DE69830602T2

DE69830602T2 - Teilchen

Info

Publication number: DE69830602T2
Application number: DE69830602T
Authority: DE
Inventors: John David CLARKE; Henry Michael HARRISON; Singh Harmesh Saddleworth AOJULA
Original assignee: University of Manchester
Current assignee: University of Manchester
Priority date: 1997-10-16
Filing date: 1998-10-14
Publication date: 2006-05-04
Anticipated expiration: 2018-10-15
Also published as: ATE297715T1; PT1023047E; AU9547398A; NO20001976D0; WO1999020252A1; EP1023047B1; CA2306972A1; NO20001976L; DE69830602D1; AU742846B2; JP2001520185A; US7723056B1; GB9721901D0; EP1023047A1; ES2245044T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Targeting von biologischen Zellen, z.B. für die Aufgabe des Analysierens des Vorhandenseins und/oder eine Menge davon in einer speziellen Probe oder für die Aufgaben der Medikamentenzuführung.
"Biologische Zellen" ist ein weit verwendeter Begriff zur Beschreibung lebender Zellen als die Gebilde, die den Körper eines breiten Bereichs lebender Organismen im Wesentlichen aufbauen, wie beispielsweise Mikroorganismen (z.B. Bakterien, Protozoen, Pilze, Algen), Pflanzen und Tiere. Biologische Zellen können als Einzelzellen, als individuelle Zellen in einer Suspension oder als Zellen bereitstehen, die in Form von mehrzelligen Organismen oder den Geweben oder Organen darin assoziiert sind.
Es ist wünschenswert in der Lage zu sein, spezielle Typen von Zellen in einer Probe zu beobachten und/oder zu identifizieren. Diese Zellen können sich in unbelebtem Material befinden (beispielsweise in pathogenen Organismen, die Lebensmittel oder die Wasserversorgung kontaminieren) oder können gemischt sein mit anderen Typen von Zellen (z.B. bei einer mikrobiologischen Infektion eines mehrzelligen Organismus oder bei einer Krebszelle in einem Patienten).
Die Stoffwechselaktivität einer Zelle bewirkt Änderungen in der extrazellulären Umgebung, wobei herkömmlich derartige Änderungen direkt gemessen wurden, indem eine Messvorrichtung in ein Medium oder in unmittelbarer Nähe zu diesem gebracht wurde, welches die Zellen, die von Interesse sind, enthielt. So ist beispielsweise die Stoffwechselaktivität von Zellen gemessen worden, indem Änderungen des pH-Wertes beobachtet wurden, die im typischen Fall aus der Freisetzung von Carbonsäuren resultieren (wie beispielsweise Milchsäure, Essigsäure), Änderungen in Gasen (z.B. Kohlendioxid und Ammoniak und deren Auflösung unter Erzeugung dissoziierter Elektrolyte) oder anderen protonierbaren Gruppen (wie beispielsweise Amine und Aminosäuren). Typischerweise wird der pH-Wert durch Eintauchen einer pH-Elektrode in das Medium gemessen, das mit den biologischen Zellen zusammenhängt. Ähnliche physiologische Aktivitäten sind gemessen worden, indem eine Leitfähigkeitselektrode in das Medium eingetaucht wurde, soweit derartige Messergebnisse aus den Änderungen in der Konzentration und der Ladung der dissoziierten Elektrolyten in dem Medium resultieren. Andererseits ist die Stoffwechselaktivität von Zellen mit einer Redox-Elektrode gemessen worden, wie beispielsweise einer Platinelektrode, mit der die Fähigkeit des mit den Zellen zusammenhängenden Mediums zur Abgabe von Elektronen an oder zur Aufnahme von Elektronen von einem elektronischen Schaltkreis gemessen wird, von dem die Elektrode einen Teil bildet. Damit sind die Zellen in Kontakt mit einem Medium der variable Teil einer elektrochemischen Zelle, die ebenfalls von mindestens zwei Elektroden kontaktiert wird, welche den pH-Wert messen, die Leitfähigkeit oder das Redox-Potential (in einem potentiometrischen Schaltkreis) oder den Faradayschen Strom (in einem amperometrischen Kreis).
Die Stoffwechselaktivität einer Zelle kann auch indirekt gemessen werden. Beispielsweise lässt sich in das mit den Zellen zusammenhängende Medium ein Farbstoff einführen, so dass die optischen Eigenschaften des Farbstoffes (z.B. Absorption oder Fluoreszens bei einer bestimmten Wellenlänge des Lichtes) proportional zu den Änderungen in dem Medium (wie beispielsweise pH-Wert oder Redox-Potential) geändert werden. Derartige optische und einige elektrochemische Messungen werden auch mit den Aktivitäten von Enzymen gekoppelt, die von den Zellen produziert werden. Beispielsweise lässt sich die Aktivität hydrolytischer Enzyme, wie beispielsweise Proteasen, durch deren Wirkung auf chromogene oder fluorogene Substrate messen.
In Verbindung mit diesen konventionellen Messmethoden gibt es zahlreiche Unzulänglichkeiten. Beispielsweise ist die Größenordnung der Änderung in dem Medium (d.h. die Stoffwechselaktivität, die beobachtet werden soll), das durch eine geringe Zahl von Zellen zusammengeschmiedet ist (im typischen Fall dort, wo die Konzentration der Zellen kleiner ist als 10⁴ bis 10⁵ Zellen pro ml), oftmals unzureichend, um einen messbaren Effekt zu erzeugen. Darüber können ähnliche Änderungen in dem Medium durch andere Zellen vermittelt werden (die nicht von Interesse sind) oder durch ebenfalls in dem Medium vorhandene Materialien, was zu mehrfachen oder störenden Beiträgen der zu messenden Änderung fuhrt und zu einer geringen Spezifität im Bezug auf die gewünschte Messung. Diese Nachteile im Bezug auf Empfindlichkeit und Spezifität sind in nicht spezialisierten Geräten und Assays alltäglich, die außerhalb eines spezialisierten Laboratoriums zur Anwendung gelangen, um Routinemessungen auszuführen.
Der Nachweise von Mikroorganismen, wie beispielsweise Bakterien, in Lebensmittel und/oder Umweltproben, erfordern im typischen Fall das Vorhandensein von mindestens 10⁴ Organismen für die Messung über eine Dauer von 1 bis 4 Stunden. Theoretisch können in mindestens 1 Organismus oder Zelle gemessen werden, wenn diese Zelle wächst und sich exponentiell teilt, und zwar bis zu einer Mindestgrenzkonzentration von Organismen, die für die Nachweismethode benötigt werden, was jedoch mehrere Stunden in Anspruch nehmen kann.
Abgesehen von den Analysenaufgaben gibt es andere Prozeduren, wo die Erkennung von Zellen von Bedeutung ist (z.B. das Targeting). Eines der Beispiele ist der Fall der Medikamentenzuführung. Die gerichtete Zuführung eines Medikaments zu einem speziellen Zell-Typ ist besonders wünschenswert, da es die Notwendigkeit für eine systemische Verabreichung unnötig macht und dadurch die Gefahr nicht spezifischer Wirkungen oder unerwünschter Nebenwirkungen in Zellen zu umgehen, die keine Target-Zellen sind.
Es können spezielle Mittel auf eine Zelle für die Aufgaben der Medikamentenzuführung oder Analyse in einer Reihe von Möglichkeiten gerichtet werden. Beispielsweise kann man Antikörper, die zellspezifische Antigene erkennen verwenden, um sie auf eine Zelle zu richten. Derartige Antikörper können direkt oder indirekt mit anderen Mitteln verknüpft sein, wie beispielsweise detektierbare Marker oder ein therapeutisches Mittel. Neuerdings sind Partikel, wie beispielsweise Liposomen, mit Antikörpern versehen worden, um Immunoliposomen zu erzeugen. Diese Immunoliposomen sind nützlich, um irgendeine in dem Liposom enthaltende Substanz auf eine Zelle zu richten.
Sobald eine Spezies auf eine Zelle gerichtet worden ist, besteht in der Regel die Notwendigkeit, sie zu einer Reaktion zu bringen oder freizusetzen, damit sie ihre gewünschte Wirkung ausüben kann. Wenn eine Zelle beispielsweise für die Aufgaben der Überwachung des Vorhandenseins dieser Zelle in einer Probe einem Targeting unterzogen wird, kann die Spezies ein detektierbarer Marker sein (der freigesetzt werden muss und/oder in der Nähe der Zelle aktiviert werden muss). In dem Fall eines Systems zur Medikamentenzuführung kann es sein, dass das Medikament an der Targetstelle freigesetzt und/oder aktiviert werden muss. Eines der Probleme in Verbindung mit bekannten Targeting-Partikeln, z.B. Immunoliposomen, besteht darin, dass sie einen beschränkten Nutzen haben. Dieses ist darauf zurückzuführen, dass die Freisetzung oder Aktivierung ihrer Inhalte oftmals von der durch die Zelle vermittelten Endozytose und dem anschließenden Aufbrechen des Liposoms im Inneren der Zelle abhängt. Es kann jedoch sein, dass auf eine Zelle im Targeting gerichtete Substanzen extrazellulär freigesetzt werden müssen (z.B. Liganden von Zelloberflächenrezeptoren), damit sie ihre gewünschte Wirkung ausüben können.
Die WO 96/40060 offenbart ein Verfahren zum Behandeln von Zellen, in welchem ein pH-empfindliches Liposom eine Zelle modulierende Substanz enthält, die zur Zerstörung der spezifischen Zellen verwendet wird. Darüber hinaus werden in der US-A-5525232 Verfahren zum Verkapseln hoher Konzentrationen kationischer Spezies in einschichtigen und mehrschichtigen Vesikeln offenbart.
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die Nachteile in Verbindung mit Partikeln bekannter Ausführung zu vermeiden oder zu mildern.
Dementsprechend ist ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung die Gewährung eines Lipidvesikel-Partikels, welches im Targeting auf einen Zell-Typ gerichtet werden kann, der von Interesse ist, wobei in das Partikel ein Peptid eingebaut ist, das auf ein vorbestimmtes metabolisches Signal von der getroffenen Zelle reagiert, um so die Permeabilität des Partikels zu modulieren, wobei in das Partikel ferner eine Spezies eingebaut ist, die auf die Zelle gerichtet werden soll, die bei der Modulation der Permeabilität aktiviert wird.
Die Aktivierung der Spezies kann eine Reihe von Formen annehmen, wie beispielsweise die Freisetzung aus dem Partikel und/oder Umwandlung (auf chemischem Wege oder anders). Die Umwandlung kann innerhalb des Partikels oder ohne dieses erfolgen. Die Aktivierung der Spezies betrifft auch die Aktivierung einer chemischen Reaktion, indem Reaktionsteilnehmer und Katalysatoren (z.B. ein Enzym) in die Lage versetzt werden, miteinander in Wechselwirkung zu treten.
Wir haben festgestellt, dass Partikel nach dem ersten Aspekt der Erfindung sehr nützlich sind für ein Targeting einer Spezies zu einer Zelle und für eine anschließende Aktivierung dieser Spezies in der Nähe der Zelle. Diese Reaktion kann in Abhängigkeit von der Beschaffenheit des metabolischen Signals aus der getrockneten Zelle hochempfindlich und/oder hochselektiv sein.
Es ist ein allgemeines Merkmal von biologischen Zellen, dass sie Mittel enthalten, wie beispielsweise Enzyme, die Reaktionen und andere Prozesse ausführen, wie beispielsweise den Transport von Elektronen, Protonen, Ionen, chemischen und biochemischen Spezies. Derartige Reaktionen und Prozesse werden oftmals als Metabolismus bezeichnet. Der Metabolismus in einer Zelle führt oftmals zu einer Änderung der Umgebung der Zelle, wobei die Umgebung auch den Metabolismus im Inneren der Zelle beeinflussen kann. Diese Erscheinungen werden als Schlüsselaspekte der Physiologie der biologischen Zelle verstanden und hierin als "metabolische Signale" bezeichnet.
Geeignete Partikel schließen Partikel jeder beliebigen Größe ein, die nicht zu groß sind, um sich mit Zellen enthaltenden Proben leicht zu mischen und in diesen zu dispergieren. Die Partikel sollten klein genug sein, so dass sie sich in der wässrigen Suspension nicht absetzen. Partikel können einen Durchmesser von wenigen zig Mikrometer haben bis herab zu Partikeln in Submikrongröße.
Die Lipidvesikel-Partikel können über einen inneren wässrigen Hohlraum verfügen, der von der äußeren Umgebung durch mindestens eine Schicht von diesen umgebenden Lipiden (z.B. Phospholipide) getrennt ist. Diese Spezies kann im Inneren dieses Hohlraums zurückgehalten werden.
Vorzugsweise sind die Lipidvesikel-Partikel Liposomen und können mehrschichtig sein oder mehr bevorzugt einschichtig.
Das Partikel kann so angepasst sein, dass die Spezies in einer Reihe von Möglichkeiten aktiviert wird. Beispielsweise kann die Permeabilität der Lipid-Doppelschicht eines Liposoms so reguliert werden, dass die Permeabilität durch die Doppelschicht hindurch in Reaktion auf ein vorbestimmtes metabolisches Signal erhöht werden kann. Nach dem ersten Aspekt der Erfindung lässt sich dieses dadurch erreichen, dass Peptide, die als zytolytische Mittel wirken, in das Vesikel eingebaut werden. Diese Peptide können große Proteine oder kurze Peptide unter der Voraussetzung sein, dass sie in der Lage sind, die Permeabilität des Partikels zu modulieren. Diese Mittel können zum Öffnen der Poren oder Kanäle im Inneren der Lipid-Doppelschicht wirken oder dieses vermitteln, damit die Moleküle in das Vesikel gelangen können und dadurch eine chemische Veränderung der darin enthaltenden Substanz bewirken. Alternativ oder zusätzlich kann das Öffnen von Poren oder Kanälen im Inneren der Lipid-Doppelschicht die Freisetzung der Substanz in die extravesikulare Umgebung ermöglichen. Die zytolytischen Mittel können auch ein Bersten des Lipidvesikels bewirken, um die Freisetzung der darin enthaltenen Spezies zu erlauben. Die zytolytischen Mittel sind im Bezug auf eine von der Zelle freigesetzte oder biochemische Substanz ansprechbar.
Das Peptid kann ein Innenkanal sein, der sich in Reaktion auf Ionen "öffnet" (z.B. H⁺, Na⁺, Cl^–, HCO^–, K⁺, usw.). Alternativ kann der Ionenkanal auf das Binden großer Molekül reagieren, die von der im Targeting getroffenen Zelle deriviert sind (beispielsweise ein Wachstumsfaktor, eine Komponente der extrazellulären Matrix von Säugerzellen oder Kapsel-Polysaccharide von Mikroorganismen). Ebenfalls ist es möglich, ein Peptid genetisch so zu bearbeiten, dass es auf jedes beliebige vorbestimmte metabolische Signal von einer ausgewählten Zelle reagiert.
Das Peptid ist vorzugsweise ein mit der Lipid-Doppelschicht verbundenes Protein (d.h. das Peptid überspannt die Lipid-Doppelschicht). Allerdings gilt als selbstverständlich, dass das Peptid mit der Doppelschicht auf andere Weise wechselwirken kann (z.B. an der äußeren Lipidschicht nicht kovalent gebunden).
Bevorzugte Peptide zum Erzeugen von Partikeln, die auf ein metabolisches Signal ansprechen, sind in Tabelle 1 zusammengestellt.
TABELLE 1
Bevorzugte Partikel können 1 mg Peptid für jeweils 1 bis 1000 mg Lipid aufweisen und vorzugsweise 1 mg Peptid für jeweils 10 bis 100 mg Lipid und am meisten bevorzugt 1 mg Peptid für jeweils 30 bis 60 mg Lipid. Es gilt jedoch als selbstverständlich, dass das genaue Verhältnis von Peptid zu Lipid von den speziellen Merkmalen abhängen wird, die in dem zu erzeugenden Lipidvesikel-Partikel benötigt werden.
Ein bevorzugtes Peptid-zytolytisches Mittel ist N, Myristin-GALA.
N, Myristin-GALA hat eine Aminosäuresequenz von W-E-A-A-L-A-E-A-L-A-E-A-L-A-E-H-L-A-E-A-L-A-E-A-L-E-A-L-A-A (worin W Tryptophan ist, E ist Glutaminsäure, A ist Alanin, L ist Leucin und H ist Histidin). Die Myristinsäure wird mit dem N-Ende (Tryptophan; W) umgesetzt, um N-Myristin-GALA zu ergeben.
Es gilt als selbstverständlich, dass andere zytolytische Peptide zur Anwendung gelangen können (und speziell solche, die in Tabelle 1 aufgeführt sind). Beispielsweise lassen sich Partikel verwenden, die HELP, KALA und LAGA enthalten.
Partikel nach dem ersten Aspekt der Erfindung können auf Zellen gerichtet sein, indem selektive oder spezifisch bindende Mittel verwendet werden. Die im Targeting getroffenen Zellen existieren oftmals innerhalb einer Population anderer Nicht-Target-Zellen weshalb man bevorzugt, dass das Mittel zum Targeting des Partikels mindestens eine gewisse Spezifität im Bezug auf die Target-Zelle gegenüber derjenigen der Nicht-Target-Zellen hat.
Das Binden des Partikels an einer Target-Zelle (hierin bezeichnet als primäres Binden) kann direkt oder indirekt erfolgen. An dem Partikel gebundene Antikörper können vorteilhaft zum direkten Binden des Partikels an Antigenen auf der im Targeting getroffenen Zelle eingesetzt werden. Derartige bevorzugte Partikel können ein Liposom mit einem Peptid-zytolytischen Mittel aufweisen und einen mit der Lipid-Doppelschicht in Verbindung assoziierten Antikörper.
Es ist möglich, das Partikel an einer Zelle indirekt zu binden, indem man dafür sorgt, dass man ein bindendes Mittel hat, welches nicht direkt mit dem Partikel verbunden ist. Beispielsweise ließe sich ein Antikörper-Konjugat verwenden, das über einen Teil verfügt, der sich an einem Partikel bindet, während der Antikörper-Abschnitt in der Lage ist, an der Target-Zelle zu binden. In diesem Zusammenhang lässt sich Biotin in das Partikel für die Aufgaben des Targetings einer Zelle einbauen. Ein mit Biotin konjugierter Antikörper kann zum Binden an einer Target-Zelle verwendet werden. Die "Antikörper-markierte" Target-Zelle kann dann an Avidin exponiert werden, das sich an dem Biotin auf dem Antikörper-Konjugat bindet. Sodann können Partikel, in die Biotin eingebaut ist, den Zellen hinzugefügt werden und werden sich spezifisch an dem Avidin binden und werden dadurch spezifisch auf die Zelle gerichtet, die den Antikörper erkannt hat. Ein bevorzugtes Protokoll zum Binden unter Verwendung von Antikörpern, Avidin- und Biotin-Protein G, wird in Beispiel 1 beschrieben. In diesem Fall ist ein Antikörper an einem spezifischen Antigen in einer Target-Zelle gebunden, wonach Biotin-Protein G hinzugefügt wird (das Protein G bindet den Antikörper) und anschließend Avidin an dem Biotin-Protein G gebunden wird. Abschließend werden Partikel, die Biotin führen, an dem Avidin auf dem Komplex gebunden und dadurch spezifisch auf die Zelle gerichtet. Es gilt daher als selbstverständlich, dass Biotin (oder Moleküle mit ähnlichen Bindungseigenschaften) beim Targeting von Zellen sowie in dem Prozess des sekundären Bindens verwendet werden können (nachfolgend detaillierter diskutiert).
Dem Fachmann auf dem Gebiet ist eine Vielzahl anderer bindender Mittel bekannt und kann innerhalb des Schutzumfanges der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Es können Peptide in die Lipid-Doppelschicht eines Vesikelpartikels eingesetzt werden, die an vorbestimmten Strukturen auf der Target-Zelle binden. Beispielsweise kann der Fibronectin-Rezeptor oder ein Integrin zum Binden der extrazellulären Matrix einer Zelle verwendet werden.
Es wird augenscheinlich, dass es für ein einzelnes Molekül möglich ist, die Rolle eines bindenden Mittels zu übernehmen, um auf das metabolische Signal reagieren zu können und die Anpassung des Partikels vermitteln zu können, um die Freisetzung oder Aktivierung der darin enthaltenen Spezies zu ermöglichen.
Damit ist es möglich zu gewährleisten, dass ein Partikel nach dem ersten Aspekt der Erfindung im Targeting mit einer hohen Selektivität wird/oder Spezifität versehen wird (z.B. unter Verwendung eines Antikörpers) und dass das Partikel außerdem so angepasst wird (z.B. durch Einbau eines zytolytischen Peptids), dass die eingebaute Spezies in Reaktion auf ein vorbestimmtes metabolisches Signal aktiviert wird.
Die in dem Partikel eingebaute Spezies kann jede beliebige gewählte Verbindung sein. Beispielsweise kann die Spezies ein relativ kleines Molekül sein, wie beispielsweise ein Farbstoff, ein elektrochemischer Vermittler oder ein Rezeptor-Antagonist. Die Spezies kann auch ein fluoreszentes Molekül sein (wie beispielsweise Latex oder Polystyrol), ein Antikörper, Hormon oder ein Enzym.
Es ist offensichtlich, dass die Spezies nicht auf das metabolische Signal aus der Zelle zu reagieren braucht. Während der Einbau einer Spezies, die unabhängig von dem metabolischen Signal reagieren kann, im Schutzumfang der Erfindung liegt, ist ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung, dass ein großer Bereich von Spezies, die nicht von sich aus auf das vorbestimmte metabolische Signal reagieren, zur Anwendung gelangen kann.
Partikel gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung lassen sich so anpassen, dass die Partikel auf ein metabolisches Signal mit Hilfe von Peptiden reagieren kann, die einem metabolischen Signal aus der äußeren Umgebung leicht zugänglich sind. Im Idealfall wird die Spezies im Inneren des Partikels gehalten, wo sie so lange nicht aktiviert werden kann, bis das Peptid auf dem Partikel auf das metabolische Signal reagiert. Lipidvesikel-Partikel gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung stellen einen technischen Fortschritt gegenüber konventionellen Partikeln dar, die reaktionsfähige Spezies enthalten. Dieses ist darauf zurückzuführen, dass eine im Inneren eines konventionellen Partikels festgemachte Spezies sich mit der äußeren Umgebung in einer vergleichsweise schlechten Kommunikation befindet und daher im Bezug auf ein metabolisches Signal relativ intensiv ist. Alternativ kann sich die Spezies auf der Oberfläche eines konventionellen Partikels befinden oder im Inneren eines vergleichsweise durchlässigen Partikels gehalten werden. Dieses ermöglicht der Spezies jedoch im Bezug auf ein Target reaktionsfähig zu sein, führt aber oftmals zu einer nichtspezifischen Aktivierung des Partikels. Partikel gemäß der vorliegenden Erfindung haben den Vorteil, dass eine Spezies in Reaktion auf ein metabolisches Signal von einer Target-Zelle sensitiv und spezifisch aktiviert werden kann.
Partikel nach dem ersten Aspekt der Erfindung lassen sich darüber hinaus derart modifizieren, dass die Partikel zum Aggregieren in der Lage sind (hierin bezeichnet als ein sekundäres Binden). Ein erstes Partikel kann so modifiziert sein, dass ein erster bindender Teil auf dem ersten Partikel eingeführt wird, das sich an einem zweiten Partikel bindet, welches einen zweiten bindenden Teil hat, der zur Wechselwirkung mit dem ersten Teil in der Lage ist. Es können Aggregate gebildet werden, die viele Tausende von Partikeln enthalten. Das Aggregat kann eine gelähnliche Struktur um eine Zelle herum bilden, die sogar noch groß genug sein kann, um für das bloße Auge sichtbar zu sein.
Um das sekundäre Binden zu vermitteln, lassen sich zahlreiche bindende Moleküle als der erste oder zweite Teil verwenden. Bevorzugte Moleküle für die ersten und zweiten Teile sind Biotin bzw. Avidin oder Biotin bzw. Streptavidin. Es können Derivate und Analoga derartiger Teile zur Anwendung gelangen. Beispielsweise sind Protein A-Avidin-Konjugate oder Protein G-Avidin-Konjugate als Antikörper verwendbar, die an den Konjugaten gebunden werden können. Derartige Konjugate mit Antikörpern daran lassen sich vor dem Kontakt mit den Target-Zellen herstellen.
Partikel, die zur Aggregation in der Lage sind, stellen ein bedeutendes Merkmal der Erfindung dar, da die aggregierten Partikel in Anwendungen zum Einsatz gelangen können, die eine hohe Empfindlichkeit erfordern. So wird nach einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Aggregieren einer Vielzahl von Lipidvesikel-Partikeln gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung gewährt, umfassend das Bereitstellen eines ersten bindenden Teils an mindestens einigen Partikeln und mindestens eines zweiten bindenden Teils an mindestens einigen der übrigen Partikel, wobei die ersten bindenden Teile mit den mindestens zweiten bindenden Teilen derart wechselwirken, dass ein Aggregat von Lipidvesikel-Partikeln gebildet wird.
Nach einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Aggregat bereitgestellt, das eine Vielzahl von Lipidvesikel-Partikeln nach dem ersten Aspekt der Erfindung aufweist, worin ein Abschnitt der Partikel über einen ersten bindenden Teil verfügt und weiterer Abschnitt über einen zweiten bindenden Teil verfügt, der an dem ersten bindenden Teil binden kann, wodurch die Partikel untereinander aggregieren.
Das Verfahren des zweiten Aspekts der vorliegenden Erfindung macht es möglich, dass eine große Zahl von Partikeln in die unmittelbare Nähe einer Target-Zelle gebracht werden können. Die Verwendung eines Aggregats von Partikel ermöglicht einer Spezies sich in der Nähe einer Target-Zelle in größeren Mengen anzusammeln, als dies normalerweise möglich ist, wenn man auf das primäre Binden zwischen den Partikeln und Zellen angewiesen ist.
Das zweite Binden braucht nicht im Bezug auf die Target-Zellen spezifisch zu sein, obgleich es von eindeutigem Nutzen ist, wenn die durch Verwendung der zweiten bindenden Teile hervorgerufene Bildung von Aggregaten von sich aus spezifisch ist und eine hohe Aktivität hat. Dieser Vorteil ergibt sich, weil anders als bei bekannten mit Antikörper gerichteten Partikeln (z.B. Fluoreszenz-Partikel) die Partikel der vorliegenden Erfindung lediglich auf ein metabolisches Signal (z.B. pH-Wert, Redox) von der Target-Zelle reagieren. Damit werden irgendwelche Aggregate, die sich zwischen den Partikeln bilden könnten, die nicht mit einer Target-Zelle verbunden sind (über ein primäres Binden), die eingebaute Spezies weder chemisch ändern, noch freisetzen, da das notwendige metabolische Signal dafür nicht vorhanden ist. Es ist augenscheinlich, dass es möglich ist, den Prozess der Aggregatbildung so zu arrangieren, dass die Zahl von Aggregaten, die die Target-Zelle nicht enthalten, auf ein Minimum herabgesetzt wird. Eine der Möglichkeiten, dieses zu erzielen, besteht in der Behandlung der Zellen mit Partikeln unter solchen Bedingungen, die das primäre Binden ermöglichen, jedoch wenig oder keine Aggregate bilden, wonach, sobald ein primäres Binden eingetreten ist, ein Reagens zugesetzt werden kann, um das sekundäre Binden einzuleiten und dadurch die Bildung von Aggregaten.
Wenn Partikel verwendet werden, die mit Avidin und Biotin modifiziert sind, tritt ein sekundäres Binden zwischen dem Biotin und Avidin ein. Der Prozess der Aggregatbildung von mit Avidin und Biotin modifizierten Partikeln kann so lange fortgeführt werden, bis zahlreiche Partikel ein Aggregat von Partikeln um die im Targeting getroffene Zelle herum bilden.
Es ist augenscheinlich, dass sich die Spezifität des Targetings dadurch verbessern lässt, dass man dafür sorgt, dass das sekundäre Binden ebenfalls hochspezifisch ist. In diesem Zusammenhang kann das sekundäre Binden zwischen Antikörpern (auf einem ersten Partikel), und Antigen (auf einem zweiten Partikel) erfolgen.
Wenn Partikel ferner einen bindenden Teil aufweisen, so ist offensichtlich, dass das bindende Mittel, welches das primäre Binden mit der Target-Zelle vermittelt, nicht direkt an dem Partikel angebracht sein muss. Beispielsweise kann ein Antikörper, der auf die Zelle spezifisch ist, mit einem bindenden Teil konjugiert sein, der mit einem komplementären Teil auf dem Partikel in Wechselwirkung steht. Dieses Antikörper-Konjugat erfährt dann ein primäres Bindungsereignis mit der Zelle, und die Partikel mit Teilen zum komplementären Binden mit dem Teil auf dem Antikörper-Konjugat leiten dann den Prozess der Aggregatbildung ein. 1 veranschaulicht einen bevorzugten Komplex der Aggregatbildung, bei dem das Mittel zum primären Binden nicht direkt an dem Partikel angebracht ist.
Weitere Vorteile ergeben sich aus der Nutzung von zwei oder mehreren Vertretern von erfindungsgemäßen Partikeln. So lassen sich beispielsweise zwei oder mehrere Populationen von reaktionsfähigen Partikeln, die jedes eine andere Spezies zu der in den anderen Populationen eingebauten Spezies eingebaut haben können, zum Targeting einer Zelle oder zum Erzeugen eines Aggregates um eine Zelle herum verwenden. Durch diese Vorgehensweise kann die Aktivierung der Spezies in den unterschiedlichen Populationen der Partikel (durch das metabolische Signal) eine Wechselwirkung zwischen den verschiedenen Spezies derart ermöglichen, dass eine angestrebte Reaktion eintritt. Diese Reaktion kann die Aktivierung einer Arzneimittelvorstufe sein und diese in ihre aktive Form bringen, oder kann die Erzeugung einer detektierbaren Verbindung sein (wenn die Partikel zum Zwecke der Detektion verwendet werden). Es ist als selbstverständlich anzusehen, dass die Wahrscheinlichkeit dafür, dass die ersten und zweiten Populationen in eine unmittelbare Nähe gelangen, mit der Ausnahme gering ist, wo sie beide an der gleichen Target-Zelle gebunden werden. Insbesondere ist dort, wo ein spezifisches und lebhaftes Binden erfolgt, die Wahrscheinlichkeit für ein solches Auftreten einer Reaktion anderswo in dem Medium oder der Probe dementsprechend gering und speziell dort, wo jede Population zuerst in Reaktion auf das vorbestimmte metabolische Signal aktiviert werden muss. Die Spezifität der Aktivierung der Partikel wird damit hoch sein, wenn zwei Populationen von Partikeln verwendet werden.
Partikel nach dem ersten Aspekt der Erfindung können zum Monitoring auf das Vorhandensein einer Zelle in einer Probe verwendet werden oder können auf dem Gebiet der Diagnostik zum Identifizieren spezieller Zellen in dem Körper verwendet werden. Diese Art der Anwendung der Partikel stellt ein wesentliches Merkmal der Erfindung dar. Damit gewährt ein vierter Aspekt der Erfindung ein Verfahren zum Detektieren von Zellen, die in einer Probe vorhanden sind oder potentiell vorhanden sind, umfassend das Behandeln der Probe mit einem Partikel, das im Targeting auf einen Zell-Typ von Interesse gerichtet werden kann, wobei dieses Partikel eine Spezies einbaut, die direkt oder indirekt detektierbar ist, wenn sie in Reaktion auf ein vorbestimmtes metabolisches Signal von der im Targeting getrockneten Zelle aktiviert wird, sowie direktes oder indirektes Monitoring der Spezies.
Es erscheint offensichtlich, dass die Probe alles sein kann, das auf das Vorhandensein spezifischer Zellen getestet werden soll. Die Probe kann unbelebt sein (z.B. eine flüssige Probe, wie beispielsweise Abwasser oder Wasser, oder eine feste Probe, wie beispielsweise Nahrungsmittel). Die Probe kann auch ein ex vivo-Gewebe oder sogar Organismus sein (z.B. die Detektion eines spezifischen Zell-Typs in einem Säuger).
Die nach dem vierten Aspekt der Erfindung verwendeten Partikel sind vorzugsweise Partikel gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung oder sind Aggregate von Partikeln gemäß dem zweiten oder dritten Aspekt der Erfindung.
Es kann jedoch als selbstverständlich gelten, dass andere Partikel gemäß dem vierten Aspekt der Erfindung benutzt werden können. Beispielsweise kann ein Partikel aus Polymeren hergestellt werden und Strukturen aufweisen, die sich in Reaktion auf das metabolische Signal ändern, oder das Partikel kann alternativ ein Mikrosom aufweisen, das aus Tensiden oder ähnlichen Molekülen gebildet wird.
So wie die Partikel Proteine oder Peptide enthalten, die auf ein metabolisches Signal ansprechen können, können die Partikel so angepasst sein, dass die Durchlässigkeit der Lipid-Doppelschicht durch Einbau spezieller zytolytischer Lipide in das Partikel reguliert werden kann. Beispielsweise können Lipide in ein Vesikel derart eingebaut werden, dass deren Ladung und Struktur in Reaktion auf das metabolische Signal verändert werden kann (z.B. durch Protonen- oder Elektronenübertragungsreaktionen). Beispiele für derartige Lipide schließen Dioleoylphosphatidyl (DOPE)/Oleinsäure; 1,2-Dioleoyl-3-succinylglycerin und 1,2-Diacyl-3-succinylglycerin ein. Diese Änderung in Ladung und Struktur kann zu einer Änderung der Durchlässigkeit der Lipid-Doppelschicht führen. Die Durchlässigkeitsänderung kann die intravesikulare chemische Umgebung verändern und dadurch die chemische Änderung und/oder Freisetzung von Substanzen möglich machen, die in dem Vesikel enthalten sind.
Das Verfahren nach dem vierten Aspekt der Erfindung kann zum Detektieren von Zellen in einer Probe oder einem Patienten mit großer Empfindlichkeit und/oder Spezifität angewendet werden. Wir haben festgestellt, dass das Verfahren nach dem vierten Aspekt der Erfindung direkt oder indirekt zum Detektieren von weniger als 10⁴ Zellen in einer Probe und bis herab zu 10' Zellen in einer Probe innerhalb weniger Stunden angewendet werden kann.
Die Empfindlichkeit kann unter Verwendung von aggregierten Partikeln nach dem zweiten oder dritten Aspekt der Erfindung weiter verbessert werden.
Das Verfahren nach dem vierten Aspekt der Erfindung ist besonders verwendbar zum Detektieren von Pathogenen. Derartige Pathogene können sich beispielsweise in Lebensmitteln befinden, in Wasserproben oder sogar höhere Organismen infizieren. Beispielsweise macht eine einwandfreie Lebensmittelhygiene erforderlich, dass es weniger als ein pathogenes Bakterium (z.B. Salmonellen oder E. coli) in 25 g Lebensmittel oder in 1 Liter Flüssigkeit gibt. Konventionelle Mittel zum Monitoring, die üblicherweise mindestens 10⁴ Bakterien erfordern, sind zum Detektieren derartiger geringer Kontaminationsmengen unbrauchbar. Daher müssen Proben des Lebensmittels oder der Flüssigkeit in Kultur genommen werden, um das Wachstum der Bakterien einzuleiten (oftmals mit einer vorherigen Anreicherung der Wachstumsphase, gefolgt von einem selektiven Wachstum), damit es eine ausreichende Zahl zum Detektieren gibt. Dieser Prozess kann bis zu 4 Tage dauern. Das Verfahren nach dem vierten Aspekt der Erfindung hat den Vorteil, dass das Bakterium innerhalb einer sehr viel kürzeren Zeitdauer detektiert werden kann und im typischen Fall innerhalb eines Tages und häufig innerhalb von Stunden. Eine solche Zeitersparnis ist besonders für Hygieneaufgaben und für den Erzeuger hoch signifikant, der zum Prüfen in der Lage ist und dann die getesteten Lebensmittel anschließend schneller vertreiben kann.
Die nach dem vierten Aspekt der Erfindung verwendeten Partikel können eine Spezies direkt in das Medium hinein freisetzen, welches die Zelle umgibt und von wo aus es detektierbar ist (beispielsweise kann ein Farbstoff aus einem Liposom in Reaktion auf ein metabolisches Signal von einer im Targeting getrockneten Zelle freigesetzt werden). Alternativ kann die in das Partikel eingebaute Spezies ein Enzym sein. Ein solches Enzym kann die Bildung eines detektierbaren Produktes katalysieren (das Substrat kann auch in das Partikel eingebaut sein, kann sich in dem Medium befinden oder kann sogar aus der getrockneten Zelle freigesetzt werden), und zwar in Reaktion auf das metabolische Signal aus der Zelle.
Partikel, die für die Detektion von Zellen zur Anwendung gelangen, müssen sich nicht im direkten Kontakt mit dem die Zellen enthaltenden Medium befinden. Sofern dieses der Fall ist, kann das Medium, das die Zellen enthält, in Verbindung mit einem zweiten Medium stehen, welches die Partikel enthält, die auf Änderungen in dem Medium reagieren, das die Zellen enthält. Diese Änderungen lassen sich zu dem zweiten Medium mit Hilfe einer Gasphase oder durch eine Grenzfläche übertragen, die für die aktivierende Spezies durchlässig ist (z.B. pH-Wert). Beispielsweise lässt sich die mikrobielle Wirkung detektieren, indem in einem zweiten Medium Kohlendioxid aufgefangen wird, das durch die metabolische Aktivität von Zellen in einem ersten Medium erzeugt wird. Dieses Auffangen des Kohlendioxids in dem zweiten Medium führt im typischen Fall zu einer Änderung der Leitfähigkeit, die man messen kann. Diese Leitfähigkeitsänderung kann in dem zweiten Medium dadurch verstärkt werden, dass verstärkende Spezies in ein Partikel eingebaut werden, welches auf die pH-Änderung in dem zweiten Medium reagiert und Reagentien oder Enzyme freisetzt (z.B. Asparginase), die eine größere konduktometrische Reaktion erzeugt. In ähnlicher Weise können die Partikel bei hohen Konzentrationen hinter einer Membran zurückgehalten werden, die für Protonen oder Redox-verringernde Verbindungen durchlässig ist.
Nach dem vierten Aspekt der Erfindung können Partikel direkt auf die Probe aufgebracht werden (z.B. Wasserquellen, Lebensmittel oder sogar ein anderer Organismus) und die Aktivierung der Spezies im Inneren der Probe unter Verwendung einer Vorrichtung zum Detektieren detektiert werden, die für die in dem Partikel verwendete Spezies geeignet ist. Ein bevorzugte Möglichkeit zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass man die Partikel und Probe (die die Target-Zellen vermutlich enthält) in oder auf ein gelähnliches Substrat bringt. Beispielsweise ist der in den Beispielen beschriebene Agarplatten-Assay eine geeignete Möglichkeit zur Ausführung des Verfahrens nach dem vierten Aspekt der Erfindung.
Ein bevorzugtes Partikel zur Verwendung entsprechend dem Verfahren nach dem vierten Aspekt der Erfindung umfasst eine Spezies, bei der es sich um einen Verstärker für das metabolische Signal von der Target-Zelle handelt, wodurch die Empfindlichkeit des Verfahrens erhöht wird. Derartige Verstärker machen es möglich, Zellen in einer Probe oder in einem Patienten nachzuweisen, bei dem eine Diagnose mit hoher Empfindlichkeit ausgeführt wird. Die Partikel können im Targeting spezifisch auf die Zelle von Interesse gerichtet sein, wonach die Substanz chemisch verändert oder freigesetzt wird, so dass das metabolische Signal, welches die Zelle "markiert", für die Detektion verstärkt ist.
Im typischen Fall wird der Verstärker im Inneren des Partikels gehalten, so dass der Verstärker vor der Reaktion des Partikels auf das metabolische Signal nicht detektierbar ist. Sobald das Partikel angesprochen hat, kann der Verstärker in einer messbaren Form freigesetzt oder in irgendeiner Weise mit anderen Reagentien in dem Medium zur Reaktion gebracht werden, um ein indirekt gemessenes Analogon des metabolischen Signals zu erzeugen. In diesem Zusammenhang besteht ein bedeutendes Merkmal des vierten Aspektes der Erfindung darin, dass der Verstärker von sich aus nicht direkt auf das gewünschte metabolische Signal reagieren muss und dieses im Normalfall auch nicht tut. Anstelle dessen wird der Verstärker in ein Partikel eingebaut, dessen Eigenschaften sich direkt in Reaktion auf das gewünschte metabolische Signal von der im Targeting getrockneten Zelle ändert, wobei der Verstärker freigesetzt wird oder zu einer messbaren Form aktiviert wird oder mit anderen Reagentien in dem Medium unter Erzeugung eines detektierbaren Produktes reagieren kann.
Der Verstärker kann ein konzentrierter detektierbarer Marker sein (wie beispielsweise ein Farbstoff), der im Inneren des Partikels gehalten wird. Alternativ kann der Verstärker ein Enzym oder ein anderer Katalysator sein. Das detektierbare Ausgangssignal aus dem Verstärker in Reaktion auf das metabolische Signal ist vorzugsweise wesentlich größer als das Signal, welches das Partikel aktiviert. Auf diese Weise kann eine Aktivierung eines Partikels, wie beispielsweise eines einen Farbstoff enthaltenden Partikels in Submikrongröße, und zwar in einigen 10-fachen bis einigen 100-fachen Äquivalentmengen, zur Erzeugung mindestens einiger tausend Äquivalente führen. Im Fall eines großen Moleküls (wie beispielsweise ein Enzym) können dementsprechend weniger Moleküle in das Partikel im Vergleich zu einem Verstärker mit geringerem Molekulargewicht eingebaut werden. Eine mit einem Enzym katalysierte Reaktion kann viele Male unter Erzeugung eines Äquivalentes oder eines größeren Effektes neu aufgebaut werden. Verstärker zur Verwendung nach dem vierten Aspekt der Erfindung können aus einem großen Bereich chemischer und biochemischer Systeme ausgewählt werden, wie beispielsweise anorganischen, Redox-, Fluoreszens-, kolorimetrischen, Lumineszens- oder Biolumineszens-Reagentien, Enzymen oder Kombinationen davon.
Sofern Enzyme in Partikeln gekapselt sind, sollten die Enzyme vorzugsweise mindestens eines der folgenden Kriterien erfüllen:

1. Sie dürfen nicht in der im Targeting getrockneten Zelle anzutreffen sein;
2. Sie müssen unter den gleichen Bedingungen aktiv sein, unter denen das Peptid auf das metabolische Signal ansprechbar ist (wenn das Peptid beispielsweise M-GALA ist, sollte das Enzym über einen pH-Wert-Bereich wirksam sein, über dem das M-GALA die Permeabilität des Partikels moduliert);
3. Es sollte keine hohe spezifische Aktivität haben und
4. Es sollte beim Einbau in das Partikel stabil sein.

Die detektierte Verbindung kann aus mehr als nur einem Präkursor erzeugt werden. Sofern dieses der Fall ist, reicht es aus, einen der bei der verstärkenden Reaktion in dem Partikel beteiligten Präkursoren einzubauen. Die anderen Präkursoren wird man in dem Medium antreffen, so dass sie von dem in das Partikel eingebauten Präkursor isoliert sind, bis zu dem Zeitpunkt, wo das Partikel auf das metabolische Signal anspricht. Wenn beispielsweise das Partikel ein Vesikel entsprechend dem ersten Aspekt der Erfindung ist, kann das metabolische Signal die Permeabilität der Lipid-Doppelschicht erhöhen und dadurch möglich machen, dass die Präkursoren unter Erzeugung der detektierbaren Verbindung wechselwirken.
Um nur ein Beispiel auszuführen, lässt sich die mikrobielle Aktivität indirekt durch Messung des durch die metabolische Aktivität der Zellen erzeugten Kohlendioxids detektieren und/oder durch Messung der pH-Wert-Änderung in der Umgebung der Mikroben (d.h. die Änderungen von Kohlendioxid und des pH-Wertes sind die vorbestimmten metabolischen Signale, auf die die Partikel ansprechen). Eine Zunahme in der Erzeugung des Kohlendioxids führt zu einer Leitfähigkeitsänderung, die wiederum gemessen werden kann. Diese Leitfähigkeitsänderung lässt sich mit Hilfe von Verstärkern verstärken, die in ein Partikel eingebaut sind und die auf die pH-Wert-Änderung ansprechen (das metabolische Signal). Die aktivierten Partikel können ein Enzym (z.B. Asparaginase) freisetzen, welches eine Reaktion unter Erzeugung einer starken konduktometrischen Reaktion katalysiert.
An einem Beispiel ausgeführt, kann die mikrobielle Aktivität unter Verwendung von Glucoseoxidase detektiert werden, die im Inneren eines Partikels gekapselt ist. Bei der Aktivierung wird die Permeabilität des Partikels erhöht und ermöglicht der Glucoseoxidase, dass sie in Kontakt mit Glucose von den äußeren Medien gelangt. Das Produkt der Aktivität der Glucoseoxidase (H₂O₂) kann dann auf ein weiteres Enzym einwirken, das in dem Medium bereitgestellt ist (z.B. Meerrettichperoxidase), um ein Produkt zu erzeugen, das colorimetrisch leicht detektierbar ist (siehe Beispiel 1 für weitere Einzelheiten). Dieses kann unter Verwendung eines Messgerätes erfolgen oder sogar mit bloßem Auge beobachtet werden.
Beispiele für Verstärker, die in die Partikel zur Verwendung nach dem Verfahren es dritten Aspektes der Erfindung eingebaut werden können, sind in Tabelle 2 gezeigt.
TABELLE 2 – BEISPIELE FÜR VERSTÄRKER, DIE GEKAPSELT WERDEN KÖNNEN
Ein bedeutendes Merkmal des Verfahrens nach dem vierten Aspekt der Erfindung besteht darin, dass die Partikel in unmittelbarer Nähe zu den Zellen gebracht werden können, so dass die metabolische Aktivität, die am Ort der Zelle auftritt, direkter auf die Aktivierung der Spezies ansprechbar ist. Die unmittelbare Nähe des Partikels zu der Zelle bedeutet, dass das metabolische Signal in der Mediummasse nicht verwässert wird, wodurch die Empfindlichkeit der gesamten Messung erhöht wird. Die aktivierte detektierbare Spezies ist außerdem direkter mit der metabolischen Aktivität der Zelle gekoppelt, wodurch die Selektivität und die Spezifität der gesamten Messung erhöht wird, und zwar im Bezug auf die Zelle stärker als im Bezug auf alle ähnlichen störenden Änderungen, die in dem massenhaften Medium vorkommen.
In der Regel ist es nicht praktisch, die Nähe zwischen konventionellen Messgeräten und den metabolischen Änderungen, die von den Zellen verarbeitet werden, zu erhöhen, um die Störung und Verdünnungseffekte auf ein Minimum herabzusetzen, die in typischen Medien in Erscheinung treten und speziell solchen Proben, die vergleichsweise geringe Mengen an Target-Zellen enthalten. Insbesondere enthalten typische Proben, wie beispielsweise Lebensmittelproben und klinische Proben, oftmals eine Vielzahl anderer Nicht-Target-Zellen. Im Vergleich zu den Zellen (im typischen Fall 0,1 bis 50 Mikrometer groß) sind gegenwärtige Messvorrichtungen wesentlich größer (im typischen Fall mit Abmessungen im Bereich von mm bis cm). Damit wird speziell in dem Fall, wo lediglich wenige Target-Zellen in der Probe vorhanden sind (selbst wenn diese Zellen mit der Messvorrichtung in Kontakt gebracht werden), wird die Messvorrichtung an großen Mengen der Probe exponiert. Selbst in dem Fall, wo die Target-Zellen an der Messvorrichtung separiert und zurückgehalten werden und der große Teil der Bestandteile der Probe eliminiert ist, wird die Empfindlichkeit aus den gleichen Gründen zumindest nicht wesentlich verbessert.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren nach dem vierten Aspekt der Erfindung ferner einen Schritt, mit dem die Partikel und die im Targeting gerichteten Zellen in einer Probe angereichert werden können. Es wurde eine Reihe von Trennmethoden entwickelt, um Zellen aus Proben zu extrahieren und zu konzentrieren. Viele dieser Methoden lassen sich mühelos so modifizieren, dass sie als Methoden angewendet werden können, Target-Zellen und Partikel in eine enge Nähe bringen zu können. Beispielsweise findet die Filtration durch Membranen, die zum Zurückhalten von Target-Zellen konzipiert sind, weit verbreitete Anwendung für die Verarbeitung von Wasserproben, die verdünnte Suspensionen enthalten, sowie für die Handhabung von Proben von Zellen in den Laboratorien. Spezifisch bindende Proteine, wie beispielsweise Antikörper, sind ebenfalls auf derartigen Membranfiltern zum Zurückhalten von Zellen aufgebracht worden. In beiden Fällen ist es möglich, Partikel in unmittelbarer Nähe zu den zurückgehaltenen Target-Zellen anhand ihrer ähnlichen Größe und ihres spezifischen Bindens wirksam einer Co-Separation zu unterwerfen. In ähnlicher Weise ist es möglich, wo derartige Membranfilter oder Maßnahmen zum spezifischen Binden in Verbindung mit den vorhandenen Messvorrichtungen angewendet werden, die im Targeting getroffenen biologischen Zellen und die ansprechbaren Partikel in unmittelbarem Kontakt mit der Messvorrichtung einzufangen, um die Spezifität und Empfindlichkeit der Messung zu erhöhen.
In ähnlicher Weise wird eine Reihe von Phasentrennsystemen, wie beispielsweise Dextran- und Polyethylen-Glykol-Lösungen, zum Trennen von Zellen verwendet. Ähnlichkeiten zwischen Target-Zellen und den Partikeln (speziell Vesikelpartikel) machen ihre Co-Separation relativ einfach. Auch hier kann die Modifikation der Phasentrennungsmedien mit Mitteln zur Verbesserung der Selektivität oder Spezifität (z.B. unter Verwendung von Antikörpern) der Trennung von Zellen mühelos zur Co-Separation von Partikeln mit Target-Zellen angewendet werden.
Darüber hinaus werden magnetische Zusammensetzung und speziell solche, die mit Hilfe von spezifisch bindenden Mitteln, wie beispielsweise Antikörper (immunmagnetische Zusammensetzungen) zum Abtrennen von Zellen von anderer Substanz umfangreich zur Anwendung gebracht. Magnetische und immunmagnetische Zusammensetzungen lassen sich in das Innere der Partikel oder auf deren Oberflächen nach dem ersten Aspekt der Erfindung unter Erzeugung von immunmagnetischen Partikeln einbauen. Damit lassen sich Zellen, die über magnetische Zusammensetzungen verfügen, die an den Zellen gebunden sind, sowie magnetische Partikel einer Co-Reinigung unterziehen.
Die Partikel können auch ohne weiteres in Verbindung mit Trennmethoden verwendet werden, wie beispielsweise Dielektrophorese (ein Mittel zum Konzentrieren von Zellen in einem asymmetrischen elektrischen Feld). Die Partikel (und speziell solche, die eine Lipid-Doppelschicht aufweisen) besitzen eine ähnliche Oberfläche und physikalische Eigenschaften im Vergleich zu solchen Zellen und können daher einer Co-Separation unterworfen werden. In ähnlicher Weise lassen sie sich in einer Vorrichtung mit dielektrophoretisch wandernder Welle einem Co-Transport unterziehen. In ähnlicher Weise können Zellen und Partikel in einer stehenden Ultraschallwelle einem Co-Einfang unterworfen werden und in einer Ultraschall-Wanderwelle einem Co-Transport unterzogen werden.
Partikel lassen sich auch in Verbindung mit Maßnahmen zum Isolieren von Zellen verwenden. Damit lassen sich die Zellen auf festen Wachstumsmedien isolieren, die selektive Wachstumsmittel enthalten, oder durch selektiv bindende Mittel (z.B. Antikörper). In diesem Fall können die Partikel in das feste Wachstumsmedium eingebaut werden, indem die Partikel in die flüssigen Medien vor der Gelbildung eingeführt werden. Die Partikel können auch eine Schicht bilden (z.B. auf der Oberfläche des festen Mediums) oder die Oberfläche von vorgeformten festen Wachstumsmedien können mit ihnen imprägniert werden. Alternativ können diese Partikel mit den Target-Zellen auf der Oberfläche von festen Wachstumsmedien einer Co-Isolation unterworfen werden entweder dadurch, dass man Mischungen von Zellen und Partikeln aufbringt oder durch Kontaktieren der festen Wachstumsmedien mit ähnlichen Mischungen. In ähnlicher Weise können Mischungen von Zellen und Partikeln an selektiven Medien exponiert werden, die zur Anreicherung oder selektiven Wachstum ausgelegt sind oder zum Metabolismus der Target-Zellen. Einzelne biologische Zellen können durch Mikromanipulation oder durch geeignete Verdünnung (z.B. in Arrays von Mikroplatten) mit separaten Wachstumskomponenten zusammengebracht werden, so dass sie in die Nähe der Partikel gelangen.
Eine bevorzugte Möglichkeit zur Ausführung des Verfahrens nach dem vierten Aspekt der Erfindung ist die Nutzung von Partikeln, die nach dem zweiten oder dritten Aspekt der Erfindung aggregiert sind. Beispielsweise kann beim Monitoring auf das Vorhandensein von Bakterien in einer Probe eine einzelne Bakterienzelle detektiert werden. Dieses kann man durch Monitoring einer Farbänderung auf einer Kulturplatte aus Partikeln erreichen, die Enzyme enthalten, welche eine Reaktion katalysieren, die colorimetrisch verfolgt werden kann. Wir haben festgestellt, dass eine Farbänderung, die mit dem bloßen Auge sichtbar ist, bei einem einzelnen Bakterium etwa eine Stunde nach dem Targeting des Bakteriums beobachtet werden kann und ein Aggregat um das Bakterium herum gebildet wird. Bisher war es nicht möglich gewesen, eine einzelne Zelle anders als unter Verwendung komplizierter und kostspieliger Instrumente, wie beispielsweise Mikroskope und Durchflusszytometer, abzusondern. Diese Instrumente erfordern eine fachmännische Anwendung und lassen sich nicht direkt auf Proben anwenden, die nur wenige Target-Zellen in einem Hintergrund eines großen Überschusses anderer Körper in der gleichen Matrix enthalten. Daher umgeht das Verfahren nach dem vierten Aspekt der Erfindung (und speziell bei Nutzung von Partikeln nach dem ersten Aspekt der Erfindung) die Notwendigkeit komplizierter Instrumente für den Nachweis kleiner Zahlen von Zellen. Darüber hinaus dienen die Partikel zur Erhöhung der Spezifität und Empfindlichkeit jedweder Nachweisinstrumente, was für den Fachmann auch erkennbar bedeutet, dass die Detektionszeit unter Anwendung der vorliegenden Erfindung auch drastisch herabgesetzt werden kann.
Die hohe Empfindlichkeit und Spezifität von Verfahren nach dem vierten Aspekt der Erfindung bedeutet, dass es nicht immer notwendig ist, die Target-Zellen von ihrer ursprünglichen Umgebung abzutrennen und anschließend die abgetrennte Probe an einer geeigneten Messvorrichtung zu exponieren. Detektierbare Verbindungen, die mit Hilfe der auf diese ansprechbaren Partikel in der Nähe der Target-Zellen erzeugt werden, können geeigneterweise groß genug sein, um durch eine Messvorrichtung aufgelöst zu werden oder im Fall der Verwendung von Verstärkern mit Hilfe bloßer Sinnesorgane des menschlichen Körpers, wie beispielsweise dem Auge.
Das Verfahren nach dem vierten Aspekt der Erfindung kann für diagnostische Bildgebung angewendet werden. Um nur ein Beispiel aufzuführen, lassen sich Liposom-Partikel mit einer Substanz füllen, bei der es sich um einen Präkursor eines Kontrastmittels handelt (z.B. für die CAT), der auch ein Substrat für ein Enzym ist, das in Körperflüssigkeiten angetroffen wird. Das Liposom kann im Targeting auf einen gewünschten Zell-Typ unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers gerichtet werden, der auf der Oberfläche des Liposoms aufgebracht ist. Darüber hinaus kann in das Liposom ein Proteinzytolytisches Mittel eingebaut werden, das auf den Stoffwechsel der Target-Zelle ansprechbar ist, so dass eine Änderung in der Permeabilität der Lipid-Doppelschicht eine Exponierung der Substanz an dem Enzym erlaubt und die Erzeugung des Kontrastmittels resultiert. Das Targeting des Kontrastmittels unter Verwendung ansprechbarer Liposomen verbessert die Empfindlichkeit und Auflösung verschiedener Diagnostikmethoden zur Bildgebung.
Unter bestimmten Umständen ist es nicht möglich, ein detektierbares Verhalten von Partikeln zu messen, wenn normale Prozeduren der Detektion zur Anwendung gelangen, wie beispielsweise nichtzeitaufgelöste Messungen eines optischen Ausganges. Unabhängig davon, wie groß der Ausgang relativ zum Hintergrund gemacht wird, das detektierbare Verhalten braucht nicht in der Lage zu sein, sich mit ausreichender Größe durch die Probenmatrix für genaue Messungen auszubreiten (speziell dann, wenn die Probe die Messung möglicherweise stören wird). Wenn dieses der Fall ist, sind Gase und Dämpfe (die vorteilhafterweise leicht zu messen sind) geeignete detektierbare Spezies, die in ein Partikel eingebaut und in Reaktion auf ein metabolisches Signal freigesetzt werden können. Einige Gase und Dämpfe lassen sich sogar bei geringen Konzentrationen durch die bloßen Sinnesorgane von Geruch und Geschmack nachweisen. Die Dampfphase einer flüssigen oder festen Probe gelangt leicht mit beliebigen Dämpfen oder Gasen in der Probe ins Gleichgewicht, was bedeutet, dass Gas oder Dampf zur Verwendung mit festen Proben genau so gut wie flüssige Proben geeignet sind.
Daher lassen sich in bevorzugten Partikeln zur Verwendung nach dem vierten Aspekt der Erfindung ein Gas oder ein Dampf einbauen, die zum Freisetzen (oder die erzeugt werden) in Reaktion auf ein metabolisches Signal in der Lage sind. Besonders bevorzugt enthält das Partikel Substanzen, die unter Erzeugung eines Gases reagieren können, wenn das Partikel auf das metabolische Signal anspricht. Mehr bevorzugt enthält das Partikel ein Enzym, welches die Erzeugung eines Gases aus dem Substrat in den Medien (oder einem ebenfalls mit Partikeln versehenen Substrat) katalysiert. Andererseits kann das Partikel Substrate für ein Enzym enthalten, welches in der Probe angetroffen wird, das in ein Gas umgewandelt wird, wenn das Partikel auf das metabolische Signal anspricht. Tabelle 3 bietet eine Reihe typischer chemischer und biochemischer Reaktionen, die für die Erzeugung von Gasen und Dämpfen nach einer Partikelaktivierung geeignet sind.
TABELLE 3 – CHEMISCHE UND BIOCHEMISCHE REAKTIONEN, DIE FÜR DIE ERZEUGUNG VON GAS UND DÄMPFEN VON PARTIKELN GEEIGNET SIND
Gas oder Dampf freisetzende Partikel können zum Detektieren geringer Mengen von pathogenen Mikroorganismen in Lebensmitteln mit Hilfe der Headspace-Dampfanalyse in Reihe detektiert werden. Alternativ können die Partikel in dem Lebensmittel belassen werden, um eine nachfolgende Kontamination zu detektieren oder das Wachstum von Mikroorganismen mit Hilfe einer ähnlichen Ansammlung des Dampfes oder Gases im Headspace über dem Lebensmittel in der Verpackung. Gase und Dämpfe können auch Verpackungsmaterial durchdringen, das mit chemischen Substanzen zum Messen imprägniert ist und deren optische oder andere Eigenschaften während des Versands, der Lagerung oder des Verkaufes automatisch abgelesen werden können. Alternativ kann ein stechend riechender Dampf oder helle Farben erzeugt werden, um vor einer möglichen Gefährdung in dem Lebensmittel zu warnen.
Ein Beispiel für eine Verwendung von Partikeln zum Freisetzen von Gas oder Dampf ist die Aufnahme durch Einatmung oder durch Verdauung, um mögliche Infektionen im Körper nachzuweisen (wie beispielsweise Rachen/Lunge oder im Darmkanal). Dieses kann zur Unterstützung der Diagnose dieser Infektionen oder zur Untersuchung der Wirksamkeit einer Therapie angewendet werden, wie beispielsweise einer antibiotischen Behandlung. Im letzteren Fall besteht ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung darin, dass im Targeting die Mikroorganismen angegriffen werden und Dampf proportional zu dem relativen metabolischen Signal von den Mikroorganismen freigesetzt wird. Mit Hilfe ähnlicher Mittel ist es möglich, die Ansprechbarkeit einer mikrobiellen Infektion auf eine Behandlung mit Hilfe einer speziellen antibiotischen oder anderen Therapie zu bestimmen. Die Möglichkeit zur schnellen Bestimmung der Ansprechbarkeit von Mikroorganismen auf eine solche Therapie selbstverständlich vor oder während einer verordneten Behandlung und speziell angesichts des vermehrten Auftretens von zahlreichen medikamentenresistenen Stämmen von Mikroorganismen von Bedeutung. Bei anderen Infektionen, wie beispielsweise bei der Tuberkulose, kommt es darauf an, die Flexibilität des Patienten bei einer solchen Therapie festzustellen.
Um nur ein Beispiel zu nennen, kann ein gaserzeugendes Partikel durch Co-Verkapseln des Enzyms Kohlensäureanhydrase mit Natriumhydrogencarbonat im Inneren von Liposomen erzeugt werden. Dieses Enzym wandelt schnell Hydrogencarbonat zu Kohlendioxid in Gegenwart von Säure um. Wenn die Zellen (z.B. Bakterien) Säure erzeugen, fällt der pH-Wert im Inneren der Liposomen ab, wenn das Partikel auf das metabolische Signal anspricht, und Kohlensäureanhydrase beginnt Kohlendioxid zu erzeugen. Andere mögliche Methoden sind die Verkapselung von Asparaginase und Asparagin, um Ammoniak oder Urease und Harnstoff um Ammoniak und Kohlendioxid zu erzeugen.
Während metabolisch ansprechbare Partikel (speziell Partikel nach dem ersten Aspekt der Erfindung) in der Detektion und Messung von Zellen verwendet werden können, lassen sich die gleichen Partikel auch zur Behandlung von Zellen verwenden. So können Partikel, die im Targeting auf eine Zelle gerichtet worden sind, auf ein metabolisches Signal ansprechen und bioaktive Substanzen für die Behandlung der Zelle freisetzen. Damit wird nach einem fünften Aspekt der Erfindung ein Verfahren zum Behandeln von Zellen gewährt, welches das Aufbringen eines Partikels auf eine Behandlung erfordernde Zelle umfasst, wobei in das Partikel eine Spezies eingebaut ist, die die Zellaktivität moduliert, wenn sie in Reaktion auf ein vorbestimmtes metabolisches Signal von den Zellen aktiviert wird.
Die nach dem fünften Aspekt der Erfindung verwendeten Partikel sind bevorzugt Partikel nach dem ersten Aspekt der Erfindung oder sind Aggregate von Partikeln nach dem zweiten oder dritten Aspekt der Erfindung.
Augenscheinlich ist jedoch, dass andere Partikel nach dem Verfahren des fünften Aspektes der Erfindung eingesetzt werden können. Beispielsweise können die vorstehend zur Verwendung nach dem Verfahren des vierten Aspektes der Erfindung vorgesehenen Partikel mit der Ausnahme verwendet werden, dass eine Spezies verwendet werden kann, welche die Zellaktivität moduliert.
Die Behandlung von Zellen nach dem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung macht es möglich, den im Targeting getrockneten Zellen selektiv Substanzen zuzuführen, welche die Zellaktivität modulieren. Darüber hinaus ist es möglich, hohe Konzentrationen einer Substanz zu erreichen, welche die Zellaktivität in der Umgebung der im Targeting getrockneten Zelle moduliert, wenn die Substanz in Reaktion auf ein metabolisches Signal von der getrockneten Zelle freigesetzt wird.
Es können nach dem fünften Aspekt der Erfindung Zellen so behandelt werden, dass sie durch diese Behandlung verstärkt werden. Ein Beispiel ist die Unterstützung des Wachstums von inkulturgenommenen Zellen (z.B. indem der getroffenen Zelle eine Spezies mit Wachstumsfaktoraktivität vermittelt wird) und speziell genetisch bearbeitete Zellen auf dem Gebiet der Biotechnologie.
Alternativ können die Partikel Spezies enthalten, bei denen es sich um zytotoxische Substanzen für die Zerstörung der getroffenen Zelle handelt. Beispielsweise können die Partikel im Labor zur Zerstörung eines unerwünschten Zell-Typs verwendet werden, wenn die Wahl zwischen einer Mischung von Zellen gewünscht wird (z.B. die Dekontaminierung eines Kulturkolbens von Zellen, die pilzlich infiziert worden sind). Das Verfahren nach dem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung ist außerdem für die Dekontaminierung einer Wasserquelle verwendbar, indem in das Wasser Partikel eingeführt werden, in die eine Substanz mit antimikrobieller Aktivität eingebaut ist.
Die Partikel können auch zur Behandlung von Tier oder Menschen verwendet werden. Damit wird nach einem sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Partikel bereitgestellt, das im Targeting auf eine Zelle gerichtet werden kann, in die eine therapeutisch wirksame Menge einer Spezies eingebaut ist, die in Reaktion auf ein vorbestimmtes metabolisches Signal von einer Zelle aktiviert wird, um in der Behandlung medizinischer Erkrankungen Anwendung zu finden.
Nach einem siebten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Behandeln medizinischer Erkrankungen gewährt, welches Verfahren das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines Partikels an einen Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf, umfasst, welches Partikel im Targeting auf eine Zelle gerichtet werden kann, in die eine therapeutisch wirksame Menge einer Spezies eingebaut ist, die in Reaktion auf ein vorbestimmtes metabolisches Signal von einer Zelle aktiviert wird.
Die nach dem sechsten oder siebten Aspekt der Erfindung verwendeten Partikel sind vorzugsweise Partikel nach dem ersten Aspekt der Erfindung oder Aggregate von Partikeln nach dem zweiten oder dritten Aspekt der Erfindung.
Allerdings gilt als selbstverständlich, dass andere Partikel nach den sechsten oder siebten Aspekten der Erfindung genutzt werden können. Beispielsweise können die vorstehend für den Gebrauch nach dem Verfahren des vierten Aspektes der Erfindung vorgesehenen Partikel mit der Ausnahme verwendet werden, dass Spezies zur Anwendung gelangen können, die über eine therapeutische Wirksamkeit verfügen.
Bei der Spezies mit therapeutischer Wirkung kann es sich um eine therapeutische Substanz handeln, die durch metabolische Signale in der Lokalität einer Target-Zelle aktiviert wird. Derartige Substanzen sind bereits bekannt (beispielsweise Aktivierung von Substanzen durch Änderung der Redox-Chemie für die Krebstherapie). Nach dem sechsten oder siebten Aspekt der Erfindung spricht jedoch das Partikel an sich auf das metabolische Signal an. Dieses ist deshalb von Vorteil, weil die Verwendung von reaktionsfähigen Partikeln es für die therapeutische Spezies von sich aus unnötig macht, reaktionsfähig zu sein. Damit lässt sich in das Partikel ein großer Bereich therapeutischer Spezies einbauen, während bisher lediglich eine begrenzte Zahl von reaktionsfähigen Substanzen (die in der Herstellung aufwendig waren) zur Verfügung stand.
Die Partikel können für die Zuführung von Medikamenten für die Behandlung von fast jedem medizinischen Krankheitszustand verwendet werden. Allerdings sind die Partikel in hohem Maße für die Zuführung von Medikamenten geeignet, die eines sorgfältigen Targetings bedürfen. Beispielsweise sind die Partikel für die Zuführung von Medikamenten mit einem schmalen therapeutischen Fenster (z.B. einiger Formen der Chemotherapie) verwendbar oder für die Zuführung von Medikamenten mit schwerwiegenden Nebenwirkungen auf Nichttarget-Gewebe. Im Allgemeinen sind die Partikel verwendbar, wenn eine allgemeine systemische Verabreichung eines Medikaments unerwünscht ist.
Die Partikel sind besonders nützlich für die Zerstörung von Krebszellen und lassen sich zur Zuführung chemotherapeutischer Mittel oder radiotherapeutischer Mittel verwenden. Krebszellen besitzen oftmals mindestens eine ausgeprägte Oberflächenstruktur, die zum Binden der Partikel geeignet ist, und verfügen oftmals über eine ausgeprägte Physiologie, wie beispielsweise höhere Wachstumsgeschwindigkeit, die oftmals das Gleichgewicht physiologischer Krankheitszustände, wie beispielsweise Redox, in ihrer Lokalität stört. Daher werden Krebsformen besonders geeignet mit den Partikeln im Targeting behandelt.
Die Partikel sind außerdem für die Behandlung mikrobieller Infektionen verwendbar, wie beispielsweise eine bakterielle Infektion. Zur Bekämpfung einer respiratorischen Infektion kann beispielsweise ein Aerosol von Partikeln, die ein Antibiotikum enthalten, inhaliert werden. An einem weiteren Beispiel haben wir festgestellt, dass ein Partikel, welches mit dem Antibiotikum beladen ist, zum Targeting und Abtöten von Bakterien verwendet werden kann, die Blut infizieren. Damit sind die Partikel für die Behandlung von Sepsis usw. verwendbar.
Die Partikel können auch nach dem sechsten oder siebten Aspekt der Erfindung in der Behandlung anderer Erkrankungen verwendet werden. Beispielsweise können Zellen, die bei Immunantworten des Körpers beteiligt sind, unter Verwendung von Partikeln behandelt werden, in die therapeutische Mittel eingebaut sind. Bei einigen Erkrankungen, wie beispielsweise Autoimmunerkrankungen, kann es von Nutzen sein, spezielle Zellen zu unterdrücken, die bei dem Angriff von Körpergeweben beteiligt sind, während es bei anderen Erkrankungen, wie beispielsweise bei schwachen Zellular- oder Immunantworten gegen Infektionen oder Krebserkrankungen, es von Nutzen sein kann, die Entwicklung, das Wachstum oder den Metabolismus spezieller Zellpopulationen oder Subpopulationen zu fördern, um einen verbesserten Schutz gegen derartige Erkrankungen zu bewirken.
Die Partikel nach dem sechsten oder siebten Aspekt der Erfindung sind auch nützliche Mittel zum Behandeln von Erkrankungen, in denen Zellen, die in sehr geringen Zahlen angetroffen werden, für den Betreffenden schädlich sein können (beispielsweise bei kleinen und/oder neu entwickelten malignen Geweben).
Die Verwendung von mehr als einem Partikel-Typ ermöglicht das Targeting von mehr als einem Medikamenten-Typ im Bezug auf die gleiche Wirkungsstelle. Wenn daher zwei Komponenten zur Erzeugung eines wirksamen Arzneimittels benötigt werden, ließe sich jede in einem anderen Partikel bereitstellen. Andererseits können mehrere Medikamente zu der gleichen Targetstelle zugeführt werden (z.B. mehrere verschiedene Antibiotika gegenüber mehrfachen arzneimittelresistenten Infektionen). Ebenfalls ist es möglich, viele Partikel auf die Wirkungsstelle unter Verwendung einer Mindestmenge an Antikörper zu richten, wenn verschiedene, ein Medikament führende Partikel um die Target-Zelle aggregiert sind. Die Aggregatbildung von Partikeln ermöglicht außerdem ein Targeting in einer größeren Menge eines weniger starken oder weniger löslichen Medikamentes in Bezug auf die Wirkungsstelle. Alle vorstehend beschriebenen Systeme werden durch das metabolische Signal von den Target-Zellen aktiviert und negieren somit jegliches nichtspezifische Binden oder Antikörper an anderen Zellen.
Unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen werden nachfolgend Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung anhand von Beispielen beschrieben.
Es zeigen:
1 eine schematische Darstellung eines Aggregates von Partikeln gemäß der Erfindung;
2 eine graphische Darstellung von Wachstumskurven von vier Salmonellen-Spezies in Beispiel 2;
3 eine graphische Darstellung einer Wachstumskurve von S. enteritidis mit und ohne Liposomen mit einem Start-Inokulum von 2 × 10⁸ kolonniebildenden Einheiten/ml von Beispiel 2;
4 eine graphische Wachstumskurve für S. entiridis mit und ohne Liposomen mit einem Start-Inokulum von 2 × 10⁷ koloniebildenden Einheiten/ml von Beispiel 2; und
5 eine graphische Darstellung einer Wachstumskurve für S. enteritidis mit und ohne Liposomen mit einem Start-Inokulum von 2 × 10⁶ koloniebildenden Einheiten/ml von Beispiel 2.
1 veranschaulicht einen bevorzugten Aggregatbildungskomplex von Partikeln nach dem fünften Aspekt der Erfindung. In 1 sind Antikörper 1 mit einem ersten bindenden Teil 2 konjugiert und erzeugen die primäre Wechselwirkung des Bindens mit der Target-Zelle 3. Partikel 4 aggregieren dann mit einer Vielzahl von sekundären bindenden Teilen 5 um das Konjugat herum durch komplementäres Binden zwischen den ersten zwei und den zweiten fünf bindenden Teilen. Das Aggregat kann durch Hinzufügung weiterer Partikel mit weiteren bindenden Teilen 6 vergrößert werden (die unter Umständen dem bindenden Teil 2 gleich sein können), die dann an einem zweiten bindenden Teil 5 binden. Wie sich erkennen lässt, wird die Größe des potentiellen Aggregats lediglich durch die Verfügbarkeit weiterer Partikel mit bindenden Teilen begrenzt.
BEISPIEL 1
Es wurden Partikel nach dem ersten Aspekt der Erfindung entsprechend den folgenden Protokollen hergestellt. Die Partikel waren nach dem Verfahren nach dem zweiten Aspekt der Erfindung durch Hinzufügung von Biotin zur Aggregatbildung in der Lage. Die Partikel wurden sodann in einem Verfahren zum Detektieren auf Vorhandensein von Bakterien nach dem vierten Aspekt der Erfindung (1.4) genutzt.
1.1. HERSTELLUNG VON BIOTINYLIERTEN LIPOSOMEN-KAPSELNDE GLUCOSEOXIDASE
Es wurde Phosphatidylcholin (Sigma P-3556) mit 40 mg, 11 mg Cholesterol (Sigma C8667), 2,8 mg Dihexadecylphosphat (Aldrich 27,149-7) in 5 ml 1:1 Chloroform zu Methanol (beide von BDH HiPer Solv) aufgelöst und in einen runden 50 ml-Rundkolben gegeben. Es wurden 0,272 mg Biotin-DPPE (Pierce 22008) als 1 mg/ml in 1:1 Chloroform zu Methanol aufbereitet und in den Kolben gegeben, was sodann auf einem Rotationsverdampfer bis zur Trockene eingedampft wurde. Der Kolben wurde anschließend auf einen Gefriertrockner für mindestens eine Stunde gesetzt, um etwaige letzte Spuren an Lösemittel abzutreiben.
Der resultierende Lipidfilm wurde sodann mit 13 mg Glucoseoxidase (GOD) in 7,5 ml Tris-Puffer pH 7,1 hydratisiert und über Nacht in dem Gefrierschrank vor dem Gefrieren in flüssigen Stickstoff mit nachfolgendem Auftauen in einem Wasserbad aufbewahrt. Dieses wurde fünf Mal wiederholt.
Die Liposomen wurden sodann zwei Mal durch eine Polycarbonatmembran mit 0,4 μm und anschließend zehn Mal durch diese mit 0,2 μm unter Verwendung von sauerstofffreiem Stickstoff zwischen einem Druck von 5 und 40 bar extrudiert (Extruder – Lipex Biomembranes Inc. Vancouver, Kanada). Die Aufbewahrung der Liposomen erfolgte bei 22°C nach Extrusion sowie nach allen Schritten danach. Die Liposomen wurden sodann unter Anwendung der Gelfiltration und unter Verwendung einer Sepharose CL-6B-Säule (Sigma CL-6B-200) und 10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Sigma T1503)-Puffer mit pH 7,1 gereinigt. Die Säule hatte ein Gesamtvolumen von 50 ml CL6B mit einem Hohlvolumen von 14 ml, 2 ml Aliquots von ungereinigten Liposomen wurden in die Säule gegeben und 1 ml-Fraktionen von dem optisch trüben Elutionsmittel aufgenommen. Jede Fraktion wurde sodann auf nichtgekapselte und gekapselte Enzymaktivität entsprechend der nachfolgenden Beschreibung assayiert.
1.2. ASSAY VON EINE ENZYMSPEZIES KAPSELNDEN LIPOSOMEN (GLUOSEOXIDASE)
Es wurden Liposomen assayiert, so dass diejenigen, die GOD kapseln, selektiert werden konnten.
1.2.1. SPEKTROPHOTOMETER-PROZEDUR
Es wurden zwei Lösungen A und B angesetzt:

A: 300 mg D-Glucose und 200 International Units Horseradish Peroxidase (HRP, Sigma P6782) (Meerrettichperoxidase) in 20 ml eines 50 mM-Natriumphosphat-Puffers mit pH 6.
B: 1 mg/ml 5-Aminosalicylsäwe (5-ASA, Sigma A3537) in Phosphat-Puffer mit pH 6 (ein Substrat für HRP).

Es wurden 0,5 ml von A und 0,5 ml B in eine Küvette gegeben und zur Nullpunktjustierung eines UV/Vis-Spektrophotometers bei 450 nm verwendet.

(a) In die Küvette wurden 30 μl Liposomen (1.1) gegeben. Sodann wurde die Glucoseoxidase-Aktivität in der Küvette gemessen, um das Maß der Verkapselung einzuschätzen. Jegliche resultierende Enzymaktivität war eine Folge von ungekapselter GOD, die entweder in der Lösung frei vorlag oder an dem Äußeren der Vesikel gebunden war. Je geringer damit die gemessene Aktivität war, um so besser war die Verkapselung von GOD.
(b) Anschließend wurden 10 μm 10%ige Triton X100 (Pierce 28314) in die Küvette gegeben (um eine Lyse der Partikel herbeizuführen). Die Küvette wurde bewegt und erneut in das Spektrophotometer gegeben. Sodann wurde die Enzymrate der lysierten Liposomen gemessen, um die Gesamt-GOD in der Probe einzuschätzen.

Es wurden Liposomfraktionen mit hohem gekapseltem Enzym und geringem Hintergrundsignal gepoolt, der Rest wurde verworfen.
1.2.2. WEITERE REINIGUNG VON GOD EINBAUENDEN LIPOSOMEN
Es wurden Liposomen weiter gereinigt, indem Liposomfraktionen durch eine Concanavalin A-Sepharose 4B-Säule (Sigma C9017) nach unten geleitet wurden, um den Glucosyl-Teil des Glykoproteins GOD zu binden. Dadurch wurde weiteres GOD entfernt, das auf dem Äußeren der Liposomen gebunden war.
Alternativ wurde eine weitere Reinigung durch hydrophobe Ionenchromatographie unter Verwendung von Aminopropyl-Glaskügelchen (Sigma G 5019) oder Trypsin, das auf Glaskügelchen gebunden war (Sigma T 8899) erreicht. Den Kügelchen wurde Liposomen zugegeben (1 ml zu 100 mg) und auf einem Walzenmischer für 14 Stunden inkubiert.
Wird das an dem Äußeren der Liposomen gebundene Enzym nicht entfernt, so führt dieses zu einem hohen nichtspezifischen Hintergrundsignal und macht die Detektion der Bakterien unmöglich.
1.2.3. AGGREGATBILDUNG VON AVIDIN
Das Vorhandensein von Biotin auf der Außenseite der Liposomen wurde durch Aggregatbildung der Liposomen mit Avidin bestätigt.
Es wurde ein Spektrophotometer auf 600 nm eingestellt und als Blindprobe 1 ml Tris-Puffer mit pH 7,1 verwendet. Es wurden 100 μl gereinigte biotinylierte Liposomen zu 1 ml Tris, pH 7,1, gegeben und eine relativ flache Linie in Abhängigkeit von der Zeit festgestellt, die die anfängliche Trübung der Liposomen zeigte. Zu dieser Küvette wurden 30 μl-Aliquots von 1 mg/ml Avidin gegeben, bis das Absorptionsmaß abzunehmen begann und eine Avidinsättigung zeigte, wodurch die Liposomen nicht mehr länger aggregierten.
Die Zugabe einer ausreichenden Menge von Avidin bewirkte eine Aggregatbildung der Liposomen und erhöhte dadurch die Trübung der Probe (gemessen als Zunahme des Absorptionsmaßes im Spektrophotometer). Die Zugabe von weiterem Avidin bewirkte die Bildung sehr großer Aggregate, die aus der Suspension ausfielen (wodurch das Absorptionsmaß abnahm). Ein Überschuss von Avidin führte zur Bildung kleiner Aggregate, die zu einem verringerten detektierbaren Signal führten.
1.3. EINBAU EINES ZYTOLYTISCHEN PEPTIDS (M-GALA)
Es wurde ein Partikel nach dem ersten Aspekt der Erfindung durch Einbau von M-GALA in die Lipid-Doppelschicht des nach dem Verfahren von 1.2. erzeugten Liposoms erzeugt.
N-Myristin-GALA hat eine Aminosäuresequenz von W-E-A-A-L-A-E-A-L-A-E-A-L-A-E-H-L-A-E-A-L-A-E-A-L-E-A-L-A-A (worin W Tryptophan ist, E ist Glutaminsäure, A ist Alanin, L ist Leucin und H ist Histidin). Die Myristinsäure wird mit dem N-Terminus (Tryptophan; W) umgesetzt, um N-Myristin-GALA zu ergeben.
Durch M-GALA wird das Partikel pH-empfindlich und ist damit auf ein metabolisches Signal von einer Target-Zelle ansprechbar (die Zellen neigen dazu, ihre Umgebung anzusäuern). Eine Abnahme des pH-Wertes bewirkt eine gleichzeitige Änderung in M-GALA, die die Permeabilität der Lipid-Doppelschicht des Partikels erhöht und dadurch die Aktivierung von HRP möglich macht (was in der extravesikulären Umgebung zur katalytischen Oxidation von Glucose führt).
Liposomen (von 1.2.) wurden filtersterilisiert durch ein 0,22 μm-Filter. Es wurde eine Lösung von 0,1 mg/ml M-GALA in demineralisiertem Wasser angesetzt, indem einige wenige Kristalle Ammoniumcarbonat zum Auflösen zugegeben wurden. Dieses wurde dann ebenfalls filtersterilisiert. Es wurden 500 μl sterilisierte Liposomen und 750 μl sterilisierte M-GALA-Lösung (oder Anteile davon) gemischt und bei Raumtemperatur für 30 min inkubiert.
Es wurde festgestellt, dass die Menge des verwendeten M-GALA für eine erfolgreiche Herstellung von Partikeln nach dem ersten Aspekt der Erfindung entscheidend war. Zu viel Peptid bewirkt die vorzeitige Freisetzung dieser in den Liposomen enthaltenen Spezies, während zu wenig zur Folge hat, dass das Partikel auf das metabolische Signal nicht ansprechbar ist.
1.4. DETEKTION VON BAKTERIEN NACH DEM VERFAHREN NACH DEM VIERTEN ASPEKT DER ERFINDUNG
Es wurden unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Partikel Bakterien detektiert. GOD und HRP wurden in einem verbundenen Enzymassay genutzt, das ein farbiges Produkt ergab und für das Vorhandensein von Bakterien hinweisend ist. Die Aktivierung von Partikeln führte zu der durch GOD vermittelten Erzeugung von H₂O₂. Dieses wurde wiederum mit 5-ASA (vermittelt durch HRP) zur Reaktion gebracht, um ein leicht detektierbares komplexes farbiges Produkt zu ergeben. Das Vorhandensein von farbigem Produkt ist Hinweis dafür, dass die Partikel auf das metabolische Signal angesprochen haben und dass die im Targeting getrockneten Zellen vorhanden waren. Es gilt als anerkannt, dass der Betrag der erzeugten Farbe quantitativ bestimmt werden kann, um einen Hinweis für die Zahl der vorhandenen getroffenen Zellen zu liefern.
Es wurde ein Agarplatten-Assay ausgeführt, um die Nutzanwendung der Partikel zum Nachweis von Bakterien in einer Probe zu veranschaulichen.
1.4.1. HERSTELLUNG VON MEDIEN
Es wurden Agarmedien hergestellt, die Pepton (5 g/l), Hefeextrakt (2 g/l), Glucose (10 g/l) und Agar (15 g/l) aufwiesen.
Vor dem Gießen der Platten wurde 1 mg/ml 5-Aminosalicylsäwe (20% des fertigen Volumens der Medien) filtersterilisiert und der Platte mit 0,1% (bezogen auf das fertige Volumen) steriles HRP (100 IU/ml) zugegeben. Nach dem Gießen und Härten wurde der pH-Wert der Platten überprüft, um zu gewährleisten, dass er oberhalb von 6,8 lag. Alternativ wurde das 5-ASA zu den Medien vor dem Autoklavieren zugegeben, da dadurch Agarplatten erzeugt wurden, die über der Oberfläche einen gleichförmigeren pH-Wert hatten. Sofern Platten mit pH 6 benötigt wurden, wurden die Medien vor dem Autoklavieren auf pH 7 eingestellt und bei pH 7 Platten wurden die Medien vor dem Autoklavieren auf pH 8,3 eingestellt.
1.4.2. DETEKTION DER BAKTERIEN
Es wurde eine Salmonellenkultur in TSB (Oxoid CM 129) oder BHI (Oxoid CM225) als Kulturmedium über Nacht bei 37°C aufgezogen. Am Morgen wurde dieses in frischen Medien in subkulturgenommen und für weitere 2 Stunden wachsen gelassen, wodurch gewährleistet wurde, dass sich die Kultur in der Logphase des Wachstums befand. Die Reihenverdünnung der Kultur wurde in PBS ausgeführt.
Es wurden 1 mg CSA-Antikörper (Bactrace 01-91-99) und 1,3 mg Avidin (Sigma A9390) in 833 μl sterilem PBS aufgelöst und filtersterilisiert. Anschließend wurden 167 μl von 1 mg/ml Protein G-Biotin (Sigma P8045) in PBS filtersterilisiert und zugegeben. Die Mischung wurde zusammen für 30 min inkubiert.
Zu 1 ml einer Bakterienverdünnung wurden 20 μl des CSA-Antikörpers Protein G-Biotin-Avidin-Komplex zugegeben und für 90 min inkubiert. Diese Mischung wurde bei 13000 g für 10 min zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die Pellets wurden erneut in 1 ml PBS suspendiert, nochmals zentrifugiert und der Überstand verworfen (indem ungebundener Komplex und überschüssiges Avidin entfernt wurde).
Anschließend wurden 10 μl Partikel (siehe 1.4) und 900 μl PBS zugegeben und die Mischung für weitere 30 min vor der Zugabe von 20 μl sterilem Avidin zu dem Aggregat der Liposomen inkubiert. Nach einer weiteren Inkubation von 60 min wurde die Mischung mit 0,1 g für 4 min zentrifugiert und dann für 15 min stehen gelassen, um das Absetzen des aggregierten Komplexes zu fördern. Der Überstand wurde sorgfältig entfernt und das Pellet sodann erneut in 20 μl PBS suspendiert und dieses Volumen sodann der getrockneten Agarplatte zugegeben. Die Platte wurde bei 37°C inkubiert und in Abständen von einer halben Stunde bis zu 6 Stunden beobachtet.
1.4.3. ERGEBNISSE
Das Vorhandensein eines farbigen Produktes der HRP-vermittelten Reaktion ist hinweisend für das Vorhandensein von Bakterien in der Probe (ein positives Ergebnis).
Es wurden Versuche ausgeführt, bei denen mit Wärme und Formalin getötete Zellen (als Kontrollen) und Zellen verglichen wurden, die wie vorstehend behandelt wurden. Die Farbentwicklung wurde in zwei Arten von Salmonellen getestet.
Bei Lebendproben von S. enteritidis war eine 185 Zellen enthaltende Probe in 30 nun positiv, während eine Probe, die 18 Zellen enthielt, in 2 Stunden positiv war. Bei Lebendproben von S. typhimurum war eine 115 Zellen enthaltende Probe in 1 Stunde positiv, während eine Probe, die 11 Zellen enthielt, in 2 Stunden positiv war. Kontrollproben von getöteten Zellen lieferten kein Signal.
Diese Ergebnisse demonstrieren die Geschwindigkeit, mit der die Methode nach dem vierten Aspekt der Erfindung zum Detektieren von Bakterien angewendet werden kann. Darüber hinaus kann die Methode zur Unterscheidung lebensfähiger Zellen von toten Zellen angewendet werden.
Innerhalb von 2 Stunden ist der Nachweis von näherungsweise 10¹ bis 10² kolonniebildenden Einheiten möglich. Dadurch wird gegenüber konventionellen Methoden die Detektionsdauer stark verbessert und die Detektion von Zellen innerhalb eines einzigen Arbeitstages in einer Probe ermöglicht, die 10² lebensfähige Zellen (oder weniger) enthält.
1.5. DETEKTION VON BAKTERIEN NACH DEM VERFAHREN NACH DEM VIERTEN ASPEKT DER ERFINDUNG IN LEBENSMITTELN
1.5.1. AUSWAHL DER LEBENSMITTEL ZUM TESTEN
Das Verfahren des vierten Aspektes der Erfindung wurde angewendet (unter Einsatz der vorstehend beschriebenen Partikel), um auf das Vorhandensein von Salmonella in verschiedenen Lebensmittel zu testen. Ebenfalls wurde an den Lebensmittelproben der Nachweis von Salmonella nach dem Britischen Standard (BS5763:Teil 4:1990) ausgeführt, um die Empfindlichkeit und Selektivität des erfindungsgemäßen Verfahrens zu bewerten.
Bei den Lebensmitteln, die getestet wurden, handelte es sich um Vollei, Magermilchpulver, Milchschokolade, rohes Hackfleisch, gekochtes Hühnerfleisch und rohen Kohl. Die Lebensmittel wurden auf der Grundlage der folgenden Kriterien ausgewählt:

a) inbeziehung von Lebensmittel(n) aus einer größeren Lebensmittelgruppe (Fleisch/Fisch, Molkereiprodukt, Gemüse)
b) Einbeziehung von Lebensmittel(n) in Abhängigkeit von unterschiedlichen Verarbeitungsbedingungen (roh, gekocht, getrocknet)
c) Einbeziehung von Lebensmittel(n) mit einer Variation der Nährstoffzusammensetzungen (Gehalt an Fett, Protein, Kohlenhydrat)
d) Einbeziehung größerer Lebensmittelvektoren für Salmonella
e) Einbeziehung von Lebensmitteln, die reich sind an Biotin und/oder Avidin, wie beispielsweise Eier und Magermilch. Diese Kategorie wurde einbezogen, um die Möglichkeit einer Störung von dem Avidin/Biotin in dem Lebensmittel in Bezug auf das Binden der biotinylierten Liposome des CSA-Antikörper/Protein G-Komplex (siehe vorstehend) zu bewerten.

Die Testproben der Lebensmittel wurden versetzt mit 10 bis 100 (niedrig) kolonniebildenden Einheiten von Targetorganismen (S. enteritidis), 10⁴ bis 10⁶ (hoch) kolonniebildenden Einheiten von Targetorganismen (S. enteritidis) oder wurden ohne Zusatz gelassen (Kontrollproben). Alle Lebensmittel wurden auf die jeweilige Zusatzmenge zweifach analysiert.
Das Inokulum zum Versetzen wurde hergestellt, indem über Nacht eine BPW-Kultur von S. enteritidis in PBS bis 10^–6 (für den niedrigen Versetzungswert) und 10^–3 (für den hohen Versetzungswert) verdünnt wurde. Anschließend wurden die Lebensmittelproben mit 0,1 ml der 10^–3-Verdünnung (niedriger Versetzungswert) oder 1 ml der 10^–3-Verdünnung (hoher Versetzungswert) beimpft. Die Zahl der Organismen, mit der die Lebensmittelproben versetzt wurden, wurde überprüft, indem in doppelter Ausführung PBS-Verdünnungen auf Agar zur Keimzahlbestimmung unter Anwendung einer Plattenausstreichmethode ausgezogen wurden. Die Platten wurden bei 37°C für 24 Stunden inkubiert, wonach die Kolonien gezählt wurden.
Es wurden 25 g jeder Lebensmittelprobe mit 225 ml gepufferter Pepton-Wasser-Kulturbrühe gemischt und anschließend mit S. enteritidis entsprechend der vorstehenden Beschreibung versetzt und sodann für 16 bis 20 Stunden inkubiert. Die Brühe wurde sodann auf 1:10 unter Verwendung von PBS vor dem Testen mit den Partikeln verdünnt.
1.5.2. ERGEBNISSE
Salmonella wurden in allen Lebensmittelproben nachgewiesen, die Bakterien enthielten (sowohl mit hohem Wert als auch mit geringem Wert versetzte Proben), indem das Verfahren nach dem vierten Aspekt der Erfindung angewendet wurde. Es gab keinerlei fehlerhafte negative Ergebnisse.
Im Gegensatz dazu lieferte die BS-Methode fehlerhafte negative Ergebnisse bei einigen der "gering" versetzten Lebensmittelproben (jeweils eine Wiederholungsprobe für Hackfleisch und Kohl mit geringen Versetzungsmengen).
Damit liefert das Verfahren nach dem vierten Aspekt der Erfindung eine Möglichkeit, nach der Bakterien in Lebensmittelproben nachgewiesen werden können, was eine Verbesserung gegenüber einer konventionellen Prüfmethode darstellt.
BEISPIEL 2
Es wurden Partikel nach dem ersten Aspekt der Erfindung hergestellt, die Asparaginase als die in das Liposom eingebaute Spezies enthielten. Diese Partikel wurden in einer Methode zur Detektion auf Bakterien nach dem vierten Aspekt der Erfindung verwendet, die das Assayieren von Leitfähigkeitsänderungen (das metabolische Signal) umfasste, die durch die Targetbakterien vermittelt wurden.
In der Leitfähigkeitsmethode führten pH-Wert-Änderungen, die durch die Salmonella-Bakterien in einer Probe hervorgerufen würden, zu einem pH-empfindlichen zytolytischen Peptid (M-GALA) in dem Liposompartikel, das die Freisetzung von Asparaginase aus dem Liposom vermittelte. Die freigesetzte Asparaginase reagiert mit Asparagin in dem Medium, um eine weitere Erhöhung der Leitfähigkeit hervorzurufen (NH₃-Erzeugung) und dadurch zur Verstärkung der Leitfähigkeitsänderung zu führen, die durch die Bakterien an sich vermittelt wird.
Durch Asparagniase vermittelte Reaktion: L-Asparagin + H₂O → L-Aspartat + NH₃
2.1. HERSTELLUNG VON ASPARAGINASE KAPSELNDEN LIPOSOMEN
Es wurde Asparaginase (1000 IU/ml, CAMR, Porton Down) hergestellt, indem die gefriergetrackneten Inhalte einer Ampulle mit 10000 Einheiten in einem 0,22 μm-Filter in sterilisiertem demineralisiertem Wasser auf 1000 Einheiten/ml verdünnt wurden und in einem Gefriertrockner in 1 ml-Aliquots bis zur Verwendung aufbewahrt wurden.
Es wurde Phosphatidylcholin (Sigma P3556) mit 50 mg/ml in einer 1:1-Mischung von Chloroform:Methanol angesetzt und vor Gebrauch in dem Gefrierapparat aufbewahrt. 800 μl dieser Mischung wurden entnommen und in einen 50 ml-Rundkolben gegeben. 11 mg Cholesterol (Sigma C8667) ausgewogen und in 2 ml Chloroform:Methanol (1:1 Volumen/Volumen) aufgelöst und ebenfalls dem Rundkolben zugegeben. Anschließend wurden 2,8 mg Dicetylphosphat (Sigma D2631) ausgewogen und in Chloroform:Methanol aufgelöst und ebenfalls dem Rundkolben zugegeben.
Die Probe wurde auf dem Rotationsverdampfer unter Verwendung eines bei 35°C eingestellten Wasserbades eingedampft, bis sämtliches Lösemittel entfernt worden war, wonach ein dünner Lipidfilm auf dem Kolben zurückgelassen wurde. Der Kolben wurde anschließend über Nacht in einen Gefriertrockner gegeben, um zu gewährleisten, dass auch die letzten Spuren des Lösemittels entfernt worden waren.
Sodann wurden 6 ml demineralisiertes Wasser zusammen mit 750 μl von 100 mM Tris, pH 7, und 750 μl Asparaginase (1000 IU/ml) dem Kolben zugegeben und für 2 Stunden bei Raumtemperatur leicht gemischt. Nach Ablauf dieser Zeit wurde die Lipidmischung in flüssigen Stickstoff getaucht, bis sie vollständig gefroren war. Anschließend wurde die Mischung in ein bei 35°C eingestelltes Wasserbad bis zum vollständigen Schmelzen getaucht. Der Gefrier/Auftauprozess wurde insgesamt fünf Mal ausgeführt.
Es wurde ein Extruder mit einer Ablaufscheibe gefolgt von zwei 0,4 μm-Membranen zusammengebaut. Die Lipidmischung wurde sodann zwei Mal durch den Extruder mit einem Mindestdruck von der sauerstofffreien Stickstoffleitung geleitet. Die Scheiben wurden sodann gegen zwei 0,2 μm-Scheiben ausgewechselt und die Lipidmischung insgesamt zehn Mal durchgeleitet. Die resultierenden Liposomen wurden anschließend in einem Kühlschrank aufbewahrt.
Die Liposomen wurden gereinigt, um jegliches überschüssiges Enzym zu entfernen, das nicht gekapselt worden war. Dieses wurde ausgeführt, indem 100 mg Trypsin aufgebracht auf DITC-Glaskügelchen zu 1 ml Liposomen zugegeben wurden und für 11 bis 12 Stunden bei Raumtemperatur gemischt wurde. Die Kügelchen wurden vor Gebrauch in demineralisiertem Wasser gewaschen, um den Stabilisator zu entfernen. Nach Ablauf der Inkubationsdauer wurden die Kügelchen durch Zentrifugieren für 10 min bei 13000 U/min entnommen. Die Liposomen wurden entnommen und bei Gefriertemperaturen aufbewahrt.
Um die Liposomen pH-empfindlich zu machen, wurde das M-GALA-Peptid in die Lipidmembran insertiert. Dieses wurde durch Inkubieren der M-GALA-Lösung (0,1 mg/ml) mit den Liposomen in gleichen Volumina für 30 min erreicht.
2.2. LEITFÄHIGKEITSTESTS
Es wurden Tests auf einem "Don Whitley Scientific RABIT"-Instrument (Rapid Automated Bacterial Impedance Technique) ausgeführt. Das System verwendet zwei einzeln zusammengesetzte Kunststoffzellen mit zwei Elektroden in dem Boden. Die Kunststoffzellen sitzen in einem bei 37°C gehaltenen Modul, der an einem Computer angeschlossen ist, von dem das Instrument betrieben wird. Die Medien (Minimum 2 ml) wurden in die jeweilige Zelle gegeben und das System auf Leitfähigkeitsabmessung für jede der 32 Zellen für jede Minute bis zu 24 Stunden eingestellt.
Die im Targeting zu behandelnden Bakterien wurden in spezifisch angesetzten selektiven Medien aufgezogen, die eine geringe Leitfäbigkeit hatten. Das Wachstum der Bakterien führte zu einer Zunahme der Leitfähigkeit der Medien, wobei Leitfähigkeitsänderungen in Abhängigkeit von der Zeit aufgetragen wurden. Bei Einführung pH-empfindlicher Liposomen in das System lösten sich die Liposomen mit dem Wachstum der Zellen auf und senkten den pH-Wert, wodurch die Asparaginase/Asparagin eine schnellere Leitfähigkeitsänderung der Lösung bewirkte als bei Wirkung der Zellen allein.
Die Tests wurden wie folgt ausgeführt: es wurden 2 ml Medium in ein RABIT-Röhrchen eingeführt und für 30 min stabilisieren gelassen. Nach Ablauf dieser Zeit wurden 200 μl Substrat (30 mM Asparagin), 50 μl Peptid (0,00025 mg/ml M-GALA) und 100 μl Liposomen (siehe 2.1.) dem Röhrchen zusammen mit einer Verdünnung einer Bakterienkultur zugegeben. Die Module wurden bei 37°C zwischen 8 und 24 Stunden betrieben und alle Minuten Ablesungen genommen. Im Ablauf dieser Zeit wuchsen Salmonellen, erzeugten Säure, die zur Lyse der Liposomen führte und damit die gemessene Leitfähigkeit erhöhte. Diese Zunahme der Leitfähigkeit ist gezeigt in Form einer mit Hilfe der RABIT-Software dargestellten Wachstumskurve.
2.3. ERGEBNISSE
Wir haben festgestellt, dass die Verwendung von Partikeln nach der vorliegenden Erfindung, die einen geeigneten Verstärker (wie beispielsweise Asparaginase) enthalten, zu einer beschleunigten Nachweiszeit (näherungsweise 2 Stunden) für im Targeting getrocknete Bakterien führt. Dieses lässt sich mit der Nachweisdauer von 8 bis 24 Stunden vergleichen, die unter Verwendung eines selektiven Mediums allein bei den meisten Salmonella-Spezies benötigt wird.
2.3.1. KONVENTIONELLE DETEKTION AUF SALMONELLEN
Die Zeit für die Detektion wurde als die Zeit bestimmt, die für eine sigmoide Wachstumskurve zu sehen ist. Es wurden vier Spezies Salmonella in TMAO bei 37°C für 24 Stunden in Abwesenheit von Partikeln aufgezogen (siehe 2). Wie zu erwarten war, variierte die Zeit für die Detektion zwischen den Spezies und lag zwischen etwa 6 Stunden bei S. enteritidis und 20 Stunden bei S. abony.
2.3.2. TESTS AUF LIPOSOMENEMPFINDLICHKEIT
Die Zeiten für die Detektion auf der RABIT unter Anwendung des Verfahrens nach dem vierten Aspekt der Erfindung wurden unter Anwendung einer Verdünnungsreihe einer Übernacht-Kultur von Salmonella gemessen, da dieses außerdem ein Hinweis für die Zahlen gab, die für die beschleunigte Methode benötigt werden, um vorteilhaft zu sein, d.h. die Empfindlichkeit der Methode.
3, 4 und 5 veranschaulichen das Wachstum von S. enteritidis (2 × 10⁸ kolonniebildende Einheiten/ml, 2 × 10⁷ kolonniebildende Einheiten/ml und 2 × 10⁶ kolonniebildende Einheiten/ml) in Gegenwart der nach dem Protokoll 2.1. aufgebauten Liposomen.
Diese Daten zeigen, dass für die 10^–1-Verdünnung von S. enteritidis (näherungsweise 10⁸ kolonniebildende Einheiten/ml) die logarithmische Wachstumsphase nach etwa 5 Stunden in Gegenwart von Partikeln und 7 Stunden für eine Kontrolle (d.h. bei Abwesenheit von Partikeln) detektiert wurde. Die 10^–2-Verdünnung (10⁷ kolonniebildende Einheiten/ml) zeigte ebenfalls eine näherungsweise 2 Stunden-Beschleunigung in Gegenwart von Partikeln.
Kontrollversuche bestätigten, dass die Leitfähigkeit in Medien, die Partikel (aber keine Bakterien) enthielten, auf einem geringen Wert lag, da die Partikel inaktiviert blieben, während die Zugabe von Triton zu einer raschen Zunahme der Leitfähigkeit führte, da die Lyse der Partikel Asparaginase in das Medium freisetzte (das das Asparagin enthielt).
BEISPIEL 3
Es wurden Partikel nach dem ersten Aspekt der Erfindung nach den folgenden Protokollen hergestellt. Die Partikel wurden anschließend nach dem fünften und sechsten Aspekt der Erfindung genutzt, um Bakterien aus einer Blutprobe zu eliminieren.
3.1. HERSTELLUNG VON GENTAMICIN ENTHALTENDEN PARTIKELN
Es wurden 50 mg Phosphatidylcholin und 13 mg Cholesterin in Chloroform/Methanol (1:1 Volumen/Volumen) in einem Rundkolben aufgelöst und anschließend bis zur Trockene unter Verwendung eines Rotationsverdampfers und eines Wasserbades bei 50°C eingedampft. Der Kolben wurde anschließend über Nacht in einen Gefriertrockner gegeben, um zu gewährleisten, dass keinerlei Spur von Lösemittel zurückblieb. Sodann wurde der Lipidfilm mit 2 ml 10 mM Tris-HCl-Puffer, 20 mg Gentamicin-Sulfat (Sigma G 3632) enthielt, für 2 Stunden auf einer Kolben-Schüttelmaschine vor der Aufbewahrung über Nacht in dem Gefrierschrank hydratisiert. Die Mischung wurde anschließend in flüssigem Stickstoff gefroren und danach in einem Wasserbad aufgetaut, wobei dieser Prozess insgesamt vier Mal wiederholt wurde. Die Liposomen wurden sodann zwei Mal durch eine 400 nm-Polycarbonat-Membran extrudiert, gefolgt von 10 Passagen durch eine 200 nm-Membran. Anschließend wurden die Liposomen mit Hilfe der Gelfiltration (PD 10) vor der Aufbewahrung bei Raumtemperatur gereinigt. Die lysierten Liposomen wurden auf Platten ausgestrichen, auf denen eine Bahn von S. Typhimurium wuchs und sehr viel größere Zonen der Hemmung im Vergleich zu unlysierten Liposomen beobachtet, was demonstriert, dass Gentamicin im Inneren der Partikel gekapselt war (keine Daten angegeben).
3.2. AUFBEREITUNG VON ERYTHROZYTEN
Es wurde frisches Rattenblut erhalten, dem zur Verhinderung der Gerinnung Natriumheparin zugesetzt worden war. Nach dem Zentrifugieren bei 600 g für 10 min und dem Verwerfen des Überstandes wurden die pelletisierten Erythrozyten erneut suspendiert und drei Mal in isotonischem Saccharose-Glucosephosphat-Puffer gewaschen (0,2 Mol Saccharose, 0,1 M Glucose, 10 mM Natriumphosphat, pH 7,3). Die Erythrozyten wurden am gleichen Tag verwendet.
3.3. HÄMOGLOBIN-ASSAY
Es wurde das Austreten von Hämoglobin aus den Erythrozyten (50 μl-Aliquots) spektrophotometrisch bei 578 nm gegen einen isotonischen Saccharin/Glucosephosphat-Puffer assayiert. Die prozentuale Lyse der Erythrozyten wurde durch Konstruktion einer Standardkurve ermittelt. Der Überstand der zentrifugierten Zellen (3.2.) stellte 0% dar, während 100% Lyse durch Inkubation mit 20 μl 10%igem (Volumen/Volumen) Triton X100 für 10 min erhalten wurde.
3.4. HERSTELLUNG VON LIPOSOM-ANTIKÖRPERKONJUGATEN
Es wurden 1 mg CSA-Antikörper in 750 μl Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) aufgelöst und filtersterilisiert durch ein 0,22 μm-Filter. Hierzu wurden 250 μl steriles biotinyliertes Protein G gegeben und die Mischung für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. 60 μl des Komplexes wurden in sterile Eppendorf-Schläuche gegeben, gefolgt von 100 μl sterilen Gentamicin-Liposomen. Es wurden zwei separate Aliquots von 30 μl sterilem Avidin (1 mg/ml) den Eppendorf-Schläuchen zugesetzt, 10 min stehen gelassen und die Mischung für 30 min inkubiert, um einen CSA-Antikörper-Protein G-Biotin-Avidin-aggregierten Biotin-Liposom-Komplex zu erzeugen. Jeder Eppendorf-Schlauch hatte sodann 100 μl steriles M-GALA-Peptid (0,1 mg/ml), das zugegeben wurde, wobei dieses anschließend für weitere 30 min inkubiert wurde.
3.5. ELIMINIERUNG VON BAKTERIEN IN GEGENWART VON ERYTHROZYTEN
Es wurde S. Typhimurium in Trypton-Sojabrühe aufgezogen und anschließend in PBS zu 4.600 kolonniebildende Einheiten pro Milliliter (anhand einer Lebendzahl) verdünnt und 5 μl verdünnte Bakterien zu 50 μl Erythrozyten in 1 ml Saccharose/Glucosephosphat-Puffer zugesetzt, gefolgt von 100 μl Liposomen-Antikörper-Komplex und die Mischung für 30 nun inkubiert.
3.6. ERGEBNISSE
Es wurden Kulturen bei 600 g für 10 nun zentrifugiert und der Überstand spektrophotometrisch entsprechend der vorstehenden Beschreibung untersucht, um die Erythrozytenlyse zu ermitteln. Die Erythrozytenlyse variierte in Gegenwart von Partikeln (jedoch keinen Bakterien) zwischen 0,88 und 0,61% mit einem Mittelwert von 0,73%. Die Zugabe von M-GALA allein zu den Erythrozyten erzeugte eine Lyse von 0,31%. Es erfolgte keine Lyse bei Erythrozyten, die in Puffer allein gelassen wurden.
Bakterien, Erythrozyten und Liposomen-Komplexe wurden sowohl auf Näherstoffagar als auch auf Rambach-Agarplatten ausgestrichen und die Kolonien nach Inkubation über Nacht bei 37°C gezählt. Von den in Gegenwart von Partikeln aufgezogenen Proben wurden lediglich 0,95% Bakterienkolonien im Vergleich zu unbehandelten Organismen beobachtet, die direkt auf der PBS-Verdünnung aufgezogen wurden. Im Gegensatz dazu überlebten 76,1% Organismen den Kontrollversuch, der mit Erythrozyten ausgeführt wurde. Dieses demonstriert das Überleben von Erythrozyten in einem im Targeting behandelten Liposomen-Komplex, bei dem S. Typhimurium wirksam abgetötet wurde.
SEQUENZLISTE

Claims

Verfahren zum Detektieren eines Zell-Typs von Interesse der in einer Probe vorliegt oder potentiell vorliegt, umfassend das Behandeln der Probe mit Lipidvesikel-Partikeln, die auf den zu detektierenden Zell-Typ gerichtet werden, wobei die Partikel ein zytolytisches Peptid inkorporiert haben, welches die Durchlässigkeit der Partikel in Reaktion auf ein vorbestimmtes metabolisches Signal von der getroffenen Zelle moduliert, sofern sie in der Probe vorhanden ist, wobei die Partikel ferner eine Spezies inkorporiert haben, die bei dieser Modulation der Durchlässigkeit aktiviert wird, und Monitoring der Spezies direkt oder indirekt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die Partikel ein Bindemittel aufweisen, das zum Binden des Partikels an dem Zell-Typ von Interesse in der Lage ist, wenn das Partikel darauf gerichtet wird.
Verfahren nach Anspruch 2, bei welchem das Bindemittel ein Antikörper zum Binden an einem Antigen auf dem Zell-Typ von Interesse ist.
Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, bei welchem ein Teil der Partikel einen ersten bindenden Rest hat und einen weiteren Teil einen zweiten bindenden Rest hat, der an dem ersten bindenden Rest binden kann, wodurch die Partikel untereinander aggregiert sind oder dazu in der Lage sind.
Verfahren nach Anspruch 4, bei welchem eine Sammlung von Partikeln um eine zu detektierende Zelle aggregiert ist.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, bei welchem der bindende Rest an einigen Partikeln Avidin ist oder ein Derivat davon und der bindende Rest an anderen Partikeln Biotin ist oder ein Derivat davon.
Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, bei welchem das zytolytische Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus GALA, helikales Erythrozyt-lysierendes Peptid (HELP), KALA und LAGA.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei welchem das zytolytische Peptid N, Myristin-GALA, ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei welchem das zytolytische Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Amphotericin B, Alamethicin, Gramicidin, Melittin, Nigericin, P25, Polymixin B und Valinomycin und Vibriolsin.
Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, bei welchem die Spezies ein Farbstoff ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei welchem die Spezies ein Enzym ist.
Verfahren nach Anspruch 11, bei welchem das Enzym alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder Asparaginase oder Glucoseoxidase ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei welchem die Spezies ein Co-Faktor oder Substrat eines Enzyms ist.
Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, bei welchem die zu detektierenden Zellen pathogene Zellen sind.
Verfahren nach Anspruch 14 zum Analysieren von Lebensmitteln auf Vorhandensein pathogener Zellen.
Verfahren nach Anspruch 14 zum Analysieren von Wasserproben auf das Vorhandensein pathogener Zellen.
Lipidvesikel-Partikel, das auf einen Zell-Typ von Interesse gerichtet werden kann, wobei in das Partikel ein zytolytisches Peptid inkorporiert ist, das auf ein vorbestimmtes metabolisches Signal von der getroffenen Zelle anspricht, um so die Durchlässigkeit des Partikels zu modulieren, wobei in das Partikel ferner eine Spezies inkorporiert ist, die auf die Zelle gerichtet werden soll, die bei dieser Modulation der Durchlässigkeit aktiviert ist.
Partikel nach Anspruch 17, wobei das Partikel eine äußere Lipid-Doppelschicht hat und das metabolische Signal die Durchlässigkeit der Lipid-Doppelschicht moduliert.
Partikel nach Anspruch 17 oder 18, wobei das Partikel ein Liposom ist.
Partikel nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei das Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus GALA, helikales Erythrozyt-lysierendes Peptid (HELP), KALA und LAGA.
Partikel nach einem der Ansprüche 17 bis 19, bei welchem das Peptid N, Myristin-GALA, ist.
Partikel nach einem der Ansprüche 17 bis 19, bei welchem das Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Amphotericin B, Alamethicin, Gramicidin, Melittin, Nigericin, P25, Polymixin B und Valinomycin und Vibriolsin.
Partikel nach einem der Ansprüche 17 bis 22, bei welchem die Spezies ein Enzym ist.
Verfahren nach Anspruch 23, bei welchem das Enzym alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder Asparaginase oder Glucoseoxidase ist.
Partikel nach einem der Ansprüche 17 bis 22, bei welchem die Spezies ein Co-Faktor oder Substrat eines Enzyms ist.
Partikel nach einem der Ansprüche 17 bis 25, wobei das Partikel einen Antikörper zum Targeting auf ein Antigen auf einer Zelle aufweist.
Partikel nach einem der Ansprüche 17 bis 26, wobei das Partikel ferner einen bindenden Rest zum Binden an anderen Partikeln aufweist.
Sammlung von Partikeln nach einem der Ansprüche 17 bis 27, bei welchem ein Teil der Partikel einen ersten bindenden Rest hat und ein weiterer Teil einen zweiten bindenden Rest hat, der in der Lage ist, mit dem ersten bindenden Rest zu binden, wodurch die Partikel miteinander aggregiert sind oder dazu in der Lage sind.
Sammlung von Partikeln nach Anspruch 28, wobei der erste bindende Rest Avidin oder ein Derivat davon ist und der zweite bindende Rest Biotin oder ein Derivat davon ist.
Aggregat, aufweisend eine Sammlung von Partikeln nach Anspruch 28 oder 29.
Aggregat, aufweisend eine Mehrzahl von Lipidvesikel-Partikeln nach einem der Ansprüche 17 bis 27, wobei ein Teil der Partikel einen ersten bindenden Rest hat und ein weiterer Teil einen zweiten bindenden Rest hat, der mit dem ersten bindenden Rest binden kann, wodurch die Partikel untereinander aggregiert sind.
Lipidvesikel-Partikel, das auf einen Zell-Typ von Interesse gerichtet werden kann, wobei das Partikel ein zytolytisches Peptid inkorporiert hat, das auf ein vorbestimmtes metabolisches Signal von der getroffenen Zelle reagiert, um so die Durchlässigkeit des Partikels zu modulieren, wobei in das Partikel ferner eine therapeutisch wirksame Menge einer Spezies inkorporiert ist, um auf die Zelle gerichtet zu werden, die bei der Modulation der Permeabilität aktiviert wird, zur Verwendung in der Behandlung medizinischer Zustände.
Partikel nach Anspruch 32, wobei das Partikel ein Partikel nach einem der Ansprüche 2 bis 9 zur Verwendung in der Behandlung medizinischer Zustände ist.
Partikel nach Anspruch 33 zur Verwendung in der Behandlung von Krebs.
Partikel nach Anspruch 33 zur Verwendung in der Behandlung mikrobieller Infektionen.