DE2652091C2 - Hämagglutinations-Hemmungstest für Togaviren - Google Patents

Hämagglutinations-Hemmungstest für Togaviren

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Description

  • Die Erfindung betrifft einen verbesserten Hämagglutinations-Hemmungstest für Togaviren.
  • Der Hämagglutinations-Hemmungstest (nachfolgend kurz als HI-Test bezeichnet) eines Togavirus wie Rubella ist empfindlicher und zweckmäßiger durchzuführen als Neutralisations- und Komplement-Fixierungstests und stellt ein nützliches Mittel der serologischen Diagnose dar. Jedoch werden stark falsch-positive Reaktionen mit Serum des Menschen und anderer Tiere erhalten, die üblicherweise solchen HI-Tests unterworfen werden, da diese Seren Hämagglutinations-Hemmer enthalten, die nicht spezifisch für die Togavirus-spezifischen Hämagglutinierungs-Antigene sind. Zum Zweck der Entfernung dieser Hämagglutinations-Inhibitoren werden Techniken wie die Adsorption an Kaolin und die Acetonextraktion üblicherweise angewendet. Im Fall des HI-Tests für den Rubella-Virus wurde vorteilhaft die Ausfällung mit Heparin-MnCl&sub2; oder Dextransulfat-CaCl&sub2; auf Grund ihrer hohen Reproduzierbarkeit angewendet. Jedoch ist Kaolin ein nicht-spezifisches Adsorbens, das nicht nur die nicht-spezifischen Inhibitoren der Hämagglutinierungshemmung, sondern auch den Hämagglutinationshemmungs-Antikörper (nachfolgend kurz als HI-Antikörper bezeichnet) selbst adsorbiert, wodurch falsch-negative Reaktionen hervorgerufen werden, Aceton andererseits denaturiert und inaktiviert die Antikörpermoleküle und verursacht dadurch ähnlich falsch-negative Reaktionen. Im Fall der Heparin- MnCl&sub2;- oder Dextransulfat-CaCl&sub2;-Methode müssen die Reagenzien in hohen Konzentrationen angewendet werden, um die nicht-spezifischen Hemmer der Hämagglutination zu entfernen, jedoch kommt es in der Praxis zu einem schlechten Hämagglutinationsbild und daher zu einem häufigen Versagen bei der genauen Auswertung des Testergebnisses. Weiter erfordern diese Techniken unvermeidlich eine Zentrifugierung zur Abtrennung der nicht-spezifischen Inhibitoren der Hämagglutination vom HI-Antikörper, so daß HI-Tests in großem Maßstab zeitraubend und beschwerlich bei der Durchführung sind.
  • Aus der Veröffentlichung in Med. Microbiol. Immunol. 161, 99-106 (1975) ist außerdem bekannt, den Hämagglutinations-Hemmungstest für Toga-Viren so durchzuführen, daß man das Versuchsserum mit Phospholipase C behandelt, mit Toga-Viren spezifischen Hämagglutinationsantigenen mischt und Erythrocyten hinzufügt. Die Phospholipase C wird dabei entweder in einer insolubilisierten Form oder in einer 0,2%igen Lösung angewandt. Auch dieser Test zeigt nicht die notwendige Genauigkeit und Empfindlichkeit. Mit diesem technischen Hintergrund wurde nun überraschenderweise gefunden, daß nicht-spezifische Inhibitoren der Hämagglutinations, die in einem Versuchsserum für den HI-Test für einen Toga-Virus auftreten, im wesentlichen vollständig inaktiviert werden können, indem man Phospholipase C in einer bestimmten, niedrigen Konzentration auf das Versuchsserum einwirken läßt, ohne die Aktivität des Toga-Virus spezifischen HI-Antikörpers im Serum zu beeinträchtigen und das durch Unterwerfung des so behandelten Versuchsserum dem HI-Test unter Verwendung fixierter Erythrocyten der Titer an Toga-Virus spezifischem Antikörper im Versuchsserum mit der gewünschten Genauigkeit und hohen Empfindlichkeit bestimmt werden kann.
  • Es ist daher ein Gegenstand der Erfindung, eine verbesserte HI-Test-Methode zur Verfügung zu stellen.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auf einen Hämagglutinationshemmungstest für Toga-Viren, bei dem man das Versuchsserum mit Phospholipase C behandelt, mit Toga-Virus spezifischen Hämagglutinationsantigenen mischt und Erythrocyten hinzufügt, der dadurch gekennzeichnet ist, daß das Versuchsserum mit einer wäßrigen Lösung 0,04 bis 0,12 Einheiten/ml an Phospholipase C behandelt, bevor es mit fixierten Erythrocyten vermischt wird.
  • Die Erfindung ist für alle Arten von Togaviren, die empfindlich auf HI-Tests reagieren, geeignet, wie den Rubella-Virus, Arbo-Virus, (z. B. den japanischen Encephalitis-Virus), Gelbfieber-Virus, Dengue-Virus, den Westnil-Virus u. ä. Das Versuchsserum kann jedes Serum sein, das den HI-Tests für die oben genannten Togaviren unterworfen werden kann, z. B. die Sera von warmblütigen Tieren, wie Säugetieren, z. B. Menschen, Rinder, Ratten, Mäuse, Meerschweinchen u. ä. Üblicherweise ist menschliches Serum als Versuchsserum für die Zwecke der Erfindung am besten geeignet.
  • Gemäß der Erfindung wird die Reaktion von Phospholipase C auf das Versuchsserum einfach und glatt durchgeführt, indem die Phospholipase mit dem Serum bei einer Temperatur zwischen etwa 10 und etwa 50°C in Berührung gebracht wird. Die verwendete Phospholipase C kann beliebigen Ursprungs sein. Sie wird in Form einer Lösung angewendet, die 0,04 bis 0,12 Einheiten/ml, insbesondere etwa 0,06 Einheiten/ml Phospholipase C in einem wäßrigen Lösungsmittel (z. B. Wasser, physiologischer Kochsalzlösung, herkömmlichen Puffern usw.), enthält. Diese enzymatische Behandlung kann im allgemeinen durch Zugabe der genannten wäßrigen Lösung von Phospholipase C zu einem Versuchsserum oder einer Serumverdünnung, die durch Verdünnung des Versuchsserums mit einem üblichen Verdünnungsmittel erhalten wird, und Stehenlassen der Mischung bei Temperaturen zwischen etwa 10 und etwa 50°C, vorzugsweise etwa 37°C, während 3 bis 20 Stunden durchgeführt werden.
  • Durch diese Behandlung mit Phospholipase C werden die nichtspezifischen Inhibitoren der Hämagglutination im Versuchsserum hydrolisiert und inaktiviert, wobei jedoch die Aktivität des Togavirus-spezifischen HI-Antikörpers, der in gleichen Serum auftritt, in keiner Weise nachteilig beeinflußt wird. Anders als bei den bekannten Methoden mit Kaolin, Aceton, Heparin-MnCl&sub2; oder Dextransulfat-CaCl&sub2; erfordert das erfindungsgemäß behandelte Versuchsserum keine Zentrifugierstufe, die üblicherweise für die Trennung der nicht-spezifischen Hämagglutinations-Hemmer vom Togavirus-spezifischen HI-Antikörper erforderlich sind. Daher kann das Serum den Togavirus- HI-Tests unterworfen werden, nachdem es lediglich in der herkömmlichen Weise (z. B. durch Inkubation bei 56°C während 30 Min.) inaktiviert und gewünschtenfalls verdünnt worden ist. Die Inaktivierung der Hämagglutinations-Hemmer, die nicht spezifisch für Togavirus-spezifische Hämagglutinations-Antigene sind, kann jedoch nicht durch Einwirkung von Phospholipase A, B und D auf das Versuchsserum erreicht werden.
  • Erfindungsgemäß kann der Gehalt an Togavirus-HI-Antikörpern genau und mit hoher Empfindlichkeit durch Ausführung des Togavirus-HI-Tests unter Verwendung eines Versuchsserums bestimmt werden, in dem jeglicher nicht-spezifischer Hämagglutinations-Hemmer in der oben beschriebenen Weise inaktiviert worden ist. In diesem Zusammenhang wurde überraschenderweise gefunden, daß - obwohl frische Erythrocyten durch die im Serum verbliebene Phospholipase C hämolysiert werden - die fixierten Erythrocyten überhaupt nicht durch Phospholipase C hämolysiert werden, wodurch ein gut definiertes Hämagglutinationsbild erhalten wird.
  • Die Erythrocyten können beliebige Erythrocyten sein, die durch Togavirus-spezifische Hämagglutinierungs-Antigene agglutiniert werden. Es können daher beispielsweise die Erythrocyten von Säugetieren (Schaf, Esel und Mensch, Gruppe 0), und Geflügel (Hühnern, Küken und ausgewachsenen Hühnern, Gänsen, Tauben, Wachteln usw.) vorteilhaft verwendet werden. Die Fixierung solcher Erythrocyten kann auf jede an sich bekannte Weise durchgeführt werden. Formalin-fixierte Erythrocyten sind besonders vorteilhaft. Mit Formalin fixierte Erythrocyten von eintägigen Küken sind z. B. in der japanischen Offenlegungsschrift 26 913/1973 beschrieben und können vorteilhaft verwendet werden.
  • Die HI-Tests können in an sich bekannter Weise durchgeführt werden. So wird das Versuchsserum, in dem jegliche nicht-spezifische Hämagglutinations-Hemmer mit den wäßrigen Lösungen von Phospholipase C inaktiviert worden sind, mit einem Togovirus-spezifischen Hämagglutinations-Antigen und danach mit den fixierten Erythrocyten gemischt, um das Auftreten oder Nichtauftreten von Hämagglutinierung abzuschätzen. Bei der Durchführung des HI-Tests kann jede beliebige für Togavirus-HI-Tests anwendbare Technik benutzt werden, wie die Mikrotiter-Methode. Zum Beispiel kann ein Togavirus-HI-Test wie folgt durchgeführt werden:
    0,025 ml eines Versuchsserums mit inaktivierten nicht-spezifischen Hämagglutinations-Inhibitoren wird fortlaufend in zweifachen Stufen auf einer Mikroplatte verdünnt und 0,025 ml eines Togavirus-spezifischen Hämagglutinations-Antigens mit 4 Hämagglutinationseinheiten wird zugegeben. Das System wird 30 Minuten bei Zimmertemperatur stehengelassen, worauf 0,050 ml einer 0,25%igen Suspension von fixierten Erythrocyten mit der obigen Präparation vermischt werden. Das System wird 60 Minuten bei Zimmertemperatur stehengelassen, worauf das Auftreten oder Nichtauftreten von Hämagglutinierung beobachtet wird. Der Toga-Virus-HI-Antikörper-Titer ist der reziproke Wert des höchsten Verdünnungsfaktors des Versuchsserums mit vollständig inhibierter Hämagglutination. Mit dieser Verfahrensweise kann der Gehalt an Togavirus-HI-Antikörpern des Versuchsserums mit Genauigkeit und hoher Empfindlichkeit bestimmt werden.
  • Die folgenden Beispiele und Versuche veranschaulichen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung.
  • In der Beschreibung und den Ansprüchen bedeuten jeweils "mg", "g", "ml", "°C", "M" und "N" "Milligramme", "Gramm", "Milliliter", "Grad Celcius", "Molare Konzentration" und "Normalität"; Prozentsätze beziehen sich jeweils auf Gewicht/Volumen, falls nicht anderweitig definiert.
    • Beispiel 1
  • Zu 0,1 ml eines menschlichen Versuchsserums für den Togavirus-HI-Test werden 0,2 ml HSAG *¹), sowie 0,1 ml einer wäßrigen Lösung von Phospholipase C *²) (0,06 Einheiten/ml) zugegeben. Das Gemisch wird über Nacht bei 37°C inkubiert. Dann wird 30 Min. bei 56°C inkubiert. Auf diese Weise werden die nicht-spezifischen Inhibitoren der Hämagglutinierung im Versuchsserum inaktiviert.
    • *¹) HSAG: HEPES-Saline-Albumin-Gelatin der folgenden Zusammensetzung:
      HEPES (N-2-hydroxyäthylpiperazin-N&min;-2&min;-äthansulfonsäure 2,97 g
      NaCl 4,09 g
      CaCl&sub2; (wasserfrei) 55,5 mg
      Rinderserumalbumin 1,0 g
      Gelatin 1,25 mg

  • Die obigen Ingredienzien werden in 400 ml destilliertem Wasser gelöst, die Lösung wird auf pH 6,2 mit lN-NaOH eingestellt und mit destilliertem Wasser auf 500 ml aufgefüllt.
    • *²) Die verwendete Phospholipase C ist ein Handelsprodukt, hergestellt aus Clostridium perfringens ("Phospolipase C" hergestellt und verkauft durch P-L Biochemicals, Inc., Milwaukee, USA), wobei eine Einheit dieses Enzyms imstande ist, ein Mikromol des säurelöslichen Phosphors (Phosphors des Phosphorylcholins) pro Minute bei Einwirkung auf Lecithin bei 37°C und pH 7,3 freizusetzen.
    Beispiel 2
  • Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wird wiederholt mit der Ausnahme, daß VBS *³) oder PBS *&sup4;) anstelle von HSAG zur Inaktivierung der nicht-spezifischen Hämagglutinations-Hemmer in den menschlichen Versuchsseren verwendet werden.
    • *³) VBS: Veronal-gepufferte Kochsalzlösung der folgenden Zusammensetzung:
      5 Veronal-Puffer 200 ml
      CaCl&sub2; (wasserfrei) 0,2 g
      MgCl&sub2; · 6 H&sub2;O 0,2 g
      Rinderserumalbumin 1,0 g
      Gelatin 10 mg

  • Die obigen Bestandteile werden mit verdünntem Wasser auf 1000 ml verdünnt.
    • *&sup4;) PBS: Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung der folgenden Zusammensetzung:
      NaCl 8,0 g
      KCl 0,2 g
      KH&sub2;PO&sub4; 0,2 g
      Na&sub2;HPO&sub4; · 2 H&sub2;O 1,44 g
      CaCl&sub2; (wasserfrei) 0,1 g
      MgCl&sub2; · 6 H&sub2;O 0,1 g
      Rinderserumalbumin 2,0 g
      Gelatin 10 mg

  • Die obigen Bestandteile werden in destilliertem Wasser auf 1000 ml gelöst.
    • Beispiel 3
  • Die Seren von Rind, Ratte, Maus und Meerschweinchen werden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei die nicht-spezifischen Inhibitoren der Hämagglutinierung inaktiviert werden.
    • Versuch1 Vergleich von unbehandeltem Serum mit Phospholipase C behandeltem Serum, Kaolin-behandeltem Serum und Dextransulfat-CaCl&sub2;-behandeltem Serum im Rubella-Virus-HI-Test
  • Von jedem menschlichen Versuchsserum werden die folgenden unbehandelten und vorbehandelten Seren a) bis d) hergestellt:
    • a) Unbehandeltes Serum:
      0,1 ml des Versuchsserums wird mit 0,6 ml HSAG verdünnt.
    • b) Phospholipase C-behandeltes Serum:
      0,4 ml des Phospholipase C-behandelten Serums nach Beispiel 1 wird mit 0,3 ml HSAG verdünnt.
    • c) Kaolin-behandeltes Serum:
      0,1 ml des Versuchsserums wird mit 0,3 ml HSAG versetzt. Zu diesem verdünnten Serum, werden 0,4 ml einer 25%igen Suspension gegeben. Das Gemisch wird 30 Min. bei 30°C bebrütet, danach zentrifugiert. Das Überstehende wird 30 Min. bei 56°C zur Inaktivierung des Serums bebrütet.
    • d) Dextransulfat-CaCl&sub2;-behandeltes Serum:
      Zu 0,1 ml des Versuchsserums werden 0,4 ml HSAG gegeben. Dann werden jeweils 0,1 ml 1%iges Dextransulfat und 0,5 M-CaCl&sub2; zu dem verdünnten Serum gegeben. Das Gemisch wird 60 Min. bei 4°C stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Überstand wird zur Inaktivierung des Serums 30 Min. bei 56°C bebrütet.

  • Zu jedem der obigen Seren a) bis d) werden vor der Verwendung im HI-Test 0,1 ml einer 10%igen Suspension von formalin-behandelten Erythrocyten (wie nachfolgend beschrieben) gegeben.
  • Für das mit Phospholipase C behandelte Serum b) werden sowohl die formalinbehandelten, von Eintagsküken stammende (lyophilisierte Erythrocyten, hergestellt nach Beispiel 1 der japanischen Offenlegungsschrift 26 913/1973 resuspendiert in destilliertem Wasser) als auch frische Erythrocyten von Eintagsküken verwendet, während die vorstehend erwähnten und formalinbehandelten Erythrocyten lediglich für die anderen vorbehandelten Seren verwendet werden. Durch die Mikrotiter-Technik von Sever (Journal of Immunology 88 (1962) 320-329) wird der Titer an Rubella-Virus-HI-Antikörper Versuchsseren unter Verwendung von permanenten V-Typ-Platten bestimmt. Die Verdünnung der Seren, HA-Antigen und der Erythrocyten wird stets mit HSAG durchgeführt. Die Resultate sind in der Tabelle 1 enthalten. Tabelle 1 &udf53;vu10&udf54;&udf53;vz26&udf54; &udf53;vu10&udf54;
  • Die Rubella-Virus-HI-Tests unter Verwendung von mit Phospholipase C behandelten Seren werden wiederholt, mit der Ausnahme, daß die formalinbehandelten Erythrocyten von Eintagsküken durch formalinbehandelte Erythrocyten von erwachsenen Hühnchen, einen Tag alten Gänsen oder Schafen ersetzt werden, wobei ähnliche Ergebnisse wie für die Phospholipase C-behandelten Seren in der Tabelle 1 erhalten werden.
    • Versuch 2 Vergleich von unbehandeltem Serum mit Phospholipase C-behandeltem Serum und Aceton-behandeltem Serum im HI- Test für den japanischen Encephalitis-Virus
  • Für jedes der menschlichen Versuchsseren werden die folgenden unbehandelten und vorbehandelten Seren e) bis g) hergestellt:
    • e) Unbehandeltes Serum:
      0,1 ml des Versuchsserums wird mit 0,6 ml einer 0,01 M- wäßrigen Lösung von Natriumborat verdünnt.
    • f) mit Phospholipase C behandeltes Serum:
      0,4 ml des mit Phospholipase C behandelten Serums, das unter Verwendung von PBS nach Beispiel 2 hergestellt worden war, wird mit 0,3 ml einer 0,01 M-wäßrigen Lösung von Natriumborat verdünnt.
    • g) Aceton-behandeltes Serum:
      Zu 0,1 ml des Versuchsserums werden 2 ml Aceton hinzugegeben, worauf das Gemisch bei 1500 R.P.M. 5 Min. zentrifugiert wird. Der Überstand wird verworfen, worauf nach Zugabe von weiteren 2 ml Aceton das Serum nochmals zentrifugiert wird. Der Überstand wird verworfen. Das Sediment wird getrocknet, worauf 0,7 ml einer 0,01 M-wäßrigen Natriumboratlösung zugegeben werden. Das Gemisch wird über Nacht bei 40°C stehengelassen.

  • Zu jedem der obigen Seren e) bis g) werden 0,1 ml einer 10%igen Suspension von formalinbehandelten Erythrocyten von Eintagsküken nach Versuch 1 zugegeben, um die natürlichen Agglutinine zu absorbieren, bevor die Seren dem HI-Test unterworfen werden.
  • Für jedes der Seren wird der HI-Titer des japanischen Encephalitis-Virus mittels der Mikrotiter-Methode von Clarke et al (American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 7 (1958), 561-573) unter Verwendung permanenter V-Platten und der Anwendung von formalinbehandelten Erythrocyten von Eintagesküken bestimmt.
  • Die Resultate sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 &udf53;vu10&udf54;&udf53;vz18&udf54; &udf53;vu10&udf54;

Claims (8)

1. Hämagglutinationshemmungstest für Toga-Viren, bei dem man das Versuchsserum mit Phospolipase C behandelt, mit Toga- Virus spezifischen Hämagglutinationsantigenen mischt und Erythrocyten hinzufügt, dadurch gekennzeichnet, daß man das Versuchsserum mit einer wäßrigen Lösung von 0,04 bis 0,12 Einheiten/ml an Phospolipase C behandelt, bevor es mit fixierten Erythrocyten vermischt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Versuchsserum Serum von Warmblütern verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man menschliches Serum verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Versuchsserum mit Phospholipase C bei einer Temperatur zwischen etwa 10 und etwa 50°C in Berührung bringt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als fixierte Erythrocyten solche von warmblütigen Tieren verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Warmblüter Geflügel, vorzugsweise Hühner verwendet.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als fixierte Erythrocyten formalinbehandelte Erythrocyten verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Toga-Virus einen Rubella-Virus verwendet.
DE2652091A 1975-11-17 1976-11-16 Hämagglutinations-Hemmungstest für Togaviren Expired DE2652091C2 (de)

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