DE3935257A1 - Mit antikoerpern verknuepfte liposomen als traeger fuer einen gezielten transport von wirkstoffen und reagenzien - fluoreszenzmarkierung der transportwege und des wirkorts - Google Patents

Mit antikoerpern verknuepfte liposomen als traeger fuer einen gezielten transport von wirkstoffen und reagenzien - fluoreszenzmarkierung der transportwege und des wirkorts

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Description

Der gezielte Transport von pharmakologisch wirksamen Substanzen zum eigentlichen Wirkort ist ein ungelöstes Problem. Während man bei einer großen Anzahl von wirksamen Substanzen eine Verteilung über den ganzen Körper inkaufnehmen kann, ist dies beispiels­ weise bei Cytostatika und anderen Wirkstoffen mit einer geringen therapeutischen Breite höchst unerwünscht. Gerade bei den meist unspezifisch stark toxisch wirkenden Cancerostatika brächte eine Freisetzung erst am Zielort einen wesentlichen Fortschritt in der Therapie. Ein attraktiver Weg, dieses Problem zu lösen, ist die Ausnutzung der Antigen-Antikörper-Reaktion, die die ge­ wünschte Spezifität besitzt. Man könnte nun daran denken, den Antikörper kovalent mit dem Wirkstoff zu verknüpfen. Dies hat aber den Nachteil, daß dadurch die Wirksamkeit des Wirkstoffs oder die Spezifität des Antikörpers beeinflußt werden können - man kann zudem nur wenige Wirkstoffmoleküle mit einem Antikörper transportieren. Außerdem müßte für jeden Wirkstoff ein neues Synthesekonzept für die Verknüpfung entworfen werden. Dies macht das Verfahren umständlich, schwerfällig und synthetisch aufwen­ dig. Wünschenswert wäre ein universelles Trägersystem, dessen Funktion und Transport sich möglichst einfach verfolgen läßt und das viele Wirkstoff- und Markierungs- bzw. Detektions-Moleküle pro Antikörper transportieren kann.
Zum Erstaunen läßt sich dies mit Liposomen erreichen, die mit dem entsprechenden Antikörper verknüpft werden. Der Hohlraum der Liposomen, sowie die Lipidmembranen können sehr unterschiedliche Wirkstoffe aufnehmen, die dann am Zielort aktiv werden.
An Liposomen werden Antikörper immobilisiert. Die Immobilisie­ rung ist sowohl über kovalente Bindungen als auch über Nebenva­ lenzkräfte möglich. Für die kovalente Immobilisierung eignet sich die direkte Kondensation zwischen funktionalisierten Lipo­ somen und Antikörpern unter Zuhilfenahme an und für sich bekann­ ter Kondensationsmittel. Für die kovalente Immobilisierung eignet sich besonders N-Succinimidyl-3-(2-pyridyl­ dithio)propionat (SPDP) und N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat (SATA), das etwas bessere Kupplungsresultate liefert (J.T.P.Derksen, G.L.Scherphof, Biochim.Biophys.Acta 814 (1985) 151). Für die eigentliche Kupplung wird die Reaktionsfolge nach Abb.1 ausgeführt.
Für die Immobilisierung über Nebenvalenzkräfte eignet sich be­ sonders die Biotin-Avidin-Komplexierung (H.Schott, B.Leitner, R.A.Schwendner, H.Hengartner, J.Chromatogr. 441 (1988) 115). Die Kupplung wird nach der Reaktionsfolge der Abb. 1c durchgeführt Wesentlich für die Anwendung der mit Wirkstoffen beladenen und mit Antikörpern versehenen Liposomen ist die Möglichkeit, ihren Transport und das Binden an den Zielort verfolgen zu können. Bei in-vitro-Versuchen besteht zwar grundsätzlich die Möglichkeit, dies mit einer radioaktiven Markierung zu erreichen, die die er­ forderliche Nachweisempfindlichkeit liefert. Hier ist aber be­ reits der Umgang mit radioaktiven Stoffen störend, da er beson­ dere Vorsichtsmaßnahmen erfordert. Bei klinischen Anwendungen sollte man dagegen nach Möglichkeit auf jegliche radioaktiven Stoffe verzichten. Günstiger ist es daher, die Liposomen mit ei­ ner Markierung zu versehen, die unproblematisch und ungefährlich mit optischen Methoden nachgewiesen werden kann. Die Liposomen können hierfür mit einem Farbstoff versehen werden. Eine quanti­ tative Bestimmung des Farbstoffs über seine Lichtabsorption er­ weist sich aber als schwierig und störanfällig, da eine Absorp­ tionsmessung eine optische Qualität der Probe voraussetzt. Dies ist bereits bei der Liposom-Antikörper-Kombination wegen deren Größe nicht gegeben. Bei gebundenen Antikörpern werden die Unsi­ cherheiten noch erheblich größer.
Einen erstaunlichen Fortschritt bringt die Verwendung von Fluo­ reszenzfarbstoffen als optische Markierer. Die Probe wird durch die optische Anregung nun selbst zur Lichtquelle, die problemlos auf einen optischen Empfänger fokussiert werden kann. Außerdem bietet die Fluoreszenz den Vorteil einer sehr hohen Nachweisemp­ findlichkeit, da gegenüber dem nichtfluoreszierenden Hintergrund gemessen wird.
Für den Fluoreszenzfarbstoff sind jedoch einige Randbedingungen zu beachten : Da biologische Proben selbst leicht bläulich fluo­ reszieren, sollte die Fluoreszenz des Farbstoffs außerhalb die­ ses Wellenlängenbereichs liegen, also genügend langwellig sein. Zum Erreichen einer hohen Nachweisempfindlichkeit wird man ein Anregungslicht mit hoher Intensität verwenden. Der Fluoreszenz­ farbstoff muß daher eine hohe Photostabilität besitzen, um nicht während der Messung auszubleichen. Schließlich sollte der Farb­ stoff nicht toxisch sein. Eine besonders wichtige Eigenschaft ist ein festes Haftvermögen an den Liposomen, denn während des Transports darf der Farbstoff nicht freigesetzt werden. Anderer­ seits darf der Farbstoff nicht an den Antikörper selbst binden, da dadurch möglicherweise seine Spezifität und sein Bindungsver­ mögen nachteilig beeinflußt wird. Schließlich darf der Farbstoff auch die Adsorptionseigenschaften der Liposomem nicht verändern.
Diese Bedingungen werden in überraschend guter Weise vom Pery­ lenfarbstoff 1 erfüllt (N,N′-Bis(1-hexylheptyl)-3,4 : 9,10-pery­ lenbis(dicarboximid), für die Synthese siehe S.Demmig, H.Langhals, Chem.Ber. 121 (1988) 225), der die Eigenschaften hohe Photostabilität, große Fluoreszenzquantenausbeute (100%), gute Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln (lipophile Me­ dien) und langwellige Fluoreszenz (540 und 575 nm) in sich ver­ einigt. Außerdem sind von der Klasse der Perylenfarbstoffe kei­ nerlei toxische Wirkungen bekannt, obwohl sie schon sehr lange Zeit (ab 1909) technisch verwendet wird.
Unerwartet fest ist der Einbau von Farbstoff 1 in die Liposomen - es wird keinerlei Abgabe des Farbstoffs unter physiologischen Bedingungen aus den Liposomen beobachtet -, so daß der Farbstoff alle geforderten Bedingungen erfüllt. Eine mögliche Erklärung für die feste Bindung in der Lipidschicht der Liposomen ist darin zu sehen, daß der Farbstoff zum einen sehr hydrophob ist und zum anderen die terminalen Alkylketten wahrscheinlich in optimale Wechselwirkung mit den Alkylketten der Lipidmembran treten kön­ nen. Hierbei ist noch wichtig, daß der Farbstoff klein genug ist, um nicht aus der Lipiddoppelschicht herauszuragen. Experi­ mentell wird tatsächlich beobachtet, daß durch die eingebauten Farbstoffmoleküle die Absorptionseigenschaften der Liposomen nicht verändert werden.
Die Geschwindigkeit der Kopplung von Antikörpern an Liposomen geht aus Abb. 2 hervor. Der eigentliche Kopplungsvorgang ist im wesentlichen nach weniger als einer Stunde abgeschlossen.
Die Bestimmung der Bindung der Antikörper an Zellen erfolgt Cy­ tofluorimetrisch. Die Empfindlichkeit der Methode geht aus Abb. 3 hervor.
In Abb. 4 ist das Ergebnis eines Konkurrenzversuchs mit freien Antikörpern angegeben. In Abb. 5 sind Raster-Elektronenmikrosko­ pische Aufnahmen mit gebundenen und ungebundenen Liposomen ange­ geben und in Abb. 6 schließlich elektronenmikroskopische Aufnah­ men, die die Rezeptor-gesteuerte Aufnahme eines Liposoms zeigen.
Neben der Möglichkeit, mit dem Fluoreszenzfarbstoff den Trans­ port von Wirkstoffen zu verfolgen kann dieser auch direkt in der Diagnostik eingesetzt werden - dies führt direkt zu einem neuen Fluoreszenzimmunessay mit einer ungewöhnlich hohen Empfindlich­ keit, insbesondere bei Antikörpern auf Zellen. Dies läßt sich im Vergleich mit den bestehenden Methoden wie folgt erklären : Zell­ spezifische monoklonale Antikörper sind gegenüber einer Deriva­ tisierung sehr empfindlich. Sie können daher manchmal nicht und wenn, dann nur mit wenigen Markermolekülen (z. B. Fluoreszenz­ farbstoffe) derivatisiert werden. Üblicherweise wird als Ausweg ein zweiter, unempfindlicher Antikörper, der auf den ersten spe­ zifisch ist, eingesetzt, der dann mit mehr Markermolekülen bela­ den werden kann. Hierdurch wird ein notwendiger Verstärkungsfak­ tor in der Empfindlichkeit erreicht. Dieser ist jedoch stark begrenzt, da auch der zweite Antikörper in der Regel nur mit we­ niger als 10 Markermolekülen beladen werden kann. Einen ganz we­ sentlichen Fortschritt bringt hier der Einsatz von Antikörper- Liposomen, die ohne Probleme 10 000 und viel mehr Fluoreszenz­ farbstoff-Moleküle aufnehmen können. Dadurch wird ein ungewöhn­ lich großer Verstärkungsfaktor erreicht. Darüber hinaus kann ein Liposom im allgem. direkt an den zellspezifischen monoklonalen Antikörper gebunden werden, ohne ihn zu beeinträchtigen. Dadurch vereinfacht sich ein Fluoreszenzimmunnachweis ganz beträchtlich und weist gleichzeitig den hohen Verstärkungsfaktor auf. Die mit Fluoreszenzfarbstoff beladenen Liposomen können aber auch an den genannten zweiten (sekundären) Antikörper gebunden werden. Es wird dann ebenfalls der große Verstärkungsfaktor erzielt und außerdem besitzen dann die Liposom-Antikörper-Einheiten eine größere Robustheit.
Schließlich können die Fluoreszenzfarbstoffe in den Antikörper- gebundenen Liposomen direkt zur Therapie eingesetzt werden. Hierbei läßt sich ausnutzen, daß photochemisch Elektronenüber­ tragungsreaktionen bei Farbstoffen ausgelöst werden können. Die Farbstoffe werden zum Wirkort, z. B. eine Geschwulst, transpor­ tiert und binden durch den Antikörper. Der Farbstoff selbst ist dabei zunächst nicht toxisch. Durch Licht kann nun lokal und zu­ dem gezielt durch die Antikörper plaziert, eine chemische Reak­ tion ausgelöst werden, mit der der Zielort beeinflußt wird.
Besonders wichtig ist eine Behandlung mit dem genannten Antikör­ per-Liposomen-System, mit Wirkstoff und mit Fluoreszenzfarb­ stoff- oder nur mit Fluoreszenzfarbstoff-beladen, in den Fällen, in denen ein operativer Eingriff nicht erfolgreich ist. Hier wären folgende Erkrankungen als Beispiel zu nennen :
  • - Metastasen von bösartigen Geschwülsten
  • - Geschwülste, bei denen ein operativer Eingriff lebens­ gefährlich oder unmöglich ist (z. B. bei Gehirntumoren)
  • - Virusinfektionen
  • - Behandlung chronischer, lokaler Entzündungen (rheumatische Erkrankungen)
  • - allgemeiner Befall von parasiten (Filarien, Billhaziose, Malaria, Trypanosomen, Leberegel oder dergl.)
EXPERIMENTELLER TEIL N6-(6-maleimidocapronyl-N2-palmitoyl-L-lysinmethylester (EMC-PL)
950 mg (4.5 mmol) 6-Maleimidocapronsäure werden in 4 ml wasser­ freiem Methylenchlorid gelöst und mit N-Methylmorpholin auf pH 7-8 gebracht (Glaselektrode). Es werden 1.02 g (4.95 mmol) Dicy­ clohexylcarbodiimid zugegeben, 10 min gerührt, und dann wird mit 6 g (4.5 mmol) N2-Palmitoyl-L-lysinmethylester-Hydrochlorid versetzt. Die Reaktionsmischung wird 18 h bei Raumtemperatur un­ ter Lichtausschluß gerührt. Der Niederschlag wird abfiltriert und mit 10 ml Methylenchlorid gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in 20 ml Me­ thylenchlorid gelöst und über eine Kieselgel-Säule (21.5×5 cm) chromatographiert. Die Säule wird mit 2.5 l Methylenchlorid, 2.5 l Methylenchlorid/Methanol (97 : 3 v/v), 2.5 l Methylenchlo­ rid/Methanol (95 : 5 v/v) und, 2 l Methylenchlorid/Methanol (90 : 10 v/v) eluiert. Das letzte Eluat wird eingedampft und ergibt ein Produkt, das keine Reaktion mit Ninhydrin und Bromkresolgrün zeigt. Die Palmitoylgruppe läßt sich mit 2,7-Dichlorfluorescein und die Amidgruppe mit Chlortoluidin nachweisen.
Ausb. 1,7 g (67%)
RF (Kieselgel-CH₂Cl₂/Methanol 95 : 5 v/v) = 0,7.
MS (70 eV) : m/z (%) = 592.
C₃₃H₅₇N₃O₆ (591)
Ber. C 66,97, H 9,71, N 7,10;
Gef. C 66,54, H 10,28, N 7,42.
Auf völlig analogem Wege wird das lipophile Maleinimidderivat N6-(3-Maleimido-propionyl-N2-palmitoyl-L-lysin-methylester (MP- PL) synthetisiert.
Darstellung von N4-Oleyl-ara-C-Liposomen mit verschiedenen philen Maleimidderivaten
Kleine unilamellare Liposomen werden durch Detergenzdialyse ent­ sprechend Literaturangaben (W.Rubas, A.Supersaxo, H.G.Weder. H.R.Hartmann, H.Hengartner, H.Schott, R.A.Schwendner, Int.J.Cancer 37 (1986) 149) hergestellt. Das Matrix-Lipidmate­ rial ist dabei bei allen Versuchen Sojabohnenöl-phosphatidylcho­ lin (SPC) : Cholesterol : DL-α-Tocopherol wie 1 : 0.2 : 0.01 Molteile mit 20 mg SPC/ml (26 µmol/ml) Anfangskonzentration an Lipiden. Die Maleimidderivate MP-PL, EMC-PL werden in 0.02 und N4-Oleyl-ara-C (NOAC, N4-Oleyl-cytosin-arabinosid) in 0.2 Mol­ teilen zugegeben. Der lipophile Fluoreszenzmarker BHPD (N,N′- Bis(1-hexylheptyl)-3,4 : 9,10-perylenbis(dicarboximid) - Farbstoff 1) wird in 0.006 Mol-Teilen in die Liposomen eingebracht.
Alle Lipide einschließlich des entsprechenden Spacers und NOAC und BHPD werden in Methanol/Chloroform (1 : 1 v/v) gelöst. Na­ triumcholat wird in einem Molverhältnis von 0.6 bis 0.7 in Ver­ gleich zur Summe der Konzentrationen aller Membran-bildenden Li­ pide zugesetzt.
Nach Entfernen der organischen Lösungsmittel am Rotationsver­ dampfer (40°C, 60 min) wird die Lipid-Detergenz-Mischung mit ei­ nem Phosphatpuffer (67 mM Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat/ 67 mM Kaliumdihydrogenphasphat, pH 7.4) solubilisiert. Die Mi­ cell-Lösung (10-20 ml) wird gegen 5-10 l des gleichen Puffers bei 40°C 2 h und dann bei 25°C 24 bis 36 h dialysiert. Die Lipo­ somen werden dann durch einen 0.45µm Sterilfilter (Sartorius) filtriert. Die Liposomen werden bei 4°C gelagert. Ihre Größe wird durch Lichtstreuung und Elektronenmikroskopie nach bekann­ ten Methoden bestimmt.
Bestimmung der Liposomen-Konzentration durch BHPD-Fluoreszenz
Der Fluoreszenzfarbstoff BHPD (Farbstoff 1) wird zur Konzentra­ tionsbestimmung der Liposomen durch Cytofluorometrie verwendet. Insbesondere kleine BHPD-Konzentrationen (unter 4×10-7 M) werden mit einem SPF-500 Aminco Spektrofluorometer bei 489 nm Anregung umd 533nm Emission gemessen. Verdünnungsreihen von Micellen oder Liposomen mit bekannter Lipid- und BHPD-Konzentrationen werden dabei als Standards verwendet.
Zur Kontrolle der Stabilität der BHPD-Inkorporation in die Lipo­ somenmembran wird 0.5 ml Liposomen-Anteil gegen 200 ml 67 mM Phosphatpuffer (pH 7.4) bei 4°C über 30 Tage dialysiert. Die BHPD-Konzenration wird in Intervallen von 48 h bestimmt. Zusätz­ lich läßt sich die Lipid-Konzentration des Dialysats durch Szin­ tillationszählung von 3H-radioaktiv markierten Lipiden kontrol­ lieren und läßt damit evt. auftretende Volumenänderungen erken­ nen.
Antikörper
Die monoklonalen Antikörper B8-24.3 (Maus IgG2b,MHC Klasse I, anti H-2kb) wurden aus Ascites -Flüssigkeit von Bals/c-Mäusen nach bekannten Verfahren gewonnen. Die Antikörper werden mit 40% Ammoniumsulfat gefällt und mit HPLC auf Hydroxyapatitsäulen (100 ×7.8mm, BioGel HPHT, BioRad) weiter gereinigt, wobei ein Phos­ phat-Puffergradient (10-300 mM, pH 6.8) mit einem Fluß von 0.5 ml/min verwendet wird.
Der anti B16 Melanom Antikörper (Ratt IgG2a) wurde in gefrierge­ trockneter Form erhalten und entsprechend der Literatur ohne weitere Reinigung eingesetzt.
Antikörper-Liposom-Kupplung mit SPDP Derivatisierung der Antikörper mit SPDP
SPDP wird mit den Antikörpern nach einem abgewandelten Verfahren der von Carlsson (J.Carlsson, H.Drevin, R.Axen, Biochem.J. 173 (1978) 723) beschriebenen Methode verbunden. Hierfür wird zu 10- 40 mg/ml Antikörper in 0.1M Phosphatpuffer / 0.1 M Kochsalz (pH 7.5) langsam bei Raumtemperatur eine Lösung von 150 mM SPDP ge­ geben, bis das Verhältnis von Antikörper zu SPDP 1 : 24, 1 : 12 oder 1 : 6 beträgt - Reaktionsdauer 60 min. Zum Entfernen von nicht umgesetzten SPDP wird der Ansatz 24 h bei 4° gegen das 1 000 fache Volumen Phosphatpuffer dialysiert. Die dialysierten Antikörper (Ab-PDP) werden bei 4°C gelagert. Die Anteile von ge­ bundenen SPDP-Molekülen werden nach Reduktion der Disulfidbrüc­ ken mit 100 mM Dithiothreitol durch Absorptionsmessung von 2- Thiopyridon bei 343 nm bestimmt.
Reduktion von Antikörper-PDP und Kopplung an Maleimid-Liposomen
Die Ab-PDP Lösungen werden gegen Acetatpuffer (0.1 M Natriumace­ tat/0.1 M Essigsäure und 0.1 M Kochsalz (pH 4.5)) bei 4°C 24 h dialysiert. Dithiotreitol wird zugegeben, bis eine Konzentration von 25 mM erreicht wird. Nach 60 min Inkubationszeit bei 25°C wird die Mischung bei Raumtemperatur an einer Sephadex G 50 Säule (30×1 cm) mit 67 mM Phosphatpuffer (pH 6.0) chromatogra­ phiert. Mit einem Fluß von 0.5 bis 1 ml/min wird der aktivierte Antikörper von Dithiotreitol und 2-Thiopyridon getrennt. Frak­ tionen des Eluats werden gesammelt und bei 280 nm (LKB Ultrorac, Uvicord S) untersucht.
Die Kupplung an Maleimid-Liposomen wird direkt nach der Säulen­ trennung des aktivierten Antikörpers durchgeführt. Molare Ver­ hältnisse von Ab-P-SH zu Liposomen-Maleimid von 1 : 10, 1 : 20 und 1 : 40 werden dabei verwendet. Die Antikörper-Konzentratio­ nen variieren zwischen 0.15 und 0.6 mg/ml, und die Lipid-Konzen­ tration beträgt 1 bis 5 mg SPC/ml. Die Kupplungsreaktion wird bei 25°C unter Stickstoff und gelegentlichem gelinden Rühren in Volumina von 2 bis 12 ml entsprechend den Eduktverhältnissen ausgeführt. Die Reaktion wird durch die Zugabe von N-Ethylmalei­ mid gestoppt, das die freien Thiogruppen absättigt. N-Ethyl­ maleimid wird hierfür in einem minimalen Volumen von 67 mM Phos­ phatpuffer (pH 7.4) gelöst und in 24fachem Überschuß, bezogen auf die Antikörper-Konzentration, zur Reaktionsmischung gegeben.
Antikörper-Liposom-Kupplung unter Verwendung von SATA Derivatisierung der Antikörper mit SATA
Die Antikörper-Derivatisierung mit SATA wird nach Literaturanga­ ben (J.T.P.Derksen, G.L.Scherphof, Biochim.Biophys.Acta 814 (1985) 151 und R.J.S.Duncan, P.D.Weston, R.Wrigglesworth, Anal.Biochem. 132 (1983) 88) vorgenommen. Die Antikörper werden in 50 mM Phosphatpuffer/1 mM EDTA (pH 7.5) bei einer Konzen­ tration von 4 bis 10 mg/ml (0.25 bis 1×10-9 M) gelöst und 60 min bei 25°C unter Stickstoff-Schutzatmosphäre und gelindem Rühren mit 150 mM SATA zur Reaktion gebracht, das im minimalen Volumen DMF gelöst wird. Die molaren Verhältnisse Antikörper zu SATA sind 1 : 24, 1 : 12 und 1 : 6. Nicht umgesetztes SATA wird durch 24 h Dialyse bei 4°C gegen das 1000fache Volumen des gleichen Puffers entfernt. Die SATA-gekoppelten Antikörperlösungen (Ab- ATA) werden bei 4°C gelagert.
Zur Bestimmung der Menge des Antikörper-gekoppelten SATA wird die Acetyl-Schutzgruppe mit Hydroxylamin entfernt. Die Bestim­ mung der freien Sulfhydrylgruppe erfolgt mit Ellman′s Reagenz, wie oben beschrieben.
Deacetylierung von Ab-ATA und Kupplung mit Maleimid-Liposomen
1 ml der Ab-ATA-Lösung wird durch Zugabe von 1 ml Hydroxylamin­ hydrochloridlösung (0.5 M in 50 mM Phosphatpuffer/25 mM EDTA (pH 7.5)) während 1h Reaktionszeit bei 25°C unter Stickstoff und gelindem Rühren deacetyliert. Danach werden die aktivierten Antikörper (Ab-A-SH) sofort bei pH 6 an Maleimid-Liposomen ge­ kuppelt. Das molare Verhältnis Antikörper zu Liposom beträgt da­ bei 1 : 10, 1 : 20 und 1 : 40 bei einer Ab-A-SH-Konzentration von 0.3mg/ml. Die Reaktion wird nach einer Inkubationszeit bei 25°C von 0.2 bis 20 h durch die Zugabe von N-Ethylmaleimid in einem molaren Verhältnis von 1 : 24 gestoppt.
Trennung der Immunoliposomen von freien Antikörpern
Freie Antikörper werden von den Immunoliposomen nach zwei Metho­ den getrennt:
  • 1. Trennung mit HPLC mit einer Trennsäule BioGel TSK 40 (300× 7.5 mm) und einem Fluß von 0.75 ml/min 67 mM Phosphatpuffer (pH 7.4). Dabei wird die Elution der Liposomen über die Absorption von incorporiertem BHPD bei 522 nm verfolgt. Freie Antikörper und Immunoliposomen werden getrennt gesammelt und aufgearbeitet.
  • 2. Die zweite Methode wird zur Trennung größerer Volumina (5 bis 10 ml) verwendet. Ungekuppelte, aktivierte Antikörper werden hierbei von den Immunoliposomen durch Flotation in einem diskon­ tinuierlichen Metrizamid-Gradienten getrennt D.Rickwood, G.D.Birnie, FEBS Lett. 50 (1975) 102). Hierfür wird in einem 5 ml Nitrocellulose-Zentrifugenglas (Beckmann, Ultraclear) die Im­ munoliposom-Lösung mit 60% Metrizamid gemischt, bis eine Konzen­ tration von 20% Metrizamid erreicht wird. Diese wird mit 2 ml 10% Metrizamid überschichtet, gefolgt von 0.5 ml 67 mM Phosphat­ puffer (pH 7.4) als Deckschicht. Der Dichtegradient wird 12 bis 16 h bei 95000×g bei 4°C zentrifugiert (L8-9M Ultrazentrifuge von Beckmann). Die Immunoliposomen sind dann als gelborange fluoreszierender Ring sichtbar, der vorsichtig isoliert und zweimal gegen 400 ml 67 mM Phosphatpuffer (pH 7.4) dialysiert wird, um reversibel gebundenes Metrizamid zu entfernen.
Bindungs-Experimente
Immunfluoreszenz und Cytofluorometrische Analyse:
Die Bindungsaktivitäten von unbehandelten und aktivierten Anti­ körpern (Ab-P-SH, Ab-A-SH) können routinemäßig in vitro über­ prüft werden. Antikörper-Zell-Bindung wird durch Immunfluores­ zenz in Anlehnung an Literaturmethoden (N.Berinstein, K.Matthay, D.Papahadjopoulos, R.Levy, B.I.Sikic, Cancer Res. 47 (1987) 5954) bestimmt. Hierbei werden Ziegen-anti-Maus FITC-IgG (Tago, Burlingame, CA, USA) für die Markierung von B8-24.3 und Ziegen­ anti-Ratte FITC-IgG (EY Laboratories, San Mateo, Ca, USA) für B16-6.2, beziehungsweise für Second-Antikörper-Labeling verwen­ det.
Spezifische Immunoliposom-Zell-Bindung wird durch Cytofluorime­ trische Analyse bestimmt. Hierbei wird die Fluoreszenz des in die Membran eingebauten photostabilen BHPD genutzt.
Ziel-Zellen (1.5×106) werden in IMDM suspendiert und mit 4×1012 (0.025nM) Immunoliposomen (entsprechend 2.5×106 Liposomen pro Zelle) in Reagenzgläsern bei einem Volumen von 300 bis 400 µl 60 min bei 4°C umgesetzt. Die Zellen werden dann dreimal mit je 1 ml 67 mM Phosphatpuffer (pH 7.4) gewaschen, der 1% Rinder-Serum­ albumin und 0.02% Natriumazid enthält. Dann werden die Zellen in 0.5 bis 1 ml des gleichen Puffers resuspendiert. Die Zell-gebun­ dene BHPD-Fluoreszenz wird dann z. B. mit einem Epics Profile Fluoro Cytometer (Coulter Corp.) bei 470 nm Anregung und 530 nm Emissionswellenlänge gemessen.
Die Bindung von BHPD-markierten Liposomen wird durch die Fluo­ reszenzmessung in einem festen Intensitätsfenster bestimmt, das individuell für EL4- und B16-Zellen festgelegt wird. Dieses Fen­ ster ist so gesetzt, daß eine natürliche Fluoreszenz der Zellen und die Fluoreszenz von unspezifisch gebundenen Liposomen ausge­ schlossen wird (siehe Abb. 3).
Bezugszeichenliste :
Abb. 1: Reaktionsfolgen zur Kupplung der Antikörper mit den Lipo­ somen - a) SPDP - b) SATA - (Ab.: Antikörper, DTT: Dithiotrei­ tol) - c) Kupplung über Biotin-Avidin-Kompexierung: separat wer­ den Antikörper und mit Wirkstoffen und/oder mit Fluoreszenzfarb­ stoffen beladene Liposomen mit Biotin versehen. Im nächsten Schritt werden die Biotin-Reste der Liposomen mit Avidin komple­ xiert und schließlich die Biotin-tragenden Antikörper an die freie Bindungsstelle des immobilisierten Avidins gebunden.
Abb. 2: a) Kupplung von SPDP modifizierten B8-24.3 Antikörpern an MP-PL Liposomen bei molaren Verhältnissen SPDP zu Antikörper 1 : 12 (⚫) und 1 : 24 (▲) bei einem molaren Verhältnis von 1 : 40 von Antikörper zu Maleinimid-Gruppen auf der Liposomen-Oberfläche. Anfangskonzentration an Antikörper ist 2 : 10-8 (100%). Reaktion bei Raumtemperatur unter Stickstoff und pH 6.0. - b) Kupplung von SATA modifizierten B8-24.3 Antikörpern an MP-PL Liposomen unter gleichen Bedingungen wie bei a). Molare Verhältnisse SATA zu Antikörper 1 : 6 (⬩), 1 : 12 (⚫) und 1 : 24 (▲).
Abb. 3: Cytofluorimetrisch bestimmmte Bindung von Liposomen an Zellen über die Fluoreszenz von B16-F10-Zellen. a) Selbstfluo­ reszenz der Zellen. - b) unspezifische Bindung von MP-PL-Liposo­ men (Kontrollversuch). - c) spezifische Bindung von B16-6.2 mo­ difizierten Liposomen. Der waagerechte Strich gibt das Fenster für die spezifische Ab-Liposomenbindung an. Ähnliche Ergebnisse werden bei Messungen von B8-24.3 modifizierten Liposomen gegen­ über EL4-Zellen erhalten.
Abb. 4: Freier Antikörper wurde 60 min bei 4°C umgesetzt. Es wurde mit den Zellen inkubiert, dann drei mal mit 67 mM Phos­ phatpuffer (pH 7.4), der 1% Rinder-Serumalbumin und 0.02% Natri­ umazid gewaschen. Danach wurden so viel Liposomen (2.5×106 Vesi­ kel pro Zelle) zugegeben bis das Incubationsvolumen von 360 µl erreicht war. Zellgebundene BHPD-Fluoreszenz wurde nach einer Inkubationszeit von 60 min bei 4°C bestimmt. a) Liposomen-Bin­ dungskonkurrenz mit 0.1 nM freiem B8-24.3 Antikörper an EL4-Zel­ len (⚫) und unspezifische Bindung von Liposomen (). - b) 0.025 nM B16-6.2 Antikörper und MP-PL Liposomen an B16-F10-Zellen (⚫) und unspezifische Bindung von Liposomen ().
Abb. 5: a) Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von EL4-Zel­ len. 1.6 µm Markierung. - b) Oberflächedetail von EL4-Zellen, die mit Antikörper-freien Kontroll-Liposomen behandelt wurden 64 000fache Vergrößerung, Markierung 0.3 µm. Die Pfeile bezeichnen einzelne adsorbierte Liposomen und Liposomen-Aggregate. - c) spezifisch gebundene B8-24.3-Liposomen mit einzelnen Liposomen hauptsächlich an die Zellmikrovilli gebunden (Pfeil, 64 000 fa­ che Vergrößerung und 0.3 µm Markierung) .
Abb. 6: a) Elektronenmikroskopische Aufnahme eines EL4-Zell­ schnitts, mit B8-24.3-Liposomen behandelt worden ist. An die Zellmembran gebundenen Liposomen sind mit Pfeilen markiert (7 600×, Markierung 2.5 µm). - b) Der Ausschnitt der EL4-Zelle zeigt ein einzelnes Liposom, das an die Zellmembran adsorbiert ist (230 000×, Markierung 0.09 µm). - c) Rezeptor gesteuerter Zell-Eintritt eines einzelnen Liposoms (100800×, Markierung 0.2 µm).

Claims (21)

1. Kupplung von Antikörpern an Liposomen, die Detektions-Verbin­ dungen enthalten. Bevorzugte Antikörper sind B8-24.3- und B16- 6.2-Antikörper (für EL4- und B16-F10-Zielzellen). Bevorzugte ko­ valente Kupplungsreagenzien sind N-Succinimidyl-3-(2-pyridyl­ dithio)propionat (SPDP) und N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat (SATA). Am meisten bevorzugt wird als Kupplungsreagenz SATA. Be­ vorzugte Nebenvalenz-Kupplung ist die Biotin-Avidin Komplexie­ rung. Bevorzugte Liposomenbestandteile sind Sojabohnenöl-Phos­ phatidylcholin, Cholesterol, Maleinimidderivate und α-Tocophe­ rol, bevorzugt im Verhältnis (0.2-3) : (0.05-0.5) : (0.005- 0.1) : (0.001-0.1) am meisten bevorzugt 1 : 0.2 : 0.02 : 0.01. Als De­ tektions-Verbindungen werden Farbstoffe bevorzugt. Stärker be­ vorzugt werden Fluoreszenzfarbstoffe, noch stärker bevorzugt werden Perylen-Fluoreszenzfarbstoffe, am meisten bevorzugt wird N,N′-Bis(1-hexylheptyl) -3,4 : 9,10-perylenbis(dicarboximid) - Farbstoff 1 (BHPD).
2. Einlagerung von Detektions-Molekülen in die Lipid-Doppel­ schicht der Liposomen nach Anspruch 1, die Antikörper tragen, bevorzugt sind lipophile Farbstoffe, stärker bevorzugt sind Fluoreszenzfarbstoffe, noch stärker bevorzugt werden Perylen­ farbstoffe, am meisten bevorzugt wird Farbstoff 1.
3. Der gezielte Einsatz von Antikörper tragenden Liposomen nach Anspruch 1 und 2 in der medizinischen Therapie, in der medizini­ schen Diagnostik und in der Biochemie und der Biologie für vielerlei Tests, bevorzugt Immun-Tests wie z. B. AIDS-Tests, Krebsvorsorgeuntersuchungen, Diagnose von Stoffwechselerkrankun­ gen.
4. Der gezielte Einsatz von Antikörper tragenden Liposomen nach Anspruch 1 und 2 in der medizinischen Therapie, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Liposomen mit Wirkstoffen bela­ den werden, die an einer bestimmten Stelle im Organismus aktiv werden sollen. Bevorzugt sind Wirkstoffe mit einer geringen the­ rapeutischen Breite. Als bevorzugte Beispiele für solche Wirk­ stoffe seien Cytostatika, Virostatika und Antibiotika genannt. Ein bevorzugtes Beispiel für ein Cytostatikum sei N4-Oleyl-cyto­ sin-arabinose genannt. Ein typischer Einsatz für die Antikörper- tragenden Liposomen sind Erkrankungen wie Krebs, insbesondere dann, wenn bereits Metastasen vorliegen oder Formen, bei denen eine operative Behandlung sehr risikoreich oder unmöglich ist. Weitere Beispiele sind die Behandlung von Virusinfektionen, lo­ kaler, chronischer Entzündungen wie rheumatische Erkrankungen und die Behandlung eines allgemeinen Parasiten-Befalls wie etwa der Befall mit Filarien, Trypanosomen oder Leberegel oder die Behandlung von Billharziose oder Malaria.
5. Die Verwendung der Antikörper-tragenden Liposomen nach An­ spruch 1 und 2 zur Behandlung von Erkrankungen des Zentralner­ vensystems, bei denen wichtig ist, daß der Wirkstoff die Blut- Hirn-Schranke passiert, wobei die Liposomen auch Wirkstoffe durch die Schranke transportieren können, für die sonst die Schranke undurchlässig ist.
6. Verknüpfung der Liposomen nach Anspruch 1 und 2 mit primären, zellspezifischen Antikörpern.
7. Verknüpfung der Liposomen nach Anspruch 1 und 2 mit sekun­ dären Antikörpern, die wiederum mit primären, zellspezifischen Antikörpern wechselwirken.
8. Nachweis und quantitative Bestimmung der mit Antikörpern ver­ knüpften Liposomen durch Cytofluorimetrie. - Cytofluorimetrische Bestimmung der Verteilung und des Transports von Liposomen und von Wirkstoffen.
9. Fluorimetrische Untersuchung des Transports und der Konzen­ tration der Liposomen in vivo durch fluorimetrische Bestimmung oder visuellen Vergleich. - Fluoreszenz-Kontrolle des Fort­ schreitens einer Therapie.
10. Verwendung von Perylenfarbstoffen der allgemeinen Formel 2 in Antikörper-tragenden Liposomen nach Anspruch 1 oder 2, worin R1 und R2 für Wasserstoff, oder Wasserstoff und ein bis vier isocyclische aromatische Reste, dann vorzugsweise mono- bis tetracyclische, insbesondere mono- oder bicyclische Reste, wie Phenyl, Diphenyl oder Naphthyl stehen. Bedeuten R1 oder R2 einen heterocyclischen aromatischen Rest, dann vorzugsweise einen mono- bis tricyclischen Rest. Diese Reste können rein heterocy­ clisch sein oder einen heterocyclischen Ring und einen oder meh­ rere ankondensierte Benzolringe enthalten. Beispiele von hete­ rocyclischen aromatischen Resten sind Pyridyl, Pyrimidyl, Pyra­ zinyl, Triazinyl, Furanyl, Pyrrolyl, Thiophenyl, Chinolyl, Iso­ chinolyl, Cumarinyl, Benzofuranyl, Benzimidazolyl, Benzoxazolyl, Dibenzfuranyl, Benzothiophenyl, Dibenzothiophenyl, Indolyl, Car­ bazolyl, Pyrazolyl, Imidazolyl, Oxazolyl, Isoxazolyl, Thiazolyl, Indazolyl, Benzthiazolyl, Pyridazinyl, Cinnolyl, Chinazolyl, Chinoxalyl, Phthalazinyl, Phthalazindionyl, Phthalimidyl, Chromonyl, Naphtholactamyl, Benzopyridonyl, ortho-Sulfobenimidyl, Maleinimidyl, Naphtharidinyl, Benzimidazolonyl, Benzoxazolonyl, Benzthiazolonyl, Benzthiazolinyl, Chinazolonyl, Pyrimidyl, Chinoxalonyl, Phthalazonyl, Dioxapyrinidinyl, Pyridonyl, Isochinolonyl, Isothiazolyl, Benzisoxazolyl, Benzisothiazolyl, Indazolonyl, Acridinyl, Acridonyl, Chinazolindionyl, Benzoxazindionyl, Benzoxazinonyl und Phthalimidyl. Sowohl die isocyclischen wie die heterocyclischen aromatischen Reste können die üblichen nicht wasserlöslich machenden Substituenten aufweisen, wie
  • a) Halogenatome, beispielsweise Chlor, Brom, Jod oder Fluor.
  • b) Verzweigte oder unverzweigte Alkylgruppen mit vorzugsweise 1 bis 18, insbesondere 1 bis 12, vor allem 1 bis 8 und besonders bevorzugt 1 bis 4 C-Atomen. Diese Alkylgruppen können nicht-wasserlöslich machende Substituenten aufweisen, wie beispielsweise Fluor, Hydroxy, Cyano, -OCOR₃, -OR₄, -OCOOR₃, -CON(R₄)(R₅) oder -OCONHR₃, worin R₃ Alkyl, Aryl wie Naphthyl, oder unsubstituiertes oder durch Halogen, Alkyl, oder -O-Alkyl substituiertes Benzyl oder einen heterocyclischen Rest, R₄ und R₅ Wasserstoff, unsubstituiertes oder durch Cyano oder Hydroxy substituiertes Alkyl, C₃- bis C₂₄- Cycloalkyl, bevorzugt C₅-, C₆-, C₁₂-, C₁₅-, C₁₆-, C₂₀- und C₂₄-Cycloalkyl, Aryl oder Heteroaryl, insbesondere unsubstituiertes oder durch Halogen, Alkyl oder -O-Alkyl substituiertes Phenyl bedeuten, oder worin R₄ und R₅ zusammen mit dem anderen Rest R₂ einen 5-6gliedrigen Ring oder auch Heteroring bilden, wie beispielsweise einen Pyridin-, Pyrrol-, Furan- oder Pyranring. Weitere mögliche Substituenten an den Alkylgruppen sind mono- oder dialkylierte Aminogruppen, Arylreste, wie Naphthyl oder insbesondere unsubstituiertes oder durch Halogen, Alkyl oder -O-Alkyl substituiertes Phenyl, oder ferner heterocyclische aromatische Reste, wie z. B. die 2-Thienyl, 2-Benzoxazolyl-, 2-Benzthiazolyl-, 2-Benzimidazolyl-, 6-Benzimidazolonyl-, 2-, 3- oder 4-Pyridinyl-, 2-, 4-, oder 6-Chinoly- oder 1-, 3-, 4-, 6-, oder 8-Isochinolylreste.
    Enthalten die unter b) genannten Substituenten ihrerseits wieder Alkyl, so kann dieses Alkyl verzweigt oder unverzweigt sein und vorzugsweise 1 bis 18, insbesondere 1 bis 12, vor allem 1 bis 8 und besonders bevorzugt 1 bis 4 C-Atome enthalten.
    Beispiele von unsubstituierten Alkylgruppen sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, sec-Butyl, tert-Butyl, tert-Amyl, n-Hexyl, 1,1,3,3-Tetramethylbutyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl, n-Decyl, n-Undecyl, n-Dodecyl, n-Octadecyl, 3-Pentyl, 4-Heptyl, 5-Nonyl, 6-Undecyl, 7-Tridecyl, 3-Hexyl, 3-Heptyl, 3-Nonyl, 3-Undecyl, Hydroxymethyl, 2-Hydroxyethyl, Trifluormethyl, Trifluorethyl, Cyanomethyl, Methoxycarbonylmethyl, Acetoxymethyl oder Benzyl.
  • c) Die Gruppe -OR₆, worin R₆ Wasserstoff, Alkyl, Aryl, beispielsweise Naphthyl oder insbesondere unsubstituiertes Phenyl, C₃ bis C₂₄-Cycloalkyl, bevorzugt C₅-, C₆-, C₁₂, C₁₅-, C₁₆-, C₂₀-, und C₂₄-Cycloalkyl, Aryl oder Heteroaryl, insbesondere unsubstituiertes oder durch Halogen, Alkyl oder -O-Alkyl substituiertes Phenyl bedeuten. In den Definitionen von R₆ vorkommendes Alkyl kann z. B. eine der unter b) als bevorzugt angegebene Anzahl an C-Atome haben. Als Beispiele von R₆ seien genannt : Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, sec-Butyl, tert-Butyl, tert-Amyl, n-Hexyl, 1,1,3,3-Tetramethylbutyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl, n-Decyl, n-Undecyl, n-Dodecyl, n-Octadecyl, 3-Pentyl, 4-Heptyl, 5-Nonyl, 6-Undecyl, 7-Tridecyl, 3-Hexyl, 3-Heptyl, 3-Nonyl, 3-Undecyl, Hydroxymethyl, 2-Hydroxyethyl, Trifluormethyl, Trifluorethyl, Cyanomethyl, Methoxycarbonylmethyl, Acetoxymethyl, Benzyl, Phenyl, o-, m- oder p-Chlorphenyl, o-, m-, oder p-Methylphenyl, 1- oder 2-Naphthyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cyclododecyl, Cyclopentadecyl, Cyclohexadecyl, Cycloeicosanyl, Cycloetetracosanyl, Thienyl oder Pyranylmethyl.
  • e) Die Cyanogruppe.
  • f) Die Gruppe der Formel -N(R₄)(R₅), worin R₄ und R₅ die unter b) angegebene Bedeutung haben. Als Beispiele seien genannt : Amino, Methylamino, Dimethylamino, Ethylamino, Diethylamino, Isopropylamino, 2-Hydroxyethylamino, 2-Hydroxypropylamino, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)amino, Cyclopentylamino, Cyclohexylamino, Cyclododecylamino, Cyclopentadecylamino, Cyclohexadecylamino, Cycloeicosanylamino, Cyclotetracosanylamino, Phenylamino, N-Methylphenylamino, Benzylamino, Dibenzylamino, Piperidyl oder Morpholyl.
  • g) Die Gruppe der Formel -COR₃, worin R₃ die unter a) angegebene Bedeutung hat. Als Beispiele für R₃ seien genannt : Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, sec-Butyl, tert-Butyl, tert-Amyl, n-Hexyl, 1,1,3,3-Tetramethylbutyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl, n-Decyl, n-Undecyl, n-Dodecyl, n-Octadecyl, 3-Pentyl, 4-Heptyl, 5-Nonyl, 6-Undecyl, 7-Tridecyl, 3-Hexyl, 3-Heptyl, 3-Nonyl, 3-Undecyl, Hydroxymethyl, 2-Hydroxyethyl, Trifluormethyl, Trifluorethyl, Cyanomethyl, Methoxycarbonylmethyl, Acetoxymethyl, Benzyl, Phenyl, o-, m- oder p-Chlorphenyl, o-, m-, oder p-Methylphenyl, 1- oder 2-Naphthyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cyclododecyl, Cyclopentadecyl, Cyclohexadecyl, Cycloeicosanyl, Cyclotetracosanyl, Thienyl, Pyranylmethyl, Benzyl oder Furfuryl.
  • h) Die Gruppe der Formel -N(R₇)COR₃, worin R₃ die unter b) angegebene Bedeutung hat, R₇ Wasserstoff, Alkyl, beispielsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, sec-Butyl, n-Hexyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl, n-Decyl, n-Undecyl, n-Dodecyl, n-Octadecyl, 3-Pentyl, 4-Heptyl, 5-Nonyl, 6-Undecyl, 7-Tridecyl, 3-Hexyl, 3-Heptyl, 3-Nonyl, 3-Undecyl, Hydroxymethyl, 2-Hydroxyethyl, Cyanomethyl, Methoxycarbonylmethyl, Acetoxymethyl, Benzyl, Phenyl, insbesondere unsubstituiertes oder durch Halogen, Alkyl oder -O-Alkyl substituiertes Phenyl, beispielsweise o-, m- oder p-Chlorphenyl, o-, m-, oder p-Methylphenyl, 1- oder 2-Naphthyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cyclododecyl, Cyclopentadecyl, Cyclohexadecyl, Cycloeicosanyl, Cyclotetracosanyl, Thienyl, Pyranylmethyl, Benzyl oder Furfuryl. In den Definitionen von R₇ vorkommendes Alkyl kann z. B. eine der unter b) bevorzugt angegebene gegebene Anzahl C-Atome haben. Als Beispiel seien genannt : Acetylamino, Propionylamino, Butyrylamino, Benzoylamino, p-Chlorbenzoylamino, p-Methylbenzoylamino, N-Methylacetamino, N-Methyl-benzylamino, N-Succinimido, N-Phthalimido oder N-(4-Aminolphthalimido.
  • i) Die Gruppe der Formel -N(R₆)COOR₃, worin R₃ und R₆ die unter b) bzw. c) angegebene Bedeutung haben. Als Beispiele seien die Gruppen -NHCOOCH₃, -NHCOOC₂H₅, oder -NHCOOC₆H₅ genannt.
  • j) Die Gruppe der Formel -N(R₆)CON(R₄)(R₅), worin R₄, R₅ und R₆ die unter b) bzw. c) angegebene Bedeutung haben. Als Beispiele seien genannt : Ureido, N-Methylureido, N-Phenylureido, oder N,N′-2′,4′-Dimethylphenylureido.
  • k) Die Gruppe der Formel -NHSO₂R₃, worin R₃ die unter b) angegebene Bedeutung hat. Als Beispiele seien genannt : Methylsulfonylamino, Phenylsulfonylamino, p-Tolylsulfonylamino oder 2-Naphthylsulfonylamino.
  • l) Die Gruppen der Formel -SO₂R₃ oder -SOR₃, worin R₃ die unter b) angegebene Bedeutung hat. Als Beispiele seien genannt : Methylsulfonyl, Ethylsulfonyl, Phenylsulfonyl, 2-Naphthylsulfonyl, Phenylsulfoxidyl.
  • m) Die Gruppe der Formel -SO₂OR₃, worin R₃ die unter b) angegebene Bedeutung hat. Als Beispiele für R₃ seien genannt : Methyl, Ethyl, Phenyl, o-, m-, oder p-Chlorphenyl, o-, m-, oder p-Methylphenyl, 1- oder 2-Naphthyl.
  • n) Die Gruppe der Formel -CON(R₄)(R₅), worin R₄ und R₅ die unter b) angegebene Bedeutung haben. Als Beispiele seien genannt : Carbamoyl, N-Methylcarbamoyl, N-Ethylcarbamoyl, N-Phenylcarbamoyl, N,N-Dimethylcarbamoyl, N-Methyl-N-phenylcarbamoyl, N-1-Naphthylcarbamoyl oder N-Piperdylcarbamoyl.
  • o) Die Gruppe der Formel -SO₂N(R₄)(R₅), worin R₄ und R₅ die unter b) angegebene Bedeutung haben. Als Beispiele seien genannt : Sulfamoyl, N-Methylsulfamoyl, N-Ethylsulfamoyl, N-Phenylsulfamoyl, N-Methyl-N-phenylsulfamoyl oder N-Morpholylsulfamoyl.
  • p) Die Gruppe der Formel -N=N-R₈, worin R₈ den Rest einer Kupplungskomponente oder einen gegebenenfalls durch Halogen, Alkyl oder -O-Alkyl substituierten Phenylrest bedeutet. In den Definitionen von R₈ vorkommendes Alkyl kann z. B. eine der unter b) als bevorzugt angegebene Anzahl C-Atome haben. Als Beispiele für R₈ seien genannt : die Acetoacetarylid-, Pyrazolyl-, Pyridonyl-, o-, p-Hydroxyphenyl-, o-Hydroxynaphthyl-, p-Aminophenyl- oder p-N,N-Dimethylaminophenyl-Reste.
  • q) Die Gruppe der Formel -OCOR₃, worin R₃ die unter b) angegebene Bedeutung hat. Als Beispiele für R₃ seien genannt : Methyl, Ethyl, Phenyl, o-, m- oder p-Chlorphenyl.
  • r) Die Gruppe der Formel -OCONHR₃, worin R₃ die unter a) angegebene Bedeutung hat. Als Beispiel für R₃ seien genannt : Methyl, Ethyl, Phenyl, o-, m-, oder p-Chlorphenyl.
R₁ und R₂ können Wasserstoff und ein bis vier der folgenden Reste bedeuten :
  • a) Halogenatome, beispielsweise Chlor, Brom, Jod oder Fluor.
  • b) Verzweigte oder unverzweigte Alkylgruppen mit vorzugsweise 1 bis 18, insbesondere 1 bis 12, vor allem 1 bis 8 und besonders bevorzugt 1 bis 4 C-Atomen. Diese Alkylgruppen können nicht-wasserlöslich machende Substituenten aufweisen, wie beispielsweise Fluor, Hydroxy, Cyano, -OCOR₃, -OR₄, -OCOOR₃, -CON(R₄)(R₅) oder -OCONHR₃, worin R₃ Alkyl, Aryl wie Naphthyl, oder unsubstituiertes oder durch Halogen, Alkyl, oder -O-Alkyl substituiertes Benzyl oder einen heterocyclischen Rest, R₄ und R₅ Wasserstoff, unsubstituiertes oder durch Cyano oder Hydroxy substituiertes Alkyl, C₃- bis C₂₄-Cycloalkyl, bevorzugt C₅-, C₆-, C₁₂-, C₁₅-, C₁₆-, C₂₀- und C₂₄-Cycloalkyl, Aryl oder Heteroaryl, insbesondere unsubstituiertes oder durch Halogen, Alkyl oder -O-Alkyl substituiertes Phenyl bedeuten, oder worin R₄ und R₅ zusammen mit dem anderen Rest R₂ einen 5-6gliedrigen Ring oder auch Heteroring bilden, wie beispielsweise einen Pyridin-, Pyrrol-, Furan- oder Pyranring. Weitere mögliche Substituenten an den Alkylgruppen sind mono- oder dialkylierte Aminogruppen, Arylreste, wie Naphthyl oder insbesondere unsubstituierte oder durch Halogen, Alkyl oder -O-Alkyl substituiertes Phenyl, oder ferner heterocyclische aromatische Reste, wie z. B. die 2-Thienyl, 2-Benzoxazolyl-, 2-Benzthiazolyl-, 2-Benzimidazolyl-, 6-Benzimidazolonyl-, 2-, 3- oder 4-Pyridinyl-, 2-, 4-, oder 6-Chinoly- oder 1-, 3-, 4-, 6-, oder 8-Isochinolylreste.
    Enthalten die unter b) genannten Substituenten ihrerseits wieder Alkyl, so kann dieses Alkyl verzweigt oder unverzweigt sein und vorzugsweise 1 bis 18, insbesondere 1 bis 12, vor allem 1 bis 8 und besonders bevorzugt 1 bis 4 C-Atome enthalten.
    Beispiele von unsubstituierten Alkylgruppen sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, sec-Butyl, tert-Butyl, tert-Amyl, n-Hexyl, 1,1,3,3-Tetramethylbutyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl, n-Decyl, n-Undecyl, n-Dodecyl, n-Octadecyl, 3-Pentyl, 4-Heptyl, 5-Nonyl, 6-Undecyl, 7-Tridecyl, 3-Hexyl, 3-Heptyl, 3-Nonyl, 3-Undecyl, Hydroxymethyl, 2-Hydroxyethyl, Trifluormethyl, Trifluorethyl, Cyanomethyl, Methoxycarbonylmethyl, Acetoxymethyl oder Benzyl.
  • c) Die Gruppe -OR₆, worin R₆ Wasserstoff, Alkyl, Aryl, beispielsweise Naphthyl oder insbesondere unsubstituiertes Phenyl, C₃ bis C₂₄-Cycloalkyl, bevorzugt C₅-, C₆-, C₁₂, C₁₅-, C₁₆-, C₂₀-, und C₂₄-Cycloalkyl, Aryl oder Heteroaryl, insbesondere unsubstituiertes oder durch Halogen, Alkyl oder -O-Alkyl substituiertes Phenyl bedeuten. In den Definitionen von R₆ vorkommendes Alkyl kann z. B. eine der unter b) als bevorzugt angegebene Anzahl an C-Atome haben. Als Beispiele von R₆ seien genannt : Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, sec-Butyl, tert-Butyl, tert-Amyl, n-Hexyl, 1,1,3,3-Tetramethylbutyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl, n-Decyl, n-Undecyl, n-Dodecyl, n-Octadecyl, 3-Pentyl, 4-Heptyl, 5-Nonyl, 6-Undecyl, 7-Tridecyl, 3-Hexyl, 3-Heptyl, 3-Nonyl, 3-Undecyl, Hydroxymethyl, 2-Hydroxyethyl, Trifluormethyl, Trifluorethyl, Cyanomethyl, Methoxycarbonylmethyl, Acetoxymethyl, Benzyl, Phenyl, o-, m- oder p-Chlorphenyl, o-, m-, oder p-Methylphenyl, 1- oder 2-Naphthyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cyclododecyl, Cyclopentadecyl, Cyclohexadecyl, Cycloeicosanyl, cloeicosanyl, Cyclotetracosanyl, Thienyl oder Pyranylmethyl.
  • e) Die Cyanogruppe.
  • f) Die Gruppe der Formel -N(R₄)(R₅), worin R₄ und R₅ die unter b) angegebene Bedeutung haben. Als Beispiele seien genannt : Amino, Methylamino, Dimethylamino, Ethylamino, Diethylamino, Isopropylamino, 2-Hydroxyethylamino, 2-Hydroxypropylamino, N,N- Bis(2-hydroxyethyl)amino, Cyclopentylamino, Cyclohexylamino, Cy­ clododecylamino, Cyclopentadecylamino, Cyclohexadecylamino, Cy­ cloeicosanylamino, Cyclotetracosanylamino, Phenylamino, N-Me­ thylphenylamino, Benzylamino, Dibenzylamino, Piperidyl oder Mor­ pholyl.
  • g) Die Gruppe der Formel -COR₃, worin R₃ die unter a) angegebene Bedeutung hat. Als Beispiele für R₃ seien genannt : Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, N-Butyl, sec-Butyl, tert-Butyl, tert-Amyl, n-Hexyl, 1,1,3,3,-Tetramethylbutyl, n-Heptyl, n- Octyl, n-Nonyl, n-Decyl, n-Undecyl, n-Dodecyl, n-Octadecyl, 3- Pentyl, 4-Heptyl, 5-Nonyl, 6-Undecyl, 7-Tridecyl, 3-Hexyl, 3- Heptyl, 3-Nonyl, 3-Undecyl, Hydroxymethyl, 2-Hydroxyethyl, Trifluormethyl, Trifluorethyl, Cyanomethyl, Methoxycarbonylme­ thyl, Acetoxymethyl, Benzyl, Phenyl, o-, m- oder p-Chlorphenyl, o-, m- oder p-Methylphenyl, 1- oder 2-Naphthyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cyclododecyl, Cyclopentadecyl, Cyclohexadecyl, Cy­ cloeicosanyl, Cyclotetracosanyl, Thienyl, Pyranylmethyl, Benzyl oder Furfuryl.
  • h) Die Gruppe der Formel-N(R⁷)COR₃, worin R₃ die unter b) ange­ gebene Bedeutung hat, R₇ Wasserstoff, Alkyl, beispielsweise Me­ thyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, sec-Butyl, n-Hexyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl, n-Decyl, n-Undecyl, n-Dodecyl, n- Octadecyl, 3-Pentyl, 4-Heptyl, 5-Nonyl, 6-Undecyl, 7-Tridecyl, 3-Hexyl, 3-Heptyl, 3-Nonyl, 3-Undecyl, Hydroxymethyl, 2-Hydroxy­ ethyl, Cyanomethyl, Methoxycarbonylmethyl, Acetoxymethyl, Benz­ yl, Phenyl, insbesondere unsubstituiertes oder durch Halogen, Alkyl oder -O-Alkyl substituiertes Phenyl, beispielsweise o-, m- oder p-Chlorphenyl, o-, m- oder p-Methylphenyl, 1- oder 2-Naph­ thyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cyclododecyl, Cyclopentadecyl, Cyclohexadecyl, Cycloeicosanyl, Cyclotetracosanyl, Thienyl, Py­ ranylmethyl, Benzyl oder Furfuryl. In den Definitionen von R₇ vorkommendes Alkyl kann z. B. eine der unter b) bevorzugt angege­ bene Anzahl C-Atome haben. Als Beispiel seien genannt : Ace­ tylamino, Propionylamino, Butyrylamino, Benzoylamino, p-Chlor­ benzoylamino, p-Methylbenzoylamino, N-Methylacetamino, N-Methyl­ benzoylamino, N-Succinimido, N-Phthalimido oder N-(4- Amino)phthalimido.
  • i) Die Gruppe der Formel -N(R₆)COOR₃, worin R3 und R₆ die unter b) bzw. c) angegebene Bedeutung haben. Als Beispiele seien die Gruppen -NHCOOCH₃, -NHCOOC₂H₅ oder -NHCOOC₆H₅ genannt.
  • j) Die Gruppe der Formel -N(R₆)CON(R₄)(R₅), worin R₄, R₅ und R₆ die unter b) bzw. c) angegebene Bedeutung haben. Als Beispiele seien genannt : Ureido, N-Methylureido, N-Phenylureido oder N,N′-2′,4′-Dimethylphenylureido.
  • k) Die Gruppe der Formel -NHSO₂R₃, worin R₃ die unter b) angege­ bene Bedeutung hat. Als Beispiele seien genannt : Methylsulfon­ ylamino, Phenylsulfonylamino, p-Tolylsulfonylamino oder 2-Naph­ thylsulfonylamino.
  • l) Die Gruppen der Formel -SO₂R₃ oder -SOR₃, worin R₃ die unter b) angegebene Bedeutung hat. Als Beispiele seien genannt : Me­ thylsulfonyl, Ethylsulfonyl, Phenylsulfonyl, 2-Naphthylsulfonyl, Phenylsulfoxidyl.
  • m) Die Gruppe der Formel -SO₂OR₃, worin R₃ die unter b) angege­ bene Bedeutung hat. Als Beispiele für R₃ seien genannt : Methyl, Ethyl, Phenyl, o-, m- oder p-Chlorphenyl, o-, m- oder o-Me­ thylphenyl, 1- oder 2-Naphthyl.
  • n) Die Gruppe der Formel -CON(R₄)(R₅), worin R₄ und R₅ die unter b) angegebene Bedeutung haben. Als Beispiele seien genannt: Carbamoyl, N-Methylcarbamoyl, N-Ethylcarbamoyl, N-Phenylcarba­ moyl, N,N-Dimethylcarbamoyl, N-Methyl-N-phenylcarbamoyl, N-1- Naphthylcarbamoyl oder N-Piperdylcarbamoyl.
  • o) Die Gruppe der Formel -SO₂N(R₄)(R₅), worin R₄ und R₅ die un­ ter b) angegebene Bedeutung haben. Als Beispiele seien genannt: Sulfamoyl, N-Methylsulfamoyl, N-Ethylsulfamoyl, N-Phenylsulfa­ moyl, N-Methyl-N-phenylsulfamoyl oder N-Morpholylsulfamoyl.
  • p) Die Gruppe der Formel -N=N-R₈ den Rest eine Kupp­ lungskomponente oder einen gegebenenfalls durch Halogen, Alkyl oder -O-Alkyl substituierten Phenylrest bedeutet. In den Defini­ tionen von R₈ vorkommendes Alkyl kann z. B. eine der unter b) als bevorzugt angegebene Anzahl C-Atome haben. Als Beispiele für R₈ seien genannt : die Acetoacetarylid-, Pyrazolyl-, Pyridonyl-, o-, p-Hydroxyphenyl-, o-Hydroxynaphthyl-, p-Aminophenyl- oder p-N,N- Dimethylaminophenyl-Reste.
  • q) Die Gruppe der Formel -OCOR₃, worin R₃ die unter b) angege­ bene Bedeutung hat. Als Beispiele für R₃ seien genannt : Methyl, Ethyl, Phenyl, o-, m- oder p-Chlorphenyl.
  • r) Die Gruppe der Formel -OCONHR₃, worin R₃ die unter a) angege­ bene Bedeutung hat. Als Beispiel für R₃ seien genannt : Methyl, Ethyl, Phenyl, o-, m- oder p-Chlorphenyl.
11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekenn­ zeichnet, daß 1 bis 200 SATA-Einheiten auf einen Antikör­ per bei 1 bis 1000 Maleinimid-Funktionen auf der Oberfläche des Liposoms verwendet werden. Bevorzugt ist ein Verhältnis 12 SATA : 1 Antikörper: 40 Maleinimid-Resten.
12. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekenn­ zeichnet, daß 1 bis 200 SPDP-Einheiten auf einen Antikör­ per bei 1 bis 1000 Maleinimid-Spacergruppen auf der Oberfläche des Liposoms verwendet werden. Bevorzugt ist ein Verhältnis 24 SPDP: 1 Antikörper: 40 Maleinimid-Resten.
13. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekenn­ zeichnet, daß 1 bis 50 Antikörper mit einem Liposom ver­ knüpft werden. Bevorzugt sind 1 bis 5 Antikörper.
14. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekenn­ zeichnet, daß 1 bis 10⁸ Immunoliposomen pro Ziel-Zelle verwendet werden, bevorzugt sind 100 bis 10⁷, stärker bevorzugt sind 10⁵ bis 10⁷, am meisten bevorzugt sind 10⁶ bis 4·10⁶ Immu­ noliposomen pro Ziel-Zelle.
15. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Fluoreszenzfarbstoff im molaren Ver­ hältnis zum Sojabohnenöl-Phosphatidylcholin von 0.00001 bis 0.1 zu 1, bevorzugt von 0.001 bis 0.01 zu 1, am meisten bevorzugt von 0.006 : 1., eingesetzt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekenn­ zeichnet, daß zur Detektion des Fluoreszenzfarbstoffs Licht mit hoher Intensität verwendet wird.
17. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die mit den Antikörpern verknüpften Liposo­ men bei 4°C gelagert werden.
18. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Verknüpfung von Antikörpern mit SATA oder SPDP bei Temperaturen von 4 bis 40°C, bevorzugt 20 bis 25°C während 1 Minute bis 10 Stunden, bevorzugt 1 Stunde, vorgenommen wird und anschließend überschüssiges Reagenz bei 0 bis 10°C, be­ vorzugt bei 4°C, durch Dialyse während 2 bis 500 Stunden, bevor­ zugt 24 Stunden, entfernt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die eigentliche Kupplung mit den Liposomen nach einer Voraktivierung mit Hydroxylamin in einem Phosphatpuf­ fer bei pH 6.0 durch Inkubation bei 25°C unter nachfolgender Be­ handlung mit N-Methylmaleinimid erfolgt.
20. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Immunoliposomen von den nicht umgesetz­ ten Antikörper mit der Ultrazentrifuge in einem Dichtegradienten oder chromatographisch abgetrennt werden.
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