DE2808539A1

DE2808539A1 - Reaktionsfaehige derivate von hs-gruppen enthaltenden polymeren

Info

Publication number: DE2808539A1
Application number: DE19782808539
Authority: DE
Inventors: Rolf Erik Axel Verner Axen; Jan Per Erik Carlsson; Haakan Nils Yngve Drevin; Goeran Einar Samuel Lindgren
Original assignee: Pharmacia Fine Chemicals AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 1977-03-04
Filing date: 1978-02-28
Publication date: 1978-09-07
Also published as: GB1597757A; FR2382489A1; SE431758B; JPS53130781A; FR2382489B1; US4175073A; SE7702463L

Description

Unsere Nr. 21 778 . F/La

Pharmacia Fine Chemicals AB Uppsala / Solweden

Reaktionsfähige Derivate von HS-Gruppen enthaltenden Polymeren

Vorliegende Erfindung betrifft reaktionsfähige Derivate von HS-Gruppen enthaltenden Polymeren; diese Derivate können beispielsweise als Thiolierungsmittel oder als Träger für z.B. Enzyme oder andere Proteine verwendet werden.

Die er findungr. gemäßen reaktionsfähigen Derivate zeichnen sich dadurch aus₅ daß eine Anzahl der HS-Gruppen in eine Disulfidgruppe der allgemeinen Formel

O	oder	NH
ti	Tl
-C-S-R	-C-O-

umgewandelt sind, in der A einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10j vorzugsweise 1 bis 6, Kohlenstoffatomen, und Z eine der Gruppen

0 ^°~Λ
-C-O-N (⁰¹V

<-i S

oder ein Säureanlagerungssalz derselben bedeuten, worin η 2 oder 33 R, einen 2-Pyridyl-, 5~Nitro-2~pyridyl- oder 4-Pyridy!rest; und Rp den Methyl- oder Ethylrest bedeuten.

Das Polymere kann in wässrigen Flüssigkeiten löslich oder unlöslich sein. Das Polymere kann synthetisch hergestellt werden odor es kann natürlichen Ursprungs und mit Gruppen

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der Formel -SH versehen sein. Es kann auch von organischer oder teilweise anorganischer Art sein. Eine besonders wichtige Gruppe von Polymeren ist eine solche, die HS-Gruppen enthaltende Derivate solcher Biopolymeren, wie Polysaccharide, Proteine und Polypeptide umfaßt. Das Polymere kann zu einem in Wasser unlöslichen Netzwerk vernetzt sein, welches jedoch in Wasser quellbar sein kann. Ein Beispiel für wasserunlösliche Polymere sind HS-Gruppen enthaltende Derivate von Agarose, vernetztem Dextran oder vernetzter Stärke (wie z.B. solche, die mit Epichlorhydrin unter Bildung eines unlöslichen Gels vernetzt sind), Cellulose oder anderenwasserunlöslichenPolysacchariden oder Glas. Als Beispiele für wasserlösliche Polymere können HS-Gruppen enthaltende Derivate von Dextran, Stärke oder anderen wasserlöslichen Polysacchariden genannt werden. Andere Beispiele für Polymere in diesem Zusammenhang sind native oder modifizierte lösliche oder unlösliche Proteine oder Polypeptide mit freien HS-Gruppen. In vielen Fällen stellt es einen Vorteil dar, HS-Gruppen enthaltende Derivate von wasserunlöslichen, jedoch in Wasser .quellbaren PoIymersubstanzen zu verwenden, wie z.B. derartige Substanzen wie diejenigen, die vernetzte Polymersubstanzen mit einem Gehalt an hydrophilen Gruppen, wie z.B. Hydroxylgruppen, umfassen.

Es gibt viele Beispiele für polymere Substanzen mi, einem Gehalt an HS-Gruppen. Beispielsweise ist ein derartiges Polymeres in Acta Chom. Scand., Bd. 17, S. 2610 -2621 (1963) beschrieben.

ivinip,;; dorv.rtir-or Polymeren mit einem Geh-il*; an freien HS-o rl or Disul ridpiruppori, v/nlcho leicht in freie HS-Gruppen übergoführt werden können, sind im Handel erhältlich. Ein Beispiel hierfür sind die Copolyneren von Acrylamid mit der Gruppe

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-CH₂-CH-CO-NH-CH(CO₂H)-Ch₂-SH

•ρ

(Handelsprodukt Enzacryl Polythiol der Firma Koch-Light Laboratories Ltd., England) und Glas, das mit der Gruppe

-Si-(CH₂),-NH-CO-CH(NH-CO·CH,)-CH₂-SH

substituiert ist (Handelsprodukt Corning Thiol CPG der Firma Corning Glass Company, V.St.A.).

Andere Beispiele sind Agarose, die mit der Gruppe -0-CH₂*CH(OH)'CH₂-SH substituiert ist, sowie Agarose, die mit Glutathiongruppen mit freien HS-Gruppen substituiert ist, welche erhalten werden, indene man entsprechende 2-Pyridyl-disulfid-derivate von Agarose reduziert, welch* letztere im Handel erhältlich sind /Handelsprodukte Thiopropyl-Sepharose dB und Aktivierte Thiol-Sepharose *ίΒ der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden?.

Im Falle der infragestehenden polymeren Substanzen kann die HS-Gruppe an ein in einer Polymerkette im Grundskelett des Polymeren vorliegendes Kohlenstoffatom gebunden sein. Vorzugsweise jedoch werden Polymere auegewählt, bei denen die HS-Gruppe an ein Kohlenstoffatom gebunden ist, das in einer Gruppe vorliegt, die sich aus einer Polymerkette in dem Grundskelett des Polymeren heraus verzweigt und infolgedessen zugänglicher ist. Das Kohlenstoffatom, an das die HS-Gruppe gebunden ist, kann in einer aliphatischen oder aromatischen Gruppe im Polymeren vorliegen und ist seinerseits vorzugsweise direkt an zumindest 1 Kohlenstoffatom gebunden.

Die restlichen Bindungen an dem zuerst genannten Kohlenstoffatom sind vorzugsxyeise mit Wasserstoffatomen abgesättigt.

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Vorzugsweise liegen ausgewählte HS-Gruppen in der Gruppe -CHp-SH oder in einer Gruppe "^C-SH vor, wo das Kohlenstoffatom in einem aromatischen Ring, beispielsweise einem Benzol ring, liegt. Infolgedessen enthält das Polymere vorzugsweise zumindest eine Gruppe der Formel -C-SH, wo eine der

restlichen Bindungen des Kohlenstoffs sich zu einem anderen Kohlenstoffatom erstreckt, und die restlichen Bindungen zu Kohlenstoff und/oder Wasserstoff. Was zuvor im Hinblick auf die Bindung der HS-Gruppe an ein Kohlenstoffatom in der polymeren S.ubstanz gesagt wurde, trifft auch für die Gruppe -S-S-A-Z in den neuen erfindungsgemäßen Polymerderivaten zu.

Die reaktionsfähigen Derivate gemäß der Erfindung können hergestellt v/erden, indem man beispielsweise ein Grundpolymeres, welches keine HS-Gruppen enthält, auf an sich bekannte Weise, z.B. durch Aminieren und nachfolgendes Umsetzen mit einem Thxolxerungsmxttel, wie z.B. Thiolimidat oder N-Acetylhomocystein-thiolacton im Falle von Hydroxylgruppen enthaltenden Polymeren, thioliert und das erhaltene Produkt sodann mit einem bifunktioneilen Mittel der allgemeinen Formel

R₁-S-S-A-Z (I)

umsetzt, worin R^, A und Z die zuvor genannten Bedeutungen besitzen.

Wenn Amino- oder Thiolgruppen bereits in dem Polymeren vorliegen, können entsprechende Stufen bei der obigen Reaktionsfolge entfallen.

Die er-findungsgemäßen reaktionsfähigen Derivate können auch hergestellt werden, indem man das Gruridpolymere mit Gruppen

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IL-S-S-A- versieht, bei denen R₁ und A die zuvor genannten Bedeutungen besitzen. Das so modifizierte Polymere wird sodann mit einem Reaktanden der allgemeinen Formel HS-A-Z umgesetzt, worin A und Z die zuvor genannten Bedeutungen besitzen. Dieser Reaktand kann aus einer Verbindung der allgemeinen Formel R^-S-S-A-Z durch Reduktion unter Bedingungen hergestellt werden, bei denen die Struktur Z nicht beeinflußt wird.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I können auf eine ι——

j mm

Anzahl unterschiedlicher Wege hergestellt werden (vgl. |._Ώ jy Patentanmeldung P .⁰S-^.9K Λλ-Ρ.'Λ? .- zr ■—-)". Die derzeit am bevorzugtesten Her- _;'ü.,{~

ί (D Ώ. stellungsverfahren sind folgende: ;3-q

Die Verbindungen der Formel I, bei denen Z die Gruppe

bedeutet, werden hergestellt, indem man ein Disulfid der allgemeinen Formel

R₁-S-S-A-COOH (II)

worin R₁ und A die zuvor genannten Bedeutungen besitzen, in dem Fall, daß η = 2 sein soll, mit N-Hydroxysuccinimid (oder mit der analogen Verbindung, falls Verbindungen erwünscht sind, bei denen η = 3 sein soll) in Gegenwart eines Koridensationmittels um_^.setzt,

Die Umsetzung wird in einem organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur von 10 bis j50°C durchgeführt. Ein geeignetes Lösungsmittel ist beispielsweise r-5ethylenchlorid, Ethyl-

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acetat oder Dioxan. Die Reaktionszeit schwankt in Abhängigkeit von den ausgewählten Reaktionskomponenten und der Reaktionstemperatur.

Das in diesem Falle benutzte Kondensationsmittel kann ein für Veresterungsreaktionen übliches sein, wie z.B. N,N^f-Dicyclohexylcarbodiimid.

Die Ausgangsverbindung der Formel II kann durch Umsetzung einer Mercaptoalkylcarbonsäure der allgemeinen Formel

HS-A-COOH (III)

mit einem Dipyridyldisulfid der allgemeinen Formel

R₁-S-S-R₁ (IV)

hergestellt werden, wobei in den Formeln A und R₁ die zuvor genannten Bedeutungen besitzen.

Diese Umsetzung wird in einem organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur von 10 bis 30 C durchgeführt. Ein geeignetes Lösungsmittel ist z.B. Ethanol, Ethylacetat oder Dioxan. Die Reaktionszeit schwankt in Abhängigkeit von den ausgewählten Reaktionskomponenten und der Reaktionstemperatur.

Verbindungen der allgemeinen Formel I₃ bei denen Z die Gruppe

0
tt

-C-S-R₁

bedeutet, werden hergestellt, indem man ein Disulfid der Formel II mit dem entsprechenden Thiopyridon in Gegenwart eines Kondensationsmittels in einem organischen Lösungsmittel bei anfänglich niedriger Temperatur, wie z.B. -20⁰C, etwa 1 bis 2 Stunden und sodann bei Umgebungstemperatur (z.B.

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2O°C) umsetzt. Ein geeignetes Lösungsmittel ist z.B. Methylenchlorid, Ethylacetat oder Dioxan. Das benutzte Kondensationsmittel ist vorzugsweise N₁N'-Dicyclohexylcarbodiimid.

Vorteilhafterweise umfaßt das benutzte Ausgangsmaterial ein •Gemisch, welches durch Umsetzung einer Verbindung der Formel III mit einer Verbindung der Formel IV erhalten xiurde.

Verbindungen der allgemeinen Formel I, bei denen Z die Gruppe

NH

Il

-C-O-R₂

bedeutet, werden hergestellt, indem man ein Thiolimidat der allgemeinen Formel

NH

HS-A-C-O-R₂

worin R₂ und A die zuvor genannten Bedeutungen besitzen, mit einem Pyridyldisulfid der allgemeinen Formel R₁-S-S-R₁, worin R₁ die zuvor genannte Bedeutung besitzt, in einem organischen Lösungsmittel umsetzt. Ein in dieser Hinsicht geeignetes Lösungsmittel ist beispielsweise Methanol, welches etwa 10 % Eisessig enthält.

Mit den erfindungsgemäßen Derivaten können niedermolekulare organische Verbindungen, Peptide, Proteine und Kohlenhydrate, welche funktionelle Amino-, HS- oder OH-Gruppen aufweisen, die gegenüber der Gruppe Z reaktionsfähig sind, über eine oder mehrere dieser Gruppen kovalent an das Polymere gebunden und sodann abgespalten werden, indem die Brücke -S-S- gespalten wird, beispielsweise durch reduktive^ Aufspalten oder durch einen Thiol-Disulfidaustausch. So wird, wenn das Polymerkonjugat mit einem Reduktionsmittel, z.B. einem niedrigmolekularen Thiol, behandelt wird, die gebundene Komponente in modifizierter Form freigegeben, welche eine

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oder mehrere Thiolgruppen aufweist. In dieser Hinsicht ist es in erster Linie von besonderem Wert, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen mit Substanzen, die Aminogruppen enthalten^ gekuppelt werden können, wobei eine verhältnismäßig stabile Verbindung an der Kupplungsstelle erhalten wird.

Wenn das Trägerpolymere unlöslich ist, wie es z.B. bei Agarose oder vernetstern Dextran oder aber Glas der Fall ist, stellt es ein Thiolierungsmittel für Komponenten dar, Vielehe Aminogruppen enthalten, wie z.B. Proteine.

Ein Thiolieren mit einem derartigen Thiolierungsmittel (in Festsboffphase) hat bestimmte offensichtliche Vorteile im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren, die normalerweise in homogenen löslichen Systemen durchgeführt werden. Beispielsweise ist das Produkt hinsichtlich des Thiolierungsgrades einheitlicher. Nach Bildung des Gelkonjugates wird alles Materialj welche« nicht immobilisierb (d.h. nicht modifiziert) wurde, weggewaschen, bevor· die modifizierten Moleküle durch Reduktion freigesetzt werden. Dies bedeutet, daß das desorbierte Material zumindest eine Thiolgruppe aufweist. Herkömmliche Verfahren zum Thiolieren von Protein (beispielsweise unter Verwendung von N-Acetylhomocystein-thiolacton oder Thiolimidaten) führen häufig zu heterogenen Produktgemischen bei denen einige Moleküle mehr Thiolgruppen enthalten, während andere gar keine tufweisen, wenn auch die Analyse angibt, daß der mittlere Thiolgehalt derjenige ist, v/elcher beabsichtigt wurde. Auch iat er> schwierig, thioliertcs Material von dem unthiolierten abzutrennen, wenn man herkömmliche Trennverfahren anwendet. (In Falle bestimmter Anwendungen, K.B. wenn Derivate von thiolierten Proteinen mit schweren Atomen hergestellt werden, ist es wesentlich, daß das thiolierte Material so homogen wie möglich ist.) Ein Thiolieren nach dem Feststoffphanen-Verfahren auf diese V/eise führt auch zu einer gewissen sterischen Spezifität, so daß vorzugsweise bestimmte exponierbe Aminogruppen in den

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Molekülen, welche thioliert werden sollen, vorzugsweise modifiziert werden.

Gelderivate der zuvor genannten Art mit Imidat- und Esterstrukturen können auch geeignet aktivierte Träger zur Imobilisierung von Enzymen und anderen Proteinen oder Polypeptiden bilden.

Von speziellem Interesse ist die Möglichkeit eines redukfciven Abspaltens und. Wegwaschens eines gebundenen Enzyms, wenn dieses seine Aktivität verloren hat ,women das Trägermaterial^ nachdem es regeneriert wurde, wieder verwendet wird. Aufgrund der hohen Kosten des Trägermaterials und der Tatsache, daß die Träger, x?enn das Enzym inaktiviert ist₃ verworfen werden müssen, hat sich die Anwendung von Verfahren zur Enz3?mmmobilisierung in technischem Maßstab bisher verzögert, da die meisten !mobilisierungsverfahren zu stabilen kovalenten Bindungen führen, Vielehe nicht leicht aufgespalten werden können.

Nachfolgende Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Herstellung der erfindungsgemäßen reaktionsfähigen Derivate.

Beispiel 1

Herstellung von Agarose-Derivaten mit disulfidgebundenen N-Hydroxysuccinimidesterstrukturen

Sepharose 4b Thiosulfat (15 g sedimentiertes Gel) mit einem Substitutionsgrad von annähernd 100 μΗοΙ Thiosulfatgruppen pro g getrocknetes Gel, hergestellt aus Sepharose 'IB (Agaroseperlen der Firma Pharmacia Pine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) gemäß Acta Chem,Scand., Bd. 29 (1975), Seite 471. bis 474, wurde mit einer 0,1 m NaHCO,-Lösung ge-

"809836/0712 " C F^iKAL !NSPECTCO

waschen und mit 150 mg Dithiothreit (in 15 ml) während 45 Minuten bei 23° C reduziert. Das Gel wurde mit destilliertem Wasser, einem 0,1 m Na-Acetat/0,3 m NaCl-Puffer vom pH-Wert

4.8 und mit einem Gemisch aus 0,1 m Acetatpuffer vom pH-Wert 4,8 und Ethanol im Verhältnis 70:30 gewaschen.

Die Substanz wurde auf einem Glasfilter abgesaugt und sodann durch Durchsaugen von Luft getrocknet, wonach das Gel, welches nun HS-Gruppen enthielt, mit 7 ml eines Puffers aus 0,1 m Natriumacetat und 0,3m NaCl vom pH 4,8 und 45 mg N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat in 3 ml 99,5 tigern Ethanol vermischt wurde. Man ließ 30 Minuten bei 23°C unter gelindem Rühren weiter_reagieren, wonach das Gel auf einem Glasfilter abgesaugt und sodann mit einem Gemisch aus Natriumacetatpuffer vom pH-Wert 4,8 und Ethanol im Verhältnis von 70:30 und schließlich mit reinem 99,5 tigern Ethanol gewaschen wurde. Das erhaltene Agarosederivat wurde in Form einer Suspension in 99,5 tigern Ethanol bei 4 C gelagert.

Der Substitutionsgrad des Agarosederivates hinsichtlich der N-Hydroxysuecinimidestergruppen wurde bestimmt, indem man das Gel während 60 Minuten einem leicht alkalischen pH-Wert (von 8 bis 10) aussetzte, wonach das N-Hydroxysuccinimid freigesetzt und spektrophotometrisch bei einem f\ = 260 nm (S = 8,2 χ 10 M~ cm ) bestimmt wurde. Das erhaltene Agarosederivat enthielt annähernd 40 uMol N-Hydroxysuccinimidestergruppen pro g Trockenderivat.

N-Succinimidyl~3~(2-pyridyldithio)-propionat kann auf folgende Weise hergestellt werden:

1.9 g (8,6 mMol) 2_>2¹-Dipyridyl-disulfid wird in 10 ml Ethylacetat gelöst. Unter Rühren gibt man während 15 Minuten tropfenweise eine Lösung von 0,9 g (8,6 mMol)' 3-Mercaptopropionsäure in 10 ml Ethylacetat zu, und gleichzeitig

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werden 0,5 mg (2 Tropfen) Bortrifluoridetherat zum Reaktionsgemisch gegeben- Nach 20-stündigem Rühren bei .Räumtemperatur wird das Reaktionsgemisch bei einer Temperatur unterhalb 40°C eingedampft (unter Verwendung eines Büchi-Rotationsverdampfers), und der feste gelbe Rückstand wird in 10 ml kaltem (+4⁰C) Ethylacetat aufgeschlämmt und filtriert. Zum Piltrat werden 0,68 g (5 mMol) N-Hydroxysuccinimid zugegeben, wonach unter Rühren bei Raumtemperatur innerhalb von 15 Minuten tropfenweise 1,03 g (5 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 10 ml trockenem Ethylacetat, zugegeben werden. Während 5 Stunden läßt man unter Rühren die Reaktion bei Raumtemperatur weiterlaufen, wonach das Reaktionsgemisch auf 4 C abgekühlt wird, und der Niederschlag aus Dicyclohexylcarbamid abfiltriert wird. Die hellgelbe Lösung wird eingedampft, und das Öl wird in Ethanol aufgelöst und bei -20⁰C kristallisieren gelassen. Die Ausbeute beträgt 45 %; der Schmelzpunkt ist 78,5 bis 8O,5°C.

Beispiel 2

Herstellung von 3 Agarosederivaten mit einem Gehalt a.n disulfidgebundenen'aktivierten Carbonsäuren.

I) 7 ml eines Puffers aus 0_sl m Natriumacetat und 0,3 m Natriumchlorid mit einem pH-Wert von 4,8 und eine Lösung von 80 mg N-Hydroxysuccinimidyl-(2-mercapto)-propionat₎ gelöst in 5 ml 99 _s 5 tigern Ethanol«, wurden zu 3 g gewaschener und trockengesaugter Thiopropylsepharose 6B (Handelsprodukt der Firma Pharmacia Pine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) gegeben= Die Umsetzung wurde während 1 Stunde unter Rühren bei Raumtemperatur durchgeführt. Sodann wurde das Gel zuerst mit einem Natriumacetatpuffer vom pH-Wert 4,8, mit einem Gemisch von Ethanol und Wasser im Verhältnis von 70:30 und schließlich mit 99,5 tigern Ethanol gewaschen. Das Gel wurde als Suspension in Ethanol bei 4°C gelagert.

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- lh -

II) 3 g gewaschene und trockengesaugte Thiopropyl-Sepharose 6b wurden mit 7 ml eines Puffers aus 0,1 m Natriumacetat und O₃3 m Natriumchlorid vom pH-Wert 4,8 und mit 100 mg 3-Marcaptopropionsäure, gelöst in 5 ml 99,5 /Sigem Ethanol, versetzt. Die Reaktion wurde während 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Rühren durchgeführt. Sodann wurde das Gel zweimal mit je 25 ml 0,1 m HCl und zweimal mit 25 ml Aceton + 5 % 0,001 m HCl gewaschen. Das Gel wurde in einen Kolben gebracht, der mit einem Magnetrührer versehen war, wonach 15,3 ml Aceton + 5 % 0,001 m'HCl zugegeben wurden. Danach wurden 250 mg Thiopyridon und 480 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben, und das Gemisch ließ man 3 Stunden bei 31 C sich umsetzen. Nach der Umsetzung wurde zweimal mit 25 ml Aceton + 5 % Wasser und 15 x mit 25 ml 99,5 tigern Ethanol gewaschen. Das Gel wurde als Suspension in Ethanol bei 4°C gelagert.

III) 3 g gewaschenes und trockengesaugtes Thiopropyl-Sepharose 6B wurden mit 7,0 ml eines Puffers aus 0,1 m Hatriumacetat und 0,3 m Natriumchlorid vom pH-Wert 4,8 und l40 ml Methyl-4-mercapto-butyrimidat-hydrochlorid, gelöst in 5 nil 99,5 $igem Ethanol, versetzt. Man ließ sich das Gemisch 11/2 Stunden bei Raumtemperatur umsetzen, wonach es mit Natriumacetatpuffer vom pH-Wert 4,8 und 10 χ mit 25 ml 99,5 tigern Ethanol gewaschen und als Suspension in Ethanol bei 4°C gelagert wurde.

Die zuvor hergestellten 3 Agarosederivate I, II und III wurden auf folgende Weise getestet:

Eine Menge des Gels, welche 0,5 g gefriergetrockneter Substanz entsprach, wurde 12 χ mit 15 ml einer eisgekühlten 0,001 m Salzsäure gewaschen und abgesaugt, wonach in einem

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Zentrifugenrohr aus Kunststoff überschüssiges Glycylleucin₃ gelöst in 25 ml 0,1 η Natriumhydrogencarbonat-Natriumchlorid-Lösung, zugegeben wurde; Das Rohr wurde 11/2 Stunden bei Raumtemperatur langsam rotieren gelassen.

Das Gel wurde auf einem Glasfilter dreimal mit 15 ml Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffer vom pH-Wert 8₅ sodann dreimal mit 15 ml Acetatpuffer vom pH-Wert 4 und schließlich 10 bis 15 x mit 15 ml Wasser und sodann 5 bis 7 x mit 15 ml Aceton gewaschen. Das Gel wurde 2H Stunden bei 80 C getrocknet. Die Aminosäureanalyse führte zu folgenden Ergeb

nissen;

Derivat

juMol χ g~ Trockensubstanz

CH, 0 ⁰V ι Pn Γ

AG-S-S-CH-C-O-N

35 -

II AG-S-S-CH₂-CH₂-C-S

10 - 20

NH

ti

III AG-S-S-CH₉-CH₅-C-.

•OCH.

0-5

Anmerkung;

AG bedeutet die Agarose-Matrix.

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Beispiel 3

Herstellung eines Glasderivates mit einem Gehalt an disulfidgebundenen N-Hydroxysuccinimidesterstrukturen

0,1 g Thiolglas (Handelsprodukt "Corning Thiol CPG 550" der Firma Corning Biological Prod. Dept., Medfield, Mass., V.St. A.) mit 0,03 Milliäquivalenten Thiolgruppen pro g in 1,5 ml 0,1m Natriumphosphat/0,3 m HCl vom pH-Wert 7j5 wurden mit 0,5 ml (50 mMol) Dithiothreit vermischt. Man ließ die Reduktion 60 Minuten bei 25°C fortschreiten. Das Glasderivat wurde dreima.1 mit je 10 ml 0,3 m NaCl-Lösung gewaschen und in 1,0 ml 0,1 m Natriumacetatpuffer vom pH-Wert 4,6 inkubiert. Sodann wurden 0,25 ml einer Lösung von 50 mMol N-Succinimidyl~3-(2-pyridyldithio)-propionat in absolutem Ethanol zugegeben. Nach Umsetzung bei 25°C unter Rühren durch Rotation während 1 Stunde wurde das Glasderivat mit einem 0,1 m Natriumacetatpuffer vom pH-Wert 4,6 gewaschen, danach mit destilliertem Wasser und 99 ₅ 5 tigern Ethanol. Das erhaltene Glasderivat (91 mg) wurde schließlich im Vakuum bei 25°C getrocknet.

Der Substitutionsgrad des Glasderivates hinsichtlich der N-Hydroxysuccinimidestergruppen wurde ermittelt, indem man es einem schwach alkalischen pH-Wert (10 mg Glasderivat + 2,5 ml einer NaHCO,-Lösung vom pH-Wert 9) bei 25°C 6o Minuten aussetzte, wobei N-Hydroxysuccinimid freigesetzt wird, und eine spektrophotometrische Bestimmung bei 260 nm (£ = 8,2 χ

3 -Ϊ -1
10 H cm ) durchführte. Das Glasderivat enthielt etwa 6 uMol N-Eydroxysuccinimidesterstrukturen pro g trockenes Glas.

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Beispiel 4

Herstellung eines Dextrander!vates mit einem Gehalt an disulfi(!gebundenen N-Hydroxysuccinimidesterstrukturen

5 g Dextran T-70 (Handelsprodukt der Pharmacia Pine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) wurden in 20 ml 20 $iger Natronlauge, welche 1 % NaBH₁. enthielt, gelöst. Nach Zugabe von 5 g 2-Chlorethylamin-hydrochlorid wurde das Gemisch 18 Stunden bei 90°C gerührt. Mach Abkühlen auf 25°C und Neutralisieren mit 6 m HCl *,tfurde die kleine Menge an gebildetem Niederschlag abzentrifugiert. Der überstand wux'de gegenüber destilliertem V/asser dialysiert und gefriergetrocknet.

5 g trockenes Produkt (Arainoethyldextran) wurden erhalten. Der Stickstoffgehalt betrug 1,5 %.

1 g des Aminoethyldextrans wurde in 30 ml 0,05 m Natriumboratpuffer vom pH-Wert 9 aufgelöst, wonach innerhalb von 10 Minuten unter Rühren 300 mg N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionab in 30 ml absolutem Ethanol tropfenweise zugegeben wurden. Das Reaktionsgemisch wurde weitere 20 Minuten stehen gelassen, wonach 3 ml konzentrierte Essigsäure zugegeben wurden. Das hierbei erhaltene Gemisch wurde gegen 50 #iges Ethanol (3 x 2000ml) 48 Stunden dialysiert, auf 15 ml eingeengt und gefriergetrocknet. Hierbei wurden 1 g trockenes Produkt (2-Pyridyldisulfiddextran) ex'halten.

0,12 ml einer Lösung von 50 mMol N-Succinimidyl-3~(2-pyridyldithio)-propionat in absolutem Ethanol wurden in 1 ml eines Puffers aus 0,1 m Natriumacetat und 0,3 m NaCl vom pH-Wert 4,6 aufgelöst» Es wurden 50 ^uI einer Lösung von 50 mMol Dithiothreit zugegeben, und das Gemisch wurde 30 Minuten gerührt. Danach wurden 20 mg 2-Pyridyldisulfiddextran, gelöst in 1 ml eines Puffers von 0,1 m Natriumacetat und 0,3 m NaCl vom pH-Wert 4,6 zugegeben. Nach Umsetzung während

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1 Stunde bei 25°C wurden die Komponenten niedrigen Molekulargewichtes durch Gelfiltration an Sphadex G--25 (Perlen aus mit Epiehlorhydrin vernetatem Dextran; Handelsprodukt der Firma Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) entfernt; das verwendete Medium war 0,3 m NaCl. Es wurde ermittelt, daß das unbesetzte (void) Material (3₃0 ml) etwa 6 mg Dextranderivat/ml enthielt.

Der Substitutionsgrad des Dextranderivats bezüglich N-Hydroxysuccinimidestergruppen wurde bestimmt, indem man das Derivat einem schwach alkalischen pH-Wert (0,1 ml der Probe + 1,9 ml H₂O + 0,5 ml NaHCO,-Lösung vom pH-Wert 9) 60 Minuten bei 25°C aussetzte, xfobei N-Hydroxysuecinimid freigesetzt und spektrophotometrisch bei 260 nm (£ = 8,2 χ 10^ M~ cm ) bestimmt wurde. Das Dextranderivat enthielt etwa 25 «Mol IJ-Hydroxysuccxnimxdesterstrukturen pro g trockenes Derivat.

In den vorherigen Beispielen wurden Derivate hergestellt, bei denen A einen gerad- oder verzweigtkettigen aliphatischen Rest darstellt. Es kann jedoch auch ein aromatischer Rest einen Teil der Gruppe. A bilden. Im allgemeinen wird jedoch eine Alkylenkette ~(^CH2^m"' ^{worin m eine} ganze Zahl von 1 bis 6 bedeutet, ausgewählt, welche gegebenenfalls mit einer oder mehreren Alkylgruppen substituiert ist, wobei die Gesamtanzahl der Kohlenstoffatome: von A höchstens 10 ist.

Anwendungsbeispiele Beispiel A

Verwendung eines Agarosederivates mit einem Gehalt an disulfidgebundsnen N-Hydroxysuccinimidesterstrukturen zur Enzyminmobilisierung und Proteinthiolierung

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20 mg .o6-Amylase (Handelsprodukt "Bacterial type HA" der Firma Sigma, V.St.A», ¹J χ kristallisiert) wurden in 3 ml einer 0,1 m NaHCO,- und 0,3 m NaCl-Lösung gelöst. Die Lösung wurde sodann mit 3 g des Agarosederivates vermischt, welches gemäß Beispiel 1 hergestellt und (auf einem Glasfilter) trocken gesaugt und zuerst mit 99^5 tigern Ethanol und sodann 1 mMol HCl gewaschen worden war. Die Umsetzung wurde 3 Stunden bei 23 C fortsetzen gelassen, während durch Rotation gerührt wurde. Das Gel wurde sodann mit einer 0,1 m NaHCO,- und 0,3 m NaCl-Lösung gexvaschen. Die Aminosäureanalyse zeip;te, daß das Gelderivat 120 mg ^-Amylase pro g getrocknetes Derivat enthielt.

Die Bestimmung der oC~Amylaseaktivität des Gels mit 1 % Stärke als Substrat zeigte, daß die jnusobilir.erte öL-30 % der Aktivität des nativen Enzyms aufwies.

Nach Waschen des Agaros e-oü- Amy lasekon j ugates, das sorgfältig mit 0,1 m NaIICO.. und 0,3 m NaCl auf einem Glasfilter vorgenommen wurde, Tiurde das Konjugat mit 3 ml einer 0,1 m NaHCOv-und 0,3 m NaCl-Lösung, die 50 mg Dithiothreit enthielt, v/ährend 60 Minuten inkubiert. Das unlösliche Material wurde sodann auf einem Glasfilter abgesaugt, und das Filtrat

wurde an Sephadex ^l G-25 gelfiltriert (Perlen von mit Epichlorhydrin vernetzten! Dextran, Handelsprodukt der Firma Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden); das hierbei benutzte Medium war der zuvor angegebene Puffer. Die Analyse des unbesetzten (void) Materials ergab, daß dieses 90 % der erwarteten c£-Amy las einenge (aufgrund der Analyse des Gel-Enzymkon j ugates) enthielt. Die Bestimmung des Thiolgehaltes der modifizierten oi-Amylase ergab einen Substitutionsgrad von 1,2 Mol SH pro Mol c</~ Amy läse.

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Beispiel B

Verwendung eines Glasderivates mit einem Gehalt an disulfidgebundenen N-Hydroxysuccinimidesterstrukturen zur reversiblen Inrobilisierung eines Enzyms.

1 mg der in Beispiel A verwendeten ci-Ainylase wurde in 1,0. ml eines Puffers aus 0,1 m Natriumphosphat und O₃3 πι NaCl vom pH-Wert 7,5 gelöst. 10 mg e'ines Glasderivates mit einem Gehalt an 0,06 yuMol N-Hydroxysuccinimidesterstrukturen (hergestellt nach Beispiel 3) wurden sodann zur Lösung zugegeben. Unter identischen Bedingungen wurde ein Blindversuch durchgeführt, bei dem ein Glasderivat eingesetzt wurde, in welchem die N-Hydroxysuccinimidesterstrukturen hydrolysiert worden waren (in Übereinstimmung mit dem zxveiten Absatz des Beispiels 3), bevor es mit der ci-Amylaselösung vermischt wurde. Man ließ die Umsetzung 24 Stunden bei 23°C unter Rühren durch Rotation fortschreiten. Nach Absetzen der Glasderivate wurde der überstand abdekantiert, und die Glasderivate wurden mit 0,3 m NaCl gewaschen. Die Menge an innDbilisierter oi.-Amylase wurde ermittelt, indem man die Aktivität der ct-Amylase der Überstände und der Glasderivate maß (nach Reduktion mit 0,8 ml eines Puffers aus 0,1 m Natriumphosphat und 0,1 m NaCl vom pH-Wert 7,5 + 0,2 ml 50m.Mol Dithiothreit während 60 Minuten bei 25°C). Die Aktivitätsbestimmung wurde durchgeführt, indem man 1,0 ml einer geeigneten Verdünnung des Überstandes von der Kupplung bzw. Reduktion mit 1 ml blauer Stärke inkubierte (eine Tablette des Handelsproduktes Phadebas Amylase Test der Firma Pharmacia Diagnostics AB, Uppsala, Schweden, suspendiert in H ml destilliertem Wasser), und zwar während 15 Minuten bei 25°C, wonach 0,5 ml einer 0,5 molaren Natronlauge zugegeben wurden, und der Wert Ag₁₀ des Überstandes nach Absetzen überschüssigen Substrats und unlöslicher Komponenten bestimmt wurde.

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Die Aktivitätsbestimmungen zeigten, daß die Umsetzung des φ-Amylasederivates mit dem Glasderivat, welches n-Hydroxysuccinimidestergruppen enthielt, zu einem Derivat geführt hatte, welches 30 mg &'-Amy läse pro g trockenes Derivat enthielt, während die nicht-spezifische Absorption, welche mit dem entsprechenden Glasderivat ermittelt wurde, lediglich etwa 1 mg pro g Glas betrug.

Für: Pharmacia Pine Chemicals AB Uppsala- Schweden

DrMl\ .F. Wq Iff Rechtsanwalt

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Claims

Pat entansprüche:

1. Reaktionsfähige Derivate von HS-Gruppen enthaltenden Polymeren, bei denen eine Anzahl von HS-Gruppen in eine Disulfidgruppe der Formel

-S-8-A-Z

übergeführt ist, worin A einen Kohlenwasserstoffro;>t mit 1 bis 10, vorzugsweise 1 bis 6, Kohlenstoffatomen, und Z eine der Gruppen

0 ^C-^ 0 NH

-C-O-N (⁰¹Vn » -C-S-R₁ oder -C-O-R₂

oder ein Säureanlagerungssalz derselben bedeuten, worin η 2 oder 3, R₁ einen 2-Pyridyl-, 5-Nitro-2-pyridyl-- oder ^-Pyridylrest, und Rp den Methyl- oder Ethylrest darstellen.

2. Reaktionsfähige Derivate gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymeren wasserlösliche Polymere sind.

3. Reaktionsfähige Derivate gemäß Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyneren Polysaccharidderivate sind.

4. Reaktionsfähige Derivate gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymere^Agarosederivate sind.

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ORIGINAL INSPECTED

5. Reaktionsfähige Derivate gemäß einem der Ansprüche 1 bis ^i, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymeren vernetzt sind.

6. Reaktionsfähige Derivate gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die vernetzten Polymeren in Wasser unlöslich, jedoch quellbar sind.

7. Reaktionsfähige Derivate gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6j dadurch gekennzeichnet, daß Z die Gruppe

-C-O-N-CT I

^C-CiL.

und A den Rest -CH₂-CH₂- bedeuten,

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