Mittel zur Herstellung eines immunologischen Indikators, Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mittel zur Herstellung eines immunologischen Indikators, der aus Mikrobenzellen aufgebaut ist, wobei das Mittel bei der Herstellung des Indikators an Antigene gebunden wird.
Das erfindungsgemässe Mittel ist aus Mikrobenzellen aufgebaut, an die eine Verbindung durch eine kovalente chemische Bindung gebunden ist, wobei diese Verbindung noch eine freie reaktive Gruppe aufweist, die chemisch an Antigensubstanzen gebunden werden kann. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung dieses Mittels und dessen Verwendung zur Herstellung eines Indikators, wobei hiezu an die freie reaktive Gruppe des Mittels eine Antigensubstanz gebunden wird, wodurch ein immunologischer Indikator erhalten wird, der zur visuellen Feststellung von homologen Antigenen oder Antikörpern verwendet werden kann.
Die Möglichkeit, die Anwesenheit von Antigensubstanzen in verschiedenen Flüssigkeiten festzusteller hat sehr grosse Bedeutung. Bei vielen industriellen Verfahren werden proteinartige Materialien, die Antigeneigenschaften besitzen, entweder als Reaktanten verwendet oder diese Materialien werden sonst irgendwie behandelt. Die Möglichkeit, die Änderungen in der Konzentration dieser Materialien festzustellen, um derartige Reaktionen zu verfolgen, ist insbesondere bei der Kontrolle und der Wiederholbarkeit derartiger industrieller Verfahren von Bedeutung. Ein anderes, sehr bedeutendes Anwendungsgebiet besteht in der Feststellung verschiedener Antigene und Antikörper in Körperflüssigkeiten.
Der Spiegel vieler Hormone, Proteine, Lipoproteine, Mucoproteine, Glycoproteine usw. und der Spiegel der Hydrolyseprodukte dieser Materialien, die normalerweise im Körper vorkommen und auch dann, wenn verschiedene pathologische Erscheinungen auftreten, ist für die medizinische Praxis von grosser Bedeutung. Einige dieser Substanzen, die von grossem Interesse sind, können nach bisher bekannten Methoden unter Verwendung von üblichen chemischen Analysenmethoden schwer festgestellt werden. Jedoch unter Anwendung von immuno-chemischen Testverfahren können manche dieser Antigene und Antikörper in Mischungen, die andere grosse Moleküle enthalten, die ähnliche chemische Gruppen aufweisen, jedoch nicht genau die gleiche Konfiguration wie das zu bestimmende Makromolekül besitzen, nachgewiesen werden.
Eine Anzahl von diesen immunologischen Verfahren sind jedoch schwer auszuführen und benötigen oft lange Zeit und spezielle Arbeitstechniken, sie wurden aber dennoch zur Feststellung der Anwesenheit derartiger Substanzen in verschiedenen Körperflüssigkeiten verwendet. Für einige Antigene und Antikörper waren jedoch bisher keine Testverfahren zugänglich.
In neuerer Zeit wurden Hämagglutinationssysteme für die Feststellung von Antigenen oder die Feststellung deren Antikörper ausgearbeitet. Bei diesen Systemen werden rote Blutkörperchen als Indikatorteilchen angewandt, die zu deren Verwendung auf irgend eine Art mit einer Antigensubstanz verbunden werden, so dass ein Indikator erhalten wird, der zur Feststellung des homologen Antikörpers oder zur Feststellung der Antigensubstanz selbst verwendet werden kann. Zur Feststellung der Anwesenheit oder Abwesenheit der Substanz, auf die unter Verwendung derartiger Indikatoren geprüft wird, ist es im allgemeinen notwendig, das Aussehen des Musters der roten Blutkörperchen zu interpretieren um feststellen zu können, ob eine Hämagglutination aufgetreten ist.
Hämagglutination tritt dann auf, wenn der homologe Antikörper in dem Testmedium in einer solchen Form vorliegt, die in der Lage ist, mit der Antigensubstanz zu reagieren, die an die roten Blutkörperchen gebunden ist, um mit derselben einen Immunkomplex zu bilden. Hämagglutination tritt nicht auf, wenn der homologe Antikörper keinen Komplex mit den roten Blutkörperchen bilden kann, an welche die Antigensubstanz gekuppelt ist. Aufgrund vieler Bedingungen, zu denen die Anwesenheit von Puffern und anderen reaktionsfähigen Materialien zählt, ist dieses Testverfahren nur beschränkt anwendbar und es ist nötig, ein geübtes Personal zur Verfü gung zu haben, das in der Lage ist, das Aussehen der erhaltenen Muster zu interpretieren, obwohl gut arbeitende Testsysteme für einige Substanzen bereits angewandt werden.
Eine andere, Schwierigkeiten verursachende Erscheinung, die bei Hämagglutinationssystemen auftritt, ist die Erscheinung, die unter der Bezeichnung heterophiles Antikörperproblem zu verstehen ist, und die von einigen Serumproteinen hervorgerufen wird, die in der Antiserumlösung enthalten sind, die mit den Antigengruppen reagiert, die üblicherweise an der Oberfläche der roten Blutkörperchen auch dann vorkommen, wenn das Antiserum von einer Species genommen wird, die von der Tierspecies verschieden ist, von der die roten Blutkörperchen verwendet werden. Auf diese Weise wurde Ovalbumin bereits früh von Pressmann, D., Campbell, D. H., Pauling, L.: Journal of Immunology 44, Seiten 101-105 (1942) im Serum entdeckt. Ein ähnliches Verfahren wurde angewandt, um Tuberkulin gereinigtes Proteinderivat festzustellen, eine Methode die von Cole, L. R., Farell, V.
R. im Journal of Experimental Medicine 102, Seite 157 (1955) beschrieben ist, und Insulin wurde im Serum von Arquilla, E. R. und Stavitsky, A. B. festgestellt, wie dies im Journal of Clinical Investigation 35.
Seiten 458466 (1956) beschrieben ist. In der USA Patentschrift Nr. 3 236 732 von Edward R. Arquilla ist ein ähnliches System zur Prüfung auf das Hormon Choriongonadotropin beschrieben. Eine pathologische Antigen substanz, nämlich Diphtherietoxin wurde auf diese Weise getestet und dieses Verfahren ist von Butler W.T. im Journal of Immunology 90, Seiten 663-671 (1963) beschrieben.
Es wird angenommen, dass die beschränkte Anwendbarkeit dieser Arten des Hämagglutinationstest zum Teil darauf zurückzuführen ist, dass ein enger Bereich der Grössen und der speziellen Konfigurationen der tierischen roten Blutkörperchen, die im allgemeinen angewandt werden, vorliegt, und dass eine grössere Anwendbarkeit der Agglutination in immun ologischen Indikatoren und Testsystemen dadurch erreicht werden könnte, wenn Indikatorpartikeln gefunden werden könnten,
die die roten Blutkörperchen ersetzen können und die eine stärkere Variation der Grösse erlauben würden. Im allgemeinen ist durch die Verwendung von tierischen roten Blutkörperchen als Indikatorteilchen für verschiedene Antigene sowohl die Anwendung eines chromatographischen als auch die Anwendung eines Plattentyp-Agglutinationsmechanismus ausgeschlossen. Die roten Blutkörperchen sind auch bei ihrer Verwendung teuer, denn es müssen im Laboratorium Tiere gehalten werden und die Abnahmebedingungen müssen sorgsam vorgeschrieben sein, damit eine Hämolyse der Zellen vermieden wird und damit eine Einheitlichkeit erreicht wird, ohne welche der Hämagglutinationstest nicht reproduzierbar ausgeführt werden kann.
Es hat sich nun herausgestellt, dass Mikrobenzellen als immunologische Indikatorpartikeln dienen können und dass hierdurch viele der vorher beschriebenen Schwierigkeiten überwunden werden können. Mikrobenzellen existieren in sehr breiten Grössenbereichen und auch ihre Farben sind stark unterschiedlich und die Grössen liegen in den Bereichen, die sowohl für Röhren-Agglutinationstest als auch für Platten-Agglutinationstest benötigt werden und auch für Tests der chromatographischen Typs zugänglich sind. Daher ist eine Vielzahl von Testmechanismen anwendbar, wenn Mikrobenzellen als Indikatorpartikeln verwendet werden. Die Zellen können leicht unter Laboratoriumsbedingungen gezüchtet werden und können billig hergestellt werden.
Die Mikrobenzellen können entsprechend der benötigten Grösse, entsprechend der Oberflächeneigenschaften, die für den jeweiligen Testmechanismus besonders vorteilhaft sind und nach dem Gesichtspunkt, unter dem die Züchtung der Zellen besonders leicht möglich ist, ausgewählt werden. Deshalb ist eine grössere Variationsmöglichkeit bei der Herstellung des immunologischen Indikators bzw. immunologischen Testsystems möglich, wenn Mikrobenzellen verwendet werden. Durch die Verwendung von Mikrobenzellen kann auch das heterophile Antikörperproblem beseitigt werden.
Unter der Bezeichnung Indikatorteilchen sind hierin Mikrobenzellen zu verstehen, an die keine Verbindung chemisch gebunden ist, die nach der Bindung an die Mikrobenzellen noch eine freie reaktive Gruppe aufweist. Diese Verbindung, die bevor sie an die Mikrobenzellen gebunden wird 2 nichtgebundene reaktive Gruppen aufweist, von denen dann eine mit den Mikrobenzellen unter Ausbildung einer kovalenten chemischen Bindung reagiert, wird in der Folge auch Kupplungsmittel genannt. Unter der Bezeichnung Mittel zur Herstellung eines immunologischen Indikators sind Mikrobenzellen zu verstehen, an die das Kupplungsmittel gebunden ist, aber ohne dass eine Antigensubstanz an dieselben gebunden ist. Unter der Bezeichnung immunologischer Indikator ist die Kombination aus Zellen, Kupplungsmittel und Antigensubstanz zu verstehen.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher das Mittel zur Herstllung eines immunologischen Indikators, das zur chemischen Bindung an Antigensubstanzen geeignet ist, und das dadurch gekennzeichnet ist, dass es aus Mikrobenzellen aufgebaut ist, an die über eine covalente chemische Bindung eine Verbindung gebunden ist, die noch mindestens eine freie reaktive Gruppe aufweist, wobei diese reaktive Gruppe in der Lage ist, mit Antigenen zu reagieren, wenn das Mittel mit diesen zusammengebracht wird.
Die Mikrobenzellen des erfindungsgemässen Mittels zur Herstellung eines Indikators können Bakterienzellen, Pilzzellen, Parasitenzellen, Protozoenzellen oder Virenzellen sein. Vorzugsweise haben die Mikrobenzellen gleiche Form und Grösse und besitzen in einer Richtung eine maximale Ausdehnung im Bereich von 0,2 bis 10 Mikron. Die Mikrobenzellen können mit einem Inaktivierungsmittel vorbehandelte Mikrobenzellen und/oder gefärbte Mikrobenzellen sein.
Als Beispiel für die Verbindungen, die beim erfindungsgemässen Mittel über eine freie reaktive Gruppe an die Mikrobenzellen gebunden sind und noch eine freie reaktive Gruppe aufweisen, seien genannt: Bis-diazobenzidin, Bis-di azobenzidin-disulfonsäure, Tetraazo-p-phenylendiamin, Difluordinitrobenzol, Carbodiimid, Toluoldiisocyanat, Cyanurchlorid, Dichlor-s-triazin oder N-t-Butyl-5-methylisoxazolium-perchlorat.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemässen Mittels, wobei sich dieses Verfahren dadurch auszeichnent, dass man Mikrobenzellen mit einer Verbindung zusammenbringt, die mindestens 2 nicht gebundene reaktive Gruppen aufweist, und dass man eine dieser reaktiven Gruppen mit den Mikrobenzellen unter Bildung einer kovalenten chemischen Bindung reagieren lässt und die andere der genannten reaktiven Gruppen in dem ungebundenen Zustand belässt.
Bei der Durchführung dieses Verfahrens kann man die Mikrobenzellen suspendieren und diese Suspension mit der Verbindung, die mindestens 2 reaktive Gruppen aufweist, zusammenbringen. Als Beispiel für Verbindungen mit mindestens 2 reaktiven Gruppen seien genannt: Bis-diazobenzidin, Bis-diazobenzidindisulfonsäure, Tetraazo-p-phenylendiamin, Difluordinitrobenzol, ein Carbodiimid, Toluoldiisocyanat, Cyanurchlorid, Dichlor-s-triazin und N-t-Butyl-5-methylisoxazolium-perchlorat.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemässen Mittels zur Herstellung eines Indikators. Diese Verwendung ist dadurch gekennzeichnet, dass man das Mittel mit einem Antigen umsetzt, wobei das Antigen an die reaktiven Gruppen des Mittels durch kovalente Bindungen gebunden wird.
Ein so erhaltener immunologischer Indikator kann zur Feststellung eines Antigens verwendet werden und kann auch zur Verwendung in Kombination mit den homologen Antikörpern geeignet sein, wobei der Indikator aus Mikrobenzellen zusammengesetzt ist, die an das Antigen mit Hilfe eines chemischen Kupplungsmittels gebunden sind. Bei dieser Verwendung kann der erhaltene Indikator auf ein saugfähiges Material als Abscheidung aufgebracht werden. Man kann das erfindungsgemässe Mittel mit einem Antigen umsetzen, das ein Serumantigen, vorzugsweise y-Globulin, Serumalbumin oder eine Blutgruppensubstanz, oder ein Mikrobenantigen, eine antigene Hormonsubstanz, ein Proteinhydrolyseprodukt oder ein Enzym ist.
Spezielle Beispiele für Antigene mit denen der Indikator umgesetzt werden kann sind: Ovalbumin, ein mit Tuberkulin gereinigtes Proteinderivat, Insulin, das Hormon Choriongonadotropin (CGTH), das sowohl menschlichen als auch tierischen Ursprungs sein kann, sowie menschliches Serumalbumin oder Pferdey-Globulin.
Die Mikrobenzellen des erfindungsgemässen Mittels und der daraus herstellbaren immunologischen Indikators können irgendwelche selbstreproduzierende Mikroorganismen sein, die sich abhängig von oder unabhängig von anderen Organisrnen fortpflanzen. Sowohl grampositive als auch gramnegative Bakterienzellen können verwendet werden, ferner sind auch die Zellen von Pilzen und Protozoen-Zellen anwendbar und auch Virenzellen sind für einige Testsysteme verwendbar. Dies sind im allgemeinen einzellige Organisrnen, die manchmal in Klumpen oder Aggregaten miteinander verbunden sind. Die Zellen können in dieser Form angewandt werden, vorausgesetzt, dass ihre Aggregatgrösse kein Trägerteilchen bildet, das so gross ist, dass das mit diesem gebildete Testsystem in Anwesenheit einer Substanz, die homolog zu der an die aggregierten Zellen zu bindende Antigensubstanz ist, nicht agglutiniert.
Im allgemeinen sind die bevorzugten Mikrobenzellen, Bakterienzellen oder Aggregate derselben, die einheitliche Form und Grösse aufweisen, und maximale Aussenabmessungen im Bereich von etwa 0,2 bis 10 Micron besitzen. Obwohl es nicht vorzuziehen ist, kann auch eine Mischung aus verschiedenen aber einheitlichen Zellen verwendet werden. Bei diesen Bakterien gehören zu den verwendbaren Mikrobenzellen diejenigen der Abteilung I des Pflanzenreiches, zu der die Klassen I, II und III, Ordnung I gehören. Zur Klasse III Ordnung 1 der Mikrobenzellen gehören die intrazellularen Virenorganismen, die Grössen im Be reicll von etwa 0,2 Micron aufweisen.
Bezüglich der kompletten Aufzählung der verwendbaren Bakterienzellen sei auf Bergey's Manual of Determinative Bacteriology von R. S. Breed, E. G. D.
Murray, N. R. Smith., 7. Ausgabe 1947, (Williams und Wilkins Company) verwiesen. Besonders geeignet sind Bakterien der Klasse II Unterordnung II Familie IV (Pseudomonadaceen) und der Klasse II Ordnung IV Familie IV (Enterobacteriaceen). Man nimmt an, dass alle Stämme I bis IV zur Durchführung der vorliegenden Erfindung bevorzugte Zellen darstellen. Auch die Klasse II Ordnung IV Familie V (Brucellaceen), X (Lactobacillaceen) und XIII (Bacillaceen) sind bevorzugte Mikroorganismen. Sowohl die Ordnungen I als auch II der Klasse III der Organismen können angewandt werden, wenn Partikeln einer geringeren Grösse von etwa 0,2 Mikron oder noch kleiner gewünscht sind. Insbesondere die Viralen der Ordnung II sind von sehr geringen Grössenabmessungen, wodurch ihre Verwendbarkeit begrenzt ist.
Besonders bevorzugte Bakterienzellen sind Brucella abortus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Lactobacillus leichmannii und Pseudomonas fragi. Die Hefewachstumsphase der Pilzzellen sind auch zur Durchführung der Erfindung bevorzugt. Besonders bevorzugt ist die übliche erhältliche Hefe, nämlich Saccharomyces cerevisiae.
Die Mikrobenzellen können in ihrem natürlichen Zustand verwendet werden, d. h. das Kupplungsmittel kann mit ihnen direkt umgesetzt werden. Wenn jedoch die natürlichen pathogenen Eigenschaften irgendwelcher Mikrobenzellen als gefährlich angesehen werden müssen, dann kann die natürliche Antigenität und damit die pathologischen Eigenschaften dadurch entfernt werden, dass man die Mikrobenzellen mit Inaktivierungsmitteln behandelt oder abtötet. Die gebräuchlichsten Inaktivierungsmittel sind Formaldehyd und Phenol. Es ist bemerkenswert, dass für den Fall, dass Mikrobenzellen mit einem derartigen Inaktivierungsmittel vorbehandelt und dann noch abgewandelt wurden, indem das Kupplungsmittel an sie gebunden wurde, die auf der Zellenoberfläche natürlich vorkommenden Antigengruppen genügend modifiziert wurden, so dass sie inaktiv wurden.
Um irgendwelche Zellen, die natürliche Antigenaktivität aufweisen vollständig auszuschalten, kann das hergestellte Testsystem mit einem Serum enthaltenden Antikörper an das Antigen gebunden werden, das im natürlichen Zustand auf der Zellenoberfläche anwesend ist, wobei hierdurch ein Komplex gebildet wird, der bei weiteren Tests nicht mehr stört.
Wenn z. B. Escherichia coli für die Indikatorpartikeln des Mittels zur Herstellung eines Indikators verwendet werden und die Antikörper für Escherichia coli in der Testprobe anwesend sind, dann kann die Reaktion zwischen dem Indikator und seinem Antikörper durch die Adsorption der Escherichia coli-Zellen des Indika tors mit Antiseren blockiert werden, die den entsprechenden Antikörper enthalten. Deshalb kann man nicht mehr annehmen, dass die Mikrobenzellen, die im erfindungsgemässen Indikator anwesend sind, ihre natürliche Antigenität besitzen.
Falls gewünscht wird, können die Mikrobenzellen gefärbt werden, um die visuelle Unterscheidbarkeit des erhaltenen Indikators von dem umgebenden Hintergrund zu verbessern. Im allgemeinen werden Farbstoffe wie Hematoxylin, Fuchsin und Kristallviolett zu diesem Zweck verwendet. Eine andere, gegebenenfalls vorgenommene Behandlung besteht darin, dass man die Zellen mit organischen Lösungsmitteln, wie z. B.
Alkoholen, Äthern usw. wäscht, um Polysaccharid- oder Wachsschichten zu entfernen, die anwesend sein können.
Die Verbindungen, die mindestens 2 reaktive Gruppen aufweisen, nämlich die Kupplungsmittel müssen solche reaktiven Gruppen besitzen, die sowohl mit der Mikrobenzelle als auch den Antigensubstanzen reagieren. Die Kupplungsmittel sind im allgemeinen Verbindungen, die zwei oder mehr der folgenden reaktiven Gruppen aufweisen: Azogruppen, Sulfonsäuregruppen, Fluorgruppen die mit Nitrogruppen kombiniert sind, Acide, Imine und reaktive Chlorgruppen, die mit einem Ring verbunden sind, der eine geeignete Resonanzstruktur besitzt.
Diese reaktiven Gruppen sind in der Lage, mit den primären Aminogruppen mit den SH-Gruppen (Mercaptogruppen) und mit den Hydroxylgruppen in den Polymerketten und an der Oberfläche der Mikrobenzellen zu reagieren und bei der Verwendung des Mittels reagieren sie dann mit analogen Gruppen des Antigens unter Ausbildung des immunologischen Indikators.
Als Kupplungsmittel seien beispielsweise angeführt: Bis-diazobenzidin, Bis-diazobenzidin-disulfonsäure, Tetraazo-p-phenylendiamin, Difluordinitrobenzol, verschiedene Carbodiimide, Toluoldiisocyanat, Cyanurchlorid, Dichlor-S-triazin und N-t-Butyl-5-methylisoxazoliumperchlorat.
Einige dieser Kupplungsmittel, insbesondere die cyanurierenden Mittel sind in der Lage, die Zellen, zu der Zeit, wo sie mit Gruppen der Oberfläche der Mikrobenzellen kuppeln, so zu schützen, dass bei Verwendung dieser Kupplungsmittel keine getrennte Vorbehandlung zum Schutz der Zellen notwendig ist. Bei Verwendung der zuletzt aufgezählten Verbindung werden die Indikatorteilchen zuerst mit einem succinilierenden Mittel, beispielsweise Bernsteinsäureanhydrid, behandelt.
Zur Bildung des Mittels zur Herstellung des immunologischen Indikators wird das Kupplungsmittel zuerst mit den Mikrobenzellen zur Reaktion gebracht, die zweckmässigerweise in einer Flüssigkeit suspendiert sind, und dann wird daraus der Indikator, wenn er gebraucht wird, hergestellt, indem man das Mittel mit der Antigensubstanz unter Bildung des Indikators mischt.
Das erfindungsgemässe Mittel kann als handelbarer Artikel betrachtet werden, da es hergestellt und verkauft werden kann, so dass es der Verbraucher zur Herstellung eines Indikators für jede beliebige Antigensubstanz verwenden kann.
Im allgemeinen kann jede beliebige Antigensubstanz mit dem erfindungsgemässen Mittel gekuppelt werden. Unter dem Begriff Antigensubstanz ist ein Material zu verstehen, das, wenn es in das Kreislaufsystem eines Tieres eingeführt wird, den entsprechenden Antikörper liefert. Unter diesen breiten Begriff fallen daher Serumantigene, wie z. B. y-Globulin und Serumalbumin und auch die Blutgruppensubstanzen A und B, die zur Testung der verschiedenen Bluttypen dienen.
Mikrobenantigene können an den Indikator gekuppelt werden und es kann dann entweder die Mikrobe selbst oder ihr Antikörper in den Flüssigkeiten festgestellt werden. Antigene Hormonsubstanzen, die in Flüssigkeitssystemen des Organismus anwesend sein können, können auch an den Indikator gekuppelt werden. Auch Proteinhydrolyseprodukte und Enzyme können als Antigensubstanzen verwendet werden. Die Mikrobenantigene oder Antikörper können von bakterieller, pilzlicher, parasitologischer oder virenartiger Natur sein. Die Hauptforderung, die an die Antigensubstanzen gestellt wird, ist die, dass sie mindestens eine Gruppe in ihren Polymerketten aufweisen, die mit der reaktiven Gruppe von mindestens einem der bekannten Kupplungsmittel reagieren kann. Soweit bekannt ist, erfüllen alle Antigensubstanzen diese Forderung.
Die Antigensubstanz kann ein natürlich vorkommendes Material sein oder sie kann ein künstlich hergestelltes Material sein. Einige natürlich vorkommende Substanzen, die mit einem erfindungsgemässen Mittel zur Herstellung eines immunologischen Indikators gekuppelt werden können, sind; Ovalbumin, Tuberculin gereinigtes Proteinderivat, Insulin, das Hormon Choriongonadotropin (CGTH), und zwar sowohl dasjenige menschlichen als dasjenige tierischen Ursprungs, menschliches Serumalbumin und Pferde-y-globulin.
Es gibt drei allgemeine Methoden zur Durchführung der Tests mit den bei der Verwendung des erfindungsgemässen Mittels erhaltenen immunologischen Indikatoren. Diese Methoden wenden die Prinzipien der Chromatographie, diejenigen der Agglutination in einer Röhre und die der Agglutination in einer Schicht oder auf einer Platte an. Welche Methode nun tatsächlich ausgewählt wird, hängt im wesentlichen von der Grösse der Mikrobenzellen ab, die verwendet werden.
Für den chromatographischen Test werden Mikrobenzellen bevorzugt, die die Form von ellypsoidförmigen Stäben besitzen und etwa 0,3 bis 0,4 Micron lang sind. Für die Platten-Agglutination-Tests können die Mikrobenzellen längere Stäbe sein, die beispielsweise eine Länge im Bereich von 1 bis 3 Mikron und einen Durchmesser im Bereich von 0,5 Mikron besitzen, wobei die Zellen auch Kokkenform aufweisen können.
Ein Röhren-Agglutinations-Test kann für einen weiten Grössenbereich der Mikrobenzellen ausgearbeitet werden, wobei der Grössenbereich zwischen etwa 0,2 bis etwa 10 Mikron in jeder Raumrichtung der Mikroben.
d. h. in Längsrichtung oder in Querrichtung liegen kann.
Die Platten- oder Röhren-Agglutinations-Tests beruhen auf der Fähigkeit des immunologischen Indikators, der aus dem erfindungsgemässen Mittel erzeugt wurde, zu agglutinieren, wobei sich bei der Agglutination ein erkennbarer Unterschied im Muster zu dem Muster bildet, das das System bei Nichtvorhandensein einer Agglutination zeigt. Diese Art der Testung kann in zwei grundlegend verschiedenen Weisen durchgeführt werden, wobei im ersten Fall eine Agglutination und im zweiten Fall eine Hemmung der Agglutination auftritt. Im Fall der Agglutination wird ein Antigen an die Mikrobenzellen gekuppelt, wobei sich ein Indikator bildet, und dieser wird verwendet, um die Anwesenheit des entsprechenden Antikörpers in der Probe festzustellen.
Wenn die Probe den Antikörper enthält, dann agglutiniert der Indikator mit dem Antikörper und dieser Umstand kann durch das Muster festgestellt werden, das der Indikator zeigt. Bei der Hemmung der Agglutination wird das Antigen an die Mikrobenzellen gekuppelt, wobei sich ein immunologischer Indikator bildet, der dann mit dem homogenen Antikörper zur Testung auf die Anwesenheit von Antigen in der Probe herangezogen wird. Wenn die Probe das Antigen enthält, wird der homologe Antikörper von dem Antigen gehemmt oder neutralisiert und das Indikatorsystem wird nicht agglutiniert. Unter der Bedingung der Nicht Agglutination wird sich der Indikator, der aus unlöslichen Mikrobenzellen und dem gebundenen Antigen besteht, aus der Testflüssigkeit abscheiden, wobei sich ein erkennbarer Unterschied im Muster im Vergleich zu dem Muster bildet, das der agglutinierte Indikator zeigt.
Die Agglutinierung zeigt sich im Fall des Platten Tests durch die Bildung eines körnigen Musters, während im Fall des Röhren-Tests die Agglutinierung durch eine gleichmässige einheitliche Suspension der Zellen angezeigt wird. Wenn beim Platten-Test eine Nicht-Agglutinierung auftritt, so zeigt sich dies in Form eines glatten Musters und im Fall des Röhren Tests zeigt sich die Nicht-Agglutinierung durch die Sedimentation des Indikators am Boden der Röhre, wobei diese Sedimentation entweder die Form eines Ringes oder eines Fleckes annehmen kann.
Die gleiche Art der Agglutinierung oder Hemmung der Agglntininierung ist für den Typus der chromatographischen Testung verantwortlich, wobei für den Fall, dass die getestete Probe ein spezielles Antigen oder einen Antikörper enthält, dann von der chromatographischen Lösung eine spezielle Wanderungseigenschaft gezeigt wird. Für den Fall, dass Agglutinierung auftritt, wird beim chromatographischen Test ein Fleck des Indikators auf einen geeigneten chromatographischen Träger, beispielsweise ein Filterpapier, aufgetragen und dann wird ein Tropfen der auf die Aussenseite des Antikörpers zu testenden Flüssigkeit an der gleichen Stelle aufgetragen und der Rand des Trägers wird mit der Entwicklerflüssigkeit, beispielsweise einer Salzlösung in Berührung gebracht.
Wenn die Probe den Antikörper enthält, dann agglutiniert der Indikator und bildet mit dem Antikörper ein Immunaggregat. Dieses Aggregat wandert nicht weiter, wenn die Entwicklerflüssigkeit vordringt und es wird nur eine geringe Ver änderung des Flecks auftreten. Wenn jedoch die Probe keinen Antikörper enthält, dann bildet sich kein Immunaggregat und der Indikator wandert dann weiter, sobald die Lösungsmittelfront fortschreitet, wobei sich ein Streifenmuster bildet. Bei der Ausführung eines Tests auf die Hemmung der Agglutinierung wird nach dem chromatographischen Testverfahren ein Fleck des Immunaggregates gebildet, indem man einen Tropfen einer Antikörper enthaltenden Lösung auf einen Tropfen der auf die Anwesenheit des Antigens zu testenden Probe wird dann auf den Fleck des Immunaggregats aufgetragen und man lässt eine Lösung im Trägermaterial aufsteigen.
Es ist auch möglich, den Rand des Trägermaterials direkt mit der Probe zusammenzubringen so dass das Antigen, falls es anwesend ist, mit dem Tropfen des Immunaggregats in Kontakt kommt. Falls die Probe das Antigen enthält, wird das Immunaggregat aufgrund der bevorzugten Reaktion zwischen Antikörper und Antigen zur Dissoziation gebracht und der Indikator wandert dann und bildet ein Streifenmuster.
Für den Fall, dass kein Antigen in der Probe anwesend ist, tritt natürlich keine Wanderung des Fleckes, der das Immunaggregat enthält, auf.
Die Erfindung soll anhand der Beispiele näher er iäutert werden. In den Beispielen werden die Teile als Gewichtsteile pro Volumen angegeben und die Pufferkonzentrationen werden in Molaritäten M angegeben, falls nicht ausdrücklich angeführt wird, dass andere Bezeichnungsweisen vorliegen.
Beispiel 1
Ein Mittel zur Herstellung eines immunologischen Indikators wurde erzeugt, indem man als Mikrobenzellen, Zellen der Brucella abortus verwendete und es wurde Bis-diazobenzidin (BDB) als Kupplungsmittel angewandt. Das erhaltene Mittel wurde dann mit menschlichem Choriongonadotropin (CGTH) das als Antigen diente, zu einem speziellen Indikator umgesetzt und dieser wurde dann auf ein aufsaugendes Trägermaterial in Verbindung mit dem Antikörper des CGTH aufgetragen und Harnproben wurden dann mit der so erhaltenen Testvorrichtung auf die Anwesenheit von CGTH geprüft. Dieser Indikator funktionierte nach dem in der Folge beschriebenen chromatographischen Mechanismus.
Herstellung des Reagens
Isotone Salzlösung:
Eine 0,850/oige Salzlösung wurde hergestellt, indem man 8,5 g Natriumchlorid in einem Liter destilliertem Wasser löste.
Phosphatpuffer: Eine 0,15-molare Pufferlösung eines pH-Wertes von 7 wurde hergestellt, indem man eine trockene Mischung aus 81 /o sekundärem Natriumphosphat (Na2HPO4) und 19 /o primärem Natriumphosphat (NaH2PO+) in destilliertem Wasser auflöste, bis der gewünschte pH-Wert erreicht war.
Bis-diazobenzidinlösung:
Zu 0,92 g Benzidin wurden 100 ml destilliertes Wasser und 6 ml 6-normale Salzsäure gegeben. Es wurden zusätzlich 100 ml destilliertes Wasser der Mi Mischung zugesetzt. Nach der Auflösung des Benzidins wurde die Lösung in einem Eis-Salzkühlbad auf 0 C abgekühlt. Sobald sich in der Lösung Eiskristalle zu bilden begannen, wurden 6,5 ml einer 100/oigen Lösung aus Natriumnitrit rasch unter Rühren zugesetzt. Das Rühren wurde so lange fortgesetzt, bis die Lösung gegenüber Stärkejodidpapier negativ reagierte. Während des Rührens wurde dafür Sorge getragen, dass die Temperatur niemals auf über etwa 10 C anstieg.
Dieses Material wies eine schwache Gelbfärbung auf. Bei der Zugabe des Phosphatpuffers veränderte sich die Farbe in rotbraun. Die blassgelbe Lösung war bei Zimmertemperatur zwischen 5 und 7 Stunden beständig, bei 40 C war sie etwa 7 Tage lang stabil.
Wenn diese Lösung gefroren wurde und bei -200 C aufbewahrt wurde, dann war sie 60 Tage hindurch beständig. Bei einer Lagerung bei -35" C war sie mindestens 6 Monate lang beständig.
Formalinisierung der Mikrobenzellen: Zellen der Brucella abortus wurden 72 Stunden lang bei 37 C auf Tryptose agar gezüchtet und dann wurde der Agar mit einer 0,050/oigen Salzlösung die 10/0 Formaldehyd enthielt, weggewaschen. Die Zellen wurden sofort mit Formaldehyd behandelt, indem man sie in einer Kochsalz-Formaldehyd-Lösung 24 Stunden lang bei Zimmertemperatur (250 C) beliess. Die Zellen wurden dann gründlich gewaschen, um den Rest des Schutzmittels (Formaldehyd) zu entfernen. Das Waschen der Zellen der Brucella abortus wurde durchgeführt, indem man die Zellen in destilliertem Wasser suspendierte.
Die Zellen wurden dann abzentrifugiert und erneut in destilliertem Wasser suspendiert, wobei diese Verfah rensschritte mehrmals wiederholt wurden. Die konservierten Zellen wurden dann gefärbt.
Färbung der formalinisierten Mikrobenzellen: 2 g der nass zusammengepackten formalinisierten Zellen der Brucella abortus, 1 ml 20/obiges Ferrosulfat und 5ml 10/obiges wässriges Hematoxylin, wurden 100 ml destilliertem Wasser zugesetzt und die Mischung wurde 24 Stunden lang ständig gerührt. Die Zellen wurden dauerhaft gefärbt und die Farbe laugte sich nicht aus.
Erzeugung des Mittels zur Herstellung des Indikators: (Formalinisierte Mikrobenzellen-BDB-CGTH) Zellen der Brucella abortus, die mit Hematoxilin wie oben beschrieben, gefärbt waren, wurden als Indikatorpartikeln herangezogen. Ein Volumen, das 0,5 g zusammengepackter gefärbter Zellen enthielt, wurde zu 10 ml einer Salzlösung gegeben, und dann wurden 12 ml Phosphatpuffer und 40 ml einer verdünnten BDB-Lösung, die durch Mischen von 8 ml der oben beschriebenen BDB-Lösung mit 32 mol Phosphatpuffer hergestellt wurde, zugegeben. Man liess die Kupplnngsreaktion unter ständigem Rühren 20 Minuten lang bei Zimmertemperatur (250 C) ablaufen.
Das so erhaltene Mittel wurde zur Herstellung eines Indikators verwendet, indem man es mit menschlichem CGTH, das von der Vitamerican Corp. Little Falls, New Jersey, erhalten wurde, in einer Menge von 20 mg CGTH pro 0,9 g der Zellen (bezogen auf deren Gewicht vor der Kupplung) umsetzte. Der erhaltene Indikator war ein brauner Komplex, der abzentrifugiert wurde. Da der Indikator auf einen saugfähigen Träger aufgetragen werden sollte, wurde ein Anteil von 0,1 g dieses Indikators in einem Mörser homogenisiert. Es wurde eine kräftige Mischung mit einem Tropfen 10/obigem Methiolat vorgenommen und 1 g Saccharosesirup (25 Gew.-O/o pro Volumen) wurde langsam zugegeben.
Herstellung des Antikörpers für das CGTH: Laboratoriumskaninchen wurden mit Injektionen aus menschlichem CGTH in Freund's komplettem Hilfsstoff in einer Reihe von Impfungen behandelt. Nach einem vorgegebenen Zeitraum wurde den Kaninchen Blut abgenommen und das Serum, das den Antikörper enthielt, wurde vom Gesamtblut abgetrennt. Das angewandte CGTlR kann irgendeines der käuflich erwobenen Präparate sein. Beonders nützlich ist dasjenige, das von der Vitamerican Corp. vertrieben wird, und das eine Aktivität von etwa 2000 bis 2500 internationalen Einheiten (I. U) pro mg aufweist.
Ein typisches Schema für die Injektionsbehandlung und die Abtrennung des Antikörpers ist das folgende: Eine Lösung, die 10 mg CGTH pro ml Salzlösung enthält, wurde mit gleichen Teilen Freund's komplettem Hilfsstoff gemischt, 1/10 (0,1 ml) der Mischung wurde in jeden Zehenballen eines Kaninchens injiziert, das 3 t/2 kg wog.
Am Ende eines Zeitraumes von 2 Wochen wurde eine erste Injektion von 0,5 ml einer Lösung verabreicht, die 5 mg CGTH pro ml Salzlösung enthielt. Die Injektion wurde intravenös gegeben. Zwei Tage nach der ersten Injektion wurde eine zweite verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Injektion wurden dem Kaninchen Blutproben abgenommen. Das Antiserum wies einen Titer von 1:2560, bestimmt durch Hämagglutination, auf.
Testverfahren (chromatographisches Testverfahren): Ein Fleck des oben hergestellten Indikators wurde etwa in einer Entfernung von 19 mm vom Rand eines Stücks Filterpapier aufgetragen und ein Tropfen des obigen Antiserum wurde sodann aufgetragen, wo- bei sich ein Immunaggregat bildete. Der Rand des Papiers wurde dann mit einer normalen Harnprobe einer Nichtschwangeren in Kontakt gebracht. Als der Harn im Papier hochstieg, blieb der Fleck des Tmmunaggregats fest am Papier. Dies zeigte, dass das gebildete Im munaggregat durch die üblichen Harnbestandteile nicht zur Dissoziation gebracht wurde.
Ein anderer Streifen des Filterpapiers wurde wie oben beschrieben mit einem Fleck aus Immunaggregat versehen und der Rand des Papiers wurde in eine Harnprobe einer schwangeren Frau eingebracht, der Harn stieg im Papier hoch, ein Teil des Immunaggregats dissoziierte und bewirkte eine Streifenbildung oder eine Aufwärtswanderung des gefärbten Indikators aus dem Aggregatfleck, der entsprechenderweise an Farbintensität verlor.
Bei einem anderen Test wurden die Flecke des Immunaggregats auf verschiedenen Papierstreifen aufgetragen und dann wurden die Harnproben auf diese Streifen aufgetropft. Die Ränder der Streifen wurden dann in eine physiologische Salzlösung eingetaucht. Sobald die Salzlösung über die Flecken hinaus aufstieg, die mit dem Harn einer schwangeren Frau behandelt wurden, wanderte ein Teil des gefärbten Indikators mit, wobei sich ein Streifenmuster bildete. Eine relativ geringe Streifenbildung zeigte sich, wenn die Salzlösung über Flecken wanderte, die mit dem normalen Harn einer Nichtschwangeren behandelt wurden.
Testvorrichtungen wurden zum Testen des Vorhandenseins des Antikörpers für menschliches CGTH hergestellt, indem man Flecken des oben beschriebenen Indikators etwa 1,9 cm vom Rand eines Stückes Filterpapier auftrug. Ein Tropfen Kaninchenserum, das den Antikörper enthielt, wurde auf den Fleck des Indikators auf einen der Streifen aufgetragen und der Rand des Filterpapiers wurde in eine physiologische Salzlösung eingetaucht. Die Salzlösung wanderte über den Fleck, ohne dass eine Streifenbildung des Indikators auftrat, wodurch gezeigt wurde, dass sich ein unlösliches Immunaggregat gebildet hatte. Ein Tropfen normalen I(aninchenserums wurde in gleicher Weise mit dem Indikator getestet und es stellte sich heraus, dass ein Abwandern vom FIeck auftrat, wodurch gezeigt war, dass sich kein Immunaggregat gebildet hatte.
Der oben beschriebene Indikator zeigte auch Agglutinierung durch den Antikörper des menschlichen CGTK, wenn der Agglutiniertest nach dem System des Röhrchentests durchgeführt wurde, Diese Agglutinierungen konnten durch Zugabe geringerer Mengen einer CGTH enthaltenden Lösung zu dem Testmedium leicht gehemmt werden.
Bei der Herstellung der diagnostischen Zusammensetzungen auf einem aufsaugenden Trägermaterial un ter Verwendung eines Indikators, der Mikrobenzellen enthält, ist es wesentlich, dass das aus Zellen bestehende Material durch Behandlung mit einem Schutzmittel, wie oben beschrieben, stabilisiert wird.
Eine andere Indikatorvorrichtung kann hergestellt werden, indem man den oben beschriebenen Indikator mit dem Antikörper unter Bildung eines Immunaggregats mischt und einen einzigen Fleck auf eine Stelle, die vom Rand des Streifens entfernt ist, aufträgt und trocknet. Bei der Verwendung wird ein Tropfen einer Ilarnprobe auf diesen Fleck aufgetragen oder an einer Stelle aufgetragen, die sich zwischen diesem Fleck und dem Rand des Papiers befindet, worauf dann das Ende des Streifens in eine Salzlösung eingetaucht wird.
Wenn der Harn CGTH enthält, dann dissoziiert das Aggregat und der gefärbte Indikator wandert mit der Salzlösung und es bilden sich Streifen. Falls kein CGTH anwesend ist, tritt keine Veränderung auf.
Andererseits kann auch die Harnprobe als chromatographische Entwicklerflüssigkeit verwendet werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Testvorrichtung so geartet, dass das diagnostische Reagens in Form eines Streifens vorliegt, der beispielsweise dadurch hergestellt wird, dass man ein Band des Indikators und Antikörperaggregats etwa 15 mm vom langen Rand eines Eaton-Dikeman Filterpapiers Nr. 609, das die Dimension 13 cm X 26 cm aufweist, aufträgt und das Reagens bei Zimmertemperatur trocknen lässt und das Papier der Breite nach in Streifen zerschneidet und diese Streifen bis zu deren Verwendung in einem geeigneten Behälter aufbewahrt.
Man sieht, dass viele verschiedene Materialien als saugfähige Streifen bei dem beschriebenen Streifentest angewandt werden können. Beispielsweise können viele Arten chromatographischer Materialien angewandt werden und es können auch viele Arten chromatographischer Entwicklerflüssigkeiten verwendet werden.
Beispiel 2
Escherichia coli wurde als Indikatorteilchen zur Erzeugung eines Mittels zur Herstellung eines Indikators verwendet, wobei das Mittel aus Mikrobenzellen und BDB bestand. Dieses Mittel wurde durch Umsetzung mit CGTH in einen Indikator verwandelt, der zusammen mit dem Antikörper für CGTH angewandt wurde, wobei ein Agglutinationstest nach dem Plattentyp vorgenommen wurde und eine klinische Feststellung der Schwangerschaft wurde mit diesem Test durchgeführt.
Herstellung der Reagentien 0,850/obige Salzlösung:
Es wurden 68g Natriumchlorid in 8 Litern destilliertem Wasser gelöst und die Lösung wurde bei einer atü und 3500 C 30 Minuten lang im Autoklaven behandelt. Sie wurde dann abgekühlt und bei 4" C aufbewahrt. Die Behandlung im Autoklaven wurde durchgeführt, um die Salzlösung zu sterilisieren.
1 0/oige Formaldehydlösung: eine 37Einige Formalinlösung wurde behandelt, indem man gepulvertes Calciumcarbonat zu der Lösung zusetzte und die Mischung 24 bis 28 Stunden lang stehen liess. Das überstehende Material wurde dann in einen anderen Behälter abgegossen und dreimal durch ein hochwertiges, weisses Filterpapier mit gecreppter Oberfläche abfiltriert. Wenn der pH-Wert unter 7 lag, dann wurde er durch Zugabe einer 0,loloigen NaOH Lösung auf 7 eingestellt. Eine ausreichende Menge dieser behandelten 370/0igen Formalinlösung wurde destilliertem Wasser zugesetzt, so dass sich eine 1 l0ige Lösung ergab.
Phosphatpufferlösung: es wurden 100 ml eines Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7,4 hergestellt, indem man 80,8 ml einer Natriumphosphatlösung mit 19,2 ml einer Kaliumphosphatlösung bei 200 C mischte. Die Natriumphosphatlösung enthielt 53,726 g Na2HPO4 12H2O pro Liter destilliertem Wasser. Die Kaliumphosphatlösung enthielt 20,441 g KH2PO4 pro Liter destilliertem Wasser.
Bis-diazobenzidin (BDB):
0,640 g Benzidindihydrochlorid (Benzidin 2HCl) wurden in 100 ml einer 0,56 /0igen Salzsäurelösung in einem 250 ml Erlenmeyerkolben aus Pyrexglas gelöst.
Dieser Kolben wurde auf eine mit Eis gefüllte magnetische Rührvorrichtung gegeben und der magnetische Rührer wurde in die Lösung eingetaucht. Wenn die Temperatur 40C erreicht hatte, wurde ein 5 ml Anteil einer Natriumnitritlösung, die durch Zugabe von 0,68 g NaNO2 zu 10 ml Wasser hergestellt wurde, mit einer serologischen Pipette aufpipettiert und tropfenweise zu der Benzidinlösung während einer Zeit von 7 bis 10 Minuten gleichmässig zugegeben, wobei der magnetische Rührer mit einer Geschwindigkeit von 200 Umdrehungen pro Minute lief. Es wurde alle 4 bis 6 Sekunden ein Tropfen Natriumhydridlösung zugegeben, wobei die Natriumnitritlösung ebenfalls eine Temperatur von 40 C aufwies.
Die Lösung wurde kontinuierlich 20 Minuten lang gerührt, und nach dieser Zeit wurde sie sofort eingefroren und bei -60" C in einer Anzahl von 1 Gramviolen aufbewahrt. Die Lösung kann sich sogar bei einer Temperatur von 0 bis 5 C zersetzen und daher wurde sie eingefroren, damit sie stabil gehalten wurde. Sie kann dann erwärmt werden, wenn sie zur Verwendung gebraucht wird.
Antikörper für das CGTH.
Eine Emulsion, die 10 mg CGTH pro ml enthält, wurde hergestellt, indem man 100 mg gereinigtes CGTH in 5 ml der obigen Salzlösung löste und 5 ml des kräftig gemischten kompletten Freund's Hilfsmittel zugab und zur Herstellung einer Emulsion schüttelte.
Eine Menge von 0,2ml der Emulsion wurde in jede Fussballe eines gesunden Kaninchens injeziert, das sich in standardisierter Laboratoriumsumgebung befand, wobei das Kaninchen eine Gesamtmenge von 0,8 ml der Emulsion (8mg CGTH) injiziert erhielt.
Dem Kaninchen wurde dann eine Reihe von Injektionen verabreicht, wobei jede aus einer 0,5 ml Lösung bestand, die hergestellt wurde, indem man ausreichend gereinigtes CGTH in 0,85 /Oiger Salzlösung löste. so dass eine Konzentration von 5 mg pro ml erhalten wurde. Die Injektionen wurden in die Ohrvenen gegeben. Diese folgenden Injektionen wurden an den fol genden Tagen nach der ersten Emulsionsinjektion verabreicht und zwar am 22. Tag, am 24., 38., 40., 71.
und 73. Tag. Zwei Proben von 40 bis 50 ml Blut wurden dem Kaninchen durch Kardiapunktur sowohl am 50. als auch am 83. Tag entnommen. Die roten Blutkörperchen dieser Proben wurden vom Serum jeder Probe abgetrennt, indem man das Blut in einem Zen trifugierröhrchen bei etwa 25 C etwa 2 Stunden lang ausflocken liess und das darüberstehende Serum wurde dann in ein Röhrchen mit einem geringeren Durchmesser (weniger als 30mm) gegeben und das Röhrchen 30 Minuten lang in ein Wasserbad von 56" C gegeben.
10 mg mit Formaldehyd behandelter roter Blutkörperchen des Schafes (lyophilisiert) wurden dann pro ml der Serumprobe zugegeben und 15 Minuten bei 25 C gemischt, um heterophile Antikörper aus dem Serum zu adsorbieren. Das adsorbierte Serum wurde mittels Zentrifugieren von den roten Blutkörperchen getrennt, wobei während des Abzentrifugieres etwa die tausendfache Erdbeschleunigung herrschte.
Eine Menge von 40 ml zusammengepackter, roter Blutkörperchen des Schafes wurden für diese Adsorption hergestellt, indem man 200 mol frisches, rotes Schafblut, das in Alserver-Lösung dispergiert ist, abzentrifugierte und die darüberstehende Flüssigkeit entfernte und dann dreimal mit 0,850/oiger Salzlösung wusch, wobei pro Waschung 120 bis 200 ml Salzlösung angewandt wurden Zu den so erhaltenen roten Blutkörperchen wurden 460 ml der oben angegebenen Salzlösung und 500 ml einer 3obigen Formalinlösung des pH-Wertes 7,3 gegeben. Die dabei erhaltene Suspension wurde gemischt und man liess sie 18 bis 20 Stunden lang bei 370 C stehen.
Die roten Blutkörperchen wurden dann durch Zentrifugieren entfernt und sie wurden fünfmal mit destilliertem Wasser gewaschen, wobei bei jedem Waschvorgang etwa 200 ml destilliertes Wasser verwendet wurde. Es wurde dann eine ausreichende Menge an destilliertem Wasser zugegeben, so dass sich eine 100/oige Suspension der Zellen ergab. Diese Suspension wurde bei 40 C aufbewahrt bis sie dann zur Adsorption verwendet wurde.
Mikrobenzellen: Die Zellen der Escherichia coli wurden erhalten, indem man einen Darmabstrich eines toten Laboratoriumskaninchens in einer Hirn-Herz-Infusionsbrühe (HHI-Brühe) züchtete. Ein Volumen von 68 ml einer gut gewachsenen Kultur (18 Stunden) wurde verwendet, um 3 Liter der Him-Herz-Infusionsbrü- he zu beimpfen, wobei die Brühe vor der Impfung auf Sterilität geprüft wurde. Die Zellen wurden 41/2 Stunden lang bei 37 C unter Schütteln bebrütet. Die so erhaltenen Zellen wiesen einheitliche Grösse und Form auf.
Herstellung des Indikators
Die drei Liter an suspendierten Escherichia coli Zellen wurden mit 10l000 Umdrehungen pro Minute 10 Minuten lang abzentrifugiert, um die überschüssige Flüssigkeit von den zusammengepackten Zellen zu isolieren. Das darüberstehende Material wurde abgegossen und die zurückbleibenden zusammengepackten Zellen wurden mit etwa 45 ml einer Formaldehydlösung, die mit 37 /o Calciumcarbonat behandelt war, zusammengebracht, um eine Tötung der Escherichia coli zu gewährleisten.
Man liess das Formalin mit den Zellen eine Stunde lang in Berührung und nach dieser Zeit wurden die Zellen dreimal mit der oben beschriebenen Salzlösung gewaschen und dann in 1600 ml einer 1 /oigen Formaldehydlösung 21 Stunden lang bei Zimmertemperatur (25 C) suspendiert. Diese Zellen wurden dann abzentrifugiert und als zusammengepackte, mit Schutzmittel behandelte Zellen isoliert. Die zusammengepackten Zellen wurden dann erneut mit 500 ml der oben beschriebenen Salzlösung suspendiert und bei 4" C aufbewahrt. Die Konzentration der Zellen betrug 4a/o, wie eine Messung mit einem Hämatokrit ergab.
Ein Teil der oben beschriebenen Suspension der Zellen wurde zentrifugiert, um ein Volumen an zusammengepackten Zellen zu gewinnen und 0,5 ml dieser zusammengepackten Zellen wurden entfernt und 10 ml der oben beschriebenen Salzlösung zugegeben, der vor/ her 12 ml Phosphatpuffer und 40 ml verdünnte BDB-Lösung zugegeben worden waren. Die verdünnte BDB-Lösung wurde hergestellt, indem man 8 ml BDB mit 32 ml Phosphatpuffer zusammenbrachte. Das so erhaltene Mittel zur Herstellung eines Indikators wurde durch Umsetzung mit 20 mg CGTH in einen speziellen Indikator umgewandelt. Das CGTH hatte eine Aktivität von 36 000 internationalen Einheiten pro mg und wurde bei der Vitamerican Copr. gekauft.
Diese Mischung wurde kontinuierlich 5 Minuten lang bei Zimmertemperatur geschüttelt und dann wurde der gebildete Indikator durch Zentrifugieren gewonnen und dreimal mit der oben beschriebenen Salzlösung gewaschen und sodann zentrifugiert und erneut in einer 1:50 Verdünnung von Rinder-Serumalbumin (3O0/o) in der obigen Salzlösung suspendiert. Das Rinder-Serumalbumin (BSA) wurde bei der Armour & Co. erworben.
Die erhaltene Suspension des Indikators zeigte eine bräunliche Farbe und es stellte sich heraus, dass sie über weite Temperaturbereiche stabil war.
Vorprüfung des Indikators
Zur Bestimmung der geringsten feststellbaren Mengen an CGTH wurden normale Harnproben hergestellt, indem man ihnen bekannte Mengen an CGTH zusetzte. Der oben hergestellte Indikator wurde dann zusammen mit dem obigen Antikörper für CGTH (AkCGTH) zur Durchführung eines Agglutinationstests nach dem Plattentyp angewandt.
Bei dieser Prüfung wurde der obige Indikator erneut in ausreichender Menge an 1:50 BSA-Salzlösung resuspendiert, wobei eine 80/obige Zellenkonzentration erhalten wurde. Darauffolgend wurden drei Lösungen der oben beschriebenen Antikörperlösung hergestellt, indem man einen Teil der Antikörperlösung mit 250 Teilen der oben beschriebenen Salzlösung sowie mit 500 Teilen der oben beschriebenen Salzlösung und ferner mit 1000 Teilen der oben beschriebenen Salzlösung verdünnte. Diese Verdünnungen wurden als 1:250, 1:500 und 1:1000 bezeichnet.
Harnproben jeder der folgenden Konzentrationen an CGTH wurden hergestellt, indem man 0,25 ml einer Vorratslösung aus 4mg CGTH pro ml Salzlösung (3600 internationale Einheiten pro mg) zu 100 mol einer Harnprobe einer nichtschwangeren Frau zugab und dann in der Serie mit Salzlösung 2,25, 4,5, 6, 9, 18 und 36 internationalen Einheiten CGTH pro ml Harn und Salz verdünnte.
Ein Teil dieser Harnprobe wurde dann als Leerwert aufbewahrt.
Ein Tropfen jeder dieser Harnproben wurde mit einem Tropfen der geeigneten Antikörperverbindung gemischt und die Mischung wurde auf eine Platte aufgetragen. Dann wurde ein Tropfen der oben beschriebenen 80/obigen Suspension des Indikatorsystems den Zellen, die sich bereits auf der Platte befanden, zugesetzt und gemischt. Die Ergebnisse dieser Testreihe werden in der unten angeführten Tabelle 1 angegeben. In dieser Tabelle bedeutet - Agglutination und daher ein körniges Aussehen in der Suspension auf der Platte, während + ein glattes, nicht agglutiniertes Muster auf der Platte bedeutet.
Tabelle 1 CGTH-Konzentration Verdünnungen an CGTH-Antikörpern im Harn in internat.
Einheiten pro ml 1:250 1:500 1:1000 0 (Leerwert) - - -
22
2,25 - - -
4,5 - - +
6,0 - + +
9,0 + + +
18,0 + + +
36,0 + + +
Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, dass für den Fall, dass kein CGTH in der Harnprobe anwesend ist, Agglutination eintritt. Diese Erscheinung ist darauf zurückzuführen, dass die Harnprobe kein CGTH enthält, das bevorzugt mit dem Antikörper des CGTH reagieren könnte, so dass der Antikörper des CGTH mit dem Indikator agglutiniert und das körnige Aussehen der balligen oder klumpigen Zellen auf dem benetzten Teil der Platte liefert.
Wenn man 2,25 internationale Einheiten CGTH pro ml einer Harnprobe zusetzt, dann ist noch immer genug CGTH Antikörper in dem System anwesend, dass bei Umsetzung des gesamten CGTH noch eine ausreichende Menge an CGTH-Antikörper anwesend ist, der ein Zusammenballen der Zellen oder eine Agglutination selbst bei einer Verdünnung von 1:1000 liefert. Wenn Harnproben, die 4,5 internationale Einheiten CGTH pro ml enthalten, mit drei Verdünnungen an Antikörper des CGTH's getestet wurden, dann setzt sich der Antikörper mit dem CGTH bei Verdünnungen zwischen 1:500 und 1:1000 vollständig um, so dass das Aussehen bei einer Verdünnung von 1:1000 nicht körnig ist, sondern ein glattes Muster von suspendierten Indikatorzellen geliefert wird, d. h., dass in diesem Fall keine Agglutination auftritt.
Man sieht, dass mit 6,0 internationalen Einheiten an CGTH pro ml die nötige Menge an Antikörper zwischen den Verdünnungen von 1:250 und 1:500 liegt, wie dies auch zu erwarten war, da eine grössere Menge an CGTH anwesend ist und daher auch eine grössere Menge an Antikörper der CGTH's notwendig ist, um eine vollständige Reaktion mit dem CGTH hervorzurufen. In diesem Fall tritt daher das körnige Muster bei einer Verdünnung von 1:250 auf. Aus Tabelle 1 sieht man, dass sehr geringe Mengen an CGTH im Harn, nämlich etwa 4,5 internationale Einheiten CGTH pro ml dann festgestellt werden können, wenn man geringe Konzentrationen an Antikörper des CGTH's im Testsystem, nämlich Verdünnungen von 1:10000 oder weniger, anwendet.
Es hat sich auch herausgestellt, dass durch eine Verdoppelung der Harnmenge, nämlich durch eine Verwendung von zwei Tropfen, Konzentrationen an CGTH, die nur 2 internationale Einheiten CGTH pro ml betragen, festgestellt werden können.
Um die genauen Zeiten, die zur Entwicklung des körnigen Musters in einem Bereich von CGTH-Antikörperkonzentrationen und Zellkonzentrationen festzustellen, wurden die folgenden zusätzlichen Tests aufgeführt.
Anteile des Indikators wurden in einer ausreichenden Menge der oben beschriebenen BSA 1:T0 Verdünnung in Salzlösung wieder suspendiert, so dass Konzentrationen von 0,6250/0 1,250/0, 2,50/o und 50/o Zellen erhalten wurden. Sodann wurde eine Verdünnungsreihe an CGTH-Antikörperlösungen mit Hilfe der obigen BSA hergestellt und zwar 1:50 in Salzlösung, so dass die Verdünnungen 1:125, 1:250, 1:500, 1:1 000, 1:2 000, 1:4 000, 1:8 000 und 1:16 000 erhalten wurde. Vier Tropfen jeder der CGTH-Antikörperverdün- nungen wurden in getrennten Parallelenreihen auf die Oberfläche einer kreuzweise schraffierten Glasplatte aufgetragen. Dem ersten Tropfen jeder dieser Verdünnungen wurde ein Tropfen der niedrigsten Konzentration der Indikatorzellsuspensionen zugesetzt.
Dem zweiten Tropfen jeder Verdünnung des CGTH-Antikörpers wurde ein Tropfen einer 1,250/oigen Suspension zugesetzt und den dritten und vierten Tropfen jeder der Verdünnungen ein Tropfen der 2,50/oigen, bzw.
50/oigen Zellsuspensionen zugefügt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt, wobei die Zeit bis zur Entwicklung eines körnigen Agglutinationsmusters für jede Testmischung in Sekunden angegeben ist.
Die Bezeichnung S in der Tabelle zeigt an, dass in diesem Fall eine ungenügende Menge an CGTH-Antikörper in der Antikörperverdünnung anwesend war, so dass in diesem Fall keine Agglutination der Zellen auftrat und daher das Muster glatt blieb.
Tabelle 2
Agglutinationszeiten in Sekunden Konzentrationen Verdünnung an CGTH-Antikörpern des Indikatorsystems, /o 1:125 1:250 1:500 1:1000 1:2000 1:4000 1:8000 1:16000
0,625 34 50 213 85 107 280 S S
1,25 31 30 36 58 56 150 120 S
2,5 25 31 43 62 92 140 S S
5,0 35 30 55 60 75 S S S
Die in Tabelle 2 angeführten Agglutinationszeiten zeigen, dass eine relativ kurze Zeitperiode notwendig ist, um die Agglutination festzustellen, wobei Agglutination beim tatsächlichen Test dann die Abwesenheit von Schwangerschaft bedeutet. Aus diesem Grunde kann Schwangerschaft nach dem Plattenagglutinationstest mit dem obigen Indikatorsystem in einer Zeit von etwa einer Minute oder in noch kürzerer Zeit festgestellt werden.
Dies ist ein wesentlich kürzerer Zeitraum als derjenige, der bei den Röhrchen-Agglutinationssystemen angewandt werden muss, die auf der Verwendung von roten Blutkörperchen beruhen. Auch die Muster, durch die die Erscheinung der Agglutination von dem Fehlen der Agglutination unterschieden wird, sind sehr klar gezeichnet und es gibt praktisch bei diesen Tests keine unklaren, dazwischenliegenden Muster, bei denen es zweifelhaft ist, ob Agglutination oder keine Agglutination auftreten kann. Es ist daher möglich, die Reagentien so auszuwählen, dass genau bestimmte Muster für die Diagnose der Schwangerschaft erhalten werden können.
Tabelle 2 zeigt auch, dass ein weiter Bereich an CGTH-Antikörperverdünnungen angewandt werden kann, und dass auch ein weiter Bereich an Indikator Konzentrationen verwendbar ist. Die Konzentration des Indikators in BSA 1:50 Verdünnung in Salzlösung kann bei einem verwendbaren Testsystem im Bereich von weniger als 10/o bis etwa 120/0 liegen.
Zur Prüfung des Indikators des Beispiels 2 mit tatsächlichen Harnproben wurden 16 Harnproben von 16 nichtschwangeren Frauen gewonnen, wobei 4 dieser Frauen unter einer regelmässigen Behandlung mit Empfängnis-verhütenden Pillen standen. Die Testmethode war die gleiche wie die oben angegebene. Dies heisst, ein Tropfen der Harnprobe wurde mit einem Tropfen einer 1:1000 CGTH-Antikörperverdünnung gemischt und dann wurde ein Tropfen dieser Mischung auf eine Glasplatte gegeben und ein Tropfen einer 40/obigen Suspension des oben beschriebenen Indikators wurde der Mischung, die bereits auf der Platte anwesend war, zugegeben. In all diesen 16 Fällen, bildete sich ein körniges Muster, das Agglutination anzeigte, und deshalb der Test anzeigte, dass keine Schwangerschaft vorlag.
Dieses Testergebnis zeigt an, dass falsche, positive Resultate nicht zu den Schwierigkeiten des obigen Indikators gehören, und dass für diese spezielle Art der Testung Hormonspiegel, die durch Schwangerschaftswerhütende Pillen hervorgerufen werden, nicht stören.
Klinischer Test unter Verwendung eines Indikators
31 gefrorene Harnproben wurden verwendet, und die Tests wurden ausgeführt, wobei die Gesundheitsbedingungen der Patienten, von denen diese Proben genommen wurden, unbekannt waren. Ein bekannter Harn einer Schwangeren wurde als Kontrollwert mitaufgenommen und ebenso ein Harn einer Nichtschwangeren als weiterer Konfroflwert Die Plattentests wurden in der oben beschriebenen Weise durchgeführt und mit Plattentests verglichen, die mit den gleichen ETarn- proben aber mit einem käuflich erhältlichen Plattentest zur Bestimmung der Schwangerschaft, der aus einem Indikator aus Latexpartikeln in Kombination mit CGTH bestand, durchgeführt.
Der Indikator wurde als 4zeigte Suspension verwendet. Die Antikörperlösung bestand aus einer 1:1000 Verdünnung der oben beschriebenen Antikörperlösung in Kochsalzlösung. Das Testverfahren bestand darin, dass man einen Tropfen jeder Harnprobe mit einem Tropfen der Antikörperlösung vermischt und dann je einen Tropfen dieser Mischung auf eine reine Glasplattenoberfläche gab und dann einen Tropfen einer 40/oigen Indikatorsuspension zusetzte und mischte. Die Ergebnisse wurden mit + als positiv bezeichnet, d. h.
es zeigte sich ein glattes Muster, durch das angezeigt war, dass die Agglutination gehemmt war und daher dieses Ergebnis einen positiven Test auf Schwangerschaft darstellte. Mit negativ, also mit einem - Zeichen wurde die Anwesenheit eines körnigen Musters bezeichnet, dh. eines Musters, das Agglutination zeigte und daher anzeigte, dass keine Schwangerschaft vorlag.
Der Test mit dem käuflich erhältlichen Testsystem wurde genau nach den oben auf der Packung angegebenen Instruktionen durchgeführt und die Ergebnisse wurden als schwanger und nichtschwanger mit plus und minus bezeichnet. Diese Ergebnisse sind in der unten angeführten Tabelle 3 aufgeführt.
Tabelle 3
Klinische Studien der Ergebnisse
Käuflich Unbekannte erhältliches Urinprobe Indikator des Schwangerschafts
Nr. Beispiels 2 testsystem
1 + -
2 + ¯
3 + +
4 + +
5 + +
6 + -
7 + +
8 + kein Versuch
9 + +
10 +
11 +
12 + +
13 + +
14 + +
15 + +
16 + -
17 +
18 +
Tabelle 3 (Fortsetzung)
Klinische Studien der Ergebnisse
Käuflich Unbekannte erhältliches Urinprobe Indikator des Schwangerschafts.
Nr. Beispiels 2 testsystem
19 + +
20 +
21 + +
22 + kein Versuch
23 +
24 + +
25 +
26 + +
27 + +
28 + +
29 + +
30 + kein Versuch
31 + kein Versuch
Aus der obigen Tabelle ist ersichtlich, dass bei Durchführung des Testes mit Hilfe des Indikators nach Beispiel 2 alle Harnproben als Harnproben von schwangeren Frauen beurteilt wurden. 11 der 27 Harnproben, die mit dem käuflich erhältlichen Testsystem durchgeführt wurden, zeigten negative Ergebnisse, d. h.
gemäss diesem Test sollten diese Harnproben von nichtschwangeren Frauen stammen. Es wurde dann von der die Proben liefernden Stelle bekannt gegeben, dass alle unbekannten Harnproben von schwangeren Frauen stammten, wobei die Proben im Zeitraum zwischen wenigen Wochen Schwangerschaft und 8 1/2 Monaten Schwangerschaft abgenommen wurden.
Der bekanntermassen von einer Schwangeren stammende Harn und bekanntermassen von einer Nichtschwangeren stammende Harn wurden nur mit dem Indikator des Beispiels 2 getestet und deshalb wurden diese Werte nicht in der Tabelle 3 aufgenommen. Die Ergebnisse bei diesen beiden Tests waren jedoch wie erwartet, d. h. negativ für den Harn der Nichtschwangeren und positiv für den Harn der Schwangeren, die sich in der 8. Woche der Schwangerschaft befand.
Beispiel 3
Das Mittel zur Herstellung des Indikators wurde hergestellt, indem man zuerst Zellen der Escherichia coli einer Pufferlösung zugab und dann eine BDB-Lösung unter Bildung des Mittels zusetzte. Zur Herstellung eines Indikators wurde dann eine CGTH-Lösung zugefügt, und die Kupplungsreaktion wurde dann ausgeführt.
Herstellung der Reagentien
Salz-Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7. Es wurden 150 ml einer sekundären Natriumphosphat Kochsalzlösung (Na2HPO4) mit Hilfe von 75 ml einer primären Natriumphosphat-Salzlösung (NaH2PO4) auf einen pH-Wert von 7,0 gebracht Die erste Lösung wurde hergestellt, indem man 150ml einer 0,5-molaren NayHPO4 7H2O-Lösung mit 350 ml destilliertem entionisiertem Wasser und 500ml einer 0,850/oigen Kochsalzlösung mischte. Die primäre Natiumphosphat-Kochsalzlösung wurde hergestellt, indem man 150 ml einer 0,5 molaren NaH2PO4 H2O-Lösung mit 350 ml destilliertem, entionisiertem Wasser und 500 ml einer 0,850/ oigen Salzlösung mischte.
Salzphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5.
Es wurden 180ml der oben beschriebenen sekundären Natriumphosphat-Kochsalzlösung mittels der oben beschriebenen primären Natriumphosphat-Kochsalzlösung auf einen pH-Wert von 7,5 gebracht.
BDB-Lösung: Es wurden 1 Vol.-Teil einer 0,025molaren Benzidinhydrochloridlösung (Benzidin . 2HCl) in 0,36 molarer HCI einem Volumen einer 0,1-molaren NaNO2-Lösung in destilliertem entionisiertem Wasser zugesetzt und man liess die erhaltene Mischung zwei Minuten lang reagieren. Dann wurde die Mischung auf einen pH-Wert von 7 gebracht, indem man gleiche Volumina der Mischung des oben beschriebenen Salz Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7 und 0,31 molare NaOH in destilliertem Wasser zugab. Sofort nachher wurden 6 ml und 2 ml Anteile der BDB-Lösung in Behälter gegeben, die verschlossen und versiegelt wurden und bei -83 C eingefroren wurden. Diese BDB-Lösungen wurden bei Verwendung bei +40 C aufgetaut.
Zellen der Escherichia coli: die Zellen der Escherichia coli wurden in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise mit Formaldehyd behandelt und dann zu einer 1,40/oigen Zellsuspension verdünnt und diese wurde in 50ml Zentrifugengläser pipettiert und mit 3100 Umdrehungen pro Minute 15 Minuten lang zentrifugiert.
Das darüberstehende Material wurde dann verworfen und die zusammengepackten Zellen wurden erneut suspendiert, indem man sie zuerst mit einem Vortex mischte, bis das Produkt glatt erschien und dann wurden 20 ml der Salzlösung des Beispiels 2 zugegeben.
Die Zellen wurden dann abzentrifugiert und das dar überstehende Material verworfen. Diese Saizwaschung wurde bei zwei weiteren Waschungen zweifach durchgeführt. Eine Menge von 0,2ml der erhaltenen zusammengepackten Zellen wurde in 2 ml der oben beschriebenen Salzlösung suspendiert. Diese Suspension wurde dann eine Stunde lang bei 40 C aufbewahrt. Nach dieser Zeit wurden 2ml einer 1:5 Verdünnung der obigen BDB-Lösung in der Phosphatlösung des Beispiels 2 zugegeben und die Mischung wurde in eine Rotationsschüttelapparatur bei 4 C gegeben und 30 Minuten lang im Dunkeln geschüttelt. Die Zellen wurden dann 5 Minuten lang bei 40 C abzentrifugiert und zweimal mit 4 ml einer kalten-Salz-Phosphatpufferlösung, deren pH-Wert 7m5 betrug, gewaschen, wobei sich eine relativ stabile Suspension bildete.
Daraufhin wurden 1,6ml des kalten Salz-Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7,5 und 0,8ml CGTH in 6 ml einer Salzlösung, die 4 mg Kochsalz pro ml enthielt, zu der Zellsuspension zugefügt. Der hierbei erhaltene Indikator wurde zur Testung vorbereitet, indem man die Mischung einmal mit 25ml BSA 1:50 in Salzlösung wusch und bei 300 Umdrehungen pro Minute 5 Minuten lang abzentrifugierte und das Material in einem Vortex-Mischer erneut suspendierte.
Eine 0,9 ml Lösung von BSA 1:50 in Kochsalzlösung wurde dann zugegeben, um den Indikator erneut zu suspendieren, worauf es dann in einem Kühlschranl gelagert wurde. Ein Anteil von 0,3ml dieses obigen Präparats wurde bei Zimmertemperatur 4 Stunden lang auf der Schüttelmaschine geschüttelt. Die Suspension wurde dann eine Stunde lang bei 37"C auf einer Schüttelmaschine behandelt. Die Suspension wurde zweimal mit der oben beschriebenen Salzlösung gewaschen und einmal mit BSA 1:50 in Salzlösung gewaschen. Die Zellen wurden dann erneut zu 0,3 ml in BSA 1:50 in Salzlösung suspendiert, wobei eine 100/oige Zellenkonzentration erhalten wurde.
Ein indirekter Agglutinationstest wurde dann durchgeführt, indem man einen Tropfen der Zellensuspension mit einem Tropfen jeder der Antikörperlösungen mit steigender Verdünnung vermischte. Die Verdünnungen waren 1:250, 1:5001 und 1:10001. Ein glattes Muster zeigte eine gute, indirekte Agglutination an und ein derartiges Muster zeigte sich bei beiden Verdünnungen 1:1000. Wenn auch dieses Muster nicht so stark war, wie die beiden anderen, wurde es als glatte Agglutination betrachtet. Dies zeigt, dass das erfindungsgemässe Mittel getrennt hergestellt und aufbewahrt werden kann und zur Kupplung von Antigenma terialien verwendet werden kann, die nachher zur Testung herangezogen werden können.
Beispiel 4
Ein Mittel zur Herstellung eines immunologischen Indikators wurde aus Hefezellen und BDB erhalten.
Bei Zugabe von menschlichem CGTH zu diesem Mittel konnte die Kupplung des menschlichen CGTH an Hefezellen mit Hilfe des chemischen Kupplungsmittels BDB erreicht werden. Der dabei erhaltene Indikator wurde in Kombination mit dem Antikörper für CGTH zur Ausführung eines Tests auf die Hemmung der Agglutination verwendet.
Ein Gramm der Hefe Saccharomyces cerevisiae wurde ausgewogen und dreimal mit 200ml der oben beschriebenen Salzlösung gewaschen. Die agewandte Hefe war diejenige, die unter dem Handelsnamen Fleischmanns aktive Trockenhefe vertrieben wird.
Die Hefezellen wurden dann wieder suspendiert, und zwar in 400 ml einer 10/o Formaldehyd enthaltenden Kochsalzlösung. Man liess die Suspension bei Zimmertemperatur 24 Stunden lang unter manchmaligem Umschütteln stehen. Die Zellen wurden dann mit 2000 Umdrehungen pro Minute, während einer Zeit von 10 Minuten abzentrifugiert und die zusammengepackten Zellen entfernt und in 200 ml der oben beschriebenen Salzlösung bei 40 C aufbewahrt. Bei der Messung im Hämatokrit zeigte die Suspension einen Wert von 1,40/0.
Zu 0,5 ml der zusammengepackten, mit Formaldehyd behandelten Hefezellen wurden 12ml des oben beschriebenen Phosphatpuffers und dann 6ml einer Kochsalzlösung zugegeben, und dann wurden die Zellen mit 40ml einer 1:5-Verdünnung der obigen BDB-Lösung zusammengebracht. Das so erhaltene Mittel wurde mit CGTH zu einem Indikator umgesetzt, dieser wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und drei.
mal mit der oben beschriebenen Salzlösung gewaschen, wobei nach der Waschung die zusammengepackten Zellen erneut in einer BSA-Salzlösung der Verdünnung 1:50 suspendiert wurden. Die erhaltenen Suspension zeigte im Hämatokrit einen Wert von 60/o.
Die 60/obige Zellsuspension wurde dann mit CGTH-Antikörper einer Verdünnung von 1:500 verwendet, um zwei Harnproben auf die Anwesenheit von CGTH zu prüfen. Ein Anteil von 0,2ml der 60/obigen Zellsuspension wurde einmal gewaschen und mit BSA 1:50 in Kochsalzlösung auf die übliche Konzentration verdünnt, um ein Endvolumen von 0,2 ml zu erreichen. Ein Tropfen eines Harns einer Frau, von der bekannt war, dass sie schwanger ist, wurde mit einem Tropfen der CGTH-Antikörperlösung gemischt und die Mischung wurde 2 Minuten lang stehen gelassen. Dann wurde ein Tropfen dieser Mischung auf eine Glasplatte gegeben. Ein Tropfen des Indikators wurde mit dem auf der Glasplatte befindlichen Material gemischt. Es bildete sich ein glattes Muster, das das Vorhandensein einer Schwangerschaft anzeigte.
Der Test wurde mit dem Harn einer Nichtschwangeren wiederholt und in kurzer Zeit bildete sich ein körniges agglutiniertes Muster.
Dieses Beispiel zeigt, dass Hefezellen als Indikatorpartikeln in einem Mittel bzw. einem daraus hergestellten Indikator verwendet werden können. Diese Zellen bringen den Vorteil mit sich, dass sie in trockener, stabiler Form käuflich erworben werde können.
Beispiel 5
Ein Mittel zur Erzeugung eines Indikators wurde hergestellt, indem man Escherichia coli als Mikrobenzellen verwendete und ein Carbodiimid als Kupplungsmittel anwandte. Bei der Herstellung eines Indikators aus diesem Mittel wurde CGTH als Antigensubstanz verwendet. Dieser Indikator wurde sowohl zur Prüfung der Agglutination als auch zur Prüfung der Hemmung der Agglutination verwendet.
Herstellung der Reagentien
Mikrobenzellen: die Zellen der Escherichia coli wurden wie in Beispiel 2 gezüchtet, aus dem Zuchtmedium isoliert und mit Formaldehyd behandelt. Ein Volumen von 20 ml einer 2,5obigen Suspension wurde auf diese Weise hergestellt. Diese Suspension wurde abzentrifugiert und 0,5 ml der zusammengepackten Zellen wurden zur Herstellung des Indikatorsystems verwendet.
Kupplungsmittel: es wurden 0,2g N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid in 0,5 ml Tetrahydrofuran gelöst und dann wurden 1,0ml destilliertes Wasser zu der Lösung zugegeben.
Antigensubstanz: es wurden 40 mg CGTH in 2ml destilliertem Wasser gelöst. Das verwendete CGTH hatte eine Aktivität von 2590 internationalen Einheiten pro mg und wurde bei der Vitamerican Corp., Little Falls, New York erworben.
Lösung des CGTH-Antikörpers: Anteile der Antikörperlösung und der 0,85 /0igen Kochsalzlösung, die nach Beispiel 2 hergestellt wurde, wurden verwendet, um Verdünnungen des CGTH/Antikörpers von 1:50, 1:100 und 1:200 herzustellen.
Dieses Beispiel zeigt, dass Carbodimid als Kupplungsmittel zum Binden der Antigensubstanz an die Mikrobenzellen verwendet werden kann.
Zur Herstellung weiterer Indikatoren wurden als Antigene menschliches Serumalbumin (human serum albumin = HSA) und Pferde y-globulin verwendet.
Beispiel 6
Die Indikatoren und die Agglutinationstests des Beispiels 5 wurden mit gleichen Resultaten wiederholt, indem man N-t-Butyl-5-methylisoxazolium perchlorat anstelle von Carbodiimid als Kupplungsmittel verwendete.
Dieses Kupplungsmittel wurde verwendet, indem man 10 ml einer 2,50/oigen Suspension der mit Formaldehyd behandelten Zellen des Beispiels 2 anwandte und 5 bis 10 Minuten lang zentrifugierte, um die dar überstehende Lösung zu entfernen. Die Zellen wurden dann viermal mit kaltem Wasser gewaschen und wieder suspendiert und zwar in 20ml einer 0,10/obigen Natriumbicarbonatlösung in destilliertem Wasser. Eine Menge von 3 mg Bernsteinsäureanhydrid wurde dann zugegeben und die Zellen wurden über Nacht bei 4" C geschüttelt. Die Zellen wurden zentrifugiert und noch dreimal mit Wasser gewaschen, worauf dann die succi nilierten Zellen in 5 ml destilliertem Wasser wieder suspendiert wurden. Eine Pipette wurde verwendet, um den Zellen 10 Mikroliter Triäthylamin zuzugeben.
Sodann wurden 17 mg N-t-Butyl-5-methylisoxazoliumperchlorat zugegeben. Dieses Kupplungsmittel ist unter dem Namen Woodward's Reagenz L bekannt.
Das so gebildete Mittel zur Herstellung eines immunologischen Indikators wurde verwendet, um die im Beispiel 5 beschriebenen Antigene in den dort angegebenen Mengen zu kuppeln. Menschliches Serumalbumin und Pferde-y-globulin wurden an die Zellen der Escherichia coli nach dem oben angeführten Verfahren gekuppelt, wobei eine Umsetzung mit 1:10 des Kaninchen-Antikörpers bezüglich menschlichen Serumalbumins und eine Umsetzung mit 1:10 des Kaninchenantikörpers gegen Pferde-y-globulin jeweils Agglutination lieferte. Keine Agglutination wurde hingegen hervorgerufen, wenn normales Kaninchenserum 1:10 verwendet wurde.
Beispiel 7
12 verschiedene Indikatoren wurden hergestellt, indem man gemäss Beispiel 2 die Formaldehydbehandlung der Mikrobenzellen durchführte und die Kupplung des Antigens an diese Mikrobenzellen mit Hilfe BDB durchführte. Es wurden die folgenden Mikrobenzellen verwendet: Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Lactobacillus leichmannii und Pseudomonas fragi und die Antigene, die in Kombination mit diesen Indikatorpartikeln angewandt wurden, waren menschliches Serum- albumin, Pferde-y-globulin und menschliches Insulin.
Agglutinationstests nach dem Plattentyp wurden durchgeführt.
Der Bacillus subtilis und der Bacillus pumilus wurden in der gleichen Weise gezüchtet, wie für die Zellen der Escherichia coli in Beispiel 2 beschrieben wurde.
Der Lactobacillus leichmannii wurde während der gleichen Zeit unter der gleichen Temperatur von 370 C auf einer Brühe gezüchtet, die wie fogt zusammengesetzt war: 890 ml Wasser, 100 mol Tomatensaftfiltrat,
10ml Bacto-Tween 80 , 7,5g Hefeextrakt, 7,5g Peptone, 10 g Dextrose und 2 g sekundäres Natriumphosphat. Die Brühe wies einen pH-Wert von 6,8 auf und war im Autoklaven 10 Minuten lang bei 1210 C unter einem Druck von 1 atü zur Sterilisierung behandelt worden.
Die Zellen der Pseudomonas fragi wurden 4 1/2 Stunden lang bei Zimmertemperatur (250 C) in einer vorher sterilisierten Brühe gezüchtet, die aus 1 Liter Wasser, 5 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 1 g Dextrose und 1g sekundärem Natriumphosphat bestand.
Die gewonnenen Zellen wurden mit Formalin behandelt und 0,25ml des zusammengepackten Zellenvolumens jeder der beschriebenen Zellen wurden für das in Beispiel 2 beschriebene Kupplungsverfahren verwendet. Es wurden hiezu drei Ansätze jeder dieser Zellen in 6ml des in Beispiel 2 beschriebenen Phosphatpuffers suspendiert und zu jeder Portion der suspendierten Zellen wurden die folgenden Antigene zugegeben, die in 5 mol einer 0,85 /oigen Kochsalzlösung gelöst waren. Als Antigene wurden verwendet: 3mg menschliches Serumalbumin, 40mg Pferde-y-globulin und 20 mg Insulin. Dann wurden 20ml einer 1:5 Verdünnung der BDB-Lösung des Beispiels 2 in Phosphatpuffer zugegeben, um ähnliche Kupplungsreaktionen durchzuführen.
Jeder der 12 genannten Indikatoren wurde mit den entsprechenden Antikörpern und mit gewöhnlichem Serum als Vergleichsversuch getestet. Die Indikatoren, die menschliches Serumalbumin bzw. Pferde-y-globulin enthielten, wurden mit einer 1:50 Verdünnung des im Kaninchen gebildeten Antikörpers für menschliches Serumalbumin bzw. des im Kaninchen gebildeten Antikörpers für Pferde-y-globulin in Salzlösung getestet.
Die Insulin-Indikatorsysteme wurden mit einem unverdünnten Insulin-Antikörper enthaltenden Meerschweinchenserum in Salzlösung getestet. Die Vergleichsversuche jedes der 12 Tests wurden durchgeführt, indem man eine 1:10 Verdünnung eines gewöhnlichen Kaninchenserums in Kochsalzlösung prüfte. Die jedem der Antigene entsprechenden Antikörper agglutinierten jede der vier Indikatoren, die mit den einzelnen Antigenen hergestellt wurden, und bei den Vergleichsversuchen wurde jeweils keine Agglutination gefunden.
Die Erfindung betrifft sämtliche Mittel zur Herstellung immunologischer Indikatoren, sofern es Mittel des Typs Mikrobenzellen-Kupplungsmittel sind. Diese Mittel können an Antigensubstanzen gebunden sein, wodurch ein immunologischer Indikator des Typs Mi krobenzellen-Kupplungsmfttel-Antigensubstanz erh- ten wird, der zur Durchführung sehr vieler Tests und zur Herstellung von Testvorrichtungen verwendet werden kann.
PATENTANSPRUCH 1
Mittel zur Herstellung eines immunologischen Indikators, das zur chemischen Bindung an Antigene geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, dass es aus Mikrobenzellen aufgebaut ist, an die über eine kovalente chemische Bindung eine Verbindung gebunden ist, die noch mindestens eine freie reaktive Gruppe aufweist, wobei diese reaktive Gruppe in der Lage ist, mit Antigenen zu reagieren, wenn das Mittel mit diesen zusammengebracht wird.
UNTERANSPRÜCHE
1. Mittel nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrobenzellen Bakterienzellen, Pilzzellen, Parasitenzellen, Protozoenzellen oder Virenzellen sind.
2. Mittel nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrobenzellen gleiche Form und Grösse aufweisen und in einer Richtung eine maximale Ausdehnung im Bereich von 0,2 bis 10 Mikron besitzen.
**WARNUNG** Ende DESC Feld konnte Anfang CLMS uberlappen**.