DE2163318B2

DE2163318B2 - Verfahren zur herstellung von zur passiven agglutination geeigneten traegerteilchen aus mit formaldehyd behandelten mikroorganismen

Info

Publication number: DE2163318B2
Application number: DE19712163318
Authority: DE
Inventors: Koichiro Wako Fujita (Japan)
Original assignee: Fujizoki Seiyaku Kk Tokio
Current assignee: Fujirebio Inc
Priority date: 1970-12-26
Filing date: 1971-12-20
Publication date: 1973-03-29
Also published as: DK135916C; AU3681971A; AT309687B; NL159192B; JPS502730B1; US3873684A; BR7108599D0; AU470899B2; DE2163318C3; GB1362977A; CH542927A; DK135916B; SE375622B; NL7117835A; CA958332A; DE2163318A1; FR2119745A5

Description

Mikroorganismen nach der Formaldehydbehand- tionsklümpchen — durch welche entweder eine

lung auf 90 bis 135° C erhitzt positive oder negative Reaktion in der passiven

ίο Agglutination festgestellt werden kann — wegen des

großen Umf angs des Trägers nicht erhalten werden.

Aus der belgischen Patentschrift 700 570 ist auch bereits ein Verfahren zur Herstellung von Teilchen

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur zur passiven Agglutination aus Mikroorganismen

Herstellung von zur passiven Agglutination geeigneten 15 bekannt. Gemäß diesem Verfahren werden die Mikro-

Trägerteilchen aus mit Formaldehyd behandelten Organismen mit Formaldehyd und nach der Behand-

Mikroorganismen. lung mit einem Kupplungsmittel mit einem Antigen

Eine Masse, die man durch Adsorbieren eines oder Antikörper beladen.

Antigens oder eines Antikörpers auf ein partikel- Es besteht aber ein Bedürfnis an einem verbesserten

förmiges Material gewünschter Größe (wobei das 20 Verfahren, mit dem die Lagerzeit der sensibilisierten

partikelförmige Material ein Träger ist) erhält, unter- Zellen verlängert werden kann und bei dem sensibih-

liegt der Agglutination mit dem entsprechenden Anti- sierte Zellen erhalten werden, die die erwünschte

körper oder Antigen. Eine solche Agglutination wird passive Agglutination bei der Antigen-Antikörper-

als passive Agglutination und die obenerwähnte Reaktion zeigen.

Masse, auf der ein Antigen oder ein Antikörper 25 Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren adsorbiert ist, wird hier als »sensibilisierte Zelle« zur Herstellung von zur passiven Agglutination bezeichnet. Die sensibilisierte Zelle kann auch als geeigneten Trägerteilchen aus mit Formaldehyd behan- »Indikator« bezeichnet werden, der ein Antigen oder delten Mikroorganismen, das dadurch gekennzeichnet einen Antikörper sichtbar werden läßt. ist, daß man die Mikroorganismen nach der Form-Ais herkömmliche Träger der sensibilisierten Zelle 30 aldehydbehandlung auf 90 bis 135⁰C erhitzt,
wurden nichtbiologische Materialien, wie Polystyrol- Überraschenderweise wurde gefunden, daß nach dem latex, Kaolin oder Holzkohlenpulver, und biologische erfindungsgemäßen Verfahren gegenüber den bisher Materialien, wie Erythrocyten eines Tieres, verwendet. bekannten verbesserte sensibilisierte Zellen erhalten Der nichtbiologische Träger hat den Vorteil, daß er werden, die die oben geschilderten Nachteile nicht chemisch stabil ist und keine antigene Wirksamkeit 35 mehr aufweisen.

hat, aber den Nachteil, daß er ein Antigen oder einen Um nun verbesserte, sensibilisierte Zellen herzu-

Antikörper nicht fest adsorbiert. Es entfernt sich stellen, die nicht die obenerwähnten Nachteile haben,

daher bei einer unter Verwendung des nichtbiologi- wird die Verwendung von Mikroorganismen als Träger

sehen Trägers hergestellten, sensibilisierten Zelle das für sensibilisierte Zellen unter Berücksichtigung fol-

adsorbierte Antigen oder der adsorbierte Antikörper 40 gender Gesichtspunkte empfohlen:
leicht von dem Träger, wenn man die sensibilisierte Man sucht Mikroorganismen gewünschter Größe

Zelle dem Trocknen oder Gefrieren unterwirft. Es und Form im Bereich von 0,2 bis 5 μ aus. Die als

muß demgemäß die sensibilisierte Zelle in einem Rohmaterial dienenden Mikroorganismen unterliegen

flüssigen Zustand an einem dunklen und kalten Platz aber der Autolyse durch ihre eigenen Enzyme, wobei

gelagert und kann dennoch nicht über längere Zeit 45 sie sich zersetzen, und es können daher die aus diesen

aufbewahrt werden. als Rohmaterial dienenden Mikroorganismen her-

Wenn Kaolin oder Holzkohle als Träger verwendet gestellten, sensibilisierten Mikroorgnaismenzellen

wird, können sensibilisierte Zellen mit bestimmter nicht längere Zeit gelagert werden. Außerdem sind die

Teilchengröße nicht erhalten werden, weil Kaolin als Rohmaterial dienenden Mikroorganismen hydro-

oder Holzkohle gleichmäßiger Größe schwer zu so phil, d. h., sie haben eine starke Affinität gegenüber

erhalten sind. Andererseits können bei Polystyrollatex Wasser, so daß ein auf dem Mikroorganismus adsor-

Teilchen gleichmäßiger Größe hergestellt werden, biertes Antigen oder adsorbierter Antikörper nicht

aber die Polystyrollatex-Teilchen agglutinieren in mit dem entsprechenden Antikörper oder Antigen

einem Medium bei einem pH-Wert von 5,0 bis 8,0 in dem Medium unter Bildung eines Klümpchens

von selbst ohne Antigen- oder Antikörper-Reaktion. 55 der Passivagglutination in der Antigen-Antikörper-

Wenn daher Polystyrollatex-Teilchen als Träger ver- Reaktion reagieren kann.

wendet werden, muß eine Untersuchung der Antigen- Man unterwirft die Mikroorganismen der Zellwand-Antikörper-Reaktion in einer geeigneten Pufferlösung, fixierung mit Formaldehyd. Auf diese Weise kann die wie einer alkalischen Lösung eines höheren pH-Wertes obenerwähnte Lagerzeit der sensibilisierten Zellen als 8,6, durchgeführt werden. Humanserum hat 60 verlängert werden, aber diese sensibilisierten Zellen jedoch einen pH-Wert von etwa 7,2. Die Polystyrol- zeigen noch immer nicht die gewünschte passive latex-Teilchett haben den Nachteil, daß sie unerwünscht Agglutination bei der Antigen-Antikörper-Reaktion. agglutinieren, wenn sie als Träger für die sensibilisierte Gemäß der vorliegenden Erfindung werden also die Zelle in einem solchem neutralen Medium mit pH 7,2 sensibilisierten Zellen dadurch hergestellt, daß man verwendet werden. 65 einen Mikroorganismus als Träger der sensibilisierten Biologische Träger, wie Erythrocyten von Tieren, Zelle verwendet und ein Antigen oder Antikörper auf beispielsweise Schafen, haben bestimmte Teilchen- den Träger adsorbiert. Dabei sind die Träger Mikrogrößen und sind leicht erhältlich, aber ihre Größe ist Organismen, die der Zellwandfixierung mit Form-

aldehyd und dann der Intrazellfixierung bei einer erhöhten Temperatur unterworfen werden.

Es können zahlreiche Mikroorganismen als Träger für die sensibUisierten Zellen verwendet werden, die den folgenden Bedingungen entsprechen:

Die Mikroorganismen sollen

1. keine serologische Aktivität haben,

2. kerne nichtspezifische Agglutination aufweisen,

3. ein Antigen oder einen Antikörper fest adsorbieren und keine Änderung der antigenen Eigenschaften hervorrufen,

4. eine bestimmte Größe haben,

5. ein dem Medium ähnliches spezifisches Gewicht haben und

6. längere Zeit stabil sein.

Bevorzugte Mikroorganismen, die den obenerwähnten Bedingungen entsprechen, sind beispielsweise:

Saeeharomyces cerevisiae (Größe: 5 μηι),
Serratia marcescens (Größe: 0,5x0,5- 1,0 μΐη), Brucella abortus (Größe: 0,25 μπι).

A-ißeidem können die nachfolgenden Mikroorganismen bevorzugt verwendet werden:

Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus megatherium, Proteus vulgaris. Bacterium zopfii, Lactobacillus bulgarieus, Acetobactor suboxydans, Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Tetracoccus liguefaciens, Sarcina lutea, Micrococcus lysodelkties, Stapholococcus, Saceharomyces delbruckii lindner, Eremascus fertilis, Endomyces bisporus, Cryptococcus albidus u. dgl

35 Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

In diesem Beispiel wurde »Brucella abortus«, das in einem Agarkulturmedium, das Rinderserum enthielt, gezüchtet wurde, als Träger der sensibilisierten Zelle verwendet.

25 mg Brucella abortus, wie oben angegeben kultiviert, wurden in 1 ml Kochsalzlösung, die 0,3 % Formaldehyd enthielt, suspendiert und unter Rühren bei Zimmertemperatur 12 Stunden stehengelassen, um die Zellwandfixierung zu bewirken. Der so behandelte Brucella abortus-Träger wurde abgetrennt und mit destilliertem Waiser gewaschen und dann erneut in 1 ml destilliertem Wasser suspendiert. Diese wäßrige Suspension wurde bei einer Temperatur von 12O⁰C 20 Minuten in einem Autoklav erhitzt. Der so behandelte Träger wurde mit »Haematoxylin-Fe⁺⁺« 12 Stunden unter Rühren gefärbt und dann mit Wasser gewaschen und in 1 tpl 0,15 m PPK-(Phosphatpufferkochsalz-)Lösung mit pH 7,2 suspendiert.

Der — wie oben angegeben — gefärbte Träger wurde mit einer 0,15m PPK-Lösung, die 0,02% Tanninsäure enthielt, behandelt.

1 ml der PPK-Lösung, die 25 mg tanninsäurebehandelten Träger enthielt, wurde mit ImI 0,15 m PPK-Lösung, die 2 mg eines Protein-Antigens, d. h. Streptolysin 0, enthielt, gemischt und das Gemis:.h bei 37⁰C und pH 6,4 40 Minuten stehengelassen, um die Adsorption des Antigens auf dem Träger zu bewirken.

Der Träger mit dem adsorbierten Antigen (d. h. »die mit Streptolysin 0 sensibilisierte Zelle«) wurde mit der 0,15 m PPK-Lösung (pH 7,2) gewaschen und dann die sensibilisierte Zelle in die 0,15 m PPK-Lösung, die normales Kaninchenserum und Glycin enthielt, suspendiert Auf diese Weise wurde eine Suspension der gewünschten sensibilisierten Zelle (Indikator) zur Verwendung bei der passiven Agglutination erhalten. Es ist darauf hinzuweisen, daß der oben angegebene, mit Tanninsäure behandelte Träger andere verschiedene Antigene, beispielsweise Streptokinase, Treponema palladium-Zellkomponente, Thyroglobulin u. dgl., in der gleichen Weise, wie oben beschrieben, adsorbieren kann und daß die so erhaltenen sensibilisierten Zellen vorzugsweise zu der entsprechenden passiven Agglutinierung verwendet werden können.

In dem oben angegebenen Beispiel wurden die mit Formaldehyd fixierten Mikroorganismen bei einer Temperatur von 120⁰C 20 Minuten erhitzt. Die so behandelten Mikroorganismen wurden mit nichtbehandelten und nur mit Formaldehyd fixierten Mikroorganismen in der folgenden Weise verglichen.

100 mg von jedem der angegebenen Mikroorganismen wurden entsprechend in 1 ml destilliertem Wasser suspendiert, und 1 ml einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumeitrat wurde zu der Suspension gegeben, um die Koagulierung zu vergleichen.
Folgende Ergebnisse wurden erhalten.

Mikroorganismen Koagulierungsgrad

nicht fixiert (nicht behandelte) .. vollständig

fixiert mit Formaldehyd mäßig

fixiert nach der vorliegenden

Erfindung nicht

Im allgemeinen haben Kolloide Teilchengrößen im Bereich von 0,001 bis 0,1 μηι. Die in dieser Erfindung verwendeten Mikroorganismen haben aber Abmessunger von 0,2 bis 5 μηι. Solche Mikroorganismen sind genaugenommen keine Kolloide. Jedoch zeigen wäßrige Suspensionen von diesen Mikroorganismen ein der kolloidalen Lösung ähnliches Verhalten.

In der Kolloidchemie ist es allgemein bekannt, daß durch Zugabe einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumeitrat eine hydrophile kolloidale Lösung leicht und eine hydrophobe kolloidale Lösung schwer zum Koagulieren zu bringen ist, d. h., daß die gerättigte wäßrige Lösung von Natriumeitrat zur Feststellung geeignet ist, ob ein hydrophiles oder hydrophobes Kolloid vorliegt.

Aus dem oben angegebenen Ergebnis kann daher ersehen werden, daß die Mikroorganismen durch die Wärmefixierung ihren hydrophilen kolloidalen Zustand verändert haben.

Um nun die Überlegenheit der vorliegenden Erfindung darzulegen, wurde eine Versuchsreihe durchgeführt, bei der die Passivagglutination der sensibilisierten Zellen verglichen wurde.

1. Herstellung der
sensibilisierten Zellen mit Streptolysin 0

a) Die sensibilisierte Zelle A wurde dadurch hergestellt, daß man das obenerwähnte Verfahren anwendete, ausgenommen, daß die Formaldehydfixierung und die Wärmefixierung nicht durchgeführt wurde.

b) Die sensibilisierte Zelle B wurde nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt, ausgenommen, daß die Wärmefixierung nicht durchgeführt wurde.

c) Pie sensibilisierte Zelle C-I sowie die sensibilisierten Zellen C-2 bis C-6 vuxden nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt, ausgenommen, daß die Wärmefixierung unter Verwendung der folgenden Temperaturen und Zeiten an Stelle einer Temperatur von 120⁰C und 20 Minuten durchgeführt wurde.

Sensibilisierte Zelle C-2 90⁰C, 12 Stunden.

Sensibilisierte Zelle C-3 100° C, 5 Stunden.

Sensibilisierte Zelle C-4 110⁰C, 1 Stunde.

Sensibilisierte Zelle C-5 130⁰C, 10 Minuten.

Sensibilisierte Zelle C-6 135°C₅ 5 Minuten.

2. Untersuchungsverfahren
a) Die Passivagglutination wurde wie foflgt ver-

glichen:

Verdünnte Sera wurden wie folgt hergestellt: Ein Serum, das aus dem mit Streptococcus hemolyticus infizierten Blut erhalten wurde, wurde auf die gewünschte Konzentration mit 0,15 m PPK-Lösung verdünnt. Der Verdünnungsgrad betrug 1:10, 1:20, 1:40, 1: 80, 1:160, 1: 320, 1: 640 und 1:1280.

Die Passivagglutination wurde dadurch beobachtet, daß man einen Tropfen von jeder Suspension der sensibilisierten ZeIIeA bis C-6 zu jedem der verdünnten Sera gab.

b) Spezifische Viskositäten der Suspension der sensibilisierten Zellen A bis C-6 wurden bei einer Temperatur von 25° C mit dem Ostwald-Viskometer bestimmt. In diesem Falle wurde die Suspension, die 10 mg sensibilisierte Zellen in 1 ml enthielt, verwendet.

3. Ergebnisse a) Ergebnisse nach dem Untersuchungsverfahren a)

Sensibilisierte	1:10	1:20	Grad der Verdünnung des Serums	1:40	1:80	1:160	1:320	1:640	1:1280*)
Zelle
A	-\|-	_\|-						*—
B		+ +			+ +	+
C-I							_
C-2	+ +	+ +	+ +		_\|_
C-3			+ +	+ +	_\|_
C-4		+ +
C-5	+ +	++	++	++	+
C-6

*) = keine Agglutinierung,
⁺ = mäßige Agglutinierung,
++ = vollständige Agglutinierung.

b) Ergebnisse nach dem Untersuchungsverfahren b)

Sensibilisierte Zelle Spezifische Viskosität

A 1,0310

B 1,0287

C-I 1,0195

C-2 1,0245

C-3 1,0234

C-4 1,0215

C-5 1,0223

C-6 1,0205

4. Analyse

Aus den Ergebnissen der Untersuchungen ist zu ersehen, daß die sensibilisierten Zellen C-I bis C-6 bevorzugt zur Passivagglutination verwendet werden, wobei diese sensibilisierten Zellen dadurch hergestellt werden, daß man Mikroorganismen verwendet, die der Formaldehydfixierung und Wärmefixierung bei einer Temperatur von 90 bis 135°C wenigstens Minuten unterworfen wurden.

Die Suspensionen der sensibilisierten Zellen C-I bis C-6 haben eine geringe spezifische Viskosität. Eine derartige geringe Viskosität der Suspension ist der Änderung des hydrophilen kolloidalen Zustands in den hydrophoben kolloidalen Zustand des Mikroorganismus zuzuschreiben. Nach der Erfindung werden die sensibilisierten Zellen, die aus den Mikroorganismen des hydrophoben kolloidalen Zustandes hergestellt werden, bevorzugt zur passiven Agglutination verwendet. Außerdem können die — wie oben angegeben — erhaltenen sensibilisierten Zellen sehr gut mit einem Farbstoff, wie Fuchsin oder Methylen-Blau, gefärbt werden. Die Passivagglutination ist leichter festzustellen, wenn man gefärbte sensibilisierte Zellen verwendet oder man die Farbstoffe dem Medium zugibt, das zur Verdünnung des zur Prüfung vorgesehenen Serums verwendet wird.

Bei der obenerwähnten Formaldehydfixierung kann die Konzentration einer Formaldehydlösung, die Temperatur der Lösung und die Fixierzeit gegebenenfalls und abhängig von der Art des zur Behandlung vorgesehenen Mikroorganismus geändert werden. Im allgemeinen kann die Konzentration von 0,2 bis 20 %, die Temperatur 0 bis 37°C und eine Zeit von 30 Minuten bis 72 Stunden nach Wunsch verwendet werden.

Beispiel 2

Eine sensibilisierte Zelle wurde dadurch hergestellt, daß man das Verfahren analog Beispiel 1 wiederholte, ausgenommen, daß:

1. Saccharomyces cerevisiae, die in einem Agarkulturmedium, das 1% Maltose enthielt, kultiviert wurden, als Träger an Stelle von Bnicella abortus verwendet wurden;

2. ein Antigen, »Treponema pallidium-Zellkomponente«, an Stelle von Streptolysin 0 verwendet wurde, und

3. ein Serum, das aus mit Syphilis infiziertem Blut erhalten wurde, an Stelle eines Serums, das man aus mit Streptococcus hemolyticus infiziertem Blut erhalten hatte, verwendet wurde.

Die so hergestellten sensibüisierten Zellen zeigten ähnliche Eigenschaften wie die sensibüisierten Zellen des Beispieles 1 hinsichtlich der Antigen-Antikörper-Reaktion.

In den oben angegebenen Beispielen 1 und 2 handelte

es sich um sensibüisierte Zellen, bei denen ein Antigen auf den Träger adsorbiert wurde. Es können jedoch die Mikroorganismen, die der Formaldehyd-Fixierung und der Wärmefixierung unterworfen wurden, ebenso als Träger verwendet werden, auf die ein Antikörper adsorbiert wird, und die so sensibüisierten Zellen, auf die der Antikörper adsorbiert ist, können mit dem entsprechenden Antigen reagieren, wodurch die passive Agglutination in ähnlicher Weise wie in den Bei-

o spielen 1 und 2 bewirkt wird.

Claims

1 O 2

im allgemeinen groß. Es kann daher, wenn solche

Patentanspruch: biologische Träger verwendet werden, eine Untersuchung der Agglutinationsreaktion nur in einem

Verfahren zur Herstellung von zur passiven relativ großen Gefäß, wie einem Reagenzglas, durchAgglutination geeigneten Trägerteilchen aus mit 5 geführt werden.

Formaldehyd behandelten Mikroorganismen, da- Wenn die Untersuchung auf einem Objektträger

durch gekennzeichnet, daß man die durchgeführt wird, können die bevorzugten Agglutina-