DE2703523A1 - Verduennungsmittel fuer den rubella- virus-haemagglutinations-hemmungstest - Google Patents

Description

Takeda Chemical Industries, Ltd.

27, Doshomachl 2-chome, Higashi-ku, Osaka/Japan

Verdünnungsmittel für den RubelIa-Virus-Hämagglutinations-Hemmungstest

Die Verbindung betrifft Verdünnungsmittel für den Hämagglutinations-Hemmungstest für den Rubella-Virus.

Der Hämagglutinations-Hemmungstest (nachfolgend kurz als HI-test bezeichnet) eines Rubella-Virus ist wegen seiner vergleichsweise hohen Empfindlichkeit, Vorteilhaftigkeit und Bequemlichkeit bei der Anwendung ein wichtiges Werkzeug in der serologischen Diagnose gegenüber anderaa diagnostischen Verfahren für den Rubella-Virus, wie Neutralisations-, Komplementfixierungs-, fluorezierende Antikörper- und andere Tests.

Bisher wurden in einem solchen Rubella-Virus-HI-Test die drei Reaktanten Rubella-Virus-Hämagglutinations-Antigen (nachfolgend kurz als Rubella-Virus-HA-Antigen bezeichnet), Testserum und Erythrocyten verwendet, wie früher verdünnt mit dem gleichen Typ von Verdünnungsmittel; Für diesen Zweck sind verschiedene Verdünnungsmittel bekannt. Jedes der bekannten Verdünnungsmittel hat jedoch seine eigenen Nachteile. Derzeit wird am meisten Veronal-Pufferlösung verwendet. Jedoch ist die Empfindlichkeit jes Rubella-Virus-HI-Tests im pH-Bereich von etwa 6,ο bis 6,5 zehnmal größer als bei pH 7,2, dem durch Veronal-Puffer eingestellten pH-Wert (Journal of Immunology Io4, 8l5(197o). Daher wurden häufig Verdünnungsmittel verwendet, die durch N-2-Hydroxyäthylpiperazin-N¹-2^T-athansnlfnnsSnrp (nachfolgend kurz als

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HEPES bezeichnet) gepuffert sind, die eine hohe Pufferkapazität im pH-Bereich von 6,0 bis 6,5 aufweist und die ein stabiles, gut definiertes Erythrocyten-Agglutinations-BiLd erzeugen hilft. Dieses Verdünnungsmittel enthält nicht nur . ΗΞΡΞ5 in einer molaren Konzentration von o,o25, sondern j

auch NaCl in einer molaren Konzentration von o,l^il, 1% (Ge- , wicht/Volumen; auch nachfolgend) Rinderserumalbumin, o,ooo25 % Gelatin und ο,οοΐ Mol. CaCl2> wobei jeder dieser Bestandteile als wesentlich angesehen wurden wegen ihrer unveränderlich starken Einflüsse auf die Empfindlichkeit der HI-Reaktion, die Stabilität des erhaltenen Erythrocyten-Agglu- '■ tinationsbilds und die Deutlichkeit des Endpunkts der Reak-j tion. Im allgemeinen wird das Rubella-Viruo-HA-Antigen bei \ Verdünnung mit einem Verdünnungsmittel rasch inaktiviert. ' Man ist daher bei der Anwendung dieses HEPES-Puffers, ebenso j wie im Fall von anderen Puffern, nicht in der Lage, aufbewahrte, früher verdünnte Rubella-Virus-HA-AntigenflUssigkeit zu verwenden, sondern muß das Antigen auf die vorgeschriebene Konzentration von ^ Hämagglutinations-(HA) Einheiten unmit-' teIbar vor der Durchführung der Reaktion mit einem Testserum verdünnen. Darüber hinaus finiet die Inaktivierung des ΚΑ-Antigens selbst hierbei statt und stört so eine genaue Einschätzung des Endpunkts der HI-Reaktion des Rubella-Anti4 körpers im Testserum, mit dem Ergebnis, daß der so bestimm- , te HI-Antikörper-Titer weder genau noch reproduzierbar ist.

Unter den oben beschriebenen technischen Umständen wurde \ nun überraschenderweise gefunden, daß die Inaktivierung des Rubella-Virus-HA-Antigens in einem System von mit HEPES-Puffer verdünntem Rubella-Virus-HA-Antigen abhängt von und resultiert aus der Konzentration von HEPES und der Anwesenheit von CaCl₂- Die Erfindung betrifft ein neues Verllnnungsmittel für Rubella-Virus-HA-Antigen und für Rubell»-Virus-HI-Testseren, welches der Aufrechterhaltung der Stabilität der HA-Aktivität des Rubella-Virus-HA-Antigens förderlich

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ist und keinen nachteiligen Einfluß auf die Antigen-Antlkörper-Reaktion hat. Ein weiterer Gegenstand 'ier Erfindung ist ein Verfahre-) für den Rubella-Virus-HI-Test, das dadurch gekennzeichnet irt, daß man dieses neue Verdünnungsmittel in Kombination mit einem solchen Verdünnungsmittel ^! für Erythrozyten anwendet, welches nie iil-heaktion mit hoher Empfindlichkeit ermöglicht und ein stabiles und deutliches Erythrocyten-Agglutinations-Muster liefert, wodurch ; eine !Bestimmung des Rubella-Virus-HI-Antikörpergehalts im _s Testserum mit Genauigkeit un i hoher Empfindlichkeit ermög- ' licht wird.

Das Verdünnungsmittel gemäß der Erfindung für Rubella-Virusi -HA-Antigen und für Rubella-Virus-Testseren hat eine neue ' Zusammensetzung, die HEPES in einer molaren Konzentration von etwa ο,οοΐ bis etwa o,ol und NaCl enthält, wobei der ' pH-Wort im Bereich von etwa 6,ο bis etwa 7,5 liegt und die frei von Calcium-Ionen ist. Dieses Verdünnungsmittel ist im wesentlichen gekennzeichnet durch seinen Gehalt an HEPES in, einer niedrigen Konzentration, das heißt einer molaren Kon-, zentration von etwa ο,οοΐ bis o,ol und seine Freiheit von Calcium-Ionen. Aufgrund dieser neuen Zusammensetzung ist es möglich, die Inaktivierung von Rubella-Virus-HA-Antigen ' beinahe vollständig auszuschließen und hierdurch eine effektive Verwendung von gelagertem, vorher verdünntem HA-Antigen zu gewährleisten. Es ist besonders vorteilhaft, wenn das Verdünnungsmittel HEPES in einer molaren Konzentration von etwa o,oo^]( bis ο,οοβ enthält und einen pH-Wert im Bereich von etwa 6,ο bis 6,5, insbesondere in der Nähe von 6,2, aufweist. Hinsichtlich der Konzentration von NaCl ist im allgemeinen eine Molarkonzentration von etwa o,o5 bis etwa o,3 bevorzugt. Besonders dann, wenn ein Rubella-Virus-HI-Test unter Anwendung vnn frischen Erythrocytes -.urchgeführt wird, ist Kochsalz bevorzugt in einem molaren Anteil von etwa ο,Ι'Ί bis etwa o,15 Holen enthalten. Bevorzugt enthält dieses Verdünnungsmittel weiter Albumin, vorzugsweise

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Serumalbumin, insbesondere Serumalbumin vom Rind. Normalerveise liee;t die Konzentration an Albumin im Bereich von etwa o,o5 bis Ι,οίί. '

Gemäß der Erfindung kann für die Erythrocyten das Verdün- j nungsmittel verwendet werden, welches Calcium-Ionen in eineif ausreichenden Konzentration enthält, um die RubelIa-Virus- | HI-Reaktion mit hoher Empfindlichkeit stattfinden zu lassenj und welches HEPES in ausreichender Konzentration enthält, uni das Verdünnungsmittel hohe Pufferkapazität entfalten zu las· sen, wodurch die Erzeugung eines stabilen, gut definierten Erythrocyten-Agglutinationsmusters unterstützt wird. Die Konzentration von HEPES in diesem Verdünnungsmittel kann ;

im Bereich von etwa o,ol Mol bis etwa o,o5 Mol liegen und beträgt vorzugsweise etwa o,o25 Mol. Die Konzentration an !

CaCl^ liegt im Bereich von etwa o,ooo5 Mol bis etwa o,ol Mol vorzugsweise etwa o,oo2 Mol. Der pH-Wert des Verdünnungsmittels liegt im Bereich von etwa 6,ο bis etwa 6,5» vorzugsweise bei etwa 6,2. Im allgemeinen liegt die Konzentration ; an NaCl in diesem Verdünnungsmittel bevorzugt im Bereich j von etwa o,o5 Mol bis etwa o,3 Mol und, wenn frische Erythrd· cyten angewendet werden, ist ein Bereich von etwa o,l4 bis etwa o,15 besonders erwünscht. Dieses Verdünnungsmittel enthält bevorzugt Gelatine, deren Konzentration im Bereich vori etwa o,ool# bis etwa o,ol#, vorzugsweise bei o,oo5& liegt. ■

Das für die Praxis dieser Erfindung verwendete Testserum j kann jedes beliebige Serum sein, vorausgesetzt, daß die Be- i Stimmung von Rubella-Virus-HI-Antikörpern möglich ist. Es können daher beispielsweise die Sera von Warmblütern, I wie Menschen, Rindern, Kaninchen, Ratten und ähnlichen verwendet werden. Insbesondere menschliches Serum kann als Testserum für die Zwecke der Bestimmung des Gehalts an Rubella-Virus-HI-Antikörpern verwendet werden. Bevorzugt wird vor der Verdünnung mit dem Verdünnungsmittel gemäß der Erfindung das Testserum einer Vorbehandlung unterworfen, um

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die nicht-spezifischen Inhibitoren der Agglutination, die
im Serum vorhanden sind, zu entfernen oder zu desaktivieren. Als Beispiele einer solchen Vorbehandlung sei die Adsorption an Kaolin, die Extraktion mit Aceton, die Ausfällung
mit Heparin-MnClp u.~w. genannt. Besonders vorteilhaft ist
das Verfahren, bei dem Phospholipase C zwctks Inaktivierung
der nicht-spezifischen Agglutinations-Hemrnstoffe auf das ; Testserum einwirkt. ι

Als Erythrocyten können beliebige Erythrocyten verwendet j werden, die sich zur Agglutination mit Rubella-Virus-HA- ; Antigen eignen. So sind beispielsweise die Erythrocyten von ,' Geflügel, wie Eintagsküken, Gänsen, Tauben, Wachteln usw.,

i vorteilhaft. Solche Erythrocyten können frische Zellen oder I fixierte Erythrocyten sein. Die fixierten Erythrocyten sind' bevorzugt formalin-behandelte Erythrocyten. Beispielsweise ' können formalinisierte Erythrocyten von Eintagsküken, be- ; schrieben z.B. in der japanischen Patentanmeldung Nr. j 37724/1975, vorteilhaft verwendet werden. ,

Gemäß einem Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren
für den Rubella-Virus-HI-Test, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man ein Rubella-Yirus-HA-Antigen mit einem Testse-j rum mischt, die beide vorher mit dem oben genannten Verdün-j ' nungsmittel für Rubella-Virus-HA-Antigen und für das Testserum verdünnt worden sind, worauf die erhaltene Mischung wei-» ter mit einer Suspension von Erythrocyten, die mit dem oben!

genannten Verdünnungsmittel für Erythrocyten verdünnt wur-, den, zwecks Abschätzung der Agglutination oder Nicht-Agglutination der Erythrocyten vermischt wird. Aufgrund dieses ! Verfahrens ist es möglich, den Gehalt an Rubella-Virus-HI-
J)O Antikörper im Testserum genau und mit hoher Empfindlichkeit
zu bestimmten.

Um die HI-Reaktion gemäß der Erfindung durchzuführen, kann
jedes beliebige Verfahren herangezogen werden, wobei ein

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typisches Verfahren die Mikrotiter-Xethode ist. Ein solches Verfahren sieht beispielsweise vor, da3 o,o25 nl eines Testserums, dessen nicht-spezifische Agglutinations-Inhibitors entfernt oder inaktiviert worden sind, serienmäßig ;> in zv/eifachen Schritten auf einer Mikroplatte mit dem obengenannten Verdünnungsmittel für Rubella-HA-Antigen und für Tostserum verdünnt werden, worauf o,o25 ml einer Rubella-HA-Antigen-FlÜBsigkeit zugegeben werden, die vorher mit oem gleichen Verdünnungsmittel auf h ΚΑ-Einheiten verdünnt ; worden sind. Nachdem man 60 Minuten bei Raumtemperatur hat ^; stehenlassen, wird dar? Gemisch weiter mit o,o5o ml einer o,25 ^igen Suspension von Erythrocyten versetzt, die vorher mit dem vorstehend erwähnten Verdünnungsmittel für Erythro-, cyten verdünnt worden sind. Das gesamte Gemisch wird 60 Minuten bei 4°C stehengelassen und danach auf die Agglutination oder Nicht-AgglutJnation der Erythrozyten untersucht. Der Rubella-Virus-HI-Antiköfpergehalt wird ausgedrückt als maximaler Verdünnungsfaktor des Testserums, bei dem die Agglutinierung der Erythrocyten vollständig gehemmt worden ist.

Die Erfindung betrifft gemäß einem anderen Aspekt eine Ausrüstung für den obengenannten Rubella-Virus-HI-Test, die besteht aus

1. dem genannten neuen Verdünnungsmittel für

Rubella-Virus-HA-Antigen und für Rubella-Virus- -HI-Testseren,

2. das genannte Verdünnungsmittel für Erythrocyten, und J). Rubella-Virus-HA-Antigen.

Diese Ausrüstung kann weiter Erythrocyten, insbesondere fixierte Erythrocyten,enthalten.

Die folgenden 3eispiele und Versuche sind lediglich zur Erläuterung derzeit bevorzugter Ausführungsformer, der Er-

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/O

findung gedacht und sollen den Umfang der Erfindung nicht beschränken.

In .er gesamten Beschreibung und den Ansprüchen bedeuten "ng", V, "ml", "⁰C", "M" und ¹¹N" jeweils "Milligramm" "'Gramm", "Ki Hi liter", "Grad Celsius", ''Molare Konzontration" und "Normalität"; die Prozentsätze besieher: sich auf Gewicht/Volumen, falls nicht anders definiert.

Beispiel 1

ΗΕΡΞ3 59^ mg

NaCl 4,o9 g

Rinderserumalbumin l,o g

Die obigen Bestandteile werden in 45o ml destilliertem Wasser gelöst, mit o,IN-KaOH auf einen pH-Wert von 6,2 eingestellt und mit destilliertem Wasser auf 5oo ml aufgefüllt. Auf diese V/eise wird ein Verdünnungsmittel für Rubella-Virus-HA-Antigen und für Testseren zur Verwendung im Hubella-Virus-HI-Test erhalten, welches ο,οοί; ."-'-HEPZS, ο,Ι^Μ-NaCl und o,?.% Rinderserumalbumin enthält und einen pH-Wert von 6,2 hat.

Beispiel 2

HEPES 2,97 g

,CaCl₂ (wasserfrei) 111 rrg

NaCl i»,o9 g

Gelatine 25 mg

Die obigen Komponenten werden in ^5o ml destilliertem Wasser gelöst, mitlN-NaOH auf pH-Wert 6,2 eingestellt und mit destilliertem Wasser auf 5oo ml aufgefüllt. Hierdurch wird ein Verdünnungsmittel für Erythrocyten erhalten, das o,o?5

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M-HEPES, ο,οοPM-CaCl„, ο, 14K-NaCl und ο,οο5# Gelatine enthält und einen pH-Wert von 6,2 hat.

Versuch 1

ι Portionen von Rubella-Virus-HA-Antigen werden im Verdün- ,

nungsmittel von Beispiel 1 für Rubella-Virus-HA-Antigen und ■ -Testseren und in einem herkömmlichen Verdünnungsmittel, HSAGC*¹), gelöst. Aliquote Teile von jeder Antigen-Flüssigkeit werden jeweils bei 5 C und Raumtemperatur (25°C) gelagert, worauf Proben in gemessenen Zeitabständen genommen werden, um die HA-Titer zwecks Vergleich der relativen Stabilität der HA-Antigen-VerdUnnungen zu bestimmen.

Die HA-Titer werden auf die folgende Weise bestimmt: Formalinisierte Erythrocyten von Eintagsküken (eine Suspension der lyophilisierten Erythrocyten in destilliertem Wasser wird nach dem Vorfahren von Beispiel 1 der japanischen Patentschrift 37724/1975 erhalten;)werden mit dem Verdünnungsmittel von Beispiel 2 für Erythrocyten verdünnt, worauf der Rubella-Virus-HA-Titer nach der Mikromethode von Sever (Journal of Immunology ';*''* 32o-329 (1962) auf einer

wi ra
beständigen V-Platte bestimmt. Die Verdünnung des HA-Antlger wird unter Verwendung des Verdünnungsmittels von Beispiel 1 vorgenommen.

Tabelle 1

HA-Antigen-Flüs- sigkeit (gela gert)	Lager temperatur	Rubella-Virus-HA-Titer	64	64	32
Verdünnungsmit tel von Beispiel 1	5°C	Lagerzeit	64	128	64
HSAGC *X^	Raumtem peratur	O Std. 1 Std. 2 Std. 4 Std.	8	4
5°C	64	16		4
Raumtem peratur	64
64
64

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bedeutet HEPES-Kochpalz-Albumin-Gelatir,-CaClj der folgenden Zusammensetzung:

HEPES	2,97	g
NaCl	4,oo	g
Riniierserumalbumin	l,o	g
Gelatin	1,25	mg
CaCIp (wasserfrei)	55,5	mg

Die obigen Komponenten werden in destilliertem Wasser gelöst, mit IN-NaCH auf pH 6,2 eingestellt und auf 5oo ml mit destilliertem Wasser aufge

füllt.

Versuch 2

Aliquote eines menschlichen Testserums werden jeweils einer der folgenden Vorbehandlungen a) bis e) zwecks Herstellung von Serumproben fUr Rubella-Virus-HI-Tests unterworfen:

a) unbehandeltes Kontrollserum:

Zu o,l ml von menschlichem Serum werden o,3 ml HS ' gegeben.

b) Kaolin-behandeltes Serum:

Zu o,l ml menschlichem Serum werden o,3 ml

HS gegeben, es folgt eine Zugabe von o,4 ml einer 25^igen Kaolin-HS-Suspension zur erhaltenen Serumverdünnung. Das Gemisch wird J>o Minuten bei 3o°C bebrütet, wonach zentrifugiert wird. Die überstehende Flüssigkeit wird verwendet und 3o Minuten

bei 56 C zur Inaktivierung des Serums erhitzt.

c) Aceton-behandeltes Serum:

Zu o,l ml menschlichen Serums werden etwa 4 ml 709841/0571

Aceton gegeben, worauf das Gemisch bei 15oo U.p.M. 5 Ki nuten zentrifugiert wird. Die überstehende
Flüssigkeit wird verworfen, worauf das Gemisch
nach Zugabe von etwa 4 ml Aceton wiederum auf die gleiche Weise zentrifugiert wird. Der Überstand

wird verworfen. Das Sediment wird getrocknet, worauf o,4 ml HS zugegeben werden. Das Gemisch wird bei ^⁰C über Nscht stehengelassen und danach zur
Inaktivierung des Serums >o Minuten auf 5β C erhitzt. i

d) Heparin-MnClj-behandeltes Serum:

Zu o,l ml menschlichen Serums werden o,2 ml HS i gegeben, gefolgt von der Zugabe von jeweils o,o5
ml Heparin (Ι,οοο Einheiten/ml) und o,5^-MnClp·

IS Das Gemisch wird 60 Minuten bei 4⁰C stehengelassen!

und dann zentrifugiert. Die überstehen-ie Flüssig- ·

keit wi: d verwendet und 3o Minuten auf 56⁰C zur \

i Inaktivierung des Serums erhitzt. ;

e) Phospholipase C-behandeltes Serum:

Zu o,l ml des menschlichen Serums werden o,2 ml _;

HS gegeben, gefolgt von der Zmp.be von o,l ml von | 0,06 Einheiten/ml an Phospholipase C*^ . Das Gemisch wird bei 57°C über Nacht bebrütet und dann j 3o Minuten bei 56 C zur Inaktivierung des Serums ;

?b erhitzt. j

■ HS bedeutet HEPES-Kochsalzlösung der folgenden

Zusammensetzung:

HEPES 238 mg

NaCl 4,o9 g

Die obigen Komponenten werden in 4^o ml destilliertem Wasser gelöst, mit o,IN-NaOH auf einen
pH-Wert von 7,2 eingestellt und mit destilliertem

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Wasser auf ^oo ml aufgefüllt.

*■*")
^' Die verwendete Phospholipase C ist ein Handelsproc-jkt, hergestellt aus Clostridium perfringens (''Phospholipase C", hergestellt und verkauft durch P-L Bio-r.r.micals, Inc., Milwaukee, USA). Eine

Einheit dieses Enzyms vermag 1 Mikromoi säurelöslicheri Phosphor (Phosphor des Pnosphorylcholins) pro Minute freizusetzen, wenn es bei ^⁰C und einem pH-Wert von 7,3 auf Lecithin einwirkt.

Zu Jeder der verschiedenen oben erhaltenen HI-Test-Serumpro-: ben werden o,l ml einer lo^igen Suspension von formalinisierten Erythrocyten von Eintagsküken zugegeben, wobei die natürlich vorkommenden Agglutinine vor der Durchführung des HI-Tests absorbiert werden.

In diesem HI-Test wird unter Verwendung des Verdünnungsmit- , tels von Beispiel 1 für die Verdünnung von Serum und Antigen und des Verdünnungsmittels von Beispiel 2 für die Verdünnung der formalinisierten Erythrocyten der Gehalt an Rubella-Vi- , rus-HI-Antikörper mit der oben beschriebenen Mikrotiter-Methode nach Sever auf einer beständigen V-Platte bestimmt. Dss Ergebnis zeigt Tabelle 2.

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AS

Tabelle

Test serum Nr.	Γ	unbe- haridr-lt	lUbella-Virus-HI-Antikörper-Titer	Aceton- beh^ndelt	Heparin behandelt	Phospho- lipase C behandelt
1	64 ο	Kaoltn- behandelt	2o	]*ο	4o
2	64o	16	4o	'•0	80
3	64o	32	4o	2o	Ίο
4	64o	16	2o	2o	2o
VJl	32o	16	5	Io	VJl
6	32o	8	2o	2o	2o
7	64o	16	2o	4o	4o
8	64o	16	2o	4o	4o
9	128o	16	4o	80	80
Io	64o	16	5	^ 5	-\ 5
11	64o	^ 3	4o	4o	80
12	128o	64	80	160	160
13	128o	64	4o	80	80
14	64o	64	4o	4o	4o
15	64o	32	^Z 5	-C 5	^ 5
-C 8

Versuch

Gleiche Teile von Rubella-Virus-HA-Antigen werden mit dem Verdünnungsmittel von Beispiel 1 und HSAGC auf einen HA-Titer von 4 Einheiten verdünnt und 2 Stunden bei 5⁰C gelagert Unter Verwendung der so verdünnten und gelagerten HA-Antigen-Flüssigkeiten wird der Rubella-Virus-HI-Antikörpergehalt für die Phospholipase C-behandelten Seren des Versuchs 2 in der gleichen Weise wie in Versuch 2 bestimmt. Sind HA-Antigen-

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Flüssigkeiten verwendet worden, die rait dem Verdünnungsmittel von Beispiel 1 verdünnt worden sind, so werden die Testsereri mit dem Verdünnungsmittel von Beispiel 1 verdünnt, während die Formalin-behandelten Erythrocyten mit dem Verdünnungsmittel von Beispiel 2 verdünnt werden. Wird mit HSAGC verdünntes HA-Antigen verwendet, so werden sowohl das Serum als auch die formalinisierten Erythrocyten mit HSAGC verdünnt. Die erhaltenen Resultate zeigt Tabelle

Tabelle

Testserum Nr.	Rubella-Virua-HI-Antikörper-Titer	HA-Antigen verdünnt mit HSAGC
1 2 3 4 5 6 7 8 9 Io 11 12 13 14- 15	HA-Antigen verdünnt mit dem Verdünnungs mittel von Beisp. 1	8o* 6o* So* 4o* lo* 2o* ko* eo*' 32o* j <: 5 I6o* I6o* 8o* ! l*o* I i <5
ko 8o 4o 2o 5 2o 4o 4o Bc < 5 8o l6o 8o 4o «C 5

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Wegen der Inaktivierung des HA-Antigens während .

der Lagerung (Verringerung des HA-Titers von ^ Ein- '

heiten auf eine Einheit)wird kein adäquates Erythro- ; cyten-Agglutinationsbild erhalten . Dies bedeutet

einen schlecht definierten Endpunkt der HI-Reaktion, I welcher eine genaue Bestimmung des HI-Titers stört.

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   ^; 1.)Verdünnungsmittel für Rubella-Virus-Hämagglutinations-Antigen und für Rubella-Virus-Hämagglutinations-Hemmungstest-Sera, gekennzeichnet durch einen Gehalt an N-2-Hyoroxyäthylpiperazin-N'-2'-äthansulfonsäure in einer molaren Korizeritration von etwa ο,οοΐ bis etwa o,ol und Kochsalz eines pH-Werts im Bereich von etwa ό,ο bis etwa 7,5, welches frei von Calcium-Ionen ist.

   2. Verdünnungsmittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine nolare Konzentration an N-2-Hydroxyäthylpiperazin-N'-2'-äthansulfonsäure im Bereich von etwa ο,οο- bis etwa 0,006.

   3. Verdünnungsmittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen pH-V/ert im Bereich von etwa 6,ο bis etwa 6,5·

   4. Verdünnungsmittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch < einen Gehalt an Albumin. !

   i Zi. Verdünnungsmittel nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch | einen Gehalt an Serumalbumin.

   6. Verdünnungsmittel nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch eine Albuminkonzentration von etwa o,o5 bis etwa Vp.

   7. Verdünnungsmittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine molare Konzentration an Kochsalz im 3ereich von etwa o,o5 bis etwa o,3.

   8. Rubella-Virus-Hämagglutinations-Hemmungstest, dadurch gekennzeichnet, daß man Testserum, welches vorher nit einem Verdünnungsmittel verdünnt worden ist, das N-2-Hydroxyäthylpiperazin-N^f-2'-äthansulfonsäure in einer molaren Konzentration von etwa ο,οοΐ bis etwa o,ol und Kochsalz

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   enthält, einen pH-Wert im 3ereich von etwa 6,0 bis 7»5 aufweist und frei von Calcium-Ionen ist, mit Rubella-Virusr^;ärr,aöglutinationn-Antigeri versetzt, welches vorher mit diesem Verdünnungsmittel verdünnt worden ist, und danach :: das erhalten«:· Gemisch mit einer Suspension vo:i Erythrocyte!! versetzt, die vorher mit einem Verdünnungsmittel verdünnt worden :'st, welches N-2-Hyiroxyäfnylpiperazin-N' -2' äVr.ansulfonsäure in einer molaren Konzentration von etwa o,öl bis etwa o,o5, CaCIp in einer molaren Konzentration von etwn o,ooo5 bis etwa o,ol und Kochsalz enthält und einen pH-Wort im Dereich von etwa 6,0 bis 6,5 aufweist.

   9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß ■ Verdünnungsmittel für RubelIa-Virus-Hämagglutinations-Antigen und für Testserum zusätzlich Albumin enthalten.

   Io. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß \ das Verdünnungsmittel für die Erythrocyten zusätzlich

   Gelatin enthält. !

   11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß

   das verwendete Serum Humanserum ist. j

   12. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Erythrocyten Geflügel-Erythrocyten verwendet werden.

   13. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß Erythrocyten von Küken verwendet werden.

   14. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß fixierte Erythrocyten verwendet werden.

   15. Ausrüstung für die Durchführung des Rubella-Virus-Hämagglutinations-Hemmungstests, bestehend aus

   a) einem Verdünnungsmittel für Rubella-Virus-Hämagglutinations-Antigen und für Rubella-Virus-Hämagglutina-

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   tions-Hemmungstest-Seren, welches N-2-Hydroxyäthyl-; piperazin-N'-2'-äthansulfonsäure einer molaren Konzentration von etwa ο,οοΐ bis etwa o,ol und Koch- : salz aufweist, einen pH-Wert im Bereich von etwa ! 6,0 bis 7,5 hat und frei an Calcium-Ionen ist,

   b) einem Verdünnungsmittel für Erythrocyten, welches 1 N-2-Hydroxyäthylpiperazin-N¹-2'-äthansulfonsäure : in einer molaren Konzentration von etwa o,ol bis
   o,o5, CaCl2 in einer molaren Konzentretlon von et- j

   wa o,ooo5 bis etwa o,ol und Kochsalz enthält und \

   einen pH-Wert im Bereich von etwa 6,0 bis 6,5 aufweist und I

   c) Rubella-Virus-Hämagglutinations-Antigen. j

   16. Ausrüstung nach Anspruch 15, gekennzeichnet dunh einen j zusätzlichen Gehalt an fixierten Erythrocyten. !

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