NO124336B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte ved fremstilling av en immunologisk indikator

for kjemisk binding til antigene stoffer.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangstnå-te ved fremstilling

-av en immunologisk indikator for kjemisk binding til antigene stoffer,

hvilken fremgangsmåte utmerker seg ved at mikrobeceller bringes i kon-

takt med mol-ekyler av e-t koblingsmiddel som har minst to ikke-bundne-,

re.aktive grupper, og den ane av de reaktive grupper bringes til å

danne en kovalent kjemisk binding med mikrobecellene mens den annenTeaktive gruppe bibeholdes i ikke-bundet tilstand, hvorved indikatoren

blir i stand til.å reagere med antig ene stoff er når -den bringes i kon-

takt' med slike..

Det er av stor viktighet a kunne påvise tilstedeværelsen av antigene stoffer i forskjellige væsker. Imange industrielle pro-

sesser anvendes idet proteinmaterialer med. antigene egenskaper enten som reaktanter eller som materialer som underkastes en eller annen

behandling. Muligheten for å påvise endringer i konsentrasjonen av disse materialer, slik at sådanne reaksjoner kan folges, er av storste betydning for reguleringen og reproduserbarheten av disse industrielle prosesser. Et annet viktig anvendelsesområde er på-visningen av forskjellige antigener og antistoffer i kroppsvæsker. Mengden av mange av hormonene, proteinene, lipoproteinene, mucopro-teinene, glycoproteinene, osv., og deres hydrolyseprodukter som forekommer naturlig i kroppen såvel som under diverse patologiske til-stander, er av stor betydning for utoverne av medisinen. Enkelte av disse substanser har vært vanskelig- å påvise ved hjelp av standard analytiske kjemiske metoder. Ved hjelp av immuno-kjemiske testmetoder kan imidlertid noen av disse antigener og antistoffer påvises i bland-inger inneholdende andre store, molekyler med. lignende kjemiske grupper men som ikke har noyaktig samme ste-reo-konfigurasjon som macromole-kylet av interesse. Flere av disse immunologiske metoder er vanske-lige å utfore, tar' lang tid'og er teknisk "-kompliserte, men de har . vært brukt i praksis for å påvise tilstedeværelsen av sådanne substanser i diverse kroppsvæsker. For ■ enkelteantigener og antistoffer har ingen metode,.vært; tilgjengelig.

Nylig er hemagglutineringssystemer blitt forbedret for påvisning av antigener eller deres antistoffer. Disse systemer g'jor bruk av rode blodlegemer som indikatorpartikler, hvilke for anvendelse bindes til et antigent materiale for dannelse av et indikator system som kan anvendes for påvisning av det homologe antistoff eller selve det antigene materiale. For bestemmelse av tilstedeværelsen eller fraværet av materialet som skal testes ved anvendelse av slike systemer, er det vanligvis nodvendig å fortolke utseendet av det monster som dannes av de rode blodlegemer for å bestemme hvorvidt hemagglutinering har funnet sted. Hemagglutinering finner sted når det homologe antistoff er tilstede i testmediet i en form som gjor det mulig for det å reagere med det antigene materiale som er koblet til de rode blodlegemer og å danne et immunt kompleks med disse. Hemagglutinering finner ikke sted når det homologe antistoff ikke kan danne et kompleks med rode blodlegemer tilkoblet det antigene materiale. Avhengig av mange betingelser innbefattende puffere og andre sterkt reaktive materialer har denne testmetode begrenset anvendelighet og krever faglært personell for å fortolke utseendet av de.resulterende monstere, ennskjont anvendelige testsystemer er blitt utarbeidet for enkelte stoffer. En annen brysom vanskelighet som er forbundet med hemagglutineringssystemet, er problemet med heterofile antistoffer, hvilket problem skyldes at noen av serumproteinene som inneholdes i antiserumopplosningen reagerer med de antigene grupper som forekommer naturlig på overflaten av de rode blodlegemer, selv når antiserumet er tatt fra en art som er -forskjellig fra den dyreart som har produ-sert de anvendte rode blodlegemer. Ovalbumin ble tidlig påvist i serum på denne måte; se Pressman, D. ,. Campbell, D.H. , Pauling, L.: Journal of Immunology Mf, sider 101 - 105 (19<*>+2). En tilsvarende metode ble anvendt for påvisning av tuberculinrenset proteinderivat (Cole, L.R. , Farrell, V,R.-: Journal of Experimental Medicine 102,

side 15.7 (1955))»og. insulin ble påvis-t i serum av.Arqullla, E.R.

og Stavitsky, A.B..; se Journal of Clinical Investigation 35, sider ^58 - M56 (1956). U..S. patentskrift nr. 3 236 732 beskriver et lignende system for testing med hensyn på hormonet chorionisk gonadotropin. Et patologisk antigent, stoff, diphtheria toxoid., ble også testet på denne måte, se Butler, W.T.: Journal of Immunology 90,

sider 663 - 671 (1963).

Det antaes hu -at den begrensede kommersielle bruk av denne

type hemagglutineringstesting delvis har vært forårsaket av det snevre stor-relsesområde og den særegne konfigurasjon av de rode dyreblodlegemer som vanligvis anvendes, og-at mer utbredt anvendelse av immunologiske agglutineringstestsystemer ville være mulig dersom det"kunne finnes indikatorpartikler som tillater en s-torre variasjon i stbrrelsen, til erstatning av de rode blodlegemer. Vanligvis ute-lukker anvendelsen av .rode dyreblodlegemer som indikatorpartikler for forskjellige antigener anvendelse av enten en kromatografisk'agglutineringsmekanisme eller en aggl-utineringsmekanisme. av platetypen. Dessuten er de rode blodlegemer -kostbare å anvende kommersielt, fordi det må holdes laboratoriedyr og fordi betingelsene ved oppsamlingen må avpasses omhyggelig for å unngå hemolyse av cellene og å Tremme ensartet kvalitet, da hemagglutineringste sten ellers ikke ville kunne utfores reproduserbart.

- Det har nu vist seg at mikrobeceller kan tjene .som immunologiske indikatorpartikler, hvorved mange av de tidligere erfarte van-skeligheter kan overvinnes.. Mikrobeceller eksisterer i et bredt utvalg av størrelser og former, og storrelsene ligger i de områder

som kreves ved agglutineringstester både i ror og på plater samt også i tester av kromatograferingstypen. En rekke testmekanismer kan således anvendesnår mikrobeceller benyttes som indikatorpartikler. Cellene kan lett. dyrkes under.labdratoriebetingelser og kan produseres kommersielt til lave omkostninger. Mikrobecellene kan velges.

etter .onsket storrelse, etter de overflateegenskaper som er mest for-delaktige for en gitt testmekanisme og etter den letthet med hvilken de kan produseres. Således muliggjores storre fleksibilitet ved opp-bygningen av immunologiske testsystemer ved anvendelse av mikrobeceller. Dessuten elimineres ved bruk av mikrobeceller problemet med heterofile antistoffer.

Den her anvendte betegnelse "indikatorpartikler" refererer til mikrobeceller som ikke er t i-l bund et noe koblingsmiddel, mens beteg-nelsen "immunologisk indikator" refererer til mikrobeceller hvortil det er bundet et koblingsmiddel men intet antigent materiale. Be-tegnelsen "immunologisk indikatorsystem" refererer til kombinasjonen av celler, koblingsmiddel og antigent materiale.

Det er derfor et mål med denne oppfinnelse å tilveiebringe en immunologisk indikator bestående av mikrobeceller og et til disse bundet kjemisk koblingsmiddel hvortil det er kovalent bundet antigene materialer, hvilken immunologisk indikator kan anvendes for visuell påvisning av antigen-antistoff-reaksjoner.

Det er videre et mål med denne oppfinnelse å tilveiebringe en immunologisk indikator for antigen-antistoff-reaksjoner, som består av mikrobeceller aven hvilken" som helst storrelse i et bredt stor-relsesområde.

Den immunologiske indikator som fremstilles ved fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen,<1>kan i store trekk beskrives som sammensatt av mikrobeceller til hvilke det er kjemisk bundet molekyler av et koblingsmiddel med minst en ikke-bundet reaktiv gruppe som er istand til å danne enkovalent binding med en reaktiv gruppe i antigene stoffer ved kontakt og reaksjon med disse. Indikatoren fremstilles ved at man suspenderer mikrobecellene i en væske og til denne til-setter koblingsmidlet. som er istand tii å reagere med en reaktiv gruppe på overflaten av mikrobecellene. Det antigene stoff som skal kobles til mikrobecellene, kan være tilstede i den samme væskesus-pensjon når koblingsmidlet tilsettes, slik at et spesifikt immunologisk indikatorsystem dannes straks, eller stoffet kan tilsettes senere til den fremstilte indikator. Koblingen av indikatoren til et antigent stoff forer til dannelse av et indikatorsystem som kan anvendes på en spesifikk måte som nedenfor beskrevet.

Mikrobecellene av den immunologiske indikator og det immunologiske testsystem kan være en hvilken som helst cellereproduserende mikroorganisme som forplanter seg med eller uten innvirkning av andre organismer. Både gram-positive og gram-negative bakterieceller kan anvendes, fungus-celler og protozodlogiske celler kan benyttes og likeledes virus-celler for enkelte testsystemer. Disse er vanligvis .encellede organismer som leilighetsvis forekommer i klumper eller aggregater. Cellene kan anvendes i denne form forutsatt at deres aggregatstorrelse ikke utgjor en bærerpartikkel som er så stor at systemet som herved dannes, ikke vil agglutinere i nærvær av et stoff som er homologt med det antigene stoff som er bundet til de aggregerte celler. Vanligvis er de foretrukne mikrobeceller bakterieceller eller aggregater herav som har ensartet form og storrelse og som har maksi-male ytre dimensjoner i en retning fra 0,2 til 10 )um. Ennskjont dette ikke foretrekkes, kan en blanding av forskjellige, men ensartede celler anvendes. For disse bakterier innbefatter de anvendelige mikrobeceller de i inndeling I av planteriket, innbefattet klasse I,

II og III, orden I. Mikrobeceller av klasse III, orden I innbefatter de intracellulare virusorganismer som har dimensjoner på omtrent 0,2 iim.

For en fullstendig oversikt over anvendelige bakterieceller re-fereres det til Bergey's Manual of Determinative Bacteriology av R.S. Breed, E.G.D. Murray,- NR. Smith, 7de utgave, 19^7, Williams and Wilkins Company. Spesielt nyttige er bakteriene av klasse II, underorden II, familie IV (Pseudomonadaceae) og klasse II, orden IV, familie IV (Enterobacteriaceae). Samtlige underfamilier I-V anses å representere foretrukne mikrobeceller for nærværende oppfinnelses formål..

Også klasse II, orden IV, familier V (Brucellaceae), X (Lactobacilla-ceae) og XIII (Bactillaceae) betraktes som foretrukne. Både orden I

og orden II av organismene i klasse III kan benyttes når der onskes anvendt partikler av storrelse omtrent 0,2fim eller mindre. Spesielt er Virales av orden II av så små dimensjoner at Jeres anvendelighet er begrenset.

Spesielt foretrukne bakterieceller er Brucella abortus, Escherichia .coli, Bacillus subtills, Bacillus pumilus, Lac-tobacillus leichmannii og Pseudomonas fragi. Gjærvekstfaser av fungus-celler■fore-trekkes også for anvendelse i oppfinnelsen. Særlig foretrukket er den lett tilgjengelige gjær Saccharomyces cerevisiae.

Mikrobecellene kan anvendes i deres naturlige tilstand, dvs. koblingsmidlet kan omsettes med disse, hvoretter det antigene stoff tilbindes gjennom koblingsmidlet. Dersom imidlertid de naturlige patogene egenskaper av noen av mikrobecellene ansees å representere et faremoment, kan den naturlige antigen!sitet og folgelig de patogene egenskaper elimineres ved at man behandler eller dreper mikrobe cellene med et konserveringsmiddel. De vanligste konserveringsmidler er formaldehyd og fenol. Det er å merke at når mikrobeceller har vært behandlet med konserveringsmiddel og deretter ytterligere modifi-seres ved at de tilbindes koblingsmidler og antigene stoffer, modifi-seres de naturlig forekommende antigene grupper på celleoverflatene i tilstrekkelig grad til at de gjores inaktive. For å oppnå en fullstendig eliminering av celler som måtte ha naturlig antigen aktivitet kan de tilberedte testsystemer absorberes med serum inneholdende antistoffet i antigenet som forekommer naturlig på celleoverflatene for å danne komplekser som ikke interfererer under den senere testing. Dersom f.eks. E.coli anvendes som indikatorpartikler i indikatoren og antistoffer til E.coli er tilstede i materialet som skal testes, kan reaksjonen mellom indikatoren og motstoffet blokkeres ved at E.coli-celleindikatoren adsorberes med antisera som inneholder antistoffet. Mikrobecellene som anvendes ved fremgangsmåten ifblge oppfinnelsen,

kan således ikke lenger betraktes å oppvise naturlig antigenisitet.

Om onskes, kan mikrobecellene merkes for å forbedre den visu-elle kontrast mellom det resulterende indikatorsystem og omgivelsene.

De vanlige farvestoffer såsom hematoxylin, fuchsin og krystallfiolett kan anvendes for dette formål. En annen eventuell behandling består '

i å vaske cellene med organiske opplbsningsmidler såsom alkoholer, ethere, etc. for å fjerne eventuelt tilstedeværende polysaccharid eller vokslag.

Koblingsmidlene som kan omsettes kjemisk med reaktive grupper både på mikrobecellene og på de antigene stoffer., er vanligvis forbindelser med to eller flere av de folgende reaktive grupper: azo, sulfonsyre, fluorgrupper kombinert med nitrogrupper,fazid, imin og reaktive klorgrupper bundet til. en ring med gunstige resonansstruk-turer. Disse reaktive grupper er istand til å. reagere med de primære aminogrupper, sulphydryl (mercapto)-grupper og hydroxylgrupper i de polymere kjeder av de antigene stoffer og på mikrobecellenes overflater.

En representativ liste over kjente koblingsmidler er: bis-diazobenzidin, bi s-diazobenzidin-disulfonsyre, tetraazo-p-fenylendiamin, difluordinitrobenzen, diverse carbodiimider, toluendiisocyanat, tri-klorcyanidin, diklor-S-trizin og N-t-butyl-5-methylisoxazolium-per-klorat. Enkelte av disse koblingsmidler, og spesielt cyanurerings-midlene, er istand til å konservere cellene samtidig som de kobles til grupper på mikrobecelleoverflåtene, slik at ingen separat for-behandling for konservering av cellene er nodvendig ved anvendelse av disse koblingsmidler. For anvendelse av den siste av de ovennevnte forbindelser behandles forst indikatorpartiklene med et

succinyleringsreagens såsom ravsyreanhydrid.

For fremstilling av den immunologiske indikator omsettes forst koblingsmidlet med mikrobecellene, som er oppslemmet i en væske, og deretter, når behovet er tilstede, blandes denne indikator med det antigene stoff for dannelse av et indikatorsystem. Dette vil si at indikatoren i seg selv betraktes som et handelsprodukt, idet det kan fremstilles og selges for anvendelse av forbrukeren ved oppbygning av testsystemer for et hvilket som helst gitt antigent stoff. •

Den foretrukne måte hvorpå mikrobecellene og det antigene

stoff bringes i kontakt med koblingsmidlet for dannelse av testsystemer består i å suspendere mikrobecellene og det antigene stoff i en væske og å tilsette koblingsmidlet til denne under kraftig omroring. En annen metode til å bringe komponentene i kontakt med hverandre består i å tilsette mikrobecellene og det antigene stoff samtidig til en opplosning inneholdende koblingsmidlet. Disse kon-taktmetoder begrenser krysskoblingen av mikrobeceller og krysskoblingen av molekylene av det antigene stoff.

Vanligvis kan et hvilket som helst antigent stoff kobles til den immunologiske indikator som fremstilles i henhold til oppfinnelsen. Et "antigent stoff", slik det her er brukt, betegner et materiale som, når det innfores i et dyrs.kretslop, produserer homologt antistoff. Ved denne brede definisjon innbefattes serumantigener såsom gamma-globulin og serum- albumin eller blodgruppestoffer "A" og "B" for prover for bestemmelse av blodtype. Mikrobiale antigener kan kobles til indikatoren for påvisning enten av mikroben selv eller dens antistoff i væsker. Antigene hormonsubstanser som er tilstede i organis-mers væskesystemer, kan også kobles til indikatoren. Også protein-hydrolyseprodukter og -enzymer kan anvendes som antigene stoffer.

De mikrobiale antigener eller antistoffer kan være av -bakteriell, fungisk, parasitologisk eller viral natur. Hovedkravet til de antigene stoffer er at de har minst en gruppe i deres polymere kjeder som kan reagere med den reaktive gruppe av minst ett av de kjente koblingsmidler. Alle kjente antigene stoffer antaes å tilfredsstille dette krav.

Det antigene stoff kan være et naturlig forekommende materiale eller det kan være et kunstig fremstilt materiale. Noen naturlig forekommende stoffer som kan kobles til den immunologiske indikator som fremstilles ved fremgangsmåten ifblge oppfinnelsen, er ovalbumin, tuberculin-renset protein-derivat, insulin, hormonet chorionisk gona dotropin (CGTH), såvel fra mennesker som fra dyr, menneskelig serum-albumin, og heste-gamma-globulin.

Det finnes tre generelle metoder for utfdrelse av tester med

de immunologiske indikatorsystemer. Disse er metoder som innbefatter kromatografiprinsippet, de som'innebærer agglutinering i et ror og de som innebærer agglutinering på en plate. Den spesielle metode som velges, bestemmer i.stor utstrekning storrelsen av mikrobecellene som anvendes..

For en test av kromatograferingstypen foretrekkes det å anvende mikrobeceller som har form av ellipseformede staver av lengde omtrent 0,3 _ 0,^-Mm« For plateagglutineringstester kan mikrobecellene være storre staver av lengder 1 - 3 jLtm og diametre på ca. 0,5 /im, forutsatt at cellene likeledes-kan ha coccoid form. Ved plateagglutineringstester kan der anvendes et bredt utvalg av storrelser av mikrobeceller, idet der kan brukes mikrobeceller med dimensjoner fra 0,2 til 10/zm i en hvilken som helst retning, såsom lengde eller diameter.

Plate- og roragglutineringstestene er basert på det immunologiske indikator systems evne til å agglutinere og derved danne et monster med merkbar forskjell fra det monster som frembringes når agglutinering ikke finner sted. Denne testtype kan utfores på. to generelle måter, hvorav den forste betegnes som agglutinering, mens den annen betegnes som inhibering av agglutinering. For agglutinering kobles et antigen til mikrobecellen for dannelse av et indikatorsystem, og dette anvendes så for å undersoke om det homologe antistoff er tilstede i proven som undersøkes. Dersom proven inneholder antistoffet, vil indikatorsystemet agglutinere med antistoffet, og den tilstand som derved oppstår, kan gjenkjennes ved hjelp av det monster som oppvises av indikatorsystemet. For inhibering av agglutinering kobles antigenet til mikrobecellen for dannelse av et immunologisk indikatorsystem som deretter benyttes med det homologe antistoff for å undersoke om antigenet er tilstede i proven som undersokes. Dersom proven inneholder antigenet, vil det homologe antistoff inhiberes eller nøy-traliseres av antigenet, og indikatorsystemet vil ikke agglutineres. Når agglutinering ikke finner sted, vil indikatorsystemet bestående

av uoppløselige mikrobeceller og det tilbundede antigen, skilles ut fra testvæsken og gi et monster med merkbar forskjell fra det monster som frembringes av det agglutinerte indikatorsystem.

Ved platetesten vises agglutineringen ved dannelse av et

kornet monster, mens agglutineringen ved rørtesten vises ved en jevn,

ensartet suspensjon av celler. Tilstanden hvor agglutinering ikke har funnet sted, vises ved platetesten ved dannelse av-et jevnt monster,, og i det tilfelle hvor der benyttes en rortest, vises denne tilstand ved sedimentering av indikatorsystemet på bunnen av roret enten i et ringmonster eller i et flekkmonster.

Denne samme type agglutinering eller inhibering av agglutinering ligger til grunn for testmetoden av kromatograferingstypen, hvor der vil finne sted en karakteristisk vandring av' kromatograferings-opplosningen dersom proven som undersokes, inneholder det gitte antigen eller antistoff. Ved en agglutineringstest av kromatograferingstypen avsettes en flekk av indikatorsystemet på en egnet kromatograf-eringsbærer, såsom filtrerpapir,.hvoretter en dråpe av væskeproven som skal testes på tilstedeværelse av antistoffet, anbringes på denne samme flekk og kanten av bæreren bringes i kontakt med en kromato-graf eringsopplosning såsom en saltopplosning. Dersom væskeproven inneholder antistoffet,- vil indikatorsystemet agglutinere og danne et immunt aggregat med antistoffet. Dette aggregat vil ikke fores med av den fremrykkende kromatograferingsopplbsning, og liten for-andring av flekken vil finne sted. Dersom imidlertid væskeproven ikke inneholder antistoffet, vil der ikke dannes noe Immunt aggregat, og indikatorsystemet vil i så tilfelle vandre sammen -med den fremrykkende opplosninghvorved der dannes et.strekformet monster. For å utfore en test av kromatograferingstypen med inhibert agglutinering dannes en flekk av immunt aggregat ved at en dråpe av en antistoff-holdig opplosning anbringes på en flekk av avsatt immunologisk indikatorsystem. En dråpe av væskeproven som skal testes på tilstedeværelse av antigenet, -anbringes deretter på flekken av immunt aggregat, og en opplosning tillates å rykke frem opp gjennom bæreren, eller alternativt kan kanten av bæreren bringes i direkte kontakt

med væskeproven, slik at antigenet, dersom dette er tilstede, kan komme i kontakt med flekken av immunt aggregat. "Dersom væskeproven inneholder antigenet, vil det immune aggregat disossieres som folge av den preferensielle reaksjon mellom antistoffet og antigenet, og indikatorsystemet vil forflytte seg og frembringe et strekformet monster. Dersom intet'antigen er tilstede i væskeproven, vil selv-følgelig ingen vandring av flekken av immunt aggr-egat finne sted.

De nedenstående eksempler vil ytterligere illustrere oppfinnelsen.

Eksempel 1

Et immunologisk indikator system ble fremstilt under anvendelse av Brucella abortus celler som mikrobeceller, bis-diazobenzidin (BDB) som koblingsmiddel og menneskelig chbrionisk gonadotropin (CGTH) som antigen. Dette indikatorsystem ble deretter avsatt på et fuktighetsabsorberende bærermateriale sammen med antistoffet til CGTH, og urin-prøver ble deretter testet på tilstedeværelse av CGTH med den erholdte anordning. Denne indikatoranordning funksjonerte ved en kromatograf-eringsmekanisme som vil bli beskrevet lenger ned.

FREMSTILLING. AV REAGENSER

Isotonisk saltopplbsning

En 0,85 vekt$ saltopplbsning ble fremstilt ved opplosning av 8,5 g natfiumklorid il liter destillert vann.

Fo- sf atpuff er

En 0,15 M pufferopplosning av pH 7 A ble fremstilt ved opplosning av en torr blanding av 8l$-ig surt dinatriumfdsfat og 19% surt mononatriumf osf at i ..destillert vann inntil den..bnskede pH-verdi var nådd.

bi s- diazobenzidinopplbsning

Til 0,92 g benzidin ble det tilsatt 100 ml destillert vann og

6 ml 6N saltsyre. Denne blanding ble tilsatt ytterligere 100 ml destillert'vann. Etter at benzidinet var opplost ble oppløsningen kjolt til 0°C i en blanding av is og salt. - Såsnart iskrystaller begynte å dannes i oppløsningen ble. 6,5 ml av en 10%- ±g opplosning av. natriumnitrit tilsatt hurtig under omrbring. Omrbringen ble fortsatt inntil opplbsningen var negativ ved prbvning med stivelse-jod-papir. Under omrbringen må opplbsningen aldri tillates å nå en temperatur over ca. 1°C.

Det erholdte materiale var lysegult. Ved. tilsetning av fosfatpuffer. gikk farven over til rbdlig brunt. Den blekt gule opplosning var stabil ved romtemperatur i 5.-7 timer. Ved k°C var den stabil i ca. 7 dager. Ved frysning og lagring ved -20°C var den stabil i ca. 60 dager, og ved lagring ved temperatur lavere enn -35° C var den stabil i' minst 6 måneder.

Formalinbehandling av mikrobeceller

Brucella abortus celler ble dyrket i 72 timer ved 37°C på tryptoseagar og ble deretter vasket ut av agaren med en 0,85#-ig saltopplbsning inneholdende 1% formaldehyd. Cellene ble straks behandlet med formaldehyd ved at de ble suspendert i en salt-formaldehyd-opplbsning i 2<*>+ .timer ved romtemperatur (25°C). Cellene ble deretter grundig vasket for å fjerne det gjenværende konserveringsmiddel. Vaskningen av Brucella abortus cellene ble utfort ved å suspendere cellene i destillert vann. Cellene ble oppsamlet ved sentrifugering og påny suspendert i destillert vann, idet det sist-nevnte trinn ble gjentatt flere ganger. De konserveringsmiddelbehandlede celler ble deretter merket.

Merking av formalin. behand. lede mikrobeceller

2 g av de våt-pakkede, formalinbehandlede Brucella abortus celler, 1 ml 2%- lg ferrosulfat og 5 ml 1%- ig vandig hematoxylin ble tilsatt til 100 ml destillert vann og omrbrt kontinuerlig i 2<*>+ timer. Cellene var permanent merket, -og farvestoffet ble ikke utlutet.

Fremstilling av indikator system - (formalinbehandlede microbeceller -

BDB - CGTH) Brucella abortus celler, som var merket med hematoxylin som ovenfor beskrevet, ble anvendt som indikatorpartikler for CGTH fra mennesker levert av Vitamerican Corp. , -Little Falls,

New Jersey. 0,5 g sammenpakkede, merkede celler ble tilsatt til

10 ml saltopplbsning inneholdende 20 mg CGTH, hvoretter 12 ml fosfatpuffer og ^-0 ml fortynnet BDB-opplbshing -fremstilt ved blanding av 8 ml av =den ovennevnte -BDB-opplbsning med 32 ml fos f atpuff er ble tilsatt. Koblingsreaksjonen skred frem under omrbring i 20 minutter ved romtemperatur"(25°C). Det erholdte brune kompleks ble deretter oppsamlet ved sentrifugering og vasket tre ganger ved sentrifugering med destillert vann. Da -det var bnsket å overfore'dette indikatorsystem på et fuktighetsabsorberende bærerelement, ble en 0,2 g's porsjon av indikatorsystemet homogenisert i en morter. Porsjonen ble deretter grundig blandet med 1 dråpe 1% merthiolate og 1 g sucrosesiryp ( 75% m/v) ble deretter langsomt tilsatt.

Fremstilling av antistoff til CGTH

Laboratoriekaniner "ble gitt menneskelig CGTH i Freund<1>s fullstendige hjelpevæske i en rekke injek-sjoner. Etter et gitt tidsrom ble kaninene årelatet, og serumet inneholdende antistoffet ble separert fra blodet. Det anvendte CGTH kan skaffes fra en hvilken som helst av de kommersielle leverandører. Spesielt anvendelig er det som selges av Vitamerican Corp., som har en aktivitet av omtrent 2000 - 2500 internasjonale enheter (I.U. ). Et typisk injek.sjonsskjema og en typisk separasjon av antistoffet er som folger: en opplosning inneholdende 10 mg CGTH pr. ml saltopplbsning ble blandet i like mengder med Freund's fullstendige hjelpevæske. 0,1 ml av blandingen ble injisert på hver labb av en hare som veiet 3?5kg. Etter en periode av 2 uker ble en fbrste "booster" på 0,5 ml av en opplosning inneholdende 5 mg CGTH pr. ml saltopplosning injisert intravenbst. 2 dager etter denne fbrste "booster"-injeksjon ble en ny injeksjon gitt. Blodprbver fra kaninen ble tatt 7 dager etter den siste "booster"-injeksjon. Antiserumene hadde en titer på 1/2560, bestemt ved hemagglutinering.

Testmetoder ( kromatografisk)

En flekk av det som ovenfor beskrevet fremstilte indikatorsystem ble anbragt ca. 19 mm fra kanten av et stykke filtrerpapir,

og en dråpe av de ovennevnte antisera ble anbragt på denne for dannelse av et immunt aggregat. Kanten av papiret, ble deretter bragt i kontakt med en normal, ikke-besvangret urinprove. Mens. urinproven forflyttet seg oppover papiret, forble flekken av immunt aggregat i samme stilling på papiret. Dette viste at det dannede immune aggregat ikke.ble dissosiert av de normale urinbestanddeler. En annen filtrerpapir strimmel ble tilberedt med en annen flekk av immunt aggregat,

og kanten av papiret ble bragt i kontakt med en urinprove fra en besvangret kvinne. Etterhvert som urinen forflyttet seg oppover papirstrimmelen dissosierte endel av det immune aggregat og forårsaket en strekdannelse eller vandring av det farvede indikatorsystem oppover fra aggregatflekken som ble tilsvarende lysere i farve.

Ved en annen test ble flekkene av immunt aggregat dannet på flere papirstrimler og urinprbvene deretter dryppet ned på disse flekker. Kantene av strimlene ble bragt i kontakt med en fysiologisk saltopplbsning. Da saltopplbsningen hadde rykket forbi flekkene behandlet med urin fra en besvangret kvinne, satte noe av det farvede indikator system seg i bevegelse og forårsaket et strekformet monster. Relativt lite strekdannelse ble funnet når saltopplbsningen rykket forbi flekkene behandlet med normal urin fra ikke-besvangrede kvinner.

Det ble tilberedt testanordninger for testing på tilstedeværelse av antistoffet til menneskelig CGTH ved at flekker av det ovenfor beskrevne indikator system ble anbragt ca. 19 mm fra kanten av filtrerpapir stykker. En dråpe kaninserum inneholdende antistoffet ble deretter anbragt på en flekk indikatorsystem på en av strimlene, og kanten av denne ble bragt i kontakt med en fysiologisk saltopplbsning. Saltopplbsningen rykket forbi flekken uten at noen strekdannelse oppsto som folge av indikatorsystemet, hvilket viste at et uopplbselig, immunt aggregat var blitt dannet. En dråpe normalt kaninserum ble deretter testet på tilsvarende måte. Indikatorsystemet viste seg da å forflytte seg vekk fra flekken, hvilket viste at intet immunt aggregat var blitt dannet.

Det ovennevnte indikatorsystem viste også agglutinering som folge av antistoff til menneskelig CGTH ved tester utfort ved rbr-typeagglutineringer. Disse agglutineringer ble lett inhibert ved tilsetning til testmediet av små mengder av en opplosning inneholdende

CGTH.

Ved fremstilling av det diagnostiske preparat på et fuktighetsabsorberende bærermateriale under anvendelse av en indikator bestående av mikrobeceller er det vesentlig at cellematerialet sta-biliseres ved en konserveringsbehandling som ovenfor beskrevet.

En annen indikatorinnretning kan fremstilles ved at man blander det ovenfor omtalte indikatorsystem med antistoffet for dannelse av et immunt aggregat, avsetter en enkelt flekk på et område i en gitt avstand fra strimmelens kant og torrer. Når indikatoranordningen skal anvendes, anbringes en dråpe urinprove på denne flekk eller mellom flekken og strimmelkanten, og enden av strimmelen anbringes i en saltopplbsning. Dersom urinen inneholder CGTH, vil aggregatet dissosieres, hvorved fremrykning av det merkede indikatorsystem sammen med saltopplbsningen muliggjbres og det dannes et strekformet monster. Dersom intet CGTH er tilstede, vil der ikke bli noen endring.

Alternativt kan urinprbven anvendes som kromatograferingsopp-Ibsning som ovenfor. I en foretrukken utfbrelsesform fremstilles en slik anordning ved at det diagnostiske reagens fremstilles i .strimmel-form, idet man f.^eks. anbringer et bånd av aggregatet av indikatorsystem og antistoff omtrent 15 mm fra lengdekanten av et 13 cm x 26 cm stykker Eaton-Dikeman nr.. 609 filtrerpapir, tillater reagenset å torre ved romtemperatur, kutter opp papiret i strimler og lagrer disse i egnede beholdere inntil de skal anvendes.

Det vil forståes at mange forskjellige materialer kan anvendes ved .testen med fuktighetsabsorberende strimmel. Eksempelvis kan mange typer kromatograferingsmaterialer anvendes og likeledes mange typer kromatograferingsvæsker for eluering.

Eksempel 2

Escherichia coli ble benyttet som indikatorpartikler for fremstilling av et immunologisk indikatorsystem av mikrobeceller-BDB-CGTH. Dette indikatorsystem ble anvendt sammen med antistoffet for CGTH i en agglutineringstest av platetypen, og kliniske svanger-skapsbestemmelser ble utfort ved hjelp av denne test.

Fremstilling av reagenser

0. 85$- ig saltopplosning - 68 g natriumklorid ble opplost i 8 liter destillert vann, og opplbsningen ble oppvarmet i en autoklav ved et overtrykk på 1,05 kg/cm^ og ved en temperatur av 250°C i 30 minutter. Opplbsningen ble deretter kjblt og oppbevart ved<1>+°C. Auto-klavbehandlingen ble utfort for å sterilisere saltopplbsningen.

l#- ig formaldehvdopplbsning - En 37^-ig formalinopplbsning

ble behandlet ved at den ble tilsatt pulverisert kalsiumcarbonat og deretter ble tillatt, å stå i et tidsrom fra 2h til h8 timer. Det overflytende skikt ble deretter heldt over i en annen beholder og filtrert tre ganger gjennom hvitt kvalitetsfiltrerpapir med krepp-overflate. Når pH-vérdien minsket til under ca. 7,0, ble den innstilt på denne pH-verdi med 0,1^-ig NaOH-opplbsning. En tilstrekkelig mengde av denne behandlede 37$-ige formalinopplbsning ble tilsatt til destillert vann for dannelse av en 1^-ig opplosning.

Fosfatpufferopplosning

100 ml av en fosfatpuffer med pH 7A ble fremstilt ved ut-bland ing av 80,8 ml av en natriumfosfatopplbsning med 19,2 ml av en kaliumfosfatopplbsning ved 20°C. Natriumfosfatopplbsningen inneholdt 53,726 g Na2HP0lf.12H20 pr. liter destillert vann. Kaliumf osf atopp-lbsningen inneholdt 20AlL|" g KH2P0^pr. liter destillert vann.

bis- diazobenzidin ( BDB)

0,6^0 g benzidin • 2 HC1 ble opplost 100 ml av en 0,56$2-ig HCl-opplbsning i en 250 ml's Pyrex Erlenmeyerkolbe. Denne kolbe ble anbragt i et med is fylt kar utstyrt for magnetisk omrbring og med en magnetisk rbrer neddykket i opplbsningen. Da temperaturen hadde nådd

*+°C, ble en 5 ml's alikvotopplbsning av en natriumnitritopplbsning som var fremstilt ved tilsetning av 0,680 g NaN02til 10 ml destillert vann, og som holdt 1+°C, tatt opp i en serologisk pipette og tilsatt dråpevis med jevn hastighet til benzidinopplbsningen i lbpet av et tidsrom fra 7 til 10 minutter, mens den magnetiske rorer arbeidet med en hastighet av 200 omdreininger pr. minutt (1 dråpe hvert fjerde

til sjette sekund). Denne opplosning ble omrort kontinuerlig i 20 minutter, hvoretter den straks ble fryst og holdt ved -60°C i et antall skåler av kapasitet en dram. Denne opplosning har tendens til å spaltes selv ved temperaturer fra 0° til 5°C, og det var derfor nodvendig å fryse oppløsningen for å opprettholde stabiliteten. Den kan oppvarmes til brukstemperatur når dette trenges.

Antistoff til CGTH

En emulsjon inneholdende 10 mg CGTH pr. ml ble tilberedt ved opplosning av 100 mg renset CGTH i 5 ml av den ovennevnte saltopplosning, tilsetning av 5 ml av en grundig blandet Freund's komplette hjelpevæske og rystning for dannelse av en jevn emulsjon. En mengde av 0,2 ml av emulsjonen ble injisert på hver labb av en-sunn og frisk kanin som ble holdt i standard laboratorieomgivelser, i en total mengde av 0,8 ml emulsjon (8 mg CGTH).

Kaninen ble deretter gitt en rekke injeksjoner, hver bestående

av 0,5 ml av en opplosning tilberedt ved opplosning av en tilstrekkelig stor mengde renset CGTH i 0,85%-ig saltopplosning til å oppnå en konsentrasjon av 5 mg pr. ml. Injeksjonene ble gitt i brevenene. Disse påfolgende injeksjoner ble gitt de folgende dager etter den fbrste emulsjoninjeksjon: Den 22, 2M-, 38, k0, 71 og'73. To k0 - 50 ml1 s blodprbver ble tatt av kaninen ved hjertepunktur den 50. og 83. dag. Disse provers blodceller ble deretter separert fra serumet i hver

prove ved at blodet ble tillatt å klumpe seg i et sentrifugerdr ved omtrent 25°C i ca. 2 timer, hvoretter det overflytende serum ble anbragt i et ror av liten diameter ( mindre enn 30 mm) og roret ble neddykket i et vannbad av 56°C i 30 minutter. 10 mg formalinbehandlede rode saueblodceller (lyofiliserte) ble deretter tilsatt pr. ml av serumproven og blandet i 15 minutter ved ca. 25°C for å adsorbere heterofile antistoffer fra serumet. Det adsorberte serum ble deretter separert ved sentrifugering fra cellene ved en sentrifugalkraft på ca. 1000 ganger tyngdekraften.

h0 ml sammenpakkede saueceller ble tilberedt for denne ad-sorpsjon ved sentrifugering og sifonering av det overflytende skikt fra 200 ml friskt, rodt saueblod dispergert i Alserver's opplosning og deretter vasket tre ganger med 0,85%-ig saltopplosning under anvendelse av fra 120 til 200 ml saltopplosning pr. vaskning. Til disse celler ble det tilsatt<*>+60 ml av den ovennevnte saltopplosning og 500 ml av en 3%- ig formalinopplbsning av pH 7,3. Den erholdte suspensjon ble blandet og ble tillatt å stå i 18 - 20 timer ved 37 C.

Cellene ble deretter fjernet ved sentrifugering og vasket fem ganger med ca. 200 ml destillert vann pr. vaskning. Det ble tilsatt tilstrekkelig meget destillert vann til at det ble oppnådd en 10^-ig suspensjon av cellene. Denne- suspensjon ble lagret ved h°C inntil den skulle brukes for ad sorpsjonen.

Mikrobeceller

E. coli celler ble oppnådd ved dykning av et tarmstykke fra

en dod laboratoriekanin i hjerne-hjerte-infusjonsskum (brain - heart infusion (BHI brotn). 68 ml av en kultur i full vekst (18 timer)

ble anvendt til å pode 3 liter BHI som på forhånd'var blitt sjekket med hensyn til sterilitet. Cellene ble deretter inkubert i ^,5 timer ved 37°C under rystning. De erholdte celler viste seg å være av ensartet storrelse og form.

FREMSTILLING AV ET INDIKATORSYSTEM

De tre liter suspenderte E.coli celler ble sentrifugert ved 10.000 omdreininger pr. minutt i 10 minutter for å separere overskud-det, av væsker fra de sammenpakkede celler. Supernatanten ble sifonert fra, og de g~je nværende sammenpakkede celler ble bragt i kontakt med omtrent<>>+5 ml av en 37#-ig kalsiumcarbønat-behandlet formaldehydopp-losning for å drepe E.coli cellene. Formalinen ble tillatt å forbli i kontakt med cellene i en time, hvoretter cellene ble vasket tre ganger med den ovennevnte saltopplosning og deretter suspendert i 1600 ml 1%- ig formaldehydoppldsning i hl timer ved romtemperatur (25°C). Disse celler ble deretter sentrifugert og oppsamlet som sammenpakkede konserveringsmiddelbehandlede cellr. Disse sammenpakkede celler ble deretter påny suspendert i 5°0 ml av den ovennevnte saltopplosning og lagret ved h°C. Cellekonsentrasjonen var h% målt ved hjelp av en hematocrit.

En porsjon av den ovennevnte suspensjon av celler ble sentrifugert for å utvinne et volum sammenpakkede celler, og 0,5 ml av disse ble fjernet og tilsatt til 10 ml av den ovennevnte saltopplosning, til hvilket det var tilsatt 20 mg CGTH, 12 ml av fosfatpufferen og h0 ml fortynnet BDB-opplosning fremstilt ved blanding av 8 ml BDB og 32 ml av fosfatpufferen. Den anvendte CGTH hadde en aktivitet på 3600 I.U. pr. mg og var levert av Vitamerican Corp. Blandingen ble kontinuerlig omrort i 20 minutter ved romtemperatur, og deretter ble det erholdte indikatorsystem oppsamlet ved sentrifugering og vasket tre ganger med den ovennevnte saltopplosning og deretter sentrifugert og påny suspendert i en 1:50 fortynning av bovine serum albumin ( 30%) i den ovennevnte saltopplosning. Kveg-serum-albuminet, BSA-, var levert av Armour and Co.

Den erholdte suspensjon av indikatorsystemet hadde en brunlig farve og viste seg å være stabil over et bredt temperaturområde.

FORBEREDENDE TESTING MED INDIKATORSYSTEMET

For å bestemme de minste påviselige mengder CGTH ble normale urinprover tilberedt ved at de ble tilsatt kjente mengder CGTH. Det tilberedte indikatorsystem ble deretter benyttet sammen med det ovennevnte antistoff til CGTH (Ab-CGTH) i agglutineringstester av platetypen.

For denne testing ble det ovennevnte indikatorsystem påny suspendert i en tilstrekkelig mengde 1:50 BSA-saltopplosning, hvorved man fikk en &%- ig konsentrasjon av cellene. Deretter ble det tilberedt tre fortynninger av den ovennevnte anti stoffopplosning ved fortynning av en del av antistoff oppløsningen med henholdsvis 250 deler,. 500 deler og 1000 deler av den ovennevnte saltopplosning. Disse fortynninger ble merket henholdsvis 1:250, 1:500 og 1:1000. Urinprover med hver av de fdlgende konsentrasjoner av CGTH ble tilberedt ved tilsetning av 0,25 ml av en opplosning av h mg CGTH/ml saltopplosning (3600 I.U./mg) til 100 ml av en normal urinprove fra en ikke-besvangret kvinne med påfolgende fortynning med saltopplbsning: 2,25;<1>+; 5; 6;

9; 18 og 36 I.U. CGTH/ml urin og saltopplbsning. En porsjon av urin-prøven ble satt til side som blindprbve.

1 dråpe av hver av urinprøvene ble blandet med 1 dråpe av den passende antistoff-fortynning og blandet på en glassplate. Deretter ble 1 dråpe av den ovennevnte 8%- ige indikatorsystemsuspensjon tilsatt cellene allerede pa platen og blandet. Resultatene av denne forsbksrekke er oppfort i den nedenstående tabell I hvor - betegner agglutinering og derfor et kornet monster i suspensjonen på glassplaten og betegner et glatt, ikke-agglutinert monster på glassplaten.

Tabell I viser at når intet CGTH er tilstede i urinen, finner der sted agglutinering som folge av at urinprdven ikke inneholder CGTH som' kan reagere preferensielt med'Ab-CGTH, hvorved antistoffet agglutinerer .med indikatorsystemet og frembringer et kornet utseende av sammenklumpede celler over den fuktede del av glassplaten. Ved tilsetning av 2,25 I.U. CGTH pr. ml til urinprdven er der fortsatt tilstrekkelig meget Ab-CGTH tilstede i systemet til at det reagerer med alt tilstedeværende CGTH og forårsaker såmmenklumpning av cellene eller agglutinering selv ved fortynningen 1:1000. Da urinprdven inneholdende ^,5 I.U./ml ble testet med de tre fortynninger av Ab-CGTH, reagerte antistoffet fullstendig med det tilstedeværende CGTH mellom fortynningene 1:500 og 1:1000, slik at monsteret for fortynningen 1:1000 ikke oppviste et kornet utseende men forelå som et glatt monster av suspenderte indikatorsystemceller, hvilket viste at ingen agglutinering hadde funnet sted. Det vil sees at ved anvendelse av 6,0 I.U. CGTH/ml finner man den nodvendige mengde antistoff mellom fortynningene 1:250 og 1:500, hvilket man kunne vente, fordi en stdrre mengde CGTH er tilstede og det derfor er nodvendig med en stdrre mengde Ab-CGTH for å reagere fullstendig med CGTH for å- frembringe et kornet monster ved fortynningen 1:250. Det vil sees av tabell I at meget små mengder av storrelsesordenen ^,5 I.U. CGTH/ml urin kan påvises ved anvendelse av lave konsentrasjoner av Ab-CGTH i testsystemet, nemlig fortynninger på 1:1000 eller mindre. Det har også vist seg at man ved å doble den anvendte urinmengde til 2 dråper kan påvise så pass lave konsentrasjoner som 2 I.U. CGTH/ml urin.

For å teste noyaktig den tid utviklingen av de kornede monstere tar over et område av konsentrasjoner av Ab-CGTH og celler ble de folgende undersøkelser utfort.

Porsjoner av indikatorsystem ble oppslemmet i tilstrekkelig

meget av den ovennevnte 1:50 BSA-fortynning i saltopplosning til at det ble oppnådd konsentrasjoner på 0,625$, 1,25$, 2,5$ og 5$ celler. Deretter ble det tilberedt en rekke' fortynninger av Ab-CGTH-oppldsning med den ovennevnte 1:50 fortynning av BSA i saltopplosning, for å tilveiebringe fortynninger på 1:125, 1:250, 1:500, 1:1000, 1:2000, 1:^000, 1:8000 og 1:16000. Fire dråper av hver av Ab-CGTH-fortynningene ble dryppet i separate, parallelle rader på overflaten av en tverrskravert glassplate. Til den forste dråpe av hver av disse fortynninger ble det tilsatt 1'dråpe av den laveste konsentrasjon av indikator system-cellesuspensjonene. Til den annen dråpe av hver av Ab-CGTH-fortynningene ble det tilsatt 1 dråpe av den l,25$_ige suspensjon, og til den tredje og fjerde dråpe av hver av fortynningene ble det tilsatt henholdsvis 2,5$ og 5$ cellesuspensjoner. Resultatene er oppfort i den nedenstående tabell II, hvor tiden for utvikling av et kornet agglutineringsmonster er gitt i sekunder for hver av test-blandingene. En "S" viser at der var tilstede utilstrekkelig meget Ab-CGTH i antistoff-fortynningen til å forårsake agglutinering av cellene, og monsteret forble derfor glatt.

De i tabell II oppforte agglutineringstider viser at relativt kort tid er nddvendig for å påvise forekomst av agglutinering,'hvilket, ' ved en virkelig, test, gir et negativt svar på spdrsmålet om' svangerskap. Således kan et eventuelt svangerskap påvises ved hjelp av en plate agglutinerlngstest under anvendelse av det ovennevnte indikatorsystem i ldpet av omtrent 1 minutt eller mindre. Dette er en langt kortere tid enn den som kreves for agglutineringssystemer av rortypen basert på rode, blodceller. Dessuten er de monstere som skiller agglutinering fra ikke-agglutinering, meget markerte, og disse tester gir praktisk talt ingen intermediære, tvilsomme monstere. Det er således mulig å velge reagensene slik at klart definerte monstere som kreves for diagnose av svangerskap, kan oppnåes.

Tabell II viser også at et bredt område av Ab-CGTH-fortynninger kan anvendes og likeledes et bredt område av indikatorkonsentrasjoner. Konsentrasjonen av indikatorsystemet i en 1:50 fortynning av BSA i saltopplosning kan være fra mindre enn 1% til ca. 12% i anvendbare testsystemer.

For å teste indikatorsystemet ifolge eksempel 2 med aktuelle urinprover ble 16 urinprover oppnådd fra 16 ubesvangrede kvinner, av hvilke<1>)- brukte befruktningshindrende piller etter et regelmessig program. Testmetoden var den samme, som ovenfoT angitt. En dråpe av urinprdven ble således blandet med en dråpe av en 1:1000 Ab-CGTH-fortynning, hvoretter en drå0 pe av.denne blanding ble anbragt på en<0>glassplate og en dråpe av en h%- lg suspensjon av det- ovennevnte indikatorsystem ble tilsatt til blandingen som allerede var -tilstede på glassplaten. I samtlige 16 tilfeller ble det dannet et kornet monster som viste at agglutinering hadde funnet sted, og intet svangerskap ble påvist. Denne testing gir et begrenset bevis på at falske positive■resultater ikke utgjor noen vanskelighet ved det ovennevnte indikatorsystem, og at hormonmengder som skyldes aktive befruktningshindrende programmer ik:ke har noen innvirkning ved denne spesielle testmetode.

KLINISK TESTING UNDER ANVENDELSE AV INDIKATORSYSTEM

31 fryste urinprover ble mottatt, og tester ble utfort som en bliridundersokelse, idet tilstanden av pasientene ved hvilke provene var blitt tatt, var ukjent. En kjent urinprove fra en besvangret kvinne ble innbefattet I forsdksrekken som en kontrollprove, og en kjent urinprove fra en ikke-besvangret kvinne ble likeledes inkubert som en ytterligere kontrollprove. Platetester ble utfort på den ovenfor.beskrevne måte og sammenlignet med platetester utfort på de samme urinprover etter en konvensjonell platetest for bestemmelse av svangerskap basert på et indikatorsystem av latexpartikler i kombina-sjon med CGTH.

Indikatorsystemet ble brukt i form av en h%- lg suspensjon. Antis-toffopplosningen besto av en 1:1000 fortynning av den ovennevnte antistoffopplosning i saltopplosning. Testmetoden besto i å blande 1 dråpe av hver av urinprøvene med en dråpe av antistoffoppløsningen og å tilsette deretter en dråpe av denne blanding på en ren glassplate-overflate med påfdlgende tilsetning til denne av en dråpe av den h%-. ige indikatorsystemsuspensjon og omrdring. Resultatene ble ansett som positive og merket + når det ble oppnådd et glatt monster som viste at agglutineringen var inhibert og folgelig indikerte svangerskap og ble ansett som negativt og merket - når det ble dannet et kornet monster som viste agglutinering og folgelig viste at svangerskap ikke forelå.

Den kommersielt tilgjengelige test ble utfort i ndyaktig over-ensstemmelse med de ledsagede instruksjoner, og resultatene med hensyn til svangerskap eller ikke svangerskap notert. Resultatene var som angitt i den nedenstående tabell III.

Det vil sees av den ovenstående tabell at samtlige av de 31 urinprover viste seg å stamme fra besvangrede kvinner ifdlge indikatorsystemet fra 'eksempel 2. 11 av de 27 -urinprover som ble testet etter den kommersielt tilgjengelige svanger skap stest viste seg å være. negativ og indikerte således at svangerskap ikke forelå. Det viste seg imidlertid at samtlige av de ukjente urinprover var tatt fra svangre kvinner, idet svangerskapets varighet varierte fra noen få

uker til 8,5 måneder.

Den kjente "urinprove fra en svanger kvinne og den kjente urinprove fra en ikke svanger kvinne ble testet bare med indikatorsystemet ifolge eksempel 2 og. er derfor ikke inkludert i tabell III. Resultatene var som ventet, idet det ble oppnådd et negativt resultat for urinen fra den ikke svangre kvinne og et positivt -resultat for urinen fra den svangre kvinne som var i den 8. uke av svangerskapet.

Eksempel 3

Til forskjell fra det ovenstående eksempel 2 ble et indikatorsystem fremstilt ved en 2-trinns reaksjon, idet E.coli cellene forst ble tilsatt til en puffeTOppldsning og det deretter ble tilsatt en BDB-oppldsning for dannelse av en immunologisk indikator. For fremstilling av et indikatorsystem ble deretter.en opplosning av CGTH tilsatt og koblingsreaksjonen utfort.

FREMSTILLING AV REAGENSER

Fosfatpuffer- saltopplosning av pH 7. 0 -

150 ml av en dinatriumfosfat-saltopplosning ble titrert til pH 7,0

med 75 ml av en mononatriumfosfat-saltopplosning. Den forste opp- . lbsning ble fremstilt ved at 150 ml 0,5M Na^PO^: 7H20-oppldsning ble blandet med 350 ml destillert avionisert vann og 500 ml 0,85$-ig saltopplosning. Mononatriumfosfat-saltoppldsningen ble fremstilt ved blanding av 150 ml 0,5M Na^PO^/^O med 350 ml destillert, avionisert vann og 500 ml 0,85$-ig saltopplosning.

Fosfatpuffer- saltopplosning av pH 7, 5 - 180 ml av den ovennevnte dinatriumfosfat-saltopplosning ble titrert til pH 7,5 med den ovenfor beskrevne mononatriumf osf at-saltopplosai rig.

BDB-oppldsning - 1 volumdel 0,025M benzidin<*>2HC1 i 0,36M

HC1 ble tilsatt til en volumdel 0,1M NaN02i destillert, avionisert vann, og den erholdte blanding fikk reagere i 2 minutter. Den ble deretter titrert til pH 7,0 med en blanding av like volumdeler av den ovenfor beskrevne fosfatpuffer-saltopplosning av pH 7,0 og 0,31 M NaOH i destillert vann. Straks deretter ble 6'ml's og 2 ml'.s alikvotdeler av BDB-opplosningen anbragt i beholdere, som ble til-' korket, forseglet og fryst til -83,3°C. BDB-opplosningen ble tint opp til<l>h°C etter behov..

E.coli-celler ble behandlet med formalin som beskrevet i eksempel 2 og ble deretter tilberedt I form av en l, h%- lg cellesuspensjon og ved hjelp av en pipette overfort til et 50 ml's sentrifuge-ror og sentrifugert ved 3100 omdreininger pr. minutt i 15 minutter. Supernatanten ble deretter hevet, og de sammenpakkede celler påny suspendert ved forst å blandes i en hvirvelblander til det var oppnådd et jevnt preparat, og deretter tilsettes 20 ml av saltopplbsningen fra eksempel 2. Cellene ble deretter sentrifugert, og det ovenstående skikt hevet. Denne vaskning med saltopplosning ble utfort ytterligere, to ganger. 0,2 ml av de erholdte sammenpakkede celler ble deretter suspendert i 2 ml av den ovenfor beskrevne saltopplosning. Denne suspensjon ble så holdt ved V°C i 1 time. Deretter ble 2 ml av en 1:5 fortynning av BDB-opplosningen i fosfatoppldsningen fra eksempel 2 tilsatt og det hele anbragt i morke i et roterende rysteapparat ved h°C i 30 minutter. Cellene ble deretter sentrifugert i 5 minutter ved<i>f°C og vasket to ganger med h ml kald f osf atpuff er-saltopplosning av pH 7,5, hvorved det ble erholdt en relativt stabil suspensjon.

Deretter ble 1,6 ml kald fosfatpuffer-saltopplosning av pH 7,5 og 0,8 ml CGTH i 6 ml saltopplosning ( h mg/ml) tilsatt til cellesuspensjonen. Det erholdte indikatorsystem ble klargjort for testing ved at preparatet ble vasket en gang med 25 ml 1:50 BSA i saltopplosning, sentrifugert ved 3000 omdreininger pr. minutt i 5 minutter og påny suspendert ved hjelp av en hvirvelblander. • En 0,9 ml<1>s opplosning av 1:50 BSA i .saltopplosning hie deretter tilsatt for påny å suspendere indikatorsystemet, nemlig for lagring i en kjoler. En 0,3 ml<1>s porsjon av det ovenfor beskrevne preparat ble rystet i h timer ved romtemperatur i en ryster. Suspensjonen bie deretter behandlet i en ryster ved .37°C i 1 time. Suspensjonen ble så vasket to ganger i den ovennevnte, saltopplosning og en gang med 1:50 BSA i saltopplosning. Cellene ble derpå påny suspendert til 0,3 ml i 1:50 BSA i saltopplosning, hvorved det ble erholdt en 10%-ig cellekonsentrasjon.

En indirekte agglutineringstest ble deretter utfort ved at en dråpe av cellesuspensjonen ble blandet med en-dråpe av hver av tre antistoffoppldsninger av dkende fortynning. Fortynningene var 1:250, 1:500 og 1:1000. Et glatt monster som viste en god, indirekte agglutinering, ble frembragt for fortynningen til 1:1000, og skjdnt monsteret ikke var like markert som de to dvrige, ble det ansett å gi uttrykk for en jevn agglutinering. Dette viser at indikatormaterialet som fremstilles etter fremgangsmåten ifdlge oppfinnelsen, kan fremstilles og lagres separat og deretter benyttes til å koble antigene materialer som kan anvendes senere - for.. testing.

Eksempel '*+

Et immunologisk, indikatorsystem ble tilberedt fot testing av urinprover på tilstedeværelse av CGTH ved at menneskelig CGTH ble koblet til gjærceller ved hjelp av det kjemiske koblingsmiddel BDB. Indikatorsystemet ble brukt i tilknytning til antistoffet til CGTH for -utfdreise av en test med inhibert agglutinering..

lg Saccharomyces cerevisiae ble veiet ut og vasket tre ganger med 200 ml av den ovennevnte saltopplosning. Den gjær som ble brukt, var på markedet under iiand-elsnavnet Fleischmann's Active Dry Yeast. Gjærcellene ble deretter oppslemmet i ^00 ml 1%- ig formaldehydoppldsning i saltopplosning. Suspensjonen ble tillatt å stå ved romtemperatur i 2h timer, idet den leilighetsvis -bl-e rystet. Cellene ble så sentrifugert.ved 2000 omdreininger .pr. minutt i 10 minutter og det sammenpakkede eellevolum tatt ut og oppbevart i 200 ml av den ovennevnte saltopplosning ved. k°C, Denne suspensjon viste en hematocrit-verdi på 1 ,!+$.

Til 0,5 ml av de sammenpakkede formalinbehandlede gjærceller ble det tilsatt 12 ml av den ovennevnte fosfatpuffer og deretter 6 ml av en saltopplosning som inneholdt 20 mg CGTH/10 ml, hvoretter cellene.

"ble bragt i kontakt med ^0 ml av en 1:5 fortynning av den ovennevnte BDB-opplosning. Reaksjonen forlop under kontinuerlig omroring i 20 minutter ved romtemperatur. Det erholdte indikatorsystem ble oppsamlet ved sentrifugering og vasket tre ganger i den ovennevnte saltopplosning, hvoretter de sammenpakkede celler ble suspendert i en 1:50 fortynning av BSA i saltopplosning. Den erholdte suspensjon viste en hematocrit-verdi på 6%.

Denne 6%- ige celle suspensjon ble deretter anvendt med en 1:500

fortynning av Ab-CGTH for testing på tilstedeværelse av CGTH i to urinprover. En 0 - 2 ml's porsjon av den 6%- ige cellesuspensjon ble vasket en gang og fortynnet med 1:50 BSA i saltopplosning til den opprinnelige konsentrasjon, hvorved det ble erholdt et sluttvolum på 0,2 ml. En dråpe av en kjent urin fra en svanger kvinne ble blandet med en dråpe av Ab-CGTH-oppldsningen og tillatt å stå i 2 minutter, hvoretter en enkelt dråpe av blandingen ble anbragt på en glassplate. En dråpe av indikatorsystemet ble deretter blandet- med materialet på glassplaten. Det ble dannet et glatt monster som indikerte svangerskap. Testen ble gjentatt med en urinprove fra en ikke svanger kvinne. Det ble dannet et kornet, agglutinert monster i ldpet av kort tid.

Dette eksempel viser at gjærceller kan anvendes som indikatorpartikler for indikatorsystemet. Disse celler oppviser den fordel at de fores i handelen i en torr, stabil form.

Eksempel 5

Et indikatorsystem ble fremstilt under anvendelse av E. coli

som mikrobeceller, et carbodiimid som koblingsmiddel og CGTH som antigent stoff. Dette indikatorsystem ble deretter brukt både i tester basert på agglutinering og i tester basert på inhibering av agglutinering.

FREMSTILLING AV REAGENSER

Mikrobeceller - E. Coli celler ble dyrket, innhostet og behandlet med formaldehyd som beskrevet I eksempel 2. Et volum av 20 ml av en 2, 5%- ig suspensjon ble fremstilt på denne måte. Denne suspensjon ble sentrifugert og 0,5 ml sammenpakkede celler utvunnet for anvendelse ved fremstilling av indikatorsystemet.

Koblingsmiddel - 0,2 g N,N'-dicyclohexylcarbodiimid ble opplost

i 0,5 ml tetrahydrofuran, hvoretter opplbsningen ble tilsatt 1,0 ml destillert vann.

Anti<g>ent stoff - k- 0 mg CGTH ble opplost i 2 ml destillert vann. Det anvendte CGTH hadde en aktivitet på 2590 I.U./mg og var levert

av Vitamerican Corp., Little Falls, New York.

Ab- CGTH- opplosning - Porsjoner av antistoffopplbsningen og den 0,85$-ige saltopplbsning fremstilt i henhold til eksempel 2 ble benyttet for tilberedelse av fortynninger på 1:5°, 1:100 og.1:200 av Ab-CGTH.

FREMSTILLING AV INDIKATORSYSTEMET

De 0,5 ml sammenpakkede E. coli celler ble vasket fem ganger

med koldt vann og deretter suspendert i de 2 ml CGTH-opplbsning. Koblingsmiddeloppldsningen ble deretter tilsatt til de suspenderte celler og CGTH for å koble disse. Blandingen ble rystet og deretter satt tilside i 2If timer ved 25°C. De fblgende vaskinger ble deretter utfort for å befri det således erholdte indikatorsystem fra eventuelle, medrevne forurensninger: tre ganger med 0,01M natriumcarbonatopplbs-ning, tre ganger med 0,01M HC1, tre ganger med destillert vann, e"n gang med 1% NaCl (pH 2,3), én gang med en 1:20 fortynning av fosfat-saltopplbsning' fra eksempel 3 i 0,85%-ig saltopplbsning (pH 7,0), og en gang med en 1:50 fortynning av BSA i 0, 85%- ig saltopplbsning. Det vaskede indikatorsystem ble. deretter suspendert•til en 8%- ig cellekonsentrasjon i 1:50 BSA i 0,85%-ig saltopplbsning. Denne 8%- ige suspensjon ble oppbevart i et kalt rom og tatt ut for den nedenfor beskrevne testing.

En forberedende agglutinering ble utfort ved at en dråpe av

hver av de ovenfor omtalte antistoffortynninger ble blandet med en dråpe av indikatorsystemfunksjonen på adskilte områder på.en glassplate. Et kontrollforsbk ble utfort ved å blande en dråpe av en 1:50 fortynning av.normalt kaninserum (NRS) i 0,85%-ig saltopplbsning med en dråpe av indikatorsystemsuspensjonen på et separat område av den samme, plate. Resultatene er oppfort i den nedenstående tabell IV, hvor "S" betegner et glatt og folgelig ikke;-agglutinert monster og "G" betegner et kornet og folgelig agglutinert monster..

Tabell IV viser at agglutinering fant sted for 1:50 og 1:100 fortynningene, men at utilstrekkelig meget Ab-CGTH var tilstede ved 1:200 fortynningen til å bevirke agglutinering av indikatorsystemet. Kontrollprdven oppviste et glatt monster, hvilket viser at systemet ikke spontant agglutinerer med NRS-oppldsningen.

Ytterligere testing ble utfort ved at 0,5 ml av en urinprove fra en svanger kvinne ble blandet med 0,5 ml av 1:100 antistoff-fortynningen i et testrdr, hvilken blanding deretter ble tillatt å stå i 5 minutter ved 25°C. En dråpe ble deretter tatt ut fra test-proven og blandet med en dråpe av den 8%- ige indikatorsystemsuspensjon på en glassplate. Et glatt monster, "S", ble iakttatt, hvilket viste at agglutineringen av indikatorsystemet ved hjelp av Ab-CGTH var blitt forhindret av det'I urinprdven tilstedeværende CGTH.

Testen ble gjentatt under anvendelse av 0,5 ml av en urinprove fra en ikke svanger kvinne med det resultat at det i'ldpet av kort tid ble oppnådd et kornet monster "G".

Dette eksempel viser at et earbodiimid kan anvendes som koblingsmiddel for å binde antigene stoffer til mikrobeceller.

Eksempel 6

Ytterligere to indikatorsystemer ble fremstilt i henhold til eksempel 5. De anvendte antigener var menneskelig serum-albumin (HSA) og heste-gamma-globulin. Indikatorsystemet for HSA ble tilberedt ved anvendelse av 10 mg HSA pr. 0,25 ml sammenpakkede E.coli celler istedenfor CGTH. Indikatorsystemet for heste-gamma-globulin ble fremstilt ved anvendelse av *+0 mg av dette antigen pr. 0,25 ml sammenpakkede E.coli-celler istedenfor CGTH.

Agglutineringstesten ble utfort ved at en dråpe av hvert av de' fremstilte indikatorsystemer ble blandet med en dråpe av en 1:10 fortynning av deres respektive antisera i 0,85$-ig saltopplosning. En kontrollprove for hver test ble utfort under anvendelse av en dråpe av en 1:10 fortynning av normalt kaninserum i 0,85%-ig saltopplosning. Antiserumdråpene forårsaket i hvert tilfelle dannelse av gode agglutineringsmdnstere for de respektive indikatorsystemer. Ingen agglutinering ble forårsaket av det normale kaninserum.

Eksempel 7

Fremstillingen av indikatorsystemene og utfdrelsen av aggluti-neringstestene ifolge eksempel 6 ble gjentatt med samme resultater ved anvendelse av N-t.-butyl-5-methylisoxazolium-perklorat istedenfor earbodiimid-koblingsmidiet. 10 ml av en 2,5$-ig suspensjon av de formalinbehandlede celler fra eksempel 2 ble sentrifugert i et tidsrom fra 5 til 10 minutter, hvoretter supernatanten ble fjernet. Cellene ble deretter vasket fire ganger med koldt vann og deretter suspendert i 20 ml 0,l$-ig natriumbicarbonat i destillert vann. 3 mg ravsyreanhydrid ble deretter tilsatt, og cellene ble rystet natten over ved V°C. Cellene ble deretter sentrifugert og vasket ytterligere tre ganger med vann, hvoretter de succinylerte celler ble oppslemmet i 5 ml destillert vann. Det ble så brukt en pipette for å tilsette 10 mikroliter tri-ethylamin til cellene. Deretter hie det tilsatt 17 mg N-t.-butyl-5-methylisoxazolium-perklorat. Dette koblingsmiddel er også kjent som Woodward<1>s reagens "L". Den således erholdte immunologiske indikator ble anvendt til å koble de i eksempel 6 angitte antigener i de der angitte mengder. Menneskelig serum-albumin og heste-gamma-globulin koblet til E.coli etter den ovenfor beskrevne metode ga agglutinering når omsatt med anti-menneskeserumalbumin fra kaniner og 1:10 anti-heste-gamma-globulin fra kaniner. Ingen agglutinering ble forårsaket av 1:10 normal kaninserum.

Eksempel 8

Tolv forskjellige indikatorsystemer ble fremstilt i henhold til eksempel 2 med hensyn til formalinbehandlingen av mikrobecellene og koblingen av antigener til disse ved anvendelse av BDB. De anvendte mikrobeceller var Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Lactobacillus leichmannii og Pseudomonas fragi, og antigenene som ble brukt sammen med hver av disse indikatorpartikler var HSA, heste-gamma-globulin og menneskeinsulin. Agglutineringstester av platetypen ble utfort.

De anvendte B. subtilis og B. pumilus ble dyrket på samme måte som E. coli i eksempel 2. L. leichmannii ble dyrket i like lang tid og ved samme temperatur på 37°C i et skum sammensatt av 890 ml vann, 100 ml -tomatsaf tfiltrat, 10 ml "Bacto-Tween 80", 7., 5 g gjærekstrakt, 7,5 g pepton, 10 g dextrose og 2 g dinatriumfosfat. Skummet hadde, en pH-verdi på 6,8 -og var blitt.behandlet i autoklav i 10 minutter ved 121°C under et overtrykk på 1,05 kg/cm<2>for sterilisering.

P. fragi ble dyrket >+,5 timer ved romtemperatur (25°C) I et på forhånd sterilisert skum bestående av 1 liter vann, 5 g trypton, 5 g gjærekstrakt, 1 g dextrose og 1 g dinatriumfosfat.

De innhostede celler ble deretter formalinbehandlet og 0,25 ml sammenpakkede celler fra hver kultur anvendt etter koblingsmetoden ifolge eksempel 2, idet tre porsjoner av h<y>er av disse celler ble suspendert i 6 ml av fosfatpufferen_fra dette eksempel og det deretter til hver av disse porsjoner av suspenderte celler ble tilsatt de folgende antigener opplost i 5 ml 0,85$-ig saltopplosning: 3 mg HSA, ' hO mg heste-gamma-globulin og 20 mg insulin. Deretter ble det tilsatt 20 ml av en 1:5fortynning av BDB-opplosningen fra eksempel 2 i fosfatpuffer for å utfore tilsvarende koblingsreaksjoner.

Hver av de tolv indikatorer ble testet med deres respektive antistoffer og med kontrollprover av normalt serum. HSA- og heste-gamma-globulin-indikatorsystemet ble testet med en 1:50 fortynning av'henhold svis anti-HSA og anti-heste-gamma-globulin fra kaniner .i saltopplosning, mens insulin-indikatorsystemene ble testet med et ufortynnet anti-insulinserum fra marsvin i saltopplosning.. Kontroll-forsokene for hver av de tolv tester ble utfort med en 1:10 fortynning av normalt kaninserum i saltopplosning. Antistoffene til hvert av antigenene agglutinerte hvert av de fire indikatorsystemer tilberedt med de individuelle antigener,, og ingen agglutinering. ble iakttatt for kontrollprdvenes vedkommende.

Claims (3)

I

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av en immunologisk indikator for kjemisk binding til antigene stoffer, karakterisert ved at man bringer mikrobeceller i kontakt med molekyler av et koblingsmiddel som har minst to ikke-bundne, reaktive grupper, og den ene av de reaktive grupper -bringes til å danne en kovalent kjemisk binding med mikrobecellene mens den annen reaktive gruppe bibeholdes i Ikke-bundet tilstand, hvorved indikatoren blir i stand til å reagere med antigene stoffer når den bringes i kontakt med slike.

2. Fremgangsmåte i folge krav 1, karakterisert ved at det anvendes mikrobeceller valgt fra gruppen bestående av bakterieceller, fungus-celler, parasitologiske celler og vlrus-celler.

3. Fremgangsmåte lfdlge krav 1, karakterisert ved at det anvendes mikrobeceller av ensartet form og storrelse og som har en maksimal dimensjon i en retning fra 0,2 til 10/ Lim.

h. Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved at det anvendes konserveringsmiddelbehandlede og eventuelt merkede mikrobeceller.