DE1617734C - Verfahren zur Herstellung eines immunologischen Reagens - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Erythrocyterisuspension zur Feststellung des
Rheumafaktors durch Bindung eines Antikörpers an Erythrocyten mit Formalin.
Das immunologische Reagens ermöglicht insbesondere die schnelle Feststellung des Rheumafaktors
auf einem Objektträger, beispielsweise einem Glasplättchen, zur Diagnostizierung der chronisch entzündlichen
Polyarthritis. Das Reagens nach der Erfindung ist so stabil, daß es sich lange Zeit konservieren läßt und
auf einem Objektträger, der chronisch entzündlichen Polyarthritis. Das Reagens nach der Erfindung ist so
stabil, daß es sich lange Zeit konservieren läßt und dabei zuverlässige Analysenergebnisse gewährleistet.
Es ist bekannt, daß der Rheumafaktor häm-agglutinierende
Eigenschaften zeigt, wenn er sich in Anwesenheit eines BIutkörperchen-Antigene und ihre
entsprechenden Iso- und Hetero-Immunseren umfassenden
Komplexes, also eines Komplexes löslicher BIutkörperchen-Antigene und Antikörper, befindet.
Man kann bereits durch eine Reaktion in der Eprouvette den Rheumafaktor der chronisch entzündlichen
Polyarthritis, dadurch feststellen,, daß man. ihn mit
einem äußerst instabilen System' zusammenbringt, das man. nur im Augenblick der Verwendung herstellen
kann. Dieses. System, besteht im wesentlichen aus frischen röten'Blutkörperchen und aus einem
sensibilisierenden hämolytischeri Serum, das ein'den'
betreffenden roten Blutkörperchen entsprechendes Iso- oder Hetero-Immunserum ist.
Es ist bekannt, daß die frischen roten Blutkörperchen'
sich als solche nicht konservieren lassen und daß außerdem das sensibiiisierende Serum nur stabil ist,
solange es in sterilen Ampullen konserviert ist. Das erhaltene System, bestehend aus frischen roten Blutkörperchen und Antiserum, ist. seinerseits ebenfalls·
instabil und muß zu Analysenzwecken sofort verwendet werden.'
Die Abhandlungen von M i 1 g ι ο m (Arthritis und
Rheumatismus 7, [1], S. 1 bis 7, [1964]) haben, zwar
die Möglichkeit der Konservierung von sensibilisierten roten Blutkörperchen angedeutet, der Komplex von
Blutkörperchen und .Serum hat sich jedoch bisher nach Stabilisierung des Systems nicht über längere
Zeit konservieren lassen.
Die Kriindung schafft nun ein Verfahren zur
Herstellung eines stabilen Reagens der obigen Galtung, das sich mindestens ein Jahr lang konservieren
läßt und ohne Notwendigkeit der Vorbereitung oder vorhergehenden Behandlung die Durchführung der
sogenannten .Waaler-Roseschen Reaktion .oder der
davon hergeleiteten, auf: die Agglutinationsfähigkeit des Rheumafaktors gründenden Reaktionen auf
schnelle Weise ermöglicht. ■
Das Reagens gemäß der Erfindung ist insbesondere von einem System gebildet, das einen löslichen,
formolierten Komplex von Blutkörperchen-Antigenen und Antikörpern, enthält.
Das Verfahren zur Herstellung des Reagens nach
Das Verfahren zur Herstellung des Reagens nach
ίο der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß man
. die formalinisierten Erythrocyten mit einem gegen sie . sensibilisierten" Serum in Gegenwart einer solchen
Menge des gleichen Serums, das nicht von sensibilisierten . Tieren stammt, zusammenbringt, daß noch
is keine Agglutinierung eintritt, und dieses Gemisch
mit Formalin behandelt.
Bisher war es unmöglich, eine stabile Vereinigung der roten Blutkörperchen und des Antiserums zu
schaffen. Dadurch war man gezwungen, die roten
»ο Blutkörperchen, und das Antiserum getrennt herzustellen
und erst im Augenblick der Verwendung miteinander zu vermischen. Der Komplex nach der
Erfindung bleibt überraschenderweise mindestens ein Jahr lang stabil, wenn er bei +40C konserviert wird.
Weiterhin kann der Komplex nach der Erfindung von beliebigen roten Blutkörperchen und von beliebigen
sensibilisierenden Seren ausgehend erhalten werden, wie sie in der folgenden Tabelle angeführt sind:
| 30 | . Erythrozyten | Sensibiiisierende Seren |
| (rote) | ||
| Blutkörperchen) | Anti-A- oder Anti-B-Iso-Immun- | |
| A oder B | serum | |
| 35 | Anti-Rh-Serum | |
| ORh + | Kaninchen, Anti-Schaf | |
| Schaf | Kaninchen, Anti-Ziege | |
| Schaf | Kaninchen, Anti-Ziege | |
| Ziege | Kaninchen, Anti-Schaf | |
| 40 | Ziege | Kaninchen, Anti-Rind |
| Rind | Kaninchen, Anti-Meerschweinchen | |
| Meer | ||
| schweinchen | Kaninchen, Anti-Huhn | |
| Huhn | Meerschweinchen, Anti-Schaf | |
| 45 | Schaf ': | Pferd, Anti-Schaf |
| Schaf | Kaninchen, Anti-Maus | |
| Maus | Kaninchen, Anti-Meerschweinchen | |
| Meer | ||
| schweinchen | Meerschweinchen, Anti-Schaf | |
| 50 | Schaf | Meerschweinchen, Anti-Pferd |
| Pferd | Meerschweinchen, Anti-Rind | |
| Rind | Iso-Immun-Serum vom Schaf | |
| Schaf | Ziege, Anti-Schaf | |
| Schaf . | Kaninchen, Anti-Pavian | |
| 55 | Pavian | Kaninchen, Änti-Katze |
| Katze | ||
Das System, bestehend aus menschlichen-Erythrozyten
der Blutgruppe 0 und dem dazu gehörigen Antiserum (Anti-human-Erythrozyten-Serum) des Kaninchens,
erweist sich nach den an diesem Komplex durchgeführten Versuchen als besonders interessant.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung.
1. Vorbereitung der Erythrozyten
Dieses Beispiel wird zur Veransehaulicluing an
Hand des Falles der Vorbereitung der roten Blut-
3 4
körperchen vom Schaf gegeben. Dieses Vorgehen Das Testserum wird in der folgenden Weise vorkann
natürlich auch im Falle der roten Blutkörperchen bereitet:
anderer Herkunft (siehe obige Tabelle) angewandt Die formolierten Erythrozyten werden zu zwischen
werden. 5 und 10% in Anti-Schaf-Serum in Suspension ge-
Das Blut wird in steriler Weise auf einem koagula- 5 bracht, das seinerseits mit physiologischem Serum
tionshemrnenden Agens, beispielsweise tetraessig- bis zur Grenze seines Agglutinationstiters oder etwas
sauerem Äthylendiamin (E. D. T. A.) in 1 gramm- darüber verdünnt ist.
prozentiger Lösung in physiologischem Serum von Dann wird 1 Volumteil Formol in 0,5- bis l%iger
9 g %o entnommen. Man kann sich in gleicher Weise Lösung in physiologischem Serum hinzugegeben. Das
anderer koagulationshemmender Agenden, wie Na- io verwendete Formol ist ein 30%iges Formol, das vorher
triumcitrat, bedienen. mittels einer 1 N-NaOH-Lösung bis auf einen pH-Wert
Die frisch abgenommenen Blutkörperchen (9 Vo- von 7,2 neutralisiert wurde.
lumteile je Volumteil E. D. T. A.) werden sofort mit Die Lösung läßt man unter langsamem und konphysiologischem
Serum (9 g NaCl/1) viermal ge- stantem Rühren mindestens 5 Stunden lang zwischen
waschen. Wenn die oben schwimmende Flüssigkeit 15 20 und 37° C inkubieren. Dieser Inkubationsvorgang
noch Hämolyse zeigt (was mittels eines Kolorimeters in Anwesenheit von Formol führt zu dieser Sensibilivon
550 πιμ feststellbar ist), werden noch eine bis sierung der Erythrozyten durch das Anti-Schafmehrere
Waschungen durchgeführt. Serum.
Die roten Blutkörperchen werden schließlich in Das Formol wird dann nach bekannten Verfahrensphysiologischem
Serum in Suspension gebracht. 20 weisen neutralisiert. Das Reagens wird in dem gleichen
Einem Volumteil roter Blutkörperchen in 5- bis Albumin in Anwesenheit von 0,l%o Natriummeren-
15%iger Suspension in physiologischem Serum von rothuolat bei+40C in steriler Ampulle konserviert.
9 g °/oo wird ein gleiches Volumen einer zwischen
9 g °/oo wird ein gleiches Volumen einer zwischen
1- und 5°/oigen Verdünnung von Formol in physiolo- 4- vorbereitung des Kontrollreagens
gischem Serum zugegeben. (Das verwendete Formol 25 Um die Spezifizität des immunologischen Systems
ist ein 40%iges Formol, das mittels einer normalen zu erhärten, wird parallel dazu die Reaktion mit einem
Sodalösung vorher bis auf einen pH-Wert von 7,2 Kontrollreagens durchgeführt, das von einer Suspen-
neutralisiert wurde.) sion von formolierten Erythrozyten in 5- bis 10 %iger
Die Suspension läßt man unter langsamem und Verdünnung in einer Lösung von physiologischem
konstantem Rühren bei einer Temperatur zwischen 30 Serum mit einem Gehalt von 0,2 bis 1 °/0 von normalem
25 und 37°C 12 bis 22 Stunden lang je nach den Kaninchenserum gebildet ist.
Anteilen inkubieren. Aus den oben gegebenen Beispielen geht also hervor,
Anschließend wird zwei- bis dreimal mit physio- daß die äußerst weitgetriebene Sensibilisierung der
logischem Serum gewaschen. formolierten Erythrozyten durch die Verwendung
35 einer hohen Konzentration von Erythrozyten und
2. Vorbereitung des hämolytischen durch ihre Verdünnung in einem Albumin-Milieu
Anti-Schaf-Kaninchenserums ermöglicht wird.
Diese Faktoren begünstigen die lang andauernde
Die Schafserythrozyten, die in der oben beschrie- Stabilität des immunologischen Komplexes, mit dem
benen Weise vorbereitet wurden, werden mit der 40 der Rheumafaktor augenblicklich feststellbar ist, und
Hälfte ihres Volumens an physiologischem Serum zwar ausgehend von einem Tropfen des reinen Serums
verdünnt. eines Patienten.
Einem Kaninchen wird in Abständen von 3 oder Das Vorgehen ist das gleiche wie das übliche Vor-
4 Tagen ein gewisses Volumen der Blutkörperchen- gehen unter Verwendung von frischen Reagenzien
Suspension in folgender Weise intravenös injiziert. 45 und unter Anwendung der sogenannten »Waaler-
Die erste Injektion beträgt 5 ml; die drei folgenden Roseschen« Reaktion oder der daraus abgeleiteten
betragen 2 oder 3 ml und die übrigen (drei oder vier) Reaktionen, die auf die Agglutinationsfähigkeit des
betragen je 1 ml. Rheumafaktors gegründet sind, d. h., man bringt auf
Nach Feststellung des Titers des Serums wird dem das Glasplättchen einen Tropfen Serum des Patienten
Tier durch Carotispunktion eine Woche nach der 50 in Anwesenheit des Testserums. Wenn eine Agglutina-
letzten Injektion Blut entnommen. tion auftritt, ist daraus auf die Anwesenheit des
Nach Koagulieren des Blutes wird das Serum ge- Rheumafaktors zu schließen. Bei Fehlen dieses
sammelt und zur Zerstörung des Komplements auf Faktors tritt keine Agglutination auf.
560C erhitzt. Das Reagens gemäß der Erfindung kann auch in
Das Serum wird anschließend in sterilen Ampullen 55 lyophilisierter Form, also als Produkt einer Trocknung
bei +40C konserviert. der in der oben beschriebenen Weise erhaltenen
formolierten Suspension im Vakuum bei niedriger
3. Vorbereitung des Testserums gemäß der Temperatur (zwischen —5 und —200C) konserviert
Erfindung werden. Um sich seiner als Testserum zu bedienen,
60 genügt es dann, das genannte Testserum in lyophili-
Das laut obiger Beschreibung hergestellte hämoly- sierter Form in physiologischem Serum in Suspension
tische Serum hat einen hohen hämolytischen Titer zu bringen,
von über 5000 hämolytischen Einheiten. Man kann in gleicher Weise die Verwendung des
Auf einem Glasplättchen wird der Agglutinations- Reagens nach einer Immunofluoieszenz-Technik in
titer des hämolytischen Serums gegenüber den formo- 65 Betracht ziehen, und zwar nach Hinzufügen eines
lierten Erythrozyten in 5- bis 10%iger Suspension in Farbstoffes wie Fluorescein-Isothiocyanat, und diese
physiologischem Serum mit einem Gehalt von zwischen letztere Technik erleichtert den Nachweis des Rheuma-
0,2 und 1 % des normalen Kaninchenserums bestimmt. faktors auf Gewebeebene.
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Herstellung einer Erythrocytensuspension zur Feststellung des Rheumafaktors durch Bindung eines Antikörpers an Erythrocyten mit Formalin, dadurch gekennzeichnet, daß man die formalinisierten Erythrocyten mit einem gegen sie sensibilisierten Serum in Gegenwart einer solchen Menge . des gleichen Serums, das, nicht. von sensibilisierten Tieren stammt, zusammenbringt, daß noch keine Agglutinierung eintritt und dieses Gemisch mit Formalin behandelt.
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