DE2639180A1

DE2639180A1 - Verfahren zur herstellung einer endogenen, morphinaehnlichen verbindung und nach dem verfahren hergestellte verbindung

Info

Publication number: DE2639180A1
Application number: DE19762639180
Authority: DE
Inventors: Sidney Spector
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1976-04-07
Filing date: 1976-08-31
Publication date: 1977-10-20
Also published as: CA1070613A; JPS52122613A; US4042682A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer endogenen, morphinähnlichen Verbindung sox-jxe die nach dem Verfahren hergestellte, endogene, morphinähnliche Verbindung.

Wechselwirkungen von Drogen mit Geweberezeptoren werden als hochspezifisch angesehen, und pharmakologisch. aktive Substanzen üben Hire biologischen Effekte durch Wechselwirkung mit diesen Geweberezeptoren bzw. Geweberezeptorplätzen

aus. Eine sehr spezifische Wechselwirkung ist die Immunreaktion. Die Wechselwirkung von Antikörpern mit einem Proteinantigen ist sehr komplex, da jedes Antigenmolekül zahlreiche bestimmende Gruppen besitzt, mit denen der Antikörper eine Bindung eingehen kann. Wegen ihres geringen Molekulargewichtes ergeben Drogen im allgemeinen keine Antikörper, jedoch können sie bei der Paarung mit Trägerproteinen so umgewandelt werden, daß sie als HaIbantigeneinheiten wirken. Einige der auf diese Weise gebildeten Antikörper erkennen verschiedene Teile der Halbantigengruppe. So sollte es möglich sein, Antikörper zu entwickeln, welche eine dem Rezeptor sehr stark ähnelnde bestimmende Komplementarität besitzen. Die Antikörper könnten dann verwendet werden, um den endogenen Liganden für den Rezeptor zu binden.

Es gibt beträchtliche Hinweise dafür, welche es nahelegen, daß die analgetischen Effekte, welche, durch die Opiate erzeugt werden, über diskrete, funktioneile Rezeptoren vermittelt werden. Diese Hinweise umfassen die strengen, sterisehen Erfordernisse, welche für eine analgetische Aktivität erforderlich sind, die Fähigkeit von iTaloxon, den schmerzunterdrückenden Wirkungen aller strukturell verschiedenen Opiate entgegenzuwirken, die neuerliche

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Demonstration von gesättigten, stereospezifischen Bindungsplätzen . für Opiate honer Affinität im Nervengexvebe, welche durch Naloxon blockiert werden können, und eines Peptids mit morphinähnlichen Eigenschaften.

Die Annahme ist daher vernünftig, daß Jede Substanz mit morphinähnlichen, biologischen Eigenschaften zumindest in einem gewissen Ausmaß strukturelle Ähnlichkeiten mit Morphin haben sollte. Damit das Molekül einen Effekt aus-, üben kann, muß es zuerst mit dem Rezeptor eine Bindung eingehen oder in Wechselwirkung treten. Daher gibt es ein Erkennen des Primärmuskels (Agonist) durch den Rezeptor. Antikörper wurden bereits beschrieben, siehe Spector und Parker, Science, 16>8( 1970) , S. 134-7, gegenüber dem HaTbantigenniolekül Morphin durch Paarung hiervon an den Proteinträger Rinderserumalbumin (RSA). Die durch dieses Immunogen gebildeten Antikörper erkennen verschiedene, bestimmende Teile des Morphinmoleküls spezifisch, siehe Spector, J. Pharmacol. Exp. Ther. Λ70. (1971"),-Nr. 2, S.253.

Es wurde nun gefunden, daß die Isolierung einer endogenen Substanz mit morphinähnlichen, biologischen und immunologischen Eigenschaften aus Säugetiergehirngewebe möglich ist. Diese morphinähnliche Verbindung (MLC) kann aus dem Gehirn von verschiedenen Arten durch Verwendung von für Morphin spezifischen Antikörpern extrahiert werden, z. B. aus Methanolextrakten von Gehirngewebehomogenaten unter Verwendung von für Morphin spezifischen Antikörpern, welche durch ein Carboxymethylmorphinimmunogen erzeugt wurden. MLC bindet an diese Antikörper, und die erhaltene Paarung aus MLC-Antikörper kann aus der Gewebeextraktlösung durch lällung mit Ariimoniumsulfat abgetrennt werden. Die Trennung des MLC von dem Antikörper kann in einfacher Weise durch

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Denaturierung- des Proteins durch Hitze und anschließende Ultrafiltration der Lösung durch ein Filter mit einer Grenzschwelle für ein Molekulargewicht von 100Q erreicht werden. Das MLC- findet sich in dem Piltrat.

MLC zeigt in immunologischen, chemischen und chromatografischen Untersuchungen große Ähnlichkeiten zu Morphin. Die Verbindung besitzt biologische Aktivität, da sie die elektrisch induzierten. Kontraktionen von" sowohl Meerschweinchenileum als auch Mäuse-Samenleitergefäßen inhibiert, wobei diese Inhibierung jedoch durch/Haloxon oder Naltrexon nicht umgekehrt wird.

Methanolextrakte von Homogenaten von diskreten Bereichen wurden auf die Anwesenheit von MLC unter Anwendung einer radioimmunologischen Untersuchungsmethode getestet, wobei letztere auf der Konkurrenzreaktion mit ^H-Dihydromorphin zur Bindung an Morphinantikörper basierte.· Wie sich aus den aus der folgenden Tabelle I zusammengefaßten Ergebnissen ersehen läßt, besitzt MLC eine diskrete Verteilung sowohl in Katzengehirn als auch in Kaninchengehirn.

	Tabelle	I	10 (10)	und Katzen
Verteilung von MLC	im Gehirn von Kaninchen	4 (2)	Katze ng/g
Gehirnbereich	Kaninchen ng/g	3 (9)	24 t 7 (5)
Caudate	*DD -*	3 (4)	12 t 6 (3)
Hypo uhalmus	14 t	1 (3)	14 t 4- (5)
Cerebellum	■12 ±	1 (2)	5 t 2 (3)
Hippocampus	8 t	1 (5)	2,7 t 1 (3)
Mittelhirn	4t
Pons und Medulla	4t	1.5 t π.7 ro)
Cortex	2t

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Die verschiedenen Bereiche des Gehirns wurden in drei Volumina von eiskaltem Methanol, wie bei den Methoden "beschrieben, homogenisiert. Eine gleiche Teilmenge der überstehenden Flüssigkeit wurde dann auf ihre Fähigkeit untersucht, die Bindung von ^H-Dihydromorphin an Morphinantikörper zu inhibieren. Die Daten wurden als Morphinimmunoäquivalente angegeben. Die Anzahl der einzelnen Bestimmungen Ist in Klammern aufgeführt.

Beim Kaninchen enthielt das Caudate die höchste Konzentration an Morphinimmunoäquivalenten, nämlich 33 ng/g Gewebe; der Hypothalmus und das Cerebellum enthielten annähernd gleiche Konzentrationen von 14- bzw. 12 ng/g, und der Hippocampus 8 ng/g. Der Cortex enthielt die geringsten Mengen mit annähernd 2 ng/g. Ähnliche Verteilungen wurden im Katzengehirn erhalten. Die MLC-Aktivität war ebenfalls In Gehirnen von Meerschweinchen, Ratten, Schweinen und Rindern vorhanden.

Um die Möglichkeit auszuschalten, daß die MLC-Aktivität eine Folge einer Wechselwirkung zwischen dem markierten Dihydromorphin und MLG war, wodurch die Reaktion der markierten Verbindung mit dem Anitkörper verhindert worden wäre, wurden zusätzliche Untersuchungen durchgeführt. Solche Untersuchungen zeigten, daß MLC plus nicht-radioaktivem Morphin eine zusätzliche Inhibierung bei der radioimmunologischen Untersuchung ergab, die von der Reihenfolge der Zugabe unabhängig war. Dies wäre jedoch nicht zu erwarten gewesen, falls MLC mit dem markierten Dihydromorphin eine Bindung eingehen würde, so daß diese Möglichkeit ausgeschlossen ist.

Eine weitere Möglichkeit für eine andere Erklärung der beobachteten Aktivität von MLC wäre, daß MLC an das *

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Serumprotein in nicht spezifischer Weise absorbiert und dann mit dem Ammoniumsulfat ausgefällt worden wäre. Fm diese Möglichkeit zu untersuchen, wurde TItC mit normalem Serum bei Abwesenheit von für Morphin spezifischem Antikörper inkubiert. Unter diesen Bedingungen enthielt die nach der Ausfällung mit Ammoniumsulfat erhaltene Probe kein MLC.

Da Morphin mit dem ESA zur Bildung' des Immunogens gepaart war, bestand die Möglichkeit, daß die endogene Substanz an dem Teil des Antikörpers gebunden war, der der Erkennungsplatz für das ESA war. Diese Möglichkeit wurde jedoch dadurch ausgeschlossen, daß gezeigt wurde, daß andere Halbantigene wie Reserpin, Melatonin und Propranolol ebenfalls an ESA kuppelten und ein Antigen ergaben, das nicht mit MLC in Wechselwirkung trat. Es ist von Interesse, daß Antikörper für Ivaloxon, einen spezifischen Antagonisten für Morphin, mit MLC reagierten. Jedoch war die Konzentration, ausgedrückt in ITaloxon-immunoäquivalenten siebenmal geringer als diejenige, die in Morphineinheiten erhalten wurde.

Diese Ergebnisse legen es nahe, daß MLC den radioimmunologischen Versuch hemmt, und zwar durch Konkurrenzreaktion für Bindungsplätze, welche für Morphin spezifisch sind, auf dem. Antikörper.

Methoden

Die Methode der Seinigung der morphinähnlichen Verbindung (MLC) war wie folgt:

Die verschiedenen Bereiche des Gehirns von Kaninchen und Katzen wurden in drei Volumina von eiskaltem Methanol, das 10 M.Ascorbinsäure enthielt, mit einem Homogenisator aus

Polytetrafluoräthylen (Teflon), der auf 4- ⁰C gehalten war, für 30 bis 4-5 Minuten homogenisiert. Jede Probe würde dann

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bei 4- °C in einer Zentrifuge (Beckman RC2-B) "bei 30 000 X g für 45 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde sorgfältig entfernt, mit drei Volumina an doppelt destilliertem. Wasser verdünnt und dann lyophilisiert. Die getrocknete Probe wurde in einem Volumen Wasser, 1.0 bis 20 % ihres ursprünglichen Methanolvolumens, aufgelöst, und eine gleiche Teilmenge vmrde" auf m-orphinähnliche Aktivität untersucht, indem ihre Fähigkeit festgestellt wurde, mit Dihydromorphin für spezifische Bindungsplätze auf Antikörpern in Konkurrenzreaktion zu treten, wobei diese Antikörper in Kaninchen gegen Carboxymethylmorphinimmunogen erzeugt worden warenDie Konzentration an morphinähnlicher Verbindung (MLC), ist als Morphinimmunäquivalente ausgedrückt. Diese wurden bestimmt, indem das Ausmaß der Inhibierung der Bindung von -%-Dihydromorphin, welche durch nicht-radioaktives Morphin hervorgerufen v/urde, mit dem Ausmaß der Bindung, welche durch MLG hervorgerufen wurde, verglichen -wurde. Im Anschluß an. die Bestimmung der MLC-Konzentration in dem Methanolextrakt wurde Morphinantiserum zu der wieder aufgelösten Probe in einer Menge hinzugegeben, welche das 10-fache der erforderlichen Menge zur Bindung von 50 % des MLC war. Diese Menge an Antiserum war in- der Lage, die gesamteMLC-Aktivität zu binden. Normales Kaninchenserum wurde dann hinzugegeben, um eine Endserumkonzentration von 15 % zu erreichen, und die Lösung x^urde über Nacht bei 4 ⁰C inkubieren gelassen. Ein gleiches Volumen an gesättxgtem Ammoniumsulfat wurde hinzugegeben, wie dies von Farr, J. Infect. Dis. 105 (1958), S. 239 beschrieben ist, und die Lösung xifurde kräftig geschüttelt und 30 Minuten bei 4 ⁰C stehengelassen. Dies führt zur Ausfällung des Antikörper-MLC-komplexes zusammen mit Globulinen. Nach dem Zentrifugieren bei 13 000 X g bei 4 ⁰C vrährend 30 Minuten wurde die überstehende Flüssigkeit verworfen. Die Frobe (Rückstand) wurde einmal mit 50 % gesättigten Ämaoniuasulfat gewaschen, bei 13 000 X g bei 4 -⁰C während

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30 Miauten zentrifugiert und dann erneut in einem Volumen von destilliertem Xiasser, das 5 bis 10 % des ursprünglichen Volumens des Methanols ausmachte, suspendiert. Die Suspension wurde dann in Schläuchen dialysiert, die einen Schwellenwert von Molekulargewicht 3000 besaßen. Dies wurde unter kräftigem Rühren gegenüber 2000 Volumina an destilliertem Wasser bei Zimmertemperatur während 2 Stunden durchgeführt. Das Material in dem Dialyseschlauch wurde in ein Reagensglas überführt, das dann in siedendes-Wasser für 5 Minuten eingetaucht wurde. Der durch Hitze ausgefällte Antikörper wurde von dem löslichen MLC durch Zentrifugieren bei 30 000 X g bei 4- ⁰G während 4-5 Minuten abgetrennt. Die überstehende Flüssigkeit wurde dann durch ein ΙΠί-2-Filter (Schwellenwert vom Molekulargewicht 1000), das zuvor mit 50 ml destilliertem Wasser gewaschen worden war, unter einem Stickstoff druck von 3 Atmosphären bei 4- C filtriert. Das Piltrat wurde entweder sofort verwendet oder lyophilisiert und bei 4- ⁰C gelagert. .Von der in den anfänglichen Methanolextrakten gemessenen Gesamtaktivität >-urden zwischen 60 und 75 % in der Endstufe der Reinigung wie d er gexionnen.

Zur Bestimmung der Verteilung von MLG im zentralen Nervensystem wurden Rohmethanolextrakte ohne irgendwelche zusätzliche Reinigung untersucht. Die Konzentrationen wurden unter Verwendung einer Standardkurve berechnet, welche in Anwesenheit einer gleichen Menge an Methanol erhalten worden war. Untersuchungen der physikalischen und chemischen Eigenschaften von MLG wurden an Material durchgeführt, das durch den gesamten Extraktionsvorgang erhalten worden, war. Bei den Versuchen unter Einschluß der Wirkungen von Peptidasen wurde die Lösung anschließend in siedendem Wasser für 10 Minuten angeordnet, um die Enzymaktivität vor der

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radioimmunologischen Untersuchung zu zerstören. Im. Anschluß an das Imkubieren mit Oxidationsmitteln wurde .ein Überschuß von KpSJj^- zugesetzt, um überschüssiges Oxidationsmittel zu zerstören.

Pur chromatografische Untersuchungen wurden MLC und Morphin auf Kieselerdegel-Dünnschichtplatten getrennt als Flecken aufgetragen und gemeinsam chromatografiert. Sie wurden in vier verschiedenen Lösungsmittelsystemen'entwi kelt, n-Butanol-Essigsäure-Vasser (4:1:1), Chloroform-Aceton-Diäthylamin (5:4:1), Ohloroform-Diäthylamin (9:1) und n-Butanol-Benzol-Iiethanol-Wasser (1-5:10:60:15)- Hach dem Trocknen in einem x^armen Ofen wurde jedes Chromatogramm unter UV-Licht und durch Anfärben mit einem Eisen(IIl)-chlorid-Eisen(III)-cyanid-gemisch, einem Phenolreagens, analysiert.

Die biologischen Untersuchungen wurden sowohl an Me er-

schweinchen-Ileum als auch an Mäuse-Samenleitergefäß durchgeführt. Das Ileum des Meerschweinchens wurde montiert und durch transmurale, elektrische Reizung stimuliert, wie von Paton, Br. J. Pharmacol. IJ_- (1957), S. 119, beschrieben, wobei die intraluminale Elektrode als Anode benutzt wurde. Rechteckstrompulse von 0,2 msec Dauer und von ausreichender Stärke, um ein maximales Ansprechen gegenüber einem Einzelschock hervorzurufen, wurden an die Elektroden einmal alle 10 Sekunden mit einem Sti-mulator (Grass model S8S stimulator) angelegt. Die Reize wurden kontinuierlich auf einem Oszilloskop, das quer zu den Elektroden angeschlossen war, überwacht. Die isometrischen Kontraktionen des Darmes wurden auf einem Mehrfachschreiber (Grass polygraph) über einen Kraftwandler (Grass FT 03 force transducer) aufgezeichnet. Die Ruhespannung wurde auf 1 g fixiert. Die

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Temperatür des 5 ml Organbades wurde konstant auf 37 ⁰C gehalten. Alle Versuche wurden an Ileumstücken durchgeführt, die in einer modifizierten Krebs-Lösung bei pH = 7j4- axt folgender Zusammensetzung (in millimolaxen Konzentrationen) aufgehangen waren: BTaCl = 118; KCl = 4-,7; CaCl₂ = 2,5; MgCl₂ = 1,2; NaH₂PO₄ = 1,2; FaHCO, = 25; Glucose = 11; Cholinchlorid = 0,29- Ein Gemisch aus 95 % O₂ und 5 % CO₂ wurde durch den Puffer zur Oxidation als Bläschen durchgeleitet.

Beide Samenleitergefäße wurden aus Mäusen von 25 g entfernt, an beiden Enden miteinander verknüpft, in einem 3 ml Organbad zwischen zwei parallelen Silberelektroden montiert und stimuliert, wie zuvor für das Meerschweinchen-Ileum beschrieben. Der verwendete Puffer war eine modifizierte Krebs-Lösung bei pH = 7,4- mit folgender Zusammensetzung (in aillimolaren Konzentrationen): NaCl = 118; KCl = 4,75; CaCl₂ = 2,54-; MgSO₄ = 1,27; KH₂PO₄ = 0,93; NaHCO, = 25,0; Glucose = 11,0. Die gleiche Gasmischung wurde zur Oxidation verwendet, und-der Puffer wurde auf 34· °C gehalten.

Biologische Aktivität

Stimuliertes Meerschweinchen-Ileum und Mäuse-Samenleitergefäß sind zwei periphere Neuroeffektorverbindungen, die gegenüber Morphin in einer narkotischen, spezifischen Weise empfindlich sind. Das. MLC wurde daher auf biologische Aktivität an diesen beiden Systemen untersucht. MLC bei einer Dosis von 0,2 ng/ml an Morphinimmunoäquivalenten ergab eine vorübergehende Hemmung von elektrisch induzierten Kontraktionen, beim Meerschweinchen-Ileum. Der Beginn der Hemmung trat innerhalb von 10 Sekunden auf und erreichte üblicherweise sein Maximum von etwa 4-0 % Hemmung innerhalb 30 Sekunden,

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danach ergab es eine partielle Erholung. Eine Konzentration von 0,1 ng/ml ergab eine 20 %ige .Hemmung der . Kontraktion. Dies zeigt die Parallelität zwischen der RIA-Aktivität und der biologischen Aktivität. Morphin ergab eine 40 %ige Hemmung des Kontraktion bei einer Konzentration von 10 M (28,5 ng/ml). Die Inhibierung der elektrisch induzierten Kontraktionen des Mäuse-Samenleiters zeigte im wesentlichen die gleichen Eigenschaften mit der Ausnahme, daß die Inhibierung etwas geringer * beim Beginn war und langer anhielt. Versuche zum Blockieren der Inhibierung mit einer M- bis 10 Minuten Vorbehand-

—6 lung mit Naloxon oder JTaltrexon (10 ΓΊ), zwei Narkoseantagonisten, waren nicht erfolgreich..

Eigenschaften von MLC

In der folgenden Tabelle II sind die Effekte von verschiedenen Enzymen und chemischen Reagentien auf MCL angegeben.

Tabelle II

Effekte von chemischen Behandlungen auf die MLC-Aktivität

Chemische Behandlung % Verlust von RLA.-Äqui

valenten

Pronase; 0,01 mg/ml	0
Trypsin; 0,01 mg/ml	0
Carboxypeptidase A-; 0,01 mg/ml	0
Aminopeptidase; 0,01 mg/ml	0
0,1N HCl	0
NaJO,	0
K₂S₂O₅ ■ ■ "	0
0,1N NaOH	50
H₂O₂ .	100
^J2	100

* RIA = radioimmunologischer Test

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MLC wurde entsprechend den unter "Methoden" "beschriebenen Arbeitsweisen gereinigt. Eine bekannte Menge wurde dann mit den Peptidasen (0,01 mg/ml), Pronase,"Trypsin, Carboxypeptidase A, Aminopeptidase, 0,1H" HCl, 0,1F FaOH (gekocht für 10 Minuten), FaJO., (0,5 g/nil über Facht), ^K2^S2°5 ^⁰'¹ ^ms/^ml ^ütier Facht), 1 % H₃O₅ über Facht und 0,21 Jp für 5 Minuten inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation mit den oben beschriebenen Substanzen wurde das MLC mit dem Radioimmunotest untersucht. Bei der Behandlung von MLC mit Peptidasen wurde die Lösung 10 Minuten gekocht, um die enzymatisch^ Aktivität vor der radioimmunologischen Untersuchung zu zerstören.

Keine der Peptidasen, der Pronase (von Enzyme Development Corp.), Trypsin (Sigma), Carboxypeptidase A (Worthington Biochem Corp.), und Aminopeptidase (Rohm), veränderten die MLC-Aktivität, wie durch den Radioimmunotest oder dem Biotest gemessen wurde. Keine der Aktivitäten wurde bei der Inkubation über Facht bei Zimmertemperatur in O,1F HCl oder in siedender 0,1F HCl für 10 Minuten verändert. Die Behandlung mit reduzierenden Mitteln wie FaJO, (0,5 mg/ml über Facht) und KpSpO_n- (0,1 mg/ml über Facht) hatte evenfalls keinen Einfluß auf die biologische oder immunologische Aktivität. Jedoch zerstörte ein 10-minütiges Kochen in O,1F ITaOH annähernd 50 % der immunologischen Aktivität, wie durch den Radioimmünotest bestimmt wurde, und 1 % HpOp (über Facht) und 0,2F J₂ bei pH = 9,3 für 5 Minuten zerstörten die gesamte immunologische Aktivität. In jedem Fall wurde die biologische Aktivität in annähernd dem gleichen Ausmaß beeinträchtigt. Eine authentische Probe von Morphin wurde in gleicher Weise durch die Oxidationsmittel beeinträchtigt.

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Weiterhin wurden dünnschichtchromatografische Untersuchungen durchgeführt. Sowohl Morphin als auch MLC wurden auf Dünnschichtplatten in vier unterschiedlichen Lösungsmittelsystemen chromatografiert, nämlich: (a) Butanol-Essigsäure-Wasser (4:1:1); (b) Chloroform-Aceton-Diäthylamin (5:4:1); (c) Chloroform-Diäthylamin (9JΊ)* und (d) Butanol-Benzol-Methanol-Wasser (15:10:60:15)- In allen Systemen war der R~-Wertvon Morphin identisch mit dem hei MLC beobachteten Ev.-Wert. Der R^-Wert im System (a) war 1,0 , beim System (b) 0,16, beim System (c) 0,08 und beim System (d) 0,7· Wenn beide Substanzen gemeinsam chromatografiert wurden, wurde ein Fleck mit einem E„-Wert von Morphin erhalten. Beim Besprühen des Chromatogramms mit Eisen(IIl)-chlorid-Eisen-(Ill)-cyanid-gemisch erschien eine blaue Färbung, welche für ein Phenol charakteristisch ist.

Die zuvor angegebenen Daten zeigen, daß Gehirnextrakte eine Substanz (MLC) enthalten, die effektiv an für Morphin spezifischen Plätzen auf gegen das Alkaloid gebildeten Antikörpern bindet. Dies inpliziert, daß MLC bestimmte funktionelle Gruppen besitzt, welche von dem Antikörper erkannt werden und daher wahrscheinlich eine gewisse Ähnlichkeit mit Morphin tragen. Die Tatsache, daß MLC ebenfalls eine Phenolgruppe enthält und die gleichen R~-Werte wie Morphin in vier unterschiedlichen Lösungsmittelsystemen ergibt, unterstreicht weiterhin die nahe Ähnlichkeit zu Morphin. Es sei daraiif hingewiesen, daß gereinigtes MLC hitzestabil ist und gegenüber verdünnter Säure und einer Vielzahl von Peptidasen beständig ist, so daß es hierdurch von dem morphinähnlichen Peptid Enkephalin, über das in letzterer Zeit berichtet wurde, verschieden ist.. IiLC ist jedoch gegenüber einer Oxidation durch Wasserstoffperoxid und Jod empfindlich, wie dies bei Morphin der Fall ist. Obwohl MLC im gereinigte_%n Zustand stabil ist, ist es in Gehirnhomogenaten sehr

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labil,-was erklärt, daß es für gewöhnlich, den Radioiaaunotest (RIA.) auf Morphin im Gehirn nicht stört. Weiterhin schließen die beim Radioimmunotest (RIA.) verwendeten Verdünnungen, wegen der geringen, in G-ehirngewebe gefun-* denen Mengen, eine Störung von MLC aus« Wie Morphin hemmt MLC die elektrisch induzierten Kontraktionen sowohl beim Meerschweinchen-Ileum als auch beim Mäuse-Samenleiter. Jedoch wird im Gegensatz zu Morphin die Inhibierung von elektrisch induzierten Eontraktionen nicht durch eine Vorbehandlung mit entweder Haloxon oder Kaltrexon (1Ο~ΎΙ), zwei reinen Harkoseantagonisten, umgekehrt. Die letztgenannte Tatsache kann dadurch erklärt werden, daß entweder die durch MLC gebildete Inhibierung nicht über den narkotischen Rezeptor weitergeleitet wird, oder daß MLC eine weit größere Affinität für den narkotischen Rezeptor besitzt als sowohl die narkotischen Antagonxsten oder Morphin. Das letzte scheint so zu sein, wie aus den beim Biotest beobachteten Dosisansprechwerten abgeleitet werden kann.

Es sei darauf hingewiesen, daß MLC mittels eines gegen Morphin gerichteten Radioimmunotests untersucht wurde. Es kann sein, daß die MLC-Mengen größer sind als durch die Morphinimmunoäquivalente angezeigt wird. Weiterhin ist es auch möglich, daß die Affinität des MLC für den Antikörper diejenige von Morphin erreichen könnte.

In neuerer Zeit wurde ein Peptid, Enkephalin, aus Gehirn isoliert, und. es wurde gezeigt, daß es mit dem Opiatrezeptor in Wechselwirkung tritt. MLC unterschiedet sich jedoch von Enkephalin in mehrfacher Weise. Es ist kein Peptid, wie durch seine Beständigkeit gegenüber Peptidasen und saurer Hydrolyse gezeigt wird, und die Verteilungen von

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MLC und. Enkepnalin scheinen ebenfalls etwas verschieden zu sein. Im Gegensatz zu Enkephalin scheint die Verteilung von MLC im Gehirn nicht exakt parallel zu der berichteten Verteilung des vermeintlichen, narkotischen Rezeptors zu sein.

MLC kann als Pharmazeutikum Verwendung finden.

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Claims

PATENTANWÄLTE

D R. A. VAN DERWERTH DR. FRANZLEDERER . " REINER F. MEYER

DlPL-ING. (1934-1974) DIPL-CHEM. DIPL-ING.

8000 MÜNCHEN 80'

LUCILE-GRAHN-STHASSE

TELEFON: (083) 472947 TELEX: 524624 LEDER D TELEGR.: LEDERERPATENT

18. August 1976 ΕΑ.ΪΓ 4001/97

F. Hoffmann - La Roche & Co. Aktiengesellschaft Basel, Schweiz

Verfahren zur Herstellung einer endogenen, morphinähnlichen Verbindung und nach dem. Verfahren hergestellte Verbindung

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung einer in Säugetiergehirngewebe endogenen, morphinähnlichen Verbindung .mit folgenden physikalischen,chemischen und biologischen Eigenschaften:

a) wirksamer Bindung an für Morphin spezifische Antikörper; .

b) nicht peptidähnlich, wie durch Beständigkeit gegen-.. _: über Peptidasen, Säurehydrolyse und Hitze gezeigt;

c). besitzt den gleichen Rp-Wert wie Morphin bei der Dünnschichtchromatografie;

d) zeigt Opiat-Primärmuskelaktivität,"wie durch Versuche an Meerschweinchenileum und Mäusesamenleitergefäß gezeigt wird, wobei diese Aktivität nicht durch Vor-

.'. behandlung mit Naloxon oder NaItrexon blockiert wird; und

7 0 9 8 4 2/059 ?! ORiGiNAL iNSPEGTEn

e) bildet eine blaue Färbung bei der Behandlung mit einem Gemisch aus Eisen(III)-chlorid-Eisen(III)-cyanid, was die Anwesenheit einer phenolischen Gruppe anzeigt,

wobei diese morphinähnliche Verbindung im wesentlichen frei von anderen normalerweise in Säugetiergehirngewebe vorhandenen Substanzen ist, dadurch gekennzeichnet, daß diese Verbindung aus Säugetiergehirngewebe unter "Verwendung von für Morphin spezifischen Antikörpern·isoliert wird. ^% ' ■

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die morphinähnliche Verbindung aus Methanolextrakten aus Gehirngewebehomogenaten unter Verwendung von für Morphin spezifischen, durch Carboxymethylmorphinitaniunogen erζeugtfnAntikörpern isoliert wird, wobei die erhaltene Faarung aus morphinähnlicher Verbindung-Antikörper von der Gewebeextraktlösung durch eine Ammoniumsulfatausfällung abgetrennt und die morphinähnliche Verbindung von dem Antikörper durch Hitzedenaturierung des Proteins mit anschließender Ultrafiltration der Lösung durch ein Filter mit einer Trennung bei einem Molekulargewicht von 1000 getrennt wird, wobei die morphinähnliche Verbindung im Piltrat gefunden wird.

3. Morphinähnliche, in Säugetiergehirngewebe endogene Verbindung mit den folgenden physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften:

a) wirksamer Bindung an für Morphin spezifische Antikörper;

b) nicht peptidähnlich, wie durch Beständigkeit gegenüber Peptidasen, Säurehydrolyse und Hitze gezeigt;

c) besitzt den gleichen R_f-Wert wie Morphin bei der Dünnschichtchromatografie;

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d) zeigt Opiat-Primärmuskelaktivität, wie durch Versuche an Meerschweinchenileum und Mäusesamenleitergefäß gezeigt wird, wobei diese Aktivität nicht durch Vorbehandlung mit Naloxon oder Naltre— xon blockiert wird;

und

e) bildet eine blaue Färbung bei der Behandlung mit einem Gemisch aus Eisen(III)-chlorid-Eisen(lII)-cyanid, was die Anwesenheit einer phenolischen Gruppe anzeigt,

wobei die morphinähnliche Verbindung im wesentlichen, frei von anderen normalerweise in Säugetiergehirngewebe vorhandenen Substanzen ist, hergestellt nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2.

4. Morphinähnliche, in Säugetiergehirngewebe endogene Verbindung mit den folgenden physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften;

a) wirksamer Bindung an für Morphin spezifische Antikörper ;

b) nicht peptidähnlich, wie durch Beständigkeit gegenüber Peptidasen, Säurehydrolyse und Hitze gezeigt;

c) besitzt den gleichen R„-¥ert wie Morphin bei der Dünnschichtchromatografie;

d) zeigt Opiat-Primärmuskelaktivität, wie durch Versuche an Meerschweinchenileum und Mäusesamenleitergefäß gezeigt wird, wobei diese Aktivität nicht durch Vorbehandlung mit Naloxon oder Naltrexon blockiert wird;

und

e) bildet eine blaue Färbung bei der Behandlung mit einem Gemisch aus Eisen(III)-chlorid-Eisen(III)-cyanid, was die Anwesenheit einer phenolischen Gruppe anzeigt,

wobei die morphinähnliche Verbindung im wesentlichen frei von anderen normalerweise in Säugetiergehirngewebe vorhandenen Substanzen ist.

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