobei 0,5 ml einer jeden Suspension in ein kleines Reagensglas eingefüllt und

ι-, 2Stunden stehengelassen werden, worauf die Agglutinierungswirkung des Trägers auf der Grundlage der Sedimentation am Boden des Reagenzglases ermittcii

wird.
Die Agglutinierungswirkung eines Trägers selbsl

in wird nach Zugabe eines Rinderserumalbumins als Stabilisierungsmittel für ein Reaktionssystem in der gleichen Weise wie in dem Fall gemessen, daß kein Serumalbumin vorliegt, mit der Ausnahme, daß eine Phosphatpuffersalzlösung, die 0,2%Rinderserum-

i-, albumin enthält, zum Suspendieren des Trägers verwendet wird. Die Agglutinierungswirkung eines Trägers, der mit einem Anti-HSA-Antikörper sensibilisiert'ist, wird in der gleichen Weise wie in Spalte 2 vor Tabelle II angegeben ist, mit der Ausnahme, daß ein

jo Träger verwendet wird, der mit einem Anti-HSA-Antikörper sensibilisiert ist. Die Kriterien für die Sedimentation auf dem Boden eines Reagensglases werder wie folgt festgelegt:

r, +++ sehr intensive positive Reaktion

++ intensive Reaktion

+ positive Reaktion

- negative Reaktion

4(i Die Ergebnisse sind in der Tabelle II zusammen gefaßt.

Tabelle II

Gerbsäure, die an
I ml Blutzellen
gebunden ist

(mg)

Spalte 1

Agglutinierungswirkung des Trägers
selbst

Spalte 2

Agglutinierungswirkung des
Trägers selbst mit Zusatz von
Rinderserumalbumin als
Stabilisierungsmittel für das
Reaktionssystem

Spalte 3

Agglutinierungswirkung des Trägers, der mit einem
Anti-HSA-Anti
körper sensibilisiert
ist

500

100

10

Die Tabelle U zeigt, daß der erfindungsgemäße Träger, an dem eine große Menge Gerbsäure gebunden ist, eine spontane Agglutinierungsreaktion bedingt, während die herkömmlichen Träger, an denen nur eine kleine Menge Gerbsäure gebunden ist* diese Wirkung nicht zeigt. Dies legt nahe, daß dann, wenn eine große Menge an Gerbsäure an die Blutzellen gebunden ist, eine bestimmte Veränderung der Oberfläche der Blut zellen erfolgt, die eine Erhöhung der Agglutinic rungswirkung des Trägers selbst bedingt.

Die Beziehung zwischen der Menge an Gerbsäure die an Blutzellen gebunden ist, und der Menge an Anti körper oder Antigen, der bzw. das an den Träger ge bunden ist, der wiederum mit Gerbsäure verbünde: ist, wurde untersucht.

Die Menge an Antikörper oder Antigen, der bzw

das an einen Träger gebunden ist, wird durch Bestimmung der Menge an Antikörper oder Antigen in der überstehenden Flüssigkeit nach der Sensibilisierung des Trägers mit Antikörper oder Antigen nach einer immunologischen Diffusionsmethode und Abziehen von der Anfangsmenge an Antikörper oder Antigen,

der bzw. das zum Zwecke der Sensibilisierung zugesetzt worden ist, ermittelt.

In dem vorliegenden Beispiel wird ein Kaninchen-Gammaglobulin bzw. HSA als Antikörper und Antigen verwendet.

Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle IiI hervor.

Tabelle III

Gerbsäure, die an 1 ml	Gebundener Antikörper	Gebundenes	Antigen (HSA), mg
Blutzellen gebunden ist	(Gammaglobulin), mg
	(5 mg Zusatz zu 0,2 ml	(2 mg Zusatz	zu 0,2 ml
(mg)	Blutzellen)	Blutzellen)

500

100

50

10

3,0(60%)
2,5 (50%)
1,9(38%)
0,6(12%)
0,4(8%)

Wie aus der Tabelle III hervorgeht, steigt mit zunehmender gebundener Menge Gerbsäure an dem Träger die an dem Träger gebundene Gammaglobulinmenge. Ein Träger, an dem 500 mg Gerbsäure pro 1 ml Blutzellen gebunden sind, bindet ungefähr 7,5mal soviel Gammaglobulin wie ein Träger, an dem 1 mg Gerbsäure gebunden sind. Im Falle von gebundenem Antigen ist die Situation ähnlich. Daraus ist zu schließen, daß der erfindungsgemäße Träger eine merklich gesteigerte Wirkung besitzt, Antikörper oder Antigen zu binden, und zwar im Vergleich zu herkömmlichen Trägern.

Ferner besitzt der erfindungsgemäße Träger den Vorteil, daß die hohe Agglutinierungswirkung und das ausgeprägte Vermögen, eine große Menge an Antigen oder Antikörper zu binden, je nach dem Anwendungszweck gesteuert werden kann. Eine derartige Steuerung läßt sich in sehr wirksamer Weise durch Anwendung der bekannten Methoden durchführen, beispielsweise bei der Sensibilierung eines Trägers mit einem Antigen oder Antikörper, um die Menge an Antigen oder Anti-

1,7(85%)
1,5(75%)
1,3 (65%)
0,7(35%)
0,3(15%)

körper zu steuern, ferner durch Zugabe von normalem Kaninchenalbumin, Rinderserumalbumin oder eines grenzflächenaktiven Mittels etc. als Stabilisierungsmittel für das immunochemische Reaktionssystem, durch eine Steuerung des pH-Wertes und der Ionenstärke des immunochemischen Reaktionssystems oder durch eine Kombination dieser bekannten Methode (vgl. die Tabelle II).

Der erfindungsgemäße Träger kann als Träger für Antigen oder Antikörper zur Durchführung von immunochemischen Agglutinierungs- und Agglutinierungsinhibierungsreaktionen eingesetzt werden. Wird beispielsweise HSA unter Einsatz des erfindungsgemäßen Trägers gemessen, dann ist eine Messung von HSA in einer Größenordnung von 100 pg/ml möglich. Dies bedeutet, daß die Empfindlichkeit der Messung um ungefähr das lOOOfache im Vergleich zu dem Einsatz herkömmlicher Träger verstärkt wird.

Die folgenden Versuche und Beispiele erläutern die Erfindung.

Versuch

2 ml Schafblutzellen, die mit Formalin fixiert worden sind, werden in 60 ml Phosphatpuffcrsalzlösung suspendiert. Die Suspension wird mit 60 ml einer Lösung von Gerbsäure mit verschiedenen Konzentrationen, gelöst in der Pufferlösung, vermischt, worauf die Mischung bei 56°C während einer Zeitspanne von 30 Minuten umgesetzt wird. Verschiedene Träger mit verschiedenen Mengen an gebundener Gerbsäure werden erhalten. Jeder der Träger wird in 60 ml der Pufferlösung suspendiert und dann mit einer Antikörpcrlösung vermischt, die in der Weise hergestellt wird, daß 60 mg eines Anti-HSA-Antikörpcrs (als Kaninchcngammaglobulin) in der Pufferlösung aufgelöst werden. Die Mischung wird bei 56'¹C während einer Zeitspanne von 30 Minuten umgesetzt, bis der Träger mit dem Anti-HSA-Antikörpcr scnsibilisicrt ist, Danach wird jeder der auf diese Weise erhaltenen scnsibilisicrtcn Träger mit 50 ml Pufferlösung gewaschen und ?.u einer l%igcn Suspension in einer PhosphatpufTcrsalzlösung formuliert, die 10% Rohrzucker, 0,1 % Rindcrscrumiilbumin und 0,02% normulcs Kaninchcn-

serum enthält.

0,1 ml einer jeden dieser sensibilisicrten Trägcrsuspcnsioncn werden in ein Rcagcnsglas mit einem Innendurchmesser von ungefähr 9 mm mit einem kugelförmigen Boden eingebracht und allmählich mit 0,3 ml der Phosphatpuffcrsalzlösung zur Gewinnung einer 0,25%igcn Suspension vermischt, worauf sich die Zugaben von 0,1 ml HSA-Lösungcn mit 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10, 20, 50 bzw. lOOng/ml USA anschließen. Nach einem Schütteln werden die Mischungen während einer Zeitspanne von 2 Stunden stehengelassen. Die Sedimentationsmuster, die sich am Boden der Reagensgläser entwickeln, werden beobachtet. Die Ergebnisse werden als negativ bzw. positiv eingestuft, je nachdem, ob ein Sedimentationsring gebildet worden ist oder nicht.

Die Tabelle IV zeigt die Ergebnisse der Empfindlichkeiten von verschiedenen Trägern bei IISA-Messungen, und zwar dargestellt als die minimalen Mengen an USA, die erforderlich sind, um positive Reaktionen zu bewirken.

Tabelle IV

Konzentration der Gerbsäurelösung,	Gerbsäure, die an	Blutzellen	■) (298)	Empfindlichkeit
die für die Behandlung der Blutzellen	1 ml	gebunden ist.	(103)	bei der HSA-Messung,
verwendet wird	(mg)	(29)
	500"	(10,4)	(ng/ml)
1/50	100	(0,96)	0,5
1/250	30	0,1
1/900	10	5,0
1/2500	1	20
1/30000		100

*) Die Werte in Klammern sind die tatsächlich gemessenen Werte.

Wie aus der Tabelle IV hervorgeht, wird das beste Ergebnis mit dem Träger erhalten, bei welchem 100 mg jo Gerbsäure an 1 ml Blutzellen gebunden sind. Dieser Träger besitzt eine ungefähr lOOOmal so große Empfindlichkeit wie ein herkömmlicher Träger, bei dem nur 1 mg Gerbsäure an 1 ml Blutzellen gebunden ist,

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Versuch 2

60 ml jeweüs einer der Trägersuspensionen, die nach der in Versuch 1 beschriebenen Weise hergestellt worden sind, werden mit einer Lösung von 6 mg eine:? jo Kombinationsproduktes aus 2,4-Dinitrophenol und Rinderserumalbumin (nachfolgend als DNP-BSA bezeichnet) in 60 ml Phosphatpuffersalzlösung vermischt. Die Lösung wird bei 56°C während einer Zeitspanne von 30 Minuten umgesetzt, bis der Träger mit DNP- j-, BSA sensibilisiert ist. Dann wird jeder der Träger mit 50 ml der vorstehend erwähnten Pufferlösung gewaschen und zu einer l%igen Suspension in der Phosphatpuffersalzlösung formuliert, die 10% Rohrzucker, 0,1 % Rinderserumalbumin und 0,02% normales Kanin- -to chenserum enthält.

Zuerst wird mit den sensibilisierten Trägern das maximale Verdünnungsverhältnis eines Antiserums, das für das Auftreten einer Agglutinierungsreaktion der Träger erforderlich ist, untersucht. .,-

Ein Anti-DNP-BSA-Antiserum wird in der Weise hergestellt, daß Freund'schcs Complete Adjuvant mit DNP-BSA nach einer herkömmlichen Methode vermischt und dabei ein Kaninchen immunisiert wird. Die Absorption des Serums mit BSA liefert ein Anti- ■„, serum, das eine Antikörperaktivität nur gegenüber DNP besitzt. Das Antiscrum wird mit 0,25% einer Salzlösung verdünnt, die 1 % BSA enthält, und zwar in der Reihenfolge des 1-, H)-, 20-, 50-, 100-, 200-, 300-, 400- und 500fachen. Dann werden 0,1ml der verdünntet Sera in ein Reagensglas gegeben, das 0,1ml jeweil einer der sensibilisierten Trägersuspensionen un< 0,3 ml Phosphatpuffersalzlösung enthält, worauf ge schüttelt wird. Nach einem Stehenlassen während eine Zeitspanne von 2 Stunden wird das maximale Verdün nungsverhältnis des Antiserums, das für das Auftretei einer Agglutinierungsreaktion der Träger erfordernd ist, bestimmt.

Dann werden einige Agglutinierungsinhibierungs systeme aus jedem der sensibilisierten Träger 2:usam mengesetzt, worauf das Antiserum bei dem maximalei Verdünnungsverhältnis bestimmt wird, das für di( Agglutinierungsreaktion erforderlich ist. Jedes de Systeme, das auf diese Weise erhalten wird, wird au seine Empfindlichkeit zur Durchführung einer DNP Messung untersucht.

Für jedes der Agglutinierungsinhibicrungsreaktions systeme werden 0,1 ml des erwähnten Antiserums mi maximaler Verdünnung in einem Reagensglas mi 0,1 ml einer DNP-Lösung vermischt, die 50, 100, 200 300, 500, 700 oder 1000 ng/ml DNP in einer Phosphat Puffersalzlösung enthält, der 0,1 ml der sensibilisierter Tragerlösung und 0,2 ml Phosphatpuffersalzlösung zu gesetzt worden sind. Nach einem Schütteln und Stehen lassen während einer Zeitspanne von 2 Stunden wire das Sedimentationsmuster, das sich auf dem Boder des Rcagensglases entwickelt hat, beobachtet. Fall: cm Sedimentationsring gebildet wird, wird das Ergeb ms als positiv eingestuft, während es als negativ be wertet wird, wenn sich kein Sedimentationsring ge bildet hat.

Die Empfindlichkeiten der Träger sind in de Tabelle V zusammengefaßt und werden als minimale Menge an DNP wiedergegeben, die für das Auttrctcr positiver Reaktionen erforderlich sind.

Tabelle V

Konzentration der (ierbsiiurclosung, die für die
behandlung von HIuI-zcllcn eingesetzt winl

1/50
I/250

(ierbsiiiire, die an I ml Hlutzullcn
gebunden isl,

(mg)

500
100

Maximales Verdünnungsverhiiltnis des Antiscrums,
(Ins l'iir tins Auftreten einer
Agglutinierungsreiiklion
erforderlich isl

limpfimllichkeit
bei der I)NI'-Messung,

(ng/ml)

100
100

Fortset/.uns

Konzentration der Gerbsäurelösung, die für die
Behandlung von Blut-/ellen eingesetzt wird

Gerbsäure, die an Maximales Verdünnung*- Empfindlichkeit

1 ml Blut/eilen
gebunden ist.

(mg)

verhältnis des Antiserums,
das für das Auftreten einer
Agglucinierungsreaktion
erforderlich ist

hei der DNP-Messung.

(ng/ml)

1/900 30 100 200

1/2500 10 50 1000

1/30000 I *)

*) Es erfolgt keine Agglutinierung, selbst wenn nichtverdünntes Serum verwendet wird.

Aus der Tabelle V geht hervor, daß herkömmliche Träger, an denen 1 mg Gerbsäure pro 1 ml Blutzellen gebunden ist, auch dann nicht agglutiniert werden können, wenn nichtverdünntes Antiserum verwendet wird, während der erfindungsgemäße Träger, an dem 100 mg Gerbsäure pro 1 ml Blutzellen gebunden sind, eine Agglutinierungsreaktion mit einem Antiserum zu bewirken vermag, das um das 300fache verdünnt worden ist.

Die erfindungsgemäßen Träger besitzen eine 5- bis lOmal größere Empfindlichkeit bei der Messung als die herkömmlichen Träger.

Aus diesen Versuchen geht hervor, daß die Verwendung des erfindungsgemäßen Trägers zur Durchführung einer immunochemischen Agglutinierungsinhibierungsreaktion eine starke Vervielfachung der Verdünnung des Antiserums im Vergleich zu einer Verwendung von herkömmlichen Trägers ermöglicht, so daß Messungen mit einer höheren Empfindlichkeit möglich sind, bei denen Antiseren mit einem derart niedrigen AntikÖrpergchalt verwendet werden können, welcher bisher für eine Messung unmöglich war.

Beispiel 1

30 ml Schafblutzellen, die mit Formalin fixiert worden sind, werden mit 300 ml Phosphatpuffcrsalzlösung gewaschen und dann in einer Pufferlösung suspendiert, wobei das Gesamtvolumen der Lösung auf 900 ml eingestellt wird. Die Suspension wird mit 900 ml einer Gerbsäurclösung mit einer 1/300-Konzentralion, gelöst in der gleichen Pufferlösung, versetzt, worauf die Mischung bei 56 C wahrend einer Zeitspanne von 30 Minuten umgesetzt wird. Nach der Reaktion wird der Träger jeweils zweimal mti 600 ml der Pufferlösung gewaschen. Der Träger, der zur Durchführung dieses Beispiels eingesetzt worden ist. enthält ungefähr 90 mg Gerbsäure pro 1 ml Blutzöllen in gebundener f'Orm.

Ii c i s ρ i c I 2

50 ml Kiikenbliit/.cllcn, die mit Pyruvinaldehyil fixiert worden sind, werden lOtnal mil der physiologischen Salzlösung gewaschen und dann in HKK) ml dieses Lösungsmittels suspendiert.

Dieser Blulzcllcnsusncnsion werden 2(XK) ml einer Gerbsäurelösung mit einer 1/3.50-Konzcntralion zugcmischl, worauf die Mischung bei 25"C während einer Zeitspanne von 60 Minuten umgesetzt wird. Nach der i wird der Trauer mil KKHl ml des Lösungsmittels gewaschen. Der Träger, der zur Durchführung dieses Beispiels eingesetzt wird, weist in gebundener Form ungefähr 100 mg Gerbsäure pro 1 ml der Blutzellen auf.

Beispiel 3

50 ml Kaninchenblutzellen, die nach einer Behandlung mit Wasserstoffperoxyd fixiert sind, werden mit 500 ml einer Boratpuffersalzlösung gewaschen und dann erneut in der Pufferlösung suspendiert. Die Suspension wird mit 1500 ml einer Gerbsäurelösung mit einer 1/500-Konzentration, gelöst in der gleichen Pufferlösung, vermischt, worauf die Mischung bei 56 C während einer Zeitspanne von 45 Minuten umgesetzt wird. Nach der Umsetzung wird das Produkt mit KK)O ml der Pufferlösung zur Gewinnung eines Trägers gewaschen. Der Träger dieses Beispiels weist ungefähr 50 mg Gerbsäure pro 1 ml Blutzellen auf.

Beispiel 4

30 ml nichtbehandelter Rinderblulzellen werden mit 500 ml Veronalpufferlösung gewaschen, worauf die Blutzellen zentrifugiert werden. Die Blutzellen werden in einer Gerbsäurelösung suspendiert, die durch Auflösen von 1 g Gerbsäure in 1000 ml der Pufferlösung hergestellt worden ist, worauf die Suspension bei 37 C während einer Zeilspanne von 30 Minuten umgesetzt wird. Nach der Reaktion wird das Produkt mit der Pufferlösung zur Gewinnung eines Trägers gewaschen.

Der Träger dieses Beispiels weist ungefähr 30 mg Gerbsäure pro I ml Blutzellcn auf.

Beispiel 5

20ml Rindcrhlut/.cllcn, (lic mil Wasserstoffperoxid fixiert worden sind, werden mit 300 ml Phosphatpullersal/.lösung gcwascher· and dann in der Pufferlösung suspendiert, wobei das Gesamtvolumen der Lösung auf 6'(K) ml eingestellt wird.

Die Hlul/.ellcnsuspcnsion wird mit einer Lösung von Gerbsäure mit einer l/50-Konzentration, gelöst in der Pufferlösung, vermischt. Die Mischung wird bei 56 (' während einer Zeitspanne von 30 Minuten umgesetzt. Nach der Reaktion wird das Produkt mit der Pufferlösung zur Gewinnung eines Trägers gewaschen. Der Träger dieses Beispiels enthüll ungefähr 5(K) mg Gerbsäure pro I ml Blul/ellen.

Wie vorstehend erwähnt worden ist, besitzt der erimdunnsyemiil.le Träger für miiiiunodicmisihe Mcs sungen eine höhere Empfindlichkeit und eine höhere

Spezifität als herkömmliche Träger, so daß er ohne weiteres eine immunochemische Reaktion auslöst, und zwar auch dann, wenn die Menge der biologischen Komponenten sehr gering ist. Ferner bedingt er, aufgrund dieser Reaktion, eine vollständige Agglutinie-

rungsreaktion. Daher erleichtert die Verwendung c erfindungsgemäßen Trägers die Messung von bioli sehen Komponenten, so daß er von sehr hohem me zinischen Wert ist.

Claims

Patentansprüche:

1. Träger tür immunchemische Messungen, bestehend aus Blutzellen, an die Gerbsäure ge'bunden ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Gerbsäure in einer Menge von 30 bis 500 mg Gerbsäure pro ml der Blutzellen gebunden ist.

2. Verfahren zur Herstellung eines Trägers nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Blutzellensuspension, die durch Suspendieren von Blutzellen in einer Pufferlösung hergestellt worden ist, mit einer Gerbsäurelösung umgesetzt wird, wobei die Konzentrationen und das Mischungsverhältnis derart eingestellt werden, daß 30 bis 500 mg Gerbsäure pro 1 ml der Blutzellen gebunden werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzten Blutzellen aus verschiedenen Tieren in nicht behandeltem Zustand erhalten worden sind.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzten Blutzellen, die aus verschiedenen Tieren erhalten worden sind, mit einem geeigneten Fixiermittel fixiert worden sind.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Fixiermittel Formaldehyd, Pyruvinaldehyd oder Wasserstoffperoxid verwendet wird.

6. Verfahren nach einem der Anspüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine Blutzellensuspension mit einer Blutzellenkonzentration von 2 bis 4% in einer Pufferlösung mit einer Lösung vermischt und umgesetzt wird, die Gerbsäure in Lösung in der gleichen Pufferlösung in einer Konzentration von 1/50 bis 1/1000 enthält.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete Pufferlösung aus einer Phosphatpufferlösung, einer physiologischen Salzlösung, einer Boratpuffersalzlösung oder aus einer Veronalpufferlösung besteht.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß eine Reaktionstemperatur zwischen 37 und 56⁰C eingehalten wird.

9. Reaktionssystem für eine immunochemische Messung, bestehend aus einem Träger, der mit einem Antigen oder Antikörper sensibilisiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein Träger gemäß Anspruch 1 ist.

10. Reaktionssystem nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß er der jeweiligen Messung durch Zugabe eines Stabilisierungsmittels angepaßt ist.

11. Reaktionssystem nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich dem Meßzweck durch Steuerung seines pH-Wertes angepaßt ist.

12. Reaktionssystem nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich dem jeweiligen Meßzweck durch Steuerung seiner lonenstärke angepaßt ist.

13. Verwendung des Reaktionssystems nach Anspruch 9 zur Durchführung einer immunochemischen Agglutinierungs- oder Agglutinierungsinhibierungsreaktion mit einer Testprobe, welche die zu messenden biologischen Komponenten enthält.