DE1617644A1 - Immunologischer Indikator und Diagnosevorrichtung - Google Patents

Description

lrfindung betrifft eiReji immunalogip^litn aus MikroTaenzelleiij an die ein Kupplungsmittel· ist^: daa ehemiaeb an antigene. §ukata.nze.n. kann, wQdureh immunolQgigiohe werden, die äup aieht"bajPen^Ä.ufapü,i»ung od ep Antikarper verwtiidst wer den kennen» zur- Herstellung aöleb^i* immun.(3i und diagnostiaeher· iyatem^ Ulid lage derartiger Indikatgr-ayste

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von antigenen Substanzen in verschiedenen Flüssigkeiten aufspüren zu können« Bei vielen industriellen Verfahren werden proteinartige Materialien mit Antigeneigenschaften entweder als Reaktionsteilnehmer verwendet oder es wird auf diese in irgendeiner Art eingewirkte. Die Möglichkeit, Konzentrationsänderungen dieser Materialien festzustellen, um derartige Reaktionen verfolgen zu können, ist von erstrangiger Bedeutung "bei der Kontrolle und. Reproduzierbarkeit dieser industriellen Verfahren. Ein anderes Gebiet von großer Wichtigkeit ist die Erfassung verschiedener Antigene und Antikörper in Körperflüssigkeiten. Die Größenordnung des Vorkommens vieler Hormone, Proteine, Lipoproteine, Mukoproteine, Glycoproteine usw. und ihrer Hydrolysenprodukte, die auf natürlichem Wege, als auch während verschiedener pathologischer Umstände im Körper auftreten, ist von großer Bedeutung für die medizinische Praxis. Einige dieser interessierenden Substanzen waren von je her schwierig mittels Standardmethoden der analytischen Chemie festgustelleiu Burcrh die Anwendung immuno-chemischer Untersuchungsverfahren, sind einige dieser Antigene und Antikörper 3ed.QQh in. litohungen erkennbar geworden, dieiandere groie Moleküle, mit ähnlichen chemischen Gruppierungen enthalten ι abe.r nieht äie genau« steirlsche Konfiguration der

Makromoleküle, stafweiaeß« Eine Reihe dieser V«rfrmhr«iss„8weis.tn waren, sefewisrig durchzuuat da«©r/t©K Qft lange und wa^en teolißiaah schwierig,

jedoch verließ man sieh auf sie, um die Gegenwart von derartigen Substanzen in verschiedenen Körperflüssigkeiten aufzuspüren. Über einige Antigene un§ Antikörper waren keine Untersuchungsverfahren verfügbar.

Vor kürzerer Zeit wurden Systeme, die mit einer Hämagglutination arbeiten, zur Entdeckung von Antigenen oder ihren Antikörpern vervollkommnet. Diese Systeme verwenden rote Blutzellen als Indikatorpartikel, welche beim Gebrauch in irgendeiner Art mit einer antigenen Substanz verbunden werden, wodurch ein Indikatorsystem geschaffen wird, das zur Entdeckung der homologenen Antikörper oder antigenen Substanz selbst verwendet werden kann. Für eine Bestimmung der Gegenwart.oder Abwesenheit der zu untersuchenden Substanz durch Verwendung derartiger Systeme ist es gewöhnlich notwendig, das Aussehen der durch die roten Blutkörperchen gebildeten Muster zu interpretieren, um zu bestimmen, ob eine Hämagglutination aufgetreten ist. Die Hämagglutination findet statt, wenn der homo^e Antikörper im Untersuchungsmedium in einer Form vorhanden ist, die eine Reaktion mit der antigenen Substanz erlaubt, welche an die roten Blutkörperchen gekuppelt ist und damit einen Immunkomplex bildet. Eine Hämagglutination tritt nicht auf, wenn der homologe Antikörper mit den roten Blutkörperchen nicht komplex zusammentreten kann, an welche die antigene Substanz gekuppelt ist_o Da dieses Untersuchungsverfahren

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von vielen Bedingungen, einschließlich Puffern und anderen stark reaktiven Materialien abhängt, ist es.von begrenzter Anwendbarkeit und steht im. Ruf, ausgebildetes Personal
für die Interpretation des Aussehens der erhaltenen Muster zu erfordern, obwohl durchführbare Untersuehungssysteme
für einige Substanzen sich durchgesetzt haben. Eine andere zu Fehlschlägen führende Schwierigkeit, die mit Hämagglutinationssystemen verbunden ist, ist die, die als das
heterophile Antikörperproblem bekannt ist, welches durch
einige der Serumproteine verursacht wird, die in der Antiserumlösung enthalten sind, welche mit den antigen Gruppen reagieren, die natürlicherweise auf der Oberfläche der
roten Blutkörperchen vorhanden sind, selbst wenn das Anti— serum von einer anderen Art genommen wird, als der Tierart, die die verwendeten roten Blutkörperchen hervorbrachte. Ovalbumin wurde frühzeitig in dieser Art im Serum entdeckt gemäßere ssman, D.H. Campbell, L. Pauling: Journal of
Immunology 44, Seiten 101-105 (1942). Ein ähnliches Verfahren wurde zur Bestimmung von Tuberkulin gereinigten
Proteinderivaten verwendet, gemaß^öole, V.R. Farrelli
Journal of Experimental Medicine 102, Seite 157 (1955)
und Insulin wurde im Serum bestimmt durch E.R. Arquilla
und A.B. Stavitsky gemäß Journal of Clinical Investigation 35, Seiten 458-466 (1956). In der USA-Patentschrift
3 236 732 ist ein ähnliches System zur Untersuchung des
Hormons chorionisches Gonadotropin beschrieben. Eine
pathologische, antigene Substanz, nämlich das Diphterietoxin

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wurde ebenfalls in dieser Art untersucht gemäß W.-I. Butler: Journal of Immunology 90, Seiten 663-671 (1963)·

Man glaubt jetzt, daß die begrenzte Verwendung dieser Art. von Untersuchung durch Hämagglutination teilweise dem engen Bereich der Grögen und der besonderen Anordnung der roten Blutzellen von Tieren zuzusehreiben ist,, die gewöhnlich verwendet werden, und daß eine breitere Verwendung von auf der Agglutination beruhenden immunologischen Unter« suchungssystemen verwirklicht werden könnte, wenn Indikatorpartikel zürn Ersatz der roten Blutkörperchen*gefunden werden könnten, die eine breitere Var^iierung der-Größe erlauben würde. Im allgemeinen setzt die Verwendung von tierischen roten Blutkörperchen als Indikatorpartikel für verschiedene Antigene die Verwendung.entweder eines chromatographischen oder eines auf dem Objektträger durchgeführten Agglutinationsmechanismus voraus ο Auch sind die roten Blutkörperchen für die kommerzielle Verwendung'teuer, da Labortiere gehalten werden müssen und' die Bedingungen des Einsammeins sorgfältig vorgeschrieben werden müssen, um eine Hämolyse der Zellen zu verhindern und eine Einheitlichkeit zu fördern, ohne die der Hämagglutinationstest nicht in reproduzierbarer Weise ausgeführt werden kanne

Es wurde gefunden, daß Mikrobenzellen als immunologische

Indikatorpartikel dienen können und viele derirüheren Schwierigkeiten überwinden helfen können„ Mikrobenzellen existieren in einem breiten Bereich von Größen und iOrmen«, Die Größen liegen innerhalb der Bereiche, die sowohl für Agglutinationsversuche im Prüfröhrchen oder auf dem Objektträger und für Versuche der chromatographischen Art erforderlich sind» Daher können eine Vielzahl von Versuchsmechanismen verwendet werden, wenn Mikrobenzellen als In— dikatorpartikel verwendet werden» Die Zellen werden leicht unter Laboratoriumsbedingungen kultiviert und können zu niedrigen Kosten in handelsüblichen Mengen hergestellt werden. Mikrobenzellen können nach der gebrauchten Größe, nach den für einen bestimmten Testmechanismus vorteilhaftesten Oberflächeneigenschaften und nach der Leichtigkeit ihrer Produktion ausgewählt werden. Daher ist eine größere Flexibilität in der Konstruktion von immunologischen Testsystemen durch die Verwendung von Mikrobenzellen mögliche Auch wird durch die Verwendung von Mikrobenzellen das heterophile Antikörperproblem beseitigte

Der Ausdruck "Indikatorpartikel" bezieht sich auf Mikrobenzellen ohne Kupplungsmittel, das an sie gebunden ist« "Immunologischer Indikator" bezieht sich auf Mikrobenzellen mit daran gebundenem Kupplungsmittel, aber ohne eine daran gekoppelte antigene Substanz, und "immunologisches Indikatorsystern" bezieht sich auf die Kombination

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von Zellen, Kupplungsmittel und antigene^ Substanz.

Es ist daher Ziel der Erfindung einen immunologis.chen Indikator zu schaffen, der aus Mikrobenzellen und einem daran gebundenem chemischen Kupplungsmittel "besteht,, an welches antigene Substanzen kovalent gekuppelt werden können und das verwendet werden kann, um Antigen-Antikörper-Reaktionen sichtbar anzuzeigen_o

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung eines immunologischen Indikators für Antigen-Antikörper-Reaktionen, der aus Mikrobenzellen in jeder Größe eines breiten Bereichs besteht_β

Ein weiteres'Ziel ist die Schaffung eines immunologischen Indikatorsystems für die Verwendung bei der Bestimmung eines Antikörpers, wobei das Indikatorsystem aus Mikrobenzellen zusammengesetzt ist, die chemisch an das homologe Antigen für diesen Antikörper über ein chemisches Kupplungsmittel gekoppelt sind.

Hoch ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung eines immunologischen Indikatorsystems zur Verwendung bei der Bestimmung eines Antigens und für eine Verwendung in Verbindung mit dem homologen Antikörper, wobei das Indikatorsystem aus Mikrobenzellen besteht, die chemisch

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über ein chemisches Kupplungsmittel an das Antigen gekoppelt sind. .

Koch ein anderes Ziel ist die Schaffung immunologischer Indikatoren des genannten Typs in trockener, pulverisierter Form aus einem Träger aus. saugfähigem Material zur Schaffung von Versuchsvorrichtungen, die auf derartigen Systemen basieren.

Der immunologische Indikator gemäß der Erfindung kann kurz als aus Mikrobenζeilen zusammengesetzt beschrieben werden, an welche Moleküle eines Kupplungsmittels chemisch gebunden sind, die wenigstens eine nicht gebundene reaktive Gruppe besitzen, welche eine kovalente Bindung mit einer reaktiven Gruppe in antigenen Substanzen bilden kann, wenn sie mit diesen in Berührung und Reaktion eintritt. Der Indikator wird hergestellt, indem die Mikrobenzellen in einer Flüssigkeit suspendiert werden und dazu das Kupplungsmittel zugegeben wird, welches mit einer reaktiven Gruppe auf der Oberfläche der Mikrobenzellen reagieren iann. Die an die Mikrobenzellen zu kuppelnde antigene Substanz kann in der gleichen flüssigen Suspensifan vorhanden sein, wenn das Kupplungsmittel zugegeben wird, so daß sich sofort ein spezifischer immunologischer Indikator bildet, oder die Substanz kann später zu dem vorbereiteten Indikator zugegeben werden. Das Kuppeln

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des Indikators an eine antigene Substanz bildet ein Indikatorsystem, das in bestimmter Weise verwendet werden kann, wie nachfolgend beschrieben wird«,

Die Mikrobenzellen des immunologischen Indikator-? und diagnostischen System können jede &rt von sich selbst reproduzierenden Mikroorganismen sein, die sich mit oder ohne Abhängigkeit von anderen Organismen selbst vermehren. Es können sowohl gram-positive wie gram-negative Bakterienzellen verwendet werden, Pilzzellen und Zellen von Protozoen können ebenfalls verwendet werden, genauso wie Viruszellen"für einige Testsysteme. Diese sind im allgemeinen einzellige Organismen, welche sich gelegentlich zu Klumpen oder Aggregaten vereinigen. Die Zellen können in dieser Form verwendet werden₉ wenn die Aggregationsgröße kein Trägerteilchen bildet, daß so groß ist, daß das gebildete Testsystem nicht agglutiniert in Gegenwart einer Substanz, die der an die aggregierten Zellen gebundenen antigenen Substanz homolog", ist« Im allgemeinen sind die bevorzugten Mikrobenzellen Bakterienzellen oder deren Aggregate, die eine einheitliche lOrm und Größe besitzen und maximale äußere Dimensionen in einer Richtung von etwa 0,2 bis 10 Mikron aufweisen. Eine Mischung von verschiedenen, aber einheitlichen Zellen kanja verwendet werden, ohne daß diese bevorzugt tat. Von diesen Bakterien umfassen die brauchbaren Mikrobenzellen diejenigen der

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ersten Abteilung des Pflanzenreichs einschließlich der Klassen I,"Il und III, erste Ordnung„ Me erste Ordnung der Klasse III umfasst von den Mikrobenzellen die intrazellulären Virusorganismen, welche Dimensionen von etwa Ο,2 Mikron besitzen*

Brauchbare Baterienzellen sind, vollständig aufgeführt in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology by R.S. Breed, E,GoD. Murray, H".R. Smith, 7th Edition, 1947 the Williams and Wilkins Company,, Besonders brauchbar sind die Bakterien der Klasse II, Unterordnung HV Familie IV ¹ (Pseudomonadaceen und Klasse II, 5. Ordnung, Familie 17 (Enterobacteriaeeae). Alle Stämme I bis V stellen bevorzugte Mikrobenzellen für die Zwecke dieser Erfindung dar. Auch Klasse II, IT. Ordnung, Familie V(Brueellaceae), X (Lactobacillaceäe) und XIII (Bacillaceae), werden als bevorzugt angesehen. Sowohl die Ordnungen I und II der Organismen der Klasse III können dann verwendet werden, wenn kleinere Partikel von etwa 0,2 Mikron oder darunter erwünscht sind. Insbesondere sind die Viren der Ordnung II auch von so kleinen Dimensionen, daß ihre Brauchbarkeit dadurch begrenzt ist.

Insbesonders bevorzugte Bakterienzellen sind Bruce11a abortus, Eschericfaia coil, Bacillus subtilis, Bacillus pumilua, Lactobacillus leichmannii, und Pseudomonas fragi.

Die Wachstumsphasen von Hefe bei den Pilzzellen sind ebenfalls für die Verwendung bei der Erfindung bevorzugt« Besonders bevorzugt ist die üblicherweise ethältiehe Hefe Saccharomyges oerevisiae.

Die Mikrobenzellen können in ihrem natürlichen Zustand verwendet werden, d.h. das Kupplungsmittel kann damit umgesetzt werden, und dann kann die antigene Substanz daran gebunden werden über das Kupplungsmittel, Wenn jedoch die natürlichen phathogenen Eigenschaften einer Mikrobenzelle als Gefahr betrachtet wird, kann die natürliche Antigenwirkung und damit die päthogenen Eigenschaften durch Behandlung oder durch Abtöten der Mikrobenzellen mit einem Konservierungsmittel ausgeschaltet Werden. Die am besten bekannten Konservierungsmittel sind Formaldehyd und Phenol. Es muß bemerkt werden, daß wenn die Mikrobenzellen mit Konservierungsmittel behandelt und dann weiter geändert worden sind, durch das Anfügen von KupplungB-mitteln und antigenen Substanzen die natürlich auftretenden antigenen Gruppen auf der Zeilenoberfläche hinreichend moäifizlert sind, um sie inaktiv zu machen, TIm Zellen mit einer natürlichen antigenen Aktivität vollständig zu ellminieren, können die vorbereiteten lestsysteme an Serum absorbiert werden, welches den Antikörper zu dem natürlich vorhandenen Antigen auf der Zelloberfläche enthält, das damit Komplexe bildet, die nicht beim^:-"weiteren Untersuchen

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stören» Wenn ζ.B₀ E.eoli als Indikatorpartikel des Indikators verwendet wird und Antikörper zu E.eoli in der Untersuchungsprobe anwesend sind, dann kann die Reaktion zwischen dem Indikator und seinem Antikörper blockiert werden durch Absorption der E.eoli—Zellen mit Antiseren, welche den Antikörper dazu enthaltene Daher können die erfindungsgemäß verwendeten Mikrobenzellen nicht mehr als solche betrachtet werden, die natürliche Antigenwirkung besitzen.

Palis gewünscht, können die Mikrobenzellen angefärbt
werden, um die sichtbare Unterscheidung des erhaltenen
Indikatorsystems von dem Umgebungshintergrund zu verbessern« Die gewöhnlichen Anfärbemittel wie Hämatoxylin, Fuchsin,
und Kristallviolett können zu diesem Zweck verwendet werden.

Eine andere günstige Behandlung ist das Waschen der
Zellen mit organischen Lösungsmitteln, wie Alkoholen, Äthern usw. zur Entfernung von Schichten aus Polysacchariden
oder Wachs, die anwesend sein können_β

- Die Kupplungsmittel, welche mit reaktiven Gruppen
sowohl der Mikrobenzellen, als auch der antigenen Substanzen chemisch umgesetzt werden können, sind im allgemeinen Verbindungen mit 2-oder'mehr der folgenden reaktiven Gruppen: .

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AzogruppenY Sülfonsäuregrüppen, [Fluor in Kombination mit Nitrogruppen» Azide, imine und reaktives Chlor* welche an einen Ring mit den geeigneteii Resonanzstrukturen gebunden sind, piese reaktiven G-ruppen können mit den primären Aminogruppen, Sulfbydry!gruppen (Merkaptogruppen) und Hydroxylgruppen in den Polymerketten der antigenen Substanzen und der Mikrobenzellenoberflächen reagieren·

Eine repräsentative Liste von bekannten Knpplungsmitteln ist die folgende* Bis-diazobenzidin, Bis-diazöhen« zidin-disülfonsäure, letraäzo-p-phenylendiämin, 3)iflüördiiiitrobenzöl, verschiedene Carbodiimide, ioiuolr-diisocyanate Cyanursäureehlöridj Dichlor-S-triaäln, und li-t-Butyl-^ethyliHoxazölium-perchlorat» Einige dieser Kupplungsiöittel, insbesondere die Gyänursäure vefmittölnden Substanzen, können die fellen gleichzeitig konservieren, wenn sie an Sruppen auf den Mikrobenzeilenoberflächen kuppeiii^ so döß mit diesen KüpplungSmitteln keine getrennte Yotbefaaniilttng fiir die Konservierung der fellen notwenig 1st. Zm ITerwendlung der letztgenannten Verbinäung der Liste weiden Indikatörtelicfaeii zuerst mit einen* ^uceinylierungsmittel wie BernstöinBiureanhydrid behandelt*

2ür Bildung de& tiflisiinologiö^hen Indikators: ttird das Kupplungömittel zunächst Mit den;Mikroberizeilen

tlft

welche in einer Flüssigkeit suspendiert sind, und falls notwendig, wird danach dieser Indikator mit den antigenen Substanzen gemischt zur Bildung eines Indikatorsystems, d.he der Indikator selbst wird als Handelsartikel betrachtet, da er hergestellt und für die Verwendung durch den Kunden für die Herstellung von Untersuohungssystemen für jede besondere antigene Substanz verkauft werden kann.

Die bevorzugte Art und Weise, die Mikrobenzellen und die antigenen Substanzen mit dem Kupplungsmittel zur Bildung des Testsystems in Berührung zu bringen, ist die Sus— phdierung der Mikrobenzelien und der antigenen Substanzen in einer Flüssigkeit und das Zusetzen des Kupplungsmittels unter gründlichem Mischen. Eine andere Art des Inberührung— bringens ist die gleichzeitige Zugabe der Mikrobenzellen und der antigenen Substanz zu einer Lösung, welche das Kupplungsmittel enthält. Diese Arten des Inberührungbringens beschränken das Kuppeln von Mikrobenzellen unt^r sieh und das Kuppeln von Antigensubstanzmolekülen unter sich.

Im allgemeinen kann jede antigene Substanz an den immunoiogisoben Indikator der Erfindung gekuppelt werden. Eine "antige^· Substanz¹*, wie sie hierbei verwendet wird, heißt ein Material, das eines homologen Antikörper bildet, wenn es ia das KreislaüfsystiHi eines iieres eingebracht

wird. Dieser .breite gereich umfaßt Serumantigene., wie ^--Globulin und „Serumalbumin oder die Blutgruppensubstanzen ^A" und "B" für die untersuchung auf Blutgruppen. Mikrobenantigene können an den Indikator gekuppelt werden, am entweder die Mikrobe selbst oder deren Antikörper in 4i# Flüssigkeiten zu entdecken. Antigene Hormonsubstanzen, die in den Plüssikgeitssystemen von Organismen vorhanden sind, können ebenfalls an den Indikator gekuppelt werden. Auch Proteinhydrolyseprodukte und Enzyme können als antigene Substanzen benutzt werden. Die Mikrobenantigene oder Antikörper können ihren ITrsprung von Bakterien, Pilzen, Parasiten oder Viren haben. Das primäre Erfordernis für die antigenen Substanzen ist das Torhandensein von wenigstens einer Gruppe in ihren Polymerketten, die mit der reaktiven Gruppe von wenigstens einer der bekannten Kupplungsmittel reagieren kann« Es scheint, daß alle antigenen Substanzen diese Bedingung -erfüllen-· . ;

Die antigene Substanz kann ein natürlich auftretendes Material oder ein künstlich hergestelltes Material sein·. Einige natürlich auftretende Substanzen, die an den immunologischen Indikator der Erfindung gekuppelt werden»können, sind Ovalbümin, Tuberkullrr gereinigtes Piroteinderfirat-,.,, ....... ,.

Insulin, das hormonchorionisches Gonadotropic (CGTH)j. . sowhl menschlichen wie tierischen IJrsprungs, menschliches Serumalbumin und Gammaglobulin von Pferden. .

Es gibt drei allgemeine Verfahren, um mit den immunologischen Indikatorsystesten der Erfindung Versuche durchzuführen. Es sind die Methoden nach dem chromatographischen Prinzip, nach dem Prinzip der Agglutination in einer Röhre und nach dem der Agglutination auf einem Objektträger
oder einer Platte· Die gewählte bestimmte Methode bestimmt in großen und ganzen die Größe der Mikrobenzellen, die
verwendet werden.

Für den Versuch nach Art der Chromatographie haben die Mikrobenzellen "bevorzugt die Form von ellipsoiden Stäbchen von etwa 0,3 "bis 0,4 Mikron Länge. Bei Agglutinations versuchen auf einem Objektträger können die Mikrobenzellen größere Stäbchen sein mit Längen von 1 bis 3 Mikron und Durchmessern von etwa 0,5 Mikron, unter der Voraussetzung, daß die Zellen auch eine Kokkenform besitzen können. Ein Agglutinaionsversuch im Röhrchen kann aus einem weiten Bereich von Größen der Mikrobenzellen aufgebaut werden, einschließlich von etwa 0,2 Mikron bis etwa 10 Mikron Ausdehnung in jeder Eichtung der Länge oder des Durchmessers.

Die Agglutinationsteste auf dem Objektträger und ia Röhrchen basieren auf der Fähigkeit des immunologischen Indikatorsystems zur Agglutination und der dadurch

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bedingten Bildung eines erkennbaren Unterschieds im Muster von den Mustern, die in Abwesenheit einer Agglutination gezeigt werden. Diese Art von Versuclfdurchführung kann in zwei allgemeinen Weisen durchgeführt werden, die im ersten Fall als Agglutination und im zweiten fall als Inhibierung der Agglutination bezeichnet werden. Bei der Agglutination wird ein Antigen an die Mikrobenzelle gekuppelt und dadurch ein Indikatorsystem gebildet, und dieses verwendet, um einen Test auf Am?senheit von homolo— gen Antikörpern in einer Probe durchzuführen· Wenn die Probe den Antikörper enthält, wird das Indikatorsystem mit dem Antikörper agglutinieren, und dieser Zustand kann durch das Muster erkannt werden, das vom Indikatorsystem gezeigt wird« Zur Inhibierung der Agglutination wird das Antigen an die Mikrobenzelle gekuppelt, wobei ein immunologisches Indikatorsystem gebildet wird, das dann mit dem homologen Antikörper verwendet wird zur Prüfung auf die Anwesenheit des Antigens in einer Probe, Wenn die ^robe das Antigen enthält, wird der homologe Antikörper inhibiert oder neutralisiert durch dieses Antigen und das Indikatorsystem wird nicht agglutiniert werden. Unter den Bedingungen des Uiebtagglutiniereaäwird das Indikatorsystem, das aus unlöslichen Mikrobenzellen und dem daran angefügten Antigen besteht, aus der Untersuchungsflüssigkeit abgesetzt und ein erkennbares Muster bilden, dna gegenüber dem Muster durch das agglutinierte Indikatorsystem unterschiedlich ist,

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Im lalle des Objektträgertests wird die Agglutination angezeigt durch die Bildung eines körnigen Musters, während in einem Röhrchentest die Agglutination durch eine gleichmäßige, einheitliche Suspension von Zellen angezdgt wird. Das Hichtagglutinieren im lalle des Objektträgertests wird durch die Bildung eines ebenmäßigen Musters angezeigt, und im Falle des Röhrchentests wird dieser Zustand durch das Sedimentieren des Indikatorsystems in das Rohrchenende angezeigt, entweder in einem ringförmigen oder flecken— förmigen Muster«

Dieselbe Art der Agglutination oder Inhibierung der Agglutination ist verantwortlich für die Untersuchung nach Art der Chromatographie, wobei dann, wenn die zu untersuchende Probe das bestimmte Antigen oder den Antikörper enthält, eine bestimmte Charakteristik der StoffWandlung auftritt, die durch die chromatographische Lösung wiedergegijii wird. Im Falle eines Tests der chromatographischen Art durch Agglutination wird ein Flecken des Indikatorsystems auf einen geeigneten chromatographischen Trtger, wie Filterpapier, gebracht, und dann ein Tropfen der auf die Anwesenheit des Antikörpers zu untersuchenden Probe auf denselben Fleck gebracht und die Kante des Trägers mit einer chromatographischen lösung in Berührung gebracht, wie einer Salzlösung* Wenn die Probe den Antikörper enthalf;, wird das Indikatorsystem agglutinieren und ein

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Immunkörperaggregat mit dem Antikörper bilden_e Dieses Aggregat wird sich nicht mit der fortschreitenden chromatographischen Lösung bewegen und der Heck wird sich wenig ändern« Wenn jedoch die Probe den Antikörper nicht enthält, wird kein Immunkörperaggregat gebildet und das Indikatorsystem wird dann mit der fortschreitenden lösung wandern und ein gestrecktes Muster bilden. TJm einen chromatographischen Test auf Inhibition der Agglutinierung durchzuführen, wird ein Fleck von Immunkörperaggregat dadurch gebildet, daß ein Tropfen einer Lösung, die einen Antikörper enthält, auf einen Flecken von dem aufgebrachten immunologischen Indikatorsystem aufgebracht wird. Ein Tropfen der

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Probe, die auf die Gegenwart dee Antigens untersucht werden soll, wird dann auf den Fleck von Immunkörperaggregat gebracht und eine Lösung am !Trägermaterial aufsteigen gelassen oder wahlweise die Kante des Trägers direkt mit der Probe in Berührung gebracht, um das Antigen, falls es vorhanden ist, in Berührung mit dem Flecken von Immunkörperaggregat zu bringen. Wenn die Probe das Antigen enthält, wird das Immunkörperaggregat dissoziiert wegen der bevorzugten Reaktion zwischen dem Antikörper und dem Antigen, und das Indikatorsystem wird wandern und ein gestrecktes Muster bilden. Wenn kein Antigen in der Probe vorhanden ist, wird natürlich keine Wanderung des Fleckens des Immüiakörperaggregats stattfinden.

Die genannten Ziele und die Beschreibung werden in den folgenden Beispielen näher erörtert. Teile sind Gewichts- oder Volumenteile, und die Pufferkonzentrationen werden molar angegeben, falls nichts anderes erwähnt ist.

Beispiel 1

Ein immunologisches Indikatorsystem wurde hergö-

stellt unter Verwendung von Zellen von Brucella abortus als Mikrobenzelle, bis-Diazobenzidin (BDB) als Kupplungsmittel und menschliches chorionisches Gonadotropin (GGrTH) als Antigen. Dieses Indikator sys tem wurde dann

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auf einen saugfähigen Träger, zusammen mit dem Antikörper an OGiEH, aufgebracht und Urinproben auf die Gegenwart von CGTH mit der erhaltenen Vorrichtung geprüft. Diese Indikatorvorrichtung funktionierte durch einen chromatographischen Mechanismus, wie nachfolgend beschrieben.

Herstellung von Reagenzien

Isotonische Salzlösung; Eine 0,85 $ige Salzlösung wurde hergestellt durch Lösen von 8,5 g Natriumchlorid in 1 1 destilliertem Wasser.

Phosphat-Puffer; Eine 0,15 m Pufferlösung vom pH-Wert 7,4 wurde hergestellt durch Lösen eines trockenen Gemisches aus 81 i» Dinatriumhydrogenphosphat und 19 % Matriumdihydrogenphosphat in destilliertem Wasser, bis der gewünschte pH-Wert erreicht war«

Bis-Diazobenzidinlösung; Zu 0,92 g Benzidin wurden 100 ml destilliertes Wasser und 6 ml 6n-Salzsäure gegeben. Ein zusätzliches Volumen destillierten Wassers von 100 ml wurde zu dieser Mischung gegeben. Nachdem das Benzidin gelöst war, wurde die Lösung auf O⁰C in einem Eiskochsalzbad gekühlt. Sobald sich in der Lösung Eiskristalle bildeten, wurde 6,5 ml einer 10 Tilgen Lösung von Natriumnitrit schnell unter Rühren zugegeben. Das

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Rühren wurde fortgesetzt bis die Lösung gegenüber Jodstärkepapier negativ reagiert. Während des Rührens sollte die Lösung niemals eine Temperatur oberhalb etwa I⁰O erreichen.

Dieses Material hatte eine blaß-gelbe Färbung. Wenn der Phosphatpuffer zugegeben wurde, wurde es rötlichbraun. Die blaßgelbe Lösung war bei Raumtemperatur 5 - 7 h stabil, bei 4°C war sie etwa 7 Tage stabil; wenn sie gefroren unter -2Q⁰Q gelagert war, war sie etwa 60 Tage stabil und wenn sie unter -35°C gelagert war, war sie wenigstens 6 Monate stabil.

Behandlung von Mikrobenzellen mit Formalin;

Zellen von Brucella abortus wurden 72 h bei 37°C auf Tryptoseagar gezogen und dann vom Agar mit einer 0,85 #igen Salzlösung mit einem Gehalt von 1 $> Formaldehyd abgewaschen. Die Zellen wurden sofort mit Formaldehyd behandelt durch Suspendierung in einer SaIz-Formaldöhydlösung über 24 Stunden bei Raumtemperatur (25°0). Die Zellen wurden dann gründlich gewaschen zur Entfernung des überschüssigen Konservierungsmittels. Das Waschen der Zellen von Brucella abortus wurde durch Suspendieren der Zellen in destilliertem Wasser durchgeführt. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt und erneut in destilliertem Wasser suspendiert,

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wobei diese Stufe mehrmals wiederholt wurde. Die konservierten Zellen wurden dann gefärbt. .

Färben von formalinbehandelten Mikrobenzellen;

2 g der mit Formalin behandelten Zellen von Bruceila abortus im nassen ge-packten Zustand, 1 ml 2 ?Siger Eisen-Il-Sulfatlösung und 5 ml 1 #iger wässriger Hämatoxylinlösung wurden zu 100 ml destilliertem Wasser gegeben und 24 h fortwährend gerührt. Die Zellen färbten sich permanent, und die Färbung laugte nicht aus.

Herstellung des Indikatorsystemsi

j(formalinbehandelte Mikrobenzellen-BDB-OGTH). Brucella abortus-Zellen, die mit Hämatoacylin, wie oben, gefärbt waren, wurden als Indikatorpartikel für menschliches OGTH verwendet, iias von der Vitamerican Corp., Little Falls, New "Jersey, erhalten worden war. Ein Volumen von 0,5 g paketförmiger, gefärbter Zellen.wurden zu 10 ml Salzlösung mit einem Gehalt yron 20 mg CGiDH gegeben und. danach 12 ml Phosphat-Puffer und 40 ml verdünnter BDB-Lösung zugegeben/ die durch Mischen von 8 ml der oben genannten BDB-'Löeung mit 32 ml Pkosphatpuffer hergestellt'warI Die Kupplungereaktion schritt unter fortwaln*endem Eunren 20 min bei Raumtemperatur (25°C) fort. Der erhaltene braune Komplex wurde dann cUmsb Zentrifugieren gesammelt und dreimal durch Zentrifugieren

mit destilliertem Wasser gewaschen. Da es gewünscht wurde, dieses Indikatorsystem auf einen saugfähigen Träger zu bringen, wurde eine Portion von 0,2 g des Indikatorsystems in einem Mörser homogenisiert. Dieses wurde gründlich mit einem Tropfen 1 #igen Merthiolat und 1 g Sucrosesyrup (75 Gew.-fi/V) langsam zugefügt.

Herstellung des Antikörpers zu CGTH:

Laboratoriumskaninchen wurden mit menschlichem CGTH in einer vollständigen Lösung des Reagenz von Freund in einer Reihe von Injektionen injiziert. Nach einer vorgegebenen Zeitspanne wurde den Kaninchen Blut entnommen und das °erum, das den Antikörper enthielt, vom ganzen Blut getrennt. Das verwendete CGTH kann von jedem Händler dieses Produkts bezogen werden. Besonders brauchbar ist das der Vitamerican Corporation, welches eine Aktivität von etwa 2000 bis 2500 Internationalen Einheiten (I.TJ.) pro mg hat. Eine typische Injektionsgewinnung und Trennung des Antikörpers geschieht wie folgt: Eine Lösung mit einem Gehalt von 10 mg/ml CGTH in Salzlösung wurde in gleichen Mengenverhältnissen mit Freundscher Lösung gemischt. 1/10 (0,1) ml der Mischung wurde in jede Zehenkuppe eines Kaninchens das 3»5 kg wog, injiziert. Am Ende von zwei Wochen wurde eine erste Ladung von 0,5 ml einer Lösung mit

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5 mg/ml CGTH in Salzlösung intravenös injiziert. Zwei Tage nach der ersten Injektion wurde eine zweite gegeben. Blutproben aus dem Kaninchen wurden sieben Tage nach der letzten Injektion entnommen. Die Intiseren hatten einen Titer von 1/2560 gemäß der Bestimmung durch Hämagglutination

Methode der Untersuchung (Chromatographie)ί

Ein Flecken des wie oben hergestellten Indikatorsystems wurde etwa 19 mm von der Kante eines Stücks Filterpapier aufgebracht und ein Tropfen des genannten ^ntiserums darauf gebracht zur Bildung eines Immunkörpe^ggretats. Die Papierkante wurde dann in Berührung mit einer normalen Urinprobe nichtsehwangeren Ursprungs gebracht. Uenri der Urin an dem Papier aufstieg, blieb der Flecken des Immunkörperaggregats auf dem Papier sitzen. Dies zeigte, daß das Immunkörperaggregat nicht durch die normalen Urinkomponenten dissoziiert wurde. Ein anderer Filterpapierstreifen wurde mit einem anderen Flecken Immunkörperaggregats versehen und die Papierkante in Berührung mit einer Urinprobe von einer schwangeren Frau gebracht. Wenn der Urin an dem Papierstreifen aufstieg, dissoziierte ein Teil des Immunkörperaggregate und verursachte ein Strecken oder eine Wanderung des gefärbten Indikatorsystems rom Aggregatfleoken auf-

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wärts, welcher dementsprechend eine hellere Färbung aufwies.

In einem anderen Versuch wurden die Flecken von Immunaggregat auf verschiedene Papierstreifen gebildet und dann die Urinproben auf diese Flecken getropft. Die Kanten der Streifen wurden dann in Berührung mit physiologischer Kochsalzlösung gebracht. " Wenn die Salzlösung sich über die Flecken bewegte, die mit Urin von einer schwangeren Frau behandelt waren, wanderte ein Teil des gefärbten Indikatorsystems und verursachte ein gestrecktes Muster. Ein relativ geringes Ausmaß von Streckung wurde gefunden, wenn die Salzlösung auf die Flecken zuwanderte, die mit normalem Urin von nichtschwangeren behandelt war.

Es wurden Versuehsvorriehtungen aufgebaut für das Untersuchen auf die Gegenwart eines Antikörpers zu menschlichem CGTH, indem Flecken des genannten Indikatorsystems etwa 19 mm von der Ecke von Filterpapierstücken aufgebracht wurden. Ein Tropfen von Kaninchenserum, welches den Antikörper enthielt, wurde dann auf einem Flecken des Indikatorsystems auf einen der Streifen gebracht und die Kante darauf in Berührung mit physiologischer Kochsalzlösung gebracht. Sie Salzlösung bewegte sich über den Flecken

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hinaus ohne ein Streifenbilden des Indikatorsystems, was anzeigte, daß ein unlösliches Immunkörperaggregat gebildet worden war. Sin Tropfen normales Kaninehenserum wurde dann in ähnlicher Weise untersucht und das Indikatorsystem.wanderte vom Plecken fort, was anzeigte, daß kein Immunaggregat gebildet worden war·

Das genannte Indikatorsystem zeigte auch eine Agglutination durch Antikörper gegenüber menschlichem GGTH in Versuchen, die durch Agglutinationen in dem Röhrchen durch geführt wurden. Diese Agglutinationen wurden leicht durch einen Zusatz kleiner Mengen einer Lösung mit CGTH zum Testmedium inhibiert.

Bei der Herstellung der diagnostischen Zubereitung auf einem saugfähigen Träger unter Verwendung «Ines Indikators aus Mikrobenzellen ist es wesentlich, daß das Zellmaterial durch eine Behandlung mit Konservierungsmitteln, gemäß der Besehreibung, stabilisiert wird.

Eine andere Indikatorvorrichtung kann aufgebaut werden durch Mischern des genannten Indikatorsystems mit dem Antikörper zur Bildung eines ImmunkÖrperaggregate, Absetzen eines einzelnen Fleckens auf ein Sebiet, das τόη der Streifenkante entfernt ist und Trocknen.

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ig

Zur Verwendung wird ein Tropfen einer Urinprobe auf diesen Flecken gebracht, oder zwischen diesen Flecken und der Kante, und das Streifenende in eine Salzlösung gebracht. Wenn der Urin OGTH enthält, wird das Aggregat dissoziieren und dem gefärbten Indikatorsystem erlauben, mit der Salzlösung zu wandern und ein gestreiftes Aussehen annehmen. Wenn kein CCxTH anwesend ist, wird keine Änderung auftreten.

Wahlweise kann die Urinprobe als chromatographische Lösung, wie oben, verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Vorrichtung erstellt durch Herstellen des diagnostischen Reagenzes in Streifenform, beispielsweise durch Auftragen eines Bandes des Indikatorsystems und des Antikörperaggregates etwa 15 mm von der Längskante eines Streifens der Grosse 13 χ 26 cm von Eaton-Dikeman Fr. 6o9 Filtrierpapier, Trocknenlassen des Reagenzes bei Raumtemperatur, Schneiden des Papiers in Streifen der Breite nach und Aufbewahren in geeigneten Behältern bis zum Gebrauch.

Es ist leicht ersichtlich, dass viele verschiedene Materialien in dem Versuch mit saugfähigen Streifen verwendet werden können. Z.B. können viele Arten chromatographischen Materials verwendet werden und auch viele Arten chromatographischer Entwicklerflüssigkeiten.

Beispiel 2

Eeeherichia coil wurde als Indikatorpartikel verwendet sum Aufbau eines immunologischen Indikatorsystems aus Mikrobeneellen-BDB-CGTH. Dieses Indikatorsystem wurde zusammen mit

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dem Antikörper für OGTH für einen Agglutinationstest auf dem Objektträger verwemdet und klinische Schwangerschaftshestimmungen damit durchgeführt..

Herstellung der Reagenzien

o,85 #-ige Salzlösung; 68 g natriumchlorid wurden in 8 1 destilliertem Wasser gelöst und die Lösung hei 1,1 atü und 25o°O 13 Minuten im Autoklaven erhitzt, Sie wurde darauf gekühlt und hei 4°G gelagert. Die Behandlung im Autoklaven wurde zur Sterilisation der Salzlösung durchgeführt.

fformaldehydlösung: Eine 37 #-ige Eormalinlösung wurde durch Zugahe von pulverisiertem Oalciumcarhonat zur Lösung und Stehenlassen für 24 his 48 h behandelt. Das Überstehende wurde in einen anderen Behälter gegossen und dreimal durch ein hochgradiges weisses Filtrierpapier mit gewellter Oberfläche filtriert. Wenn der pH-Wert niedriger als etwa 7»ο war, wurde er auf diesen pH-Wert mit o,1 jS-iger MaOH-Lösung eingestellt. Eine ausreichende Menge der so behandelten Lösung von 37 i° Formalin wurde zu destilliertem Wasser gegeben, bis eine 1 #-ige Lösung erhalten wurde.

Phoβphatpufferlösungt 1oo ml eines Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,4 wurde hergestellt durch Mischen von 8o,8 ml einer Hatriumphosphatlösung mit 19,2 ml einer Kaliumphosphatlösung bei 2o*ö. Die liatriumphoephatlösung enthielt 53,726 g Na₂HPO.* 12H₂O pro Liter destilliertem Wasser· Die laliumphosphatlösung enthielt 2o,4H g von KH₂PO* pro Liter destilliertem Waeser.

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Bis-Diazobenzidin (BDB): ο,64o g Benzidin . 2 HCl wurden · in 1 oo ml einer ο,56 #-igen HCl-Iosung in einem Erlenmeyerkolben aus Pyrex-Glas gelöst. Dieser Kolben wurde auf einer eisgefüllten Schüssel eines Magnetrührers mit eingetauchtem Magnetrührer in der lösung niedergesetzt· Wenn die Temperatur 4°G erreicht hatte, wurden 5 ml einer aliquoten Lösung von Batriumnitrit bei 4°C, hergestellt durch Zugabe von o,68o g ITaIiO₂ zu 1 ο ml destilliertem Wasser in eine seriologische Pipette aufgenommen und tropfenweise zur Benzidin-lösung während 7 bis 1o Minuten einheitlich zugegeben, unter Rühren bei 2oo U/min (1 Iropfen/4-6sec.) Diese lösung wurde 2o Minuten kontinuierlich weiter gerührt, nach welcher Zeit sie sofort gefroren und bei -6o°C in einer Reihe von Flaschen von 1,7 g Inhalt aufbewahrt. Diese lösung zersetzt sich selbst bei ο - 5°C, weshalb das Einfrieren zur Erhaltung der Stabilität verwendet wurde. Sie kann auf die Grebrauchstemperatur im Bedarfsfall erhöht werden.

Antikörper zu OGIH: Eine Emulsion aus 1o mg CGTH/ml wurd^ hergestellt durch lösen von 1oo mg gereinigtem CGrTH in 5 ml der obigen Salzlösung, Zugabe von 5 ml einer gründlich gemischten Freundschen lösung und Schütteln zur Herstellung einer gleichförmigen Emulsion. Eine Menge von o,2 ml der Emulsion wurde In jeden Pussballen eines gesunden Kaninchens injiziert, das unter üblichen laboratoriumsbedingungen gehalten wurde, so dass insgesamt o,8 ml der Emulsion (3 mg CG-TH) injiziert wurden.

Dem Kaninchen wurde danach ein® Reihe von Injektionen verabreicht, deren jede aus o,5 ml einer lösung bestand, die durch

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Lösen -von ninreichend gereinigtem CGTH in der o,85 #- Salzlösung bis zu einer Konzentration von 5 mg/au, hergestellt wurde. Die Injektionen wurden in die Ohrvenen gegeben. Biese aufeinanderfolgenden Injektionen wurden an folgenden Sagen nach der ersten Emulsionsinjektion gegeben: Am 22., 24. $ 38., 4o., 71., und 73. Tag. Zwei Proben von 4o - 5© a»X Blut wurden dem Kaninchen mittels Herzpunktierung jeweils am 5©» und 83. Tag entnommen. Die Blutzellen dieser Proben wurden dann vom Serum jeder Probe getrennt, indem das Blut in einem SSentrifugenglas klumpen gelassen wurde, bei etwa 25°G während etwa 2 h, das überstehende Serum wurde dann in ein Röhrchen kleinen Durchmessers (weniger als Jo mm) gegeben und das "Röhrchen in ein Wasserbad 3o min bei 56°O eingetaucht.

to mg mit Formalin behandelten roten Blutkörperchen vom Schaf (lyophilisiert) wurden dann zu jedem ml der Serumprobe zugegeben und 15 min bei etwa 25*0 gemischt, uia heterophiXe Antikörper aus dem Serum zu absorbieren» Das absorbierte Serum wurde dann d^urch Zentrifugieren von den Zellen abgetrennt bei etwa tausendfacher Schwerkraft.

Eine Menge von 4o ml Schafsblutkörperchen in Paekenform wurden für diese Absorption durch Zentrifugieren und Absaugen der überstehenden Flüssigkeit aus 2oo ml frischem rotem Schafeblut in einer Alserverschen Lösung hergestellt» danach dreimal mit einer o,85 #-igen Salzlösung, unter Verwendung von 12o 2oo ml Se-Izlösung pro Spülung, gewaschen. Zu diesen Zellen wurden 46ο ml der genannten SeIsIosung gegeben und 5oo ml einer 3 #-igen Formalinlöaung von einem pH-Wert 7,3. Die

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erhaltene Suspension wurde gemischt und 18 - 2 ο h bei 37°G stehengelassen. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugieren entfernt und fünfmal mit etwa 2oo ml destilliertem Wasser pro Spülung gewaschen. Genügend destilliertes Wasser wurde zugegeben, um eine 1o #-ige Zellsuspension zu erhalten. Di4se Suspension wurde bei 4°0 bis zur Verwendung bei der Absorption aufbewahrt.

Mikrobenzellent Esoherichia coli-Zellen wurden erhalten durch eine Kultur eines EingeweideabStriches aus einem toten laboratoriumskaninchen in einer Gehirn-Herz-Infusionsmaische (BHI). Ein Volumen von 68 ml einer gut wachsenden Kultur (18 h) wurde verwendet, um 3 1 BHI zu beimpfen, welches vorher auf Sterilität geprüft worden war. Die Zellen wurden dann 4 1/2 h bei 37*0 unter Schütteln inkubiert. Die erhaltenen Zellen wurden als von einheitlicher Grosse und Form befunden.

Herstellung des Indikatorsystem: Die 3 1 suspendierter Zellen von Escherichia coli wurden bei 1o ooo ü/min 1o min zentrifugiert, um die überschüssige Feuchtigkeit aus den dichtgepackten Zellen zu entfernen. Die überstehende Flüssigkeit wurde abgesaugt und die verbliebenen Zellpackungen mit etwa 45 ml einer Eormaldehydlösung, die mit Oalciumcarbonat behandelt war, in Berührung gebracht, um die Abtötung der E.coli zu bewirken. Das Formalin wurde in Kontakt mit den Zellen 1 h belassen, nach welcher Zeit die Zellen dreimal mit der obigen Salzlösung gewaschen und danach in 16oo ml einer 1 ?6-igen Formaldehydlösimg 41 h bei Raumtemperatur (25°C) suspendiert. Diese Zellen wurden dann zentrifugiert und als gepackte, mit

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Konservierungsmittel "behandelte Zellen zurückgewonnen. Diese Zellpackungen wurden dann erneut in 5oo ml der obigen Salzlösung suspendiert und bei 4⁰O gelagert. Die Zellkonzentration betrug 4 ft It. Messung durch einen Hämatokriten.

Ein Teil der obigen Suspension von Zellen wurde zentrifugiert zur Wiedergewinnung eines Volumens dichtgepackter Zeilen und o,5 ml dieser Zellen entfernt und zu 1o ml der obigen Salzlösung gegeben, zu welcher vorher 2o mg OGiDH, 12 ml des Phosphatpuffers und 4o ml verdünnter BDB-Eösung gegeben waren, die durch Vereinigen von 8 ml BDB mit 32 ml des Phosphatpuffers hergestellt worden war. Das CGITH hatte eine Aktivität von 3600 I»TJ./mg und wurde von der Vitamerican Oorp. erhalten. Dieses Gemisch wurde kontinuierlich 2o min bei Raumtemperatur gerührt und danach das gebildete Indikatorsystem wiedergewonnen durch Zentrifugieren, und dreimal mit der obigen Salzlösung gewaschen, danach zentrifugiert, erneut in einer 1 : 5o-Verdünnung von Rinderserumalbumin (3o $>) in der obigen Salzlösung suspendiert. Das Rinderserumalbumin, BSA, wurde von der !Firma Armour and Go. erhalten.

Die erhaltene Suspension des Indikatorsystems zeigte eine bräunliche Färbung und wurde als stabil über einen weiten Temperaturbereich befunden.

Vorläufige Untersuchung mit dem Indikatorsystem

Zur Bestimmung der geringsten noch entdeokbaren Mengen CGTH wurden Proben von normalem Urin vorbereitet duroh Zusatz bekannter Mengen CGTH. Dann wurde das obige vorbereitite Indikatorsystem, zusammen mit dem Antikörper zu CGTH (Ab-CGTH)

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st

zur Durchführung eines Agglutinationstests auf dem Objektträger verwendet. Hierzu wurde das Indikatorsystem in einer genügenden Menge BSA-Salzlösung im Verhältnis 1 : 5ο erneut suspendiert, wobei eine 8 #-ige Zellkonzentration erhalten wurde. Danach wurden drei Verdünnungen der Antikörper lösung durch Verdünnen eines Teiles der Antikörperlösung mit 25o, 5oo und 1ooo Teilen der Salzlösung hergestellt. Diese Verdünnungen wurden etikettiert mit 1 : 25o; 1 : 5oo bzw. 1 : 1ooo. Dann wurden Urinproben der folgenden Konzentrationen an OGTH durch Zugabe von o,25 ml einer Stamralösung von 4 mg GGTH/ml Salzlösung (36oo I.U./mg) zu 1oo ml einer nichtschwangeren weiblichen normalen Urinprobe und Reihenverdünnung mit Salzlösung hergestellt: 2,25; 4,5; 6; 9; 18 und- 36 1.0. CGTH/ml Urin und Salzlösung. Ein Teil der Urinprobe wurde als Kontrollversuch beseite gesetzt.

Ein Tropfen jeder der Urinproben wurde mit einem Tropfen der geeigneten Antikörperverdünnung gemischt und auf einen Objektträger gebracht. Danach wurde ein Tropfen der 8 #-igen Suspension des Indikatorsystems zu den bereits auf dem Objektträger befindlichen Zellen gebracht und vermischt. Die Ergebnisse dieser Versuchsreihe sind in Tabelle I angegeben, wobei ⁿ-ⁿ Agglutination bedeutet und daher ein körniges Bild bei der Suspension auf der Objektträgerplatte darstellt und ^w+ⁿ ein ebenmässiges nicht agglutiniertes Muster auf dem Objektträger darstellt.

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lamelle I

GGTH-Konzentration Verdünnungen Ab-CGTH im TTrin

I.U./ml 1:25o 1:5oo 1:1ooo

0 Kontrolle

2,25 -

18,o + + +

36,o + + +

Tabelle I zeigt, class wenn kein GGTH im Urin anwesend ist, eine Agglutination stattfindet, deswegen, weil die Urinprobe kein CGTH anthält, welches vorzugsweise mit dem Ab-GGTH reagieren kann und daher der Antikörper mit dem Indikatorsystem agglutiniert und .eine körnige Erscheinungsform von geklumpten oder gehäuften Zellen über der benetzten Fläche der Obj^jektträgerplatte bildet. Durch Zugabe von 2,25 I.U./ml CGTH zur Urinprobe ist noch genügend Ab-GGTH im System enthalten, um mit allem CGTH zu reagieren und ein Verklumpen der Zellen oder eine Agglutination selbst bei der Verdünnung 1 : 1ooo zu verursachen. Wenn die Urinprobe mit 4,5 I.U./ml mit den drei Verdünnungen von Ab-CGTH untersucht wurde, reagiert der Antikörper vollständig mit dem CGTH zwischen den Verdünnungen von 1 : 5oo und 1 : 1ooo, so dass das Muster für die Verdünnung 1 : 1ooo nicht körnig, sondern ein ebenmässiges Muster

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von Zellen des suspendierten Indikatorsystems ist, welches keine Agglutiaation zeigt. Man kann sehen, dass mit 6,0 I.U. CGTH/ml die notwendige Menge Antikörper zwischen den Verdünnungen 1 : 250 und 1 : 5oo auftritt, wie erwartet werden kann, da eine grössere Menge CGTH anwesend ist und deshalb eine grössere Menge Ab-CGXH notwendig ist, um vollständig mit dem CGTH zu reagieren, damit ein körniges Muster bei der Verdünnung 1 : 25o auftreten kann. Aus Tabelle I kann entnommen werden, dass sehr geringe Mengen von etwa 4,5 I.D". CGTH/ml Urin erkannt werden können durch die Verwendung niedriger Konzentrationen des Ab-CGTH im Versuchssystem, nämlich eine Verdünnung von 1 : I000 oder weniger. Es wurde ebenfalls gefunden, dass durch Verdopplung der Urinmenge auf 2 Tropfen schon 2 I.U. CGTH/ml Urin entdeckt werden können.

Um die genauen Entwicklungszeiten des körnigen Musters über einen Bereich von Ab-CGTH und Zellkonzentrationen zu bestimmen, wurden die folgenden zusätzlichen Versuche durchgeführt .

Portionen des Indikatorsystems wurden erneut in ausreichenden Mengen der 1 : 5o-Verdünnung von BSA in Salzlösung suspendiert zur Herstellung von Zellkonzentrationen von o,625 1,25 $>, 2,5 % und 5 #. Darauf wurden eine Reihe von Verdünnungen von Ab-CGTH-lösungen mit dem genannten BSA in Salzlösung im Verhältnis 1 : 5o hergestellt und Verdünnungen von 1 : 125, 1 : 25o, 1 : 5oo, 1 : I000, 1 : 2ooo, 1 : 4000, 1 : 8000 und 1- : 16 000 erhalten. 4 Tropfen jeder der Ab-CGTH-Verdünnungen in getrennten parallelen Reihen wurden über die Fläche einer

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über Kreuz schraffierten Glasplatte aufgetropft. Zum ersten Tropfen jeder dieser Verdünnungen wurde 1 Tropfen der niedrigsten Konzentration der Suspensionen der Zellen des Indikatorsystems zugegeben. Zum zweiten Tropfen jeder Ab~ÖGTH-Verdünnung wurde 1 Tropfen der 1,25 #-igen Suspension gegeben und zum 3. und 4. Tropfen jeder der Verdünnungen 1 Tropfen der 2,5 56-igen bzw. 5 $-igen Zellsuspension gegeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle II enthalten, in der die Entwicklungszeit eines körnigen Agglutinationsmusters in Sekunden für jede der Versuchsmischungen angegeben ist. Ein ¹¹S¹¹ zeigt an, dass ungenügend Ab-GGTH in der bestimmten Antikörperverdünnung vorhanden war, um eine Agglutination der Zellen zu^ verursachen und daher blieb das Muster ebenmässig.

golgt Tabelle II

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	Konzentration des Indicator- systems, $>	1	0,625	:125	Tabelle II	Verdünnungen des	Ab-CGTH	1:4000	•	1:16000
	1,25	34		1:500 1:1000	1:2000	280	1:8000	S
	2,5 5,0	31	Agglutinationszeit, Sekunden	213 85	107	150	S	S
		25 35		36 58	56	140 S	120	S S
			1:250	43 62 55 60	92 75		S S
			50
1 O 9 8 1E		30
"Ν». CO Ca» <O	31 30

Die Agglutinationszeiten gemäß Tabelle II zeigen, daß eine relativ kurze Zeitspanne notwendig ist, die Agglutination zu bestimmen, welche in einem tatsächlichen Versuch einen Uegativtest auf Schwangerschaft darstellt* Daher kann die Schwangerschaft durch einen Agglutinationsversuch auf dem Objektträger mit dem genannten Indikatorsystem in etwa 1 min oder weniger ausgeschlossen werden. Dies ist eine weit kürzere Zeitspanne, als sie für die Agglutinationssysteme auf der Basis rbter Blutkörperchen im Versuchsröhr^hen erforderlich ist» Ebenfalls sind die Muster, die die Agglutination von einer Nichtagglutination unterscheiden, sehr klär markiert. Es werden bei diesen Versuchen hauptsächl"^h unzweifelhafte Zwischenmuster gezeigt. Es ist daher möglich, die Reagenzien so auszuwählen, daß klar definierte Muster, die für eine Schwangerschaftsdiagnose notwendig sind, erhalten werden können.

Tabelle II zeigt auch, daß ein weiter Bereich von Ab-CGTH-Verdünnungen ebenso wie ein weiter Bereich von Indikatorkonzentrationen verwendet werden kann. Die Konzentration des Indikatorsystems in der Verdünnung von BSA in Salzlösung 1 : 50 kann von weniger als 1$ bis etwa 12$ bei einem brauchbaren Testsystem schwanken«,

TJm das Indikatorsystem von Beispiel 2 mit tatsächlichen Urinproben zu untersuchen, wurden ürinproben von sechzehn

BAD ORIGINAL

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nichtschwangeren Frauen gesammelt, von denen vier ein regelmäßiges Einnahmeprogramm von empfängnisverhütenden Pillen einhielten« Die Untersuchungsmethode war die gleiche wie oben angegeben. Das heißt, ein Tropfen des Urins wurde mit einem Tropfen einer Verdünnung von Ab-CG-TH wie 1 : 1000 gemischt und dann ein Tropfen dieser Mischung auf einen Objektträger gebracht und ein Sropfen einer 4$-igen Suspension des genannten Indikatorsystems zu dem Gemisch auf dem Objektträger zugefügt. In allen sechzehn Fällen zeigte ein körniges Muster eine Agglutination an, und deshalb wurde keine Schwangerschaft festgestellt. Diese Untersuchung liefert den begrenzten Beweis, daß falsche positive Ergebnisse nicht zu den Schwierigkeiten des genannten Indikatorsystems gehören, und daß bei dieser besonderen Untersuchungsart Hormonspiegel, die aus aktiven empfängnisverhütenden Programmen stammen, nicht stören₀

Klinische Untersuchung unter Verwendung des Indikatorsystems

31 gefrorene Urinpröben wurden gesammelt und Versuche als Vergleichsstudie durchgeführt, wobei die Zustände der Patienten, von denen die Proben genommen waren, nicht bekannt waren. Ein bekannter Schwangerenurin wurde als Kontrollversuch eingeschaltet und ein bekannter Urin von einer Nichtsehwangeren wurde als eineweitere Kontrolle eingeschaltet. Es wurden in der genannten Weise Objektträgerversuche durchgeführt und gegen Objektträgerversuche

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- jfc -

verglichen, die mit denselben Urinproben durchgeführt waren mit einem handelsüblichen Öbjektträgerversuch für Schwangerschaft, der auf einem Indikatorsystem aus iatexpartikeln in Kombination mit CGTH beruhte.

Das Indikatorsgcstem wurde als 4$-ige Suspension verwendet. Die Antikörperlösung bestand aus einer 1 : 1000 Verdünnung der obigen Antikörperlösung in Salzlösung,, Das Untersuchungsverfahren bestand im Mischen eines Tropfens jeder Urinprobe zusammen mit einem Tropfen der Antikörperlösung und Aufgeben eines Tropfens dieser Mischung auf eine saubere Objektträgeroberfläche und Zugabe eines Tropfens der 4$-igen Indikatorsystemsuspension und Mischen«, Die Ergebnisse wurden dann als positiv (+) wiedergegeben, wenn ein ebenmäßiges Muster zeigte, daß die Agglutination inhibiert war und daher Schwangerschaft angezeigt wurde und ein negatives Resultat (-) bei der Gegenwart eines körnigen Musters, das Agglutination und damit FichtSchwangerschaft anzeigte«

Der handelsübliche Test wurde genau gemäß der beigepackten Anweisungen durchgeführt und die Resultate hinsichtlich der Gegenwart oder Abwesenheit von Schwangerschaft aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle III aufgeführt.

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Tabelle III
Ergebnisse klinischer Untersuchungen - "

Unbekannte Urinproben Indicator-System Handelsüblicher

nach Beispiel 2 Schwangerschaftstest

1 +

2 +

8 + keiner

9 + ■ +

10 + -

11 +

12 + +

13 + +

14 + +

15 + +

16 +

17 + -

18 +

19 + +

20 . +

21 + +

22 + keiner

23 +

24 . + +

25 +

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(Fortsetzung Tabelle III)

unbekannte Urinproben Indicator-System Handelsüblicher

nach Beispiel II Schwangerschaftstest

26 / + +

27 + +

28 + +

29 + +

30 · + keiner

31 + keiner

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Aus der Tabelle kann entnommen werden, daß alle der ein— unddreißig Urinproben gemäß dem Indikatorsystem von BeispielXals von schwangeren Frauentierstammend angezeigt wurden. SIf von den 27 Urinproben, die mit dem handelsüblichen Schwangerschafttest untersucht wurden, wurden negativ befunden, was keine Schwangerschaft anzeigt. Hinterher stellte sich heraus, daß alle der unbekannten Urinproben von schwangeren Frauen stammten, wobei die Empfängnis von einigen Wochen bis 8 1/2 Monaten schwankte·

Der eine von einer schwangeren Frau stammende Urin und der eine bekannte Urin einer Nichtschwangeren wurden nur mit dem Indikatorsystem des Beispiels 2 untersucht und daher nicht in Tabelle III eingefügt. Die Resultate gaben das erwartete Ergenis, ein negatives Resultat bei dem Niehtschwangerenurin und ein positives für den Schwangerenurin, der aus der achten Woche nach der Empfängnis stammte.

Beispiel 3

Im Unterschied im Beispiel 2 wurde ein Indikatorsystem gemäß einer Zweistufenreaktion durch Zugabe zunächst von den Zellen von E.coli zu einer Pufferlösung und danach zu einer Zugabe einer Lösung von BDB zur Bildung eines immunologischen Indikators hergerichtete Zur Herstellung eines Indikatorsystems wurde dazu eine lösung von CGTH zugegeben

und die Kupplungsreaktion durchgeführt,,

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Herstellung der Reagenzien

Phosphatgepufferte Salzlösung, pH-Wert 7,0: 150 ml einer lösung von Dinatriumphosphat und Kochsalz wurde auf einen pH-Wert 7,0 mit 75 ml einer lösung aus Mononatriumphosphat und Kochsalz eingestellt. Die erste Lösung wurde durch Mischen von 150 ml einer 0,5 m Ha₂HPO* * 7H₂O-Losung mit 350 ml destilliertem entionisiertem Wasser und 500 ml einer 0,85#-igen Salzlösung hergestellte Die lösung aus Mononatriumphosphat und Kochsalz wurde hergestellt durch Mischen von 150 ml einer Lösung von 0,5 m KaH₂PO. ο HgO mit 550 ml destillliertem entionisiertem Wasser und 500 ml einer OyBS^igen Salzlösung»

Salz-Phoaphatpuf fer, pH-Wert 7,5:· 18Ό _mi der obigen Lösung von Dinatriumphosphat und Salz wurde auf einen pH-Wert 7,5 mit der genannten Lösung von Mononatriumphosphat und Salz eingestellt.

BDB-Lösungg Ein Volumenteil einer 0,25 m Lösung von Benzidin · 2HCl in O_r36 m HCl wurde zu einem Volumenteil von 0>1 m NaHO₂ destilliertem; entionisiertem HgO gegeben und die erhaltene Mischung 2 Minuten reagieren lassen* Es wurde dann auf einen pH-Wert 7»0 mit einer Mischung gleichen Volumens des genannten Kochsalzpho^hatpuffers vom pH-Wert 7_rO und 0,31 m NaOH iß destilliertem Wasser titriert. Sofort danach wurden 6 ml und 2 ml aliquote Teile

der B&B-Lösung in Behälter gebracht, die mit Stöpseln versehen, verschlossen und auf - 83,3°C gefroren warden. Das BDB wurde auf 4⁰C aufgetaut, wenn es gebracht wurde.

Zellen von Eocoli wurden in der in Beispiel 2 genannten Weise mit Formalin behandelt und dann als eine 1,456-ige Zellensuspension aufgearbeitet und in ein Zen— trifugenröhrchen von 50 ml pipetiert und bei 3100 5 U/min zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde dann verworfen und die. dichtgepackten Zellen suspendiert, indem sie zunächst auf einen vOrtexring gemischt wurden, bis ein ebenmäßiges Präparat erkennbar war, und dann 20 ml der Salzlösung des Beispiels 2 zugegeben« Die Zellen wurden darauf zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit verworfen. Diese Salzwaschlösung wurde n&h 2-mal für weitere Waschungen verwendet. Eine Menge von 0,2 ml der erhaltenen dichtgepackten Zellen wurden in 2 ml der genannten Salzlösung suspendiert. Diese Suspension wurde dann bei 4⁰O eine Stunde gelagert. Nach dieser Zeit wurden 2 ml einer Verdünnung 1 t 5 der BDB-Iiösung in der Phosphatlösung des Beispiels 2 zugegeben und auf einem Rotationsschüttler bei 4° 30 Minuten im Dunkeln geschüttelt. Die Zellen wurden 5 min bei 4⁰C zentrifugiert und 2-mal mit 4 ma» kaltem Phosphat-Salzpuffer vom pH-Wert 7 _f5 gewaschen und eine relativ stabile Suspension erhalten.

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Danach wurden 1,6 ml des kalten Salz-Phosphatpuffers vom pH-Wert 7_f5 und 0_#8 ml CTGH in 6 ml Salzlösung (4 mg pro ml) zu der Zellensuspension gegeben» Das erhaltene Indikatorsystem wurde für den Versuch vorbereitet durch Waschen des Präparats einmal mit 25 ml BSA in Salzlösung im Verhältnis 1 ι 50» Zentrifugieren über 5 min bei 3000 U/min und wieder Suspendieren mit dem Vortexring. 0,9 ml einer Lösung von BSA in Salzlösung im Verhältnis 1 t 50 wurde dann zugegeben, um das Indikatorsystem wieder zu suspendieren zur Lagerung im Kühlschrank. Eine Menge von 0^3 ml des Präparats wurde auf einer Schüttelmaschine bei Zimmertemperatur 4 Stunden geschüttelt* Die Suspension wurde danach 2—mal in der genannten Salzlösung gewaschen und 1-mal mit BSA in Salzlösung 1 : 50. Die Zellen wurden dann erneut in 0,3 ml der BSA-Salzlösung 1 s 50 suspendiert, wonach eine Zellenkonzentration von 10$ erhalten wurde.

Danach wurde ein indirekter Agglutinationsversuch durchgeführt durch Mischeen eines Tropfens der Zellensuspension mit einem Tropfen von jeweils 3 ansteigenden Verdünnungen von Antikörperlösungen. Die Verdünnungen betrugen 1 t 250, 1 s 500, 1 t 1000. Ein ebenmäßiges Muster, das eine gute indirekte Agglutination anzeigte, wurde für beide bei der Verdünnung 1 t 1000 gebildet, aber nicht so stark wie die anderen beiden, was als ebenmäßige Agglutination angesehen wurde« Dies zeigt, daß das Indikatormaterial

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gemäß der Erfindung hergestellt und getrennt davon gelagert werden kann und danach zur Kupplung an die Antigenmaterialien verwendet werden kann, die später für die Untersuchung verwendet werden können»

Beispiel 4

Ein immunologisches Indikatorsystem wurde hergestellt zur Prüfung von Urinproben auf Gegenwart von CGTH durch Kuppeln von menschlichem CGTH an Hefezellen durch das chemische Kupplungsmittel BDB. Das Indikatorsystem wurde im Zusammenhang mit dem Antikörper für CGTH verwendet, um eine Inhibierung des Agglutinationstestes auszuführen.

Ein Gramm Saccharomyces cerevisiae wurde eingewogen und dreimal mit 200 ml der genannten Salzlösung gewaschen» Die verwendete Hefe wurde unter der Handelsbezeichnung KLeischmann's Active Dry Yeast gehandelt. Die Hefezellen wurden dann in 400 ml 1^-iger Pormaldehydlösung in Salzlösung wieder suspendiert. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur 24 Stunden unter gelegentlichem Schütteln stehen gelassen. Die Zellen wurden dann bei 3000 UM 10 Minuten zentrifugiert und das dicht gepackte Zellvolumen entfernt und in 200 ml der genannten Salzlösung bei 4⁰C aufbewahrt. Diese Suspension zeigte einen hämatokriti-

schen Wert von 1,4 $<>

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-ys -

Zu 0,5 nil der dicht gepackten, mit Formalin behandelten Hefezellen wurden 12 ml des genannten Ph°sphatpuffers und danach 6 ml einer Salzlösung gegeben, welche 20 mg CG-TH pro 10 ml enthielten und danach wurden die Zellen mit 40 ml einer ale 5-Verdünnung der genannten BDB-Xösung in Berührung gebracht. Die Reaktion schritt unter fortwährendem Rühren 20 Minuten bei Raumtemperatur fort» Das erhaltene Indikatorsystem wurde durch Zentrifugieren gesammelt und 3"JHaI in der genannten Salzlösung gewaschen, wonach die Zellen in einer BSA-Verdünnung in Salzlösung Ton 1 ί 50 wieder suspendiert wurden* Die erhaltene Suspension zeigte einen hämatokritischen Wert von 6 $·

Diese Zellensuspension von 6 # wurde danach verwendet mit einer Lösung von Ab-CGIEH 1 s 500 für die Untersuchung auf CGrTH in 2 Urinproben. Ein Anteil von 0,2 ml der öligen Zellensuspension wurde 1-mal gewaschen mit BSA-IÖsung in Salzlösung 1 t 50 bis zur ursprünglichen Konzentration, um ein Endvolumen von 0,2 ml zu erhalten» Ein Tropfen eines bekannten Schwangerenurins wurde mit einem Tropfen der Ab-CG-TH-Xiösung gemischt und 2 Minuten stehen gela.ssen_t danach ein enzelner Tropfen der mit Mischung auf einen Objektträger gebracht· Ein Tropfen des Indikatorsyetems wurde danach mit dem Material auf dem Objektträger gemischt. Ein ebenmäßiges Muster, das

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Schwangerschaft andeutete, trat auf. Der Versuch wurde wiederholt mit dem Urin einer nicht schwangeren Frau und ein körniges agglutiniertes Muster in kurzer Zeit gebildete

Dieses Beispiel erläutert, daß Hefezellen als Indikatorpartikel für die Indikatorsysteme verwend et werden können« Jene Zellen bieten den Vorteil, daß sie im Handel in trockener, stabiler Form erhältlich sind«

Beispiel-5

Ein Indikatorsystem wurde hergestellt unter Verwendung von Escheriohia doli als Mikrobenzellen, eines Carbodiimide als Kupplungsmittel und von CGTH als antigene Substanz· Dieses Indikatorsystem wurde dann verwendet sowohl für die Agglutination als auch für die Inhibition der Agglutination β

Herstellung der Reagenzien? Mikrob enzellen:

Escherichia coil -Zellen wurden gezüchtet, geerntet und mit Formaldehyd in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise behandelt* Sin Volumen von 20 ml einer 2,5?t-igen Suspension wurde in dieser Art hergestellt· Diese Suspension ward· zentrifugiert und 0,5 ml einer Zellpaekung wiedergewonnen

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zur Verwendung für die Herstellung des Indikatorsystems.

Kupplungsmittel:

o,2 g NjlP-Dicyelohexylearbodiimid wurde in o,5 ml Ketrahydrofuran gelöst und danoh 1,o ml destilliertes Wasser zur Lösung zugegeben.

Antigene Substanz:

4o / mg CGTH wurden in 2 ml destilliertem Wasser gelöst* Das verwendete OGTH hatte eine Aktivität von 259o I.U, pro mg und wurde von der Vitamerican Corp.,' Little Palls, Hew York, erhalten.

Ab-OGTH-Lö sung:

Portionen der Antikörperlösung und der o,85#-igen Salzlösung, die für Beispiel 2 hergestellt war, wurden verwendet zur Herstellung von Verdünnungen 1 : 5o, 1 : 1oo und 1 : 2oo des Ab-OGTH.

Herstellung des Indikatorsystems:

Die o,5 ml Zellvolumen von E.coil wurden fünfmal mit Kaltem Wasser gewaschen und dann in der Lösung von 2 ml CGTH suspendiert'. Die Kupplungsmittellösung wurde danach zu den suspendierten Zellen gegeben und ebenfalls CGTH um diese zu kuppeln. Die Mischung wurde geschüttelt und dann 24 h bei 25°C weggestellt. Die anschliessenden Waschvorgänge wurden dann ausgeführt, um das Indikatorsystem von eingeschleppten Verunreinigungen zu befreien: dreimsl mit o,o1 in Katriumcarbonatlösung, dreimal mit o,o1 m HOl, dreimal mit destilliertem Wasser,

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einmal mit 1 #-igem NaOl(pH-Wert 2,3), einmal mit einer Verdünnung 1 : 2o des Salz#hosphatgemisches von Beispiel 3 in o,85 #-iger Salzlösung (pH-Wert 7,o) und einmal mit einer Verdünnung 1 : 5o von BSA in o,85 #-iger Salzlösung. Das gewaschene Indikatorsystem wurde danach zu einer Zellenkonzentration von 8 i» in einer lösung von BSA in o,85 #-iger Salzlösung von 1 : 5o suspendiert. Diese 8 #-ige Suspension wurde in einem kalten Raum gelagert und für die nachfolgenden Versuche verwendet.

Ein vorläufiger Agglutinationsversuch wurde durchgeführt durch Mischen eines Tropfens jeder der genannten Antikörperverdünnungen mit einem Tropfen der Indikatorsystemsuspension auf verschiedene Teile einer Glasplatte. Bin KontrOliversuch wurde durch Mischen eines Tropfens einer Verdünnung von 1 : 5o von normalem Kaninchenserum (NRS) in o,85 #-iger Salzlösung mit einem Tropfen der Indikatorsystemsuspension auf einem getrennten Gebiet derselben Platte durchgeführt. Die Resultate sind in Tabelle IV angegeben, wobei das "S" ein ebenmässiges und daher nicht agglutiniertes Muster anzeigt und ¹¹G¹¹ eine körnige und daher agglutinierte Beschaffenheit anzeigt.

Tabelle IV

Indikator	8 £	Antikörper-Verdünnungen	Kontrollversuch
system	1:5o 1:1oo 1:2oo	NRS
Beispiel 5»	G GS	S

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Tabelle IV zeigt, dass eine Agglutination bei den Verdünnungen 1 : 5o und 1 : 1oo auftrat, aber dass ungenügend Ab-CGiEH bei der Verdünnung 1 : 2oo vorhanden war, um eine Agglutination, des Indikatorsystems zu verursachen. Der Kontrollversuch, zeigte ein ebenmässiges Muster, was anzeigte, dass das System nicht spontan agglutiniert mit der BRS-Lösung.

Danach wurde ein weiterer Versuch ausgeführt durch Mischen von 0,5 ml einer Urinprobe einer Schwangeren, mit 0,5 ml der Antikörperverdünnung 1 : 100 in einem Reagenzglas und Stehenlassen dieser Mischung über 5 Minuten bei 25⁰C. Es wurde dann 1 Tropfen aus dem Reagenzglas entfernt und mit 1 Tropfen der 8$-igen Suspension des Indikatorsystems auf einem Objektträger gemischt.. Ein "S", also ebenmäßiges Muster wurde beobachtet, was anzeigte, daß die Agglutination des Indikator systems durch das Ab-CG-TH durch das im Urin anwesende CGfTH inhibiert worden war_e

Der Versuch wurde wiederholt unter Verwendung von 0,5 ml einer Urinprobe einer nicht schwangeren !rau mit dem Ergebnis, daß ein "Gr", also ein körniges Muster, in einer kurzen Zeit entwickelt wurde.

Dieses Beispiel zeigt, daß ein Carbodiimid als Kupplungsmittel verwendet werden kann, um antigene Substanzen an Mikrobenzellen anzufügen·

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Beispiel 6

2 zusätzliche Indikatorsysteme wurden hergestellt gemäß Beispiel 5. Die verwendeten Antigene waren menschliches Serumalbumin (HSA) und ^-Grlobuixa vom Pferd. Das Indikatorsystem für HSA wurde hergestellt unter Verwendung von 10 mg HSA pro 0,25 ml gepacktes Zellenvolumen von Escherichia coli anstelle des CG-TH. Das Indikatorsystem für das Pferde-jf-Globulin wurde hergestellt unter Verwendung von 40 mg dieses Antigens pro 0,25 ml gepackten Zellvolumens von Escherichia coli anstelle des CG-TH.

Es wurde ein Agglutinationsversuch durchgeführt durch Mischen eines Tropfens jeder der hergestellten Indikatorsysteme mit einem Tropfen einer Verdünnung 1:10 ihrer jeweiligen Antiseren in 0,85 #iger Salzlösung. Ein Kontrollversuch für jeden Versuch wurde durchgeführt unter Verwendung eines Tropfens einer Verdünnung 1:10 von normalem Kaninchen— serum in 0,85 $iger Salzlösung.

Die Antiserumtropfen verursachten jeweils ein gutes Agglutinationsmuster der jeweiligen Indikatorsysteme. Keine Agglutination wurde vom normalen Kaninchenserum verursacht.

Beispiel 7

Es wurden die Indikatorsysteme und Agglutinationsversuche von Beispiel 6 wiederholt mit identischen Resultaten

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unter Verwendung von U-tert^-Butyl-5-methylisooxazoliumperchlorat anstelle des Carbodiimide als Kupplungsmittel.

Dieses Kupplungsmittel wurde verwendet, indem 10 ml einer 2,5 96 igen Suspension der mit Formalin behandelten Zellen des Beispiel 2 genommen wurden, diese 5 bis 10 Minuten zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit entfernt wurde. Die Zellen wurden dann 4—mal mit kaltem Wasser gewaschen und dann in 20 ml einer 0,1 #igen Hatriumbicarbonatlösung in destilliertem Wasser wieder suspendiert. Danach wurde eine Menge von 3 mg Bernsteinsäureanhydrid zugegeben und die Zellen über Nacht bei 4 C geschüttelt. Die Zellen wurden dann zentrifugiert und zusätzlich 3»*mal mit Wasser gewaschen, wonach die succinylierten Zellen erneut in 5 ml destillierte- Wasser suspendiert wurden. Eine Pipette wurde dann verwendet, um 10 Mikroliter Triethylamin zu den Zellen zuzugeben» Danach wurden 17 mg des N-tert·- Butyl-5-methylisooxazoliumperchlorat zugegeben« Dieses Kupplungsmittel ist auch bekannt als Woodward-Eeagens ¹¹L". Der immunologische Indikator, der derart gebildet wurde, wurde zum Kuppeln der Antigene gemäß Beispiel 6 in den dort angegebenen Mengen verwendet. Menschliches Serum Albumin und Pferde - &-Globulin kuppelten an Escherichia coli nach dieser Methode, wenn sie mit einem Kaninchenantiserumalbumin des Menschen im Verhältnis 1:10 und einem Kaninchenantipferäeyt>-Globulin im Verhältnis 1:10 umgesetzt wurden und ergaben Agglutinationen. Keine Agglutination wurde durch das normale Kaninchenserum im Verhältnis t : 10 verursacht.

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Beispiel 8

12 verschiedene Indikatorsysteme wurden gemäß Beispiel 2 hergestellt, wobei die Mikrobenzellen mit Formalin behandelt wurden und unter Verwendung von BDB Antigene daran gekuppelt wurden. Die Mikrobenzellen, die verwendet wurden, waren die folgenden Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Lactobacillus leichmannii und Pseudomonas fragi und die verwendeten Antigene bei jeder Art dieser Indikatorpartikel waren HSA, Pferde- Ψ -G-lobulin, und menschliches Insulin. Es wurden Objektträgerversüche der Agglutination durchgeführt.

BaztLlius subtilis und Bazillus pumilus wurden in derselben Art wie die Escherichia coli des Beispiels 2 gezüchtet. Lactobazillus leichmannii wurde über die gleiche Zeitspanne bei derselben Temperatur von 37⁰C in einer Gärmaische gezogen, die aus folgenden Bestandteilen bestand: 890 ml Wasser, 100 ml Tomatensaftfilträt, 10 ml "Bacto-Tween-80", 7,5 g Hefeextrakt, 7,5 g Pepton, 10 g Dextrose und 2 g Dinatriumphosphat. Die Maische hatte einen pH-Wert

.von 6,8 und war 10 Minuten bei 121 bei 1,1 atü zur Sterilisierung im Autoklaven behandelt worden.

Das Pseudomonas fragi wurde 4,5 Stunden bei Raumtemperatur (25⁰C) kultiviert in einer vorher sterilisierten Maische aus 1 Liter Wasser, 5 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 1 g Dextrose und 1 g Dinatriumphosphat.

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Die geernteten Zellen wurden dann mit lOrmalin behandelt und 0,25 ml gepackten Zellvolumens jeder Sorte gemäß der Kupplungsmethode des Beispiels 2 verwendet, indem 3 Ansätze jeder dieser Zellen in 6 ml des Phosphatpuffers dieses Beispiels suspendiert wurden und zu jeder Protion der suspendierten Zellen die folgenden Antigene, in 5 ml 0,85 $iger Salzlösung gelöst zugesetzt wurden: 3 mg HSA, 40 mg Pferde- ^-Globulin und 20 mg Insuline Danach wurden 20 ml der Verdünnung 1:5 der BDB^- Lösung des Beispiels 2 in Phosphatpuffer zugefügt, um ähnliche Kupplungsreaktionen durchzuführenο

Jeder der 12 Indikatoren wurde bezüglich ihrer Antikörper und mit normalen Serumkontrollen untersuchte Die Indikatorsysteme mit ASH und Pferde- ^-Globulin wurden mit einer Verdünnung 1:50 von Kaninchen-Anti-HSA und Kaninchen-Anti-Pferde-V -Globulin in Salzlösung geprüft, während die Insulin-Indikatorsysteme mit einem Antiinsulinserum des Meerschweinchens in Salzlösung in unverdünnter Form geprüft wurden. Die Kontrollversuche jeder der 12 Versuche wurden mit einer Verdünnung 1:10 von normalem Kaninchenserum in Salzlösung durchgeführte Die Antikörper jeder der Antigene agglutinierten bei jedem der 4 Indikatorsysteme, die mit dem individuellen Antigen hergestellt waren, und es fand bei den Kontrollversuchen keine Agglutination statt·

Erfindungsgemäß wird ein weiter Bereich von immuno-1098 15/1839

rf

logischen Indikatoren des Typs "Mikrobenzellen-Kupplungsmittel" geschaffeno Diese können an antigene Substanzen gebunden werden, um immunologische Indikatoren zu schaffen des Typs "Mikrobenzellen-Kupplungsmittel-Antigene-Substanz", die zum Aufbau eines großen Bereichs von Versuchen und Versuchsanordnungen verwendet werden können·

Patentansprüche

7838634-9

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   1* Verfahren sur Herstellung eines immunologiechen Indikators sur chemischen Bindung an antigene Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß «an Mikrobensellen mit Molekülen eines lupplungemittele, welche mindestens zwei nicht gebundene reaktiTe Gruppen besitzen, in Be- ^

   rührung bringt, eine der reaktiren Gruppen zur Bildung einer kovalenten chemischen Bindung mit den Mikrobensellen reranlaßt, und die andere reaktiTe Gruppe i« nicht gebundenen Zustand beläßt, wodurch der Indikator sur Reaktion «it antigen en Substanzen befähigt wird, wenn er damit in Berührung gebracht wird.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß «an als Mikrobenzellen die Zellen τοη Bakterien, Pilzen, Parasiten-und Viren auswählt·

   3. Verfahren naeh Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrobenzellen τοη einheitlicher for« und GrSSe sind und eine maximale Ausdehnung in einer Richtung τοη etwa 0,2 bis 10 Mikron besitsen.

   4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch g e k e η η ζ e i c h η e t, daß die Mikrobensellen «it Konservierungsmittel behandelt worden sind.

   BAD ORIGINAL

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   5· Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch g e k e η η zeichnet, daß man gefärbte und konservierte Mikrobenzellen verwendet·

   6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5» dadurch g e k e η η ζ e i c h ne t, daß man als Kupplungsmittel Biß-diazobenzidin, Sis-diazobenzidin-disulfonsäure, Tetraazo-p-phenylendiamin, Difluordinitrobenzol, ein Carbodiimid, Toluoldiisocyanat, Cyanursäurechlorid, Dichlor-S-triazin oder H-t-Butyl-S-iaethylisooxazoliumperchlorat verwendet·

   7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet« daß man von einer Suspension von Mikrobenzellen und einem Antigen ausgeht, diese Suspension mit dem Kupplungsmittel in Berührung bringt bis eine Reaktion stattgefunden hat, und danach das erhaltene immunologische Indikatorsystem aus der flüssigen Suspension abtrennt·

   8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikrobenzellen zuerst mit einem Konservierungsmittel in Berührung bringt.

   9· Diagnostische Untersuchungsvorrichtung zur Entdeckung eines Antigens unter Verwendung eines immunologischen Indikatorsystems nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem saugfähigen Material besteht, welches in einem Abstand von dessen Kante

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   den trockenen Rückstand einer ersten Ablagerung des Indikatorsysteme aus den mit Konservierungsmittel behandelten Mikrobenzellen, dem daran kovalent gebundenem Kupplungsmittel, und Antigenmolekülen, die kovalent an das Kupplungsmittel gebunden sind, enthält, sowie eine zweite Ablagerung, die auf die erste Ablagerung aufgebracht ist, aus dem Antikörper zu dem zu untersuchenden Antigen.

   10. Diagnostische Vorrichtung nach Anspruch - 9-, dadurch g e k e η η ζ eich η et, daß der trockene Bückstand von der Ablagerung eines Immunaggregats herrührt, das aus dem Antikörper zu dem zu untersuchenden Antigen und dem Indikatorsystem aus mit Konservierungsmitteln behandelten Mikrobenzellen und dem über ein Kupplungsmittel durch kovalente Bindungen daran gebundenen zu untersuchenden Antigen zusammengesetzt ist.

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