DE2221927A1 - Diagnostikum,Verfahren zu seiner Herstellung und diagnostisches Verfahren - Google Patents

Description

SSSSSS» (

DR. TH. BERENDI
• PATENTANVMLT

Aktiebolaget Leo, Hälsovägen, Helsingborg, Schweden

Diagnostikum, Verfahren zu seiner Herstellung und diagnostisches Verfahren

Bei vielen tiefsitzenden bakteriellen Infektionen, insbesondere bei Infektionen durch Staphylokokken, ist es schwierig oder sogar unmöglich, mittels einer ■Bakterienkultur eine Diagnose zu stellen.

Zur Ergänzung von Bakterienkulturen ist das serologische Verfahren, das gegenwärtig angewendet wird, auf das.Auffinden von Serum-Antikörpern gerichtet, die auftreten, wenn ein hämolysierendes Enzym vorliegt, das durch die infizierenden Bakterien gebildet wird. Um eine Staphylokokkeninfektion aufzufinden und zu diagnostizieren, wird der sogenannte Antistaphylolysintest (ASta) verwendet. Dieser Test gibt jedoch eine ziemlich starke positive Reaktion bei etwa 10 % gesunden Personen und eine eindeutig positive Reaktion bsi nur etwa 30 % Personen, die derartige Infektionen aufweisen. Hieraus ergibt sich der Bedarf für eine bessere serologische Reaktion bei Staphylokokkeninfektionen.

Es ist eine indirekte Hämagglutination als empfindliches Mittel zum Aufspüren von Virus-Antikörpern bekannt, die jedoch nicht als diagnostisches Mittel zum Aufspüren der Gegenwart von Antikörpern von Phagen angewendet worden ist. Bei einem solchen Mittel wird die Agglutination von Erythrozyten hervorgerufen, die stattfindet,

- 2 209847/1203

wenn Virus-Antikörper mit Antigenen reagieren, die auf den Oberflächen von Erythrozyten adsorbiert worden sind. Die Adsorption von pathogenen Viren an Erythrozyten, die mit Gerbsäure in gepufferten Salzlösungen vorbehandelt sind, ist in Friedman et al·-, Proc.SocExp.Biol. & Med. , Bd. 74, Seite 712 (1957) und auch von Feiton et al., in J. Immun. Bd. 86, Seite 42 (1961) beschrieben. Das beschriebene Verfahren ist jedoch nicht anwendbar, um Bakteriophagen-Antikörper aufzuspüren, weil die Phagen nicht an Erythrozyten in gepufferten Salzlösungen bei irgendeinem pH-Wert adsorbiert werden. Außerdem ist der Komplex aus Antigen und Erythrozyt nicht sehr stabil und kann nicht über längere Zeitspannen ohne Verschlechterung der Eigenschaften konserviert werden. Für praktische Anwendungszwecke und die leichte Verfügbarkeit eines solchen diagnostischen Verfahrens ist dies natürlich von entscheidender Bedeutung.

Ziel der Erfindung ist dementsprechend die Schaffung eines diagnostischen Verfahrens und eines Mittels zum Aufspüren der Gegenwart einer bakteriellen Infektion.

Weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung eines Diagnostikums aus einem stabilen Komplex aus Phagen und Erythrozyten mit nicht beeinträchtigten antigenen Stellen der Bakteriophagen.

Weitere Ziele der Erfindung ergeben sich dem Fachmann aus der folgenden Beschreibung mit Ansprüchen.

Die Erfindung sieht ein diagnostisches Verfahren für bakterielle Infektionen vor, bei dem die indirekte Hämagglutination benutzt wird, um die Gegenwart von

209847/1203

Bakteriophagen-Antikörpern zu testen. Das diagnostische Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß ein aliquoter Teil Serum aus einem leitenden, tierischen oder menschlichen Körper, bei dem der Verdacht auf eine bakterielle Infektion besteht, mit Erythrozyten vermischt wird, die darauf fixierte bekannte Bakteriophagen tragen. Wenn Serum-Antikörper gegen die Phagen, die von den Erythrozyten getragen werden, vorliegen, wird eine Hämagglutination stattfinden, wodurch angezeigt wird, daß eine bakterielle Infektion im lebenden tierischen oder menschlichen Körper vorhanden ist. Die den Bakterien entsprechenden Phagen sind hierbei von einem Typ ähnlich demjenigen, der den von den Erythrozyten getragenen Phagen entspricht.

Die Phagen tragenden Erythrozyten werden hergestellt, indem zuerst die Erythrozyten mit einem aliphatischen Aldehyd, vorzugsweise Formaldehyd, behandelt werden und anschließend in einem geeigneten Medium bei einer Temperatur oberhalb etwa 4-5°C, vorzugsweise im Bereich von etwa 50 bis §twa 60°C, und in Gegenwart eines Zuckers, wie Glukose, oder eines Proteins, wie Pepton, Serumglobulin oder Albumin, mit den Bakteriophagen in Berührung gebracht werden. Die Bakteriophagen, die an den Erythrozyten anhaften, werden darauf durch anschließende Aldehydbehandlung fixiert. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die mit dem Aldehyd behandelten Erythrozyten weiter mit Gerbsäure behandelt, also gegerbt, bevor die Bakteriophagen zugesetzt werden.

2098 k7/1203

Herstellung der Phagen tragenden Erythrozyten

Erythrozyten, die als Träger von Bekteriophagen gemäß der Erfindung verwendet werden, können von jeder geeigneten Quelle gewonnen werden. Bevorzugt sind Erythrozyten von Schafen, die in geeigneter Weise gewaschen worden sind. Es können jedoch auch Erythrozyten von Kaninchen, Menschen und dergl. verwendet werden.

Geeignete Phagen werden erhalten durch Züchten einer Kultur des sich ausbreitenden Stammes von Bakterien, bis die Kultur einen vorbestimmten Punkt der logarithmischen Wachstumskurve erreicht hat, der für jede Phagenart unterschiedlich ist. An dieser vorbestimmten Stelle wird eine bekannte Menge eines Inokulums von Phagen zugesetzt, das sofort die Bakterienzellen dadurch anzugreifen beginnt, daß die Phagen die Zellmembran durchdringen, sich innerhalb der Bakterienzellen vervielfachen und innerhalb weniger Stunden den Zerfall oder die Lyse dieser Zellen verursachen. Phagen, die in dieser Weise aus den Zellen freigesetzt werden, verbleiben in suspendierter Form im Kulturmedium. Das Kulturmedium wird danach zentrifugiert und filtriert, um die schwereren Zellfragmente zu entfernen, wodurch eine klare Brühe zurückbleibt, welche die Phagen enthält.

Die Erythrozyten werden zunächst mit einer wäßrigen Lösung eines aliphatischen Aldehyds, wie Formaldehyd, behandelt. Vorzugsweise liegt die Aldehydkonzentration im Bereich von etwa 0,5 bis etwa 5 Vol.-%, vorzugsweise bei etwa 1 Vol.-%. Die Temperatur der Lösung

- 5 -20 9 8 Λ 7 / 1 203

ist nicht kritisch, sollte jedoch nicht so hoch liegen, daß die Erythrozyten hamolysiert werden. Typische aliphatische Aldehyde außer Formaldehyd, die verwendet werden können, sind solche mit bis zu etwa 5 Kohlenstoffatomen, wie Glutaraldehyd, Methylglyoxal und dergl..

TJm das Anhaften eines Bakteriophagen an der Oberfläche des Erythrozyten zu fördern, insbesondere wenn der Erythrozyt mit Formaldehyd behandelt worden ist, ist es zweckmäßig_v den mit Aldehyd behandelten Erythrozyt mit einem die Haftung fördernden Mittel in Berührung zu bringen, wie mit einer wäßrigen Gerbsäurelösung, während einer Zeitspanne von etwa 15 Minuten bis etwa 60 Minuten, vorzugsweise etwa JO Minuten. Die Gerbsäurekonzentration kann von etwa 0,1 bis etwa 0,0001 Gew.-%, vorzugsweise von etwa 0,01 bis etwa 0,001 Gew.-% betragen. Anstelle von Gerbsäure kann gegebenenfalls diazotiertes Benzidin in ähnlichen Konzentrationen verwendet werden.

Wenn Methylglyoxal zur Behandlung der Erythrozyten verwendet wird, kann die Gerbsäurebßhandlung gewöhnlich fortgelassen werden.

Das Anhaften eines Bakteriophagen an einen Erythrozyten gemäß der beschriebenen Darstellungsweise wird bei erhöhter Temperatur von wenigstens etwa 4-5°C, vor- ■ zugsweise bei einer Temperatur von etwa 50 bis etwa 60°C in Gegenwart eines Zuckers, wie Glukose, oder eines Proteins, wie Pepton, vorzugsweise in einer Menge von etwa 0,05 bis etwa 5 Gew.-%, bezogen auf die Menge der vorhandenen Erythrozyten, erreicht. Gewöhnlich

- 6 209847/1203

wird eine wäßrige Suspension der Erythrozyten mit einer wäßrigen Suspension, die die gewünschten Bakteriophagen enthält, vermischt, das Gemisch über eine. Zeitspanne von etwa 3 bis etwa 60 Minuten, vorzugsweise etwa 20 Minuten,inkubiert.

Die Bakteriophagen werden dann auf den Erythrozyten durch eine anschließende Behandlung mit einer wäßrigen Lösung eines aliphatischen Aldehyds, vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 35 bis etwa 60°C, insbesondere von etwa 40 bis etwa 50°C fixiert. Temperaturen, die 60⁰C stark überschreiten, sind unzweckmäßig, weil Änderungen in der Natur der Phagenproteine verursacht werden können. Die Aldehydkonzentration in der Lösung kann schwanken, liegt jedoch vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis etwa 5 Vol.-%, insbesondere bei etwa 1 YoI.-%. Die Fixierungsdauer bei den vorgenannten Temperaturen kann von etwa 10 Minuten bis etwa 10 Stunden betragen, je nach den bestimmten Bakteriophagen, die adsorbiert werden. Gewöhnlich reicht eine Fixierungsdauer von einer Stunde aus.

Die in dieser Weise hergestellten Phagen tragenden Erythrozyten können über längere Zeiträume entweder als wäßrige Suspensionen oder als gefriergetrocknete trockene Stoffe, die vor dem Gebrauch wieder suspendiert werden, gelagert werden.

Die Herstellung von Erythrozyten, die als diagnostische Mittel geeignet sind und auf denen Bakteriophagen fixiert sind, ist in den folgenden Beispielen erläutert.

209847/1203 - 7 -

Beispiel 1 Formalinbehandlung

Es wird Blut von Schafen, das in der Lösung nach Alsever gesammelt worden ist (vgl. Bukantz et al., J. Lab. Olin. Med., Bd.3, Seite 394 (1946))und bei 4⁰C gelagert worden ist, zentrifugiert und die Erythrozyten daraus isoliert. Die Erythrozyten werden dann dreimal durch Zentrifugieren in 0,9 Gew.-%iger Kochsalzlösung gewaschen und in Kochsalzlösung bei einer Erythrozytenkonzentration von etwa 8 % suspendiert.

Es werden gleiche Teile der 8 %igen Erythrozytensuspension in Kochsalzlösung und eine 3 Gew.-%ige Formaldehydlösung vermischt und das erhaltene Gemisch etwa 18 bis 24 Stunden bei 37⁰O inkubiert. Nach der Inkubation werden die Erythrozyten durch Zentrifugieren isoliert, dreimal gewaschen und erneut in Kochsalzlösung in eine Erythrozytenkonzentration von 10 % suspendiert. Es wird dann Natriumäthylmercurithiosalicylat (Merthiolat) zur Erythrozytensuspension bis auf eine Endkonzentration von 1:10 000 (Gewicht auf Volumen) zugesetzt, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern, und die Erythrozyten werden bei 4°C gelagert.

Beispiel 2 Gerbsäurebehandlung

Erythrozyten, die gemäß Beispiel 1 mit Formalin behandelt waren, werden dreimal in mit 0,15 Mol Phosphatpuffer versetzter Kochsalzlösung (pH-Wert 6,4) gewaschen und erneut in einer Konfcenifr.&liiQ.n von 5 % suspendiert.

- 8 209847/1203

Gleiche !Teile der 5 %igen Erythrozytensuspension und einer Gerbsäurelösung werden dann vereinigt und 50 Minuten bei 56⁰C inkubiert· Die Endkonzentration der Gerbsäure beträgt gewöhnlich 1:40 000 (Gewicht auf Volumen). Nach der Inkubationszeit werden die Erythrozyten erneut dreimal im genannten Puffer gewaschen·

Beispiel 3 Fixierung von Phasen an die gegerbten Erythrozyten

Eine wäßrige Brühe, die Phagen enthielt, wird mit Erythrozyten vermischt, die in der in den Beispielen 1 und 2 genannten Wefee behandelt worden waren. Das erhaltene Gemisch wird danach 20 Minuten bei etwa 56⁰O inkubiert und anschließend auf Raumtemperatur gekühlt· Die mit Phagen beschichteten Erythrozyten werden aus dem Gemisch durch Zentrifugieren isoliert und zu einer Λ bis 2 #igen Suspension in einer 1 Gew.-#igen wäßrigen Formaldehydlösung suspendiert» Diese Suspension wird dann 45 Minuten lang bei etwa 45⁰C inkubiert, die Erythrozyten durch Zentrifugieren isoliert, in gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und ^Lagerung in einer gewünschten Konzentration erneut suspendiert.

Diagnostizierverfahren

Das Diagnostizierverfahren unter Verwendung der in der vorgenannten Weise hergestellten Erythrozyten besteht in deren Zugabe zu einem aliquoten Teil Serum aus einem lebenden tierischen oder menschlichen Körper, der in Verdacht steht, an einer bakteriellen Infektion zu leiden. Die Hämagglutination der Erythrozyten ist

- 9 209847/1203

ein Zeichen dafür, daß im Serum Phagen-Antikörper vorliegen. Im Fall von Staphylokokkeninfektionen wurden etwa 50 Phagen, die von Bakterien des""Stammes Staphylococcus gewonnen waren, serologisch hinsichtlich ihrer Antigenstruktur mit Hilfe des indirekten Hämagglutinationstests gruppiert. Es wurde gefunden, daß alle diese Phagen in eine von vier Gruppen eingeordnet werden können, nämlich" C1, 02, CJ und C4-. Phagen innerhalb der gleichen Gruppe sind bezüglich der antigenen Eigenschaften identisch, haben jedoch keine Antigene gemeinsam mit Phagen, die einer der anderen Gruppen zugehören· Unter Anwendung dieser Gruppierung schafft das erfindungsgemäße Verfahren ein viel empfindlicheres Mittel zum Auffinden von Serum-Antikörpern gegen Phagen von Staphylokokken und somit gegen Staphylokokkeninfektionen als jeder andere bisher bekannte Test.

Mit der Durchführung des erfinduagsgemäBeB, Verfahrens wird der aliquote Serumteil gewöhnlich, einer Verdünnungsreihe unterworfen, z.B. einer zweifachen Verdünnung, und mit einer bekannten Menge der Phagen tragenden Erythrozyten vermischt. Je höher die Verdünnung ist, bei der eine Hämagglutination auftritt, desto größer ist die Zahl der Antikörper im Serum.

Beispiel "4-

Vergleich der Antistaphylolysinreaktion (ASta) und der Antistaphylophagenreaktion (ASPA)

ASta-Reaktion

Es werden aliquote Serummengen, die' von einem Pa-

- 10 209847/1 203

tienten gewonnen worden sind, mit Kochsalzlösung einer Rei Verdünnung unterworfen und Jn getrennten Röhrchen aufbewahrt. Eine vorbestimmte Menge Staphylolysin mit bekannter Stärke ,. ausgedrückt in internationalen Einheiten, wird zu jedem Röhrchen zugegeben, und die Röhrchen werden etwa 30 Minuten bei 37° C inkubiert und dann mit einer 2 Gew.-%igen Suspension gewaschener Kaninchen-Erythrozyten versetzt· Die Röhrchen werden danach weiter etwa 1 Stunde bei 37⁰C inkubiert und etwa 3 bis 16 Stunden bei 4-⁰C aufbewahrt. Danach wird die Zahl der Antitoxineinheiten (Antistaphylolysineinheiten), die vorliegen, dadurch bestimmt, daß der G-rad der Hämolyse der Erythrozyten bestimmt wird. Das Toxin hämolysiert die Erythrozyten, die vorhanden sind, aber das im Serum des Patienten vorhandene Antitoxin neutralisiert die Wirkung des Toxins, Somit kann das Serum um so stärker verdünnt werden, während es immer noch die Fähigkeit zur neutralisation des Toxins beibehält, je höher die Menge von Antitoxin im Serum ist. Die Menge im Serum v/ird in Einheiten ausgedrückt.

ASPA-Reaktion

Es werden wäßrige Suspensionen von Erythrozyten ^svon Schafen mit darauf fixierten Phagen von Staphylokokken, die jeweils eine der serologischen Hauptgruppen entsprechend ihrer Capside darstellen, hergestellt. Derartige mit Phagen bedeckten Erytürozyten können wenigstens etwa 8 Monate bei 4-⁰G ohne Abbau gelagert werden.

Aliquote Teile Serum you einem Patienten werden mit

unbeschichteten Erythrozyten vermischt, und das erhaltene Gemisch wird s"cwa 1 Stusde bei etws. Eaumtempera-

- 11 -

209847/1203

tür aufbewahrt, um heterophile Antikörper aus dem Serum zu entfernen, d.h. solche Antikörper, die gegen Erythrozyten wirksam sind. Danach werden die Erythrozyten durch Zentrifugieren abgetrennt, und es werden zweifache Verdünnungsreihen des Serums ohne heterophile Antikörper mit einer bekannten Menge der mit Phagen beschichteten Erythrozyten in kleinen Röhrchen oder Bechern mit ruhendem Boden vermischt. Beim Mischen und Inkubieren findet eine Hamagglutination in Gegenwart von Phagen-Antikörpern statt. Die Hämagglutinationsreaktion findet/iiwa Raumtemperatur in etwa 2 Stunden statt. Je mehr der aliquote Serumteil verdünnt werden kann und immer noch eine Hamagglutination ergibt, desto mehr Antikörper (höherer Tit er) sind in dem Serum eines Patienten vorhanden.

Vergleich der Reaktionen

Es wird von 10 Patienten gewonnenes Serum mit tiefsitzenden Staphylokokkeninfektionen, die durch Kultivieren von Staphylokokkenstämmen aus den krankhaften Veränderungen bei den Patienten sichergestellt waren, in gleiche Teile aufgeteilt und den beiden Testen ASta und ASPA wie oben unterworfen. Die Versuchswerte sind in der folgenden Tabelle I wiedergegeben. Die Werte der ASPA-Titer sind in der Tabelle wiedergegeben.

Grenzwert (ASta):

2,2 Einheiten, d.h. ^2,2:negativ und J^2,2:positiv

Grenzwert (ASPA):

Titer 1/40, d.h. <^1/40«.negativ und ^>1/40jpositiv

2098 U 7/1203 -12-

- 12 Tabelle I

Patient	Verwendeter (Pest	ASta- Einheiten	ASPA-Titer	Cap sid-Grupp e	2
P.A., 12. 10. 52 B.B., 24. 9. 27 I. G., 2. 12. 42 K.H., 18. 1. 58 L.H., 9. 12. 26 G.M., 11. 4. 25 S.N., 18. 10. 10 CA., 19. 11. 19 V.B. , 21. 4. 13 G.J., 23. 2. 3	5,0 2,2 1,9 7,5 0,75 0,6 7,5 0,6 0,6 1,25	Oapsid-Gruppe 1	1/320 0/40 <1/40 <1/40 1/320 1/320 <1/40 1/160 1/640 1/160
1/640 1/160 1/320 1/160 1/640 41/40 1/320 <1/40 1/1280 ^1/40

Aus den Werten Tabelle I ist ersichtlich., daß das diagnostische Verfahren gemäß der Erfindung (ASPA-Test) viel empfindlicher ist. Nach dem ASta-Test wird eine negative Beurteilung bei 6 von 10 infizierten Patienten erhalten, während gemäß dem ASPA-Test eine positive Anzeige in allen Fällen erhalten wurde.

Die vorstehende Beschreibung und die Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken. Weitere Abänderungen innerhalb des Erfindungsgedankens sind dem Fachmann leicht ersichtlich.

2 O 9 8 k 7 / 1 2 O 3

Claims (9)

Patentansprüche

1. Diagnostisches Präparat für die serologische Diagnose von bakteriellen Infektionen, dadurch gekennzeichnet, daß es Erythrozyten enthält, auf welche der zu diagnostizierenden Bakerienart entsprechende Bakteriophagen auffixiert sind. ;

2. Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Erythrozyten mit einer wässrigen Lösung eines aliphatischen Aldehyds in Berührung bringt, die mit dem Aldehyd behandelten Erythrozyten mit Bakteriophagen bei einer Temperatur über etwa 45⁰C und in Gegenwart einer organischen Substanz zum Anheften der Phagen an die Erythrozyten in Berührung bringt und danach die an den Erythrozyten anhaftenden Phagen durch Zusammenbringen der die Phagen tragenden Erythrozyten mit einer wässrigen Lösung eines alipha.tisehen Aldehyds auffixiert.

3. Verfahren nach Anspruchs, dadurch gekennzeichnet, daß ^J man Erythrozyten von Schafen verwendet und als Aldehyd-Formaldehyd verwendet. _

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichent, daß man die Erythrozyten mit den Phagen bei einer Temperatur von etwa 50 bis etwa 6O⁰C in Berührung bringt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die mit Aldehyd behandelten Erythrozyten weiter mit Gerbsäure in Berührung Mngt, bevor sie mit den Phagen in Berührung gebracht werden.

- 14 -

209847/12 0 3

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man Phagen von Bakterien des Stamms Staphylococcus verwendet.

7. Verfahren zur serologischen Diagnose einer bakteriellen Infektion unter Verwendung des diagnostischen Präparats nach Anspruch 1 beziehungsweise das nach einem der Ansprüche 2 bis 6 hergestellt worden ist, dadurch gekennzeichnet, daß man soviel Serum aus dem Blut eines infektionsverdächtigen Menschen oder Tieres mit dem diagnostischen Präparats vermischt, das bei Vorhandensein voi/xnfektion entsprechenden Bakteriophagen-Antikörpern im·Serum, die den Bakteriophagen im Präparat entsprechen, Hämagglutination auftritt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeicöBt, daß man einen aliquoten Teil des Serums einer Reihenverdünnung unterwirft und dieverdünnten Anteile mit bekannten Mengen der die Phagen tragenden Erythrozyten vermischt.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man das Serum mit Erythrozyten zur Entfernung heterophiler Antikörper aus dem Serum vorbehandelt, bevor man die Phagen tragenden Erythrozyten mit dem Serum vermischt.

209847/1203