DE3885908T2

DE3885908T2 - Verfahren zur änderung der oberfläche eines polymers.

Info

Publication number: DE3885908T2
Application number: DE89900587T
Authority: DE
Inventors: Henrik Elsner; Soeren Mouritsen
Original assignee: GLUETECH APS COPENHAGEN
Current assignee: GLUETECH APS COPENHAGEN
Priority date: 1987-12-07
Filing date: 1988-12-07
Publication date: 1994-03-24
Anticipated expiration: 2008-12-08
Also published as: US5427779A; DK641487A; EP0390841B1; DE3885908D1; EP0319957A3; EP0319957A2; DK641487D0; EP0390841A1; DK138190D0; JPH03502938A; CA1335804C; WO1989005329A1; DK165792C; DK138190A; DK165792B; ATE97680T1

Description

KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Modifizieren der Oberfläche eines Polymers. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zum Immobilisieren von Verbindungen an einer festen Polymerphase, vorzugsweise Polystyrol, Polyvinylchlorid oder Polyethylenterephthalatglykol.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Immobilisierung von Biomolekülen an festen Phasen wird bei zahlreichen Verfahren wie z.B. Chromatographie, bei Biosensoren, in Bioreaktoren für z.B. Festphasen-Enzymaufarbeitung, bei der chemischen Synthese von Peptiden, Oligonucleotiden oder anderen Verbindungen und bei sogenannten heterogenen Immunoassays weithin angewandt.
Bei den heterogenen Immunoassays können Antigene oder Antikörper kovalent mit Trägern wie z.B. Cellulose, Agarose oder Polyacrylamid verknüpft werden. Wenn die Verbindungen an eine feste Phase, üblicherweise Polystyrol-, Polypropylen- oder Polyvinylchlorid-Reagenzgläser oder -Mikrotiterplatten, zu binden sind, ist jedoch bei heterogenen Immunoassays die physikalische Adsorption der Verbindungen das normale Verknüpfungsverfahren gewesen (Engvall und Pearlmann, J. Immunol., 1972, S. 109-129).
Passive physikalische Adsorption ist jedoch nicht irreversibel (Lehtonen u.a., J. Immunol. Methods, 1980, S. 34-61), was besonders in dem Fall, daß die mit Antigen/Antikörper beschichtete feste Phase in trockener Form aufbewahrt wird, die Reproduzierbarkeit der Immunoassays beeinflussen kann. Ferner ist es möglich, daß an fester Phase adsorbiertes Antigen wegen Denaturierung (Rekonformation bzw. Konformationsänderung) der Tertiärstruktur des Antigens durch seinen entsprechenden Antikörper nicht erkannt wird (Kurki u. Virtanen, J. Immunol. Methods, 1984, S. 67-122). Das Antigen kann auch neue Antigen-Determinanten zeigen, wenn es denaturiert ist, wie im Fall von DNA.
Die Fähigkeit zum passiven Binden an Kunststoff ist ferner auf eine begrenzte Menge von Molekülen wie z.B. Proteinen oder einzelsträngige DNA eingeschränkt. Einige Proteine und Nucleinsäuren sowie Polysaccharide und kleinere Moleküle können jedoch an einige Arten von Kunststoff nicht direkt adsorbiert werden.
Durch kovalente Bindung werden im Gegensatz zu einfacher physikalischer Bindung alle immobilisierten Verbindungen an der festen Phase in einer definierten Weise orientiert, wodurch definierte Bereiche an z.B. Antigenen, Antikörpern oder Katalyseorten von Enzymen der flüssigen Phase ausgesetzt werden, die schließlich auf die Oberfläche der festen Phase gegossen wird. Antigen-Epitope oder aktive Zentren an diesen Verbindungen können auf diese Weise funktionell bleiben. Irreversible Immobilisierung von Molekülen kann ferner einige Vorteile in bezug auf die Aufbewahrung an fester Phase immobilisierter Verbindungen in ihrem trockenen Zustand haben, weil passive physikalische Bindung z.B. einige Proteine und Nucleinsäuren teilweise denaturiert.
Es würde aus allen diesen Gründen vorteilhaft sein, wenn es möglich wäre, Antigene, Antikörper oder andere Moleküle kovalent an der festen Phase zu immobilisieren.
Kovalente Fixierung einiger Arten von Verbindungen an fester Polystyrolphase ist seit mehreren Jahren bekannt. Festphasensynthesen von Peptiden und Oligonucleotiden werden z.B. unter Verwendung von modifizierten Polystyrolteilchen als festem Trägermaterial durchgeführt. Diese Modifizierungsverfahren bringen jedoch oft sehr gefährliche Chemikalien und mehrere zeitraubende Verfahrensschritte mit sich. Ein Beispiel dafür ist die Herstellung von Merrifields Peptidharz (Merrifields Peptide Resin), die bei der Peptidsynthese weithin angewandt worden ist. An der Herstellung dieses Harzes ist das äußerst karzinogene Reagens Chlormethylmethylether beteiligt, und dieses und andere organische Lösungsmittel führen oft zu einer trüben Oberfläche, weil der Kunststoff in den Reagenzien etwas löslich ist. Dies ist unvorteilhaft, wenn ein späterer spektralphotometrischer Nachweis erwünscht ist.
Es sind Polystyrole erhältlich, die z.B. mit -OH-, -SO&sub3;Hoder -NH&sub2;-Gruppen vormodifiziert worden sind. Wenn diese vormodifizierten Polystyrole verwendet werden, ist für jede Art von modifiziertem Polystyrol eine separate Herstellung von Teilchen erforderlich.
Es ist ein Verfahren zur Einführung von Aminogruppen an Kunststoffoberflächen für die Anwendung bei Mikrotiterplatten beschrieben worden (J. Virol. Methods 3, 1981, S. 155-165). Dieses Verfahren, das die gefährlichen Chemikalien Methansulfonsäure, Eisessig und rauchende Salpetersäure erfordert, dauert zwei Tage und benötigt einen gut funktionierenden Abzug. Solche Bedingungen können wegen Umweltschutzforderungen kaum zur großtechnischen Produktion angewandt werden. Außerdem sind diese Verfahren im allgemeinen zeitraubend, und es ist schwierig, eine gleichmäßige Oberflächenmodifizierung zu erzielen.
Die chemische Modifizierung von Polymermaterialien führt im allgemeinen zu einer heterogenen Mischung von Produkten an der Polymeroberfläche, weil es nicht möglich ist, die an die feste Phase gebundenen funktionellen Hauptgruppen von den unerwünschten Produkten der Reaktion zu trennen. Dies hat mehr oder weniger eine Mischung verschiedener aktiver Gruppen, die z.B. an Proteine verschiedene Bindungsspezifitäten haben, zur Folge.
Ein anderes Verfahren zum chemischen Modifizieren oder Aktivieren von Polymeroberflächen durch Einführung funktioneller Gruppen wie z.B. OH, NH&sub2;, COOH, CHO, NCO oder SCO wird in der EP-A- Patentschrift Nr. 155252 vorgeschlagen.
Gemäß dieser Anmeldung wird eine feste Polymeroberfläche aktiviert, indem Vinylmonomere, die mindestens eine funktionelle Gruppe haben, die zur Bindung an biologisch aktive Moleküle befähigt ist, mittels Strahlen aufgepfropft werden. Das Aufpfropfen auf die Polymeroberfläche wird in dem Fall, daß das Vinylmonomer 1-mono- oder 1,1-disubstituiert ist, in einer Lösung in einem Lösungsmittel, das die Kettenübertragung vermindert, mit einer sehr niedrigen Monomerkonzentration, die nicht mehr als 3 Masse% beträgt, durchgeführt, damit Homopolymerisation und ungesteuerte autokatalytische Reaktionen verhindert werden. Wenn das Vinylmonomer 1,2-substituiert ist, können höhere Kozentrationen von etwa 10 Masse% angewandt werden.
Als anwendbare Vinylmonomere werden Crotonsäure, Acrylsäure, Acrylsäureester, Acrylamid, Bisacrylamid, Methylolacrylamid, acrylierte Amine, acrylierte Epoxide, acrylierte Ether, acrylierte Polyester, acrylierte Polyurethane, acrylierte Acrylate, acrylierte Arten von Silicium, acrylierte Silane, acrylierte Phosphate und acrylierte Titanate, Acrolein, phenylsubstituierte Styrolderivate wie p-Aminostyrol, Tiglinsäure, Seneciosäure, Angelicasäure und Zimtsäure erwähnt.
Dieses Verfahren ist wegen des ihm eigenen Risikos einer übermäßigen Polymerisation des Vinylmonomers schwer zu steuern. Dies ist der wahrscheinlichste Grund für das beschriebene hohe Bindungsvermögen. Es ist unwahrscheinlich, daß 5 bis 7 ug Protein pro Vertiefung als monomolekulare Schicht in einer einzigen Mikrotiterplatten-Vertiefung immobilisiert werden können. Es ist deshalb unbedingt notwendig, daß das Vinylmonomer in einem Lösungsmittel vorhanden ist, das die Kettenübertragung vermindert und das als ein Lösungsmittel definiert ist, das bei seiner Bestrahlung Radikale bildet, die nicht fähig sind, eine Polymerisation zu initiieren. Als Beispiele für geeignete Lösungsmittel sind Methanol, Pyridin, Wasser und Mischungen von Methanol und Wasser erwähnt. In der Praxis werden 1: 1-Methanol/Wasser-Mischungen verwendet.
Das bekannte Verfahren basiert somit auf der Erkenntnis, daß Vinylmonomere, von denen bekannt ist, daß sie an Polymeroberflächen durch Bestrahlungs-Pfropfpolymerisation oder radikalische Pfropfpolymerisation polymerisierbar sind, einer Bestrahlungsbehandlung unter Bedingungen unterzogen werden können, die eine Polymerisation verhindern, und an die Polymeroberfläche als dünne Pfropfschicht, die einer monomolekularen Schicht nahekommt, gebunden werden, wobei reaktionsfähige Gruppen zurückbleiben, die zur Bindung an biologisch aktive Moleküle befähigt sind.
Das bekannte Verfahren hat jedoch eine Anzahl von Nachteilen. Erstens ist der Pfropfungsprozeß sehr zeitraubend. Die Reaktionszeit beträgt sogar mit γ-Strahlung, die die einzige getestete Strahlungsquelle ist, 10 bis 12 Stunden. γ-Strahlung unterliegt strengen Strahlenschutzvorschriften, und es besteht die Neigung, daß der Kunststoff verfärbt wird und dadurch lichtundurchlässig und somit für optische Messungen unbrauchbar gemacht wird.
Das Verfahren erfordert ferner eine sauerstofffreie Atmosphäre und einen freie Radikale bildenden Initiator, z.B. Benzophenon.
Die Dokumentation, die in den Beispielen bereitgestellt wird, zeigt nicht überzeugend, daß die Immobilisierung von Proteinen wegen kovalenter Bindung an das gepfropfte Polymer erzielt worden ist. Ferner wird in den meisten Beispielen ein Standard- Kupplungsagens wie Glutaraldehyd oder ein Carbodiimid-Reagens verwendet. Diese Agenzien verursachen im allgemeinen eine Quervernetzung der Proteinmoleküle, die unabhängig von der Oberflächenbeschaffenheit zu einer verstärkten Bindung führt.
Es ist auch bekannt, daß γ-Strahlung Polymeroberflächen aktiviert und dadurch ihre Proteinbindungseigenschaften verbessert.
Es wird der Schluß gezogen, daß nicht eindeutig bewiesen worden ist, daß die Ergebnisse der Proteinbindung, über die berichtet wurde, auf eine Aktivierung der Polymeroberfläche zurückzuführen und nicht eine Folge der γ-Strahlung und der Verwendung von Kupplungsagenzien sind.
Es ist früher beschrieben worden, daß bifunktionelle Reagenzien, die Arylazide enthalten, an Polymeroberflächen gebunden werden können (DE-A 34 35 744). Als Beispiel dafür diente die Zugabe von Protein A zu einer festen Phase und die anschließende Zugabe der bifunktionellen Verbindung N-Succinimidyl-6-(4'- azido-2'-nitrophenylamino)-hexanoat. Dies führte zur Bindung des Arylazidderivats an die Aminogruppen von Protein A. Dieses konjugierte Produkt wurde anschließend mit Licht bestrahlt, und eine kovalente Bindung an die feste Polymerphase wurde postuliert. Es gibt jedoch keinen Beweis für eine kovalente Bindung zwischen der Polymeroberfläche und Protein A, weil keine Daten in der vorstehend erwähnten Patentanmeldung zeigten, daß Protein A zur Bindung an die Polymeroberfläche befähigt ist, ohne daß die Arylazidverbindung zugesetzt wird.
Ferner ist während der Photolyse zu erwarten, daß Abbauprodukte der Azidogruppe mit höherer Wahrscheinlichkeit an die zahlreichen nucleophilen Gruppen, die an Protein A vorhanden sind, gebunden werden und so Aggregate dieses Proteins bilden. Außerdem ist bekannt, daß Arylazide mit Nucleophilen wie z.B. Wasser reagieren, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer möglichen Reaktion mit der Polymeroberfläche weiter verringert wird.
Es sind Untersuchungen zur photochemischen Biotinylierung von Polystyrol unter Verwendung des im Handel erhältlichen Reagens N-(4-Azido-2-nitrophenyl)-N'-(3-biotinylaminopropyl)-N'-methyl- 1,3-propandiamin (Photobiotin, Sigma Cat. No. A 7667) durchgeführt worden. Dieses Reagens enthält eine Arylazidgruppe, die mit einem chemischen Verbindungsstück, das dem gemäß BEISPIEL 1 verwendeten ähnlich ist, verbunden ist. Es wurden dieselben Optimierungsversuche wie in diesem Beispiel durchgeführt, jedoch konnte keine Biotinylierung der festen Polystyrolphase nachgewiesen werden.
Im Zusammenhang mit dem Verbinden einer Nucleinsäure mit einem festen Substrat ist früher (EP-A 0130523) auch beschrieben worden, daß mit einem festen Substrat, das reaktionsfähige Gruppen hat, wobei diese Gruppen Carboxyl-, Aminogruppen o.dgl., vorvorzugsweise Hydroxylgruppen, wie sie an Cellulose gefunden werden, sein könnten, und mit einem spezifischen Kupplungsreagens, das ein funktionell gemachter, zur photochemischen Reaktion befähigter, Nucleinsäure bindender Ligand ist, - gleichzeitig oder zuerst mit einem und dann mit dem anderen - ein zur gegenseitigen Verknüpfung dienendes Kupplungsmittel wie CNBr oder 1,4-Butandioldiglycidylether zur Reaktion gebracht wird.
Sobald das feste Substrat durch das zur gegenseitigen Verknüpfung dienende Kupplungsmittel aktiviert und der zur photochemischen Reaktion befähigte, Nucleinsäure bindende Ligand an das Kupplungsmittel gebunden ist, ist das feste Trägermaterial bei geeigneter Bestrahlung fähig, eine Nucleinsäure daran zu binden.
Die photochemische Reaktionsfähigkeit des Nucleinsäure bindenden Liganden wird somit zur photochemischen Bindung des Liganden an die DNA während der Analyse und nicht zur photochemischen Bindung des Liganden an das feste Substrat angewandt. Die Bindung des Liganden an den Feststoff erfolgt durch das zur gegenseitigen Verknüpfung dienende Kupplungsmittel.
Interkalieren zur photochemischen Reaktion befähigter, Nucleinsäure bindender Liganden kann bei der Herstellung von markierten Nucleinsäuresonden angewandt werden, die z.B. bei Festphasen-Hybridisierungsformaten eingesetzt werden (EP-A 0131830), jedoch ist dadurch die photochemische Immobilisierung von Molekülen zum Modifizieren der Oberfläche eines Polymers nicht offenbart.

NÄHERE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Um Nachteile zu vermeiden, die mit den derzeit vorhandenen Modifizierungsverfahren im Zusammenhang stehen, liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Modifizieren der Oberfläche eines Polymers, insbesondere ein Verfahren zur photochemischen Immobilisierung von Molekülen an Polystyrol oder anderen Kunststoffmaterialien bereitzustellen.
Die Erfindung basiert auf der überraschenden Erkenntnis, daß eine Anzahl von bekannten zur photochemischen Reaktion befähigten, polycyclischen Verbindungen fest an verschiedene Polymeroberflächen gebunden werden, wenn sie unter geeigneten Bedingungen elektromagnetischer Strahlung ausgesetzt werden.
Die Erfindung betrifft folglich in ihrer weitesten Ausgestaltung ein Verfahren zum Modifizieren der Oberfläche eines Polymers, bei dem die Polymeroberfläche mit einer Verbindung der allgemeinen Formel I:
in der A -O-, -S-, -Se-, NH, NR¹, -NH-O-, -N=N-, S&spplus;R¹, -S-O-, Se&spplus;R¹, -CO-O, -CO-S-, -CS-O-, -CS-S-, -CSe-O-, -CO-Se-, -CS-NH-, -CO-NH , -CO-N(R¹)-, P=O oder -P(=O) (O&supmin;)- ist;
R¹ Hydrocarbyl oder Hydrocarbyloxy ist, von denen jedes mit NO, NO&sub2;, SO&sub3;&supmin;, CN, OH, O, SH, SeH, PO&sub3;&supmin;&supmin;, PO&sub2;&supmin;, COO&supmin;, Halogen, Epoxid, NH&sub2;, NHR", NR"R", worin R" Hydrocarbyl oder Hydrocarbyloxy ist, substituiert sein kann;
R², R³, R&sup4; und R&sup5;, die gleich oder verschieden sein können, H, Halogen, NO, NO&sub2;, SO&sub3;&supmin;, CN, OH, O, SH, SeH, PO&sub3;&supmin;&supmin;, PO&sub2;&supmin;, COO&supmin;, Epoxid, NH&sub2;, NHR", NR"R", worin R" Hydrocarbyl oder Hydrocarbyloxy ist, oder Heterocyclyl bedeuten oder dieselbe Bedeutung haben, wie sie für R¹ definiert ist;
X und Y, die gleich oder verschieden sein können, dieselbe Bedeutung haben, wie sie für R² bis R&sup5; definiert ist, oder
X und Y einander benachbart sind und zusammen eine Gruppe mit der Formel -CR&sup6;=CR&sup7;-A'- bilden, worin A' dieselbe Bedeutung hat, wie sie vorstehend für A definiert ist, und R&sup6; und R&sup7;, die gleich oder verschieden sein können, dieselbe Bedeutung haben, wie sie vorstehend für R² bis R&sup5; definiert ist; und
wahlweise eines oder mehr als eines von R¹ bis R&sup7; eine Sonde bezeichnet,
in Kontakt gebracht wird und das Polymer und die Verbindung der Formel I mit elektromagnetischer Strahlung bestrahlt werden.
Die geeignete elektromagnetische Strahlung kann im Hinblick auf das photochemische Reaktionsverhalten der Verbindung I, z.B. auf das Absorptionsverhalten, das von den wirklich vorhandenen Substituenten und ihrer Umgebung, z.B. Lösungsmittel und anderen gelösten Stoffen, abhängt, ausgewählt werden.
Die elektromagnetische Bestrahlung wird vorzugsweise mit einer Wellenlänge durchgeführt, die kürzer als 700 nm ist.
Gegenwärtig wird eine Bestrahlung im UV-Bereich, d.h. 10 bis 400 nm, bevorzugt. In Abhängigkeit von der tatsächlichen Verbindung I wird "langwellige" Strahlung (> 350 nm) bevorzugt, jedoch kann auch "kurzwellige" Strahlung (< 350 nm) angewandt werden.
Wie nachstehend gezeigt wird, reicht es aus, UV-Lampen mit inkohärenter Strahlung anzuwenden, obwohl die Anwendung komplizierterer Lichtquellen, z.B. von Lichtquellen mit monochromatischer, nicht monochromatischer, polarisierter, nicht polarisierter, kohärenter, nicht kohärenter, kontinuierlicher oder diskontinuierlicher Strahlung, in Betracht gezogen wird.
Der Ausdruck "Hydrocarbyl" bezeichnet Wasserstoff und Kohlenstoff enthaltende Gruppen wie z.B. Alkyl-, Alkenyl- und Alkinylgruppen, die alle höchstens 30 Kohlenstoffatome enthalten; Aryl-, Alkaryl- und Aralkylgruppen, in denen die "Alk"- oder "Alkyl"-Anteile höchstens 30 Kohlenstoffatome enthalten und der Ausdruck "Aryl" Phenyl-, Naphthyl-, Biphenylyl-, Tolylgruppen usw. bezeichnet.
Der Ausdruck "Hydrocarbyloxy" bezeichnet eine Hydrocarbylgruppe, wie sie vorstehend definiert ist, die über eine Sauerstoffbrücke mit dem restlichen Molekül verbunden ist.
Beispiele für C&sub1;- bis C&sub3;&sub0;-Alkylgruppen sind Methyl, Ethyl, Propyl, n-Butyl, Isobutyl, t-Butyl, n-, Iso- und t-Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Dodecyl, Pentadecyl, Eicosyl, Pentacosyl und Triakontyl;
Beispiele für C&sub2;- bis C&sub3;&sub0;-Alkenylgruppen sind Ethenyl, 1-Propenyl, 2-Propenyl, 1-Butenyl, 2-Butenyl, 1-Pentenyl, 1-Heptenyl usw.;
Beispiele für C&sub2;- bis C&sub3;&sub0;-Alkinylgruppen sind Ethinyl, Propinyl, Butinyl, Pentinyl usw.; und
Beispiele für Hydrocarbyloxygruppen sind Hydrocarbylgruppen, wie sie vorstehend definiert sind, die über ein Sauerstoffatom gebunden sind.
Besonders bevorzugte Hydrocarbylgruppen sind langkettige Alkylgruppen, d.h. Gruppen mit 8 bis 16 Kohlenstoffatomen, insbesondere Methyl, Undecyl, Dodecyl, Tridecyl, Tetradecyl, Pentadecyl und Hexadecyl.
Der Ausdruck "Heterocyclyl" bezeichnet vorzugsweise Pyridyl, Pyrimidinyl, Pyridinyl, Furyl, Thienyl, Imidazolyl, Isoxazolyl, Oxazolyl, Thiazolyl, Acridinyl und Morpholyl usw., die in irgendeiner Stellung an die Verbindung I gebunden sein können.
Der Ausdruck "Halogen" bezeichnet Fluor, Chlor, Brom und Iod.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung I aus der Gruppe ausgewählt, die aus wahlweise substituierten Cumarinen (a), Benzofuranen (b&sub1;, wobei Z O ist), Indolen (b&sub2;, wobei Z NH ist) und Angelicinen (c) besteht:
Die wahlweise substituierten Cumarine sind vorzugsweise wahlweise substituierte Psoralene (d):
In diesen Formeln (a) bis (d) sind die wahlweisen Substituenten wie vorstehend für R² bis R&sup5; definiert.
In der folgenden Beschreibung wird auf Psoralene Bezug genommen, jedoch wird erwartet, daß von anderen Verbindungen, die durch die allgemeine Formel I umfaßt werden, in derselben Weise wie nachstehend durch Beispiele erläutert Gebrauch gemacht werden kann.
Die Psoralene können einen oder mehr als einen Substituenten enthalten, und es wird bevorzugt, daß mindestens einer der Substituenten eine Komponente ist, die eine Aminogruppe enthält, vorzugsweise eine 3-Trimethylaminopropoxygruppe.
Als Beispiel für wahlweise substituierte Psoralene können Psoralen, 8-Methyl-3-carboxypsoralen, 4,5',8-Trimethylpsoralen und 3'-Trimethylamino-8-propyloxypsoralen erwähnt werden.
Psoralene, die eine Gruppe von planaren Furocumarinmolekülen sind, die zum Interkalieren in doppelsträngige Desoxyribonucleinsäure (dsDNA) befähigt sind, werden kovalent an DNA gebunden und quervernetzen DNA, wenn sie durch "langwelliges" UV-Licht (λ > 350 nm) aktiviert werden. Die photochemische Reaktion findet zwischen Thymidin und der Doppelbindung in dem Cumarin- und dem Furanteil von Psoralen unter Bildung eines cyclischen Produkts statt. Es ist auch bekannt (Queval u.a., Eur. J. Med. Chem. 9, 1974, S. 335), daß Cumarine (z.B. 5,7-Dimethoxycumarin) zur photochemischen Reaktion befähigte Verbindungen sind.
Gemäß der Erfindung können Psoralene mittels elektromagnetischer Bestrahlung an Polymere wie z.B. Polystyrole gebunden werden, und es ist auf diese Weise möglich, Moleküle über Psoralen kovalent an den Polymeren zu immobilisieren.
Ferner können als Beispiel für die wahlweise substituierten Cumarine Warfarin und als Beispiel für die wahlweise substituierten Indole 5-Hydroxytryptamin und 3-Indolessigsäure erwähnt werden.
Polymere, die bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden sind, sind vorzugsweise Olefinpolymere und können aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Polystyrol, Polyethylenterephthalatglykol, Polyvinylacetat, Polyvinylchlorid, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylnitril, Polymethylmethacrylat, Polytetrafluorethylen, Butylkautschuk, Styrol-Butadien- Kautschuk, Naturkautschuk, Polyethylen, Poly(4-methylpentylen), Polyester und Polypropylen besteht. Es wird erwartet, daß auch siliciumdioxidhaltige Materialien wie z.B. Glas als "Polymer" verwendet werden können.
Bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein nicht vormodifiziertes Polymer verwendet. Das Verfahren kann in reiner wäßriger Lösung ohne Zusatz organischer Lösungsmittel durchgeführt werden. Es wird eine in hohem Maße reproduzierbare und gleichmäßige Modifizierung des Polymers erzielt, und ein lichtdurchlässiges Polymer wie z. B. Polystyrol bleibt während des gesamten Verfahrens vollkommen lichtdurchlässig. Es dauert in Abhängigkeit von der Lichtquelle weniger als 60 min, in dieser Weise z.B. substituierte Psoralene zu binden, und das Verfahren ist sehr einfach in großtechnischem Maßstab durchführbar und bringt keine toxischen oder karzinogenen Reagenzien mit sich.
Wie aus den folgenden Beispielen ersichtlich sein wird, hängt der Wirkungsgrad der Modifizierung der Polymeroberfläche auch von dem pH der Lösung der Verbindung I ab. Der optimale pH für eine gegebene Verbindung hängt u.a. von den einzelnen Substituenten und ihren positiven oder negativen Ladungen und der Stabilität der Verbindung ab und kann durch Versuche festgestellt werden. Als Richtlinie gilt, daß es erwünscht ist, eine Protonierung der Verbindung I zu vermeiden. Infolgedessen wird für Verbindungen mit Basencharakter, die z.B. Aminogruppen enthalten, ein alkalischer pH bevorzugt, und für Verbindungen mit Säurecharakter, die z.B. Carboxylgruppen enthalten, wird ein saurer pH bevorzugt. Für praktische Zwecke wird ein pH von etwa 5 bis etwa 9 bevorzugt.
Der Wirkungsgrad der Modifizierung der Polymeroberfläche kann erhöht werden, indem das Polymer und die Verbindung I in Gegenwart von Aktivierungsmitteln bestrahlt werden.
Die vorliegende Erfindung wird vorzugsweise in wäßriger Lösung durchgeführt, wobei wahlweise eine die Ionenstärke erhöhende Verbindung, z.B. NaCl, vorhanden ist.
Ferner wird die Modifizierung des Polymers überraschenderweise durch Zusatz von Benzochinon zu der Lösung verbessert. Der Grund für diese Aktivatorwirkung ist nicht klar, jedoch wirkt Benzophenon entweder als Sensibilisator oder nimmt direkt an der Bindung der Verbindung I an die Polymeroberfläche teil.
Durch eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Verbinden einer Verbindung der allgemeinen Formel II:
{L}-{U}
in der L eine Verbindungseinheit (Abstandshalter) oder eine Bindung bezeichnet und U eine Sonde bezeichnet, wie sie nachstehend näher definiert ist, mit einer Polymeroberfläche über eine Verbindung der vorstehend definierten allgemeinen Formel I bereitgestellt.
Die Verbindungseinheit L ist ein organischer Anteil (Abstandshalter) oder eine Bindung, die fähig ist, die Verbindung I und U miteinander zu verbinden. Beispiele für kovalente oder nichtkovalente Verbindungseinheiten (Abstandshalter) sind N,N'-Dimethylcysteamin (Elsner u.a., Anal. Biochem. 149, 1985, S. 575- 581), Diamine wie z.B. N,N'-Dimethylhexandiamin, Cysteamin, Spermidin, Norspermidin (Burchardt u.a., JAGS 49, 1984, S. 4123 -4126), Piperazin (Hansen u.a., Med. Chem., 36, 1983, S. 1510- 1514), Selenodipropionsäure, Glycerin, Hexan und Diethylethen und Abstandshalter, wie sie in EP-A 156287 erwähnt sind.
Ein Beispiel für eine Verbindung I mit daran gebundener Verbindungseinheit ist 8-Propyloxypsoralenyl-N,N¹-dimethylhexandiamin, und ein Beispiel für eine Verbindung I, ein Verbindungsstück und eine Sonde ist N¹-Biotinyl-N-8-propyloxypsoralenyl- N,N¹-dimethylhexandiamin.
Die Sonde U ist eine chemische Komponente irgendeiner Art, die kovalent oder nichtkovalent mit L verknüpft werden kann, wodurch sie durch die Verbindung I an dem Polymer immobilisiert wird. Beispiele für U sind:
a) Ein Markeranteil, der unter Anwendung eines geeigneten Verfahrens identifiziert werden kann. Beispiele für solche Verfahren schließen spektroskopische, Radioisotopen-, photochemische, chemische, immunochemische oder biochemische Mittel wie z.B. Anwendung eines Polypeptids, Lektins oder Antikörpers, der zur Bildung eines Komplexes mit dem Markeranteil befähigt ist, ein. Beispiele für Markeranteile sind Biotin, radioaktive Verbindungen, Spinmarker, fluorogene bzw. fluorochrome Verbindungen (z.B. Fluorescein) , Enzyme oder Farbe erzeugendes Enzymsubstrat, pH-Indikator-Verbindungen bzw. in Abhängigkeit vom pH Farbe erzeugende Verbindungen (z.B. Phenolphthalein) oder Haptene, die z.B. unter Verwendung eines Enzym-markierten Antikörpers erkannt werden können. Der hierin verwendete Ausdruck "Marker" soll somit Anteile, die direkt nachgewiesen werden können, und reaktionsfähige Anteile, die indirekt über eine Reaktion, die ein nachweisbares Produkt liefert, nachgewiesen werden, einschließen.
b) Verbindungen, die reaktionsfähige chemische Gruppen enthalten (z.B. die aktiven Ester N-Hydroxysuccinimidoester und p- Nitrophenylester), die zur Reaktion mit anderen chemischen Gruppen (z.B. Aminogruppen an Proteinen) unter Bildung von kovalenten Bindungen befähigt sind. Andere Beispiele sind aktives Halogen enthaltende Verbindungen (z.B. Benzoylbromid), die sowohl mit Thiol- als auch mit Aminogruppen reagieren, Disulfid enthaltende Verbindungen, Epoxide oder optisch aktive Verbindungen (z.B. Brucin).
c) Zur nichtkovalenten Reaktion befähigte chemische Gruppen, die geladene oder hydrophobe chemische Gruppen umfassen, die Affinität zu Verbindungen zeigen, die eine entgegengesetzt geladene Gruppe oder eine hydrophobe Gruppe tragen. Beispiele für geladene chemische Gruppen sind -NH&sub3;&spplus; und -SO&sub3;&supmin;, die Affinität zu einer Verbindung zeigen, die die entgegengesetzte Gesamtladung trägt (z.B. zu einem Protein).
d) Andere Moleküle wie z.B. Proteine, die spezifische Affinität zu anderen Verbindungen zeigen (z.B. Enzyme, Antikörper, Lektine, Hämoglobin, Histone oder Nicht-Histon-Proteine oder Hormone), Peptide (z.B. Peptidhormone), Arzneimittel (z.B. Cytostatika, Vitamine oder Penicillin), Nucleinsäuren (z.B. DNA-Sonden), Mono-, Oligo- oder Polysaccharide und wahlweise substituierte Lipide.
Das Verfahren gemäß der Erfindung umfaßt folglich eine Vormodifizierung der zu immobilisierenden Moleküle und nicht unbedingt des Polymers. Dies führt zu einer sehr homogenen Modifizierung von Polystyrol und nicht zu einer heterogenen Mischung funktioneller Gruppen, wie sie vorstehend beschrieben wurde.
Ein weiterer Vorteil des Verfahrens gemäß der Erfindung besteht darin, daß es im Gegensatz zur passiven Adsorption an Kunststoff trotz des Vorhandenseins von Tensiden in den Beschichtungslösungen möglich ist, z.B. Proteine an eine feste Phase (das Polymer) zu binden. Dies ist oft der Fall, wenn mit Tensiden solubilisierte Proteine zu untersuchen sind.
Es ist außerdem bekannt, daß Psoralene mit Elektrophilen wie z. B. Doppelbindungen photochemisch reagieren. Andererseits ist bekannt, daß Arylazide z.B. mit Wasser und anderen Lösungsmitteln photochemisch reagieren. Dies macht Arylazide weniger geeignet als Psoralene.
Alle diese Vorteile im Vergleich zu den vorstehend erwähnten Verfahren bringen es mit sich, daß das hierin of fenbarte Prinzip zur chemischen Festphasensynthese wie z.B. zur Peptid- oder Oligonucleotidsynthese angewandt werden könnte, und ein besonderer Vorteil besteht darin, daß das Verfahren in Röhrchen oder Mikrotiterplatten direkt spektralphotometrisch verfolgt werden kann, wenn das Polymer lichtdurchlässig ist.
Auch in dem Fall, daß eine chemische Synthese in Mikrotiterplatten oder Röhrchen bzw. Reagenzgläsern nicht erwünscht ist, kann das Verfahren gemäß der Erfindung auch zur Modifizierung von Polystyrol in einer anderen Form wie z.B. Teilchen geeignet sein.
Ein interessanter Gesichtspunkt der Erfindung besteht darin, daß es möglich ist, das Verfahren der Bindung von Substanzen an Polymere in beliebiger Reihenfolge durchzuführen. Es ist möglich, das Polymer und die Verbindung I im ersten Schritt photochemisch reagieren zu lassen und dann die Verbindungseinheit (falls erforderlich) und die Sonde anzuschließen. Ein anderer Weg ist die Bildung eines Komplexes, der aus der Verbindung I, der wahlweisen Verbindungseinheit und der Sonde besteht, und die anschließende Bindung des gebildeten Komplexes an das Polymer durch Photoaktivierung. Noch ein anderer Weg besteht darin, daß man von einer Kombination aus einer Verbindung I und einer Verbindungseinheit ausgeht, diese Kombination mit dem Polymer photochemisch reagieren läßt und schließlich die Sonde zusetzt.
In diesem Zusammenhang sollte erwähnt werden, daß die Sonde selbst und/oder die Verbindungseinheit einen Teil der Verbindung der allgemeinen Formel I bilden können.
Ein Molekül kann im allgemeinen durch ein Verfahren, das einen der folgenden Schritte umfaßt, an einer festen Oberfläche immobilisiert werden:
a) Umsetzung des Moleküls mit einer Verbindung der allgemeinen Formel T, wahlweise mittels einer Verbindungseinheit, In- Kontakt-Bringen der Kombination mit einem Polymermaterial und elektromagnetische Bestrahlung des Polymers und der Kombination von Molekül und Verbindung I oder
b) Modifizieren der Oberfläche eines Polymers durch Umsetzung der Oberfläche mit einer Verbindung I mittels elektromagnetischer Bestrahlung und danach In-Kontakt-Bringen der modifizierten Polymeroberfläche mit dem Molekül, wahlweise mittels einer Verbindungseinheit.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist zur kovalenten Immobilisierung von Verbindungen (z.B. Antigen oder Haptenen), die an Kunststoffen nicht passiv anhaften, sehr geeignet. Das Verfahren gemäß der Erfindung kann direkt in Mikrotiterplatten, Röhrchen bzw. Reagenzgläsern, bei Streifen oder an Teilchen durchgeführt werden. Das Verfahren kann infolgedessen auch bei der Herstellung einer festen Phase, die bei verschiedenen Arten von Immunoassays zu verwenden ist, angewandt werden.
Bei einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird die feste Oberfläche aus einer Polymerplatte wie z.B. einer Dünnschichtplatte oder Mikrotiterplatte, Polymerperlen, Streifen, Tauchstäben, Reagenzgläsern und (Mikro)kugeln ausgewählt.
Bei der Festphasen-Enzymaufarbeitung und der Affinitätschromatographie müssen Proteine oder andere Verbindungen, die spezifische Affinität zu anderen Molekülen zeigen, an einer festen Phase immobilisiert werden. Eine Lösung der zu trennenden oder auf zuarbeitenden Moleküle wird dann entweder durch eine Säule hindurchgehen gelassen oder einer Suspension zugesetzt, die das feste Trägermaterial enthält. Abbauprodukte oder an feste Phase gebundene Verbindungen können dann anschließend eluiert werden.
Materialien, die bei der Chromatographie als feste Phasen verwendet werden, basieren oft auf Agarose, Polyacrylamid, Dextran oder Cellulose. Alle diese Substanzen sinken unter den hohen Drücken, die bei Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Verfahren (HPLC-Verfahren) angewandt werden, zusammen bzw. sind nicht druckstabil. Polystyrol-Mikroteilchen, die gemäß der Erfindung kovalent modifiziert worden sind, sind eine vorteilhafte Alternative zu den vorstehend erwähnten Substanzen oder siliciumhaltigen Materialien, die in HPLC-Säulen oder anderen chromatographischen Systemen verwendet werden.
Bei der Enzymaufarbeitung ist oft eine Festphasen-Immobilisierung erwünscht. Das Verfahren gemäß der Erfindung könnte zu diesem Zweck sowie zur Immobilisierung von Mikrobenzellen oder anderen Zellen angewandt werden. Es wird erwartet, daß immobilisierte Enzyme bei der Reinigung von Industrieabfällen bzw. -abwasser und bei der Trennung von anorganischen Verbindungen angewandt werden könnten.
Die Fixierung von z.B. Enzymen an z.B. Glas wird bei Biosensoren angewandt. Die vorliegende Erfindung könnte bei der zukünftigen Entwicklung von Biosensoren angewendet werden.
Bei der Behandlung von Krebs unter Anwendung cytotoxischer Arzneimittel, die an Polymeren immobilisiert sind, sind Mikrokugeln verwendet worden. Ferner sind monoklonale Anti-Krebszellen-Antikörper, die an magnetischen Polystyrolteilchen immobilisiert sind, verwendet worden, um vor einer Autotransplantation Krebszellen von Knochenmarkzellen abzutrennen. Die vorliegende Erfindung findet auch auf diesen Gebieten Verwendung.
Die vorliegende Erfindung kann sogar bei der Herstellung von laminiertem Kunststoff Verwendung finden, wobei z.B. Psoralen- Verbindungen als photoaktiver Leim zwischen den Laminatschichten eingesetzt werden. Sie kann auch angewandt werden, um farbige Verbindungen kovalent an z.B. Polystyrol zu binden, wobei z.B. Psoralene verwendet werden, die an eine farbige Verbindung konjugiert sind.
Verbindung I kann entsprechend den folgenden Grundsätzen synthetisiert werden:
Photoaktive Benzofurane, Cumarine wie Psoralene und Angelicine können synthetisiert werden, oder sie können aus Pflanzen oder Steinkohlenteer isoliert werden. 4,5',8-Trimethylpsoralen und 8-Methoxypsoralen können aus dem Pilz Sclerotina selerotiorum isoliert werden (Scheel u.a., Biochem. 2, 1963, S. 1127), und Benzofurane und Cumarine können aus Steinkohlenteer oder Pflanzen isoliert werden.
Psoralene, z.B. 4,5',8-substituierte Psoralene, können aus 2- Methyl-3-hydroxyphenol durch Reaktion mit Acetessigsäureethylester, die zur Bildung eines substituierten Cumarins führt, synthetisiert werden (Rangaswani u.a., Proc. Ind. Acad. Sci. Sect. A6, 1937, S. 112). Nach 5 weiteren Syntheseschritten: Reaktion mit Allylbromid, Erhitzen, Behandlung mit Base, Reaktion mit Brom und schließlich Behandlung mit Natriumethanolat, wird ein 4,5',8-substituiertes Psoralen gebildet (Queval u.a., Eur. J. Med. Chem. 9, 1974, S. 335). Die Reaktionsfolge ist nachstehend veranschaulicht:
Es ist möglich, die Substituenten an dem Cumarinprodukt und folglich an dem 4,5',8-substituierten Psoralen der Formel I auszutauschen, indem 2-Methyl-3-hydroxyphenol durch andere substituierte Phenole ersetzt wird. Wenn statt dessen 2-Methoxy-3- hydroxyphenol verwendet wird, ist das Endprodukt 4,5'-Dimethyl- 8-methoxypsoralen anstelle von 4,5'-Dimethyl-8-methylpsoralen. Wenn die Estergruppe in dem Cumarin z.B. gegen eine Amid-, Thioester-, Phosphoester- oder Selenoestergruppe auszutauschen ist, können als Ausgangsmaterial andere Phenolreagenzien verwendet werden, beispielsweise ein Ausgangsmaterial, bei dem die 3-Hydroxygruppe in dem Hydroxyphenol durch eine Amino-, Thiol-, Phosphor- oder Selengruppe ersetzt ist. Wenn das Ausgangsmaterial 2-Amino-3-methylphenol wäre, würde das Produkt ein Cumarin mit einer Amid- anstelle einer Estergruppe (Lactam statt Lacton) sein.
Die Estergruppe in dem Cumarin kann gegen weitere Gruppen ausgetauscht werden, indem der Essigsäureethylester in dem ersten Schritt der Synthese durch ein Halogenalkanon ersetzt wird. In dem Fall, daß der Acetessigsäureethylester durch 1-Brom-3-butanon (CH&sub3;COCH&sub2;CH&sub2;Br) ersetzt wird, ist das Produkt bei der Umsetzung mit 2-Methyl-3-hydroxyphenol oder 2-Amino-3-hydroxyphenol ein Cumarin-Analogon, bei dem die Estergruppe gegen eine Ether- bzw. eine Aminogruppe ausgetauscht ist.
Die Synthese von Psoralenen kann auch durchgeführt werden, indem anfänglich der Benzofuran-Teil synthetisiert wird. Es ist möglich, von 2,4-Dimethoxy-3-methylbenzaldehyd auszugehen und diese Verbindung mit Aluminiumtrichlorid zu reduzieren und mit Diethylbrommalonat umzusetzen. Dies führt zu substituierten Benzofuranen (Queval u.a., Eur. J. Med. Chem. 9, 1974, S. 335). Weitere Reaktionen in sechs Schritten führen zu 3-Carbethoxy-8- methylpsoralen. Die Reaktionsfolge ist nachstehend veranschaulicht: Chinolin o-Phenanthrolin
Wenn das Carbethoxypsoralen mit Eisessig in Schwefelsäure behandelt wird, wird ein Psoralen erzeugt, das eine Carboxylgruppe enthält.
Ein Modifizieren der Verbindung I mit einer reaktionsfähigen Gruppe kann mit Chlormethylmethylether durchgeführt werden und führt zu einem Chlormethylierungsprodukt, das von der Art der verwendeten Verbindung I abhängt. Wenn die Verbindung I 8-Methoxypsoralen ist, ist das Produkt. 5-Chlormethyl-8-methoxypsoralen, und wenn die Verbindung I 4,5',8-Trimethylpsoralen ist, ist das Produkt 4,5',8-Trimethyl-5'-chlormethylpsoralen (Elsner u.a., Anal. Biochem. 149, 1985, S. 575- 581). Es ist auch möglich, eine Methoxygruppe in eine reaktionsfähige Gruppe umzuwandeln, indem sie mit Magnesiumiodid und Dibrompropan umgesetzt wird. Wenn die verwendete Verbindung I 8-Methoxypsoralen ist, ist das resultierende Produkt 3-Brompropyloxypsoralen. Die vorstehend erwähnten Umwandlungen sind nachstehend veranschaulicht:
In eine Verbindung I, die eine Carboxylgruppe enthält, kann eine reaktionsfähige Estergruppe wie z.B. ein N-Hydroxysuccinimidoester eingeführt werden. Die Einführung kann durchgeführt werden, indem die Carboxylgruppe in Gegenwart eines Carbodiimids in z.B. Dioxan mit N-Hydroxysuccinimid umgesetzt wird.
Die Einführung einer Verbindungseinheit (Abstandshalter) (falls notwendig) kann unter Anwendung verschiedener Synthesewege durchgeführt werden. Das Anschließen einer Verbindungseinheit scheint an allen Stellungen an der Verbindung I möglich zu sein. Mit der Verbindungseinheit kann irgendeine Verbindung (z. B. Biotin, Enzym, chirale Verbindungen, Pharmaka usw.) verbunden werden. Wenn 3-Brompropyloxypsoralen mit N'-t-Butyloxycarbonyl-N',N-dimethylhexandiamin in Aceton erhitzt wird, wird die Verbindungseinheit, N'-t-Butyloxycarbonyl-N',N-dimethylhexandiamin, kovalent an die Verbindung I gebunden. Die t-Butyloxycarbonylgruppe kann danach z.B. durch Biotin ersetzt werden. Als Beispiele für andere Gruppen könnten ein Arylazid oder andere zur photochemischen Reaktion befähigte Verbindungen erwähnt werden (Elsner u.a., Anal. Biochem. 149, 1985, S. 575-581).
In der Beschreibung werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
ELISA: Enzymimmunoassay
dsDNA: doppelsträngige Desoxyribonucleinsäure
HPLC: Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
HRP: Meerrettichperoxidase
BSA: Rinderserumalbumin
OD: optische Dichte
IgM: Immunglobulin der Klasse M
IgG: Immunglobulin der Klasse G
RF: Rheumafaktor
DMF: Dimethylformamid
DMSO: Dimethylsulfoxid
PMMA: Polymethylmethacrylat-Teilchen
Boc: t-Butoxycarbonyl
PBS: Phosphat-gepufferte physiologische Kochsalzlösung
Die vorliegende Erfindung wird in den nachstehenden BEISPIELEN 1 bis 11 näher erläutert, und die Bindung von Verbindungen II an Psoralen wird in den nachstehenden BEISPIELEN A bis C erläutert:

BEISPIEL 1

Biotinylierung von Polystyrol mit PS12

Biotin-konjugiertes Psoralen (PS12) mit der Formel:
wurde folgendermaßen synthetisiert:

t-Butoxycarbonyl-N'N'-dimethylhexandiamin (1)

Einer gerührten Lösung von N,N'-Dimethylhexandiamin (Aldrich Cat. No. D16110-1) [Beilstein 4(1), S. 422] (2,92 g; 20 mmol) in Dimethylsulfoxid (DMSO) (30 ml) wurde t-Butoxycarbonylazid in Ether ("Organic Synthesis V", S. 157-158) (2,9 g; 20 mmol; 5,2 ml) tropfenweise zugesetzt. Die Temperatur wurde mit äußerer Kühlung bei 20 ºC gehalten. Nachdem das Zutropfen beendet war (30 Minuten), wurde das Rühren 1 Stunde lang bei Raumtemperatur fortgesetzt, worauf Wasser (30 ml) zugesetzt wurde. Die Lösung wurde mit 2 n HCl angesäuert (pH 5) und mit Ether (2 x 200 ml) extrahiert. Die DMSO/Wasser-Mischung wurde mit 6 n NaOH alkalisch gemacht (pH 11) und mit Ether (4 X 200 ml) extrahiert. Abdampfen des Ethers lieferte die Titelverbindung (1) (1,2 g) in Form eines gelben Öls.

8-Hydroxypsoralen (2)

Einer Suspension von Magnesium (0,97 g; 0,04 mol) in trockenem Benzol (75 ml) wurde im Verlauf von 1 Stunde Iod (10,2 g; 0,04 mol) zugesetzt. Dann wurden 75 ml trockenes Benzol zugesetzt, und die Mischung wurde 1 Stunde lang unter Rückfluß erhitzt. Am nächsten Tag wurde 8-Methoxypsoralen (Sigma Cat. No. M 3501) (4,3 g; 0,02 mol) zugesetzt, und nach 15minütigem Rühren wurde das Lösungsmittel unter Vakuum bei 120 ºC abgedampft, bis der Rückstand praktisch trocken war. Er wurde dann 2 Stunden lang bei 165 ºC weiter erhitzt. Der erhaltene Feststoff wurde mit verdünnter Schwefelsäure zersetzt und filtriert. Der Feststoff wurde mit Wasser gewaschen, in verdünnter Hydrogensulfitlösung suspendiert, wieder filtriert, mit Wasser gewaschen und zuletzt aus Dioxan auskristallisiert und lieferte farblose Kristalle (3,75 g); Schmp. 246 ºC.

3-Brom-8-propyloxypsoralen (3)

8-Hydroxypsoralen (2) (4,04 g; 20 mmol) und Dibrompropan (1,6 g; 8 mmol) wurden in Aceton (400 ml) mit Kaliumcarbonat (20 g) 24 Stunden lang unter Rückfluß erhitzt. Die Lösung wurde filtriert und im Vakuum abgedampft. Chromatographie des Rückstands an Kieselsäuregel mit Chloroform als Elutionsmittel lieferte 3- Brompropyloxypsoralen (2,6 g) in Form eines weißen Pulvers.

PS12

3-Brompropyloxypsoralen (3) (1,6 g) und N-t-Butoxycarbonyl- N,N'-dimethylhexandiamin (1) (1,3 g) wurden in Aceton (100 ml) mit Kaliumcarbonat (1,8 g) vermischt und 72 Stunden lang unter Rückfluß erhitzt, worauf filtriert und im Vakuum abgedampft wurde. Der Rückstand wurde 1 Stunde lang in HCl (2 mol/l) in Eisessig gerührt und anschließend im Vakuum abgedampft. Der Rückstand wurde in absolutem Ethanol (20 ml) und Triethylamin (1 ml) gelöst, worauf Hydroxysuccinimidobiotin (NHS-d-Biotin) (Sigma Cat. No. H1759) (1,7 g) zugesetzt wurde. Nach 24stündigem Rühren wurde im Vakuum abgedampft und mit Chloroform (2 × 2 ml) verdünnt; die Lösung wurde mit verdünntem Natriumhydroxid alkalisch gemacht und wieder mit Chloroform (3 × 2 ml) extrahiert. Die basischen Chloroformextrakte wurden gesammelt, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum abgedampft. Der Rückstand wurde in 1 ml Methanol gelöst, worauf 100 ul Salzsäure (10 val/l) zugesetzt wurden. Das Hydrochlorid (PS12) wurde mit Ether gefällt, gesammelt und gefriergetrocknet.

Bindung von PS12 an Polystyrol

Eine Vorratslösung (10 mg/ml) von PS12 in Dimethylsulfoxid wurde bei -4 ºC aufbewahrt. Aus dieser Vorratslösung wurden zehnfache Verdünnungen in destilliertem Wasser in Konzentrationen, die im Bereich von 0,1 bis 1000 ug/ml lagen, hergestellt, und den Vertiefungen von Polystyrol-Mikrotiterplatten (Nunc, Dänemark) wurden 100 ul/Vertiefung jeder Verdünnung zugesetzt. Die Platten wurden dann 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit "langwelligem" (λ > 350 nm) UV-Licht aus einer Philips-TL-20W/09N-Lampe, die 20 cm oberhalb der Mikrotiterplatten angeordnet war, bestrahlt, und die Vertiefungen wurden 8mal mit 200 ul eines Waschpuffers (29,2 g NaCl; 0,2 g KCl; 0,2 g KH&sub2;PO&sub4;; 0,92 g Na&sub2;HPO&sub4;; Triton X-100; Wasser ad 1000 ml; pH 7,2) gewaschen. Derselbe Versuch wurde ohne Bestrahlung der Mikrotiterplatten durchgeführt.
Den Vertiefungen wurden zum Nachweis der Bindung von PS12 an die feste Phase 100 ul/Vertiefung einer Lösung eines Avidin- Meerrettichperoxidase-(Avidin-HRP-)Komplexes (Sigma) (25 ug Avidin-HRP, 100 mg BSA, 10 ml Waschpuffer) zugesetzt und 1 Stunde lang bei 37 ºC inkubiert. Die Platten wurden dann 3mal mit Waschpuffer gewaschen, und es wurden 100 ul/Vertiefung eines Farbe erzeugenden Substrats [1 mg o-Phenylendiamin (Sigma) pro ml eines Citrat/Phosphat-Puffers (7,3 g Citronensäure; 11,86 g Na&sub2;HPO&sub4; . 2 H&sub2;O; destilliertes Wasser ad 1 Liter); 1 ul H&sub2;O&sub2; (35%ig)] zugesetzt. Nach etwa 10 Minuten wurde die Farbreaktion mit 100 ml 1 n H&sub2;SO&sub4; beendet, und die optische Dichte (OD) wurde an einem Mehrfachabtast-ELISA-Photometer (Titertek Multiscan ELISA-photometer) abgelesen (Fig. 1).

Zeitabhängigkeit der Psoralen-Biotin-Bindung

Eine PS12-Vorratslösung wurde in Wasser bis zu einer Konzentration von 10 ug/ml bzw. 100 ug/ml verdünnt. 100 ul/Vertiefung jeder Verdünnung wurden in Mikrotiterplatten übertragen, einer UV-Bestrahlung mit verschiedener Dauer oder Bestrahlungszeit unterzogen und wie vorstehend beschrieben behandelt (Fig. 2).

Immobilisierung von Streptavidin

Jeder Vertiefung von Mikrotiterplatten, die mit PS12 beschichtet worden waren (0,1 ug/Vertiefung, 1 ug/Vertiefung und 10 ug/Vertiefung, wie vorstehend beschrieben unter Bindung von PS12 an Polystyrol hergestellt), wurde Streptavidin (Zymed) (1 ug/Vertiefung in destilliertem Wasser) zugesetzt. Nach 12 Stunden bei 4 ºC wurden die Platten 3mal mit Waschpuffer gewaschen, und 100 ul einer Lösung eines Biotin-HRP-Komplexes (Sigma) (25 ug Biotin-HRP, 100 mg BSA, 10 ml Waschpuffer, Wasser) wurden zugesetzt, wonach die Platten bei 37 ºC inkubiert wurden. Nach 1 Stunde wurden die Platten 3mal mit Waschpuffer gewaschen, und die Peroxidase-Aktivität wurde wie vor stehend beschrieben ermittelt (Fig. 3).

ERGEBNISSE

Es wurde gezeigt, daß PS12 im Fall seiner Bestrahlung mit UV- Licht fähig war, an Polystyrol zu binden. Die Bindung von PS12 wurde mit Avidin-HRP gemessen, das an den Biotin-Anteil von PS12 gebunden wurde. Ohne UV-Bestrahlung konnte keine durch den Biotin-Anteil von PS12 gelieferte Biotinylierung der Vertiefungen nachgewiesen werden (Fig. 1). Dies läßt deutlich erkennen, daß die Bindung kovalenten Charakter hat. Dies wird ferner dadurch bestätigt, daß PS12 durch anschließende Behandlung unter stark alkalischen oder sauren Bedingungen oder mit den meisten organischen Lösungsmitteln nicht entfernt werden kann. So hält die Bindung einer über Nacht erfolgenden Behandlung mit z.B. 4 n H&sub2;SO&sub4;, 10 n NaOH, abs. Ethanol oder Methanol, Eisessig oder 50%igem DMSO in Wasser stand.
Die Biotinylierung von Polystyrol nahm zu, als den Vertiefungen zunehmende Konzentrationen von PS12 zugesetzt wurden. Bei diesen Versuchen wurden keine Höchstwerte erzielt. Der OD-Wert stieg mit PS12-Konzentrationen, die in dem Bereich von 0.1 ug/Vertiefung bis 1000 ug/Vertiefung lagen, von 0,2 auf 2,6 an.
Unter Verwendung von Avidin-HRP wurde gezeigt, daß nach einer Bestrahlungszeit von 1,5 Stunden ein Höchstwert des Biotinylierungsgrades erreicht wurde. Die OD-Werte stiegen während dieser Zeit von 0,1 auf 1,2 an, als 1 ug PS12 verwendet wurde, und von 0,1 auf 1,6 an, als 10 g PS12 verwendet wurden (Fig. 2).
Eine Höchstzahl der Bindungsstellen von freiem Biotin an immobilisiertem Streptavidin, die mit Biotin-HRP nachgewiesen wurden, wurde erzielt, als die Vertiefungen mit 1 ug/100 ul PS12 beschichtet wurden. Dies entsprach einem OD-Wert von 1,3. Als die Platten mit 0,1 ug/Vertiefung oder 10 ug/Vertiefung PS12 beschichtet wurden, war die Zahl der Stellen mit freiem Biotin geringer. Die Abnahme der Zahl der Biotin-Stellen war im Fall der Verwendung von PS12-Konzentrationen, die unter 1 ug/ml lagen, wahrscheinlich auf geringe Mengen von Biotin an der Polystyroloberfläche zurückzuführen. Da in Fig. 1 gezeigt wurde, daß die Menge von Avidin-HRP, das an der Biotin-konjugierten Polystyroloberfläche immobilisiert wird, mit den PS12-Konzentrationen gut übereinstimmt, kann die aus Fig. 3 ersichtliche Abnahme der Stellen mit freiem Biotin dadurch erklärt werden, daß die Biotin-Stellen an Streptavidin durch zunehmende Mengen von Biotin, das an feste Phase gebunden ist, blockiert werden.
Als kein PS12 verwendet wurde, wurde an Polystyrol kein Streptavidin gebunden, wie aus Fig. 3 ersichtlich ist.
Als 1 ug/Vertiefung PS12 verwendet wurde, lieferte der Biotinylierungsgrad, der mit Avidin-HRP ermittelt wurde, einen OD-Wert > 3, während im Fall der Verwendung von Biotin-HRP keine nachweisbaren Stellen mit freiem Biotin beobachtet wurden (TABELLE 1). Als jeder Vertiefung 2 ug/Vertiefung Streptavidin zugesetzt wurden, nahm die Menge des an feste Phase gebundenen freien Biotins, die mit Avidin-Peroxidase gemessen wurde, ab, so daß der OD-Wert 0,111 betrug. Gleichzeitig nahm die Menge der Stellen mit freiem Biotin, die mit Biotin-HRP gemessen wurde, zu, so daß der OD-Wert > 3 war (TABELLE 1). Dies läßt erkennen, daß Streptavidin tatsächlich immobilisiert und fast an das gesamte Biotin, das an feste Phase gebunden war, gebunden wurde. Unter Verwendung von Biotin- oder Avidin-konjugierter Peroxidase war es ferner möglich, die anschließende Bindung von biotinylierten Verbindungen wie z.B. Nucleinsäuren zu verfolgen. TABELLE 1 Mit PS12 beschichtete Vertiefungen Mit PS12 und Streptavidin beschichtete Vertiefungen Biotin-Peroxidase Avidin-Peroxidase

BEISPIEL 2

Enzymimmunoassay (ELISA) zur Ermittlung von IgM-Rheumafaktoren

Die passive Adsorption von Avidin an eine feste Phase ist in Verbindung mit der sekundären Immobilisierung biotinylierter Verbindungen wie z.B. Immunglobulin oder Kohlenhydraten beschrieben worden (US-Patentschrift Nr. 4 582 810). Die als Beispiel dienende Anwendung für diese Erfindung war die Entwicklung von Immunoassays.
Es ist jedoch bekannt, daß viele gesunde Personen in ihren Seren Anti-Avidin-Antikörper besitzen, die die Messung anderer Verbindungen stören können.
Andererseits zeigt aus Streptomyces isoliertes Streptavidin eine sehr niedrige Reaktionsfähigkeit mit normalem Humanserum, haftet jedoch im Gegensatz zu Avidin nicht passiv an Polystyrol an (BEISPIEL 1). Streptavidin kann infolgedessen nicht in dieser Weise als Agens für eine sekundäre Immobilisierung biotinylierter Verbindungen verwendet werden.
Streptavidin kann jedoch mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung an Polystyrol immobilisiert werden. Dieses kann z.B. bei Enzymimmunoassays (ELISA) angewandt werden. Als Beispiel dafür dient ein ELISA-Verfahren zur Ermittlung von IgM- Rheumafaktoren (IgM-RF).
Diese sind Antikörper der IgM-Immunglobulinklasse, die Affinität zu dem Fc-Teil (fragmentkristallisierbaren Teil) von Immunglobulin der IgG-Klasse zeigen. Dieses Verfahren kann zur Diagnose der primär chronischen Polyarthritis angewandt werden.

Passive Bindung von Avidin an Polystyrol-Mikrotiterplatten

Jeder Vertiefung von Mikrotiterplatten aus nichtmodifiziertem Polystyrol wurden Lösungen (100 ul) von Avidin in 0,1 m Carbonatpuffer, pH 9,5, in Konzentrationen, die im Bereich von 1 ng/ml bis 1 mg/ml lagen, zugesetzt und über Nacht bei 4 ºC inkubiert. Die Platten wurden mit Waschpuffer gewaschen, und das Vorhandensein von Biotin-Stellen wurde wie in BEISPIEL 1 beschrieben mit Biotin-HRP nachgewiesen (Fig. 4).

Immobilisierung von Streptavidin

Eine Immobilisierung von Streptavidin an Polystyrol-Mikrotiterplatten wurde wie in BEISPIEL 1 beschrieben durchgeführt. Jeder Vertiefung wurde 1 ug PS12 zugesetzt, und die Platten wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit UV-Licht (λ > 350 nm) bestrahlt. Anschließend wurden 2 ug/Vertiefung Streptavidin zugesetzt, 1 Stunde lang bei 37 ºC inkubiert und 3mal wie in BEISPIEL 1 beschrieben gewaschen. Andere Mikrotiterplatten aus nichtmodifiziertem Polystyrol wurden wie vorstehend beschrieben direkt mit 2 ug/Vertiefung Avidin beschichtet.
Die mit Streptavidin und die mit Avidin beschichteten Platten wurden über Nacht bei 4 ºC mit Waschpuffer, der 1 % BSA enthielt, (Verdünnungspuffer) (200 ul/Vertiefung) blockiert. Es wurde auch eine Platte vorbereitet, die nur Verdünnungspuffer enthielt.

Reaktionsfähigkeit von Immunglobulin aus gesunden Blutspendern mit an fester Phase immobilisiertem Avidin bzw. Streptavidin

Seren aus 10 gesunden Blutspendern wurden an Platten, die mit Streptavidin, Avidin bzw. BSA beschichtet waren, geprüft, indem 1:100-Verdünnungen in Verdünnungspuffer (100 ul/Vertiefung) zugesetzt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Nach der Inkubationszeit von 1 Stunde wurden die Platten gewaschen, und eine 1:1000-Verdünnung von HRP-markiertem Kaninchen-Antihuman-IgM oder -IgG wurde zugesetzt (100 ul/Vertiefung) und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. An feste Phase gebundene HRP wurde wie in BEISPIEL 1 beschrieben nachgewiesen.

Bestimmung von IgM-RF unter Verwendung von biotinyliertem, gebundenem IgG, das an Streptavidin (an fester Phase immobilisiert) gebunden ist

Biotinyliertes Human-IgG (VECTOR) wurde an Mikrotiterplatten aus PS12-modifiziertem Polystyrol über an fester Phase immobilisiertes Streptavidin immobilisiert.
Den vorstehend beschriebenen Platten, die immobilisiertes Streptavidin enthielten, wurde eine Lösung von 20 ul/ml biotinyliertem IgG in Verdünnungspuffer (100 ul/Vertiefung) zugesetzt, und die Platten wurden 1 Stunde lang bei 37 ºC inkubiert. Sie wurden dann gewaschen, und Serum-Verdünnungen (1 :-100) in Verdünnungspuffer von 10 IgM-RF-positiven Seren und von Seren aus 10 gesunden Blutspendern wurden doppelt zugesetzt (100 ul/Vertiefung).
Die Bindung von Immunglobulin der IgM-Klasse wurde wie vorstehend beschrieben nachgewiesen.

ERGEBNISSE

In Fig. 4 ist gezeigt, daß die Menge des passiv adsorbierten Avidins zunimmt, wenn den Vertiefungen zunehmende Mengen zugesetzt werden. Maximale OD-Werte werden erhalten, wenn jeder Vertiefung 2 ug zugesetzt werden.
In BEISPIEL 1 wurde gezeigt, daß kein Streptavidin adsorbiert wurde, wenn nichtbiotinyliertes Polystyrol verwendet wurde. Dies wurde unter Verwendung von ¹²&sup5;I-markiertem Streptavidin bestätigt.
Fig. 5 zeigt die Ergebnisse der Prüfung von Serum aus 10 gesunden Blutspendern an Vertiefungen, die mit Avidin, Streptavidin bzw. BSA beschichtet waren. Im Vergleich zu mit BSA beschichteten Vertiefungen besitzt eine signifikante Zahl von Seren IgG- sowie IgM-Antikörper, die gegen Avidin gerichtet sind. Bei mit Streptavidin beschichteten Vertiefungen wird jedoch keine signifikante Reaktion beobachtet.
Fig. 6 zeigt die Ergebnisse der Prüfung von Seren aus denselben 10 Spendern und ferner von 10 IgM-RF-positiven Seren auf das Vorhandensein von IgM-RF. Diese erfolgte unter Verwendung von Mikrotiterplatten, die an Streptavidin immobilisiertes, biotinyliertes Human-IgG enthielten. Alle IgM-RF-positiven Seren hatten auch bei dieser ELISA-Analyse einen positiven Befund, und keines der Seren aus gesunden Blutspendern enthielt IgM-RF.
Biotinyliertes IgG wurde auf diese Weise sehr stark an die feste Phase gebunden, was vorteilhaft sein muß, wenn die Platten in trockenem Zustand aufbewahrt werden.

BEISPIEL 3

Biotinylierung von Polymethylmethacrylat mit PS12

Drei Bechern mit 2 ml 0,05 NaCl in Wasser wurden 100 mg Polymethylmethacrylat-Teilchen (PMMA) [ELAVASIT 2041 (DuPont)] zugesetzt. Zweien der Becher mit PMMA wurden 10 ul PS12 [10 mg/ml in DMSO (Dimethylsulfoxid)] zugesetzt. Einer der Becher wurde 1 Stunde lang mit UV-Licht (λ > 350 nm) aus einer Philips-TL-20W/09N-Lampe, die 20 cm oberhalb des Bechers angeordnet war, bestrahlt, und der Inhalt wurde gerührt. Nach der Bestrahlung wurden die PMMA-Teilchen mit 3 x 1 ml Waschpuffer (29,2 g NaCl; 0,2 g KCl; 0,2 g KH&sub2;PO&sub4;; 0,92 g Na&sub2;HPO&sub4;; Triton X-100; Wasser ad 1000 ml; pH 7,2) und wmal mit Wasser gewaschen. Dann wurde 1 ml einer Lösung von Avidin-Peroxidase (Sigma) (25 ug Avidin- Peroxidase, 100 mg BSA, 10 ml Waschpuffer) zugesetzt, und die Becher wurden bei 37 ºC inkubiert. Nach 1 Stunde wurden die PMMA-Teilchen 3mal mit Waschpuffer gewaschen und in saubere Eppendorf-Röhrchen übertragen, und 1 ml Substrat [3 mg 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure) (Sigma) in 10 ml Wasser] wurde zugesetzt. Nach 5 Minuten wurden jedem Becher 100 ul Citronensäure (10 g in 100 ml Wasser) zugesetzt, und nach 10facher Verdünnung mit Wasser wurde die optische Dichte (OD) bei 410 nm ermittelt. ERGEBNISSE: TABELLE 2 Polymethylmethacrylat: Polymethylmethacrylat + PS12: Polymethylmethacrylat + PS12 + Licht:

SCHLUSSFOLGERUNG

PS12 bindet photochemisch an PMMA.

BEISPIEL 4

Biotinylierung von Polystyrol mit PS13

Vertiefungen von Polystyrol-Mikrotiterplatten (NUNC, Dänemark) wurden wäßrige Lösungen von radioaktiv markiertem ³H-3-Trimethylamin-8-propoxypsoralen (PS13) (J.B. Hansen u.a., Journal of Medical Chemistry 28, 1985, Seiten 1001-1010) (100 ul; 1 mg/ml; 3.800.000 Impulse/min) zugesetzt und 6mal zehnfach mit destilliertem Wasser bis zu einer Endkonzentration von 0,01 ug/ml verdünnt. Die Vertiefungen der Mikrotiterplatten wurden dann 2 Stunden lang wie vorstehend beschrieben bei Raumtemperatur bestrahlt und 8mal mit 200 ul Waschpuffer gewaschen. Derselbe Versuch wurde ohne UV-Bestrahlung durchgeführt.
Die Vertiefungen wurden dann ausgeleert, mechanisch getrennt und in Szintillatorfläschchen übertragen, wo die an fester Phase immobilisierte Radioaktivität unter Anwendung der Flüssigkeitsszintillationsmessung in 10 ml Instagel (Packard) nachgewiesen wurde.

ERGEBNISSE

Bei 1 mg/ml wurden 87 ng PS13 photochemisch immobilisiert, während in nicht bestrahlten Vertiefungen nur 17 ng immobilisiert wurden. Als PS13 in einer Konzentration von 100 ug/mg verwendet wurde, wurden an der festen Phase 48 ng immobilisiert, während nicht bestrahlte Vertiefungen Werte in der Nähe der Untergrundwerte (12 ug) zeigten (Fig. 7).
Bei Konzentrationen von weniger als 100 ug/ml konnte keine signifikante Immobilisierung von PS13 nachgewiesen werden - vielleicht wegen des niedrigen Wertes der Radioaktivität in den Verdünnungen im Vergleich zu den Untergrundwerten.

BEISPIEL 5

Biotinylierung von Mikrotiterplatten mit PS12

Ähnliche Versuche wie in BEISPIEL 1 beschrieben wurden unter Verwendung von 2 ug PS12 pro Vertiefung durchgeführt, wobei Mikrotiterplatten von verschiedenen Herstellern und aus verschiedenen Materialien verwendet wurden.
Es wurden die folgenden Flachboden-Mikrotiterplatten verwendet:
Titertek : Polyvinylchlorid, Cat. No. 77-173-05, Flow Laboratories, USA (FlowPVC);
Nunc-Immunoplatten: Polystyrol, Cat. No. 439454, Nunc, Dänemark (NuncPS);
Polystyrol mit hohem Bindungsvermögen: Kat.-Nr. 655061, C.A. Greiner und Söhne, Westdeutschland (GreinPSH);
Polystyrol mit mittlerem Bindungsvermögen: Kat.-Nr. 655001, C.A. Greiner und Söhne, Westdeutschland (GreinPSL);
Polystyrol-EIA-Platten: Cat. No. 3590, Costar, USA (CostPS):
Polyethylenglykolterephthalatplatten mit hohem Bindungsvermögen: Cat. No. 6595, Costar, USA (CostPETG).

ERGEBNISSE

Wie in TABELLE 3 gezeigt ist, banden alle Plattenarten große Mengen von PS12, als sie wie in BEISPIEL 1 definiert mit UV- Licht bestrahlt wurden. Nicht bestrahlte Platten banden keine signifikanten Mengen von PS12. TABELLE 3 Plattenart bestrahlt nicht bestrahlt FlowPVC NuncPS GreinPSH GreinPSL CostPS CostPETG

BEISPIEL 6

Einfluß der Ionenstärke auf die Biotinylierung von Mikrotiterplatten

Ähnliche Versuche wie in BEISPIEL 5 beschrieben wurden durchgeführt, wobei während der Bestrahlungszeit anstelle von destilliertem Wasser NaCl-Lösung (1 mol/l) verwendet wurde. Der Biotinylierungsgrad der Polymere wurde um 50 bis 100 % erhöht.

BEISPIEL 7

Immobilisierung von 5-Hydroxytryptamin an Polystyrol

Eine Lösung von 10 mg/ml 5-Hydroxytryptamin (Aldrich Cat. No. 10775-1) in DMSO wurde hergestellt. 0,1, 1 bzw. 10 ul des 5-Hydroxytryptamins in DMSO wurden einem Carbonatpuffer (pH = 5; 3 × 1 ml; 0,1 mol/l), einem Phosphatpuffer (pH = 7; 3 × 1 ml; 0,1 mol/l) und einem Citratpuffer (pH = 9; 3 × 1 ml; 0,1 mol/l) zugesetzt. Jeder der 9 Lösungen wurde dann ³H-markiertes 5- Hydroxytryptamin (Amersham Cat. No. TRK.223) (10 uCi; 10 ul; 4 ug) zugesetzt, was zu 9 verschiedenen Lösungen mit verschiedenem pH und verschiedenen Konzentrationen führte. Die pH-Werte betrugen 5, 7 und 9, und die Konzentrationen des 5-Hydroxytryptamins betrugen 5, 14 und 104 ug/ml Puffer.
Zu 2 × 9 Vertiefungen von Polystyrol-Mikrotiterplatten (Covasorb, NUNC, Dänemark) wurden 2 × 100 ul Puffer mit 5-Hydroxytryptamin aus jeder der 9 Lösungen hinzugegeben. Die Vertiefungen der Mikrotiterplatten wurden dann 3 h lang bei Raumtemperatur mit "langwelliger" (λ > 350 nm) UV-Strahlung aus einer Philips-TL-20W/09N-Lampe, die 20 cm oberhalb der Mikrotiterplatten angeordnet war, bestrahlt und 8mal mit 200 ul Waschpuffer und 2mal mit 100 ul Ethanol gewaschen.
Dieselben Versuche wurden ohne UV-Bestrahlung und mit kurzwelliger UV-Strahlung aus einer Philips-57415-P/40-TUV-15-W-Lampe durchgeführt. Die Vertiefungen wurden dann ausgeleert, mechanisch getrennt und in Szintillatorfläschchen übertragen, wo die an fester Phase immobilisierte Radioaktivität unter Anwendung der Flüssigkeitsszintillationsmessung in 1,5 ml Ecoscient A (National Diagnostic) nachgewiesen wurde.
Die Menge des immobilisierten Hydroxytryptamins wird aus einer Standardkurve ermittelt, die unter Anwendung einer 10fachen Verdünnung von Puffer mit ³H-markiertem 5-Hydroxytryptamin (14 ug/ml) angefertigt wird.

ERGEBNISSE

Die Menge des immobilisierten 5-Hydroxytryptamins hing von dem pH und von der Art des UV-Lichts ab (TABELLE 4). Die Menge des immobilisierten 5-Hydroxytryptamins war nach Bestrahlung mit kurzwelligem UV-Licht bei dem neutralen pH 7 am größten, d.h. 8000 ng/Vertiefung. TABELLE 4 Konzentration ug/ml ohne Bestrahlung* langwellige UV-Strahlung* kurzwellige UV-Strahlung* * immobilisiertes 5-Hydroxytryptamin (ng/Vertiefung)

BEISPIEL 8

Immobilisierung von 3-Indolessigsäure an Polystyrol

Eine Lösung von 10 mg/ml 3-Indolessigsäure (Aldrich Cat. No. I-375-0) in DMSO wurde hergestellt. 0,1, 1 bzw. 10 ul der 3-Indolessigsäure in DMSO wurden einem Carbonatpuffer (pH = 9; 3 × 1 ml; 0,1 mol/l), einem Phosphatpuffer (pH = 7; 3 × 1 ml; 0,1 mol/l) und einem Citratpuffer (pH = 5; 3 × 1 ml; 0,1 mol/l) zugesetzt. Jeder der 9 Lösungen wurde dann ¹&sup4;C-markierte 3-Indolessigsäure (Amersham Cat. No. CFA.323) (1 uCi; 20 ul; 3 ug) zugesetzt, was zu 9 verschiedenen Lösungen mit verschiedenem pH und verschiedenen Konzentrationen führte. Die pH-Werte betrugen 5, 7 und 9, und die Konzentrationen der 3-Indolessigsäure betrugen 5, 14 und 104 ug/ml Puffer.
Zu 2 × 9 Vertiefungen von Polystyrol-Mikrotiterplatten (Covasorb, NUNC, Dänemark) wurden 2 × 100 ul Puffer mit 3-Indolessigsäure aus jeder der 9 Lösungen hinzugegeben. Die Vertiefungen der Mikrotiterplatten wurden dann 3 h lang bei Raumtemperatur mit "langwelliger" (λ > 350 nm) UV-Strahlung aus einer Philips-TL-20W/09N-Lampe, die 20 cm oberhalb der Mikrotiterplatten angeordnet war, bestrahlt und 8mal mit 200 ul Waschpuffer und 2mal mit 100 ul Ethanol gewaschen. Dieselben Versuche wurden ohne UV-Bestrahlung und mit kurzwelliger UV-Strahlung aus einer Philips-57415-P/40-TUV-15-W-Lampe durchgeführt. Die Vertiefungen wurden dann ausgeleert, mechanisch getrennt und in Szintillatorfläschchen übertragen, wo die an fester Phase immobilisierte Radioaktivität unter Anwendung der Flüssigkeitsszintillationsmessung in 1,5 ml Ecoscient A (National Diagnostic) nachgewiesen wurde.
Die Menge der immobilisierten 3-Indolessigsäure wurde aus einer Standardkurve ermittelt, die unter Anwendung einer 10fachen Verdünnung von Puffer mit ¹&sup4;C-markierter 3-Indolessigsäure (13 ug/ml) angefertigt wurde.

ERGEBNISSE

Die Menge der immobilisierten 3-Indolessigsäure hing von dem pH und von der Art des UV-Lichts ab (TABELLE 5). Die Menge der immobilisierten 3-Indolessigsäure war nach Bestrahlung mit kurzwelligem UV-Licht am größten, d.h. 9000 ng/Fläschchen. Mit langwelligem UV-Licht ist es bei pH = 5 möglich, 1100 ng/Vertiefung zu immobilisieren. TABELLE 5 Konzentration ug/ml ohne Bestrahlung* langwellige UV-Strahlung* kurzwellige UV-Strahlung* * immobilisierte 3-Indolessigsäure (ng/Vertiefung)

BEISPIEL 9

Immobilisierung von Warfarin an Polystyrol

Eine Lösung von 10 mg/ml Warfarin (Aldrich Cat. No. 10775-1) in DMSO wurde hergestellt. 0,1, 1 bzw. 10 ul des Warfarins in DMSO wurden einem Carbonatpuffer (pH = 9; 3 × 1 ml; 0,1 mol/l), einem Phosphatpuffer (pH = 7; 3 × 1 ml; 0,1 mol/l) und einem Citratpuffer (pH = 5; 3 × 1 ml; 0,1 mol/l) zugesetzt. Jeder der 9 Lösungen wurde dann ³C-markiertes Warfarin (Amersham Cat. No. CFA.449) (1 uCi; 20 ul; 7 ug) zugesetzt, was zu 9 verschiedenen Lösungen mit verschiedenem pH und verschiedenen Konzentrationen führte. Die pH-Werte betrugen 5, 7 und 9, und die Konzentrationen des Warfarins betrugen 8, 17 und 107 ug/ml Puffer.
Zu 2 × 9 Vertiefungen von Polystyrol-Mikrotiterplatten (Covasorb, NUNC, Dänemark) wurden 2 × 100 ul Puffer mit Warfarin aus jeder der 9 Lösungen hinzugegeben. Die Vertiefungen der Mikrotiterplatten wurden dann 3 h lang bei Raumtemperatur mit "langwelliger" UV-Strahlung aus einer Philips-TL-20W/09N-Lampe, die 20 cm oberhalb der Mikrotiterplatten angeordnet war, bestrahlt und 8mal mit 200 ul Waschpuffer und 2mal mit 100 ul Ethanol gewaschen.
Dieselben Versuche wurden ohne UV-Bestrahlung und mit kurzwelliger UV-Strahlung aus einer Philips-57415-P/40-TUV-15-W-Lampe durchgeführt. Die Vertiefungen wurden dann ausgeleert, mechanisch getrennt und in Szintillatorfläschchen übertragen, wo die an fester Phase immobilisierte Radioaktivität unter Anwendung der Flüssigkeitsszintillationsmessung in 1,5 ml Ecoscient A (National Diagnostic) nachgewiesen wurde.
Die Menge des immobilisierten Warfarins wurde aus einer Standardkurve ermittelt, die unter Anwendung einer 10fachen Verdünnung von Puffer mit ³C-markiertem Warfarin (17 ug/ml) angefertigt wurde.

ERGEBNISSE

Die Menge des immobilisierten Warfarins hing von dem pH und von der Art des UV-Lichts ab. Die Menge des immobilisierten Warfarins war nach Bestrahlung mit langwelligem UV-Licht am größten (TABELLE 6), d.h. 300 ng/Vertiefung bei pH = 5. TABELLE 6 Konzentration ug/ml ohne Bestrahlung* langwellige UV-Strahlung* kurzwellige UV-Strahlung* * immobilisiertes Warfarin (ng/Vertiefung)

BEISPIEL 10

Verstärkte Kupplung von PS12 an Vertiefungen von Polystyrol-Mikrotiterplatten unter Verwendung von Aktivatormolekülen, z.B. p-Benzochinon

Eine Vorratslösung von p-Benzochinon, Merck Art. 802410, wurde mit einer Konzentration von 10 mg/ml DMSO hergestellt. Die Vorratslösung wurde bei +4 ºC aufbewahrt.
PS12 (Vorratslösung; 10 mg/ml DMSO) wurde in Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung, pH 7,3, 2 m NaCl, auf 4 ug/ml verdünnt. p-Benzochinon wurde in einer Reihe 2facher Verdünnungen zugesetzt (wobei Endkonzentrationen von 0 bis 500 ug/ml erhalten wurden).
100 ul der PS12-p-Benzochinon-Suspension wurden in jede Vertiefung einer Mikrotiter- bzw. MicroWell-Einheit (Nunc-Immuno Module C12, A/5 NUNC, Dänemark) pipettiert.
Die Kupplung bzw. Verknüpfung erfolgte durch 1stündige Bestrahlung der gefüllten Vertiefungen unter Anwendung einer Philips- UV-Lampe (Type TL20W/09N). Der Abstand zwischen der Lampe und der MicroWell-Einheit betrug 20 cm.
Jede Vertiefung wurde 3mal unter Verwendung von 350 ul einer Waschlösung (Phosphat-gepufferte physiologische Kochsalzlösung, pH 7,2, 2 m NaCl, Triton X-100) gewaschen, und die Kupplung von PS12 an die MicroWell-Vertiefungen wurde nachgewiesen, indem 100 ul/Vertiefung einer Mischung von Avidin (Sigma No. A- 9390) und an Avidin konjugierter Meerrettichperoxidase (Dakopatts, Code P347, Fabrikationsnummer 047) in einer Konzentration von 4 ug/ml bzw. 0,45 ug/ml zugesetzt wurden.
Es wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert und 3mal mit Waschpuffer (350 ul/Vertiefung) gewaschen.
Die Reaktion mit dem Substrat wurde entsprechend dem in BEISPIEL 1 beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Die optische Dichte wurde unter Anwendung eines Jasco-Immuno- Reader-NJ-2000-Geräts (Nippon InterMed, Japan) abgelesen.
Es wird gezeigt (Fig. 8), daß der Zusatz von p-Benzochinon mit einer Konzentration bis etwa 12 ug/Vertiefung eine verstärkende Wirkung auf die Kupplung von PS12 an Polystyrol-MicroWell- Vertiefungen hatte. Konzentrationen von p-Benzochinon, die oberhalb dieses Wertes lagen, verminderten jedoch die Kupplung. Die Bindung von PS12 hielt aufeinanderfolgenden Behandlungen mit 0,1%igem Natriumdodecylsulfonat (SDS), 1 m Essigsäure und 5 m NaCl, die jeweils eine halbe Stunde lang durchgeführt wurden, stand.

BEISPIEL 11

Kupplung von Biotin-N-hydroxysuccinimidester (NHS-d-Biotin) an feste Polystyrolphasen, die mit N,N'-Dimethylhexandiamin-8-propyloxypsoralen (PS14) modifiziert sind

Eine Arbeitslösung von PS14 mit der Formel:
(500 ug/ml PBS, pH 8,2, 2 m NaCl) wurde aus einer PS14-Vorratslösung (10 mg/ml DMSO) hergestellt.
Jeder Vertiefung einer Mikrotiter- bzw. MicroWell-Einheit (Nunc-Immuno Module C12, A/S NUNC, Dänemark) wurden 100 ul der PS14-Arbeitslösung zugesetzt und 1 Stunde lang bestrahlt, wobei der Abstand von einer UV-Lichtquelle (Philips, Type TL20W/09N) 20 cm betrug.
Jede Vertiefung wurde 3mal mit entmineralisiertem Wasser gewaschen; dann wurde NHS-d-Biotin (Hoechst, Fabrikationsnummer 410074, Calbiochem) in einer Reihe 2facher Verdünnungen mit einer Ausgangskonzentration von 125 ug/ml Carbonatpuffer, pH 9,6, 0,005 mol/l (1,59 g Na&sub2;CO&sub3;, 2,93 g NaHCO&sub3;, destilliertes Wasser ad 1000 ml) zugesetzt.
Die MicroWell-Einheiten wurden zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde jede Vertiefung 3mal mit einer Waschlösung gewaschen, wie sie vorstehend beschrieben wurde.
Der Kupplungs- bzw. Verknüpfungs-Wirkungsgrad von Biotin wurde wie vorstehend beschrieben unter Verwendung von Avidin und Meerrettichperoxidase-konjugiertem Avidin sichtbar gemacht. Die Reaktion mit dem Substrat wurde unter Anwendung des Immuno- Reader-NJ-2000-Geräts von Jasco abgelesen.
Das Ergebnis ist in Fig. 9 gezeigt, und man kann sehen, daß zwischen der Menge des zugesetzten NHS-d-Biotins und dem erhaltenen Signalwert eine ausgezeichnete Übereinstimmung besteht, die darauf hindeutet, daß eine Kupplung von NHS-d-Biotin an PS 14 stattgefunden hat.
Dies wird ferner dadurch gezeigt, daß der Zusatz von NHS-d-Biotin mit einer Konzentration von 125 ug/ml zu Vertiefungen, die nicht modifiziert, aber ansonsten wie vorstehend erwähnt behandelt worden sind, einen mittleren Signalwert von nur 0,077 OD- Einheiten lieferte. Das mittlere Untergrundsignal von PS 14 betrug 0,094 OD-Einheiten.
Die Bindung von PS14 hielt Behandlungen mit 0,1%igem SDS, 1 m Essigsäure und 5 m NaCl stand.

Herstellung von Verbindungen der Formel II

Folgende BEISPIELE A bis C erläutern die Herstellung einiger an Psoralen gebundener Verbindungen der allgemeinen Formel II. Das nachstehende Schema zeigt die hergestellten Verbindungen.

BEISPIEL A

N'N'-Dimethyl-N-[3-(8-psoralenyloxy)-propyl]-cysteamin (3a)

N-t-Butoxycarbonyl-N,N'-dimethylcysteamin (1) (0,5 g; 1,6 mmol), 3-Brompropyloxypsoralen (C. Antonello, S.M. Magno, O. Gia, F. Carlassare, F. Baccichetti und F. Bordin: Il Farmaco, Ed. Sci. 34, 1979, S. 139) (2a) (0,4 g; 1,6 mmol) und K&sub2;CO&sub3; (0,5 g) wurden in CHCl&sub3; (20 ml) vermischt. Die Mischung wurde 72 Stunden lang gerührt und anschließend zur Trockne verdampft. Chromatographie des Rückstands an Kieselsäuregel mit %igem Methanol in Methylenchlorid als Elutionsmittel lieferte N-Boc-N,N'- dimethyl-N'-[3-(psoralenyloxy)-propyl]-cysteamin (0,46 g; 60 %) wovon 0,22 g in mit Chlorwasserstoff gesättigter Essigsäure (20 ml) gelöst wurden. Nach 40 Minuten bei Raumtemperatur fiel Verbindung 3a 2 HCl 2 H&sub2;O aus.
Analyse:
Berechnet für C&sub2;&sub0;H&sub2;&sub6;N&sub2;O&sub4;S&sub2; 2 HCl 2 H&sub2;O:
C 45,20 H 6,07 N 5,27 S 12,06 Cl 13,34
Gefunden: C 45,03 H 5,25 N 5,29 S 12,45 Cl 13,75.
IR-Spektrum (KBr): νmax = 2900 und 3000 (NH), 1720 (CO), 1590 cm&supmin;¹.
Massenspektrum EI-MS, m/e: 422 (M).
Das ¹H-NMR-Spektrum stimmte mit der zugeschriebenen Struktur ausgezeichnet überein.

BEISPIEL B

N,N'-Dimethyl-N-{[(8-methoxy)-psoralen-5-yl]-methyl}- cysteamin (3b)

N-Boc-N,N'-dimethylcysteamin (1) (0,7 g; 2,4 mmol), 5-Chlormethyl-8-methoxypsoralen (A.F. Aboulezz, A.A. EI-Attar und M. El-Sockary: Acta Chim. Acad. Sci. Hung. 77, 1973, S. 208) (2b) (0,65 g; 2,4 mmol) und K&sub2;CO&sub3; (0,5 g) wurden in DMF (25 ml) vermischt. Die Mischung wurde 3 Stunden lang auf 70 ºC erhitzt und anschließend zur Trockne verdampft. Chromatographie des Rückstands an Kieselsäuregel mit Ethylacetat/Toluol (5 bis 25 % linearer Gradient) als Elutionsmittel lieferte N-Boc-N,N'-dimethyl-N-{[(8-methoxy)-psoralen-5-yl]-methyl}-cysteamin (0,63 g; 51 %). Diese Verbindung (0,45 g) wurde von der Schutzgruppe befreit, wie es vorstehend für die Verbindung 3a beschrieben wurde. Der Zusatz von Ethylacetat bewirkte eine Fällung von 3b 2 HCl 1/2 H&sub2;O (0,3 g, 70 %), Schmp. 208-210 ºC.
Analyse:
Berechnet für C&sub1;&sub9;H&sub2;&sub4;N&sub2;O&sub4;S&sub2; 2 HCl 1/2 H&sub2;O:
C 46,53 H 5,55 N 5,71 S 13,07 Cl 14,46
Gefunden: C 46,35 H 5,51 N 5,42 S 12,62 Cl 14,17
IR-Spektrum (KBr): νmax = 2500 und 3000 (NH), 1720 (CO), 1590 cm&supmin;¹.
Massenspektrum EI-MS, m/e: 408 (M).
Das NMR-Spektrum stimmte mit der zugeschriebenen Struktur ausgezeichnet überein.

BEISPIEL C

N,N'-Dimethyl-N-{[(4,8,5'-trimethyl)-psoralen-4'-yl]-methyl}- cysteamin (3c)

N-Boc-N,N'-dimethylcysteamin (1) (0,4 g; 1,4 mmol), 4'-Chlormethyl-(4,8,5'-trimethyl)-psoralen (S.T. Isaacs, J.K. Shen, J.E. Hearst und H. Papoport: Biochemistry 16, 1977, S. 1058) (2c) (0,4 g; 1,4 mmol) und K&sub2;CO&sub3; (0,5 g) wurden in CHCl&sub3; (30 ml) vermischt. Die Mischung wurde 27 Stunden lang gerührt und anschließend zur Trockne verdampft. Chromatographie an Kieselsäuregel mit CHCl&sub3; als Elutionsmittel lieferte N-Boc-N,N'-dimethyl-N-{[(4,8,5'-trimethyl)-psoralen-4'-yl]-methyl}-cysteamin (0,48 g; 64 %), das von der Schutzgruppe befreit wurde, wie es vorstehend für die Verbindung 3a beschrieben wurde. Der Zusatz von Ethylacetat bewirkte eine Kristallisation von 3c 2 HCl 2 H&sub2;O (0,40 g, 86 %) , Schmp. 183-186 ºC.
Analyse:
Berechnet für C&sub2;&sub1;H&sub2;&sub8;N&sub2;O&sub3;S&sub2; 2 HCl 2 H&sub2;O:
C 47,63 H 6,47 N 5,29 S 12,11 Cl 13,39
Gefunden: C 47,96 H 6,57 N 5,28 S 12,05 Cl 13,33
IR-Spektrum (KBr): νmax = 2500 und 3000 (NH), 1720 (CO), 1600 cm&supmin;¹.
Massenspektrum FAB-MS (Glycerin), m/e: 421 (M + 1).
Das ¹H-NMR-Spektrum stimmte mit der zugeschriebenen Struktur ausgezeichnet überein.

Claims

1. Verfahren zum Modifizieren der Oberfläche eines Polymers, bei dem die Polymeroberfläche mit einer Verbindung der allgemeinen Formel I:

in der

A -O-, -S- , -Se-, NH, NR¹, -NH-O-, -N=N-, S&spplus;R¹, -S-O-, Se&spplus;R¹, -CO-O-, -CO-S-, -CS-O-, -CS-S-, -CSe-O-, -CO-Se-, -CS-NH-, -CO-NH-, -C)-N(R¹)-, P=O oder P(=O) (O&supmin;)- ist;

R¹ Hydrocarbyl oder Hydrocarbyloxy ist, von denen jedes mit NO, NO&sub2;, SO&sub3;, CN, OH, O, SH, SeH, PO&sub3;&supmin;&supmin;, PO&sub2;&supmin;, COO&supmin;, Halogen, Epoxid, NH&sub2;, NHR" oder NR"R", worin R" Hydrocarbyl oder Hydrocarbyloxy ist, substituiert sein kann;

R², R³, R&sup4; und R&sup5;, die gleich oder verschieden sein können, H, Halogen, NO&sub2;, NO, SO&sub3;&supmin;, CN, OH, O, SH, SeH, PO&sub3;&supmin;&supmin;, PO&sub2;&supmin;, COO&supmin;, Epoxid, NH&sub2;, NHR", NR"R", worin R" Hydrocarbyl oder Hydrocarbyloxy ist, oder Heterocyclyl bedeuten oder dieselbe Bedeutung haben, wie sie für R¹ definiert ist;

X und Y, die gleich oder verschieden sein können, dieselbe Bedeutung haben, wie sie für R² bis R&sup5; definiert ist, oder

X und Y einander benachbart sind und zusammen eine Gruppe mit der Formel -CR&sup6;=CR&sup7;-A'- bilden, worin A' dieselbe Bedeutung hat, wie sie vorstehend für A definiert ist, und R&sup6; und R&sup7;, die gleich oder verschieden sein können, dieselbe Bedeutung haben, wie sie vorstehend für R² bis R&sup5; definiert ist; und

wahlweise eines oder mehr als eines von R¹ bis R&sup7; eine Sonde bezeichnet,

in Kontakt gebracht wird und das Polymer und die Verbindung der Formel I mit elektromagnetischer Strahlung bestrahlt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Bestrahlung mit einer Wellenlänge durchgeführt wird, die kürzer als 700 nm und vorzugsweise kürzer als 400 nm ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Bestrahlung unter Verwendung einer wäßrigen Lösung der Verbindung I durchgeführt wird, die vorzugsweise einen pH von etwa 5 bis etwa 9 hat und wahlweise eine die Ionenstärke modifizierende Verbindung, vorzugsweise NaCl, enthält.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Bestrahlung in Gegenwart eines Aktivatormoleküls, vorzugsweise Benzochinon, durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Polymer aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Polystyrol, Polyethylenglykolterephthalat, Polyvinylacetat, Polyvinylchlorid, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylnitril, Polymethylmethacrylat, Polytetrafluorethylen, Butylkautschuk, Styrol-Butadien-Kautschuk, Naturkautschuk, Polyethylen und Polypropylen besteht.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die Verbindung I aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus wahlweise substituierten Cumarinen, Benzofuranen, Indolen und Angelicinen besteht.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die wahlweise substituierten Cumarine wahlweise substituierte Psoralene sind.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem mindestens eine der Substituentengruppen in den Psoralenen eine Komponente ist, die eine Aminogruppe enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die Komponente, die eine Aminogruppe enthält, eine 3-Trimethylaminopropoxygruppe ist.

10. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem das wahlweise substituierte Psoralen aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Psoralen, 8-Methyl-3-carboxypsoralen, 4,5',8-Trimethylpsoralen, 3'- Trimethylamino-8-propyloxypsoralen und N,N'Dimethylhexandiamin-8-propyloxypsoralen besteht.

11. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das wahlweise substituierte Cumarin Warfarin ist.

12. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das wahlweise substituierte Indol 5-Hydroxytryptamin oder 3-Indolessigsäure ist.

13. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Verbindung I mit einer Sonde verbunden ist, die eine chemische Komponente ist, die wahlweise über eine Verbindungseinheit mit der Verbindung I verbunden ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die Sonde aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Markeranteilen, die identifiziert werden können, Verbindungen, die reaktionsfähige chemische Gruppen enthalten, zur nichtkovalenten Wechselwirkung befähigten chemischen Gruppen und Affinität zeigenden Molekülen besteht.

15. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem die Markeranteile aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Biotin, radioaktiven Verbindungen, Spinmarkern, fluorogenen bzw. fluorochromen Verbindungen, Enzymen, Enzymsubstraten, pH-Indikator-Verbindungen und Haptenen besteht.

16. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem die Verbindungen, die reaktionsfähige chemische Gruppen enthalten, aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus aktiven Estern, die zur Bildung von kovalenten Bindungen mit anderen chemischen Gruppen befähigt sind, aktives Halogen enthaltenden Verbindungen und Disulfid enthaltenden Verbindungen besteht.

17. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem die nichtkovalenten chemischen Gruppen geladene oder hydrophobe chemische Gruppen sind, die Affinität zu Verbindungen zeigen, die eine entgegengesetzt geladene Gruppe oder eine hydrophobe Gruppe tragen.

18. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem die Affinität zeigenden Moleküle aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Proteinen, Peptiden, Arzneimitteln, Mono-, Oligo- und Polysacchariden und Nucleinsäuren und wahlweise substituierten Lipiden besteht.

19. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Polymer Polystyrol ist und die Verbindung der Formel I 8-Propoxypsoralen ist, das eine Sonde trägt, die Biotin ist, das über ein N,N'-Dimethylhexandiamin-Verbindungsstück mit der Verbindung I verbunden ist.

20. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Polymer Polyvinylchlorid ist und die Verbindung der Formel I 8-Propoxypsoralen ist, das eine Sonde trägt, die Biotin ist, das über ein N,N'- Dimethylhexandiamin-Verbindungsstück mit der Verbindung I verbunden ist.

21. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Polymer Polyethylenglykolterephthalat ist und die Verbindung der Formel I 8-Propoxypsoralen ist, das eine Sonde trägt, die Biotin ist, das über ein N,N'-Dimethylhexandiamin-Verbindungsstück mit der Verbindung I verbunden ist.

22. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Polymer Polystyrol ist und die Verbindung I 3'-Trimethylpropyloxy-8-psoralen ist.

23. Modifiziertes Polymer, das durch das Verfahren nach Anspruch 1 hergestellt worden ist.

24. Modifiziertes Polymer nach Anspruch 23, das in Form einer Platte, eines Teilchens, eines Reagenzglases oder eines Teststreifens bereitgestellt wird.

25. Verfahren zum Ermitteln des Vorhandenseins eines Moleküls in einer Probe, bei dem eine Probe, die das erwähnte Molekül enthält, mit einem modifizierten Polymer nach Anspruch 23 oder 24 in Kontakt gebracht wird.

26. Verfahren nach Anspruch 25, bei dem die feste Oberfläche aus einer Polymerplatte wie z.B. einer Dünnschichtplatte oder Mikrotiterplatte, Polymerperlen, Streifen, Tauchstäben, Reagenzgläsern und (Mikro)kugeln ausgewählt wird.

27. Verfahren zum Immobilisieren eines Moleküls an einer festen Oberfläche, das einen der folgenden Schritte umfaßt:

a) Umsetzung des Moleküls mit einer Verbindung der allgemeinen Formel I, wahlweise mittels einer Verbindungseinheit, In- Kontakt-Bringen der Kombination mit einem Polymermaterial und elektromagnetische Bestrahlung des Polymers und der Kombination von Molekül und Verbindung I oder

b) Modifizieren der Oberfläche eines Polymers durch In-Kontakt- Bringen der Oberfläche mit einer Verbindung I, wie sie in Anspruch 1 definiert ist, mittels elektromagnetischer Bestrahlung und danach Umsetzung der modifizierten Polymeroberfläche mit dem Molekül, wahlweise mittels einer Verbindungseinheit.