DK143045B - Baerer til immunokemiske bestemmelser - Google Patents

Description

143045

Den foreliggende opfindelse angår en bærer ti) immunokemiske bestemmelser omfattende blodceller, som er bundet til garvesyre.

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af denne bærer.

I de senere år har man erfaret, at måling af biologisk aktive bestanddele, såsom insulin, væksthormer, prolactin, gastrin, adrenocortico-tropehormoner, skjoldbruskhormoner, angiotensin, o.I. in en levende organisme, er af stor betydning ved diagnose, behandling og forebyggelse af menneskets sygdomme eller ved forskellige funktionsprøver. Sådanne målinger er derfor meget hyppigt blevet udført i de senere år.

Da alle disse biologiske bestanddele imidlertid forefindes i meget små mængder, kan de ikke måles ved en sædvanlig kemisk metode, men kan måles ved en immunokemisk metode, såsom ved radioimmunoanalyse (i det følgende betegnet RIA), som muliggør en særdeles følsom måling.

RIA-metoden er imidlertid uegnet til rutinemæssige målinger af bestanddele i den menneskelige organisme på sædvanlige medicinske institutioner, da den kræver særlige instrumenter, der benytter isotoper, og driften heraf er indviklet og besværlig.

En velkendt simpel metode, der hidtil er blevet anvendt til måling af biologiske bestanddele i menneskelegemet, omfatter, at en bærer bestående af blodceller, polystyren iatex, kaolinit, bentonit, aktivt trækul, krystallinsk cholesterin, e.l. sensibiliseres med et antigen eller et antistof, efterfulgt af omsætning af bæreren med det i prøven tilstedeværende antistof eller antigen og tilvejebringelse af en immunokemisk agglu-tinationsreaktion eller en agglutinationsinhiberingsreaktion. Navnlig er en metode, hvor blodceller anvendes som bæreren, foretrukket på grund af dens store følsomhed. De blodceller, der anvendes som bærere ved ovennævnte immunokemiske måling, fremstilles sædvanligvis af blodceller tilvejebragt fra forskellige dyr uden nogen kemisk behandling eller af blodceller, der først er behandlet med et passende fikseringsmiddel, såsom formaldehyd, pyruvinaldehyd, hydrogenperoxid, o.I-, og derefter behandlet med et bindemiddel, såsom garvesyre, bisdiazobenzidin, 1,3-difluoro-4,6-dinitrobenzen eller lignende.

De dyr, hvorfra blodcellerne fås, er sædvanligvis pattedyr, f.eks. kvæg, heste, fir, kaniner, mennesker, o.s.v. eller fugle, f.eks. kyllinger, duer, kalkuner, o.s.v., idet dog andre dyr, heri indbefattet krybdyr, såsom krokodiller og slanger, og padder, såsom frøer, o.s.v., samt havdyr, såsom delfiner, også kan bruges.

Skønt de blodceller, der fås fra disse dyr, kan anvendes i ubehand- U3045 2 let tilstand, anvendes i de fleste tilfælde fikserede blodceller behandlet med ovennævnte fikseringsmidler, da en ubehandlet blodcelle er af ringe styrke, når den er på naturlig form, idet den har tendes til at hæmoly-sere ved mekaniske eller kemiske behandlinger. Betegnelsen "blodceller" i denne beskrivelse betyder den materialebestanddel i blodet, der hoved-sagelig består af røde blodceller, hvilket indbefatter ubehandlede blodceller og fikserede blodceller. Blodcellemængden angives af det tilsyneladende rumfang blodceller, der .fås ved centrifugering af blod.

Disse blodceller må, som tidligere nævnt, behandles med bindemidlet inden de benyttes som bærere. Det er vanskeligt at binde antigener eller antistoffer til blodceller, som ikke er behandlet med bindemidlet, og selv hvis de bindes, kan man ikke opnå noget ensartet produkt, hvilket hindrer opnåelse af en bærer med stabil følsomhed. På den anden side har en blodcelle, der er behandlet med et bindemiddel, en forbedret bindingsevne på blodcellens overflade, hvilket forbedrer bindingen til antigenet eller antistoffet, således at der fås en bærer med en bedre im-munokemisk agglutinationsreaktionsevne eller agglutinationsinhiberings-reaktionsevne.

Når f.eks. garvesyre anvendes som bindemiddel ifølge den hidtil kendte sædvanlige metode, blandes en suspension af blodceller i en pufferopløsning (blodcellekoncentration 2-8%) med et ligeså stort rumfang af en opløsning af bindemidfet i pufferopløsningen, og de to komponenter får lov at reagere ved 37-56°C i 30-60 minutter. Garvesyreopløsningen har sædvanligvis en koncentration på 1/20.000-1/40.000, hvor angivelsen 1/20.000 for garvesyreopløsningen betyder, at der fremstilles 20.000 ml opløsning ved tilsætning af 1 g af det opløste stof til opløsningsmidlet.

Denne metode findes f.eks. beskrevet af Leif Wide i Acta Endocrinologies, vol. 41^, supplementum 70, side 22-24 (1962).

Hvis blodceller, som ovenfor nævnt, behandles med garvesyre, bindes ca. 0,3-2,5 mg garvesyre til 1 ml blodceller. Blodcellerne har en følsomhed på ca. 100 ng/ml ved måling af humant serumalbumin (i det følgende betegnet HSA) med blodcellerne som bærer. Denne følsomhedsvær-di er forholdsvis høj sammenlignet med værdien for andre Lyper bærere udover blodcellerne, såsom de fine polystyren-latexpartikler. Ikke desto mindre er værdien ikke mere end 1/10-1/10.000 sammenlignet med RI A-metodens følsomhed.

Hidtil er de kvalitative og kvantitative målinger af de biologiske bestanddele i en levene organisme blevet gennemført under anvendelse af immunokemiske reaktioner. Skønt disse metoder er ganske enkle sam- 3 U3046 menlignet med radioimmunoanalyse (RIA)-metoden, har de mangler som følge af, at der ved antigen-antistofreaktioner er opnået lav følsomhed og specificitet sammenlignet med RIA-metoden som følge af, at ingen har kunnet finde en egnet bærer til at bære antigen og antistof, som reagerer med biologiske bestanddele ved en immunokemisk reaktion.

Ved immunokemiske agglutinationsreaktioner eller agglutinations-inhiberingsreaktioner har det følgelig hidtil været umuligt ved anvendelse af en sædvanlig' bærer at opnå en følsomhed, der er sammenlignelig med RIA-metoden. Med andre ord kræver måling med så høj følsomhed en ny bærer.

Som en meget følsom og meget specifik bærer til brug ved immunokemisk måling bør bæreren have følgende egenskaber: Når bæreren sensibiliseres med et antigen eller antistof svarende til det stof, der er genstand for målingen, kan en hvilken som helst ringe mængde antigen eller antistof, der som en biologisk bestanddel er tilstede i en levende organisme, let forårsage en immunokemisk reaktion med det antistof eller antigen, som bæreren er sensibiliseret med, og på basis af denne reaktion undergår den sensibiliserende bærer en fuldstændig agglutinationsreak-tion; i det tilfælde, hvor der ikke indtræder nogen immunokemisk reaktion, forekommer der på den anden side heller ingen spontan agglutination.

Formålet med opfindelsen er at tilvejebringe en bærer, som ved en simpel måling af biologiske bestanddele baseret på anvendelse af en immunokemisk agglutinationsreaktion eller en agglutinationsinhiberingsreak-tion giver en høj følsomhed og specificitet, der er sammenlignelig med, hvad der opnås med radioimmunoanalyse.

Dette formål opnås ved en bærer til immunokemisk måling ifølge opfindelsen, hvilken bærer omfatter blodceller, som er bundet til garvesyre, og som er ejendommelig ved, at mængden af til blodcellerne bundet garvesyre er på 30-500 mg pr. 1 ml af blodcellerne.

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af en bærer til immunokemiske bestemmelser omfattende blodceller, som er bundet til garvesyre, hvorved en suspension af blodceller i en pufferopløsning omsættes med en garvesyreopløsning, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at koncentrationerne og blandingsforholdet for opløsningerne/ suspensionen er således, at der bindes 30-500 mg garvesyre til 1 ml blodceller.

En udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at en blodcellesuspension med en blodcellekoncentration på 4 143045 2-4% i en pufferopløsning blandes og omsættes med en opløsning indeholdende garvesyre opløst i samme pufferopløsning med en koncentration pi 1/50-1/1.000, således at der til 1 ml blodceller bindes 30-500 mg garvesyre.

De ved den foreliggende opfindelse anvendte blodceller kan være af enhver type, der er blevet anvendt som bærer ved sædvanlige immuno-kemiske målinger.

Den mængde garvesyre, der skal bindes til blodceller, er på 30-• 500 mg pr. ml af blodcellerne. Hvis mængden er mindre end 30 mg, kan bæreren ikke opnå den ønskede store følsomhed og specificitet. Hvis den overstiger 500 mg, har bæreren en for stor agglutinationsevne til at kunne kontrolleres ved den nedenfor beskrevne metode, og derfor kan bæreren ikke længere anvendes ved en immunokemisk måling.

Ved reaktionen mellem blodceller og garvesyre blandes sædvanligvis lige store mængder af en blodcellesuspension indeholdende 2-4% blodceller og en garvesyreopløsning med en koncentration på 1/50-1/1.000; koncentrationen af blodceller i suspensionen, koncentrationen af garvesyre i garvesyreopløsningen og blandingsforholdet mellem blodcellesuspensionen og garvesyreopløsningen afpasses imidlertid således, at den mængde garvesyre, der bindes til 1 ml blodceller er mellem 30 og 500 mg. Dette gøres enten ved at suspendere blodceller i en garvesyreopløsning med en koncentration på 1/100-1/2.000 eller ved at tilsætte garvesyren selv til en blodcellesuspension med en koncentration på 1-2%.

Den pufferopløsning, der anvendes til suspension af blodcellerne og opløsning af garvesyren, kan være af. en hvilken som helst type af de pufferopløsninger, der almindeligvis anvendes ved en immunokemisk reaktion, og endvidere kan der anvendes en fysiologisk saltopløsning, fortrinsvis en phosphatpuffersaltopløsning.

Skønt blodcellerne kan omsættes med garvesyre ved stuetemperatur, fås bedre resultater ved opvarmning til en temperatur mellem 37 og 56°C, hvilket er det temperaturområde, der sædvanligvis anvendes ved almindelige immunokemiske processer.

Som følge af, at den foreliggende bærer binder en meget større garvesyremængde end sædvanlige bærere, er selve bærerens agglutinationsevne stærkt forbedret, og samtidig kan den binde en større mængde antigen eller antistof til sig end de sædvanlige bærere.

Sammenhængen mellem den garvesyremængde, der er blevet tilsat til behandling af blodcellerne, og den garvesyremængde, der er bundet til blodcellerne, er vist i tabel I.

TABEL I

143045 5 ·#““ « ........ - -- I — — .......- —I— i - — i .........— Mængde garvesyre Garvesyre bundet Bindingsgrad tilsat til 1 ml til 1 ml blod- (t) blodceller (mg) celler (mg) 1 0,9^ 9^,0 lo 8,82 88,2 loo *86,2 86,2 600 498 83,0

De i tabel I viste værdier gælder for garvesyre målt med Folin-Denis reagens i ethanolekstrakter fra de med garvesyre behandlede blodceller. Omtrent de samme værdier fås ved at måle restgarvesyreindholdet i su-pernatanten, efter at garvesyren er bundet til blodcellerne, og fradrage det fra begyndelsesmængden af garvesyre. Af denne tabel ses det, at hovedparten af den tilsatte garvesyre bindes til blodcellerne uden hensyn til den til blodcellerne tilsatte garvesyremængde.

Derudover er der gjort studier over agglutinationsevnen for selve bæreren, agglutinationsevnen når okseserumalbumin tilsættes som stabilisator for et reaktionssystem og agglutinationsevnen for en bærer sensibiliseret med anti-HSA antistof til sammenligning af de sædvanlige bærere med den foreliggende bærer. Agglutinationsevnen af selve bæreren varierer i almindelighed med pH-værdien og ion-styrken m.v. af den pufferopløsning, hvori bæreren er suspenderet. I det foreliggende eksempel suspenderes bærere, hvortil der er bundet forskellige mængder garvesyre i en phosphatpuffersaltopløsning (pH 6,4 og koncentration 0,076 mol) i en koncentration på 0,133%, og 0,5 ml af hver suspension, anbringes i et lille reagensglas og får lov at henstå i 2 timer, hvorefter bærerens agglutinatonsevne vurderes på basis af sedimentationsmønstrene på bunden af glasset.

Agglutinationsevnen for selve bæreren ved tilsætning af okseserumalbumin som stabilisator for reaktionssystemet måles på samme måde som når serumalbuminet ikke er tilstede med undtagelse af, at der anvendes en phosphatpuffersaltopløsning indeholdende 0,2% okseserumalbumin til suspension af bæreren. Agglutinationsevnen for en bærer sensibiliseret med et anti-HSA antistof måles på samme måde som i søjle 2 i tabel 2 med undtagelse af, at den med anti-HSA antistoffet sensibiliserede bærer anvendes. Bedømmelsesskalaen for sedimentationsmønstre på bunden af et reagensglas er følgende: 6 143045 +++ meget kraftig positiv reaktion ++ kraftig positiv reaktion + positiv reaktion negativ reaktion

Resultaterne er samlet i tabel 2.

TABEL. 2

Kolonne 1 Kolonne 2 Kolonne 3~

Garvesyre bundet Agglutinations- Agglutinations- Agglutinationstil· 1 ml blod- evne af selve evne af selve evneaBærer sensi-' celler (mg) bæreren bæreren ved til- biliseret med et sætning af okse- anti-HSA antistof serumalbumin som stabilisator for i reaktionssystemet ! 5oo +++· ++ — j loo +++ + - j lo ++ - - _1_ - - -

Tabel 2 viser, at bæreren ifølge den foreliggende opfindelse, hvortil der er bundet en stor mængde garvesyre, forårsager en spontan agglu-tinationsreaktion, mens de sædvanlige bærere, hvortil kun en ringe mængde garvesyre er bundet, ikke gør det. Dette indicerer, at bindingen af en stor mængde garvesyre til blodcellerne fører til en vis forandring pi blodcellerenes overflade, hvilket medfører en forøgelse af selve bærerens agglutinationsevne.

Sammenhængen mellem den mængde garvesyre, der er bundet til blodcellerne, og den mængde antistof eller antigen, der er bundet ti) bæreren, og som forener sig med garvesyren, blev også undersøgt.

Den mængde antistof eller antigen, der bindes til en bærer, miles ved at bestemme den mængde antistof eller antigen, der er tilbage i supernatanten efter sensibiliseringen af bæreren med antistof eller antigen ved en immunologisk diffusionsmetode, og fratrækkes denne fra den begyndeisesmængde af antistof eller antigen, der er tilsat til sensibilisering.

I det foreliggende eksempel anvendes henholdsvis kaningammaglo-bulin og HSA som antistof og antigen.

Resultaterne er samlet i tabel 3.

7 U3045 TABEL 3

Garvesyre bundet ! Bundet antisto£ Bundet antigen (HSA) til 1 ral blod- (gammaglobulin) (rag) celler (mg) (mg) (2 mg tilsat til (5 mg tilsat til o,2 ml blodceller) o,2 ml blodceller) 5oo .3,o (60¾) 1,7 (85%) loo 2,5 (50*) 1,5 (75%) 5o 1,9 (38^) 1,3 (65¾) lo 0,6 (12¾) o,7 (35¾) 1 °,k ( 8%) o,3 (15¾)

Som det fremgår af tabel 3 gælder, at jo' mere garvesyre, der er bundet til en bærer, jo mere gammaglobulin bindes til bæreren, og en bærer, hvortil der er bundet 500 mg garvesyre pr. 1 ml blodceller, binder ca. 7,5 gange så meget gammaglobulin som en bærer, hvortil der er bundet 1 mg garvesyre. Situationen er tilsvarende m.h.t. mængden af bundet antigen. Bæreren ifølge opfindelsen har altså en betydelig forøget evne til at binde antistof eller antigen sammenlignet med de sædvanlige bærere.

Yderligere har bæreren ifølge den foreliggende opfindelse den fordel, at den høje agglutinationsevne og evne til at binde en stor mængde antigen eller antistof kan reguleres alt efter anvendelsesformålet. Denne regulering gennemføres på mest effektiv måde ved at anvende den kendte teknik på den mest fordelagtige måde, f.eks. ved sensibilisering af bæreren med antigen eller antistof, siledes at mængden af antigen eller antistof reguleres, ved tilsætning af normal kaninalbumin, okseserum-albumin eller et overfladeaktivt stof, o.s.v., som stabilisator for det immunokemiske reaktionssystem, ved pH-regulering og ion-styrkeregule-ring af det immunokemiske reaktionssystem eller ved kombination af denne kendte teknik (se tabel 2).

Bæreren ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes som bærer for antigen eller antistof i de immunokemiske agglutinations- og agglutina-tionsinhiberingsreaktioner. Når f.eks. HSA måles ved anvendelse af den foreliggende bærer, er en måling af størrelsesordenen 100 pg/ml HSA mulig. D.v.s. at målingens følsomhed er forøget ca. 1.000 gange sammenlignet med brugen af sædvanlige bærere.

8 143045

Nedenstående forsøg og eksempler vil illustrere opfindelsen pi konkret måde.

FORSØG 1 2 ml fireblodceller fikseret med formalin suspenderedes i 60 ml phosphatpuffersaltopløsning. Suspensionen blandedes med 60 ml af en opløsning af garvesyre med forskellige koncentrationer opløst i puffer-opløsningen, og blandingen omSattes ved 56°C i 30 minutter. Dermed fremkom en række bærere med forskellige mængder bunden garvesyre.

Hver af bærerne suspenderedes i 60 ml af pufferopløsningen og blandedes derefter med antistof-opløsning fremstillet ved opløsning af 60 mg af et anti-HSA antistof (såsom kaningammaglobulin) i pufferopløsningen. Blandingen omsattes ved 56°C i 30 minutter, indtil bæreren var sensibiliseret med anti-HSA antistof. Derefter vaskedes hver af de således fremkomne sensibiliserede bærere med 50 ml pufferopløsning, og en 1% suspension i phosphatpuffersaltopløsning indeholdende 10% saccharose, 0,1% okse-serumalbumin og 0,02% normal kaninserum fremstilledes.

0,1 ml af hver af de sensibiliserede bærersuspensioner anbragtes i et reagensglas med en indre diameter på ca. 9 mm med en halvkugleformet bund og blandedes efterhånden med 0,3 ml af phosphatpuffersalt-opløsningen, således at en 0,25% suspension fremkom, efterfulgt af tilsætninger af 0,1 ml af HSA-opløsninger med henholdsvis 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10, 20, 50 eller 100 ng/ml HSA. Efter omrystning fik blandingerne lov at henstå i 2 timer. Sedimentationsmønstrene, der udvikledes pi reagensglassenes bund, jagttoges, og resultaterne bedømtes som negative eller positive alt efter, om der var dannet en sedimentationsring eller ej.

Tabel 4 viser de følsomhedsresultater, forskellige bærere udviste ved HSA-målingerne, udtrykt ved de mindste mængder HSA, der er nødvendige for at give positive reaktioner.

TABEL 4 9 143045

Koncentration af Garvesyre bundet Følsomhed ved den garvesyreop- til 1 ml blodcel- HSA-måling løsning, der er ler (njg) (ng/ml) anvendt til behandling af blodcellerne l/5o $oo *(i»98) o,5 l/25o -loo (lo3) o,l l/9oo 3o ( 29) 5»o 1/2.500 lo ( lo,4), 2o I/30.000 1 ( 0,96) loo £ tallene i parentes er faktisk målte værdier.

Som det fremgår af tabel 4, opnåedes det bedste resultat med den bærer, hvori 100 mg garvesyre er bundet til 1 ml blodceller. Denne bærer udviste ca. 1.000 gange så stor følsomhed som den sædvanlige bærer, hvori kun 1 mg garvesyre er bundet til 1 ml blodceller.

FORSØG 2 60 ml af hver af bærersuspensionerne fremstillet på samme måde som i forsøg 1 blandedes med en opløsning af 6 mg af et 2,4-dinitrophe-nol-okseserumalbuminkombinationsprodukt (i det følgende betegnet DNP-BSA) i 60 ml phosphatpuffersaltopløsning, og opløsningen omsattes ved 56°C i 30 minutter, indtil bæreren var sensibiliseret med DNP-BSA. Derefter vaskedes hver af bærerne med 50 ml af ovennævnte pufferopløsning og bragtes i 1% suspension i phosphatpuffersaltopløsningen indeholdende 10% saccharose, 0,1% okseserumalbumin og 0,02% normal kaninserum.

Med de sensibiliserede bærere studeredes først det største fortyndingsforhold af anti-serum, der er nødvendig for, at en agglutinations-reaktion af bærerne indtræder.

Et anli-DNP-BSA anti-serum fremstilledes ved at blande Freund's Complete Adjuvant med DNP-BSA ved en sædvanlig fremgangsmåde og derved immunisere en kanin. Serummets absorption med BSA gav et anti-serum, som kun udviste antistofaktivitet overfor DNP. Anti-serummet fortyndedes med 0,25% saltopløsning indeholdende 1% BSA henholdsvis 1, 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400 og 500 gange. Derefter tilsattes 0,1 ml af de fortyndede serummer til et reagensglas, som indeholdt 0,1 mg af hver 1A3045 ίο af de sensibiliserede bærersuspensioner og 0,3 ml phosphatpuffersalt-opløsning, og der omrystedes. Efter henstand i 2 timer bestemtes det største antiserum-fortyndingsforhold, der er nødvendigt for, at en ag-glutinationsreaktion for bæreren indtræder.

Derefter sammensattes aggJutinationsinhiberingssystemer mellem hver af de sensibiliserede bærere og anti-serummet ved det maksimale fortyndingsforhold, der er nødvendigt for agglutinationsreaktionen. Følsomheden ved DNP-milingen undersøgtes for hver af de siledes fremkomne systemer.

For hvert af agglutinationsinhiberinsreaktionssystemerne blandedes 0,1 ml af anti-serummet ved maksimal fortynding i et reagensglas med 0,1 ml af en DNP-opløsning indeholdende 50, 100 , 200 , 300 , 500 , 700 eller 1.000 ng/ml DNP i phosphatpuffersaltopløsning, hvortil tilsattes 0,1 ml af den sensibiliserede bærersuspension Qg 0,2 ml phosphatpuffersaltopløsning. Efter omrystning og henstand i 2 timer iagttoges det på bunden af reagensglasset udviklede sedimentationsmønster. I de tilfælde, hvor en sedimentationsring var dannet, blev resultatet bedømt positivt, mens det bedømtes negativt, når der ikke dannedes en sedimentationsring.

Bærernes følsomheder er samlet angivet i tabel 5, idet de er udtrykt ved de mindste mængder DNP, der er nødvendige for forekomsten af positive reaktioner.

TABEL 5 ""· i ~~ — ——— i 1 —1 -r i - ——

Koncentration af Garvesyre bundet Største for- Følsomhed ved .

garvesyreopløsning til 1 ml blod- tyndingsfor- DNP-måling anvendt til behand- celler (mg) hold af anti- (ng/ml) ling af blodceller serum, der er nødvendig for • forekomst af agglutinations-reaktion i | __ _____ 1 l/5o 5oo 3oo loo l/25o loo 3oo loo I/900 3o loo 2oo I/2.500 lo 5o l.ooo I/30.000 1 * x der forekommer ingen agglutination?selv når det ufortyndede serum anvendes.

143045 11

Som det ses af tabel 5, kan bæreren ifølge opfindelsen, hvortil 100 mg garvesyre er bundet pr. 1 ml blodceller, forårsage en agglutina-tionsreaktion med 300 gange fortyndet anti-serum til trods for, at de sædvanlige bærere, hvortil 1 mg garvesyre er bundet pr. 1 ml blodceller, ikke kan agglutineres, selv når det ufortyndede anti-serum anvendes.

Bæreren ifølge den foreliggende opfindelse udviste en 5-10 gange større følsomhed ved målingen end de sædvanlige bærere.

Det vides fra disse forsøg, , at brugen af bæreren ifølge opfindelsen til en immunokemisk agglutinationsinhiberingsreaktion muliggør en stor forøgelse af anti-serummets fortynding sammenlignet med de sædvanlige bærere, og måling med større følsomhed er derfor mulig, hvorved brugen af anti-serummer med lav antistoftiter, som hidtil har været umulig, muliggøres.

EKSEMPEL 1 30 ml fåreblodceller fikseret med formalin vaskedes med 300 ml phosphatpuffersaltopløsning og suspenderedes derefter i pufferopløsningen, hvorved der fremkom et totalrumfang på 900 ml. Til suspensionen sattes 900 ml af en garvesyreopløsning med en koncentration på 1/300 opløst i pufferopløsningen, og blandingen omsattes ved 56°C i 30 minutter. Efter reaktionen vaskedes bæreren 2 gange, hvergang med 600 ml af pufferopløsningen. Til bæreren i dette eksempel er bundet ca.

90 mg garvesyre pr. 1 ml blodceller.

EKSEMPEL 2 50 ml kyllingeblodceller fikseret med pyruvinaldehyd vaskedes med lo x fysiologisk saltopløsning og suspenderedes derefter igen i 1.000 ml af opløsningsmidlet.

Blodcellesuspensionen blandedes med 2.000 ml af en garvesyreopløsning med koncentrationen 1/350, og blandingen omsattes ved 25°C i 60 minutter. Efter reaktionen vaskedes bæreren med 1.000 ml af opløsningsmidlet. Til bæreren i dette eksempel blev ca. 100 mg garvesyre bundet pr. 1 ml blodceller.

EKSEMPEL 3 50 ml kaninblodceller fikseret efter behandling med hydrogen-peroxid vaskedes med 500 ml boratpuffersaltopløsning og suspenderedes derefter igen i pufferopløsningen. Suspensionen blandedes med 1.500 ml garvesyreopløsning med en koncentration på 1/500 i pufferopløsningen, og 12 143045 blandingen omsattes ved 56°C i 45 minutter. Efter reaktionen vaskedes produktet med 1.000 ml af pufferopløsningen, hvorved en bærer fremkom. Bæreren i dette eksempel tager ca. 50 mg garvesyre pr. 1 ml blodceller.

EKSEMPEL 4 30 ml ubehandlede okseblodceller vaskedes med 500 ml veronalpuf-feropløsning, hvorefter blodcellerne centrifugeredes. Blodcellerne suspenderedes i en garvesyreopløsning, fremstillet ved opløsning af 1 g garvesyre i 1.000 ml af pufferopløsningen, og suspensionen omsattes ved 37°C i 30 minutter. Efter reaktionen vaskedes produktet med pufferopløsningen, hvorved en bærer fremkom.

Bæreren i dette eksempel har ca. 30 mg garvesyre pr. 1 ml blodceller.

EKSEMPEL 5 20 ml okseblodceller fikseret med hydrogenperoxid vaskedes med 300 ml phosphatpuffersaltopløsning og suspenderedes derefter i pufferopløsningen, således at opløsningens totale rumfang blev 600 ml.

Blodsuspensionen blandedes med en garvesyreopløsning med koncentrationen 1/50 opløst i pufferopløsningen, og blandingen omsattes ved 56°C i 30 minutter. Efter reaktionen vaskedes produktet med pufferopløsningen, hvorved en bærer fremkom. Bæreren i dette eksempel indeholder ca. 500 mg garvesyre pr. 1 ml blodcelle.

Som ovenfor nævnt, har bæreren til immunokemiske målinger ifølge den foreliggende opfindelse en større følsomhed og en større specificitet sammenlignet med sædvanlige bærere, således at den let forårsager en immunokemisk reaktion, selv når mængden af biologiske bestanddele er meget fille, og på basis af denne reaktion udviser den en fuldstændig agglutinationsreaktion. Brugen af bæreren ifølge den foreliggende opfindelse letter derfor målingen af biologiske bestanddele, hvorved den bliver af stor lægevidenskabelig værdi.