DE2703523C2

DE2703523C2 - Verdünnungsmittel für den Rubella- Virus-Hämagglutinations-Hemmungstest

Info

Publication number: DE2703523C2
Application number: DE2703523A
Authority: DE
Inventors: Susumu Kyoto Iwasa; Isamu Osaka Yoshida
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1976-02-02
Filing date: 1977-01-28
Publication date: 1985-02-21
Also published as: MY8400091A; GB1566001A; DE2703523A1; HK29083A; FR2339862A1; FR2339862B1; JPS5912991B2; JPS5294418A; US4059491A

Description

4. Verdünnungsmittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Albumin.

5. Verdünnungsmittel nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Serumalbumin.

6. Verdünnungsmittel nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch eine Albuminkonzentration von etwa 0,05 bis etwa 1%.

7. Verdünnungsmittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine molare Konzentration an Kochsalz Im Bereich von etwa 0,05 bis etwa 0,3.

8. Rubella-Vlrus-Hämagglutlnations-Hemmungstest, dadurch gekennzeichnet, daß zur Verdünnung des Testserums und des Antigens ein Verdünnungsmittel gemäß Anspruch 1 verwendet wird, während für die Erythrozythensuspenslon In bekannter Welse ein Verdünnungsmittel verwendet wird, welches N-2-Hydroxyäthylplperazln-N'-2'-äthansulfonsäure In einer molaren Konzentration von etwa 0,01 bis etwa 0,05, CaCIi In einer Konzentration von etwa 0,0005 bis etwa 0,01 und Kochsalz enthält und einen pH-Wert im Bereich von etwa 6,0 bis 6,5 aufweist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Verdünnungsmittel für das Rubella-Virus-Hämagglutlnations-Antlgen und das Testserum zusätzlich Albumin enthält.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Verdünnungsmittel für die Erythrocyten zusätzlich Gelatin enthält.

11. Verwendung einer aus

a) einem Verdünnungsmittel für Rubella-Vlrus-Hämagglutlnatlons-Antlgen und für Rubella-Vlrus-Hämagglutlnations-Hemmungstest-Seren, welches N^-Hydroxyäthylpiperazln-N'^'-äthansulfonsäure einer molaren Konzentration von etwa 0,001 bis etwa 0,01 und Kochsalz aufweist, einen pH-Wert im Bereich vor. etwa 6,0 bis 7,5 hat und frei an Calclum-Ionen 1st,

b) einem Verdünnungsmittel für Erythrocyten, welches N-2-Hydroxyäthylpiperazin-N'-2'-äthansulfonsäure in einer molaren Konzentration von etwa 0,01 bis 0,05, CaCl₂ In einer molaren Konzentration von etwa 0,0005 bis etwa 0,01 und Kochsalz enthält und einen pH-Wert Im Bereich von etwa 6,0 bis 6,5 aufweist und

c) Rubella-Vlrus-Hämagglutlnatlons-Antlgen

·»<> bestehenden Ausrüstung für die Durchführung des Rubella-Vlrus-Hämagglutlnatlons-Hemmungstests.

12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausrüstung zusätzlich fixierte Erythrocyten umfaßt.

Die Erfindung betrifft ein Verdünnungsmittel für den Hämagglutlnatlons-Hemmungstest für den Rubella-Virus, gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.

sn Der Hämagglutlnatlons-Hemmungstest (nachfolgend kurz als HI-Test bezeichnet) eines Rubella-Vlrus Ist wegen seiner vergleichsweise hohen Empfindlichkeit, Vortellhaftlgkeit und Bequemlichkeit bei der Anwendung ein wichtiges Werkzeug In der serologischen Diagnose gegenüber anderen diagnostischen Verfahren für den Rubella-Virus, wie Neutralisations-, Komplementflxlerungs-, fluorezlerende Antikörper- und andere Tests.

Bisher wurden In einem solchen Rubella-Vlrus-HI-Test die drei Reaktanten Rubella-Vlrus-Hämagglutlnatlons-Antigen (nachfolgend kurz als Rubella-Vlrus-HA-Antlgen bezeichnet), Testserum und Eryihrocyten, verdünnt mit dem gleichen Typ von Verdünnungsmittel verwendet. Für diesen Zweck sind verschiedene Verdünnungsmittel bekannt. Jedes der bekannten Verdünnungsmittel hat jedoch seine eigenen Nachtelle. Derzeit wird am meisten Veronal-Pufferlösung verwendet. Jedoch Ist die Empfindlichkeit des Rubella-Vlrus-HI-Tests im pH-Bereich von etwa 6,0 bis 6,5 zehnmal größer als bei pH 7,2, dem durch Veronal-Puffer eingestellten pH-Wert

«' [Journal of Immunology 104, 818 (1970)]. Daher wurden häufig Verdünnungsmittel verwendet, die durch N-2-Hydroxyäthylplperazin-N'-2'-äthansulfonsäure (nachfolgend kurz als HEPES bezeichnet) gepuffert sind, die eine hohe Pufferkapazität Im pH-Bereich von 6,0 bis 6,5 aufweist und die ein stabiles, gut definiertes Erythrocyten-Agglutlnatlons-Blld erzeugen hilft. Dieses Verdünnungsmittel enthält nicht nur HEPES In einer molaren Konzentration von 0,025, sondern auch NaCL In einer molaren Konzentration von 0,14, 1% (Gewicht/Volumen;

(>5 auch nachfolgend) Rinderserumalbumin, 0,00025% Gelatin und 0,001 Mol CaCI₂, wobei jeder dieser Bestandteile als wesentlich angesehen wurde wegen Inrer starken Einflüsse auf die Empfindlichkeit der HI-Reaktlon, die Stabilität des erhaltenen Erythrocyten-Agglutlnatlonsbllds und die Deutlichkeit des Endpunkts der Reaktion. Im allgemeinen wird das Rubella-Vlrus-HA-Antlgen bei Verdünnung mit einem Verdünnungsmittel rasch Inaktl-

viert. Man 1st daher bei der Anwendung dieses HEPES-Puffers, ebenso wie im Fall von anderen Puffern nicht In der Lage, aufbewahrte, früher verdünnte Rubella-Virus-HA-Antigenflüssigkelt zu verwenden, sondern muß das Antigen auf die vorgeschriebene Konzentration von 4 Hämagglutinatlons-(HA)-Einheiten unmittelbar vor der Durchführung der Reaktion mit einem Testserum verdünnen. Darüber hinaus findet die Inaktivierung des HA-Antlgens selbst hierbei statt und stört so eine genaue Einschätzung des Endpunkts der HI-Reaktion des Rubella-Antlkörpers im Testserum, mit dem Ergebnis, daß der so bestimmte HI-Antikörper-Titer weder genau noch reproduzierbar ist.

Unter den oben beschriebenen technischen Umständen wurde nun überraschenderweise gefunden, daß die Inaktivierung des Rubella-Vlrus-HA-Antlgens in einem System von mit HEPES-Puffer verdünntem Rubella-Vlrus-HA-Antlgen von der Konzentration von HEPES abhängt und ferner durch die Anwesenheit von CaCU bedingt Ist. Der Erfindung Hegt somit die Aufgabe zugrunde, ein neues Verdünnungsmittel für Rubella-Virus-HA-Antigen und für Rube!Ia-Vlrus-HI-Testseren zu schaffen, welches der Aufrechterhaltung der Stabilität der HA-Aktlvltät des Rubella-Virus-HA-Antigens förderlich Ist und keinen nachteiligen Einfluß auf die Antigen-Antikörper-Reaktlon hai. Das Verdünnungsmittel soll In einem Verfahren für den Rubella-Virus-HI-Test, In Kombination mit einem Verdünnungsmittel für Erythrocytes welches die HI-Reaktion mit hoher Empfindlichkeit ermöglicht und ein stabiles und deutliches Erythrocyten-Aggluüonatlons-Muster liefert, angewendet werden können, wodurch eine Bestimmung des Rubella-V<rus-HI-Antlkörpergehalts Im Testserum mit Genauigkeit und hoher Empfindlichkeit ermöglicht wl-d.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verdünnungsmittel für Rubella-Vlrus-HA-Antlgen und für Rubella-Virus-Testseren, enthaltend HEPES und Kochsalz, wobei das Verdünnungsmittel einen pH-Wert Im Bereich *o von 6,0 bis etwa 7,5 hat, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es frei von Calclum-Ionen Ist und HEPES In einer molaren Konzentration von 0,001 bis etwa 0,01 vorhanden Ist. Aufgrund dieser neuen Zusammensetzung Ist es möglich, die Inaktivierung von Rubella-Vlrus-HA-Antlgen beinahe vollständig auszuschließen und hierdurch eine effektive Verwendung von gelagertem, vorher verdünntem HA-Antigen zu gewährleisten. Es 1st besonders vorteilhaft, wenn das Verdünnungsmittel HEPES In einer molaren Konzentration von etwa 0,004 bis 0,006 enthält und einen pH-Wert Im Bereich von etwa 6,0 bis 6,5, Insbesondere In der Nähe von 6,2 aufweist. Hinsichtlich der Konzentration von NaCl 1st Im allgemeinen eine Molarkonzentration von etwa 0,05 bis etwa 0,3 bevorzugt. Besonders dann, wenn ein Rubella-Virus-HI-Test unter Anwendung von frischen Erythrocyten durchgeführt wird, Ist Kochsalz bevorzugt in einem molaren Anteil von etwa 0,14 bis 0,15 Molen enthalten. Bevorzugt enthält dieses Verdünnungsmittel welter Albumin, vorzugsweise Serumalbumin, insbesondere Serumalbumin vom Rind. Normalerwelse liegt die Konzentration an Albumin Im Bereich von etwa 0,05 bis 1,0%.

Für die Erythrocyten kann In bekannter Welse das Verdünngsmlttel verwendet werden, welches Calctum-B:! Ionen In einer ausreichenden Konzentration enthält, um die Rubella-Virus-HI-Reaktlon mit hoher Empflndllch-

;| keit stattfinden zu lassen, und welches HEPES in ausreichender Konzentration enthält, um das Verdünnungs-

H mittel hohe Pufferkapazität entfalten zu lassen, wodurch die Erzeugung eines stabilen, gut definierten ■'>

f| Erythrocyten-Agglutlnationsmusters unterstützt wird. Die Konzentration von HEPES in diesem bekannten

rf Verdünnungsmittel Hegt Im Bereich von etwa 0,01 Mol bis etwa 0,05 Mol und beträgt vorzugsweise etwa 0,025

j| Mol. Die Konzentration an CaCl₂ liegt Im Bereich von etwa 0,0005 Mol bis etwa 0,01 Mol, vorzugsweise etwa

[:i 0,002 Mol. Der pH-Wert dieses Verdünnungsmittels liegt Im Bereich von etwa 6,0 bis etwa 6,5, vorzugsweise

if bei etwa 6,2. Im allgemeinen 'legt die Konzentration an NaCI In diesem Verdünnungsmittel bevorzugt Im «

L: Bereich von etwa 0,05 Mol bis etwa 0,3 Mol und, wenn frische Erythrocyten angewendet werden. Ist ein Bereich

i; von etwa 0,14 bis etwa 0,15 besonders erwünscht. Dieses Verdünnungsmittel enthält bevorzugt Gelatine, deren

|: Konzentration im Bereich von etwa 0,001% bis etwa 0,01%, vorzugsweise bei 0,005%, Heg·.

}| Das für die Praxis dieser Erfindung verwendete Testserum kann jedes beliebige Serum sein, vorausgesetzt,

|j daß die Bestimmung von Rubella-Virus-HI-Antikörpern möglich Ist. Es können daher beispielsweise die Sera *s

JJ von Warmblütern, wie Menschen, Rindern, Kaninchen, Ratten und ähnlichen verwendet werden. Insbesondere

■v menschliches Serum kann als Testserum für die Zwecke der Bestimmung des Gehalts an Rubella-Vlius-HI-

£ Antikörpern verwendet werden. Bevorzugt wird vor der Verdünnung mit dem Verdünnungsmittel gemäß der

Erfindung das Testserum einer Vorbehandlung unterworfen, um die nlcht-spezlflschen Inhibitoren der Agglutl-

',: nation, die Im Serum vorhanden sind, zu entfernen oder zu desaktlvleren. Als Beispiele einer solchen Vorbe- *·'

handlung sei die Adsorption an Kaolin, die Extraktion mit Aceton, die Ausfällung mit Heparln-MnCl₂ usw. genannt. Besonders vorteilhaft Ist das Verfahren, bei dem Phosphollpase C zwecks Inaktivierung der nlchtspezlfischen Agglutinations-Hemmstoffe auf das Testserum einwirkt.

ji: Als Erythrocyten können beliebige Erythrocyten verwendet werden, die sich zur Agglutination mit Rubella-

j,·, Virus-HA-Antlgen eignen. So sind beispielsweise die Erythrocyten von Geflügel, wie Eintagsküken, Gänsen, ^

f'_; Tauben, Wachteln usw., vorteilhaft. Solche Erythrocyten können frische Zellen oder fixierte Erythrocyten sein.

I) Die fixierten Erythrocyten sind bevorzugt formalln-behandelte Erythrocyten. Beispielsweise können formallnl-

j;_;: slerte Erythrocyten von Eintagsküken, beschrieben z. B. In der japanischen Patentanmeldung Nr. 37 724/1975,

j£i vorteilhaft verwendet werden.

P Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren für den Rubella-Vlrus-HI-Test, das dadurch gekennzeichnet

; Ist, daß man zur Verdünnung des Testserums und des Rubella-Vlrus-HA-Antlgens das erfindungsgemäße

iy Verdünnungsmittel verwendet, während für die Erythrozytensuspenslon das oben erwähnte bekannte Verdünnungsmittel verwendet wird. Aufgrund dieses Verfahrens Ist es möglich, den Gehalt an Rubella-Vlrus-HI-Antlkörper Im Testserum genau und mit hoher Empfindlichkeit zu bestimmten.

Um die Hl-Reaktlon gemäß der Erfindung durchzuführen, kann jedes beliebige Verfahren herangezogen ^(lS ; werden, wobei ein typisches Verfahren die Mlkrotlter-Methode Ist. Ein solches Verfahren sieht beispielsweise

vor, daß 0,025 ml eines Testserums, dessen nlcht-spezlflsche Agglutinations-Inhibitoren entfernt oder Inaktiviert worden sind, serienmäßig In zweifachen Schritten auf einer Mikroplatte mit dem obengenannten Verdünnungs-

mittel für Rubel!a-HA-Antlgen und für Testserum verdünnt werden, worauf 0,025 ml einer Rubella-HA-Antigen-Flüsslgkeit zugegeben werden, die vorher mit dem gleichen Verdünnungsmittel auf 4 HA-Elnhelten verdünnt worden sind. Nachdem man 60 Minuten bei Raumtemperatur hat stehenlassen, wird das Gemisch weiter mit 0,050 ml einer 0,25%igen Suspension von Erythrocyten versetzt, die vorher mit dem vorstehend erwähnten Verdünnungsmittel für Erylhrocyten verdünnt worden sind. Das gesamte Gemisch wird 60 Minuten bei 4° C stehengelassen und danach auf die Agglutination oder Nlcht-Agglutlnatlon der Erythrocyten untersucht. Der Rubella-Vlrus-HI-Antikörpergehalt wird ausgedrückt als maximaler Verdünnungsfaktor des Testserums, bei dem die Agglutlnierung der Erythrocyten vollständig gehemmt worden ist.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer Ausrüstung für den obengenannten Rubella-Vlrus-HI-Test, die besteht aus

1. dem genannten neuen Verdünnungsmittel für Rubella-Vlrus-HA-Antigen und für Rubella-Virus-HI-Testseren,

2. dem genannten bekannten Verdünnungsmittel für Erythrocyten, und 3. Rubella-Virus-HA-Antigen.

Diese Ausrüstung kann weiter Erythrocyten, insbesondere fixierte Erythrocyten, enthalten. Die folgenden Beispiele und Versuche sollen die Erfindung näher erläutern.

In der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen bedeuten »mg«, »g«, »ml«, »° C«, »M« und »N« jeweils »Milligramm«, »Gramm«, »Milliliter«, »Grad Celsius«, »Molare Konzentration« und »Normalität«; die Prozentsätze beziehen sich auf Gewicht/Volumen, falls nicht anders definiert.

Beispiel 1

x HEPES 594 mg

NaCl 4,09 g

Rinderserumalbumin 1,0 g

Die obigen Bestandteile werden In 450 ml destilliertem Wasser gelöst, mit 0,1 N-NaOH auf einen pH-Wert ") von 6,2 eingestellt und mit destilliertem Wasser auf 500 ml aufgefüllt. Auf diese Weise wird ein Verdünnungsmittel für Rubella-Vlrus-HA-Antlgen und für Testseren zur Verwendung Im Rubella-Vlrus-HI-Test erhalten, welches 0,005 M-HEPES, 0,14 M-NaCI und 0,296 Rinderserumalbumin enthält und einen pH-Wert von 6,2 hat.

Beispiel 2

HEPES 2,97 g

CaCi₂ (wasserfrei) 111 mg
NaCl 4,09 g

Gelatine 25 mg

Die obigen Komponenten werden In 450 ml destilliertem Wasser gelöst, mit 1 N-NaOH auf pH-Wert 6,2 eingestellt und mit destilliertem Wasser auf 500 ml aufgefüllt. Hierdurch wird ein Verdünnungsmittel für Erythrocyten erhalten, das 0,025 M-Hepes, 0,002 M-CaCl₂, 0,14 M-NaCl und 0,005« Gelatine enthält und einen pH-Wert von 6,2 hat.

Versuch 1

Portionen von Rubella-Vlrus-HA-Antlgen werden Im Verdünnungsmittel von Beispiel 1 für Rubella-Vlrus-HA-Antlgen und -Testseren und In einem herkömmlichen Verdünnungsmittel, HSAGC '), gelöst. Allquote Teile von jeder Antlgen-Flüsslgkeit werden jeweils bei 5° C und Raumtemperatur (25° C) gelagert, worauf Proben In gemessenen Zeltabständen genommen werden, um die HA-Tlter zwecks Vergleich der relativen Stabilität der HA-Antlgen-Verdünnungen zu bestimmen.

Die HA-Tlter werden auf die folgende Welse bestimmt: Formallnlslerte Erythrocyten von Eintagsküken (eine Suspension der lyophillslerten Erythrocyten in destilliertem Wasser wird nach dem Verfahren von Beispiel 1 der japanischen Patentschrift 37 724/1975 ernalten) werden mit dem Verdünnungsmittel von Beispiel 2 für Erythrocyten verdünnt, worauf der Rubella-Vlrus-HA-Titer nach der Mlkromethode von Sever [Journal of Immunology 88, 320-329 (1962)] auf einer beständigen V-Platte bestimmt. Die Verdünnung des HA-Antlgens wird unter Verwendung des Verdünnungsmittels von Beispiel 1 vorgenommen.

Tabelle 1	27	03 523	64 64 8 16	64 128 4 8	4 Std.
HA-Antigen-Flüssigkeit (gelagert)	Lager temperatur			32 64 < 4 4
Verdünnungsmittel von Beispiel 1 HSAGC ')	5° C Raum temperatur 5° C Raum temperatur
Rubella-Virus-HA-Titer Lagerzeit 0 Std. 1 Std. 2 Std.
64 64 64 64

') HSAGC bedeutet HEPES-Kochsalz-Aibumln-Gelatln-CaCl! der folgenden Zusammensetzung: HEPES 2,97 g

NaCI 4,09 g

Rinderserumalbumin 1,0 g

Gelatin 1,25 mg

CaCl₂ (wasserfrei) 55,5 mg

Die obigen Komponenten werden In destilliertem Wasser gelöst, mit 1 N-NaOH auf pH 6,2 eingestellt und auf 500 ml mit destilliertem Wasser aufgefüllt.

Versuch 2

Allquote eines menschlichen Testserums werden jeweils einer der folgenden Vorbehandlungen a) bis e) zwecks Herstellung von Serumproben für Rubella-Vlrus-HI-Tests unterworfen:

a) unbehandeltes Kontrollserum:

Zu 0,1 ml von menschlichem Serum werden 0,3 ml HS ²) gegeben.

b) Kaolin-behandeltes Serum:

Zu 0,1 ml menschlichem Serum werden 0,3 ml HS gegeben, es folgt eine Zugabe von 0,4 ml einer 25%lgen Kaolln-HS-Suspenslon zur erhaltenen Serumverdünnung. Das Gemisch wird 30 Minuten bei 30° C bebrütet, wonach zentrifugiert wird. Die überstehende Flüssigkeit wird verwendet und 30 Minuten bei 56° C zur Inaktivierung des Serums erhitzt.

c) Aceton-behandeltes Serum:

Zu 0,1 ml menschlichen Serums werden etwa 4 ml Aceton gegeben, worauf das Gemisch bei 1500 U.p.M. 5 Minuten zentrifugiert wird. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen, worauf das Gemisch nach Zugabe von etwa 4 ml Aceton wiederum auf die gleiche Weise zentrifugiert wird. Der Überstand wird verworfen. Das Sediment wird getrocknet, worauf 0,4 ml HS zugegeben werden. Das Gemisch wird bei 4° C über Nacht stehengelassen und danach zur Inaktivierung des Serums 30 Minuten auf 56° C erhitzt.

d) Heparin-MnCh-behandeltes Serum:

Zu 0,1 ml menschlichen Serums werden 0,2 ml HS gegeben, gefolgt von der Zugabe von jeweils 0,05 ml Heparin (1,000 Einheiten/ml) und 0,5 M-MnCl₂. Das Gemisch wird 60 Minuten bei 4⁰C stehengelassen und dann zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird verwendet und 30 Minuten auf 56° C zur Inaktivierung des Serums erhitzt.

e) Phospholipase C-behandeltes Serum:

Zu 0,1 ml des menschlichen Serums werden 0,2 ml HS gegeben, gefolgt von der Zugabe von 0,1 ml von so 0,06 Einheiten/ml an Phospholipase C·³). Das Gemisch wird bei 37° C über Nacht bebrütet und dann 30 Minuten bei 56° C zur Inaktivierung des Serums erhitzt.

²) HS bedeutet HEPES-Kochsalzlösung der folgenden Zusammensetzung:

HEPES 238 mg

NaCl 4,09 g

Die obigen Komponenten werden in 450 ml destilliertem Wasser gelöst, mit 0,1 N-NaOH auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt und mit destilliertem Wasser auf 500 ml aufgefüllt.

') Die verwendete Phospholipase C ist ein Handelsprodukt, hergestellt aus Clostridium perfringens (»Phospholipase C«, hergestellt und verkauft durch P-L Biochemlcals, Inc., Milwaukee, USA). Eine Einheit dieses Enzyms vermag 1 Mlkromol säurelOsllchen Phosphor (Phosphor des Phosphorylcholins) pro Minute freizusetzen, wenn es bei 37° C und einem pH-Wert von 7,3 auf Lecithin einwirkt.

Zu jeder der verschiedenen oben erhaltenen HI-Test-Serumproben werden 0,1 ml einer 10%lgen Suspension von formalinlsierten Erythrocyten von Eintagsküken zugegeben, wobei die natürlich vorkommenden Agglutlnine vor der Durchführung des HI-Tests absorbiert werden.

In diesem HI-Test wird unter Verwendung des Verdünnungsmittels von Beispiel 1 für die Verdünnung von Serum und Antigen und des Verdünnungsmittels von Beispiel 2 für die Verdünnung der formalinlsierten

Erythrocyten der Gehalt an Rubella-Vlrus-HI-Antlkörper mit der oben beschriebenen Mlkrotlter-Methode nach Sever auf einer beständigen V-Platte bestimmt. Das Ergebnis zeigt Tabelle 2.

Tabelle 2

Testserum Rubella-Virus-HI-Antikörper-Titer ^^r- unbehandelt Kaolin- Aceton-

behandelt behandelt

10

11

12

13

14

15

640 640 640 640 320 320 640 640 1280 640 640 1280 1280 640 640

16	20
32	40
16	40
16	20
8	5
16	20
16	20
16	20
16	40
< 3	5
64	40
64	80
64	40
32	40
< 8	< 5
	Versuch 3

Heparin MnCI₂- behandelt	Phospholipase C behandelt
40	40
40	80
20	40
20	20
10	5
20	20
40	40
40	40
80	80
< 5	< 5
40	80
160	160
80	80
40	40

< 5

<

Gleiche Teile von Rubella-Vlrus-HA-Antlgen werden mit dem Verdünnungsmittel von Beispiel 1 und HSAGC auf einen HA-Tlter von 4 Einheiten verdünnt und 2 Stunden bei 5° C gelagert. Unter Verwendung der so verdünnten und gelagerten HA-Antigen-Flüsslgkelten wird der Rubella-Vlrus-HI-Antlkörpergehalt für die Phospholipase C-behandelten Seren des Versuchs 2 In der gleichen Welse wie In Versuch 2 bestimmt. Sind HA-Antigen-Flüssigkelten verwendet worden, die mit dem Verdünnungsmittel von Beispiel 1 verdünnt worden sind, so werden die Testseren mit dem Verdünnungsmittel von Beispiel 1 verdünnt, während die Formalinbehandelten Erythrocyten mit dem Verdünnungsmittel von Beispiel 2 verdünnt werden. Wird mit HSAGC verdünntes HA-Antlgen verwendet, so werden sowohl das Serum als auch die formalinlsierten Erythrocyten mit HSAGC verdünnt. Die erhaltenen Resultate zeigt Tabelle 3.

Tabelle

Testserum Nr.

Rubella-Virus-HI-Antikörper-Titer

HA-Antigen HA-Antigen

verdünnt mit dem verdünnt mit

Verdünnungsmittel HSAGC von Beispiel 1

1	40
2	80
3	40
4	20
5	5
6	20
7	40
8	40
9	80
10	< 5
11	80
12	160

80*

40*

10*

20*

40*

80*

320*

< 5

160*

Testseruni	Rubella-Virus-Ill-Antikörper-Titer	IIA-Antigen
Nr.	HA-Anligen	verdünnt mit
	verdünnt mit dem	IISAGC
	Verdünnungsmittel
	von Beispiel 1

80

40

< 5

80*
160*

*) Wegen der Inaktivierung des HA-Antlgens während der
Lagerung (Verringerung des HA-Tlters von 4 Einheiten auf
eine Einheit) wird kein adäquates Erythrocyten-Agglutlnatlonsbild erhalten. Dies bedeutet einen schlecht definierten
Endpunkt der HI-Reaktlon, welcher eine genaue Bestimmung des HI-Tlters stört.

Claims

Patentansprüche:

1. Verdünnungsmittel für Rubella-Vlrus-Hämagglutinatlons-Antigen und Rubella-Virus-Hämagglutlnatlons-Hemmungstest-Sera enthaltend N-2-Hydroxyäthylpiperazln-N'-2'-äthansulfonsäure und Kochsalz, wobei

s das Verdünnungsmittel einen pH-Wert Im Bereich von 6,0 bis etwa 7,5, dadurch gekennzeichnet, daß das Verdünnungsmittel frei von Calclum-Ionen 1st und die N-2-Hydroxyäthylplperazln-N'-2'-äthansulfonsäure In einer molaren Konzentration von 0,001 bis etwa 0,01 vorhanden 1st.

2. Verdünnungsmittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch pine molare Konzentration an N-2-Hydroxyäthylplperazln-N'-2'-äthansulfonsäure Im Bereich von etwa 0,004 bis etwa 0,0006.

i"

3. Verdünnungsmittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen pH-Wert Im Bereich von etwa 6,0 bis